JP7586889B2 - Ｎｋｇ２ｄに結合する抗体 - Google Patents

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Description

本発明は、概して、例えばＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の活性化のための多重特異性抗原結合分子を含む、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体に関する。加えて、本発明は、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、さらに、同抗体を生成するための方法、及び同抗体を疾患の処置に使用する方法に関する。
がん免疫療法は非常に活発な研究分野であり、がん免疫療法は現在、多くの異なる種類のがんを処置するために使用されている。免疫チェックポイント阻害剤を用いて得られた有望な臨床結果にもかかわらず、依然としてこれらの新規治療に応答する患者の割合は低い。これは、より多数の進行がん患者の臨床的利益を改善するために、チェックポイント阻害を超えて免疫系を活性化する新規且つ差別化された治療アプローチの高い必要性を明確に実証する。
ＮＫＧ２Ｄは、１９９１年に初めて記載された細胞傷害性エフェクター細胞上に発現される活性化受容体である（Ｈｏｕｃｈｎｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７３，１０１７－１０２０）。ＮＫＧ２Ｄは、細胞質尾部にそれ自体のシグナル伝達モチーフを有さないが、荷電アミノ酸を介して１０ｋＤａのアダプタータンパク質ＤＮＡＸ活性化タンパク質（ＤＡＰ１０）と会合する。ＤＡＰ１０は、そのチロシン残基でのリン酸化後にホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を動員し、最終的にＮＫ細胞の活性化、細胞傷害性及びＣＤ８ Ｔ細胞の共刺激をもたらす細胞質ＹｘｘＭモチーフを有する。ＮＫＧ２Ｄは、ほぼ全てのＮＫ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、γδＴ細胞及びＮＫＴ細胞のサブセットで構成的に発現されるが、正常組織では発現されない（Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５，７２７－７２９）。ＮＫＧ２Ｄ発現は、様々なサイトカインによって調節され得、ＩＬ－２及びＩＬ－１５はアップレギュレーションを誘導するが、ＴＧＦβ及びＩＬ－２１はＮＫＧ２Ｄをダウンモジュレートすることが示された。腫瘍浸潤リンパ球上でもＮＫＧ２Ｄを検出することができる。
ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫＧ２Ｄリガンド（ＮＫＧ２ＤＬ）のアップレギュレーションを介して形質転換細胞のためのセンサーとして働く。多くのウイルス及び腫瘍は、ＮＫＧ２Ｄを介した検知を回避する機構を発達させており、このことは、この受容体が腫瘍及びウイルス感染の免疫監視において重要な役割を果たし、がん免疫療法のための強力な標的となることを示唆している。
二重アンタゴニスト活性及びアゴニスト活性を有する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体であるＫＹＫ－２．０は、Ｋｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｋｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８４，１１４３－１１５６；国際公開第２０１０／０１７１０３号）によって報告されている。これに由来する二重特異性抗体は、国際公開第２０１６／１３４３７１号に報告されている。ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６及び腫瘍関連抗原を標的とする三重特異性抗体は、例えば国際公開第２０１８／１４８４４５号に報告されている。
しかしながら、改善された有効性及び／又は安全性を有するＮＫＧ２Ｄを標的とする抗体、例えばがん免疫療法に使用するための抗体が依然として必要とされている。
本発明は、多重特異性抗体を含む、ＮＫＧ２Ｄに結合し、治療目的にとって特に好ましい特性を有する新規抗体を提供する。
本発明者らは、ＮＫＧ２Ｄに結合する、予想外の改善された特性を有する新規抗体を開発した。例えば、抗体は、ヒトとカニクイザルの両方のＮＫＧ２Ｄに高親和性で結合し、ＮＫＧ２Ｄ発現免疫細胞に対する結合並びにアゴニスト活性（即ち、活性化又は共刺激）を特異的に示す。本発明はまた、新規ＮＫＧ２Ｄ抗体を組み込み、良好な有効性及び生産性と低毒性及び良好な薬物動態特性とを組み合わせる、ＮＫＧ２Ｄ及び第２の抗原に結合する多重特異性抗原結合分子を包含する。これらの（多重特異性）抗体は、治療目的、特にがんの治療、特にがん免疫療法に使用され得る。重要なことに、本発明の（多重特異性）抗体は、Ｔ細胞活性化剤等の他の免疫療法剤と組み合わせるのに特に適している。
第１の態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体であって、
（ｉ）配列番号７３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号７４、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４及び配列番号１０５からなる群から選択されるＨＣＤＲ２、並びに配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７６の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号７７のＬＣＤＲ２及び配列番号７８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号６５のＨＣＤＲ１、配列番号６６のＨＣＤＲ２及び配列番号６７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号６８のＬＣＤＲ１、配列番号６９のＬＣＤＲ２及び配列番号７０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号４９のＨＣＤＲ１、配列番号５０のＨＣＤＲ２及び配列番号５１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号５３のＬＣＤＲ２及び配列番号５４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号５７のＨＣＤＲ１、配列番号５８のＨＣＤＲ２及び配列番号５９のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号６０のＬＣＤＲ１、配列番号６１のＬＣＤＲ２及び配列番号６２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｘ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２及び配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２及び配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
（ｘ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２及び配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２及び配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体を提供する。
一態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体であって、
（ｉ）配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号８０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｘ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；或いは
（ｘ）配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体を提供する。
一態様では、抗体は、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、抗体は、全長抗体である。別の態様では、抗体は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である。
一態様では、抗体は多重特異性、特に二重特異性抗体である。一態様では、抗体は、第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。一態様では、第２の抗原は、標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原である。
一態様では、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、特に、ＩｇＧ１のＦｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合を低減する、及び／又はエフェクター機能を低下させる１又は複数のアミノ酸置換を含む。一態様では、抗体はＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）に結合しない。
一態様では、第１及び／又は第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。
いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子である。そのような一態様では、第２の抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。さらなるそのような態様では、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子であり、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
代替の態様では、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子である。そのような一態様では、第１の抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。そのようなさらなる一態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子であり、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一態様では、第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、（ｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、且つ第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、且つ第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されているか、のいずれかである。
一態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む。一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がより大きな側鎖量を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に配置可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がより小さな側鎖量を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が配置可能である。
本発明のさらなる態様によれば、本発明の抗体をコードする単離ポリヌクレオチドと、本発明の単離ポリヌクレオチドを含む宿主細胞とが提供される。別の態様では、（ａ）抗体の発現に好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程と、任意に、（ｂ）抗体を回収する工程と、を含む、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体を産生する方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって産生された、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体も包含する。
本発明は、本発明の抗体と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物をさらに提供する。
本発明には、本発明の抗体及び医薬組成物を使用する方法も包含される。一態様では、本発明は、医薬としての使用のための、本発明による抗体又は医薬組成物を提供する。一態様では、疾患の処置における使用のための、本発明による抗体又は医薬組成物が提供される。具体的な態様では、疾患は、がんである。特定の態様では、使用は、Ｔ細胞活性化剤、例えばＣＤ３に結合する抗体、特にＣＤ３及び標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、に結合する二重特異性抗体と組み合わせたものである。
また、医薬の製造における本発明による抗体又は医薬組成物の使用、疾患、特にがんの処置のための医薬の製造における本発明による抗体又は医薬組成物の使用が提供される。特定の態様では、処置は、Ｔ細胞活性化剤、例えばＣＤ３に結合する抗体、特にＣＤ３及び標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、に結合する二重特異性抗体と組み合わせたものである。本発明はまた、個体における疾患、特にがんを処置する方法であって、当該個体に有効量の本発明による抗体又は医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。特定の態様では、方法は、Ｔ細胞活性化剤、例えばＣＤ３に結合する抗体、特にＣＤ３及び標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、に結合する二重特異性抗体の投与をさらに含む。
実施例１で構築されたＮＫＧ２Ｄ受容体及びＭＩＣ－Ｂリガンドの概略図。ＮＫＧ２Ｄ受容体及びＭＩＣ－Ｂリガンドを、構築物の受容体又はリガンド部分に関して単量体（「ｍｏｎｏ」）又は二量体（「ｄｉ」）としてヒト又はマウスＦｃドメインに融合の有無にかかわらずクローニングした。ｄｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ ｍｕ ＩｇＧ１ Ｆｃを除く全ての構築物は、部位特異的ビオチン化のための少なくとも１つのａｖｉタグを有する。（Ａ）ｈｉｓ ａｖｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ、（Ｂ）ｍｏｎｏ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ｋｈ ａｖｉ、（Ｃ）ｄｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉ、（Ｄ）ｄｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ ｍｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ、（Ｅ）ｄｉ ｃｙＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉ、（Ｆ）ｄｉ ｍｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉ、（Ｇ）ＥＣＤ ＦＬ ＭＩＣ－Ｂ Ｆｃ ａｖｉ。 ＥＬＩＳＡによるＭＩＣ－Ｂ競合についての抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のスクリーニング。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体なしのプレート固定化ＭＩＣ－Ｂへの組換えビオチン化ヒトＮＫＧ２Ｄの結合に対する、ＭＩＣ－ＢへのＮＫＧ２Ｄの結合の阻害パーセントを示す。 抗ＮＫＧ２Ｄ抗体による標的細胞の再指向溶解。標識化Ｐ８１５標的細胞からのカルセイン放出によって決定される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体による細胞殺傷パーセント。各クローンの抗体濃度は、（左から右へ）４０．０、１３．３３、４．４４、１．４８、０．４９、０．１６５、０．０５５、０．０１８、０．００６、０．００２μｇ／ｍｌである。 異なるエピトープに結合する抗体の２回の注射を示すＳＰＲセンサーグラムの例。 フローサイトメトリーによって測定した新たに単離された、非結合対照抗体と比較した抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の、（Ａ）ヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２、（Ｂ）増殖ヒトＮＫ細胞、（Ｃ）増殖ヒトγδＴ細胞、及び（Ｄ）ヒトＣＤ８ Ｔ細胞への結合。 抗ＮＫＧ２Ｄ抗体によるＮＫＧ２Ｄ陽性免疫細胞の活性化。ヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２を、プロテインＡビーズ上に捕捉した抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＩｇＧ１）と共培養した。ＮＫ細胞の活性化を、ＣＢＡ技術を使用して上清へのＩＮＦγ放出を測定することによって決定した。 抗ＮＫＧ２Ｄ抗体によるＮＫＧ２Ｄ陽性免疫細胞の活性化。ヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２を、プロテインＡビーズ上（Ａ）に捕捉した抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＩｇＧ１）と又は溶液中（Ｂ）で抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＩｇＧ１）と共培養した。ＮＫ細胞の活性化を、ＣＢＡ技術を使用して上清へのＩＮＦγ放出を測定することによって決定した。 抗ＮＫＧ２Ｄ抗体によるＮＫＧ２Ｄ陽性免疫細胞の活性化。ヒト初代増殖ＮＫ細胞を、プロテインＡビーズ上に捕捉した抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＩｇＧ１）と共培養した。ＮＫ細胞の活性化を、ＣＢＡ技術によって上清へのＩＮＦγ及びＴＮＦαの放出を測定することによって決定した。 抗ＮＫＧ２Ｄ抗体によるＮＫＧ２Ｄ陽性免疫細胞の活性化。ヒト初代増殖γδＴ細胞を、プロテインＡビーズ上に捕捉した抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＩｇＧ１）と共培養した。ＮＫ細胞の活性化を、ＣＢＡ技術によって上清へのＴＮＦαの放出を測定することによって決定した。 抗ＮＫＧ２Ｄ抗体によるＣＤ８ Ｔ細胞クローンの共刺激。ＮＬＶ特異的（Ａ及びＢ）及びＭＡＲＴ１特異的（Ｃ）ＣＤ８ Ｔ細胞クローンを、固定濃度のＣＤ３抗体（Ａ及びＣ）と組み合わせて、又はＣＤ３抗体（Ｂ）の非存在下で、コーティングされた抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＩｇＧ１）を含むプレートにおいて培養した。フローサイトメトリーによって決定されるＣＤ２５のアップレギュレーションを、ＣＤ８ Ｔ細胞クローンの活性化のためのマーカーとして使用した。 非ヒト化親ウサギ配列３９５（Ｐ１ＡＥ４９７２）と比較した抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３９５のヒト化ＶＨドメインのアラインメントであって、ＨＣＤＲ２の不対システインがセリンで置き換えられている（アスタリスクで示される位置）。 （例示的な第２の特異性としてＣＥＡを有する）ＮＫＧ２Ｄ二重特異性抗体フォーマットの概略図。（Ａ）Ｄフォーマット、（Ｂ）Ｊフォーマット、（Ｃ）Ｋフォーマット、（Ｄ）Ｉフォーマット、（Ｅ）Ｌフォーマット、（Ｆ）Ｍフォーマット。 ５ｎＭ ＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせたＭＫＮ－４５細胞に対するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイにおいて、ＣＥＡを標的とする二重特異性構築物としての機能活性について、いくつかの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を試験した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞の活性化を、処置の５時間後に発光を測定することによって決定した。 抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３２０を、５ｎＭ ＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせたＭＫＮ－４５細胞でのＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイにおいて、その機能活性について異なる二重特異性フォーマット（第２の特異性としてＣＥＡを伴う）で試験した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞の活性化を、処置の５時間後に発光を測定することによって決定した。 フローサイトメトリーによって測定し、それぞれのＩｇＧと比較した場合の、ＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫ９２細胞（Ａ）及びＣＥＡ陽性ＬＳ１８０細胞（Ｂ）へのＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体と抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３２０との結合。 抗ＮＫＧ２Ｄ抗体５Ｃ５（Ａ）及び０１３（Ｂ）を、５ｎＭ ＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせたＭＫＮ４５細胞でのＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイにおいて、その機能活性について異なる二重特異性フォーマット（第２の特異性としてＣＥＡを伴う）で試験した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞の活性化を、処置を加えることにより５時間後に発光を測定することによって決定した。 ５ｎＭ ＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせたＭＫＮ４５細胞に対するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイにおいて、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３９５の２つの二重特異性フォーマット（Ｍ及びＩ）の機能活性を、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３２０のＩフォーマットの機能活性と比較した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞の活性化を、処置を加えることにより５時間後に発光を測定することによって決定した。 フローサイトメトリーによって測定し、それぞれのＩｇＧと比較した場合の、ＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫ９２細胞（Ａ）及びＣＥＡ陽性ＬＳ１８０細胞（Ｂ）へのＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体と抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３９５との結合。 ２つの異なるＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体の機能活性を、異なる発現レベルのＣＥＡを有する腫瘍細胞株の存在下でＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイで試験した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞の活性化を、処置の５時間後に発光を測定することによって決定した。（Ａ）Ｉフォーマットの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３２０との二重特異性抗体、（Ｂ）Ｍフォーマットの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３９５との二重特異性抗体。 フローサイトメトリーによって測定した場合、新たに単離されたＰＢＭＣ内のＣＤ８ Ｔ細胞（Ａ）、ＮＫ細胞（Ｂ）及びＣＤ４ Ｔ細胞（Ｃ）へのＭフォーマットの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３９５との二重特異性抗体の結合。 ＭフォーマットでのＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）及びＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体と抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３９５との組合せによる、フローサイトメトリーによって測定されるＣＤ８ Ｔ細胞の活性化。（Ａ、Ｂ）０．１ｎＭ ＣＥＡ－ＴＣＢ（２）単独又は０．４ｎＭ ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体と組み合わせたＬＳ１８０腫瘍細胞での４８時間の処置による、ＰＢＭＣ内のＣＤ８ Ｔ細胞上のＣＤ６９（Ａ）及びＣＤ２５（Ｂ）のアップレギュレーション。（Ｃ、Ｄ）ＣＥＡ－ＴＣＢ単独又は２ｎＭのＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体と組み合わせたＭＫＮ－４５細胞での４８時間の処置による、ＰＢＭＣ内のＣＤ８ Ｔ細胞上のＣＤ６９（Ｃ）及びＣＤ２５（Ｄ）のアップレギュレーション。 ＮＫ９２細胞上に発現したＮＫＧ２Ｄに対する二重特異性Ｍフォーマットの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３９５のヒト化変異体の結合をフローサイトメトリーによって測定し、親抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（Ｐ１ＡＥ４９７２）と比較した。（Ａ）Ｐ１ＡＥ４９７３、Ｐ１ＡＥ４９７５、Ｐ１ＡＥ４９７７。（Ｂ）Ｐ１ＡＥ４９７８、Ｐ１ＡＥ４９７９、Ｐ１ＡＥ４９８０、Ｐ１ＡＥ４９８１。 二重特異性Ｍフォーマットの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３９５のヒト化変異体の機能活性を、５ｎＭ ＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせたＭＫＮ－４５細胞（Ａ、Ｂ）及びＨＴ－２９細胞（Ｃ、Ｄ）に対するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイで試験し、それぞれのフォーマットの活性を親抗体（Ｐ１ＡＥ４９７２）と比較した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞の活性化を、処置の５時間後に発光を測定することによって決定した。 ＴＣＢと組み合わせた二重特異性Ｍフォーマットのヒト化抗ＮＫＧ２Ｄ抗体変異体Ｐ１ＡＥ４９８０の機能活性を、ＣＥＡ陰性腫瘍細胞株（ＨｅＬａ（Ａ）及び２つのＣＥＡ陽性腫瘍細胞株（ＨＴ２９（Ｂ）及びＭＫＮ－４５（Ｃ））を用いたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイで試験した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞の活性化を、処置の５時間後に発光を測定することによって決定した。 ＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせたＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体（ヒト化抗ＮＫＧ２Ｄ抗体変異体Ｐ１ＡＥ４９８０、Ｍフォーマット）の機能活性を、シェッド（ｓｈｅｄ）ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）（Ａ）の濃度を増加させながらＭＫＮ－４５細胞に対するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイで試験した。並行して、ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ－ＴＣＢ単独と組み合わせたＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体の機能活性を、同じアッセイ（Ｂ）における参照として試験した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞の活性化を、処置の５時間後に発光を測定することによって決定した。 可溶性ＮＫＧ２ＤリガンドＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ、１０μｇ／ｍｌ）又はＵＬＢＰ２（ｓＵＬＢＰ２、１０μｇ／ｍｌ）の存在下でのＣＥＡ－ＴＣＢによるＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体（ヒト化抗ＮＫＧ２Ｄ抗体変異体Ｐ１ＡＥ４９８０、Ｍフォーマット）の機能活性を、ＭＫＮ－４５細胞に対するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイにおけるＣＥＡ－ＴＣＢによるＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体（リガンドの非存在下）の活性と比較した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞の活性化を、処置の５時間後に発光を測定することによって決定した。 ＮＫＧ２Ｄ結合因子として抗体Ｐ１ＡＥ４９８０及びＣＥＡ結合因子として抗体ｈｕＡ５Ｂ７及びその親和性成熟変異体を含む、実施例１９で調製されたＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体の概略図。 ＬＳ１８０腫瘍細胞上に発現されたＣＥＡへの抗ＣＥＡ抗体ｈｕＡ５Ｂ７、Ｐ００２．１３９及びＰ００１．１７７の２つの親和性成熟変異体との二重特異性ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ抗体の結合を、親ＣＥＡ結合因子ｈｕＡ５Ｂ７を含む対応する二重特異性ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ抗体の結合と比較した。二重特異性抗体の結合を、蛍光標識された二次抗体を用いて検出し、蛍光をフローサイトメトリーによって分析した。 ｈｕＡ５Ｂ７、Ｐ００２．１３９又はＰ００１．１７７をＣＥＡ結合因子として含む二重特異性ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ抗体を、９６ウェルプレート中で５ｎＭのＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせた高ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５細胞に対するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイでそれらの機能活性について試験した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞の活性化を、処置を加えることにより５時間後に発光を測定することによって決定した。 ＣＥＡ結合因子としてｈｕＡ５Ｂ７、Ｐ００２．１３９又はＰ００１．１７７を含む二重特異性ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ抗体を、３８４ウェルプレート中、５ｎＭ ＣＥＡ－ＴＣＢ（Ａ、Ｃ）又は１ｎＭ ＣＥＡ－ＴＣＢ（Ｂ、Ｄ）と組み合わせて、中ＣＥＡ発現ＬＳ１８０細胞（Ａ、Ｂ）及び低ＣＥＡ発現ＨＴ２９細胞（Ｃ、Ｄ）に対するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイでその機能活性について試験した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞の活性化を、処置を加えることにより３時間後に発光を測定することによって決定した。 抗ＮＫＧ２Ｄ抗体Ｃ２６、ＡＤＩ２７７４３及びＰ１ＡＥ４９８０を、フローサイトメトリーによってＮＫ９２細胞上のＮＫＧ２Ｄへの結合について試験した。結合した抗体を蛍光標識二次抗体で検出した。 ＮＫＧ２Ｄ結合因子としてＣ２６、ＡＤＩ２７７４３又はＰ１ＡＥ４９８０を含む二重特異性ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ抗体を、フローサイトメトリーによってＮＫ９２細胞上のＮＫＧ２Ｄへの結合について試験した。結合した抗体を蛍光標識二次抗体で検出した。 ＮＫＧ２Ｄ結合因子としてＣ２６、ＡＤＩ２７７４３又はＰ１ＡＥ４９８０を含む二重特異性ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ抗体を、５ｎＭ ＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせた高ＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞株に対するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイで試験した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞の活性化を、処置を加えることにより６時間後に発光を測定することによって決定した。 ＮＫＧ２Ｄ結合因子としてＣ２６、ＡＤＩ２７７４３又はＰ１ＡＥ４９８０を含む二重特異性ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ抗体を、５ｎＭ ＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせた低ＣＥＡ発現ＨＴ－２９腫瘍細胞株に対するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイで試験した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞の活性化を、処置を加えることにより６時間後に発光を測定することによって決定した。 ＰＢＭＣを、野生型又はエフェクターサイレントＦｃドメインを含むＮＫＧ２Ｄ抗体で２４時間処置し、その後、ＮＫ細胞上のＣＤ６９アップレギュレーションをフローサイトメトリーによって決定した。
Ｉ．定義
用語は、以下に別段の定義がない限り、当技術分野で一般的に使用されるように本明細書で使用される。
本明細書で使用される場合、抗原結合ドメイン等に関する「第１」、「第２」又は「第３」という用語は、各タイプの部分が２つ以上存在するときに区別の便宜のために使用される。これらの用語の使用は、そのように明示的に示されていない限り、部分の特定の順序又は向きを与えることを意図していない。
「抗ＮＫＧ２Ｄ抗体」及び「ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体」という用語は、抗体がＮＫＧ２Ｄの標的化において診断剤及び／又は治療剤として有用であるように十分な親和性を有して、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗体を指す。一態様では、無関係な非ＮＫＧ２Ｄタンパク質に対する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される場合、ＮＫＧ２Ｄに対する抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の態様では、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体は、≦１μＭ、≦５００ｎＭ、≦２００ｎＭ、又は≦１００ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）を有する。例えば、ＳＰＲにより測定して、抗体が１μＭ以下のＫＤを有する場合、抗体は、ＮＫＧ２Ｄに「特異的に結合する」と称する。ある特定の態様では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、異なる種由来のＮＫＧ２Ｄの中で保存されているＮＫＧ２Ｄのエピトープに結合する。
逆に、ある特定の抗原に「結合しない」抗体は、当該抗原を標的とする際の診断剤及び／又は治療剤として有用であるような十分な親和性で当該抗原に結合することができない。ある特定の態様では、ある特定の抗原に結合しない抗体は、当該抗原に対して１μＭを超える解離定数（ＫＤ）を有する。
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、限定されるものではないが、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含めた、さまざまな抗体構造を包含する。
「抗体断片」とは、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含む、インタクト抗体以外の分子である。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂ）、単一ドメイン抗体、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の総説としては、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。
「全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」という用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指し、即ち、集合に含まれる個々の抗体は、同一である及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する突然変異又はモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる突然変異を含む、可能な変異体抗体は含まれず、そのような変異体は一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法、例えば、本明細書に記載のモノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法を含むが、これらに限定されない多様な技術によって作製され得る。
「単離」抗体は、その自然環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー）方法によって決定したとき、純度９５％又は９９％を超えるまで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。いくつかの態様では、本発明により提供される抗体は、単離抗体である。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、そのドメイン中ではＣＤＲの全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応することになる。そのような可変ドメインは、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ばれる。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。いくつかの態様では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
「ヒト抗体」とは、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体、又はヒト抗体レパートリ等のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト由来の抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。ある特定の態様では、ヒト抗体は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物、例えば、マウス、ラット、又はウサギに由来する。ある特定の態様では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞株に由来する。ヒト抗体ライブラリから単離された抗体又は抗体断片も、本発明のヒト抗体又はヒト抗体断片であると考えられる。
「抗原結合ドメイン」という用語は、ある抗原の一部又は全部に結合し、且つある抗原の一部又は全てに相補的な領域を含む抗体の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。好ましい態様では、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む。
「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体と抗原との結合に関与する、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインである。ネイティブ抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に同様の構造を有し、それぞれのドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために充分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体のＶＨ又はＶＬドメインを使用し、それぞれ、相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリをスクリーニングして、単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されたい。可変領域配列と組み合わせて本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）によって記載されるナンバリングシステムを指す。
本明細書で使用される場合、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されるＫａｂａｔナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、本明細書では「Ｋａｂａｔによるナンバリング」又は「Ｋａｂａｔナンバリング」と呼ばれる。具体的には、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）の６４７－６６０頁を参照されたい）を、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１－７２３頁を参照されたい）を、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用し、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング」又は「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング」と言及することによってさらに明確にしている。
本明細書で使用する場合、「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列内で超可変であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを意味する。一般的に、抗体は、６つのＣＤＲを含み、ＶＨに３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、ＶＬに３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）含む。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、以下が挙げられる：
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）及び９３－１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））が挙げられる。
特に断りのない限り、ＣＤＲは、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は、任意の他の、科学的に認可された命名システムに従い決定することができることを理解するであろう。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、以下の４つのＦＲドメインからなる：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、概して、ＶＨ（又はＶＬ）中で以下の順序で現れる：ＦＲ１－ＨＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）－ＦＲ２－ＨＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）－ＦＲ３－ＨＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）－ＦＲ４。
