JPS6113135A - 反応相手の測定法およびそのための装置 - Google Patents

反応相手の測定法およびそのための装置

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JPS6113135A
JPS6113135A JP13095485A JP13095485A JPS6113135A JP S6113135 A JPS6113135 A JP S6113135A JP 13095485 A JP13095485 A JP 13095485A JP 13095485 A JP13095485 A JP 13095485A JP S6113135 A JPS6113135 A JP S6113135A
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reaction
area
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precipitation
measuring
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JP13095485A
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ペーター・グロンスキー
テオドール・クランツ
ハンス‐ヨーアヒム・フインク
フランツ・ラツペ
カール‐オツトー・マーガークルト
ロタール・ポスト
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Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
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Behringwerke AG
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    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/82Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a precipitate or turbidity
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5302Apparatus specially adapted for immunological test procedures
    • G01N33/5304Reaction vessels, e.g. agglutination plates

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は凝集および沈殿形成の下に進行する反応の相手
を検出および測定するための光学的方法ならびにそれに
適する装置に関する。
血清学的問題には、反応の相手が懸濁液の種種の相に属
する分析法が用いられる。従ってこれは例えば溶解され
た反応体の多重結合性のようなある種の物理化学的条件
の下に特徴的に進行する粒子沈殿(例えば凝集)であり
うる。その際通常血球膜の部分構造(直接凝集)または
例えばこれらの膜に化学結合した、本来は存在しない基
(間接凝集)が固相の反応相手であり、一方これら部分
構造または基と特異的に反応する抗体は溶解された相中
に存在する。相分配は逆であることもできる。
血清学的研究に通常用いられる血球またはラテックス粒
子のような非常に多数の小粒子の凝集は懸濁液の変化を
来し、これは約200μtの反応混合物中子らなスライ
ド上で視認により識別されそして半定量的に評価されつ
る。
他の場合には血球と溶解された反応体との反応は細胞の
溶解を来し、従って視認による評価が同様に可能である
その上に2〜6種の反応混合物が並存して置かれそして
評価されつる平たいスライドの代りに、反応混合物を収
容するための凹みを含有する微量画定プレートが近年用
いられる。かかるプレートにおいては多数の試料が取扱
われつる。
微量滴定プレートにより数回の希釈段階における測定も
可能であり、従ってイエス/ノー表現における定性的評
価が「半定量的」に「力価段階」の形で遂行されつる。
実験方法の如何に応じ凹面の底部を倫えた反応容器の形
態が選択されるべきである。プレートを軽くゆすって動
かすことにより平たい、球欠形のくぼみ中で反応容量物
が混合されつる。
円錐形または半球形の底部を有する深い小つぼではプレ
ートは烈しく混合したのちに動かさずに放置される。
視認による評価では沈降した血球またはラテックス粒子
の「型(パターン)」が透明な下地の上で評価される。
主観的基準により型の変遷が視認できる(第1図参照)
領域から、「力価段階」として希釈度が測定され、そこ
