JPWO2009031274A1 - 測定チップ - Google Patents

Abstract

本発明は、試料中の被測定物質を生物学的特異的凝集反応を用いて測定する測定チップであって、チップ内の混合液の温度上昇に起因する粒子の非特異的凝集を抑制しうる測定チップに関する。本発明の測定チップは、基板、一対の電極を含む管状の反応部、外部から前記反応部内に試料液を流入させる点着口、前記反応部内の気体を外部に排出する空気孔、および前記点着口または前記空気孔と前記反応部とを接続する管状の流路を有する。本発明の測定チップは、反応部内の混合液に生じた熱が流路内の混合液に伝わるため、反応部内の混合液の温度上昇を抑制することができる。その結果、被測定物質が混合液中に存在しない場合に、混合液中の粒子が分散することができるため、本発明の測定チップは被測定物質を高感度に測定することができる。

Description

本発明は、試料に含まれる被測定物質を生物学的特異的凝集反応を用いて測定または検出する測定チップに関する。

従来、試料に含まれる被測定物質を測定するために、被測定物質に特異的に結合しうる抗体を利用する方法が数多く開発されている。そのひとつに、抗原抗体反応によって生じた免疫凝集物を光学的に検出する方法がある。

この方法では、被測定物質を含む試料液に被測定物質に特異的に結合しうる抗体を一定量加えて免疫凝集物を形成させる。凝集物を形成させた後、試料液に光を照射すると、光は凝集物に当たって散乱する。この散乱光の量は凝集物の量に応じて変化し、凝集物の量は被測定物質の濃度に応じて変化する。したがって、この散乱光を測定することで、試料液中の被測定物質の濃度を測定することができる。一般的に散乱光を測定する免疫比朧法と透過光を測定する免疫比濁法とは区別されているが、凝集物による光の散乱を観察するという点ではいずれも同じ測定原理である。したがって、散乱光だけでなく透過光または反射光を測定しても、試料液中の被測定物質の濃度を測定することができる。

この原理を用いて感度をさらに向上させた方法が、ラテックス凝集法である。前述の方法において抗体をラテックス粒子の表面に固定化させておくと、被測定物質と抗体とが結合することでラテックス粒子の凝集物が形成される。ラテックス粒子の凝集物は抗原および抗体からなる凝集物よりもはるかに光の散乱が大きいため、ラテックス凝集法では被測定物質をより高感度に測定することができる。

ラテックス凝集法をさらに高感度化させる方法として、特許文献１に開示されている測定方法が知られている。以下、図１および図２を用いて特許文献１に開示されている測定方法について説明する。図１Ａは、測定チップの断面図であり、図１Ｂは、測定装置の構成を示すブロック図である。図２は、測定チップの電極部分の拡大図である。

図１Ａに示されるように、測定チップは、２枚のスライドグラス１０，１２と、その間に配置された１対の電極１４，１６とから構成されている。電極１４，１６の厚さは０.０２ｍｍであり、電極間の間隔は０.５ｍｍである。２枚のスライドグラス１０，１２および１対の電極１４，１６に囲まれた導入路１８内には、抗体を固定化されたラテックス粒子２０と試料液とを含む混合液が供給される。

導入路１８内に混合液を導入した後、交流電源供給装置３０を用いて電極１４，１６間に交流電圧を印加して上記反応系に電場を形成することで、図２Ａに示されるように、複数のラテックス粒子２０を直鎖状に並べることができる（パールチェーン化）。交流電圧を印加したときの電界強度は、５〜５０Ｖ／ｍｍ程度が好適とされている。交流電圧を印加して試料中の被測定物質を測定する方法は特許文献２にも開示されているが、特許文献２に開示されている方法では印加電圧が５０ｍＶ程度である。

その後、交流電圧の印加を停止すると、混合液中に被測定物質が存在しない場合は、図２Ｂに示されるように、ラテックス粒子２０はブラウン運動により分散する。一方、混合液中に被測定物質が存在する場合は、図２Ｃに示されるように、ラテックス粒子２０は分散せず、ラテックス粒子２０の凝集物がなおも観察される。図１Ｂに示されるように、顕微鏡２２、ＣＣＤカメラ２４、画像処理ボード２６およびパーソナルコンピューター２８から構成される画像処理装置を用いてラテックス粒子２０の凝集状態を観察して、被測定物質を測定する。

このように特許文献１の方法は、複数の粒子を積極的に接触させることで凝集反応を促進させることができるため、ブラウン運動に依存したラテックス凝集法に比べてより迅速かつ高感度に被測定物質を測定することができる。

一方、上記方法を簡便かつ安価に行うための測定チップが特許文献３に開示されている。図３は、特許文献３に開示されている測定チップの平面図である。この測定チップ４０は、スリットが形成された金属箔４２の両面に上基板４４および下基板４６をラミネートして作製される。混合液は導入口４８から導入される。空気吸引口５０から空気を吸引することで、混合液は導入口４８から金属箔４２のスリット（導入路）に導入され、測定が行われる。
特開平７−８３９２８号公報 国際公開第２００５／００１４６２号パンフレット 特開２００３−７５４４１号公報

しかしながら、従来の測定チップには、被測定物質が存在しない場合であってもパールチェーン化した粒子が分散しないという問題、すなわち粒子が非特異的に凝集してしまうという問題があった。これは、交流電圧を印加したときに測定チップ内の混合液の温度が上昇し、粒子に固定化された抗原や抗体などの生体物質が変性してしまうためと考えられる。このように、被測定物質が存在しない場合であっても粒子が非特異的に凝集してしまうため、従来の測定チップでは高感度な測定を行うことができなかった。

本発明は、試料中の被測定物質を生物学的特異的凝集反応を用いて測定する測定チップであって、測定チップ内の混合液の温度上昇に起因する粒子の非特異的凝集を抑制しうる測定チップを提供することを目的とする。

本発明者は、電場を形成する反応部の他にも混合液を保持しうる流路を設けることで上記課題を解決できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の測定チップに関する。

［１］一対の対向電極間に交流電圧を印加して、試料中の被測定物質を生物学的特異的凝集反応を用いて測定する測定チップであって、基板と、前記基板内に配置され、一対の対向電極を含む管状の反応部と、外部から前記反応部内に試料を導入する点着口と、前記反応部内の気体を外部に排出する空気孔と、前記点着口と前記反応部とを接続する管状の流路と、を有する測定チップ。
［２］前記反応部と前記空気孔とを接続する管状の第２の流路をさらに有する、［１］に記載の測定チップ。
［３］前記流路の体積は、前記反応部の体積の２〜１００％の範囲内である、［１］または［２］に記載の測定チップ。
［４］前記第２の流路の体積は、前記反応部の体積の２〜１００％の範囲内である、［２］に記載の測定チップ。
［５］前記被測定物質に特異的に結合する認識物質を固定化された粒子を、前記流路内または前記反応部内にさらに有する、［１］〜［４］のいずれかに記載の測定チップ。
［６］前記認識物質は、前記被測定物質に特異的に結合する抗体である、［５］に記載の測定チップ。

本発明によれば、反応部内で生じた熱を流路内の混合液に伝えることで反応部内の混合液の温度上昇を抑制することができるため、測定チップ内の混合液の温度上昇に起因する粒子の非特異的凝集を抑制することができる。したがって、本発明によれば、生物学的特異的凝集反応を用いて混合液中の被測定物質を迅速、簡便かつ高感度に測定または検出することができる。

図１Ａは従来の測定チップの断面図であり、図１Ｂは従来の測定装置の構成を示す模式図である。 従来の測定チップの電極部分の拡大図である。 従来の測定チップの平面図である。 図４Ａは本発明の実施の形態１に係る測定チップの一例の平面図であり、図４Ｂは本発明の実施の形態１に係る測定チップの一例の断面図である。 図５Ａは本発明の実施の形態１に係る測定チップの別の例の平面図であり、図５Ｂは本発明の実施の形態１に係る測定チップの別の例の断面図である。 本発明の測定装置の構成を示す模式図である。 図７は本発明の実施の形態２に係る測定チップの平面図である。 実施例１の測定チップの平面図である。 比較例の測定チップの平面図である。 実施例２の測定チップの平面図である。 実施例２の測定結果を示すグラフである。

以下、本明細書において「測定」とは、特定の物質の濃度や量を測定する意味だけでなく、特定の物質の有無を調べる意味も含む。すなわち、本発明の測定チップは、特定の物質を検出するための検出チップでもある。

本発明の測定チップは、試料中の被測定物質を生物学的特異的凝集反応を用いて測定するための測定チップであって、基板、一対の電極を含む反応部、外部から前記反応部内に試料液を導入する点着口、前記反応部内の気体を外部に排出する空気孔、および前記点着口または前記空気孔と前記反応部とを接続する流路を有する。本発明の測定チップは、混合液（試料液および粒子を含む液体）に電場をかける反応部の他に、混合液を保持しうる流路をさらに有することを主たる特徴とする。

基板は、その内部に反応部（後述）を有する絶縁性の板である。基板は、１の部材から構成されていてもよいが、２以上の部材から構成されていてもよい。例えば、基板は、上基板および下基板から構成されていてもよいし（図４Ｂ参照）、上基板、中間基板および下基板から構成されていてもよい（図５Ｂ参照）。測定時に反応部内の粒子の凝集状態を外部から観察するため、基板の少なくとも一部は透明性を有することが好ましい。基板の面積および厚さは、反応部、点着口、空気孔および流路を無理なく配置することができる範囲で適宜設定すればよい。

基板を構成する絶縁材料の例には、有機材料、ガラス、無機絶縁材料、半導体材料などが含まれる。有機材料の例には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホンなどが含まれる。ガラスの例には、アルカリガラス、アルカリソーダガラス、ホウケイ酸ガラス、石英ガラスなどが含まれる。無機絶縁材料の例には、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などが含まれる。半導体材料の例には、単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などが含まれる。この中では、基板の材料はＰＥＴが好ましい。基板の材料をＰＥＴとすることで、測定チップを容易かつ安価に製造することができ、結果として生産効率を大幅に向上させることができる。

反応部は、基板内に配置された管であり、その内部に一対の対向電極を有する。反応部は、その内部に導入された混合液に電場をかけて、混合液中の粒子を直鎖状に配列させる（パールチェーン化）。一対の対向電極は、粒子をパールチェーン化させるための電極である。通常、各電極は外部の電圧印加手段と接続するための端子に接続されている。

反応部の形状は、特に限定されないが直方体状が好ましい。また、反応部の深さは、５μｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。反応部内において直径数μｍの粒子を１層に配置させることができるからである。その結果、平面視したときに粒子が重ならず、かつピントが合った状態で粒子を観察することができるため、各粒子の凝集状態を正確に計測することができる。反応部の幅および長さは、一対の対向電極を内部に配置すること、すなわち一対の対向電極と混合液とを接触させることができ、かつ、必要量の混合液を保持することができれば特に限定されない。反応部の幅は、０.１ｍｍ以上１０ｍｍ以下が好ましく、０.２ｍｍ以上１ｍｍ以下がより好ましく、０.７ｍｍ程度が特に好ましい。反応部の長さは、５ｍｍ程度が好ましい。反応部の内部表面（全部または一部）は、親水性であってもよいし、疎水性であってもよい。後述するように、反応部内には、被測定物質に特異的に結合する認識物質（例えば、抗体）が固定化された粒子が配置されていてもよい。