別段の指示がない限り、ＣＤＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、上記のＫａｂａｔらに従ってナンバリングされている。
本明細書の目的において「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下に定義するように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの態様では、アミノ酸変更の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において、最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３にあるようなサブグループである。
「免疫グロブリン分子」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖から構成される。Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）と、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）と、を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）と、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインと、を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに割り当てられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）等のさらなるサブタイプに分けられてもよい。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちの１つに割り当てられてもよい。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して接続する、２つのＦａｂ分子とＦｃドメインとから実質的になる。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、抗体又は免疫グロブリンの重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には、次の５種類の主要なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分けられてもよい。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「Ｆａｂ分子」とは、免疫グロブリンの重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと、免疫グロブリンの軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬドメイン及びＣＬドメインと、からなるタンパク質を指す。
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも呼ばれる）とは、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメインが交換されている（即ち、互いに置き換わっている）Ｆａｂ分子を意味し、即ち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１（ＶＬ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向に）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（ＶＨ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向に）から構成されるペプチド鎖と、を含む。明確性のために、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１を含むペプチド鎖は、本明細書では、（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。逆に、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖は、本明細書では、（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。
これとは対照的に、「従来の」Ｆａｂ分子は、その天然のフォーマットでのＦａｂ分子を意味し、即ち、重鎖可変ドメイン及び定常ドメインから構成される重鎖（ＶＨ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向に）と、軽鎖可変ドメイン及び定常ドメインから構成される軽鎖（ＶＬ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向に）と、を含む。
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。該用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域とを含む。一態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかし、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１又は複数、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後開裂を受けてもよい。したがって、全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって、宿主細胞によって産生する抗体は、全長重鎖を含んでいてもよい、又は全長重鎖の開裂した変異体を含んでいてもよい。これは、重鎖の最終的な２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）である場合であってもよい。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、又は存在していなくてもよい。Ｆｃ領域（又は本明細書に定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、別段の指示がない場合、本明細書ではＣ末端グリシン－リジンジペプチドを含まないもが示される。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書に明記されるＦｃ領域（サブユニット）を含む重鎖は、さらなるＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書に明記されるＦｃ領域（サブユニット）を含む重鎖は、さらなるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。本明細書で別途明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１（上も参照されたい）に記載されるような、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。Ｆｃドメインの「サブユニット」は、本明細書で使用される場合、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、即ち、安定した自己会合が可能な、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
「融合した」が意味するのは、構成要素（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、ペプチド結合によって直接的に又は１又は複数のペプチドリンカーを介してのいずれかにより結合されていることである。
「多重特異性」という用語は、抗体が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。多重特異性抗体は、例えば、二重特異性抗体であり得る。典型的には、二重特異性抗体は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。ある特定の態様では、多重特異性（例えば二重特異性）抗体は、２つの抗原決定基、特に、２つの別個の細胞で発現する２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
「価数」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合分子内の特定数の抗原結合部位の存在を示す。この場合、「抗原に対する一価の結合」という用語は、抗原結合分子内の抗原に特異的な１つ（及び１つを超えない）抗原結合部位の存在を示す。
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を与える抗原結合分子の部位、即ち１又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。ネイティブ免疫グロブリン分子は、典型的には、２つの抗原結合部位を含み、Ｆａｂ分子は、典型的には、１つの抗原結合部位を有する。
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」又は「抗原」という用語は、抗原結合ドメイン－抗原複合体を形成する、抗原結合ドメインが結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される配座構成）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に認めることができる。好ましい態様では、抗原はヒトタンパク質である。
「ＮＫＧ２Ｄ」は、別途明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブＮＫＧ２Ｄを指す。この用語は、「全長」の、未処理のＮＫＧ２Ｄ、及び細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のＮＫＧ２Ｄを包含する。この用語は、ＮＫＧ２Ｄの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一態様では、ＮＫＧ２Ｄは、ヒトＮＫＧ２Ｄ、特にヒトＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）である。ヒトＮＫＧ２Ｄのアミノ酸配列及びそのＥＣＤをそれぞれ配列番号８７及び配列番号８８に示す。ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）エントリＰ２６７１８（バージョン１７６）も参照されたい。別の態様では、ＮＫＧ２Ｄはカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＮＫＧ２Ｄ、特にカニクイザルＮＫＧ２ＤのＥＣＤである。カニクイザルＮＫＧ２Ｄ及びそのＥＣＤのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号８９及び配列番号９０に示す。ＵｎｉＰｒｏｔエントリＰ６１２５２（バージョン７１）も参照されたい。別の態様では、ＮＫＧ２Ｄは、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＮＫＧ２Ｄ、特にマウスＮＫＧ２ＤのＥＣＤである。マウスＮＫＧ２Ｄ及びそのＥＣＤのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９１及び配列番号９２に示す。ＵｎｉＰｒｏｔエントリＯ５４７０９（バージョン１５１）も参照されたい。ある特定の態様では、本発明の抗体は、異なる種、特にヒト及びカニクイザルＮＫＧ２ＤからのＮＫＧ２Ｄ抗原の間で保存されているＮＫＧ２Ｄのエピトープに結合する。好ましい態様では、抗体はヒトＮＫＧ２Ｄに結合する。一態様では、第１の抗原結合ドメインは、ヒト及びカニクイザルＮＫＧ２Ｄに対して交差反応性である（即ち、それに結合する）。
「標的細胞抗原」は、本明細書で使用される場合、標的細胞、例えば、がん細胞又は（「腫瘍細胞抗原」の場合）腫瘍間質細胞といった腫瘍内の細胞の表面に提示された抗原決定基を意味する。好ましくは、標的細胞抗原はＮＫＧ２Ｄではなく、及び／又はＮＫＧ２Ｄとは異なる細胞上で発現される。一態様では、標的細胞抗原はＣＥＡである。
「ＣＥＡ」は癌胎児性抗原（癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られる）を表す。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列をＵｎｉＰｒｏｔエントリＰ０６７３１（バージョン１８８）に示す。本明細書で使用される場合、「ＣＥＡ」は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物が供給源の任意のネイティブＣＥＡを指す。この用語は、「全長」の、未処理のＣＥＡ、及び細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のＣＥＡを包含する。この用語は、ＣＥＡの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一態様では、ＣＥＡはヒトＣＥＡである。一態様では、ＣＥＡは細胞膜結合ＣＥＡである。一態様では、ＣＥＡは、細胞、例えばがん細胞の表面に発現したＣＥＡである。
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合相手（例えば、抗原）との間の、合計の非共有性相互作用の強度を指す。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する特異的結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（ＫＤ）によって表し得る。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当技術分野で既知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「親和性成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較して、１又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）において１又は複数の変化を有し、かかる改変によって抗原に対する抗体の親和性を改善する、抗体を指す。
「結合の低減」、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減は、例えば、ＳＰＲによって測定される場合、それぞれの相互作用についての親和性の低下を指す。明確性のために、本用語はまた、親和性のゼロ（又は分析方法の検出限界を下回る）までの低減、即ち、相互作用の完全な終止も含む。逆に、「結合の増加」は、個々の相互作用に対する結合親和性の増加を指す。
本明細書で使用する「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害性活性、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の１又は複数の細胞応答を指す。Ｔ細胞活性化を測定するために適したアッセイは、当技術分野で既知であり、本明細書に記載されている。
本明細書で使用される「Ｔ細胞活性化剤」は、例えばＣＤ３等のＴ細胞受容体に結合してそれを活性化する（その成分）ことによって、Ｔ細胞活性化を誘導することができる分子を指す。したがって、例示的なＴ細胞活性化剤は、ＣＤ３、特にＣＤ３のイプシロンサブユニットに結合する抗体であり得る。本発明において有用な特定のＴ細胞活性化剤は、ＣＤ３及び腫瘍細胞抗原等の標的細胞抗原に結合する二重特異性抗体である。そのようなＴ細胞活性化二重特異性抗体は、本明細書では「Ｔ細胞二重特異性抗体」又は「ＴＣＢ」とも呼ばれる。
「ＣＤ３」は、別途明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブＣＤ３を指す。この用語は、「全長」の、未処理のＣＤ３、及び、細胞内でのプロセシングによりもたらされる任意の形態のＣＤ３を包含する。この用語は、ＣＤ３の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一態様では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列をＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）エントリＰ０７７６６（バージョン２０２）に示す。別の態様では、ＣＤ３は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ３、特にカニクイザルＣＤ３εである。カニクイザルＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１に示されている。ある特定の態様では、本発明で有用なＴ細胞活性化剤は、異なる種、特にヒト及びカニクイザルＣＤ３由来のＣＤ３抗原の間で保存されているＣＤ３のエピトープに結合する。好ましい態様では、Ｔ細胞活性化剤はヒトＣＤ３に結合する。
「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾」は、ホモ二量体を形成するためのＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの同一のポリペプチドとの会合を減少又は防止する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。会合を促進する修飾は、本明細書で使用される場合、好ましくは、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（即ち、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別個の改変を含み、この修飾は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するために互いに相補性である。例えば、会合を促進する修飾は、それぞれ立体的又は静電的に望ましい会合を行うように、Ｆｃドメインサブユニットの片方又は両方の構造又は電荷を変えてもよい。したがって、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、サブユニットの各々に融合するさらなる構成要素（例えば抗原結合ドメイン）が同じではないという意味で、同一ではなくてもよい。いくつかの態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。好ましい態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々における別個のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介障害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞活性化。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインによる係合の後に、エフェクター機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。一態様では、活性化Ｆｃ受容体はＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）である。その配列を含むヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）は、ＵｎｉＰｒｏｔエントリＰ０８６３７（バージョン２０３）に記載されている。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞による、抗体で被覆された標的細胞の溶解を引き起こす免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が、一般的にＦｃ領域に対してＮ末端であるタンパク質部分を介して、特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、「減少したＡＤＣＣ」という用語は、上記で定義されたＡＤＣＣの機構による、標的細胞を取り囲む培地中の所与の濃度の抗体で所与の時間に溶解される標的細胞の数の減少、及び／又はＡＤＣＣの機構による、所与の時間に所与の数の標的細胞の溶解を達成するために必要な、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の濃度の増加のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの減少は、同じ標準的な産生、精製、製剤化及び保存の方法（当業者に知られている）を使用して、同じ種類の宿主細胞によって産生される同じ抗体によって媒介されるが、操作されていないＡＤＣＣと比較している。例えば、そのＦｃドメインを含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低下である、ＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換は、Ｆｃドメイン中にこのアミノ酸置換を含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣに対するものである。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイは、当技術分野で周知である（例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２００６／０８２５１５号又はＰＣＴ出願国際公開第２０１２／１３０８３１号を参照されたい）。
本明細書で使用される「操作する」、「操作された」、「操作すること」という用語は、天然に存在するポリペプチド又は組換えポリペプチド又はこれらの断片のペプチド骨格の何らかの操作又は翻訳後修飾を含むと考えられる。操作することは、アミノ酸配列の修飾、グリコシル化パターンの修飾、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、及びこれらのアプローチの組合せを含む。
「アミノ酸変異」という用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸の置換、欠失、挿入及び修飾を包含することを意味している。置換、欠失、挿入及び修飾の任意の組合せは、最終構築物が、所望の特徴、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減、又は別のペプチドとの会合の増加を有する限り、最終構築物に到達するように行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端のアミノ酸の欠失及び挿入を含む。好ましいアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えば、Ｆｃ領域の結合特性を変更する目的のために、非保存的アミノ酸置換、即ち、１つのアミノ酸を、構造特性及び／又は化学特性が異なる別のアミノ酸と置き換えることが特に好ましい。アミノ酸の置換には、非天然アミノ酸による置き換え、又は２０の標準的なアミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）による置き換えが含まれる。アミノ酸変異を、当技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を使用して生成することができる。遺伝的方法には、特定部位の突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれ得る。遺伝子工学以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を変更する方法、例えば化学修飾も有用であり得ると考慮される。同じアミノ酸変異を示すために、本明細書で様々な名称を使用することができる。例えば、Ｆｃドメインの位置３２９のプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙと示すことができる。
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大整列度を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、配列をアラインメントさせるのに適切なパラメータを決定することができる。或いは、同一性パーセントの値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成することができる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成されており、ソースコードは、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）のユーザドキュメンテーションにファイルされており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されており、且つ、国際公開第２００１／００７６１１号に記載されている。
別段の指定がない限り、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを使用するか、又はその後にＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ及びＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（’’Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ’’，ＰＮＡＳ ８５（１９８８）：２４４４－２４４８）、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（’’Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ’’ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６（１９９６）：２２７－２５８）、及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６（１９９７）２４－３６）により作成され、ｗｗｗ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ又はｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａから公開されて利用可能である。或いは、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を用いて、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公開サーバを使用して配列を比較し、ローカルではなくグローバルなアラインメントを確実に実行することができる。アミノ酸同一性パーセントは、アウトプットアラインメントヘッダーで与えられる。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基から構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（即ち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（即ち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成される。多くは、核酸分子は、塩基配列によって記述され、ここで、当該塩基は、核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へと表される。本明細書において、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線形又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。さらに、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含んでいてもよい。誘導体化された糖又はリン酸骨格結合又は化学修飾された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例としては、修飾されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子はまた、例えば、宿主又は患者において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして好適なＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されていなくてもよく、又は修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を増強するために化学的に修飾することができ、その結果、ｍＲＮＡを対象に注射して、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を生成することができる（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３：８１５－８１７、又は欧州特許第２ １０１ ８２３号Ｂ１を参照されたい）。
「単離」核酸分子は、その自然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離核酸分子には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、この核酸分子は、染色体外に存在するか、又はその本来の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「抗体をコードする単離ポリヌクレオチド（又は核酸）」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする１又は複数のポリヌクレオチド分子を指し、単一のベクター又は別個のベクターにおいて、そのようなポリヌクレオチド分子（複数可）が宿主細胞の１又は複数の位置に存在するそのようなポリヌクレオチド分子（複数可）を含む。
「ベクター」という用語は、本明細書では、連結している別の核酸を増殖可能な核酸分子を指す。この用語には、自己複製する核酸構造としてのベクターだけでなく、ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも含まれる。ある特定のベクターは、それらが作動的に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターを本明細書では、「発現ベクター」と呼ぶ。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は、相互に置き換え可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞としては、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び継代の数にかかわらず宿主細胞に由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞と完全に同一の核酸含量でない場合があるが、突然変異を含んでもよい。本明細書では、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体の子孫が、含まれる。宿主細胞は、本発明の抗体を生成するために使用可能な任意の種類の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、数例を挙げると、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。一態様では、本発明の宿主細胞は、真核細胞、特に哺乳動物細胞である。一態様では、宿主細胞は、ヒト身体中の細胞ではない。
「医薬組成物」又は「薬学的製剤」という用語は、調製物の中に含有される有効成分の生物活性が有効になるような形態であり、組成物が投与されるであろう対象にとって許容できない有毒を有する追加の成分を何も含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容され得る担体」は、有効成分以外の医薬組成物又は製剤中の成分であって、対象にとって非毒性である成分を指す。薬学的に許容され得る担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的な変化形、例えば、「処置する（ｔｒｅａｔ）」又は「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、処置される個体における疾患の本来の経過を変える試行における臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。処置の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行速度を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。ある特定の態様では、個体又は対象は、ヒトである。
薬剤、例えば、医薬組成物の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投薬量及び所要期間で有効な量を指す。
「添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通常含まれる指示を指すために用いられ、そのような治療製品に関する適応症、使用、投薬量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む。
ＩＩ．組成物及び方法
本発明は、ＮＫＧ２Ｄ及び第２の抗原に結合する多重特異性抗体を含む、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体を提供する。抗体は、ＮＫＧ２Ｄに対して優れた結合活性及びアゴニスト活性を示し、例えば、有効性及び安全性、薬物動態、並びに生産性に関して、治療適用のための他の好ましい特性と組み合わされる。本発明の抗体は、例えば、がん等の疾患の処置に有用である。
本発明の抗体は、例えばＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）等のＴ細胞活性化剤と組み合わせて、細胞傷害性Ｔ細胞の（共）刺激に特に有用である。本発明の抗体はまた、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）等の活性化Ｆｃ受容体を介した同時刺激を必要とせずとも、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びγδ Ｔ細胞等の他のＮＫＧ２Ｄ発現免疫細胞を効率的に活性化することができる。Ｆｃ受容体結合及びその機能に対する活性化の必要性を回避することにより、本発明の抗体は、その機能のためにＦｃ受容体結合及び活性化を必要とするＮＫＧ２Ｄ抗体よりも全身性副作用のリスクが小さい効率的な免疫細胞活性化を可能にすると考えられる。本発明の抗体はまた、標的免疫細胞活性化を達成するためにＮＫＧ２Ｄ及び標的細胞抗原（例えば、腫瘍抗原）に結合するが、全身性副作用のリスクを低下させるために活性化Ｆｃ受容体（特にＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ））にも結合しない多重特異性フォーマットで使用することができる。
Ａ．抗ＮＫＧ２Ｄ抗体
本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体を提供する。
第１の態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体であって、
（ｉ）配列番号７３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号７４、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４及び配列番号１０５からなる群から選択されるＨＣＤＲ２、並びに配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７６の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号７７のＬＣＤＲ２及び配列番号７８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号６５のＨＣＤＲ１、配列番号６６のＨＣＤＲ２及び配列番号６７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号６８のＬＣＤＲ１、配列番号６９のＬＣＤＲ２及び配列番号７０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号４９のＨＣＤＲ１、配列番号５０のＨＣＤＲ２及び配列番号５１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号５３のＬＣＤＲ２及び配列番号５４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号５７のＨＣＤＲ１、配列番号５８のＨＣＤＲ２及び配列番号５９のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号６０のＬＣＤＲ１、配列番号６１のＬＣＤＲ２及び配列番号６２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｘ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２及び配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２及び配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
（ｘ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２及び配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２及び配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体を提供する。
一態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体であって、
（ｉ）配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号８０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｘ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；或いは
（ｘ）配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体を提供する。
一態様では、抗体は、
配列番号７３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号７４、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４及び配列番号１０５からなる群から選択されるＨＣＤＲ２、並びに配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７６の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号７７のＬＣＤＲ２及び配列番号７８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、抗体は、
配列番号７３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号７４のＨＣＤＲ２、及び配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７６の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号７７のＬＣＤＲ２、及び配列番号７８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、抗体は、
配列番号７３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０２のＨＣＤＲ２、及び配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７６の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号７７のＬＣＤＲ２、及び配列番号７８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合ドメインを含む。
特定の態様では、抗体は、
配列番号７３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０４のＨＣＤＲ２、及び配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７６の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号７７のＬＣＤＲ２、及び配列番号７８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、抗体は、ヒト化抗体である。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗原結合ドメイン（即ちヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様では、ＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト化可変領域である。一態様では、ＶＨはヒト化可変領域であり、ＶＬはヒト可変領域である。
一態様では、ＶＨ及び／又はＶＬは、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一態様では、ＶＨは、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択される重鎖可変領域配列、より特には配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択される重鎖可変領域配列、最も特には配列番号１１２の重鎖可変領域配列の１又は複数の重鎖フレームワーク配列（即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、より特には配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、最も特には配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、より特には配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、最も特には配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、より特には配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、最も特には配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体はＮＫＧ２Ｄに結合する能力を保持する。ある特定の態様では、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、より特には配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、最も特には配列番号１１２のアミノ酸配列において、合計１から１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様では、ＶＨは、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、より特には配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、最も特には配列番号１１２のアミノ酸配列を含む。任意に、ＶＨは、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、より特には配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、最も特には配列番号１１２のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、ＶＬは、配列番号８０の軽鎖可変領域配列の１又は複数の軽鎖フレームワーク配列（即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号８０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号８０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号８０のアミノ酸配列に少なくとも約９８％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体はＮＫＧ２Ｄに結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号８０のアミノ酸配列において置換されている、挿入されている及び／又は欠失している。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様では、ＶＬは、配列番号８０のアミノ酸配列を含む。任意に、ＶＬは、配列番号８０のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、ＶＨは、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、より特には配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、最も特には配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号８０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、より特には配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、最も特には配列番号１１２のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号８０のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体であって、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、より特には配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、最も特には配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号８０のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体を提供する。