では評価された基準が徐々に明白に示されるゆえに溶解
された反応体の相対的含量が測定されつる。かかる評価
の正確さは用いられた希釈装置の容量−再現性を顧慮せ
ずそして評価が1人の人物によりとり行われる場合は±
1力価段階である。
沈降した粒子の型は使用された微量滴定プレートの型式
の如何に応じ相違し、それにより評価基準も異なる。溶
解試験(第2図)においてはなお無傷の細胞の量が評価
されそして希釈の結果とし7て著明となった凸状隆起お
よび完全な溶解が測定される一方で、凝集反応物では特
別の型が生成しく第1図参照)、このものは(完全な凝
集の場合)細胞ローン(cell ]、a、wn )と
してまたは(凝集反応の反応体欠如の場合)環形成また
は凸状隆起として評価されうろ。
図面について説明すれば次のとおりである。
第1図:微量滴定プレート中の間接的血球凝集(赤血球
に結合した破傷風トキソイド(TT)//ヒト抗−TT
 −1gG−抗体) a)系列A(小つぼ1〜12)は完全な凝集を示す。
b)系列Bは小つぼ1〜10の抗体濃度が直線状に減少
する場合の凝集の結果を示す。
第2図:微量滴定プレートにおける溶血検定。
系列AおよびBにおいては小つぼ1がら12繁で減少し
ゆく濃度の異なる量の免疫複合体を含有する2種類の溶
液をそれぞれ一定量の人間の血清(補体縣)とインキュ
ベーションした(67℃、1時間)。次に小つぼ1個当
り限定された量の赤血球および抗−赤血球−抗体溶液を
加えそして放置した(0.5時間、67℃)。免疫複合
体濃度が充分に低い場合、残留する残余補体活性は不完
全な(系列A 小つぼ8〜10、 系列B 小つぼ7〜
10)または完全な(系列AおよびB小つぼ11および
12)赤血球の溶解を惹き起す。系列A 小つぼ1〜7
またけ系列B小つぼ1〜6では何ら溶解が観察されない
、何故なら全部の補体が消費されたからである。
球状の底部を有する微量滴定プレート中の溶解試験およ
び凝集反応物の評価はこの基準に従い広く視認により行
われ、その際主観による誤差および強い方法上の分散ゆ
えに精度(正確さ)および再現性(精確さ)は定量的方
法に通常受容しつる範囲の外にある。
血清型を証明するための知られた装置を用いる方法(J
P−A−123909/79およびDO8DE−A−3
033870号)においては「陽性」および「陰性」反
応を区別するために特別の形態をした底部を有する小管
が利用され、それにより異なる「凝集型」が生成する。
血球と抗体との間に特異的な反応が欠落している場合は
、小管のくぼんだ部分中に細胞を滑らすことによりいわ
ゆる「蓄積型」が生成し、一方陽性反応後には「凝集型
」が生成する。その際凝集、すなわち血球相互の交叉結
合、の結果として滑りが妨げられる。
測定は知られた装置中で検出器の光電流が/J%管底部
を点状に走査する際に1直径に沿って」代表的な曲線を
猷1録器上に呈示することで自動的に行われる。凝集の
際は小管の底の中央領域中にわずかな光の弱化のみを有
する曲線が生じ、一方「陰性」反応では滑らされた細胞
の蓄積が光の弱化を強める。この方法で定性的評価(イ
エス−ノー評価)のみが「部分的凝集(半蓄積型)」に
おいて徐々に相くのみ一段階で区別されつる。
それゆえに本発明は特に免疫反応の凝集型を定量的に評
価するための方法を提供するという課題を何し、ていた
定量的な分析目的のためのこの課題の解決に必要な精度
は、驚くべきことに沈殿型が表出されそして輪郭が感光
性センサー上に電気光学的に捕捉されることによる環に
閉じられた面積の直接的積分により達成されつる(第6
図参照)。
それゆえに本発明は凝集反応の沈殿により限定された面
積を直接測定しそしてそのものから免疫学的反応相手の
量または活性を定量的に測定することを特徴とする凝集
による反応の相手−の光学的検出および測定法に関する
。反応相手め量せたは活性は面積の大きさの単調に成育
する函数であるので、それゆえこれは可能である。
この方法においては定量的に測定すべき反応相手の数回
の限定された希釈度が用いられるのが好ましい。
反応相手は溶解された状況においてそして他のものは溶
解されたかまたは粒子に結合して存在しつる。さらに反
応には1種またはそれ以上の活性な補体成分が関与しつ
る。
好ましい実施形においては沈殿を凹形に湾曲した底部を
有する1容器中に形成させつる。
ここに記載した方法のための測定装置はその上を微量滴
定プレートが光線の進路により連続的に動かされるか、
または光学装置である光源/レンズ/検出器が固定され
た微量滴定プレートの上を連続的に動かされる、レンズ
および十字を備えた光源から簡単に成りつる。画面中に
鮮明に調整された沈降物の明−暗の輪郭が感光性検出器
により捕捉されそしてコンピューターにより評価される
それゆえに本発明はさらにa)光源(1)、b)照明レ
ンズ(2)、C)ピンホール隔壁(6)、d)物体(4
)、e)写像レンズ(5)およびf)画面中の数個の直