各電極の位置および形状は、互いに対向しており、粒子がパールチェーン化するように反応部内に電場を形成できるのであれば特に限定されない。電極間の間隔は２０μｍ以上１０００μｍ以下が好ましく、１００μｍ以上５００μｍ以下が特に好ましい。電極間の間隔が２０μｍ未満の場合、直径数μｍの粒子が数珠繋ぎ状に並ぶための領域を十分に確保することができず、電極間の間隔が１０００μｍ以上の場合、有効な電界強度を得るためには５０Ｖ以上の大きな電圧を印加しなければならない（場合によっては有効な電界強度を得られない）からである。電極の材料は、導電性を有し、かつ溶液中で交流電圧を印加しても溶解および剥離しないものであれば特に限定されない。電極の材料の例には、金、銀、白金、銅、アルミ、クロム、ニッケル、タングステンおよびこれらの合金などが含まれる。この中では、電極の材料は金が好ましい。スパッタ技術によって強固に成膜することができ、かつ交流電圧の印加に対する安定性が高いからである。

点着口は、外部から反応部内に液体（試料液または混合液）を導入するための開口部である。点着口は、反応部と直接連通しているか、流路（第１の流路）を介して連通している。点着口の形状は、反応部内に液体を導入することができれば特に限定されない。

空気孔は、点着口から反応部内に液体を導入した際に、反応部内の気体を排出するための開口部である。空気孔は、反応部と直接連通しているか、流路（第２の流路）を介して連通している。空気孔の位置および形状は、点着口から反応部内に液体を導入した際に、反応部内の気体を外部に排出することができれば特に限定されない。

流路は、基板内に配置された管であり、点着口または空気孔と反応部とを接続している。流路の数は１つであってもよいし、２つであってもよい。すなわち、本発明の測定チップは、点着口と反応部とを接続する流路（第１の流路）のみを有していてもよいし（実施の形態１参照）、空気孔と反応部とを接続する流路（第２の流路）のみを有していてもよいし、第１の流路および第２の流路の両方を有していてもよい（実施の形態２参照）。

流路は反応部に隣接しており、点着口から反応部に液体（試料液または混合液）が導入された場合、反応部だけでなく流路も混合液を保持する。したがって、電極間に交流電圧が印加され、反応部内で熱が発生しても、この熱は隣接する流路内の混合液に伝わるため、反応部内の混合液の温度上昇は抑制される。

この温度上昇の抑制効果は、反応部の体積に対する流路の体積で決定される。ここで、測定時（電圧印加時）の反応部内の混合液の温度が４５℃を超えてしまうと、粒子が非特異的に凝集し、被測定物質の測定を行うことができなくなる。したがって、流路の体積は、測定時（電圧印加時）の反応部内の混合液の温度が４５℃以下になるように設定されることが好ましい。具体的には、流路の体積は、反応部の体積の２％以上１００％以下であることが好ましく、５％以上３０％以下がより好ましく、１０％程度が特に好ましい。

流路の形状は、点着口または空気孔と反応部とを接続できれば特に限定されず、例えば直方体や円柱状であればよい。また、流路の向きは、点着口または空気孔と反応部とを接続できれば特に限定されず、基板面方向に対して水平であってもよいし垂直であってもよい。流路の幅、長さおよび深さは、流路に保持させる混合液の体積に応じて適宜設定すればよい。流路の内部表面（全部または一部）は、親水性であってもよいし、疎水性であってもよい。後述するように、流路内には、被測定物質に特異的に結合する認識物質（例えば、抗体）が固定化された粒子が配置されていてもよい。

以上の構成を有する本発明の測定チップは、電極間に電圧が印加されたときに反応部内の混合液に生じた熱が流路内の混合液に伝わるため、反応部内の混合液の温度上昇を抑制することができる。その結果、本発明の測定チップは、混合液の温度上昇に起因する粒子の非特異的凝集を抑制することができるため、被測定物質を高感度に測定することができる。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して説明する。

（実施の形態１）
実施の形態１では、点着口と反応部との間に流路（第１の流路）を有する測定チップの例を示す。

図４Ａは、実施の形態１に係る測定チップの一例を示す平面図である。図４Ｂは、図４Ａの測定チップのＡ−Ａ’線における断面図である。

図４Ａおよび図４Ｂにおいて、測定チップ１００は、上基板１０２、下基板１０４、１対の対抗電極１０６ａ，１０６ｂ、点着口１０８、流路（第１の流路）１１０、反応部１１２、空気孔１１４および端子１１６ａ，１１６ｂを有する。

上基板１０２および下基板１０４は絶縁性の基板である。上基板１０２は、下基板１０４に面する面に凹部を有する。図４Ｂに示されるように、この凹部は流路１１０および反応部１１２の一部を構成する。また、上基板１０２には、流路１１０または反応部１１２に連通する２つの孔（点着口１０８および空気孔１１４）が形成されている。反応部１１２内の粒子の凝集状態を外部から観察するため、少なくとも一方の基板の少なくとも一部（例えば、上基板１０２の反応部１１２の上の部分）は透明性を有することが好ましい。上基板１０２および下基板１０４の大きさ（面積および厚さ）は、電極１０６ａ，１０６ｂ、点着口１０８、流路１１０、反応部１１２および空気孔１１４を無理なく配置することができれば特に限定されない。

電極１０６ａ，１０６ｂは、上基板１０２と下基板１０４との間に配置されており、反応部１１２において対向している。逆に言えば、点着口１０８と空気孔１１４とを接続する中空部のうち、電極１０６ａ，１０６ｂが配置されている部分が反応部１１２である。電極１０６ａ，１０６ｂは、それぞれ端子１１６ａ，１１６ｂに接続されている。電圧印加部のコネクタと端子１１６ａ，１１６ｂとを接続することで、電圧印加部は電極１０６ａ，１０６ｂ間に交流電圧を印加して反応部１１２内に電場を形成することができる（後述）。

電極１０６ａ，１０６ｂの膜厚は、１ｎｍ以上１０μｍ以下が好ましい。特に、スパッタを用いて電極１０６ａ，１０６ｂを形成するときは、製造時間の観点から、電極１０６ａ，１０６ｂの膜厚は、５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下が好ましく、１００ｎｍ程度が特に好ましい。電極の幅１１８ａ，１１８ｂは、任意に設定することができるが、通常は０.５ｍｍ以上５ｍｍ以下である。

電極間の間隔１２０は、２０μｍ以上１０００μｍ以下が好ましい。電極間の間隔１２０が２０μｍ未満の場合は、粒子がパールチェーン化するための領域を十分に確保できない。一方、電極間の間隔１２０が１０００μｍを超える場合は、パールチェーン化を引き起こすための有効な電界強度を得るために５０Ｖ以上の大きな電圧を印加しなければならなくなるため好ましくない。電極間の間隔１２０は、１００μｍ以上５００μｍ以下がより好ましく、５００μｍ程度であることが特に好ましい。電極間の間隔１２０は不変であるため、電圧印加部は電極１０６ａ，１０６ｂ間に印加する電圧を制御することで、反応部内に形成する電場の強度を容易に制御することができる。

点着口１０８は、流路１１０と外部とを接続する開口部である。点着口１０８の形状および大きさは、流路１１０内に液体（混合液または試料液）を導入することができれば特に限定されない。

流路（第１の流路）１１０は、点着口１０８と反応部１１２とを接続する中空部である。流路１１０の体積は、反応部１１２の体積の２％以上１００％以下が好ましく、２０％程度が特に好ましい。流路１１０の幅、長さおよび深さは、設定される体積に応じて適宜設定すればよい。流路１１０および反応部１１２の断面形状を同一形状とすることで、測定チップ１００の作製を容易にすることができる。例えば、図４Ａおよび図４Ｂに示されるように、流路１１０および反応部１１２の断面形状が同一形状（長方形）の場合、反応部の長さ（電極の長さ）１２２が５ｍｍであれば、流路の長さ１２４は０.１ｍｍ以上５ｍｍ以下が好ましく、１ｍｍ程度が特に好ましい。流路の長さ１２４とは、点着口１０８と反応部１１２との間隔を意味する。

反応部１１２は、点着口１０８と空気孔１１４とを接続する中空部のうち、電極１０６ａ，１０６ｂが配置されている部分である。前述の通り、反応部の深さ１２６は、５μｍ以上１０μｍ以下が好ましい。反応部の幅１２８は、電極１０６ａ，１０６ｂを反応部内に配置することができれば特に限定されないが、０.１ｍｍ以上１０ｍｍ以下が好ましく、０.２ｍｍ以上１ｍｍ以下がより好ましく、０.７ｍｍ程度が特に好ましい。また、反応部の長さ１２２は、５ｍｍ程度が好ましい。

空気孔１１４は、反応部１１２と外部とを接続する開口部である。空気孔１１４の形状および大きさは、点着口１０８から反応部１１２内に混合液を導入した際に、反応部１１２内の気体を外部に排出することができれば特に限定されない。

図４Ａおよび図４Ｂに示される測定チップ１００は、例えば、１）下基板１０４上に電極１０６ａ，１０６ｂを形成する第１のステップと、２）上基板１０２に流路１１０および反応部１１２の形状に応じた凹部、ならびに点着口１０８および空気孔１１４の形状に応じた孔を形成する第２のステップと、３）上基板１０２と下基板１０４とを貼り合わせる第３のステップとから作製することができる。

第１のステップにおいて、下基板１０４上に電極１０６ａ，１０６ｂを形成する方法は、スパッタや蒸着などの薄膜堆積技術、印刷技術などの当業者に公知の技術から選択することができる。電極薄膜が薄いほど上基板１０２と下基板１０４との間の隙間を無くすことが可能であるが（図４Ｂ参照）、スパッタはこのような薄い電極薄膜を容易に形成することができるので好ましい。なお、第１のステップでは、下基板１０４の代わりに上基板１０２上に電極１０６ａ，１０６ｂを形成してもよい。

第２のステップにおいて、上基板１０２に凹部（流路１１０および反応部１１２）ならびに孔（点着口１０８および空気孔１１４）を形成する方法は、切削技術やレーザー除去技術、インプリント技術、フォトリソグラフィーなどの当業者に公知の技術から選択することができる。

第３のステップにおいて、上基板１０２と下基板１０４とを貼り合わせる方法は、当業者に公知の技術から選択することができる。

図５Ａは、実施の形態１に係る測定チップの別の例を示す平面図である。図５Ｂは、図５Ａの測定チップのＡ−Ａ’線における断面図である。

図５Ａおよび図５Ｂにおいて、測定チップ２００は、上基板１０２、中間基板２０２、下基板１０４、１対の対抗電極１０６ａ，１０６ｂ、点着口１０８、流路１１０、反応部１１２、空気孔１１４および端子１１６ａ，１１６ｂを有する。測定チップ２００では、上基板１０２に凹部を形成する代わりに、中間基板２０２を上基板１０２と下基板１０４との間に挟ませることで、流路１１０および反応部１１２が形成される。上基板１０２および中間基板２０２以外の構成要素は、図４Ａおよび図４Ｂに示される測定チップ１００の構成要素と同じである。

測定チップ２００では、中間基板２０２の面積および厚さを調整することで、流路１１０および反応部１１２の面積および深さを容易に制御することができる。また、平板状の上基板１０２を使用することができる。さらに、その両面が接着性または粘着性を有する基板を中間基板２０２として用いることで、上基板１０２、中間基板２０２および下基板１０４を容易に貼り合わせることができる。このように、図５Ａおよび図５Ｂに示される測定チップ２００は、製造効率の観点から優れている。

図５Ａおよび図５Ｂに示される測定チップ２００は、例えば、１）下基板１０４上に電極１０６ａ，１０６ｂを形成する第１のステップと、２）上基板１０２に点着口１０８および空気孔１１４の形状に応じた孔を形成する第２のステップと、３）上基板１０２と中間基板２０２と下基板１０４とを貼り合わせる第３のステップとから作製することができる。なお、図８（実施例１）に示されるような測定チップを作製する場合は、第２のステップにおいて点着口１０８および空気孔１１４を形成する必要はない。すなわち、第２のステップは任意のステップである。