さらなる態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体であって、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ配列、より特には配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ配列、最も特には配列番号１１２のＶＨ配列と、配列番号８０のＶＬ配列とを含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体を提供する。
別の態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体であって、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ、より特には配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ、最も特には配列番号１１２のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号８０のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬとを含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体を提供する。
さらなる態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ、より特には配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ、最も特には配列番号１１２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号１１のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列とを含む。
一態様では、ＶＨは、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ、より特には、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ、最も特には、配列番号１１２のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ、より特には配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ、最も特には配列番号１１２のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークを含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ、より特には、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ、最も特には、配列番号１１２のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ、より特には配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ、最も特には配列番号１１２のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも約９５％の配列同一性のフレームワークを含む。別の態様では、ＶＨは、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ、より特には、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ、最も特には、配列番号１１２のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ、より特には配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶＨ、最も特には配列番号１１２のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも約９８％の配列同一性のフレームワークを含む。
一態様では、ＶＬは、配列番号８０のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号８０のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＶＬは、配列番号８０のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号８０のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＶＬは、配列番号８０のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号８０のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、抗体は、
配列番号６５のＨＣＤＲ１、配列番号６６のＨＣＤＲ２及び配列番号６７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号６８のＬＣＤＲ１、配列番号６９のＬＣＤＲ２及び配列番号７０のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む第１の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、抗体は、ヒト抗体である。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト抗原結合ドメイン（即ちヒト抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様では、ＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト可変領域である。
一態様では、ＶＨ及び／又はＶＬは、ヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークを含む。
一態様では、ＶＨは、配列番号７１の重鎖可変領域配列の１又は複数の重鎖フレームワーク配列（即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体はＮＫＧ２Ｄに結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号７１のアミノ酸配列において置換されている、挿入されている及び／又は欠失している。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様では、ＶＨは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。任意に、ＶＨは、配列番号７１のアミノ酸配列を含み、これにはその配列の翻訳後修飾が含まれる。
一態様では、ＶＬは、配列番号７２の軽鎖可変領域配列の１又は複数の軽鎖フレームワーク配列（即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号７２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号７２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号７２のアミノ酸配列に少なくとも約９８％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体はＮＫＧ２Ｄに結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号７２のアミノ酸配列において置換されている、挿入されている及び／又は欠失している。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様では、ＶＬは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。任意に、ＶＬは、配列番号７２のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、ＶＨは、配列番号７１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは配列番号７１のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号７２のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体であって、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体を提供する。
さらなる態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体であって、配列番号７１のＶＨ配列及び配列番号７２のＶＬ配列を含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体を提供する。
別の態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体であって、配列番号７１のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨ及び配列番号７２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬを含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体を提供する。
さらなる態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号７１のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号７２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。
一態様では、ＶＨは、配列番号７１のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７１のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７１のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７１のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＶＨは、配列番号７１のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号７１のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークを含む。
一態様では、ＶＬは、配列番号７２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７２のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＶＬは、配列番号７２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７２のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＶＬは、配列番号７２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７２のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、抗体は、
配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む第１の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、抗体は、ヒト抗体である。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト抗原結合ドメイン（即ちヒト抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様では、ＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト可変領域である。
一態様では、ＶＨ及び／又はＶＬは、ヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークを含む。
一態様では、ＶＨは、配列番号７の重鎖可変領域配列の１又は複数の重鎖フレームワーク配列（即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体はＮＫＧ２Ｄに結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号７のアミノ酸配列において置換されている、挿入されている及び／又は欠失している。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。任意に、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、ＶＬは、配列番号８の軽鎖可変領域配列の１又は複数の軽鎖フレームワーク配列（即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号８のアミノ酸配列に少なくとも約９８％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体はＮＫＧ２Ｄに結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号８のアミノ酸配列において置換されている、挿入されている及び／又は欠失している。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様では、ＶＬは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。任意に、ＶＬは、配列番号８のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号８のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体であって、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体を提供する。
さらなる態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体であって、配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列を含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体を提供する。
別の態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体であって、配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨ及び配列番号８のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬを含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体を提供する。
さらなる態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号７のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。
一態様では、ＶＨは、配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークと、を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＶＨは、配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号７のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークを含む。
一態様では、ＶＬは、配列番号８のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号８のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＶＬは、配列番号８のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号８のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＶＬは、配列番号８のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号８のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体であって、上記に提供した態様のいずれかのＶＨ配列及び上記に提供した態様のいずれかのＶＬ配列を含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体を提供する。
一態様では、抗体は、ヒト定常領域を含む。一態様では、抗体は、ヒト定常領域を含む免疫グロブリン分子、特にヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含むＩｇＧクラス免疫グロブリン分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号８３及び８４（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号８５（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）で与えられる。一態様では、抗体は、配列番号８３又は配列番号８４のアミノ酸配列、特に配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。一態様では、抗体は、配列番号８５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域は、本明細書に記載のＦｃドメインにおけるアミノ酸変異を含んでもよい。
一態様では、第１の抗原結合ドメインは、ヒト定常領域を含む。一態様では、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。一態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号８３又は配列番号８４のアミノ酸配列、特に配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、「電荷修飾」の状態で本明細書に記載のアミノ酸変異を含んでいてもよい、及び／又は、クロスオーバーＦａｂ分子での場合、１又は複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含んでいてもよい。いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、「電荷修飾」状態において本明細書に記載のアミノ酸変異を含んでいてもよい。
一態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。
一態様では、抗体は、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１抗体である。一態様では、抗体は、全長抗体である。
別の態様では、抗体は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片、特にＦａｂ分子である。別の態様では、抗体断片は、ダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディである。
本発明による抗体に含まれる第１の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合する。
好ましい態様では、抗体は、ＮＫＧ２Ｄに結合する１つを超えない抗原結合ドメインを含む。一態様では、抗体は、ＮＫＧ２Ｄに対する一価の結合を提供する。他の態様では、抗体は、ＮＫＧ２Ｄに結合する２つ以上（例えば、２つ、３つ、又は４つ）の抗原結合ドメインを含む。一態様では、抗体は、ＮＫＧ２Ｄに対する多価結合を提供する。一態様では、抗体は、ＮＫＧ２Ｄに結合する２つの抗原結合ドメインを含む。一態様では、抗体はＮＫＧ２Ｄへの二価結合を提供する。別の態様では、抗体は、ＮＫＧ２Ｄに結合する４つの抗原結合ドメインを含む。一態様では、抗体はＮＫＧ２Ｄへの四価結合を提供する。
抗体がＮＫＧ２Ｄに結合する２つ以上の抗原結合ドメインを含む態様では、好ましくはこれらの抗原結合ドメインの全てが同一である、即ち、それらは同じ分子フォーマット（例えば、従来のＦａｂ分子又はクロスオーバーＦａｂ分子）を有し、同じアミノ酸配列を含む。
別の態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である。
一態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。好ましい態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の、可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子である（即ち、第１の抗原結合ドメインは、クロスオーバーＦａｂ分子である）。
さらなる態様では、上記態様のうちのいずれかによる抗体は、下記のセクションＩＩ．Ａ．１．～１０．に記載されるように、任意の特徴を単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
好ましい態様では、抗体は、Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ Ｆｃドメイン、より特にはＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。一態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。Ｆｃドメインは、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成され、Ｆｃドメイン変異体に関連して本明細書の以下（セクションＩＩ．Ａ．１０．）に記載される特徴のうちのいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込んでもよい。
別の好ましい態様では、抗体は、第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインを含む（即ち、抗体は、本明細書の以下（セクションＩＩ．Ａ．９．）にさらに記載される多重特異性抗体である）。
１．抗体断片
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。
一態様では、抗体断片は、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆａｂ’－ＳＨ分子、又はＦ（ａｂ’）２分子であり、特に本明細書に記載のＦａｂ分子である。「Ｆａｂ’分子」は、抗体ヒンジ領域から１又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における残基の付加だけ、Ｆａｂ分子とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を保持するＦａｂ’分子である。ペプシン処置により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ分子）と、Ｆｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２分子が得られる。
別の態様では、抗体断片は、ダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディである。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）においても説明されている。
さらなる態様では、抗体断片は、一本鎖Ｆａｂ分子である。「一本鎖Ｆａｂ分子」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、及びリンカーからなるポリペプチドであり、当該抗体ドメイン及び当該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向において、以下の順序：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有する。特に、上記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２～５０個のアミノ酸のポリペプチドである。一本鎖Ｆａｂ分子は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。さらに、これらの一本鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによれば、可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化されるであろう。
別の態様では、抗体断片は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、リンカーにより接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインの融合タンパク質である。特に、リンカーは、１０～２５個のアミノ酸の短いポリペプチドであり、通常、柔軟性のためにグリシンが、且つ、溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と、又はこの逆のいずれかで、接続させることができる。このタンパク質は、定常領域が取り除かれ、リンカーが導入されているにもかかわらず、元の抗体の特異性を保持することができる。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）、また国際公開第９３／１６１８５号、並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。
別の態様では、抗体断片は単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。ある特定の態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．マサチューセッツ州ウォルサム；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照されたい）。
抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載される、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））による組換え産生を含む種々の技術によって作製することができる。
２．キメラ抗体及びヒト化抗体
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類に由来する可変領域）とヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のそれらから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体が、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化される。通常、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来する１又は複数の可変ドメインを含み、ＦＲ（又はその一部）はヒト抗体配列に由来する。任意に、ヒト化抗体はまた、ヒト定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの態様では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。
ヒト化された抗体及びその作製方法については、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）で総説され、さらに以下に記載される：Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフトの記述）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（リサーフェシングについての記述）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（ＦＲシャッフルについての記述）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフルの「ガイド付き選択アプローチの記述）。
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域としては、限定されないが、「ベストフィット」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えばＳｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）、軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞性変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照されたい）、並びにＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照されたい）が挙げられる。
３．ヒト抗体
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は一般的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）に記載されている。
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することができる。そのような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含むか、又は染色体外に存在するか、又は動物の染色体にランダムに統合されている。そのようなトランスジェニック動物では、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載する米国特許第６，０７５，１８１号及び米国特許第６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載する米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許第７，０４１，８７０号；及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。そのような動物によって生成されたインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに改変されてもよい。
また、ヒト抗体は、ハイブリドーマを用いた方法で作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が、記載されている（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照されたい。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体もまた、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する）、及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載する）を含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）にも記載されている。
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択される可変ドメイン配列を単離することによって生成することができる。その後、そのような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせられ得る。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。
４．ライブラリ由来の抗体
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体はライブラリから得られる。本発明の抗体は、１つ以上の所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離され得る。コンビナトリアルライブラリをスクリーニングするための方法は、例えば、Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．のＮａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：４９８－５０８（２０１６）において総説されている。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングするための様々な方法が当技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．のｍＡｂｓ ８：１１７７－１１９４（２０１６）；Ｂａｚａｎ ｅｔ ａｌ．のＨｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：１８１７－１８２８（２０１２）及びＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．のＣｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６：２７６－２８９（２０１６）、並びにＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．のＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）及びＭａｒｋｓ ａｎｄ ＢｒａｄｂｕｒｙのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）で総説されている。
ある特定のファージディスプレイ法において、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子のレパートリは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって個別にクローニングされ、ファージライブラリにおいて無作為に組換えられており、次いで、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．のＡｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２：４３３－４５５（１９９４）で説明されたように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、抗体断片を一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片のいずれかとしてディスプレイする。免疫源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。代替的に、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １２：７２５－７３４（１９９３）のＧｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．によって記載されるように、ナイーブなレパートリをクローン化し（例えば、ヒトから）、免疫化することなく、非自己及びさらには自己抗原の広範囲に対する単一の抗体源を得ることができる。最終的に、ナイーブライブラリはまた、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２７：３８１－３８８（１９９２）でＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒによって記載されるように、再整列していないＶ遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングすること、及びランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再整列を達成することによって、合成により作製することができる。ヒト抗体ファージライブラリについて記載する特許公報としては、例えば：米国特許第５，７５０，３７３号、同第７，９８５，８４０号、同第７，７８５，９０３号及び同第８，６７９，４９０号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０２３７７６４号及び同第２００７／０２９２９３６号が挙げられる。
１又は複数の所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングするための当技術分野で知られている方法のさらなる例には、リボソーム及びｍＲＮＡディスプレイ、並びに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞における抗体ディスプレイ及び選択のための方法が含まれる。酵母表面ディスプレイのための方法は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５０３：１３５－５６（２０１２）のＳｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．及びＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １３１９：１５５－１７５（２０１５）のＣｈｅｒｆ ｅｔ ａｌ．並びにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８８９：７３－８４（２０１２）のＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．で総説される。リボソームディスプレイのための方法は、例えば、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：５１３２－５１３４（１９９７）及びＨａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．のＰＮＡＳ ９４：４９３７－４９４２（１９９７）に記載されている。
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書ではヒト抗体又はヒト抗体断片とみなされる。
５．グリコシル化変異体
ある特定の態様では、本明細書において提供する抗体を変えて、抗体のグリコシル化の程度を増減させる。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１又は複数のグリコシル化部位が作り出されるか、又は除去されるようにアミノ酸配列を改変させることにより好都合に達成され得る。
抗体がＦｃ領域を含む場合、抗体に付着しているオリゴ糖を変更してもよい。哺乳動物細胞によって産生されたネイティブ抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐型オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの態様では、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾が、ある特定の改良された特性を有する抗体変異体を生成するために行われてもよい。
一態様では、非フコシル化オリゴ糖、即ち、Ｆｃ領域へのフコース結合（直接又は間接）が欠落した、オリゴ糖構造を有する抗体変異体を提供する。そのような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化」オリゴ糖とも呼ばれる）は特に、二分枝オリゴ糖構造の幹に第１のＧｌｃＮＡｃが結合したフコース残基を欠く、Ｎ結合オリゴ糖である。一態様では、ネイティブ又は親抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の比率が増加した抗体変異体を提供する。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は場合によっては約１００％（即ち、フコシル化オリゴ糖が存在しない）であってもよい。非フコシル化オリゴ糖の割合は、例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号に記載のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法により測定した、Ａｓｎ２９７に結合した全てのオリゴ糖の合計（例えば、複合体、ハイブリッド、及びハイマンノース構造）に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位に位置するアスパラギン残基を指す（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）；但し、Ａｓｎ２９７はまた、抗体のマイナーな配列変化のために、位置２９７の上流又は下流、即ち、位置２９４と３００の間の約±３個のアミノ酸に位置していてもよい。Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加したそのような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合、及び／又は改善されたエフェクター機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有することができる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号を参照されたい。
フコシル化が低下した抗体を産生可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が不足しているＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４－６２２（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照されたい）、又はＧＤＰ－フコース合成若しくはトランスポータータンパク質の活性が低下若しくは消滅した細胞（例えば、米国特許出願公開第２００４２５９１５０号、米国特許出願公開第２００５０３１６１３号、米国特許出願公開第２００４１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４１１０２８２号を参照されたい）が挙げられる。
さらなる態様では、抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている二分されたオリゴ糖と共に提供される。そのような抗体変異体は、上述のように、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有してもよい。そのような抗体変異体の例は、例えば、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７，１７６－１８０（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｂｉｏｅｎｇ ９３，８５１－８６１（２００６）；国際公開第９９／５４３４２号；国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００３／０１１８７８号に記載されている。
Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖の少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、ＣＤＣの機能を改善している可能性がある。かかる抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号、国際公開第１９９８／５８９６４号、及び国際公開第１９９９／２２７６４号に記載されている。
６．システイン操作抗体変異体
ある特定の態様では、抗体の１又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）を生成することが望ましい場合がある。好ましい態様では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書にさらに記載されるように、抗体を薬物部位又はリンカー薬物部位等のような他の部位に抱合して免疫抱合体を作製するために使用することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、米国特許第８，３０，９３０号、米国特許第７，８５５，２７５号、米国特許第９，０００，１３０号、又は国際公開第２０１６０４０８５６号に記載のように生成することができる。