線状に配置された検出器からなるセンサー(6)、から
なる順序における二次元物体の面積を定量的に測定する
ための光学的装置であって、物体またはセンサーのいず
れかが光軸に対し可動性垂直に配置され(第6図参照)
、従って移動に際し沈殿の総面積が捕捉される装置にも
関する。
光学的装置はその生成に例えば抗原分子、抗体分子およ
び場合により1種類またはそれ以上の活性な補体成分が
関与する凝集型の定量的測定に好都合に使用されつる。
この装置は、センサー受機上に多数の検出器を用いるこ
とにより、半球形状底部を有する小管中のインキュベー
ション反応物を振動なしで放置する際非常に感度良い方
法で生成する一連の環型の総面積が捕捉されることで非
常に正確な定量的評価が可能である。本発明による装置
での第一次測定値としての直接的面積捕捉のためのこの
特別法は、微量滴定プレートの写真露出からの沈殿環の
直径(下記参照)が抗原または抗体濃度の尺度として測
定される知られた方法(BE−PS 1549921号
、US−PS 4193981号、およびDE−A−2
744028号)とは相異する。
定量的分析目的に必要なここに記載される方法の再現性
は一部は沈殿面積の前記した測定技術による捕捉により
達成される。しかしながらプレートからプレートへそし
て日から日への客観的および比較しつる捕捉についての
前提条件は、さらに客観的検出可能性である、その場合
測定を目的物、すなわち微量滴定プレート自身でとり行
いつるという点に特別な利点が存在する。写真露出のネ
ガティブまたはポジティブでの直径の測光的測定(BE
−PS 1549921号)は露出、照明、現像条件(
浴温、浴濃度、現像時間)の如何に応じ生成する写真材
料の黒化の相異により分散過誤が拡大される。その上定
量的分析方法にとっての前提条件は比較的長時間にわた
る再現性であり、これは不可欠な試薬として用いられろ
赤血球の調製が充分に再現性がある場合にのみ血球凝集
法にとって可能であり、他の前記宴れた方法では考慮さ
れてない前提条件である(BE−PS 1549921
号参照)。
前記した方法および装置により例えば免疫複合体形成へ
の補体系の影響を定量的に捕捉することが可能である。
これは微量滴定プレートにおいて実施される従来慣用の
粒子沈殿を用いては可能でなかった。従って例えば破傷
風トギンイド(TT)とヒトの工gG種類の抗−TT−
抗体(ATTA)からなる抗体過剰範囲にある免疫複合
体は機能的に活性な補体の存在下または非存在下(56
℃に1時間加熱することによる補体不活性化)反応体を
67℃で半時間インキュベーションすることにより調製
できそして反応混合物をその直後前記した方法に従い分
析することができる、従って驚くべきことに、補体に影
響された免疫複合体形成は活性の凝集を付加的に惹起し
つる。それゆえ補体活性を機能的に検査する新しい可能
性が生ずる。従って例えば病理学的に変化した血清(あ
る種の補体欠乏状況または機能障害)の判定において診
断上助けとなりうる情報か入手しつる。他方では抗原と
結合した状況において袖体系と相互作用するそれらの能
力、すなわちそれらの機能的判定にとって重要な基準、
に関し抗体製剤を比較調査する可能性も当然存在する。
何ら抗原−抗体反応が基礎になっていない粒子沈殿が前
記したような方法および装置を用いて評価きれつる沈降
型を生成しうることも同様に考えられつる。
以下の実施例により本発明について説明する。
実施例 1 初めに、新鮮なヒトの血清475μt、抗−破傷風トキ
ンイドー1gG−溶液<pBS、田Z2.714工U/
mf ) 175 tttおよび破傷風トキソイド溶液
(PBS、 PH7,2,1[]Lf/m/)100μ
tを67℃で1時間インキュベーションスル。
その直後に反応混合物の種々の希釈物(PBS、pH7
,2>50μtずつを破傷風トキソイドを層積させた去
勢羊の赤血球懸濁液(沈降赤血球20 m1A)25μ
tと注意深く混合したのち微量滴定プレートの小つぼ中
室源で2時間インキュベーションしそして前記した方法
に従い評価する。6回測定した結果では反応混合物1 
ml当り0262±0.006IUの含量が示された。
実施例 2 実施例1において用いられた新鮮なヒト血清475μt
の代りに加熱により不活性化したヒト血清(56℃、1
時間)の同容量を用いその他は変更することなく操作し
た。3回測定した結果、0.193±0.003IU肩
の含量が示された。
【図面の簡単な説明】
第1図は微量滴定プレート中の間接的血球凝集を示す。 第2図は微量滴定プレート中の溶血検定を示す。 第6図は光源(1)、照明レンズ(2)、ピンホール隔
壁(6)、物体(4)、写像レンズ(5)および画面中
の数個の直線状に配置された検出器からなるセンサー(
6)からなる順序における二次元物体の面積を定量的に
測定するための光学的装置を示す。 特許出願人  ベーリングヴエルケ・アクチェンゲゼル
シャフト 外2名 FIG、I FIG、2