次に、上記構成を有する測定チップ１００（または測定チップ２００）を用いて被測定物質を測定するための測定装置について説明する。

図６は、測定装置の構成を示す模式図である。図６に示されるように、測定装置３００は、撮像部３０２、制御解析部３０４および電圧印加部３０６を有する。測定装置３００は、測定チップ１００の反応部１１２内の粒子の凝集状態を観察して、被測定物質を測定する。

撮像部３０２は、測定チップ１００の反応部１１２内の画像を撮像する。撮像部３０２は、動画を撮像してもよいし静止画を撮像してもよい。得られた画像は、制御解析部３０４に出力される。撮像部３０２は、例えばＣＣＤカメラである。

制御解析部３０４は、撮像部３０２および電圧印加部３０６の動作を制御するとともに、撮像部３０２が撮像した画像を解析して測定チップ１００の反応部１１２内に存在する粒子の凝集率を算出する。

電圧印加部３０６は、コネクタ３０８を介して測定チップ１００の電極１０６ａ，１０６ｂに接続されており、制御解析部３０４の制御の下で電極１０６ａ，１０６ｂ間に交流電圧を印加して反応部１１２内に電場を形成する。

次に、上記構成を有する測定チップ１００（または測定チップ２００）および測定装置３００を用いて被測定物質を測定する方法について説明する。

［第１のステップ］
第１のステップでは、被測定物質に特異的に結合する認識物質をその表面に固定化されている粒子を準備する。

認識物質を固定化される担体粒子の種類は、特に限定されない。担体粒子の例には、ラテックス粒子、ベントナイト、カオリン、金コロイド、赤血球細胞、ゼラチン、リポソームなどが含まれる。この中ではラテックス粒子が好ましい。ラテックス粒子は、凝集反応を利用した測定方法で一般に使用されているものから選択されうる。ラテックス粒子の例には、ポリスチレン系ラテックス粒子、ポリビニルトルエン系ラテックス粒子、ポリメタクリレート系ラテックス粒子などが含まれる。ラテックス粒子は、官能基モノマー（−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＳＯ_３など）が共重合して導入されていてもよい。

例えば、担体粒子がラテックス粒子の場合、担体粒子の直径（平均粒径）は、０.５μｍ以上１０μｍ以下が好ましく、１μｍ以上５μｍ以下がより好ましく、２μｍ以上３μｍ以下が特に好ましい。担体粒子の直径が０.５μｍ未満だと、後述する第３のステップにおいて粒子に十分な誘電泳動力を作用させることができず、粒子をパールチェーン化させにくくなる。また、担体粒子の直径が１０μｍを超えると、後述する第４のステップにおいて凝集していない修飾粒子がブラウン運動により混合液中に分散しにくくなる。担体粒子の直径（平均粒径）は、例えば、光学顕微鏡を用いて観察したり、コールターカウンターを用いて電気抵抗を測定したり、光散乱法で散乱光変化量を測定したりすることで測定することができる。

担体粒子に固定化される認識物質は、被測定物質に特異的に結合しうる物質であれば特に限定されない。認識物質の例には、抗体や核酸、酵素、補酵素（例えば、ビオチン）、レクチン、糖タンパク質、ヘムやポルフィリンなどの有機合成物などが含まれる。これらの認識物質を担体粒子に固定化する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、抗体を担体粒子（例えば、ラテックス粒子）に固定化する場合、疎水性相互作用を利用した物理吸着や、アミノ基やスルフヒドリル基などを利用した化学修飾などを用いることができる。

［第２のステップ］
第２のステップでは、試料と第１のステップで準備した粒子を含む混合液を調製する。

試料は、特に限定されず、測定対象や測定目的などに応じて適宜選択すればよい。試料の例には、血液、血漿、血清、それらの希釈物、所定の濃度の塩を含む電解質溶液などが含まれる。

混合液は、抗原抗体反応などの生物学的特異的凝集反応を安定化させる観点から、塩を適量含むことが好ましい。多量の塩を含むと混合液の導電率が上昇し、交流電圧を印加したときに熱が発生する可能性がある。前述の通り、混合液の濃度が上昇すると、粒子が非特異的に凝集して測定できない可能性があるが、本発明の測定チップを用いることでこの問題を回避することができる。

混合液の調製方法は、特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、第１のステップで粒子を懸濁液として準備した場合は、試料にその懸濁液を適量加えて攪拌し、さらに必要に応じてｐＨを調整すればよい。また、第１のステップで粒子を固形物（例えば、上記懸濁液の凍結乾燥物や風乾乾燥物など）として準備した場合は、その固形物に試料液を適量加えて攪拌し、さらに必要に応じてｐＨを調整すればよい。

混合液中の粒子の濃度は、例えば粒子がラテックス粒子の場合は、０.０１重量％以上１重量％以下が好ましく、０.１重量％以上０.５重量％以下がより好ましく、０.４重量％程度が特に好ましい。混合液中の粒子の濃度が高いほど、パールチェーンが形成されやすくなり、凝集反応が促進されるが、反応部１１２において粒子が重なりやすくなり、粒子の凝集状態を正確に観察することが困難となるからである。混合液中の粒子の濃度が高いほど、被測定物質が存在しない場合であっても粒子の凝集度が大きくなる傾向がある。

［第３のステップ］
第３のステップでは、第２のステップで調製した混合液を測定チップ１００の反応部１１２内に導入し、反応部１１２内に交流電場を形成して、粒子をパールチェーン化させる。

混合液を点着口１０８から反応部１１２内に導入すると、流路１１０および反応部１１２が混合液で満たされ、混合液は電極１０６ａ，１０６ｂと接触する。また、流路１１０および反応部１１２では、粒子が混合液中で均一に分散された状態となる。

混合液に外部電場を与えると、担体粒子内で双極子が誘起され、この双極子の相互作用により粒子が泳動し（誘電泳動）、粒子が電界方向と並行に一列に並ぶ（パールチェーン化）。このとき、混合液内に被測定物質が存在すれば、粒子は被測定物質を介して他の粒子に会合するため、複数の粒子が凝集する。

測定チップ１００の反応部１１２（または流路１１０）内には、第１のステップで準備した粒子を予め配置しておいてもよい。すなわち、混合液を調製する第２のステップが、反応部１１２（または流路１１０）内で行われてもよい。例えば、粒子を含む固形物（粒子懸濁液の凍結乾燥物や風乾乾燥物など）を予め流路内に配置しておくことで、試料液を点着口１０８から流路１１０および反応部１１２内に導入するのみで第２のステップを終えることができ、被測定物質の測定をより簡便に行うことができる。

電極１０６ａ，１０６ｂ間に印加する交流電圧の波形は、正弦波、矩形波、方形波、三角波などであればよく、連続波でもパルス波でもよい。また、周波数は、特に限定されないが、１０ｋＨｚ以上１０ＭＨｚ以下であることが好ましい。周波数が１０ｋＨｚ未満または１０ＭＨｚ以上の場合、混合液が発熱してしまい、測定を十分に行うことができない。

電極１０６ａ，１０６ｂ間に印加する交流電圧の電界強度は、５Ｖ／ｍｍ以上５０Ｖ／ｍｍ未満であることが好ましい。電界強度が５Ｖ／ｍｍ以下だと、パールチェーン化が生じにくくなり、凝集反応を十分に促進させることができない。一方、電界強度が５０Ｖ／ｍｍを超えると、混合液の発熱により気泡が発生し、測定を行うことができない。

交流電圧を印加すると、反応部１１２内で熱が発生する。流路１１０を有しない従来の測定チップでは、この熱により反応部１１２内の混合液の温度が著しく上昇していた。一方、流路１１０を有する本発明の測定チップ１００では、反応部１１２内で発生した熱が流路１１０内の混合液に伝わるため、反応部１１２内の混合液の温度上昇を抑制することができる（実施例参照）。交流電圧を印加しているときの混合液の温度は、３℃以上４５℃以下が好ましく、２０℃以上３５℃以下がより好ましく、３３℃程度が特に好ましい。混合液の温度が４５℃を超えると、粒子が非特異的に凝集して、被測定物質の測定を行うことができなくなる。

［第４のステップ］
第４のステップでは、交流電圧の印加を停止した後に、粒子の凝集状態を観察する。

交流電圧の印加を停止すると、凝集していない粒子はブラウン運動により混合液中に分散するが、特異的結合により凝集した粒子は凝集した状態が維持される。粒子の凝集状態は被測定物質の濃度に応じて変化する。したがって、粒子の凝集度を求めることにより、被測定物質の有無を検出したり濃度を測定したりすることができる。

凝集度の算出方法は、特に限定されず観察方法（装置）に応じて適宜選択すればよい。例えば、測定装置３００の撮像部３０２で混合液中の粒子の凝集状態を撮像し、得られた画像から制御解析部３０４において凝集している粒子の数から凝集度を算出すればよい。粒子の凝集度は、例えば以下の式により算出することができる。

凝集度（％）＝（凝集している粒子の数）／（すべての粒子の数）×１００

凝集度は、粒子の個数ではなく、粒子の面積を指標として算出することもできる。粒子の凝集度は、例えば以下の式によっても算出することができる。

凝集度（％）＝（凝集している粒子の面積）／（すべての粒子の面積）×１００

以上のように、実施の形態１の測定チップは、電極間に電圧が印加されたときに反応部内の混合液に生じた熱が第１の流路内の混合液に伝わるため、反応部内の混合液の温度上昇を抑制することができる。したがって、実施の形態１の測定チップは、混合液の温度上昇に起因する粒子の非特異的凝集を抑制することができ、結果として被測定物質を高感度に測定することができる。

（実施の形態２）
実施の形態２では、点着口と反応部との間だけでなく、反応部と空気孔との間にも流路（第２の流路）を有する測定チップの例を示す。

図７は、実施の形態２に係る測定チップを示す平面図である。

図７において、測定チップ４００は、上基板１０２、下基板１０４、１対の対抗電極１０６ａ，１０６ｂ、点着口１０８、第１の流路１１０、反応部１１２、第２の流路４０２、空気孔１１４および端子１１６ａ，１１６ｂを有する。実施の形態２の測定チップ４００は、実施の形態１の測定チップ１００とほぼ同じ構成であるが、第２の流路４０２を有する点が異なる。第２の流路４０２以外の構成要素は、実施の形態１の測定チップの各構成要素と同じため、同一の符号を付し、説明を省略する。

第２の流路４０２は、反応部１１２と空気孔１１４とを接続する中空部である。第２の流路４０２の体積は、反応部１１２の体積の２％以上１００％以下が好ましく、２０％程度が特に好ましい。第２の流路４０２の幅、長さおよび深さは、設定される体積に応じて適宜設定すればよい。反応部１１２および第２の流路４０２の断面形状を同一形状とすることで、測定チップ４００の作製を容易にすることができる。例えば、図７に示されるように、反応部１１２および第２の流路４０２の断面形状が同一形状（長方形）の場合、反応部の長さ（電極の長さ）１２２が５ｍｍであれば、第２の流路の長さ４０４は０.１ｍｍ以上５ｍｍ以下が好ましく、１ｍｍ程度が特に好ましい。第２の流路の長さ４０４とは、反応部１１２と空気孔１１４との間隔を意味する。なお、第１の流路１１０および第２の流路４０２は、同一の幅、長さおよび深さである必要はない。

実施の形態２の測定チップ４００は、実施の形態１の測定チップ１００と同様の手順で作製することができる。また、実施の形態２の測定チップ４００は、実施の形態１の測定チップ１００と同様の手順で被測定物質の測定に用いることができる。