７．抗体誘導体
ある特定の態様では、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で既知であり、容易に入手可能な、さらなる非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾されてもよい。抗体の誘導体化に適した部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に付着しているポリマーの数は様々であり、複数のポリマーが付着している場合には、それらは同じ分子であっても、異なった分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定するものではないが、改良される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下で治療に使用されるかどうか等の考慮事項に基づいて決定することができる。
８．免疫抱合体
本発明はまた、細胞傷害性薬剤、化学療法剤若しくは化学療法薬、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌真菌、植物、若しくは動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位体等の１又は複数の治療剤と抱合された本明細書における抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含む、免疫抱合体を提供する。
一態様では、免疫抱合体は、抗体が、前述の治療剤の１又は複数に抱合した、抗体薬物抱合体（ＡＤＣ）である。抗体は典型的には、リンカーを使用して、治療剤の１又は複数に接続される。治療剤及び薬剤及びリンカーの例を含む、ＡＤＣ技術の概観は、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖｉｅｗ ６８：３－１９（２０１６）に記載されている。
別の態様では、免疫抱合体は、酵素活性毒素又はその断片に抱合化した本発明の抗体を含み、これには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌からのもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリのタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウのタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、並びにトリコテセンが含まれるが、これらに限定されない。
別の態様では、免疫抱合体は、放射性原子に抱合化して放射性抱合体を形成する、本発明の抗体を含む。放射性物質の製造には、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位元素が挙げられる。放射性抱合体が検出のために使用されるとき、その例には、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、Ｔｃ９９ｍ若しくはＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（別名、磁気共鳴画像法、ＭＲＩ）のための、Ｉ１２３、Ｉ１３１、Ｉｎ１１１、Ｆ１９、Ｃ１３、Ｎ１５、Ｏ１７、ガドリニウム、マンガン、若しくは鉄等のスピン標識が含まれ得る。
抗体と細胞毒性剤との抱合体は、例えば、各種の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる：Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌ等）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジル等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネート等）、及び二活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン等）。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように、リシン免疫トキシンを調製することができる。炭素１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、抗体にラジヌクレオチドを共役させるための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞内での細胞傷害性薬物の放出を促進する「開裂性リンカー」であってもよい。例えば、酸解離性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
本明細書に記載の免疫抱合体（ｉｍｍｕｎｕｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）又はＡＤＣは、市販（例えば、米国イリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，製）の、以下のものを含むがこれらに限定されない架橋試薬を用いて調製されたそのような抱合体を明示的に企図する：ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）が、これらに限定されない。
９．多重特異性抗体
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体は多重特異性抗体、特に、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原決定基（例えば、２つの異なるタンパク質、又は同じタンパク質上の２つの異なるエピトープ）に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の態様では、多重特異性抗体は３つ以上の結合特異性を有する。ある特定の態様では、結合特異性の一方はＮＫＧ２Ｄへのものであり、他方は任意の他の抗原へのものである。ある特定の態様では、多重特異性抗体は、ＮＫＧ２Ｄの２つ（又はそれ以上）の異なるエピトープに結合し得る。多重特異性（例えば、二重特異性）抗体は、細胞傷害性薬剤又は細胞を、ＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に局在化するために使用することもできる。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）を参照されたい）及び「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号及びＡｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６（１９９７）を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、また、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の操作（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号を参照されたい）；２つ以上の抗体若しくは断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）；ロイシンジッパーを使用した二重特異性抗体の産生（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）及び国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照されたい）；軽鎖の誤対合問題を回避するための一般的な軽鎖技術の使用（例えば、国際公開第９８／５０４３１号を参照されたい）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい）；及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）；並びに例えばＴｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されている三重特異性抗体の調製によって作製することができる。
例えば、「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」を含む３つ以上の抗原結合部位を有する操作抗体、又はＤＶＤ－Ｉｇも本明細書に含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号及び国際公開第２００８／０２４７１５号を参照されたい）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号及び国際公開第２０１３／０２６８３１号に見出すことができる。多重特異性抗体又はその抗原結合断片は、ＮＫＧ２Ｄに、同様に別の異なる抗原に、又はＮＫＧ２Ｄの２つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号及び国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照されたい）。
多重特異性抗体は、同じ抗原特異性の１又は複数の結合アームにドメインクロスオーバーを有する非対称形態（いわゆる「クロスマブ（ＣｒｏｓｓＭａｂ）」技術）で、即ちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号及び国際公開第２０１５／１５０４４７号を参照されたい）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５３号を参照されたい）又は完全なＦａｂアーム（例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号参照、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１８７－１１９１及びＫｌｅｉｎ ａｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－２０）も参照されたい）を交換することによっても提供され得る。非対称Ｆａｂアームは、荷電又は非荷電アミノ酸変異をドメインインターフェースに導入して正しいＦａｂペアリングを指示することによって操作することもできる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照されたい。
多重特異性抗体の様々なさらなる分子フォーマットが当技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２０１５）９５－１０６を参照されたい）。
本発明の多重特異性抗体の好ましい態様を以下に記載する。
一態様では、本発明は、本明細書に記載されているＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合ドメインを含み、且つ第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体を提供する。
本発明の好ましい態様によれば、抗体に含まれる抗原結合ドメインはＦａｂ分子である（即ち、各々が可変ドメイン及び定常ドメインを含む、重鎖及び軽鎖から構成される抗原結合ドメインである）。一態様では、第１及び／又は第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。一態様では、当該Ｆａｂ分子は、ヒトのものである。別の態様では、当該Ｆａｂ分子はヒト化のものである。また別の態様では、当該Ｆａｂ分子は、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。
好ましくは、抗原結合ドメインの少なくとも１つは、クロスオーバーＦａｂ分子である。そのような修飾は、異なるＦａｂ分子の重鎖と軽鎖の誤対合を低減し、それによって、組換え産生における本発明の（多重特異性）抗体の収率及び純度を改善する。本発明の（多重特異性）抗体に有用な好ましいクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＬ及びＶＨ）が交換されている。しかしながら、このドメイン交換によっても、（多重特異性）抗体の調製は、誤対合重鎖及び軽鎖の間の、いわゆる、ベンス・ジョーンズ型相互作用に起因して、ある特定の副生成物を含むことがある（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１１８７－１１１９１を参照されたい）。異なるＦａｂ分子の重鎖及び軽鎖の誤対合をさらに減少し、これにより望ましい（多重特異性）抗体の純度及び収率を増加するため、反対の電荷を有する荷電アミノ酸を、第１の抗原（ＮＫＧ２Ｄ）に結合するＦａｂ分子（複数可）又は第２の抗原（例えば、標的細胞抗原、例えば腫瘍細胞抗原）に結合するＦａｂ分子（複数可）のいずれかのＣＨ１及びＣＬドメインにおける特定のアミノ酸位置に導入することができ、本明細書にさらに記載される。電荷修飾は、（多重特異性）抗体に含まれる従来のＦａｂ分子（複数可）（例えば、図１２に示される）、又は（多重特異性）抗体に含まれるＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子（複数可）において行われる（但し両方で行われることはない）。好ましい態様では、電荷改変は、（多重特異性）抗体に含まれる（好ましい態様では、第２の抗原、例えば標的細胞抗原、例えば腫瘍細胞抗原に結合する）従来のＦａｂ分子（複数可）において行われる。
本発明による好ましい態様では、（多重特異性）抗体は、第１の抗原（即ち、ＮＫＧ２Ｄ）及び第２の抗原（例えば、標的細胞抗原、例えば、腫瘍細胞抗原）に同時に結合することができる。一態様では、（多重特異性）抗体は、ＮＫＧ２Ｄ及び標的細胞抗原に同時に結合することによって、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞（Ｔ細胞又はＮＫ細胞等）及び標的細胞（腫瘍細胞等）を架橋することができる。一態様では、そのような同時結合は、標的細胞、特に標的細胞抗原発現腫瘍細胞の溶解を生じる。一態様では、そのような同時結合は、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞（Ｔ細胞又はＮＫ細胞等）の活性化をもたらす。他の態様では、そのような同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現の群から選択されるＮＫＧ２Ｄ発現細胞（Ｔ細胞又はＮＫ細胞等）の細胞応答をもたらす。一態様では、標的細胞抗原への同時結合を伴わないＮＫＧ２Ｄへの（多重特異性）抗体の結合は、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞（Ｔ細胞又はＮＫ細胞等）の活性化をもたらさない。
ある特定のこれらの態様では、本発明の（多重特異性）抗体を、Ｔ細胞活性化剤、例えばＣＤ３に結合する抗体、特にＣＤ３及び標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、に結合する二重特異性抗体と組み合わせる。
好ましくは、本発明のいずれかの態様によるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の態様では、Ｔ細胞はγδＴ細胞である。
ａ）第１の抗原結合ドメイン
本発明の（多重特異性）抗体は、ＮＫＧ２Ｄに結合する少なくとも１つの抗原結合ドメイン（第１の抗原結合ドメイン）を含む。好ましい態様では、ＮＫＧ２ＤはヒトＮＫＧ２Ｄ又はカニクイザルＮＫＧ２Ｄ、最も特にヒトＮＫＧ２Ｄである。一態様では、第１の抗原結合ドメインは、ヒト及びカニクイザルＮＫＧ２Ｄに対して交差反応性である（即ち、それに結合する）。いくつかの態様では、ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメインである。
好ましい態様では、（多重特異性）抗体は、ＮＫＧ２Ｄに結合する１つを超えない抗原結合ドメインを含む。一態様では、（多重特異性）抗体は、ＮＫＧ２Ｄに対する一価の結合を提供する。他の態様では、（多重特異性）抗体は、ＮＫＧ２Ｄに結合する２つ以上（例えば、２つ、３つ、又は４つ）の抗原結合ドメインを含む。一態様では、（多重特異性）抗体は、ＮＫＧ２Ｄに対する多価の結合を提供する。一態様では、（多重特異性）抗体は、ＮＫＧ２Ｄに結合する２つの抗原結合ドメインを含む。一態様では、（多重特異性）抗体は、ＮＫＧ２Ｄに対する二価の結合を提供する。別の態様では、（多重特異性）抗体は、ＮＫＧ２Ｄに結合する４つの抗原結合ドメインを含む。一態様では、（多重特異性）抗体は、ＮＫＧ２Ｄに対する四価の結合を提供する。
（多重特異性）抗体がＮＫＧ２Ｄに結合する２つ以上の抗原結合ドメインを含む態様では、好ましくはこれらの抗原結合ドメインの全てが同一である、即ち、それらは同じ分子フォーマット（例えば、従来のＦａｂ分子又はクロスオーバーＦａｂ分子）を有し、本明細書に記載のＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに同じアミノ酸置換を含む同じアミノ酸配列を含む（存在する場合）同じアミノ酸配列を含む。
一態様では、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合ドメイン（複数可）は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である。好ましい態様では、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合ドメイン（複数可）はＦａｂ分子である。
いくつかの態様では、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合ドメイン（複数可）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子である。そのような態様では、第２の抗原（例えば、標的細胞抗原、例えば、腫瘍細胞抗原）に結合する抗原結合ドメイン（複数可）は、好ましくは従来のＦａｂ分子である。
代替的な態様では、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合ドメイン（複数可）は、従来のＦａｂ分子である。そのような態様では、第２の抗原（例えば、標的細胞抗原、例えば、腫瘍細胞抗原）に結合する抗原結合ドメイン（複数可）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子である。
好ましい態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いに置き換わっているＦａｂ分子である（即ち、そのような態様によると、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である）。そのような一態様では、第２の抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。
ｂ）第２の抗原結合ドメイン
ある特定の態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、第２の抗原に結合する抗原結合ドメイン（第２の抗原結合ドメイン）を含む。第２の抗原は、好ましくはＮＫＧ２Ｄではない、即ちＮＫＧ２Ｄとは異なる。一態様では、第２の抗原は、ＮＫＧ２Ｄとは異なる細胞上で発現される（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞以外の細胞上で発現される）抗原である。一態様では、第２の抗原は、活性化Ｆｃ受容体、特にＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）ではない。一態様では、抗体は、活性化Ｆｃ受容体、特にＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）に結合しない。一態様では、第２の抗原はＣＤ３ではない。一態様では、抗体はＣＤ３に結合しない。
好ましい態様では、第２の抗原は、標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原である。具体的な態様では、第２の抗原はＣＥＡである。本発明によれば、第２の抗原結合ドメインは、（多重特異性）抗体を標的部位へ、例えば、第２の抗原を発現する特定のタイプの腫瘍細胞へ向かわせることができる。
好ましい態様では、（多重特異性）抗体は、第２の抗原に結合する１つを超えない抗原結合ドメインを含む。一態様では、（多重特異性）抗体は、第２の抗原に対する一価の結合を提供する。他の態様では、（多重特異性）抗体は、第２の抗原に結合する２つ以上（例えば、２つ、３つ、又は４つ）の抗原結合ドメインを含む。一態様では、（多重特異性）抗体は、第２の抗原に対する多価の結合を提供する。一態様では、（多重特異性）抗体は、第２の抗原に結合する２つの抗原結合ドメインを含む。一態様では、（多重特異性）抗体は、第２の抗原に対する二価の結合を提供する。
（多重特異性）抗体が、第２の抗原に結合する２つ以上の抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子を含む態様では、好ましくはこれらの抗原結合ドメインのそれぞれが同じ抗原決定基に結合する。さらにより好ましい態様では、これらの抗原結合ドメインの全ては、同一であり、即ち、同じ分子フォーマット（例えば、従来又はクロスオーバーＦａｂ分子）を有し、（存在する場合）本明細書に記載されるＣＨ１及びＣＬドメインに同じアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む。
一態様では、第２の抗原に結合する抗原結合ドメイン（複数可）は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である。好ましい態様では、第２の抗原に結合する抗原結合ドメイン（複数可）はＦａｂ分子である。別の態様では、第２の抗原に結合する抗原結合ドメイン（複数可）はＦｖ分子である。
いくつかの態様では、第２の抗原に結合する抗原結合ドメイン（複数可）は、従来のＦａｂ分子である。そのような態様では、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合ドメイン（複数可）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子である。
代替的な態様では、第２の抗原に結合する抗原結合ドメイン（複数可）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子である。そのような態様では、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合ドメイン（複数可）は、従来のＦａｂ分子である。
一態様では、第２の抗原結合ドメインは、ヒト定常領域を含む。一態様では、第２の抗原結合ドメインは、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号８３及び８４（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号８５（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）で与えられる。一態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号８３又は配列番号８４のアミノ酸配列、特に配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、「電荷修飾」の状態で本明細書に記載のアミノ酸変異を含んでいてもよい、及び／又は、クロスオーバーＦａｂ分子での場合、１又は複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含んでいてもよい。いくつかの態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、「電荷修飾」状態において本明細書に記載のアミノ酸変異を含んでいてもよい。
いくつかの態様では、第２の抗原はＣＥＡ、特にヒトＣＥＡである。
一態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号１１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２０のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号１２１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬとを含む。
一態様では、第２の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１２０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、及び／又は第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは配列番号１２０のアミノ酸配列を含み、及び／又はＶＬは配列番号１２１のアミノ酸配列を含む。
別の態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１２３のＨＣＤＲ２及び配列番号１２４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１２５の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１２６のＬＣＤＲ２及び配列番号１２７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
一態様では、第２の抗原結合ドメインは、ヒト化抗体である（ヒト化抗体に由来する）。一態様では、第２の抗原結合ドメインは、ヒト化抗原結合ドメイン（即ち、ヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様では、第２の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト化可変領域である。
一態様では、第２の抗原結合ドメインのＶＨは、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一態様では、第２の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１２８の重鎖可変領域配列の１又は複数の重鎖フレームワーク配列（即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号１２８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号１２８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号１２８のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体は第２の抗原に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号１２８のアミノ酸配列において置換されている、挿入されている及び／又は欠失している。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様では、ＶＨは、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む。任意に、ＶＨは、配列番号１２８のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１２９の軽鎖可変領域配列の１又は複数の軽鎖フレームワーク配列（即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１２９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１２９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１２９のアミノ酸配列に少なくとも約９８％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体は第２の抗原に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号１２９のアミノ酸配列において置換されている、挿入されている及び／又は欠失している。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様では、ＶＬは、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む。任意に、ＶＬは、配列番号１２９のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、第２の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１２８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１２９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは配列番号１２８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１２９のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
さらなる態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２８のＶＨ配列と、配列番号１２９のＶＬ配列とを含む。
別の態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号１２９のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬとを含む。
さらなる態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号１２８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号１２９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
一態様では、第２の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１２８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１２８のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＶＨは、配列番号１２８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１２８のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＶＨは、配列番号１２８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号１２８のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークを含む。
一態様では、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１２９のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１２９のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークを含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１２９のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１２９のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＶＬは、配列番号１２９のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１２９のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
別の態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号１６５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１６８のＨＣＤＲ２及び配列番号１７１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１７７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１２６のＬＣＤＲ２及び配列番号１７９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
一態様では、第２の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号１２２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１２３のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１２５の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１２６のＬＣＤＲ２、及び配列番号１８０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号１２２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１２３のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１２５の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１２６のＬＣＤＲ２、及び配列番号１８１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉｉ）配列番号１２２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１２３のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１２５の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１２６のＬＣＤＲ２、及び配列番号１８２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｖ）配列番号１６６の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１６９のＨＣＤＲ２、及び配列番号１２４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１７８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１２６のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｖ）配列番号１２２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１７０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１２４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１２５の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１２６のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｖｉ）配列番号１２２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１２３のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１２５の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１２６のＬＣＤＲ２、及び配列番号１８３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｖｉｉ）配列番号１２２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１６９のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１２５の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１２６のＬＣＤＲ２、及び配列番号１８３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｖｉｉｉ）配列番号１２２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１６９のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１２５の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１２６のＬＣＤＲ２、及び配列番号１８３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｘ）配列番号１２２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１２３のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１２５の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１２６のＬＣＤＲ２、及び配列番号１８２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｘ）配列番号１２２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１６９のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１２５の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１２６のＬＣＤＲ２、及び配列番号１８２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｘｉ）配列番号１６６の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１６９のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１２５の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、列番号１２６のＬＣＤＲ２、及び配列番号１８０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；又は
（ｘｉｉ）配列番号１６７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１７０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１２５の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１２６のＬＣＤＲ２、及び配列番号１８０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一態様では、第２の抗原結合ドメインは、ヒト化抗体である（ヒト化抗体に由来する）。一態様では、第２の抗原結合ドメインは、ヒト化抗原結合ドメイン（即ち、ヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様では、第２の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト化可変領域である。
一態様では、第２の抗原結合ドメインのＶＨは、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一態様では、第２の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４及び２０６からなる群から選択される重鎖可変領域配列の１又は複数の重鎖フレームワーク配列（即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４及び２０６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４及び２０６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４及び２０６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体は第２の抗原に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４又は２０６のアミノ酸配列において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様では、ＶＨは、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４及び２０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。任意に、ＶＨは、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４及び２０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一態様では、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５及び２０７の群から選択される軽鎖可変領域配列の１又は複数の軽鎖フレームワーク配列（即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５及び２０７の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５及び２０７の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５及び２０７の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体は第２の抗原に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、配列番号１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５又は２０７のアミノ酸配列において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様では、ＶＬは、配列番号１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５及び２０７の群から選択されるアミノ酸配列を含む。任意に、ＶＬは、配列の翻訳後修飾を含む、配列番号１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５及び２０７の群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一態様では、第２の抗原結合ドメインのＶＨは、
（ｉ）配列番号１８４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１８５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）配列番号１８６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１８７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む；
（ｉｉｉ）配列番号１８８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１８９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む；
（ｉｖ）配列番号１９０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１９１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む；
（ｖ）配列番号１９２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１９３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む；
（ｖｉ）配列番号１９４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１９５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む；
（ｖｉｉ）配列番号１９６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１９７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む；
（ｖｉｉｉ）配列番号１９８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１９９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む；
（ｉｘ）配列番号２００のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２０１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む；
（ｘ）配列番号２０２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２０３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む；