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1)凝集反応の沈殿により限定された面積を直接測定し
    そしてそのものから反応相手の量または活性を定量的に
    測定することを特徴とする、凝集による反応の相手の光
    学的検出および測定法。 2)数回の限定された希釈度における測定すべき反応相
    手の沈殿が測定されることを特徴とする前記特許請求の
    範囲第1項記載の方法。 3)反応中に反応相手の1種類が一部分は溶解された形
    態で、一部分は担体と結合してそしてその他は溶解され
    て存在することを特徴とする前記特許請求の範囲第1項
    記載の方法。 4)沈殿を1種類またはそれ以上の活性な補体成分の存
    在下に生成せしめうることを特徴とする前記特許請求の
    範囲第1項記載の方法。 5)凹形に湾曲した底面を有する容器中で測定が行われ
    ることを特徴とする前記特許請求の範囲第1項記載の方
    法。 6)a)光源、b)照明レンズ、c)ピンホール隔壁、
    d)物体、e)写像レンズおよびf)数個の直線状に配
    置された検出器からなるセンサー、からなる順序におけ
    る二次元物体の面積を定量的に測定するための光学的装
    置であつて、物体またはセンサーのいずれかが光軸に対
    し可動性垂直に配置され、従つて移動に際し総面積が捕
    捉される装置。 7)抗原、抗体および場合により1種類またはそれ以上
    の活性な補体成分の反応の結果として生成する凝集型の
    測定への前記特許請求の範囲第6項記載の光学的装置の
    使用。
JP13095485A 1984-06-19 1985-06-18 反応相手の測定法およびそのための装置 Pending JPS6113135A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3422616.8 1984-06-19
DE19843422616 DE3422616A1 (de) 1984-06-19 1984-06-19 Verfahren zur bestimmung eines partners einer reaktion und vorrichtung dazu

Publications (1)

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JPS6113135A true JPS6113135A (ja) 1986-01-21

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ID=6238645

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JP13095485A Pending JPS6113135A (ja) 1984-06-19 1985-06-18 反応相手の測定法およびそのための装置

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EP (1) EP0165551A3 (ja)
JP (1) JPS6113135A (ja)
AU (1) AU4380385A (ja)
DE (1) DE3422616A1 (ja)

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EP0165551A3 (de) 1988-03-02
DE3422616A1 (de) 1985-12-19
AU4380385A (en) 1986-01-02
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