以上のように、実施の形態２の測定チップは、電極間に電圧が印加されたときに反応部内の混合液に生じた熱が第１の流路および第２の流路内の混合液に伝わるため、反応部内の混合液の温度上昇を抑制することができる。したがって、実施の形態２の測定チップは、混合液の温度上昇に起因する粒子の非特異的凝集を抑制することができ、結果として被測定物質を高感度に測定することができる。

第２の流路を有しない測定チップでは、混合液が空気孔から外部に流出しないため、空気孔付近の粒子の密度が時間の経過とともに上昇していた。粒子の密度が上昇すると、粒子が重なってしまい、凝集していない粒子を凝集している粒子と誤認する可能性がある。この誤認は測定誤差の要因となるため、第２の流路を有しない測定チップを用いて測定を行う場合は、空気孔からある程度離れた領域で粒子の凝集状態を観察する必要があった。

一方、実施の形態２の測定チップでは、反応部と空気孔との間に第２の流路を有するため、反応部の空気孔側の端部でも粒子の密度が上昇せず、反応部内で粒子が均一に分散する。したがって、実施の形態２の測定チップを用いることで、第２の流路（空気孔）に近い領域でも粒子の凝集状態を観察することができ、観察場所を自由に設定することができる。

以下、本発明を実施例を参照してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。

（実施例１）
実施例１では、実施の形態１の測定チップ（第１の流路のみを有する測定チップ）を用いて、反応部内の溶液の温度と粒子の非特異的凝集との関係を調べた例を示す。

１．測定チップの作製
本実施例では、図８に示す本発明の測定チップ（実施例１の測定チップ）と、図９に示す流路を有しない従来の測定チップ（比較例の測定チップ）を作製した。

（１）実施例１の測定チップの作製
下基板１０４として、厚さ０.１ｍｍの清浄なホウケイ酸ガラス（Ｄ−２６３、SCHOTT社）を用意した。電極１０６ａ，１０６ｂおよび端子１１６ａ，１１６ｂのパターンを有するステンシルマスク（ステンレス製）を通してスパッタして、ガラスと金との密着性を向上させるためのクロム薄膜（膜厚５ｎｍ）を下基板１０４上に形成した。次いで、同じステンシルマスクを通してスパッタして、クロム薄膜の上に電極１０６ａ，１０６ｂおよび端子１１６ａ，１１６ｂとなる金薄膜（膜厚９５ｎｍ）を形成した。長辺が対向するように配置された１対の矩形電極１０６ａ，１０６ｂ（幅１ｍｍ、長さ５ｍｍ）間の間隔は０.５ｍｍとした。

上基板１０２として、下基板と同じホウケイ酸ガラスを用意した。上基板１０２の大きさは、幅５.５ｍｍ、長さ５.５ｍｍとした。

中間基板２０２として、第１の流路１１０および反応部１１２のパターンを有する両面粘着シート（Ｎｏ.５６０１、日東電工株式会社）を用意した。このシートは、ＰＥＴ製基材の両面にアクリル系の粘着剤が付いており、総厚１０μｍである。第１の流路１１０および反応部１１２の幅は０.７ｍｍとした。第１の流路１１０の長さは０.５ｍｍとし、反応部１１２の長さは５ｍｍとした。点着口１０８および空気孔１１４の大きさは、幅０.７ｍｍ、長さ１ｍｍとした。

反応部１１２が電極１０６ａ，１０６ｂ間に位置するように中間基板２０２を下基板１０４上に貼りあわせ、さらにこの中間基板２０２上に上基板１０２を貼りあわせた。このとき、上基板１０２の端と電極１０６ａ，１０６ｂの端子側の端とが合うように上基板１０２を中間基板２０２上に貼りあわせることで、第１の流路１１０を形成した（図８参照）。

（２）比較例の測定チップの作製
上記実施例１の測定チップと同様の手順により比較例の測定チップを作製した。比較例の測定チップは、第１の流路を有さず、点着口１０８と反応部１１２とが直接接続している点が実施例１の測定チップと異なる。下基板１０４上の矩形電極１０６ａ，１０６ｂの大きさおよび位置は、実施例１の測定チップと同様である。反応部１１２の幅は０.７ｍｍとし、反応部１１２の長さは３ｍｍとした（図９参照）。

２．反応部内の溶液の温度および凝集度の測定
平均直径２μｍのラテックスビーズ（Bangs Laboratories社）を担体粒子として用意し、抗ＣＲＰポリクローナル抗体をその表面に固定化した。抗体を固定化された粒子を緩衝液（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム，２０ｍＭ グリシン，０.１％ ＢＳＡ，ｐＨ８.６）に希釈して、粒子懸濁液（粒子０.４重量％）を調製した。

測定チップの電極間に印加する電圧ならびにその周波数および波形を制御するべく、波形発生器（３３１２０Ａ；Hewlett Packard社）および電力増幅アンプ（４０５５；株式会社エヌエフ回路設計ブロック）を電圧印加部として測定チップの端子に接続した。

粒子懸濁液１μＬを測定チップの点着口から反応部内に導入し、測定チップの１対の電極間に交流電圧（３０Ｖ、１００ｋＨｚ）を６０秒間印加して、粒子をパールチェーン化させた。電圧の印加を停止してから６０秒後に、倒立顕微鏡（オリンパス株式会社）を用いて反応部内を透過光観察し、反応部内の透過光画像を３枚撮像した。実施例１の測定チップおよび比較例の測定チップともに、反応部の深さが１０μｍのため、粒子が反応部内で２層に重なることなく、かつ粒子が顕微鏡の焦点から外れることもなく、粒子を明瞭に観察することができた。実施例１の測定チップおよび比較例の測定チップともに、交流電圧を印加している間は、反応部内で粒子がパールチェーン化しているのが観察された。

反応部内における粒子の凝集度は、以下の式により求めた。実施例１の測定チップおよび比較例の測定チップそれぞれについて、３枚の画像のそれぞれから算出された凝集度の平均値を代表値とした。溶液に含まれる抗原の濃度が極めて低いため、粒子の凝集度は低いと予想される。

凝集度＝（凝集している粒子の面積）／（すべての粒子の面積）×１００（％）

また、電圧の印加を停止してから６０秒後に、測定チップの上方に配置されたサーモビューワ（ＴＨ９１００、ＮＥＣ三栄株式会社）を用いて反応部内の温度を測定した。

表１は、実施例１の測定チップおよび比較例の測定チップの反応部内の溶液の温度および凝集度を示す表である。

比較例の測定チップでは、電圧を印加することにより溶液の温度は６２℃まで上昇した。反応部内では粒子がパールチェーン化するのが観察されたが、同時に溶液の蒸発および突沸様の気泡の発生が観察された。電圧の印加を停止した後、一部の粒子がパールチェーン化した状態のまま反応部に固着しているのが観察された。結果として、凝集度は８０％と非常に高い値となった。

一方、実施例１の測定チップでは、電圧を印加しても溶液の温度は３０℃までしか上昇しなかった。反応部で発生した熱が第１の流路内の溶液に伝わったため、反応部内の溶液の温度上昇を抑制できたと考えられる。電圧の印加を停止した後、パールチェーン化した粒子の多くが再度分散するのが観察された。結果として、凝集度は２３％と低い値となった。

以上のように、流路を有しない従来の測定チップ（比較例の測定チップ）では、溶液の温度上昇に起因する粒子の固着化が生じるため、抗原抗体反応などの生物学的特異的凝集反応を利用した測定を高い精度で行うことはできないと考えられる。一方、流路を有する本発明の測定チップ（実施例１の測定チップ）では、粒子の固着化が生じないため、生物学的特異的凝集反応を利用した測定を高い精度で行いうると考えられる。

（実施例２）
実施例２では、実施の形態２の測定チップ（第１の流路および第２の流路を有する測定チップ）を用いて、各種炎症のマーカータンパク質とされるＣ反応性タンパク質（以下「ＣＲＰ」という）を測定した例を示す。

１．測定チップの作製
本実施例では、上記実施例１の測定チップと同様の手順により、図１０に示す本発明の測定チップ（実施例２の測定チップ）を作製した。実施例２の測定チップは、第１の流路１１０だけでなく第２の流路４０２も有する点が実施例１の測定チップと異なる。下基板１０４上の矩形電極１０６ａ，１０６ｂの大きさおよび位置は、実施例１の測定チップと同様である。また、第１の流路１１０および反応部１１２の幅、長さおよび深さも、実施例１の測定チップと同様である。第２の流路４０２は、幅０.７ｍｍ、長さ０.５ｍｍ、深さ１０μｍとした。第２の流路４０２を設けるため、上基板１０２の大きさは、幅５.５ｍｍ、長さ６.０ｍｍとした。

２．反応部内の溶液の温度および凝集度の測定
実施例１と同様の手順により、電圧を印加した後の反応部内の混合液の温度および凝集度を測定した。

表２は、実施例２の測定チップの反応部内の溶液の温度および凝集度を示す表である。

実施例２の測定チップでは、電圧を印加しても溶液の温度は２９℃までしか上昇しなかった。反応部で発生した熱が第１の流路および第２の流路内の溶液に伝わったため、反応部内の混合液の温度上昇を抑制できたと考えられる。電圧の印加を停止した後、パールチェーン化した粒子の多くが再度分散するのが観察された。結果として、凝集度は２２％と低い値となった。

また、反応部のすべての領域において粒子が均一に分散しており、第２の流路に近い領域でも十分に観察することができた。

３．ＣＲＰの測定
平均直径２μｍのラテックスビーズ（Bangs Laboratories社）を担体粒子として用意し、抗ＣＲＰポリクローナル抗体をその表面に固定化した。抗体を固定化された粒子を緩衝液（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム，２０ｍＭ グリシン，０.１％ ＢＳＡ，ｐＨ８.６）に希釈して、粒子懸濁液を調製した。

ＣＲＰ（抗原）を緩衝液（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム，２０ｍＭ グリシン，０.１％ ＢＳＡ，ｐＨ８.６）に溶解させて試料溶液とした。試料溶液と粒子懸濁液とを室温で９０秒間混合し、ＣＲＰの濃度が異なる４種類の混合液を調製した。粒子の濃度は、いずれも０.４重量％とした。ＣＲＰの濃度は、４.７×１０^−６Ｍ、４.７×１０^−８Ｍ、４.７×１０^−１０Ｍ、０Ｍのいずれかとした。

混合液１μＬを実施例２の測定チップの点着口から反応部内に導入し、測定チップの１対の電極間に交流電圧（３０Ｖ、１００ｋＨｚ）を６０秒間印加して、粒子をパールチェーン化させた。電圧の印加を停止してから６０秒後に、反応部内における粒子の凝集度を求めた。

図１１は、各混合液における粒子の凝集度を示すグラフである。このグラフに示されるように、本発明の測定チップ（実施例２の測定チップ）を用いることで、反応部内の混合液の温度上昇を抑制することができ、短時間で抗原抗体反応による粒子の凝集を確認することができた。

以上のように、流路を有する本発明の測定チップを用いることで、非常に短時間（３分）で簡便かつ高感度に被測定物質を測定することができる。

本出願は、２００７年９月３日出願の特願２００７−２２７７５４に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。

本発明の測定チップは、試料中の被測定物質を迅速、簡便かつ高感度に測定することができるので、例えば、生体試料、特に血液などに含まれるタンパク質などの生体構成成分を分析する測定チップとして有用である。本発明の測定チップは、例えば、血液試料に含まれるタンパク質や健康指標物質などを測定するＰＯＣＴ診断バイオセンサなどの用途にも応用することが可能である。