（ｘｉ）配列番号２０４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２０５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む；又は
（ｘｉｉ）配列番号２０６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２０７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
一態様では、ＶＨは、
（ｉ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１８５のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）配列番号１８６のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１８７のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉｉ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１８９のアミノ酸配列を含む；
（ｉｖ）配列番号１９０のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１９１のアミノ酸配列を含む；
（ｖ）配列番号１９２のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１９３のアミノ酸配列を含む；
（ｖｉ）配列番号１９４のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１９５のアミノ酸配列を含む；
（ｖｉｉ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１９７のアミノ酸配列を含む；
（ｖｉｉｉ）配列番号１９８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１９９のアミノ酸配列を含む；
（ｉｘ）配列番号２００のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号２０１のアミノ酸配列を含む；
（ｘ）配列番号２０２のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号２０３のアミノ酸配列を含む；
（ｘｉ）配列番号２０４のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号２０５のアミノ酸配列を含む；又は
（ｘｉｉ）配列番号２０６のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号２０７のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、第２の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号１９０のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１９７のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号１９８のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｘ）配列番号２００のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｘ）配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２０３のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｘｉ）配列番号２０４のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２０５のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
（ｘｉｉ）配列番号２０６のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２０７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
さらなる態様では、第２の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号１８４のＶＨ配列及び配列番号１８５のＶＬ配列；
（ｉｉ）配列番号１８６のＶＨ配列及び配列番号１８７のＶＬ配列；
（ｉｉｉ）配列番号１８８のＶＨ配列及び配列番号１８９のＶＬ配列；
（ｉｖ）配列番号１９０のＶＨ配列及び配列番号１９１のＶＬ配列；
（ｖ）配列番号１９２のＶＨ配列及び配列番号１９３のＶＬ配列；
（ｖｉ）配列番号１９４のＶＨ配列及び配列番号１９５のＶＬ配列；
（ｖｉｉ）配列番号１９６のＶＨ配列及び配列番号１９７のＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号１９８のＶＨ配列及び配列番号１９９のＶＬ配列；
（ｉｘ）配列番号２００のＶＨ配列及び配列番号２０１のＶＬ配列；
（ｘ）配列番号２０２のＶＨ配列及び配列番号２０３のＶＬ配列；
（ｘｉ）配列番号２０４のＶＨ配列及び配列番号２０５のＶＬ配列；
（ｘｉｉ）配列番号２０６のＶＨ配列及び配列番号２０７のＶＬ配列を含む。
別の態様では、第２の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号１８４のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号１８５のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１８６のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号１８７のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号１８８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号１８９のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号１９０のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号１９１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号１９２のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号１９３のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号１９４のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号１９５のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号１９６のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号１９７のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号１９８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号１９９のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬ；
（ｉｘ）配列番号２００のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号２０１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬ；
（ｘ）配列番号２０２のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号２０３のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬ；
（ｘｉ）配列番号２０４のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号２０５のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬ；又は
（ｘｉｉ）配列番号２０６のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号２０７のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬを含む。
さらなる態様では、第２の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号１８４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号１８５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１８６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号１８７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１８８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号１８９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号１９０のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号１９１のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号１９２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号１９３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号１９４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号１９５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）配列番号１９６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号１９７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号１９８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号１９９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｉｘ）配列番号２００のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号２０１のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｘ）配列番号２０２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号２０３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｘｉ）配列番号２０４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号２０５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；又は
（ｘｉｉ）配列番号２０６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号２０７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
一態様では、第２の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４及び２０６からなる群から選択されるＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４及び２０６からなる群から選択されるＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＶＨは、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４及び２０６からなる群から選択されるＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４及び２０６からなる群から選択されるＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＶＨは、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４及び２０６からなる群から選択されるＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４及び２０６からなる群から選択されるＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５及び２０７の群から選択されるＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５及び２０７の群から選択されるＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５及び２０７の群から選択されるＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５及び２０７の群から選択されるＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＶＬは、配列番号１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５及び２０７の群から選択されるＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５及び２０７の群から選択されるＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、第２の抗原結合ドメインは、このセクション上記に提供された態様のいずれかのＶＨ配列及びこのセクション上記に提供された態様のいずれかのＶＬ配列を含む。
ｃ）電荷修飾
本発明の（多重特異性）抗体は、それに含まれるＦａｂ分子に、１つ（又は２つより多い抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合には、さらに多くの）結合アーム中にＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂベース多重特異性抗体の産生において生じ得る、軽鎖と適合しない重鎖との誤対合（ベンス・ジョーンズ型副生成物）を低減するうえで特に効率的であるアミノ酸置換を含み得る（全体が本明細書に参照により組み込まれる国際公開第２０１５／１５０４４７号、特にその中の実施例も参照されたい）。望ましくない副生成物、特に、結合アームの１つにＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する多重特異性抗体に生じるベンス・ジョーンズ型副生成物と比較した、所望の（多重特異性）抗体の比を、ＣＨ１及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置と反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することによって改善することができる（本明細書で「電荷修飾」と呼ぶことがある）。
したがって、（多重特異性）抗体の第１及び第２の抗原結合ドメインが両方ともＦａｂ分子であり、抗原結合ドメインの１つ（特に、第１の抗原結合ドメイン）において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、いくつかの特定の態様では、
ｉ）第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、正に帯電したアミノ酸で置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸が、負に帯電したアミノ酸で置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）；又は
ｉｉ）第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸で置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸で置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
（多重特異性）抗体は、ｉ）及びｉｉ）に記述されている修飾を両方とも含むことはない。ＶＨ／ＶＬ交換を有する抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置き換わっていない（即ち、交換されていないままである）。
より具体的な態様では、
ｉ）第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）；又は
ｉｉ）第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
そのような一態様では、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
さらなる態様では、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
好ましい態様では、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
より好ましい態様では、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
さらにより好ましい態様では、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸はアルギニン（Ｒ）により置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
好ましい態様では、上の態様に係るアミノ酸置換が、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１でなされる場合、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
あるいは、上記の態様によるアミノ酸置換は、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１の代わりに、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われる。好ましいそのような態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
したがって、一態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
さらなる態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
なお別の態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸はリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
別の態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸はアルギニン（Ｒ）により置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
好ましい態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合ドメインであって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、本明細書において第１の抗原結合ドメインに関して提供される態様のいずれかのような重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと；
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインであって、
第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい態様では、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい態様では、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、第２の抗原結合ドメインと、を含む。
ｄ）多重特異性抗体フォーマット
本発明による（多重特異性）抗体は、様々な構造を有することができる。例示的な構造が図１２に描写されている。
好ましい態様では、（多重特異性）抗体に含まれる抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。そのような態様では、第１、第２等の抗原結合ドメインは、それぞれ本明細書において第１、第２等のＦａｂ分子と呼ばれることがある。
好ましい態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ分子である。いくつかの態様では、第１及び／又は第２（特に第２）の抗原結合ドメインはＦｖ分子であり得る。
第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子である態様では、好ましくは第１の抗原結合ドメインは本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり（即ち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ、又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子）、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、又はその逆である。
（多重特異性）抗体が、ＮＫＧ２Ｄに結合する２つ以上の抗原結合ドメイン及び／又は第２の抗原に結合する２つ以上の抗原結合ドメインを含む態様では、好ましくはＮＫＧ２Ｄに結合する全ての抗原結合ドメインが本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原に結合する全ての抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子であり、又はその逆である。
好ましい態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットは、安定な会合が可能である。
本発明による（多重特異性）抗体は、異なる構造を有することができ、即ち、第１、第２及び任意にさらなる抗原結合ドメインは、互いに、異なる様式でＦｃドメインに融合していてもよい。構成要素は、直接的に、又は好ましくは１又は複数の適切なペプチドリンカーを介して、互いに融合していてもよい。Ｆａｂ分子の融合が、ＦｃドメインのサブユニットのＮ末端へのものである場合、それは典型的には免疫グロブリンヒンジ領域を介するものである。
好ましい態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含む（多重特異性）抗体と、を含み、
第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、
（ｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、且つ第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、且つ第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されている。
例示的なそのような構成を図１２Ｆに示す。
そのような一態様では、第１の抗原結合ドメインは本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。より具体的なそのような態様では、第１の抗原結合ドメインは、可変ドメインＶＨ及びＶＬが交換されている／互いに置き換わっているクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、本明細書に記載の電荷修飾を含む従来のＦａｂ分子である。
別のそのような態様では、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子である。より具体的なそのような態様では、第１の抗原結合ドメインは、本明細書に記載の電荷修飾を含む従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、可変ドメインＶＨ及びＶＬが交換されている／互いに置き換わっているクロスオーバーＦａｂ分子である。
さらなるそのような態様では、Ｆｃドメインは、本明細書中に記載されるように、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する改変を含む。
なおさらなるそのような態様では、（多重特異性）抗体は、第１及び第２の抗原結合ドメインと、Ｆｃドメインと、任意に１又は複数のペプチドリンカーとから本質的になる。
他の態様では、本発明の二重特異性抗体は、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合ドメインと、
（ｄ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含み、
第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、
（ｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合され、第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されるか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合され、第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。
例示的なそのような構成を図１２Ｅに示す。
そのような一態様では、第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。より具体的なそのような態様では、第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ、可変ドメインＶＨ及びＶＬが交換されている／互いに置き換わっているクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、本明細書に記載の電荷修飾を含む従来のＦａｂ分子である。
別のそのような態様では、第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ、従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子である。より具体的なそのような態様では、第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ、本明細書に記載の電荷修飾を含む従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、可変ドメインＶＨ及びＶＬが交換されている／互いに置き換わっているクロスオーバーＦａｂ分子である。
さらなるそのような態様では、Ｆｃドメインは、本明細書中に記載されるように、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する改変を含む。
なおさらなるそのような態様では、（多重特異性）抗体は、第１、第２及び第３の抗原結合ドメインと、Ｆｃドメインと、任意に１又は複数のペプチドリンカーとから本質的になる。
他の態様では、本発明の二重特異性抗体は、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合ドメインと、
（ｄ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含み、
第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、
（ｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＮ末端において、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合され、第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されるか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合され、第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＮ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合され、第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。
例示的なそのような構成を図１２Ｃに示す。
そのような一態様では、第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。より具体的なそのような態様では、第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ、可変ドメインＶＨ及びＶＬが交換されている／互いに置き換わっているクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、本明細書に記載の電荷修飾を含む従来のＦａｂ分子である。
別のそのような態様では、第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ、従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子である。より具体的なそのような態様では、第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ、本明細書に記載の電荷修飾を含む従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、可変ドメインＶＨ及びＶＬが交換されている／互いに置き換わっているクロスオーバーＦａｂ分子である。
さらなるそのような態様では、Ｆｃドメインは、本明細書中に記載されるように、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する改変を含む。
なおさらなるそのような態様では、（多重特異性）抗体は、第１、第２及び第３の抗原結合ドメインと、Ｆｃドメインと、任意に１又は複数のペプチドリンカーとから本質的になる。
他の態様では、本発明の二重特異性抗体は、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合ドメインと、
（ｄ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第４の抗原結合ドメインと、
（ｅ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第５の抗原結合ドメインと、
（ｆ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含み、
第１、第２、第３、第４及び第５の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、
（ｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第３の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、且つ第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、（ｉｉ）第４の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第５の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、且つ第５の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、（ｉｉｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＮ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＣ末端に融合されている。
例示的なそのような構成を図１２Ｂに示す。
そのような一態様では、第１、第３、第４及び第５の抗原結合ドメインはそれぞれ、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。より具体的なそのような態様では、第１、第３、第４及び第５の抗原結合ドメインはそれぞれ、可変ドメインＶＨ及びＶＬが交換されている／互いに置き換わっているクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、本明細書に記載の電荷修飾を含む従来のＦａｂ分子である。
別のそのような態様では、第１、第３、第４及び第５の抗原結合ドメインはそれぞれ従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子である。より具体的なそのような態様では、第１、第３、第４及び第５の抗原結合ドメインはそれぞれ、本明細書に記載の電荷修飾を含む従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、可変ドメインＶＨ及びＶＬが交換されている／互いに置き換わっているクロスオーバーＦａｂ分子である。
さらなるそのような態様では、Ｆｃドメインは、本明細書中に記載されるように、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する改変を含む。
なおさらなるそのような態様では、（多重特異性）抗体は、第１、第２、第３、第４及び第５の抗原結合ドメインと、Ｆｃドメインと、任意に１又は複数のペプチドリンカーとから本質的になる。
他の態様では、本発明の二重特異性抗体は、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合ドメインと、
（ｄ）第２の抗原に結合する第４の抗原結合ドメインと、
（ｅ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含み、
第１、第２、第３、及び第４の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、
第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＮ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合されており、第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、第４の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＮ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されている。
例示的なそのような構成を図１２Ａに示す。
そのような一態様では、第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメイン及び第４の抗原結合ドメインはそれぞれ、従来のＦａｂ分子である。より具体的なそのような態様では、第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ、可変ドメインＶＨ及びＶＬが交換されている／互いに置き換わっているクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメイン及び第４の抗原結合ドメインはそれぞれ、本明細書に記載の電荷修飾を含む従来のＦａｂ分子である。
別のそのような態様では、第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメイン及び第４抗原結合ドメインはそれぞれ本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子である。より具体的なそのような態様では、第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ、本明細書に記載の電荷修飾を含む従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメイン及び第４の抗原結合ドメインはそれぞれ、可変ドメインＶＨ及びＶＬが交換されている／互いに置き換わっているクロスオーバーＦａｂ分子である。
さらなるそのような態様では、（多重特異性）抗体は、第１、第２、第３及び第４の抗原結合ドメインと、Ｆｃドメインと、任意に１又は複数のペプチドリンカーとから本質的になる。
他の態様では、本発明の二重特異性抗体は、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合ドメインと、
（ｄ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含み、
第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインはＦｖ分子であり、
第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合され、第２の抗原結合ドメインは、（ｉ）Ｆｖ重鎖のＮ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合されており、且つＦｖ軽鎖のＮ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）Ｆｖ重鎖のＮ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されており、且つＦｖ軽鎖のＮ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合されている。
例示的なそのような構成を図１２Ｄに示す。
そのような一態様では、第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ、従来のＦａｂ分子である。
さらなるそのような態様では、Ｆｃドメインは、本明細書中に記載されるように、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する改変を含む。
なおさらなるそのような態様では、（多重特異性）抗体は、第１、第２及び第３の抗原結合ドメインと、Ｆｃドメインと、任意に１又は複数のペプチドリンカーとから本質的になる。
Ｆａｂ分子が、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの各々のＮ末端に融合している（多重特異性）抗体の構造において、２つのＦａｂ分子、ヒンジ領域及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子を本質的に形成する。好ましい態様では、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラス免疫グロブリンである。さらにより好ましい態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリンである。別の態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ４サブクラス免疫グロブリンである。さらに好ましい態様では、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。他の態様では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。一態様では、免疫グロブリンは、ヒト定常領域、特にヒトＦｃ領域を含む。
抗原結合ドメインは、Ｆｃドメインに又は互いに、直接的に又は１又は複数のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合していてもよい。ペプチドリンカーは、当技術分野で公知であり、本明細書に説明される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられる。「ｎ」は、一般的に、１～１０、典型的には２～４の整数である。一態様では、当該ペプチドリンカーは、少なくとも５個のアミノ酸長さ、一態様では５～１００個、さらなる態様では１０～５０個のアミノ酸長さを有する。一態様では、上記ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、ここでＧ＝グリシン、Ｓ＝セリン及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３）であり、一態様では、ｘ＝４及びｎ＝２又は４である。一態様では、ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２又は（Ｇ４Ｓ）４である。特定の態様では、上記の多重特異性抗体フォーマットにおいて第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖を互いに融合するためのペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。さらなる特定の態様では、本明細書中上記の多重特異性抗体フォーマットにおいてＦａｂ分子又はＦｖ分子をＦｃドメインのＣ末端に融合するためのペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）４である。好適なペプチドリンカーはまた、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含んでいてもよい。特に、Ｆａｂ分子が、ＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する場合、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介し、さらなるペプチドリンカーを伴い、又は伴わずに融合してもよい。特定の態様では、本明細書中上記の多重特異性抗体フォーマットにおけるＦｃドメインサブユニットのＮ末端へのＦａｂ分子の融合は、免疫グロブリンヒンジ領域を介して、好ましくはＦｃドメインと同じサブクラスの免疫グロブリンヒンジ領域を介する（例えば、ＦｃドメインがＩｇＧ１サブクラスのものであるＩｇＧ１ヒンジ領域）。
一態様では、本発明は、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインが、配列番号７３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０４のＨＣＤＲ２、及び配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７６の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号７７のＬＣＤＲ２、及び配列番号７８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）第２の抗原、特に標的細胞抗原、より具体的には腫瘍細胞抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含む（多重特異性）抗体と、を含み、
第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、
（ｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、且つ第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、且つ第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されている、（多重特異性）抗体を提供する。
一態様では、本発明は、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインが、配列番号７３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０４のＨＣＤＲ２、及び配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７６の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号７７のＬＣＤＲ２、及び配列番号７８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）第２の抗原、特に標的細胞抗原、より具体的には腫瘍細胞抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインであって、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む、Ｆｃドメインと、
第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、
（ｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、且つ第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、且つ第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されている、（多重特異性）抗体を提供する。
一態様では、本発明は、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインが、配列番号７３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０４のＨＣＤＲ２、及び配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７６の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号７７のＬＣＤＲ２、及び配列番号７８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む第１の抗原結合ドメインと