本発明は、試料に含まれる被測定物質を生物学的特異的凝集反応を用いて測定または検出する測定チップに関する。

従来、試料に含まれる被測定物質を測定するために、被測定物質に特異的に結合しうる抗体を利用する方法が数多く開発されている。そのひとつに、抗原抗体反応によって生じた免疫凝集物を光学的に検出する方法がある。

この方法では、被測定物質を含む試料液に被測定物質に特異的に結合しうる抗体を一定量加えて免疫凝集物を形成させる。凝集物を形成させた後、試料液に光を照射すると、光は凝集物に当たって散乱する。この散乱光の量は凝集物の量に応じて変化し、凝集物の量は被測定物質の濃度に応じて変化する。したがって、この散乱光を測定することで、試料液中の被測定物質の濃度を測定することができる。一般的に散乱光を測定する免疫比朧法と透過光を測定する免疫比濁法とは区別されているが、凝集物による光の散乱を観察するという点ではいずれも同じ測定原理である。したがって、散乱光だけでなく透過光または反射光を測定しても、試料液中の被測定物質の濃度を測定することができる。

この原理を用いて感度をさらに向上させた方法が、ラテックス凝集法である。前述の方法において抗体をラテックス粒子の表面に固定化させておくと、被測定物質と抗体とが結合することでラテックス粒子の凝集物が形成される。ラテックス粒子の凝集物は抗原および抗体からなる凝集物よりもはるかに光の散乱が大きいため、ラテックス凝集法では被測定物質をより高感度に測定することができる。

ラテックス凝集法をさらに高感度化させる方法として、特許文献１に開示されている測定方法が知られている。以下、図１および図２を用いて特許文献１に開示されている測定方法について説明する。図１Ａは、測定チップの断面図であり、図１Ｂは、測定装置の構成を示すブロック図である。図２は、測定チップの電極部分の拡大図である。

図１Ａに示されるように、測定チップは、２枚のスライドグラス１０，１２と、その間に配置された１対の電極１４，１６とから構成されている。電極１４，１６の厚さは０.０２ｍｍであり、電極間の間隔は０.５ｍｍである。２枚のスライドグラス１０，１２および１対の電極１４，１６に囲まれた導入路１８内には、抗体を固定化されたラテックス粒子２０と試料液とを含む混合液が供給される。

導入路１８内に混合液を導入した後、交流電源供給装置３０を用いて電極１４，１６間に交流電圧を印加して上記反応系に電場を形成することで、図２Ａに示されるように、複数のラテックス粒子２０を直鎖状に並べることができる（パールチェーン化）。交流電圧を印加したときの電界強度は、５〜５０Ｖ／ｍｍ程度が好適とされている。交流電圧を印加して試料中の被測定物質を測定する方法は特許文献２にも開示されているが、特許文献２に開示されている方法では印加電圧が５０ｍＶ程度である。

その後、交流電圧の印加を停止すると、混合液中に被測定物質が存在しない場合は、図２Ｂに示されるように、ラテックス粒子２０はブラウン運動により分散する。一方、混合液中に被測定物質が存在する場合は、図２Ｃに示されるように、ラテックス粒子２０は分散せず、ラテックス粒子２０の凝集物がなおも観察される。図１Ｂに示されるように、顕微鏡２２、ＣＣＤカメラ２４、画像処理ボード２６およびパーソナルコンピューター２８
から構成される画像処理装置を用いてラテックス粒子２０の凝集状態を観察して、被測定物質を測定する。

このように特許文献１の方法は、複数の粒子を積極的に接触させることで凝集反応を促進させることができるため、ブラウン運動に依存したラテックス凝集法に比べてより迅速かつ高感度に被測定物質を測定することができる。

一方、上記方法を簡便かつ安価に行うための測定チップが特許文献３に開示されている。図３は、特許文献３に開示されている測定チップの平面図である。この測定チップ４０は、スリットが形成された金属箔４２の両面に上基板４４および下基板４６をラミネートして作製される。混合液は導入口４８から導入される。空気吸引口５０から空気を吸引することで、混合液は導入口４８から金属箔４２のスリット（導入路）に導入され、測定が行われる。
特開平７−８３９２８号公報 国際公開第２００５／００１４６２号パンフレット 特開２００３−７５４４１号公報

しかしながら、従来の測定チップには、被測定物質が存在しない場合であってもパールチェーン化した粒子が分散しないという問題、すなわち粒子が非特異的に凝集してしまうという問題があった。これは、交流電圧を印加したときに測定チップ内の混合液の温度が上昇し、粒子に固定化された抗原や抗体などの生体物質が変性してしまうためと考えられる。このように、被測定物質が存在しない場合であっても粒子が非特異的に凝集してしまうため、従来の測定チップでは高感度な測定を行うことができなかった。

本発明は、試料中の被測定物質を生物学的特異的凝集反応を用いて測定する測定チップであって、測定チップ内の混合液の温度上昇に起因する粒子の非特異的凝集を抑制しうる測定チップを提供することを目的とする。

本発明者は、電場を形成する反応部の他にも混合液を保持しうる流路を設けることで上記課題を解決できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の測定チップに関する。

［１］一対の対向電極間に交流電圧を印加して、試料中の被測定物質を生物学的特異的凝集反応を用いて測定する測定チップであって、基板と、前記基板内に配置され、一対の対向電極を含む管状の反応部と、外部から前記反応部内に試料を導入する点着口と、前記反応部内の気体を外部に排出する空気孔と、前記点着口と前記反応部とを接続する管状の流路と、を有する測定チップ。
［２］前記反応部と前記空気孔とを接続する管状の第２の流路をさらに有する、［１］に記載の測定チップ。
［３］前記流路の体積は、前記反応部の体積の２〜１００％の範囲内である、［１］または［２］に記載の測定チップ。
［４］前記第２の流路の体積は、前記反応部の体積の２〜１００％の範囲内である、［２］に記載の測定チップ。
［５］前記被測定物質に特異的に結合する認識物質を固定化された粒子を、前記流路内または前記反応部内にさらに有する、［１］〜［４］のいずれかに記載の測定チップ。
［６］前記認識物質は、前記被測定物質に特異的に結合する抗体である、［５］に記載
の測定チップ。

本発明によれば、反応部内で生じた熱を流路内の混合液に伝えることで反応部内の混合液の温度上昇を抑制することができるため、測定チップ内の混合液の温度上昇に起因する粒子の非特異的凝集を抑制することができる。したがって、本発明によれば、生物学的特異的凝集反応を用いて混合液中の被測定物質を迅速、簡便かつ高感度に測定または検出することができる。

以下、本明細書において「測定」とは、特定の物質の濃度や量を測定する意味だけでなく、特定の物質の有無を調べる意味も含む。すなわち、本発明の測定チップは、特定の物質を検出するための検出チップでもある。

本発明の測定チップは、試料中の被測定物質を生物学的特異的凝集反応を用いて測定するための測定チップであって、基板、一対の電極を含む反応部、外部から前記反応部内に試料液を導入する点着口、前記反応部内の気体を外部に排出する空気孔、および前記点着口または前記空気孔と前記反応部とを接続する流路を有する。本発明の測定チップは、混合液（試料液および粒子を含む液体）に電場をかける反応部の他に、混合液を保持しうる流路をさらに有することを主たる特徴とする。

基板は、その内部に反応部（後述）を有する絶縁性の板である。基板は、１の部材から構成されていてもよいが、２以上の部材から構成されていてもよい。例えば、基板は、上基板および下基板から構成されていてもよいし（図４Ｂ参照）、上基板、中間基板および下基板から構成されていてもよい（図５Ｂ参照）。測定時に反応部内の粒子の凝集状態を外部から観察するため、基板の少なくとも一部は透明性を有することが好ましい。基板の面積および厚さは、反応部、点着口、空気孔および流路を無理なく配置することができる範囲で適宜設定すればよい。

基板を構成する絶縁材料の例には、有機材料、ガラス、無機絶縁材料、半導体材料などが含まれる。有機材料の例には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカー
ボネート（ＰＣ）、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホンなどが含まれる。ガラスの例には、アルカリガラス、アルカリソーダガラス、ホウケイ酸ガラス、石英ガラスなどが含まれる。無機絶縁材料の例には、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などが含まれる。半導体材料の例には、単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などが含まれる。この中では、基板の材料はＰＥＴが好ましい。基板の材料をＰＥＴとすることで、測定チップを容易かつ安価に製造することができ、結果として生産効率を大幅に向上させることができる。

反応部は、基板内に配置された管であり、その内部に一対の対向電極を有する。反応部は、その内部に導入された混合液に電場をかけて、混合液中の粒子を直鎖状に配列させる（パールチェーン化）。一対の対向電極は、粒子をパールチェーン化させるための電極である。通常、各電極は外部の電圧印加手段と接続するための端子に接続されている。

反応部の形状は、特に限定されないが直方体状が好ましい。また、反応部の深さは、５μｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。反応部内において直径数μｍの粒子を１層に配置させることができるからである。その結果、平面視したときに粒子が重ならず、かつピントが合った状態で粒子を観察することができるため、各粒子の凝集状態を正確に計測することができる。反応部の幅および長さは、一対の対向電極を内部に配置すること、すなわち一対の対向電極と混合液とを接触させることができ、かつ、必要量の混合液を保持することができれば特に限定されない。反応部の幅は、０.１ｍｍ以上１０ｍｍ以下が好ましく、０.２ｍｍ以上１ｍｍ以下がより好ましく、０.７ｍｍ程度が特に好ましい。反応部の長さは、５ｍｍ程度が好ましい。反応部の内部表面（全部または一部）は、親水性であってもよいし、疎水性であってもよい。後述するように、反応部内には、被測定物質に特異的に結合する認識物質（例えば、抗体）が固定化された粒子が配置されていてもよい。

各電極の位置および形状は、互いに対向しており、粒子がパールチェーン化するように反応部内に電場を形成できるのであれば特に限定されない。電極間の間隔は２０μｍ以上１０００μｍ以下が好ましく、１００μｍ以上５００μｍ以下が特に好ましい。電極間の間隔が２０μｍ未満の場合、直径数μｍの粒子が数珠繋ぎ状に並ぶための領域を十分に確保することができず、電極間の間隔が１０００μｍ以上の場合、有効な電界強度を得るためには５０Ｖ以上の大きな電圧を印加しなければならない（場合によっては有効な電界強度を得られない）からである。電極の材料は、導電性を有し、かつ溶液中で交流電圧を印加しても溶解および剥離しないものであれば特に限定されない。電極の材料の例には、金、銀、白金、銅、アルミ、クロム、ニッケル、タングステンおよびこれらの合金などが含まれる。この中では、電極の材料は金が好ましい。スパッタ技術によって強固に成膜することができ、かつ交流電圧の印加に対する安定性が高いからである。

点着口は、外部から反応部内に液体（試料液または混合液）を導入するための開口部である。点着口は、反応部と直接連通しているか、流路（第１の流路）を介して連通している。点着口の形状は、反応部内に液体を導入することができれば特に限定されない。

空気孔は、点着口から反応部内に液体を導入した際に、反応部内の気体を排出するための開口部である。空気孔は、反応部と直接連通しているか、流路（第２の流路）を介して連通している。空気孔の位置および形状は、点着口から反応部内に液体を導入した際に、反応部内の気体を外部に排出することができれば特に限定されない。

流路は、基板内に配置された管であり、点着口または空気孔と反応部とを接続している。流路の数は１つであってもよいし、２つであってもよい。すなわち、本発明の測定チップは、点着口と反応部とを接続する流路（第１の流路）のみを有していてもよいし（実施の形態１参照）、空気孔と反応部とを接続する流路（第２の流路）のみを有していてもよいし、第１の流路および第２の流路の両方を有していてもよい（実施の形態２参照）。