（ｂ）第２の抗原、特に標的細胞抗原、より具体的には腫瘍細胞抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含む（多重特異性）抗体であって、
第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、
（ｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、且つ第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、且つ第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているいずれかであり、
Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１又は複数のアミノ酸置換を含み、及び／又は抗体がＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）に結合しない、（多重特異性）抗体を提供する。
一態様では、本発明は、
ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号７３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０４のＨＣＤＲ２及び配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号７６の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号７７のＬＣＤＲ２及び配列番号７８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）第２の抗原、特に標的細胞抗原、より具体的には腫瘍細胞抗原に結合する第２の抗原結合ドメインであって、第２の抗原結合ドメインは（従来の）Ｆａｂ分子である、第２の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含む、（多重特異性）抗体であって、
（ｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、且つ第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、且つ第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されている、（多重特異性）抗体を提供する。
本発明による（多重特異性）抗体の異なる構造の全てにおいて、本明細書に記載されるアミノ酸置換（「電荷改変」）は、存在する場合、第２の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメイン、又は第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子のＣＨ１又はＣＬドメインのいずれかにおけるものであってもよい。好ましくは、これらは、第２の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子のＣＨ１ドメイン及びＣＬドメイン内にある。本発明の概念によれば、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第２の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子においてなされる場合、そのようなアミノ酸置換は、第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子においてはなされない。逆に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子においてなされる場合、そのようなアミノ酸置換は、第２の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子においてはなされない。アミノ酸置換は、好ましくは、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ１が互いに置き換わっているＦａｂ分子を含む（多重特異性）抗体において行われる。
本発明による（多重特異性）抗体の好ましい態様では、特に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第２の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。本発明による（多重特異性）抗体の他の態様では、特に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。いくつかの態様では、第２の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬ、並びに第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。
一態様では、本発明は、
ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号７３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０４のＨＣＤＲ２及び配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号７６の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号７７のＬＣＤＲ２及び配列番号７８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）第２の抗原、特に標的細胞抗原、より具体的には腫瘍細胞抗原に結合する第２の抗原結合ドメインであって、第２の抗原結合ドメインは（従来の）Ｆａｂ分子である、第２の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含む、（多重特異性）抗体であって、
ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
（ｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、且つ第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、且つ第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されている、（多重特異性）抗体を提供する。
上記の態様のいずれかによると、（多重特異性）抗体の構成要素（例えば、Ｆａｂ分子、Ｆｃドメイン）は、直接的に又は様々なリンカーを介して、特に本明細書に記載される又は当技術分野において知られている、１又は複数のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合されていてもよい。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれ、「ｎ」は通常１～１０、典型的には２～４の整数である。
本発明のこれらの態様による一態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号８０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
本発明のこれらの態様による一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、位置３６６のトレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、位置４０７のチロシン残基がバリン残基で置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、任意に位置３６６のトレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
本発明のこれらの態様によるさらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基で置き換えられている（Ｓ３５４Ｃ）か又は位置３５６のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、位置３４９のチロシン残基がシステイン残基により置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
本発明のこれらの態様によるさらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの各々において、位置２３４のロイシン残基がアラニン残基（Ｌ２３４Ａ）と置き換わっており、位置２３５のロイシン残基がアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３５Ａ）、位置３２９のプロリン残基がグリシン残基により置き換えられている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
本発明のこれらの態様によるさらなる態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
一態様では、本発明は、配列番号２０９の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２１０の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２１１の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号２１２の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＥＡに結合する（多重特異性）抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号２０９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２１１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号２１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＥＡに結合する（多重特異性）抗体を提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号２１３の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２１４の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２１５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号２１６の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＥＡに結合する（多重特異性）抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号２１３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２１４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２１５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＥＡに結合する（多重特異性）抗体を提供する。
さらなる態様では、本発明は、配列番号２１３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号２１４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含み、ＶＬ領域配列（配列番号１９３）が配列番号１８５、１８７、１８９、１９１、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５及び２０７からなる群から選択されるＶＬ領域配列によって置き換えられている、配列番号２１５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号２１６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含み、ＶＨ領域配列（配列番号１９２）が配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４及び２０６からなる群から選択されるＶＨ領域配列によって置き換えられている、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＥＡに結合する（多重特異性）抗体を提供する。一態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＥＡに結合する（多重特異性）抗体であって、配列番号２１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、ＶＬ領域配列（配列番号１９３）が、配列番号１８５、１８７、１８９、１９１、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５及び２０７からなる群から選択されるＶＬ領域配列によって置き換えられている配列番号２１４のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号２１５のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、ＶＨ領域配列（配列番号１９２）が、配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４及び２０６からなる群から選択されるＶＨ領域配列によって置き換えられている配列番号２１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＥＡに結合する（多重特異性）抗体を提供する。好ましくは、上記の態様では、ＶＨ及びＶＬ領域（配列番号１９２及び１９３）は、表１６で特定される結合因子に対応するＶＨ及びＶＬ領域の対によって置き換えられる。
２．Ｆｃドメイン変異体
好ましい態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。
（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、ダイマーであり、それぞれのサブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。一態様では、本発明の（多重特異性）抗体は１つを超えるＦｃドメインを含まない。
一態様では、（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインである。好ましい態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。別の態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング）。このアミノ酸置換は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩｇＧ４抗体のＦａｂアーム交換を低減する（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照されたい）。さらなる好ましい態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。より好ましい態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の例示的な配列は、配列番号８６で与えられる。
ａ）ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明による（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合し得る異なる抗原結合ドメインを含み、したがってＦｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量化によって、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組合せが生じる。組換え産生における（多重特異性）抗体の収率及び純度を改善するため、（多重特異性）抗体のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利である。
したがって、好ましい態様では、本発明による（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、一態様では、当該修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。
ヘテロ二量体化を強化するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中の修飾に複数の手法が存在し、それらは例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号に十分に記載されている。典型的には、全てのそのような手法において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは、両方とも、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを含む重鎖）がもはやそれ自体とホモ二量体化することができず、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化させるような（第１及び第２のＣＨ３ドメインがヘテロ二量体化し、２つの第１又は２つの第２のＣＨ３ドメインの間にホモ二量体が形成されないような）、相補的な様式で操作される。改善された重鎖ヘテロ二量体化のためのこれらの異なる手法は、重鎖／軽鎖の誤対合及びベンス・ジョーンズ型副生成物を低減する、（多重特異性）抗体における重鎖－軽鎖修飾との組合せでの異なる代替例として考慮される（例えば、１つの結合アームにおけるＶＨ及びＶＬの交換／置き換え、並びにＣＨ１／ＣＬ界面における反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）。
具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ（ｋｎｏｂ）」修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール（ｈｏｌｅ）」修飾を含む。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることによって構築される。突起と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。
したがって、好ましい態様では、（多重特異性）抗体のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖量を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に配置可能な突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖量を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置することが可能である。
好ましくは、より大きな側鎖量を有する当該アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。
好ましくは、より小さな側鎖量を有する当該アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。
突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作り出すことができる。
具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）において、位置３６６のトレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）において、位置４０７のチロシン残基がバリン残基で置き換えられている（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、位置３６６のトレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
さらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に位置３５４のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｓ３５４Ｃ）又は位置３５６のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に位置３４９のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの間にジスルフィド架橋の形成が生じ、二量体がさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。
好ましい態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
好ましい態様では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、（任意に、第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメイン及び／又はペプチドリンカーを介して）Ｆｃドメインの（「ノブ」改変を含む）第１のサブユニットに融合する。理論に拘束されるものではないが、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインの、Ｆｃドメインのノブ含有サブユニットへの融合は、ＣＤ３に結合する２つの抗原結合ドメインを含む抗体の生成（２つのノブ含有ポリペプチドの立体的衝突（ｓｔｅｒｉｃ ｃｌａｓｈ））を（さらに）最小化する。
ヘテロ二量体化を強化するＣＨ３修飾のための他の技術が本発明による代替例として考慮され、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されている。
一態様では、欧州特許第１８７０４５９号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。この手法は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面における特定のアミノ酸位置における反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入に基づく。本発明の（多重特異性）抗体の特定の態様は、（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインの一方におけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他方におけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
別の態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、追加的に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
別の態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むか、又は当該（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、追加的に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋを含む（全てＫａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一態様では、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインは、さらなるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。さらなる態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅから選択されるアミノ酸変異（特に、Ｌ３６８Ｅ）をさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一態様では、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様では、第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０又はＫ３９２に、例えば、ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ又はＳ４００Ｋ、ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅから選択されるさらなるアミノ酸変異を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒをさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一態様では、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用され、例えば、３６８及び４０９からなる群から選択される位置にアミノ酸修飾を有する（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一態様では、上記に記載されたノブ・イントゥ・ホール技術も使用する、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ｔを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一態様では、（多重特異性）抗体又はそのＦｃドメインは、ＩｇＧ２サブクラスのものであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。
代替的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する改変は、例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるように、静電操縦効果に介在する改変を含む。一般的に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの界面に、ホモ二量体生成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量化が静電的に望ましいように、帯電したアミノ酸残基による１又は複数のアミノ酸残基の置き換えを含む。そのような一態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負に帯電したアミノ酸によるＫ３９２又はＮ３９２のアミノ酸置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）による、特にＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）を含み、第２のＣＨ３ドメインは、正に帯電したアミノ酸によるＤ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６又はＥ３５７のアミノ酸置換（例えば、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）による、特にＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ又はＥ３５７Ｋ、より特にはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）を含む。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負に帯電したアミノ酸によるＫ４０９又はＲ４０９のアミノ酸置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）による、特にＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）をさらに含む。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））によるＫ４３９及び／又はＫ３７０のアミノ酸置換を追加的に又は代替的に含む（全てＫａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
さらなる態様では、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ及びＫ２９２Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
また別の態様では、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されているヘテロ二量体化手法を代替的に使用することができる。
一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
ｂ）Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を下げるＦｃドメイン改変
Ｆｃドメインは、（多重特異性）抗体に、標的組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期を含む好ましい薬物動態特性及び好ましい組織血液分布比を付与する。同時に、Ｆｃ受容体を発現する細胞への（多重特異性）抗体のＦｃドメインを介した結合は、Ｆｃ受容体発現細胞（ＮＫ細胞等）と他のＮＫＧ２Ｄ発現細胞（ＣＤ８ Ｔ細胞等）との架橋をもたらし、それによって全身投与時に望ましくない毒性をもたらす可能性がある。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出をもたらすことがあり、これはＴ細胞活性化特性及び（多重特異性）抗体の長い半減期と組み合わさって、全身投与するとサイトカイン受容体の過剰な活性化及び重篤な副作用を生じる。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体担持）免疫細胞の活性化は、例えば、ＮＫ細胞によるＴ細胞の破壊の可能性によって、（多重特異性）抗体の有効性さえも低減し得る。
したがって、好ましい態様では、本発明による（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を呈する。そのような一態様では、Ｆｃドメイン（又は当該Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）は、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）と比較して、５０％未満、特に２０％未満、より特には１０％未満、最も特には５％未満の結合親和性をＦｃ受容体に対して呈する、及び／又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）と比較して、５０％未満、特に２０％未満、より特には１０％未満、最も特には５％未満のエフェクター機能を呈する。一態様では、Ｆｃドメイン（又は上記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない及び／又はエフェクター機能を誘導しない。好ましい態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）である。一態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される１又は複数である。好ましい態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一つの態様では、Ｆｃドメインのドメインは、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は当該Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）が、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）の約７０％超、特に約８０％超、より特には約９０％超の結合親和性をＦｃＲｎに対して呈するとき、達成される。
ある特定の態様では、Ｆｃドメインは、非操作Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性が低減される及び／又はエフェクター機能が低減されるように操作される。好ましい態様では、（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減する１又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、同じ１又は複数のアミノ酸変異が存在する。一態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を下げる。一態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１又は少なくとも１０分の１に低減する。Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を低減する１つを超えるアミノ酸変異が存在する態様では、これらのアミノ酸変異の組合せは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１又はさらには少なくとも５０分の１にまで低減し得る。一態様では、操作Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体は、非操作Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体と比較して、２０％未満、特に１０％未満、より特には５％未満の結合親和性をＦｃ受容体に対して呈する。好ましい態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）である。好ましくは、これらそれぞれの受容体に対する結合が低下する。いくつかの態様では、補体成分に対する結合親和性（具体的には、Ｃ１ｑに対する結合親和性）も低下する。一態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は、低下しない。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合、即ち、当該受容体へのＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は当該Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）が、Ｆｃドメインの非操作形態（又は当該Ｆｃドメインの非操作形態を含む（多重特異性）抗体）の結合親和性の約７０％超をＦｃＲｎ対して呈するとき、達成される。Ｆｃドメイン又は当該Ｆｃドメインを含む本発明の（多重特異性）抗体は、そのような親和性の約８０％超、さらには約９０％超を呈し得る。ある特定の態様では、（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、非操作Ｆｃドメインと比較して、エフェクター機能が低減されるように操作される。エフェクター機能の低減として、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞への結合の低減、マクロファージへの結合の低減、単球への結合の低減、多形核細胞への結合の低減、直接的なシグナル伝達誘導性アポトーシスの低減、標的結合抗体の架橋の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの１又は複数を挙げることができるが、これらに限定されない。一態様では、エフェクター機能の低減は、ＣＤＣの低減、ＡＤＣＣの低減、ＡＤＣＰの低減及びサイトカイン分泌の低減の群から選択される１又は複数である。好ましい態様では、低下したエフェクター機能は、低下したＡＤＣＣである。一態様では、ＡＤＣＣの低減は、非操作Ｆｃドメイン（又は非操作Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
一態様では、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減するアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。いくつかの態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。そのような一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。一態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。好ましい態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より好ましい態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。具体的には、好ましい態様では、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング）、即ち、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットのそれぞれにおいて、位置２３４のロイシン残基はアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３４Ａ）、位置２３５のロイシン残基はアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３５Ａ）、位置３２９のプロリン残基はグリシン残基と置き換わっている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
そのような一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組合せは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（同様に補体）結合をほとんど完全に消滅させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号は、そのような変異Ｆｃドメインの調製方法及びその特性、例えばＦｃ受容体結合又はエフェクター機能を決定するための方法も記載する。
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及びエフェクター機能の低減を呈する。したがって、いくつかの態様では、本発明の（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。一態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能をさらに低減させるため、一態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｌ２３５におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。別の態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。好ましい態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。そのようなＩｇＧ４ Ｆｃドメイン変異体及びこれらのＦｃγ受容体結合特性は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている。
好ましい態様では、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を呈するＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
ある特定の態様では、ＦｃドメインのＮ－グリコシル化が排除された。そのような一態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｎ２９７におけるアミノ酸変異、特にアスパラギンをアラニンにより置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸に置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ｄ）を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
本明細書に上述され、且つ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているＦｃドメインに加え、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低減されたＦｃドメインには、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１又は複数の置換を有するものも含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。そのようなＦｃ変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうち２つ以上での置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
変異体Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用い、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は改変によって調製することができる。遺伝的方法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的変異導入法、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含んでいてもよい。正しいヌクレオチド変化は、例えば、スクリーニングによって確認することができる。
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な装置と組換え発現によって得られ得るＦｃ受容体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。代替的に、Ｆｃ受容体に関するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して評価してもよい。
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体のエフェクター機能は、当技術分野に既知の方法によって測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例は、米国特許第５，５００，３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載されている。代替的に、非放射性アッセイを用いてもよい（例えば、ＡＣＴＩ（商標）フローサイトメトリー用非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）及びナチュラルキラー（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ：ＮＫ）細胞が挙げられる。これに代えて、又はさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価されてもよい。
いくつかの態様では、相補性構成要素に対する（特定的にはＣ１ｑに対する）Ｆｃドメインの結合が低下する。したがって、Ｆｃドメインが低減されたエフェクター機能を有するように操作されるいくつかの態様では、当該低減されたエフェクター機能は、低減されたＣＤＣを含む。Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体がＣ１ｑに結合することができ、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２、１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ １０１、１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ １０３、２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。
ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定は、当技術分野で既知の方法を使用して実施することもできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照されたい）。
Ｂ．ポリヌクレオチド
本発明は、本発明の抗体をコードする単離ポリヌクレオチドをさらに提供する。そのような単離ポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチドであってよい。