流路は反応部に隣接しており、点着口から反応部に液体（試料液または混合液）が導入された場合、反応部だけでなく流路も混合液を保持する。したがって、電極間に交流電圧が印加され、反応部内で熱が発生しても、この熱は隣接する流路内の混合液に伝わるため、反応部内の混合液の温度上昇は抑制される。

この温度上昇の抑制効果は、反応部の体積に対する流路の体積で決定される。ここで、測定時（電圧印加時）の反応部内の混合液の温度が４５℃を超えてしまうと、粒子が非特異的に凝集し、被測定物質の測定を行うことができなくなる。したがって、流路の体積は、測定時（電圧印加時）の反応部内の混合液の温度が４５℃以下になるように設定されることが好ましい。具体的には、流路の体積は、反応部の体積の２％以上１００％以下であることが好ましく、５％以上３０％以下がより好ましく、１０％程度が特に好ましい。

流路の形状は、点着口または空気孔と反応部とを接続できれば特に限定されず、例えば直方体や円柱状であればよい。また、流路の向きは、点着口または空気孔と反応部とを接続できれば特に限定されず、基板面方向に対して水平であってもよいし垂直であってもよい。流路の幅、長さおよび深さは、流路に保持させる混合液の体積に応じて適宜設定すればよい。流路の内部表面（全部または一部）は、親水性であってもよいし、疎水性であってもよい。後述するように、流路内には、被測定物質に特異的に結合する認識物質（例えば、抗体）が固定化された粒子が配置されていてもよい。

以上の構成を有する本発明の測定チップは、電極間に電圧が印加されたときに反応部内の混合液に生じた熱が流路内の混合液に伝わるため、反応部内の混合液の温度上昇を抑制することができる。その結果、本発明の測定チップは、混合液の温度上昇に起因する粒子の非特異的凝集を抑制することができるため、被測定物質を高感度に測定することができる。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して説明する。

（実施の形態１）
実施の形態１では、点着口と反応部との間に流路（第１の流路）を有する測定チップの例を示す。

図４Ａは、実施の形態１に係る測定チップの一例を示す平面図である。図４Ｂは、図４Ａの測定チップのＡ−Ａ’線における断面図である。

図４Ａおよび図４Ｂにおいて、測定チップ１００は、上基板１０２、下基板１０４、１対の対抗電極１０６ａ，１０６ｂ、点着口１０８、流路（第１の流路）１１０、反応部１１２、空気孔１１４および端子１１６ａ，１１６ｂを有する。

上基板１０２および下基板１０４は絶縁性の基板である。上基板１０２は、下基板１０４に面する面に凹部を有する。図４Ｂに示されるように、この凹部は流路１１０および反応部１１２の一部を構成する。また、上基板１０２には、流路１１０または反応部１１２に連通する２つの孔（点着口１０８および空気孔１１４）が形成されている。反応部１１２内の粒子の凝集状態を外部から観察するため、少なくとも一方の基板の少なくとも一部
（例えば、上基板１０２の反応部１１２の上の部分）は透明性を有することが好ましい。上基板１０２および下基板１０４の大きさ（面積および厚さ）は、電極１０６ａ，１０６ｂ、点着口１０８、流路１１０、反応部１１２および空気孔１１４を無理なく配置することができれば特に限定されない。

電極１０６ａ，１０６ｂは、上基板１０２と下基板１０４との間に配置されており、反応部１１２において対向している。逆に言えば、点着口１０８と空気孔１１４とを接続する中空部のうち、電極１０６ａ，１０６ｂが配置されている部分が反応部１１２である。電極１０６ａ，１０６ｂは、それぞれ端子１１６ａ，１１６ｂに接続されている。電圧印加部のコネクタと端子１１６ａ，１１６ｂとを接続することで、電圧印加部は電極１０６ａ，１０６ｂ間に交流電圧を印加して反応部１１２内に電場を形成することができる（後述）。

電極１０６ａ，１０６ｂの膜厚は、１ｎｍ以上１０μｍ以下が好ましい。特に、スパッタを用いて電極１０６ａ，１０６ｂを形成するときは、製造時間の観点から、電極１０６ａ，１０６ｂの膜厚は、５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下が好ましく、１００ｎｍ程度が特に好ましい。電極の幅１１８ａ，１１８ｂは、任意に設定することができるが、通常は０.５ｍｍ以上５ｍｍ以下である。

電極間の間隔１２０は、２０μｍ以上１０００μｍ以下が好ましい。電極間の間隔１２０が２０μｍ未満の場合は、粒子がパールチェーン化するための領域を十分に確保できない。一方、電極間の間隔１２０が１０００μｍを超える場合は、パールチェーン化を引き起こすための有効な電界強度を得るために５０Ｖ以上の大きな電圧を印加しなければならなくなるため好ましくない。電極間の間隔１２０は、１００μｍ以上５００μｍ以下がより好ましく、５００μｍ程度であることが特に好ましい。電極間の間隔１２０は不変であるため、電圧印加部は電極１０６ａ，１０６ｂ間に印加する電圧を制御することで、反応部内に形成する電場の強度を容易に制御することができる。

点着口１０８は、流路１１０と外部とを接続する開口部である。点着口１０８の形状および大きさは、流路１１０内に液体（混合液または試料液）を導入することができれば特に限定されない。

流路（第１の流路）１１０は、点着口１０８と反応部１１２とを接続する中空部である。流路１１０の体積は、反応部１１２の体積の２％以上１００％以下が好ましく、２０％程度が特に好ましい。流路１１０の幅、長さおよび深さは、設定される体積に応じて適宜設定すればよい。流路１１０および反応部１１２の断面形状を同一形状とすることで、測定チップ１００の作製を容易にすることができる。例えば、図４Ａおよび図４Ｂに示されるように、流路１１０および反応部１１２の断面形状が同一形状（長方形）の場合、反応部の長さ（電極の長さ）１２２が５ｍｍであれば、流路の長さ１２４は０.１ｍｍ以上５ｍｍ以下が好ましく、１ｍｍ程度が特に好ましい。流路の長さ１２４とは、点着口１０８と反応部１１２との間隔を意味する。

反応部１１２は、点着口１０８と空気孔１１４とを接続する中空部のうち、電極１０６ａ，１０６ｂが配置されている部分である。前述の通り、反応部の深さ１２６は、５μｍ以上１０μｍ以下が好ましい。反応部の幅１２８は、電極１０６ａ，１０６ｂを反応部内に配置することができれば特に限定されないが、０.１ｍｍ以上１０ｍｍ以下が好ましく、０.２ｍｍ以上１ｍｍ以下がより好ましく、０.７ｍｍ程度が特に好ましい。また、反応部の長さ１２２は、５ｍｍ程度が好ましい。

空気孔１１４は、反応部１１２と外部とを接続する開口部である。空気孔１１４の形状
および大きさは、点着口１０８から反応部１１２内に混合液を導入した際に、反応部１１２内の気体を外部に排出することができれば特に限定されない。

図４Ａおよび図４Ｂに示される測定チップ１００は、例えば、１）下基板１０４上に電極１０６ａ，１０６ｂを形成する第１のステップと、２）上基板１０２に流路１１０および反応部１１２の形状に応じた凹部、ならびに点着口１０８および空気孔１１４の形状に応じた孔を形成する第２のステップと、３）上基板１０２と下基板１０４とを貼り合わせる第３のステップとから作製することができる。

第１のステップにおいて、下基板１０４上に電極１０６ａ，１０６ｂを形成する方法は、スパッタや蒸着などの薄膜堆積技術、印刷技術などの当業者に公知の技術から選択することができる。電極薄膜が薄いほど上基板１０２と下基板１０４との間の隙間を無くすことが可能であるが（図４Ｂ参照）、スパッタはこのような薄い電極薄膜を容易に形成することができるので好ましい。なお、第１のステップでは、下基板１０４の代わりに上基板１０２上に電極１０６ａ，１０６ｂを形成してもよい。

第２のステップにおいて、上基板１０２に凹部（流路１１０および反応部１１２）ならびに孔（点着口１０８および空気孔１１４）を形成する方法は、切削技術やレーザー除去技術、インプリント技術、フォトリソグラフィーなどの当業者に公知の技術から選択することができる。

第３のステップにおいて、上基板１０２と下基板１０４とを貼り合わせる方法は、当業者に公知の技術から選択することができる。

図５Ａは、実施の形態１に係る測定チップの別の例を示す平面図である。図５Ｂは、図５Ａの測定チップのＡ−Ａ’線における断面図である。

図５Ａおよび図５Ｂにおいて、測定チップ２００は、上基板１０２、中間基板２０２、下基板１０４、１対の対抗電極１０６ａ，１０６ｂ、点着口１０８、流路１１０、反応部１１２、空気孔１１４および端子１１６ａ，１１６ｂを有する。測定チップ２００では、上基板１０２に凹部を形成する代わりに、中間基板２０２を上基板１０２と下基板１０４との間に挟ませることで、流路１１０および反応部１１２が形成される。上基板１０２および中間基板２０２以外の構成要素は、図４Ａおよび図４Ｂに示される測定チップ１００の構成要素と同じである。

測定チップ２００では、中間基板２０２の面積および厚さを調整することで、流路１１０および反応部１１２の面積および深さを容易に制御することができる。また、平板状の上基板１０２を使用することができる。さらに、その両面が接着性または粘着性を有する基板を中間基板２０２として用いることで、上基板１０２、中間基板２０２および下基板１０４を容易に貼り合わせることができる。このように、図５Ａおよび図５Ｂに示される測定チップ２００は、製造効率の観点から優れている。

図５Ａおよび図５Ｂに示される測定チップ２００は、例えば、１）下基板１０４上に電極１０６ａ，１０６ｂを形成する第１のステップと、２）上基板１０２に点着口１０８および空気孔１１４の形状に応じた孔を形成する第２のステップと、３）上基板１０２と中間基板２０２と下基板１０４とを貼り合わせる第３のステップとから作製することができる。なお、図８（実施例１）に示されるような測定チップを作製する場合は、第２のステップにおいて点着口１０８および空気孔１１４を形成する必要はない。すなわち、第２のステップは任意のステップである。

次に、上記構成を有する測定チップ１００（または測定チップ２００）を用いて被測定物質を測定するための測定装置について説明する。

図６は、測定装置の構成を示す模式図である。図６に示されるように、測定装置３００は、撮像部３０２、制御解析部３０４および電圧印加部３０６を有する。測定装置３００は、測定チップ１００の反応部１１２内の粒子の凝集状態を観察して、被測定物質を測定する。

撮像部３０２は、測定チップ１００の反応部１１２内の画像を撮像する。撮像部３０２は、動画を撮像してもよいし静止画を撮像してもよい。得られた画像は、制御解析部３０４に出力される。撮像部３０２は、例えばＣＣＤカメラである。

制御解析部３０４は、撮像部３０２および電圧印加部３０６の動作を制御するとともに、撮像部３０２が撮像した画像を解析して測定チップ１００の反応部１１２内に存在する粒子の凝集率を算出する。

電圧印加部３０６は、コネクタ３０８を介して測定チップ１００の電極１０６ａ，１０６ｂに接続されており、制御解析部３０４の制御の下で電極１０６ａ，１０６ｂ間に交流電圧を印加して反応部１１２内に電場を形成する。

次に、上記構成を有する測定チップ１００（または測定チップ２００）および測定装置３００を用いて被測定物質を測定する方法について説明する。

［第１のステップ］
第１のステップでは、被測定物質に特異的に結合する認識物質をその表面に固定化されている粒子を準備する。

認識物質を固定化される担体粒子の種類は、特に限定されない。担体粒子の例には、ラテックス粒子、ベントナイト、カオリン、金コロイド、赤血球細胞、ゼラチン、リポソームなどが含まれる。この中ではラテックス粒子が好ましい。ラテックス粒子は、凝集反応を利用した測定方法で一般に使用されているものから選択されうる。ラテックス粒子の例には、ポリスチレン系ラテックス粒子、ポリビニルトルエン系ラテックス粒子、ポリメタクリレート系ラテックス粒子などが含まれる。ラテックス粒子は、官能基モノマー（−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＳＯ_３など）が共重合して導入されていてもよい。