本発明の（多重特異性）抗体をコードするポリヌクレオチドは、完全な抗体をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は共発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。共発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な抗体を形成し得る。例えば、抗体の軽鎖部分は、抗体の重鎖を含む抗体の一部分に由来する別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。共発現すると、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合し、抗体を形成する。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットのうち一方と、任意に１又は複数のＦａｂ分子（の一部）とを含む抗体の一部分は、２つのＦｃドメインサブユニットの他方と、任意にＦａｂ分子（の一部）とを含む抗体の一部分に由来する別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。共発現すると、Ｆｃドメインサブユニットは会合してＦｃドメインを形成する。
いくつかの態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように本発明による抗体分子全体をコードする。他の態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように本発明による抗体に含まれるポリペプチドをコードする。
ある特定の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
Ｃ．組換え方法
本発明の抗体は、例えば、固体状態ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組換え産生によって得られてもよい。組換え産生について、抗体をコードする１つ又以上のポリヌクレオチド、例えば、上述のものは、さらなるクローニング及び／又は宿主細胞での発現のために、単離され、１又は複数のベクターに挿入される。そのようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用い、容易に単離され、配列決定されてもよい。一態様では、本発明のポリヌクレオチド（とりわけ単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド）を含むベクター、特に発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用し、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、抗体のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよく、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、抗体をコードするポリヌクレオチド（即ち、コード領域）が、プロモーター及び／又は他の転写又は翻訳制御要素と共に操作可能に会合してクローン化される発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると考えられてもよいが、存在する場合、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域等は、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中に例えば、単一のベクター上に存在していてもよく、又は別個のポリヌクレオチド構築物中に例えば別個の（異なる）ベクター上に存在していてもよい。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、１又は複数のポリペプチドをコードしてもよく、翻訳後又は翻訳と同時に、タンパク質分解による開裂によって、最終的なタンパク質へと分離される。これに加え、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、又はその変異体若しくは誘導体に融合するか、又は融合しない、異種コード領域をコードし得る。異種コード領域としては、限定されないが、特殊な要素又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインが挙げられる。作動可能な会合は、ある遺伝子産物（例えばポリペプチド）のコード領域が、制御配列（複数可）の影響下又は制御下で、遺伝子産物の発現を行うような様式で、１又は複数の制御配列と会合する。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域及びこれに関連するプロモーター）は、プロモーター機能の導入によって、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が起こる場合、２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を試行する発現制御配列の能力を妨害しないか、又はＤＮＡテンプレートを転写する能力を妨害しない場合、「作動可能に会合する」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが核酸の転写を行うことが可能な場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合していてもよい。プロモーターは、所定の細胞内でのＤＮＡの実質的な転写のみに指向する細胞特異的なプロモーターであってもよい。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、転写停止シグナルは、細胞特異的な転写に指向するために、ポリヌクレオチドに作動可能に会合してもよい。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は、本明細書に開示される。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば最初期プロモーター、イントロン－Ａと組み合わせる）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス等）が挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ－グロビン、並びに真核細胞において遺伝子発現を制御することのできる他の配列が挙げられる。さらなる適切な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター（例えばテトラサイクリン誘導性プロモーター）が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御要素は、当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び停止コドン、ウイルス系から誘導される要素（特に、内部リボソーム侵入部位、即ちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。発現カセットは、例えば、複製の起源及び／又は染色体組み込み要素、例えば、レトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）等の他の特徴も含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌又はシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と会合してもよく、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指向する。例えば、抗体の分泌が望ましい場合、シグナル配列をコードするＤＮＡは、本発明の抗体又はその断片をコードする核酸の上流に置かれていてもよい。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有しており、これらは、粗い小胞体を通って成長したタンパク質鎖が外に出始めると、成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的に、ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有しており、ポリペプチドの分泌した形態又は「成熟」形態を産生するために、翻訳されたポリペプチドから切断されることを知っている。ある特定の態様では、ネイティブシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又は作動可能に会合するポリペプチドの分泌を指示する能力を保持する配列の機能性誘導体が使用される。又は、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
後の精製を容易にするため又は抗体を標識するのに役立てるために使用可能な短いタンパク質配列（例えば、ヒスチジンタグ）をコードするＤＮＡが、ポリヌクレオチドをコードする抗体（断片）の中に、又はその末端に含まれていてもよい。
さらなる態様では、本発明のポリヌクレオチド（即ち、単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド）を含む宿主細胞が提供される。ある特定の態様では本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載する特徴のいずれかを単独で、又は組み合わせて組み込んでもよい。そのような一態様では、宿主細胞は、本発明の抗体（の一部）をコードする１又は複数のポリヌクレオチドを含む１又は複数のベクターを含む（例えば、それらで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の抗体又はその断片を生成するように操作することが可能な任意の種類の細胞系を指す。抗体の複製及び発現補助に適した宿主細胞は、当技術分野で周知である。そのような細胞は、適切な場合、特定の発現ベクターを用いてトランスフェクト又は形質導入されてよく、大規模発酵機に接種するために大量のベクターを含む細胞を成長させ、臨床用途に十分な量の抗体 を得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核微生物（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））又は種々の真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等が挙げられる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要とされない場合には、細菌内で産生されてもよい。発現後、ポリペプチドは、適切なフラクション中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製されてもよい。原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ポリペプチドをコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照されたい。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞も、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、昆虫細胞と組み合わせて使用することができ、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用することができる。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、米国特許第６，０４０，４９８号、米国特許第６，４２０，５４８号、米国特許第７，１２５，９７８号、及び米国特許第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児性腎株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載される２９３又は２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ：ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）；例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；並びにＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））、骨髄腫細胞株、例えば、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質産生に適したある特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。一態様では、宿主細胞は、真核細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）といった哺乳動物細胞である。一態様では、宿主細胞は、ヒト身体中の細胞ではない。
これらの系において外来遺伝子を発現させる標準的な技術は、当技術分野で既知である。抗体等の抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞を操作して他方の抗体鎖も発現させ、発現した生成物が、重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体となるようにすることができる。
一態様では、本発明による抗体を生成する方法が提供され、この方法は、抗体の発現に適した条件下で、本明細書に提供される抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び任意に、宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することを含む。
本発明の（多重特異性）抗体の成分は、互いに遺伝的に融合され得る。（多重特異性）抗体は、その構成要素が互いに直接的に又はリンカー配列を通して間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当技術分野で周知の方法に従って決定されてもよく、有効性について試験されてもよい。（多重特異性）抗体の異なる構成要素の間のリンカー配列の例が、本明細書で提供される。必要に応じて、開裂部位を組み込んで融合の個々の構成要素を分離するために、追加の配列が含まれていてもよい（例えば、エンドペプチダーゼ認識配列）。
本明細書で記載するように調製される抗体は、例えば、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等の当技術分野で既知の技術によって精製されてもよい。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には、正味の電荷、疎水性、親水性等の因子に依存し、当業者には明らかである。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、抗体が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の抗体のアフィニティークロマトグラフィー精製のために、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続したプロテインＡ又はＧのアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、実施例に本質的に記載されるように抗体を単離することができる。抗体の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーを含む種々の周知の分析方法のいずれかによって決定することができる。
Ｄ．アッセイ
本明細書に提供される抗体は、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物活性について、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、同定、スクリーニング、又は特性評価され得る。
１．結合アッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対する抗体の結合（親和性）は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な器具類、及び例えば組換え発現により入手可能な受容体又は標的タンパク質を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定することができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対する抗体の結合が、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、評価されてもよい。ヒト又はカニクイザルＮＫＧ２Ｄに対する結合活性を測定するための特定の説明的且つ例示的な態様が以下に記載される。
一態様では、ＮＫＧ２Ｄに対する結合活性は、以下のようにＳＰＲによって決定される：
ＳＰＲをＢｉａｃｏｒｅ Ｂ４０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行う。抗Ｆａｂ捕捉抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃２８９５８３２５）は、標準的なアミンカップリングケミストリーを用いて、約１５００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度でＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化される。ランニングバッファー及び希釈バッファーとしては、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）を用いる。フローセルを２５℃に設定し、ランニングバッファーで２回プライミングする。
約１０μｇ／ｍｌの溶液を１０μｌ／分の流速で６０秒間注入することによって、抗体を捕捉する。会合は、溶液中の様々な濃度のｄｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉ（配列番号９６）又はｄｉ ｃｙＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉ（配列番号９７）を、６００ｎＭ、３００ｎＭ、１５０ｎＭから開始して１：３希釈後に３０μｌ／分の流量で１８０秒間注入することによって測定する。解離段階を最大４５０秒間監視し、サンプル溶液からランニングバッファーに切り替えることで誘発する。流速３０μｌ／分及び追加の安定化時間１８０秒で１０ｍＭグリシンｐＨ２．１で２×９０秒間洗浄することによって、表面を再生する。バルク屈折率差を、捕捉抗体のみで表面から得られた応答を差し引くことによって補正する。ブランク注入も差し引く（二重参照）。ＫＤ、ｋａ及びｋｄの計算には、Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ １．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＴｒａｃｅＤｒａｗｅｒ １．６．１（Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＢ）のＬａｎｇｍｕｉｒ １：１モデルを使用する。
２．活性アッセイ
本発明の（多重特異性）抗体の生物活性は、実施例に記載されるように、様々なアッセイによって測定することができる。生物学的活性としては、例えば、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞の増殖の誘導、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞におけるシグナル伝達の誘導、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞における活性化マーカーの発現の誘導、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞等の標的細胞の溶解の誘導、並びに腫瘍退縮の誘導及び／又は生存の改善を挙げることができる。
Ｅ．組成物、製剤及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば以下の治療方法のいずれかにおいて使用するための、本明細書に提供される抗体のうちのいずれかを含む医薬組成物を提供する。一態様では、医薬組成物は、本発明による抗体と、薬学的に許容され得る担体とを含む。別の態様では、医薬組成物は、本発明による抗体と、少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、以下に記載するものとを含む。
さらには、ｉｎ ｖｉｖｏでの与に適した形態で本発明の抗体を生成する方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明による抗体を得ること、及び（ｂ）抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体とを配合し、それによって、抗体の製剤を、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与のために配合することとを含む。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体に溶解又は分散した有効量の抗体を含む。「薬学的に許容され得る」という表現は、通常、使用する投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、即ち、適切な、例えばヒトといった動物に投与したときに、有害な反応、アレルギー反応又は他の不都合な反応を生まない分子要素及び組成物を指す。抗体と、任意にさらなる有効成分とを含む医薬組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０に例示される本開示の観点から、当業者に既知である。さらに、動物（例えば、ヒト）投与の場合、製剤が、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ又は他の国の対応する機関によって要求される滅菌性、発熱原性、一般的安全性及び純度基準を満たすべきであることが理解されるであろう。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」は、当業者に知られているように（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９－１３２９を参照されたい）、任意及び全ての溶媒、緩衝液、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定化剤、ポリマー、ゲル、バインダー、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、染料、そのような類似の材料及びこれらの組合せを含む。任意の従来の担体が、有効成分と不適合である場合を除き、医薬組成物における使用が想定される。
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所処置のために望まれる場合、病変内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口輸液には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が含まれる。投薬は、任意の適切な経路によるもの、例えば、一部には、投与が一時的であるか慢性的であるかに依存して、注射によって、例えば、静脈又は皮下への注射によるものであってもよい。
非経口組成物としては、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内、又は腹腔内注射により投与されるように設計されているものが挙げられる。注射のため、本発明の抗体は、水溶液中、特に生理学的に適合性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル液又は生理食塩水緩衝液中で製剤化され得る。溶液は、配合剤、例えば、懸濁剤、安定化剤及び分散剤を含有していてもよい。代替的に、抗体は、適切なビヒクル、例えば、滅菌した発熱性物質除去水と共に使用前に構成するための粉末形態であってもよい。滅菌した注射可能な溶液は、必要に応じて以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の抗体を必要な量で適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁物又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意のさらなる所望な成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝化されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造条件及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の混入作用から保護されなければならない。エンドトキシン汚染を安全なレベルに最小限に、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に維持すべきであることが認識されるだろう。適切な薬学的に許容され得る担体としては、限定されないが、緩衝液、例えば、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を上げる化合物（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストラン等）を含んでいてもよい。任意に、懸濁物は、適切な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油注射懸濁物として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪族油（例えば、ゴマ油）、又は合成脂肪酸エステル（例えば、エチルクリート（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）又はトリグリセリド）又はリポソームが挙げられる。
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよく（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに封入されてもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセル等の成型物品の形態である。特定の態様では、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組合せの組成物での使用によってもたらすことができる。
前述の組成物に加え、抗体は、デポ剤として配合されてもよい。そのような長く作用する製剤は、埋め込みによって（例えば、皮下又は筋肉内）、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、抗体は、適切なポリマー若しくは疎水性材料（例えば、許容され得る油中のエマルジョンとして）若しくはイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として配合されてもよい。
本発明の抗体を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスによって製造されてもよい。医薬組成物は、１又は複数の生理学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤又はタンパク質を薬学的に使用可能な製剤へと加工するのを容易にする補助剤を用い、従来の様式で配合されてもよい。適切な製剤は、選択する投与経路によって変わる。
抗体は、遊離酸若しくは遊離塩基、中性又は塩形態で組成物に配合されてもよい。薬学的に許容され得る塩は、遊離酸又は遊離塩基の生体活性を実質的に保持する塩である。薬学的に許容され得る塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質組成物の遊離アミノ基と形成される酸付加塩、又は塩酸又はリン酸等の無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸等の有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムの水酸化物又は水酸化第二鉄等の無機塩基から誘導されてもよく、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカイン等の有機塩基から誘導されてもよい。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。
Ｆ．治療方法及び組成物
本明細書で提供される抗体のいずれも、治療方法に使用することができる。本発明の抗体は、例えばがんの処置において、免疫治療剤として使用され得る。
治療方法における使用のために、本発明の抗体は、医学行動規範と一致した様式で配合され、用量決定され、投与される。これに関連して考慮すべき要因としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。
一態様では、医薬としての使用のための本発明の抗体が提供される。さらなる態様では、疾患の処置における使用のための本発明の抗体が提供される。ある特定の態様では、処置の方法における使用のための本発明の抗体が提供される。一態様では、本発明は、疾患の治療を必要とする個体の疾患の処置における使用のための本発明の抗体を提供する。ある特定の態様では、本発明は、個体に有効量の抗体を投与することを含む、疾患を有する個体を処置する方法における使用のための抗体を提供する。ある特定の態様では、処置される疾患は、増殖性障害である。好ましい態様では、疾患は、がんである。ある特定の態様では、この方法は、さらに、個体に、有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤（例えば、処置される疾患ががんである場合、抗がん剤）を投与することを含む。さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導することに使用するための本発明の抗体を提供する。ある特定の態様では、本発明は、標的細胞の溶解を誘導するために個体に有効量の抗体を投与することを含む、個体において、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用のための本発明の抗体を提供する。ある特定の態様では、方法は、Ｔ細胞活性化剤、例えばＣＤ３に結合する抗体、特にＣＤ３及び標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、に結合する二重特異性抗体を投与することをさらに含む。ある特定の態様では、使用は、Ｔ細胞活性化剤、例えばＣＤ３に結合する抗体、特にＣＤ３及び標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、に結合する二重特異性抗体と組み合わせたものである。上記のいずれかの態様に係る「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明の抗体の使用を提供する。一態様では、医薬は、疾患の処置を必要とする個体における、疾患の処置のためのものである。さらなる態様では、医薬は、疾患を有する個体に対し、有効量の医薬を投与することを含む、疾患を処置する方法における使用のためのものである。ある特定の態様では、処置される疾患は、増殖性障害である。好ましい態様では、疾患は、がんである。一態様では、この方法は、個体に対し、少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、処置される疾患ががんである場合は抗がん剤）の有効量を投与することをさらに含む。さらなる態様では、医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。またさらなる態様では、医薬は、標的細胞の溶解を誘導するために個体に対して有効量の医薬を投与することを含む、個体において、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用のためのものである。ある特定の態様では、方法は、Ｔ細胞活性化剤、例えばＣＤ３に結合する抗体、特にＣＤ３及び標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、に結合する二重特異性抗体を投与することをさらに含む。ある特定の態様では、処置は、Ｔ細胞活性化剤、例えばＣＤ３に結合する抗体、特にＣＤ３及び標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、に結合する二重特異性抗体と組み合わせたものである。上記のいずれかの態様による「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってよい。
さらなる態様では、本発明は、疾患を処置するための方法を提供する。一態様では、この方法は、そのような疾患を有する個体に対し、本発明の抗体の有効量を投与することを含む。一態様では、組成物は、上記個体に投与され、本発明の抗体を薬学的に許容され得る形態で含んでいる。ある特定の態様では、処置される疾患は、増殖性障害である。好ましい態様では、疾患は、がんである。ある特定の態様では、この方法は、さらに、個体に、有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤（例えば、処置される疾患ががんである場合、抗がん剤）を投与することを含む。ある特定の態様では、方法は、Ｔ細胞活性化剤、例えばＣＤ３に結合する抗体、特にＣＤ３及び標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、に結合する二重特異性抗体を投与することをさらに含む。上記のいずれかの態様による「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってよい。
さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法を提供する。一態様では、この方法は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下において、標的細胞を本発明の抗体と接触させることを含む。さらなる態様では、個体において、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法が提供される。そのような一態様では、方法は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するために、有効量の本発明の抗体を投与することを含む。ある特定の態様では、方法は、Ｔ細胞活性化剤、例えばＣＤ３に結合する抗体、特にＣＤ３及び標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、に結合する二重特異性抗体を投与することをさらに含む。一態様では、「個体」は、ヒトである。
ある特定の態様では、処置される疾患は、増殖性障害、特にがんである。がんの非限定的な例としては、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌腫、骨がん及び腎臓がんが挙げられる。本発明の抗体を用いて処置され得る他の細胞増殖障害としては、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域及び泌尿生殖器系に位置する新生物が挙げられる。前がん状態又は病変及びがん転移も含まれる。ある特定の態様では、がんは、腎臓がん、膀胱がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がん及び前立腺がんからなる群から選択される。一態様では、がんは、第２の抗原を発現するがんである。当業者であれば、多くの場合に、抗体は治癒を提供せずに部分的な恩恵のみを提供する場合があることを容易に認識する。いくつかの態様では、いくらかの効果を有する生理学的変化もまた、治療上有益であるとみなされる。したがって、いくつかの態様では、生理学的変化を与える抗体の量は、「有効量」と考えられる。処置が必要な対象、患者又は個体は、典型的には、哺乳動物であり、より特定的には、ヒトである。
いくつかの態様では、有効量の本発明の抗体が、疾患を処置するために個体に投与される。
疾患の予防又は処置のために、本発明の抗体の適切な投薬量（単独で又は１又は複数の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、抗体の種類、疾患の重篤度及び経過、抗体が予防目的で投与されるか又は治療目的で投与されるか、以前又は現在の治療介入、患者の病歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。投与に責任を持つ施術者はいずれにせよ、組成物中の有効成分（複数可）の濃度、及び個々の対象での適切な用量（複数可）を決定する。単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス輸注を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図される。
本発明の抗体は、好適には、患者に一度に又は一連の処置にわたって投与される。疾患の種類及び重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体を、例えば、１又は複数回の別個の投与によるか、又は連続的な注入によるかにかかわらず、患者に投与するための初期の候補投薬量とすることができる。典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。数日間又はそれ以上にわたる反復投与において、状態に応じ、処置は通常、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。抗体の１つの例示的な投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の非限定的な例では、用量は、１回の投与当たり、約１μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、又はそれよりも多く、及びこれらから誘導される任意の範囲を含んでもよい。本明細書に列挙される数から誘導可能な範囲の非限定的な例では、約５ｍｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重～約５００ｍｇ／ｋｇ体重等の範囲を、上述の数に基づいて投与することができる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組合せ）の１回以上の投薬を患者に投与してもよい。かかる用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間毎（例えば、患者が約２～約２０回、又は例えば約６回の用量の抗体を受容するように）投与されてもよい。最初の多めの投与量、それに続く１回以上の量の少ない用量を投与してよい。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であってもよい。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
本発明の抗体は、通常、意図した目的を達成するために有効な量で使用される。疾患状態を処置又は予防するための使用のために、本発明の抗体、又はその医薬組成物が、有効量で投与又は塗布される。
全身投与の場合、有効な用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば細胞培養アッセイから最初に概算することができる。次いで、細胞培養物で決定されるようなＩＣ５０を含む血中濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルで配合してもよい。そのような情報を使用し、ヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定することができる。
初期用量も、ｉｎ ｖｉｖｏデータから、例えば、動物モデルから、当技術分野で周知の技術を用いて概算することができる。
治療効果を維持するために十分な抗体の血漿濃度を与えるように、投薬量及び投薬間隔は個々に調節されてもよい。注射による投与に有用な患者投薬量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療に有効な血漿濃度は、各日に複数回用量を投与することによって達成されてもよい。血漿中のレベルは、例えば、ＨＰＬＣによって測定されてもよい。
本発明の抗体の有効用量は、一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療上の利益を提供する。抗体の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物実験を使用し、ＬＤ５０（集団の５０％が致死に至る用量）及びＥＤ５０（集団の５０％が治療に有効である用量）を決定することができる。毒性と治療効果との間の投薬比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きい治療指数を呈する抗体が好ましい。一態様では、本発明による抗体は、高い治療指数を呈する。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータを、ヒトでの使用に適した投与範囲を配合する際に使用することができる。投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、全くない状態で、ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、例えば、使用される投与量、利用される投与経路、対象の状態等の種々の因子に依存して、この範囲内で変動してもよい。正確な製剤、投与経路及び投与量は、患者の状態（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１のＦｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５を参照されたい）を考慮して個々の医師が選択することができる。
本発明の抗体で処置される患者の主治医は、毒性、臓器不全等に起因して、どのように、いつ、投与を中止、中断、又は調整するかを知っているであろう。逆に、主治医は、臨床応答が充分ではない場合（毒性を生じずに）、処置をもっと高レベルにするように調整することも知っている。関心のある障害の管理において投与される用量の大きさは、処置される状態の重篤度、投与経路等に伴って変動する。状態の重篤度は、例えば、部分的には、標準的な予後評価方法によって評価されてもよい。さらに、用量と、おそらく投薬頻度は、個々の患者の年齢、体重及び応答によっても変わる。
本発明の抗体は、治療において、１又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与されてもよい。「治療剤」という用語は、そのような処置が必要な個体において、症状又は疾患を処置するために投与される任意の薬剤を包含する。そのような追加の治療剤は、処置される特定の疾患に適した任意の有効成分、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含むことができる。ある特定の態様では、追加の治療剤は、免疫制御剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性薬剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を高める薬剤である。一態様では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば、微小管破壊剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン治療、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管形成剤である。好ましい態様では、追加の治療剤はＴ細胞活性化剤である。そのような一態様では、さらなる治療剤は、ＣＤ３に結合する抗体、特にＣＤ３及び標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、に結合する二重特異性抗体である。一態様では、さらなる治療剤が結合する標的細胞抗原は、第２の抗原と同じであり、及び／又は第２の抗原と同様に（例えば、同じ標的細胞上で）共発現される。
一態様では、さらなる治療剤はＣＤ３×ＣＥＡ二重特異性抗体である。本発明の抗ＮＫＧ２Ｄ（多重特異性）抗体と組み合わせて使用され得るＣＤ３×ＣＥＡ二重特異性抗体のさらなる態様を以下に記載する。特定の態様では、追加の治療剤はＣＥＡ－ＴＣＢ（配列番号１３０～１３５（ＣＤ３）及び１３８～１４３（ＣＥＡ）のＣＤＲ配列、配列番号１３６及び１３７（ＣＤ３）並びに１４４及び１４５（ＣＥＡ）の可変領域配列、配列番号１５４～１５７の完全配列）、又はＣＥＡ－ＴＣＢ（２）（配列番号１３０～１３５（ＣＤ３）及び１４６～１５１（ＣＥＡ）のＣＤＲ配列、配列番号１３６及び１３７（ＣＤ３）並びに１５２及び１５３（ＣＥＡ）の可変領域配列、配列番号１５８～１６１の完全配列）である。
そのような他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。そのような他の薬剤の有効量は、使用される抗体の量、障害又は処置の種類、及び上述の他の因子に依存する。抗体は、通常、同じ投薬量で、本明細書に記載の投与経路で使用されるか、又は約１～９９％の本明細書に記載の投薬量で、又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
上述のそのような併用療法は、組み合わせた投与（２つ以上の治療剤が、同じ又は別個の組成物に含まれる）、及び別個の投与を包含し、この場合、本発明の抗体の投与は、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時及び／又は投与後に行うことができる。本発明の抗体を、放射線治療と組み合わせても使用することができる。
本発明の抗体との組合せのためのＣＤ３×ＣＥＡ二重特異性抗体
ＣＤ３×ＣＥＡ二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合部分と、ＣＥＡに特異的に結合する第２の抗原結合部分とを含む。