例えば、担体粒子がラテックス粒子の場合、担体粒子の直径（平均粒径）は、０.５μｍ以上１０μｍ以下が好ましく、１μｍ以上５μｍ以下がより好ましく、２μｍ以上３μｍ以下が特に好ましい。担体粒子の直径が０.５μｍ未満だと、後述する第３のステップにおいて粒子に十分な誘電泳動力を作用させることができず、粒子をパールチェーン化させにくくなる。また、担体粒子の直径が１０μｍを超えると、後述する第４のステップにおいて凝集していない修飾粒子がブラウン運動により混合液中に分散しにくくなる。担体粒子の直径（平均粒径）は、例えば、光学顕微鏡を用いて観察したり、コールターカウンターを用いて電気抵抗を測定したり、光散乱法で散乱光変化量を測定したりすることで測定することができる。

担体粒子に固定化される認識物質は、被測定物質に特異的に結合しうる物質であれば特に限定されない。認識物質の例には、抗体や核酸、酵素、補酵素（例えば、ビオチン）、レクチン、糖タンパク質、ヘムやポルフィリンなどの有機合成物などが含まれる。これらの認識物質を担体粒子に固定化する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、抗体を担体粒子（例えば、ラテックス粒子）に固定化する場合
、疎水性相互作用を利用した物理吸着や、アミノ基やスルフヒドリル基などを利用した化学修飾などを用いることができる。

［第２のステップ］
第２のステップでは、試料と第１のステップで準備した粒子を含む混合液を調製する。

試料は、特に限定されず、測定対象や測定目的などに応じて適宜選択すればよい。試料の例には、血液、血漿、血清、それらの希釈物、所定の濃度の塩を含む電解質溶液などが含まれる。

混合液は、抗原抗体反応などの生物学的特異的凝集反応を安定化させる観点から、塩を適量含むことが好ましい。多量の塩を含むと混合液の導電率が上昇し、交流電圧を印加したときに熱が発生する可能性がある。前述の通り、混合液の濃度が上昇すると、粒子が非特異的に凝集して測定できない可能性があるが、本発明の測定チップを用いることでこの問題を回避することができる。

混合液の調製方法は、特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、第１のステップで粒子を懸濁液として準備した場合は、試料にその懸濁液を適量加えて攪拌し、さらに必要に応じてｐＨを調整すればよい。また、第１のステップで粒子を固形物（例えば、上記懸濁液の凍結乾燥物や風乾乾燥物など）として準備した場合は、その固形物に試料液を適量加えて攪拌し、さらに必要に応じてｐＨを調整すればよい。

混合液中の粒子の濃度は、例えば粒子がラテックス粒子の場合は、０.０１重量％以上１重量％以下が好ましく、０.１重量％以上０.５重量％以下がより好ましく、０.４重量％程度が特に好ましい。混合液中の粒子の濃度が高いほど、パールチェーンが形成されやすくなり、凝集反応が促進されるが、反応部１１２において粒子が重なりやすくなり、粒子の凝集状態を正確に観察することが困難となるからである。混合液中の粒子の濃度が高いほど、被測定物質が存在しない場合であっても粒子の凝集度が大きくなる傾向がある。

［第３のステップ］
第３のステップでは、第２のステップで調製した混合液を測定チップ１００の反応部１１２内に導入し、反応部１１２内に交流電場を形成して、粒子をパールチェーン化させる。

混合液を点着口１０８から反応部１１２内に導入すると、流路１１０および反応部１１２が混合液で満たされ、混合液は電極１０６ａ，１０６ｂと接触する。また、流路１１０および反応部１１２では、粒子が混合液中で均一に分散された状態となる。

混合液に外部電場を与えると、担体粒子内で双極子が誘起され、この双極子の相互作用により粒子が泳動し（誘電泳動）、粒子が電界方向と並行に一列に並ぶ（パールチェーン化）。このとき、混合液内に被測定物質が存在すれば、粒子は被測定物質を介して他の粒子に会合するため、複数の粒子が凝集する。

測定チップ１００の反応部１１２（または流路１１０）内には、第１のステップで準備した粒子を予め配置しておいてもよい。すなわち、混合液を調製する第２のステップが、反応部１１２（または流路１１０）内で行われてもよい。例えば、粒子を含む固形物（粒子懸濁液の凍結乾燥物や風乾乾燥物など）を予め流路内に配置しておくことで、試料液を点着口１０８から流路１１０および反応部１１２内に導入するのみで第２のステップを終えることができ、被測定物質の測定をより簡便に行うことができる。

電極１０６ａ，１０６ｂ間に印加する交流電圧の波形は、正弦波、矩形波、方形波、三角波などであればよく、連続波でもパルス波でもよい。また、周波数は、特に限定されないが、１０ｋＨｚ以上１０ＭＨｚ以下であることが好ましい。周波数が１０ｋＨｚ未満または１０ＭＨｚ以上の場合、混合液が発熱してしまい、測定を十分に行うことができない。

電極１０６ａ，１０６ｂ間に印加する交流電圧の電界強度は、５Ｖ／ｍｍ以上５０Ｖ／ｍｍ未満であることが好ましい。電界強度が５Ｖ／ｍｍ以下だと、パールチェーン化が生じにくくなり、凝集反応を十分に促進させることができない。一方、電界強度が５０Ｖ／ｍｍを超えると、混合液の発熱により気泡が発生し、測定を行うことができない。

交流電圧を印加すると、反応部１１２内で熱が発生する。流路１１０を有しない従来の測定チップでは、この熱により反応部１１２内の混合液の温度が著しく上昇していた。一方、流路１１０を有する本発明の測定チップ１００では、反応部１１２内で発生した熱が流路１１０内の混合液に伝わるため、反応部１１２内の混合液の温度上昇を抑制することができる（実施例参照）。交流電圧を印加しているときの混合液の温度は、３℃以上４５℃以下が好ましく、２０℃以上３５℃以下がより好ましく、３３℃程度が特に好ましい。混合液の温度が４５℃を超えると、粒子が非特異的に凝集して、被測定物質の測定を行うことができなくなる。

［第４のステップ］
第４のステップでは、交流電圧の印加を停止した後に、粒子の凝集状態を観察する。

交流電圧の印加を停止すると、凝集していない粒子はブラウン運動により混合液中に分散するが、特異的結合により凝集した粒子は凝集した状態が維持される。粒子の凝集状態は被測定物質の濃度に応じて変化する。したがって、粒子の凝集度を求めることにより、被測定物質の有無を検出したり濃度を測定したりすることができる。

凝集度の算出方法は、特に限定されず観察方法（装置）に応じて適宜選択すればよい。例えば、測定装置３００の撮像部３０２で混合液中の粒子の凝集状態を撮像し、得られた画像から制御解析部３０４において凝集している粒子の数から凝集度を算出すればよい。粒子の凝集度は、例えば以下の式により算出することができる。

凝集度（％）＝（凝集している粒子の数）／（すべての粒子の数）×１００

凝集度は、粒子の個数ではなく、粒子の面積を指標として算出することもできる。粒子の凝集度は、例えば以下の式によっても算出することができる。

凝集度（％）＝（凝集している粒子の面積）／（すべての粒子の面積）×１００

以上のように、実施の形態１の測定チップは、電極間に電圧が印加されたときに反応部内の混合液に生じた熱が第１の流路内の混合液に伝わるため、反応部内の混合液の温度上昇を抑制することができる。したがって、実施の形態１の測定チップは、混合液の温度上昇に起因する粒子の非特異的凝集を抑制することができ、結果として被測定物質を高感度に測定することができる。

（実施の形態２）
実施の形態２では、点着口と反応部との間だけでなく、反応部と空気孔との間にも流路
（第２の流路）を有する測定チップの例を示す。

図７は、実施の形態２に係る測定チップを示す平面図である。

図７において、測定チップ４００は、上基板１０２、下基板１０４、１対の対抗電極１０６ａ，１０６ｂ、点着口１０８、第１の流路１１０、反応部１１２、第２の流路４０２、空気孔１１４および端子１１６ａ，１１６ｂを有する。実施の形態２の測定チップ４００は、実施の形態１の測定チップ１００とほぼ同じ構成であるが、第２の流路４０２を有する点が異なる。第２の流路４０２以外の構成要素は、実施の形態１の測定チップの各構成要素と同じため、同一の符号を付し、説明を省略する。

第２の流路４０２は、反応部１１２と空気孔１１４とを接続する中空部である。第２の流路４０２の体積は、反応部１１２の体積の２％以上１００％以下が好ましく、２０％程度が特に好ましい。第２の流路４０２の幅、長さおよび深さは、設定される体積に応じて適宜設定すればよい。反応部１１２および第２の流路４０２の断面形状を同一形状とすることで、測定チップ４００の作製を容易にすることができる。例えば、図７に示されるように、反応部１１２および第２の流路４０２の断面形状が同一形状（長方形）の場合、反応部の長さ（電極の長さ）１２２が５ｍｍであれば、第２の流路の長さ４０４は０.１ｍｍ以上５ｍｍ以下が好ましく、１ｍｍ程度が特に好ましい。第２の流路の長さ４０４とは、反応部１１２と空気孔１１４との間隔を意味する。なお、第１の流路１１０および第２の流路４０２は、同一の幅、長さおよび深さである必要はない。

実施の形態２の測定チップ４００は、実施の形態１の測定チップ１００と同様の手順で作製することができる。また、実施の形態２の測定チップ４００は、実施の形態１の測定チップ１００と同様の手順で被測定物質の測定に用いることができる。

以上のように、実施の形態２の測定チップは、電極間に電圧が印加されたときに反応部内の混合液に生じた熱が第１の流路および第２の流路内の混合液に伝わるため、反応部内の混合液の温度上昇を抑制することができる。したがって、実施の形態２の測定チップは、混合液の温度上昇に起因する粒子の非特異的凝集を抑制することができ、結果として被測定物質を高感度に測定することができる。

第２の流路を有しない測定チップでは、混合液が空気孔から外部に流出しないため、空気孔付近の粒子の密度が時間の経過とともに上昇していた。粒子の密度が上昇すると、粒子が重なってしまい、凝集していない粒子を凝集している粒子と誤認する可能性がある。この誤認は測定誤差の要因となるため、第２の流路を有しない測定チップを用いて測定を行う場合は、空気孔からある程度離れた領域で粒子の凝集状態を観察する必要があった。

一方、実施の形態２の測定チップでは、反応部と空気孔との間に第２の流路を有するため、反応部の空気孔側の端部でも粒子の密度が上昇せず、反応部内で粒子が均一に分散する。したがって、実施の形態２の測定チップを用いることで、第２の流路（空気孔）に近い領域でも粒子の凝集状態を観察することができ、観察場所を自由に設定することができる。

以下、本発明を実施例を参照してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。

（実施例１）
実施例１では、実施の形態１の測定チップ（第１の流路のみを有する測定チップ）を用
いて、反応部内の溶液の温度と粒子の非特異的凝集との関係を調べた例を示す。

１．測定チップの作製
本実施例では、図８に示す本発明の測定チップ（実施例１の測定チップ）と、図９に示す流路を有しない従来の測定チップ（比較例の測定チップ）を作製した。

（１）実施例１の測定チップの作製
下基板１０４として、厚さ０.１ｍｍの清浄なホウケイ酸ガラス（Ｄ−２６３、SCHOTT社）を用意した。電極１０６ａ，１０６ｂおよび端子１１６ａ，１１６ｂのパターンを有するステンシルマスク（ステンレス製）を通してスパッタして、ガラスと金との密着性を向上させるためのクロム薄膜（膜厚５ｎｍ）を下基板１０４上に形成した。次いで、同じステンシルマスクを通してスパッタして、クロム薄膜の上に電極１０６ａ，１０６ｂおよび端子１１６ａ，１１６ｂとなる金薄膜（膜厚９５ｎｍ）を形成した。長辺が対向するように配置された１対の矩形電極１０６ａ，１０６ｂ（幅１ｍｍ、長さ５ｍｍ）間の間隔は０.５ｍｍとした。

上基板１０２として、下基板と同じホウケイ酸ガラスを用意した。上基板１０２の大きさは、幅５.５ｍｍ、長さ５.５ｍｍとした。

中間基板２０２として、第１の流路１１０および反応部１１２のパターンを有する両面粘着シート（Ｎｏ.５６０１、日東電工株式会社）を用意した。このシートは、ＰＥＴ製基材の両面にアクリル系の粘着剤が付いており、総厚１０μｍである。第１の流路１１０および反応部１１２の幅は０.７ｍｍとした。第１の流路１１０の長さは０.５ｍｍとし、反応部１１２の長さは５ｍｍとした。点着口１０８および空気孔１１４の大きさは、幅０.７ｍｍ、長さ１ｍｍとした。

反応部１１２が電極１０６ａ，１０６ｂ間に位置するように中間基板２０２を下基板１０４上に貼りあわせ、さらにこの中間基板２０２上に上基板１０２を貼りあわせた。このとき、上基板１０２の端と電極１０６ａ，１０６ｂの端子側の端とが合うように上基板１０２を中間基板２０２上に貼りあわせることで、第１の流路１１０を形成した（図８参照）。

（２）比較例の測定チップの作製
上記実施例１の測定チップと同様の手順により比較例の測定チップを作製した。比較例の測定チップは、第１の流路を有さず、点着口１０８と反応部１１２とが直接接続している点が実施例１の測定チップと異なる。下基板１０４上の矩形電極１０６ａ，１０６ｂの大きさおよび位置は、実施例１の測定チップと同様である。反応部１１２の幅は０.７ｍｍとし、反応部１１２の長さは３ｍｍとした（図９参照）。

２．反応部内の溶液の温度および凝集度の測定
平均直径２μｍのラテックスビーズ（Bangs Laboratories社）を担体粒子として用意し、抗ＣＲＰポリクローナル抗体をその表面に固定化した。抗体を固定化された粒子を緩衝液（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム，２０ｍＭ グリシン，０.１％ ＢＳＡ，ｐＨ８.６）に希釈して、粒子懸濁液（粒子０.４重量％）を調製した。

測定チップの電極間に印加する電圧ならびにその周波数および波形を制御するべく、波形発生器（３３１２０Ａ；Hewlett Packard社）および電力増幅アンプ（４０５５；株式会社エヌエフ回路設計ブロック）を電圧印加部として測定チップの端子に接続した。

粒子懸濁液１μＬを測定チップの点着口から反応部内に導入し、測定チップの１対の電
極間に交流電圧（３０Ｖ、１００ｋＨｚ）を６０秒間印加して、粒子をパールチェーン化させた。電圧の印加を停止してから６０秒後に、倒立顕微鏡（オリンパス株式会社）を用いて反応部内を透過光観察し、反応部内の透過光画像を３枚撮像した。実施例１の測定チップおよび比較例の測定チップともに、反応部の深さが１０μｍのため、粒子が反応部内で２層に重なることなく、かつ粒子が顕微鏡の焦点から外れることもなく、粒子を明瞭に観察することができた。実施例１の測定チップおよび比較例の測定チップともに、交流電圧を印加している間は、反応部内で粒子がパールチェーン化しているのが観察された。

反応部内における粒子の凝集度は、以下の式により求めた。実施例１の測定チップおよび比較例の測定チップそれぞれについて、３枚の画像のそれぞれから算出された凝集度の平均値を代表値とした。溶液に含まれる抗原の濃度が極めて低いため、粒子の凝集度は低いと予想される。

凝集度＝（凝集している粒子の面積）／（すべての粒子の面積）×１００（％）

また、電圧の印加を停止してから６０秒後に、測定チップの上方に配置されたサーモビューワ（ＴＨ９１００、ＮＥＣ三栄株式会社）を用いて反応部内の温度を測定した。

表１は、実施例１の測定チップおよび比較例の測定チップの反応部内の溶液の温度および凝集度を示す表である。

比較例の測定チップでは、電圧を印加することにより溶液の温度は６２℃まで上昇した。反応部内では粒子がパールチェーン化するのが観察されたが、同時に溶液の蒸発および突沸様の気泡の発生が観察された。電圧の印加を停止した後、一部の粒子がパールチェーン化した状態のまま反応部に固着しているのが観察された。結果として、凝集度は８０％と非常に高い値となった。

一方、実施例１の測定チップでは、電圧を印加しても溶液の温度は３０℃までしか上昇しなかった。反応部で発生した熱が第１の流路内の溶液に伝わったため、反応部内の溶液の温度上昇を抑制できたと考えられる。電圧の印加を停止した後、パールチェーン化した粒子の多くが再度分散するのが観察された。結果として、凝集度は２３％と低い値となった。

以上のように、流路を有しない従来の測定チップ（比較例の測定チップ）では、溶液の温度上昇に起因する粒子の固着化が生じるため、抗原抗体反応などの生物学的特異的凝集反応を利用した測定を高い精度で行うことはできないと考えられる。一方、流路を有する本発明の測定チップ（実施例１の測定チップ）では、粒子の固着化が生じないため、生物学的特異的凝集反応を利用した測定を高い精度で行いうると考えられる。

（実施例２）
実施例２では、実施の形態２の測定チップ（第１の流路および第２の流路を有する測定チップ）を用いて、各種炎症のマーカータンパク質とされるＣ反応性タンパク質（以下「ＣＲＰ」という）を測定した例を示す。

１．測定チップの作製
本実施例では、上記実施例１の測定チップと同様の手順により、図１０に示す本発明の測定チップ（実施例２の測定チップ）を作製した。実施例２の測定チップは、第１の流路１１０だけでなく第２の流路４０２も有する点が実施例１の測定チップと異なる。下基板１０４上の矩形電極１０６ａ，１０６ｂの大きさおよび位置は、実施例１の測定チップと同様である。また、第１の流路１１０および反応部１１２の幅、長さおよび深さも、実施例１の測定チップと同様である。第２の流路４０２は、幅０.７ｍｍ、長さ０.５ｍｍ、深さ１０μｍとした。第２の流路４０２を設けるため、上基板１０２の大きさは、幅５.５ｍｍ、長さ６.０ｍｍとした。

２．反応部内の溶液の温度および凝集度の測定
実施例１と同様の手順により、電圧を印加した後の反応部内の混合液の温度および凝集度を測定した。

表２は、実施例２の測定チップの反応部内の溶液の温度および凝集度を示す表である。

実施例２の測定チップでは、電圧を印加しても溶液の温度は２９℃までしか上昇しなかった。反応部で発生した熱が第１の流路および第２の流路内の溶液に伝わったため、反応部内の混合液の温度上昇を抑制できたと考えられる。電圧の印加を停止した後、パールチェーン化した粒子の多くが再度分散するのが観察された。結果として、凝集度は２２％と低い値となった。

また、反応部のすべての領域において粒子が均一に分散しており、第２の流路に近い領域でも十分に観察することができた。

３．ＣＲＰの測定
平均直径２μｍのラテックスビーズ（Bangs Laboratories社）を担体粒子として用意し、抗ＣＲＰポリクローナル抗体をその表面に固定化した。抗体を固定化された粒子を緩衝液（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム，２０ｍＭ グリシン，０.１％ ＢＳＡ，ｐＨ８.６）に希釈して、粒子懸濁液を調製した。

ＣＲＰ（抗原）を緩衝液（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム，２０ｍＭ グリシン，０.１％ ＢＳＡ，ｐＨ８.６）に溶解させて試料溶液とした。試料溶液と粒子懸濁液とを室温で９０秒間混合し、ＣＲＰの濃度が異なる４種類の混合液を調製した。粒子の濃度は、いずれも０.４重量％とした。ＣＲＰの濃度は、４.７×１０^−６Ｍ、４.７×１０^−８Ｍ、４.７×１０^−１０Ｍ、０Ｍのいずれかとした。

混合液１μＬを実施例２の測定チップの点着口から反応部内に導入し、測定チップの１対の電極間に交流電圧（３０Ｖ、１００ｋＨｚ）を６０秒間印加して、粒子をパールチェーン化させた。電圧の印加を停止してから６０秒後に、反応部内における粒子の凝集度を求めた。

図１１は、各混合液における粒子の凝集度を示すグラフである。このグラフに示されるように、本発明の測定チップ（実施例２の測定チップ）を用いることで、反応部内の混合
液の温度上昇を抑制することができ、短時間で抗原抗体反応による粒子の凝集を確認することができた。

以上のように、流路を有する本発明の測定チップを用いることで、非常に短時間（３分）で簡便かつ高感度に被測定物質を測定することができる。

本出願は、２００７年９月３日出願の特願２００７−２２７７５４に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。

本発明の測定チップは、試料中の被測定物質を迅速、簡便かつ高感度に測定することができるので、例えば、生体試料、特に血液などに含まれるタンパク質などの生体構成成分を分析する測定チップとして有用である。本発明の測定チップは、例えば、血液試料に含まれるタンパク質や健康指標物質などを測定するＰＯＣＴ診断バイオセンサなどの用途にも応用することが可能である。

図１Ａは従来の測定チップの断面図であり、図１Ｂは従来の測定装置の構成を示す模式図である。 従来の測定チップの電極部分の拡大図である。 従来の測定チップの平面図である。 図４Ａは本発明の実施の形態１に係る測定チップの一例の平面図であり、図４Ｂは本発明の実施の形態１に係る測定チップの一例の断面図である。 図５Ａは本発明の実施の形態１に係る測定チップの別の例の平面図であり、図５Ｂは本発明の実施の形態１に係る測定チップの別の例の断面図である。 本発明の測定装置の構成を示す模式図である。 図７は本発明の実施の形態２に係る測定チップの平面図である。 実施例１の測定チップの平面図である。 比較例の測定チップの平面図である。 実施例２の測定チップの平面図である。 実施例２の測定結果を示すグラフである。

Claims (6)

1. 一対の対向電極間に交流電圧を印加して、試料中の被測定物質を生物学的特異的凝集反応を用いて測定する測定チップであって、
   基板と、
   前記基板内に配置され、一対の対向電極を含む管状の反応部と、
   外部から前記反応部内に試料を導入する点着口と、
   前記反応部内の気体を外部に排出する空気孔と、
   前記点着口と前記反応部とを接続する管状の流路と、
   を有する測定チップ。
2. 前記反応部と前記空気孔とを接続する管状の第２の流路をさらに有する、請求項１に記載の測定チップ。
3. 前記流路の体積は、前記反応部の体積の２〜１００％の範囲内である、請求項１に記載の測定チップ。
4. 前記第２の流路の体積は、前記反応部の体積の２〜１００％の範囲内である、請求項２に記載の測定チップ。
5. 前記被測定物質に特異的に結合する認識物質を固定化された粒子を、前記流路内または前記反応部内にさらに有する、請求項１に記載の測定チップ。
6. 前記認識物質は、前記被測定物質に特異的に結合する抗体である、請求項５に記載の測定チップ。

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