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３０の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１３１のＨＣＤＲ２、及び配列番号１３２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１３３の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３４のＬＣＤＲ２、及び配列番号１３５のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む。
一態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号１３８の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１３９のＨＣＤＲ２、及び配列番号１４０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４１の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１４２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含むか、又は（ｉｉ）配列番号１４６の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１４７のＨＣＤＲ２、及び配列番号１４８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４９の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１５０のＬＣＤＲ２、及び配列番号１５１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む。
特定の態様では、ＣＤ３×ＣＥＡ二重特異性抗体は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号１３０の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１３１のＨＣＤＲ２、及び配列番号１３２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１３３の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３４のＬＣＤＲ２、及び配列番号１３５のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合し、配列番号１３８の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１３９のＨＣＤＲ２、及び配列番号１４０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４１の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１４２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含むか、又は（ｉｉ）配列番号１４６の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１４７のＨＣＤＲ２、及び配列番号１４８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４９の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１５０のＬＣＤＲ２、及び配列番号１５１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む第２の抗原結合部分とを含む。
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号１３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３６の重鎖可変領域配列と、配列番号１３７の軽鎖可変領域配列とを含む。
一態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号１４５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含むか、又は、（ｉｉ）配列番号１５２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号１５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
一態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号１４４の重鎖可変領域配列と、配列番号１４５の軽鎖可変領域配列を含むか、又は（ｉｉ）配列番号１５２の重鎖可変領域配列と、配列番号１５３の軽鎖可変領域配列とを含む。
いくつかの態様では、第１及び／又は第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。いくつかの態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。そのような態様では、第２の抗原結合部分は、好ましくは、従来のＦａｂ分子である。
二重特異性抗体の第１及び第２の抗原結合部分が両方ともＦａｂ分子であり、抗原結合部分の１つ（特に、第１の抗原結合部分）において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているいくつかの態様では、
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、又は
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
二重特異性抗体は、ｉ）及びｉｉ）に記述されている修飾を両方とも含むことはない。ＶＨ／ＶＬが置き換わっている抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置き換わっていない（即ち、交換されていないままである）。
より具体的な態様では、
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、又は
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
そのような一態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
さらなる態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
より具体的な態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
さらに特定の態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の態様では、上の態様に係るアミノ酸置換が、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１でなされる場合、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
いくつかの態様では、第１及び第２の抗原結合部分は、任意にペプチドリンカーを介して、互いに融合されている。
いくつかの態様では、第１及び第２の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、のいずれかである。
いくつかの態様では、ＣＤ３×ＣＥＡ二重特異性抗体は、ＣＤ３に対する一価の結合を提供する。
特定の態様では、ＣＤ３×ＣＥＡ二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する単一の抗原結合部分と、ＣＥＡに特異的に結合する２つの抗原結合部分とを含む。よって、いくつかの態様では、ＣＤ３×ＣＥＡ二重特異性抗体は、ＣＥＡに特異的に結合する第３の抗原結合部分を含む。いくつかの態様では、第３の抗原結合部分は、第１の抗原結合部分と同一である（例えば、第３の抗原結合分子は、Ｆａｂ分子でもあり、同じアミノ酸配列を含む）。
特定の態様では、ＣＤ３×ＣＥＡ二重特異性抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインをさらに含む。一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインである。特定の態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。別の態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング）。このアミノ酸置換は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩｇＧ４抗体のＦａｂアーム交換を低減する（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照されたい）。さらに特定の態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。特定の好ましい態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の例示的な配列は、配列番号８６で与えられる。
第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び、存在する場合、第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ分子であるいくつかの態様では、（ａ）（ｉ）第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているかのいずれか一方であり、且つ、（ｂ）存在する場合、第３の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＣＨ３ドメインの中にある。したがって、一態様では、当該修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。
具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ（ｋｎｏｂ）」修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール（ｈｏｌｅ）」修飾を含む。ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることによって構築される。突起と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。
したがって、いくつかの態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基を、より大きな側鎖量を有するアミノ酸残基で置き換えることにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に配置可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基を、より小さな側鎖量を有するアミノ酸残基で置き換えることにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が配置可能な第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成する。好ましくは、より大きな側鎖量を有する当該アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。好ましくは、より小さな側鎖量を有する当該アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作り出すことができる。
具体的なそのような態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、位置３６６のトレオニン残基がトリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、位置４０７のチロシン残基がバリン残基と置き換わっており（Ｙ４０７Ｖ）、任意に、位置３６６のトレオニン残基がセリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基がアラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。さらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に位置３５４のセリン残基がシステイン残基と置き換わっており（Ｓ３５４Ｃ）又は位置３５６のグルタミン酸残基がシステイン残基と置き換わっており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基と置き換わっており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に位置３４９のチロシン残基がシステイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。好ましい態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
いくつかの態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合を低下させる、且つ／又はエフェクター機能を低下させる１又は複数のアミノ酸置換を含む。
特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）である。一態様では、エフェクター機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、及びサイトカイン分泌の群から選択される１又は複数である。特定の態様では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。
典型的には、同じ１又は複数のアミノ酸置換が、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに存在する。一態様では、１又は複数のアミノ酸置換は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を低減する。一態様では、１又は複数のアミノ酸置換は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１又は少なくとも１０分の１に低減する。
一態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。ある特定の態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。そのような一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。一態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。具体的には、好ましい態様では、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング）、即ち、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットのそれぞれにおいて、位置２３４のロイシン残基はアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３４Ａ）、位置２３５のロイシン残基はアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３５Ａ）、位置３２９のプロリン残基はグリシン残基と置き換わっている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。そのような一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
好ましい態様では、ＣＤ３×ＣＥＡ二重特異性抗体は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号１３０の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１３１のＨＣＤＲ２、及び配列番号１３２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１３３の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３４のＬＣＤＲ２、及び配列番号１３５のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域のいずれか、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合し、配列番号１３８の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１３９のＨＣＤＲ２、及び配列番号１４０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４１の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１４２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第２及び第３の抗原結合部分であって、それぞれＦａｂ分子、特に従来のＦａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインであって、
第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている、Ｆｃドメインとを含む。
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号１３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３６の重鎖可変領域配列と、配列番号１３７の軽鎖可変領域配列とを含む。
一態様では、第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号１４５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
一態様では、第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１４４の重鎖可変領域配列と、配列番号１４５の軽鎖可変領域配列とを含む。
上記の態様によるＦｃドメインは、Ｆｃドメインに関して上に記載される特徴の全てを単独で又は組み合わせて組み込んでもよい。
一態様では、抗原結合部分及びＦｃ領域は、ペプチドリンカー、特に、配列番号１５４及び配列番号１５５にあるようなペプチドリンカーによって、互いに融合している。
一態様では、ＣＤ３×ＣＥＡ二重特異性抗体は、配列番号１５４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチドと、配列番号１５５の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチドと、配列番号１５６の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチドと、配列番号１５７の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）とを含む。
一態様では、ＣＤ３×ＣＥＡ二重特異性抗体は、配列番号１５４の配列を含むポリペプチドと、配列番号１５５の配列を含むポリペプチドと、配列番号１５６の配列を含むポリペプチドと、配列番号１５７の配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）とを含む。
特定の態様では、ＣＤ３×ＣＥＡ二重特異性抗体はシビサタマブ（ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｎｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｎａｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ），Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ＩＮＮ：Ｌｉｓｔ ８０，２０１８，ｖｏｌ．３２，ｎｏ．３，ｐ．４３８）である。
一態様では、ＣＤ３×ＣＥＡ二重特異性抗体は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号１３０の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１３１のＨＣＤＲ２、及び配列番号１３２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１３３の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３４のＬＣＤＲ２、及び配列番号１３５のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域のいずれか、特に可変領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合し、配列番号１４６の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１４７のＨＣＤＲ２、及び配列番号１４８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４９の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１５０のＬＣＤＲ２、及び配列番号１５１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第２及び第３の抗原結合部分であって、それぞれＦａｂ分子、特に従来のＦａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）安定した会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインであって、
第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている、Ｆｃドメインとを含む。
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号１３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３６の重鎖可変領域配列と、配列番号１３７の軽鎖可変領域配列とを含む。
一態様では、第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１５２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号１５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。一態様では、第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１５２の重鎖可変領域配列と、配列番号１５３の軽鎖可変領域配列とを含む。
上記の態様によるＦｃドメインは、Ｆｃドメインに関して上に記載される特徴の全てを単独で又は組み合わせて組み込んでもよい。
一態様では、抗原結合部分及びＦｃ領域は、ペプチドリンカー、特に、配列番号１５８及び配列番号１５９にあるようなペプチドリンカーによって、互いに融合している。
一態様では、（ｉｉ）の第２及び第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって、特にアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、（ｉｉ）の第２及び第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一態様では、二重特異性抗体は、配列番号１５８の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチドと、配列番号１５９の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチドと、配列番号１６０の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチドと、配列番号１６１の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）とを含む。
一態様では、二重特異性抗体は、配列番号１５８の配列を含むポリペプチドと、配列番号１５９の配列を含むポリペプチドと、配列番号１６０の配列を含むポリペプチドと、配列番号１６１の配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）とを含む。
当業者に知られるであろう他のＣＤ３×ＣＥＡ二重特異性抗体も、本発明における使用が検討されている。
一態様では、ＣＤ３×ＣＥＡ二重特異性抗体はＭＥＤＩ５６５（ＡＭＧ２１１、ＭＴ１１１）である。
Ｇ．製造物品
本発明の別の態様では、上述の障害の処置、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注溶液袋等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、それ自体で、又は、状態を処置、予防、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせられる組成物を保持し、無菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される病態を処置するために使用されることを示す。さらに、製造物品は、（ａ）組成物を含む第１の容器を含み、この組成物は本発明の抗体を含み、（ｂ）組成物を含む第２の容器を含み、この組成物は細胞疾患性又は他の治療剤をさらに含む。本発明のこの態様における製造物品は、組成物が特定の状態を処置するために使用され得ることを示す添付文書をさらに含んでいてもよい。あるいは、又は加えて、製造物品は、薬学的に許容され得る緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに備えていてもよい。他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、注射器を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
Ｈ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある特定の態様では、本明細書で提供される抗体のいずれかは、生物学的試料中のその標的（例えばＮＫＧ２Ｄ）の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用される「検出」という用語は、定量的又は定性的な検出を包含する。ある特定の態様では、生体試料は、細胞又は組織、例えば前立腺組織を含む。
一態様では、診断又は検出の方法における使用のための、本発明による抗体が提供される。さらなる態様では、生物学的試料中のＮＫＧ２Ｄの存在を検出する方法が提供される。ある特定の態様では、方法は、生体試料と、本発明の抗体とを、ＮＫＧ２Ｄに対する抗体の結合を許容する条件下で接触させることと、複合体が、抗体とＮＫＧ２Ｄとの間で形成されるかどうかを検出することとを含む。そのような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法又はｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。一態様では、本発明の抗体は、例えばＮＫＧ２Ｄが患者の選択のためのバイオマーカーである場合、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体を用いた治療法に適格な対象を選択するために使用される。
本発明の抗体を使用して診断され得る例示的な障害には、がんが含まれる。
ある特定の態様では、標識された、本発明による抗体が提供される。ラベルには、直接検出されるラベル又は部位（例えば、蛍光ラベル、発色性ラベル、電子密度ラベル、化学発光ラベル、放射性ラベル等）、及び酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される部位（例えば、酵素又はリガンド等）が含まれるが、これらに限定されるものではない。例示的なラベルには、以下のものが含まれる：放射性同位元素３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体のようなフルオロフォア、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ、例えば ホタルルシフェラーゼ及び細菌性ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼのような複素環オキシダーゼ、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼのような色素前駆体を酸化するために過酸化水素を用いる酵素、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定したフリーラジカル、及びそのようなものと結合したもの。
ＩＩＩ．配列
Ｖ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上に提供された一般的な説明を考慮すると、種々の他の態様が実施されてもよいことが理解される。
実施例１．一般的な方法及びツール
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９において説明されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、以下に与えられる：Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１－３２４２．
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
遺伝子の合成
必要に応じて、望ましい遺伝子セグメントを、適切なテンプレートを使用してＰＣＲにより生成したか、又はＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲ生成物から自動遺伝子合成によって合成した。単一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクター内へとクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって測定した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター内へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計した。全ての構築物は、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダー配列についてコードする５’末端ＤＮＡ配列を用いて設計した。
ＮＫＧ２Ｄ受容体及びＭＩＣ－Ｂリガンドの生成
ＮＫＧ２Ｄ受容体のいくつかの構築物並びにＭＩＣ－Ｂリガンドを、ファージディスプレイ用の抗原、トランスジェニックウサギのタンパク質免疫化のための免疫原として、並びにスクリーニング及び特徴づけツールとして使用するために生成した。ヒトＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を４つの異なる構築物としてクローニングした：１．非共有結合二量体（ｈｉｓ ａｖｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ）を形成するためのＮ末端Ｈ６－ａｖｉ－タグ（配列番号９３）、２．「空の」ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ－ホール鎖と対になっているａｖｉタグ付きヒトＩｇＧ１ Ｆｃ－ノブ鎖のＣ末端への一価Ｆｃ融合物として（ｍｏｎｏ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ｋｈ ａｖｉ）（配列番号９４及び９５）、３．インタクトなヒンジ領域によって二量体化されたａｖｉタグ付きヒトＩｇＧ１ ＦｃのＣ末端への二量体Ｆｃ融合物として（ｄｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉ）（配列番号９６）、及び４．インタクトなヒンジ領域によって二量体化されたマウスＩｇＧ１ ＦｃのＣ末端への二量体Ｆｃ融合物として（ｄｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ ｍｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ）（配列番号９９）。このマウスＦｃ融合物を、トランスジェニックウサギにおける免疫原性の増加のために使用した。カニクイザル及びマウスＮＫＧ２ＤのＥＣＤ（それぞれｄｉ ｃｙＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉ及びｄｉ ｍｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉ）を、上記で概説したように、ａｖｉタグ付きヒトＩｇＧ１ ＦｃのＣ末端へのヒト二量体Ｆｃ融合と同様の様式でクローニングした（それぞれ配列番号９７及び９８）。さらに、ＮＫＧ２ＤリガンドＭＩＣ－Ｂ（ＥＣＤ ＦＬ ＭＩＣ－Ｂ Ｆｃ ａｖｉ）のＥＣＤを、一価のＮ末端融合物として、Ｃ末端ａｖｉタグを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ－ノブ鎖にクローニングし、「空の」ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ－ホール鎖と対にした（配列番号１００及び１０１）。上記の受容体及びＭＩＣ－Ｂリガンドを図１に示す。ｄｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ ｍｕ ＩｇＧ１ Ｆｃを除いて、それらは、Ｂｉｒ Ａビオチンリガーゼの共発現の際に部位特異的ビオチン化を可能にするＮ末端ａｖｉタグを含む。発現カセットに加えて、各ベクターには、ＥＢＶ－ＥＢＮＡ発現細胞株における自律性複製のためのＥＢＶ ｏｒｉＰ配列が含まれている。それらをＨＥＫ２９３細胞に一過性トランスフェクトし、ＥＢＶ由来タンパク質ＥＢＮＡを安定して発現させた。ビオチンリガーゼＢｉｒＡをコードする同時に共トランスフェクトされたプラスミドが、ｉｎ ｖｉｖｏでのａｖｉタグ特異的なビオチン化を可能にした。次いで、Ｆｃタグ付きタンパク質をプロテインＡ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラムを使用して精製し、続いてゲル濾過したが、Ｈ６タグ付きＮＫＧ２Ｄ構築物をＮｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、続いてゲル濾過した。
ＮＫＧ２Ｄ／ＤＡＰ１０発現細胞株の生成
ヒトＮＫＧ２Ｄ及びＤＡＰ１０をコードする全長ｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクター内にサブクローニングした。製造業者のプロトコルに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５３３８１００）を使用してプラスミドをＣＨＯ－Ｋ１Ｍ細胞（Ｒｏｃｈｅ）及び２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）にトランスフェクションした。安定にトランスフェクトされたＮＫＧ２Ｄ／ＤＡ１０陽性ＣＨＯ細胞を、１０ｎＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、＃２５０３００８１）を補足したＣＤＭ２ Ｏｐｔ．１．１培地（ＧＩＢＣＯ、＃０８－００５９）中で維持した。２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、＃１６１４００６３）及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント（Ｇｉｂｃｏ；＃３１３３１－０２８）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、＃１１９６５０９２）中で維持した。トランスフェクションの２日後、ピューロマイシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ；＃ａｎｔ－ｐｒ－１）をＣＨＯ細胞の場合は６μｇ／ｍＬ及び２９３Ｔ細胞の場合は１μｇ／ｍＬまで添加した。最初の選択後、ＮＫＧ２Ｄの最も高い細胞表面発現を有する細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ細胞選別機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により選別し、培養して安定な細胞クローンを確立した。発現レベル及び安定性を、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ－２．０（Ｋｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８４，１１４３－１１５６）及びＰｅｒＣＰ抱合化Ｆｃガンマ特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９－１２６－０９７）を二次抗体として４週間にわたって使用するＦＡＣＳ分析によって確認した。
実施例２．ファージディスプレイによる抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の生成
一般的なＦａｂライブラリの生成
Ｆａｂフォーマットの２つの一般的なファージディスプレイ抗体ライブラリを、ヒト生殖細胞系遺伝子に基づいて生成した。これらのＣＤＲにまたがる異なる長さのランダム化プライマーを使用して、ライブラリを軽鎖のＣＤＲ３（Ｌ３）及び重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３）にランダム化し、「重複伸長によるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲによって３つの断片から組み立てた。十分な量の完全長ランダム化Ｆａｂ断片の組立て後、それらを同様に処置されたアクセプターファージミドベクターと共にＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化した。Ｆａｂライブラリインサートをファージミドベクターで連結し、精製連結を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１への形質転換に使用した。ヘルパーファージＶＣＳＭ１３を使用してＦａｂライブラリを表示するファージミド粒子を救出し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製して選択に使用した。
ファージディスプレイによる一般的なＦａｂライブラリからの抗ＮＫＧ２Ｄ結合因子の選択
ＮＫＧ２Ｄ結合因子を、ｄｉ ｍｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉ（配列番号９８）及びｄｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉ（配列番号９６）、又はｄｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉ（配列番号９６）及びｈｉｓ ａｖｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ（配列番号９３）に対するライブラリから、４回のパンニングラウンドにわたって交互に選択した。
特異的結合因子を、ＥＬＩＳＡによって以下のように同定した：１００μｌの５０ｎＭビオチン化ｄｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉ（配列番号９６）又はｈｉｓ ａｖｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ（配列番号９３）をニュートラアビジンプレート上にコーティングした。Ｆａｂを含む細菌の上清を加え、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を使用して結合ＦａｂをそれらのＦｌａｇタグを介して検出した。クローン５Ｃ５及びクローン１３Ｃ６のようにバックグラウンドよりも有意なシグナルを示すクローンを、配列決定及びさらなる分析のために候補に入れた。
Ｆａｂの精製
細菌培養物からのＦａｂを、速度論パラメータの決定のために精製した。各クローンについて、５００ｍｌの培養物に、対応するファージミドを保有する細菌を接種し、ＯＤ６００ ０．９で１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘導した。その後、培養物を２５℃で一晩インキュベートし、遠心分離により回収した。再懸濁したペレットを２５ｍｌのＰＰＢ緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％ショ糖）で２０分間インキュベートした後、細菌を再度遠心分離し、上清を回収した。このインキュベーションステップを、２５ｍｌの５ｍＭ ＭｇＳＯ４溶液で１回繰り返した。両方のインキュベーション工程の上清をプールし、フィルタにかけ、ＩＭＡＣカラム（Ｈｉｓ ｇｒａｖｉｔｒａｐ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。続いて、カラムを４０ｍｌの洗浄緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ７．４）で洗浄した。溶出後（５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ ７．４）、ＰＤ１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して溶出液を再緩衝化した。次いで、精製されたＦａｂの動態パラメータを、クローン５Ｃ５（配列番号７（ＶＨ）及び配列番号８（ＶＬ））については１００ｎＭ～６．２５ｎＭ、クローン１３Ｃ６（配列番号１５（ＶＨ）及び配列番号１６（ＶＬ））については２００ｎＭ～１２．５ｎＭの範囲の希釈系列でＳＰＲ分析（ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６、Ｂｉｏｒａｄ）によって調査した。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による親和性決定
選択されたＦａｂクローンの親和性（ＫＤ）を、ニュートラアビジン捕捉によってＮＬＣチップ上に固定化されたビオチン化ｍｏｎｏ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ｋｈ ａｖｉ（配列番号９４及び配列番号９５）及びｄｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉ（配列番号９６）を用いて、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を２５℃で使用する表面プラズモン共鳴によって測定した。組換え抗原（リガンド）の固定：抗原をＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、次いで固定化のため垂直方向で様々な接触時間で３０μｌ／分で注入した。分析物の注入：ワンショット速度論測定のため、注入方向を水平方向に変更し、精製Ｆａｂの二倍希釈系列（２００ｎＭ～６．２５ｎＭの様々な濃度範囲）を別々のチャネル１～５に沿って６０μｌ／分で同時に注入し、会合時間はそれぞれ２００秒又は３００秒、解離時間は３６０秒であった。緩衝液（ＰＢＳＴ）を第６のチャネルに沿って注入して、参照用の「インライン」ブランクを提供した。会合速度定数（ｋｏｎ）と解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアの単純な１：１ラングミュア結合モデルを使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。全ての測定の動力学的及び熱力学的データを表１に要約する。カニクイザルＮＫＧ２Ｄに対するクローン５Ｃ５及び１３Ｃ６の交差反応性、即ち、ｄｉ ｃｙＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉへの結合をＩｇＧレベルで評価した（実施例９参照）。
ＩｇＧ発現ベクターへの可変抗体ドメインのクローニング（ＩｇＧ変換）
ファージディスプレイ由来抗体５Ｃ５及び１３Ｃ６のＦａｂを、それぞれＩｇＧ１／ラムダ抗体又はカッパ抗体に変換した。このため、重鎖及び軽鎖ＶドメインのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターを含むヒトＩｇＧ１定常重鎖又はヒト定常ラムダ若しくは定常カッパ軽鎖のいずれかにインフレームで挿入した。抗体発現をＭＰＳＶプロモーターによって駆動し、ＣＤＳの下流に位置する合成ポリＡシグナル配列によって転写を終結させた。発現カセットに加えて、各ベクターは、ＥＢＶ－ＥＢＮＡ発現細胞株における自律性複製のためのＥＢＶ ｏｒｉＰ配列を含んだ。
実施例３トランスジェニックウサギの免疫化による抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の生成
動物の世話、ウサギの免疫化及び臓器の摘除
上記のファージディスプレイによって生成された抗体に加えて、ＮＫＧ２Ｄ抗原で免疫すると、ヒト化抗体レパートリ（例えば、国際公開第２０００／４６２５１号、国際公開第２００２／１２４３７号、国際公開第２００５／００７６９６号、国際公開第２００６／０４７３６７号、国際公開第２００７／０１９２２３号及び国際公開第２００８／０２７９８６号を参照されたい。これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）を発現するトランスジェニックウサギからさらなる抗体が得られた。動物は、付録Ａ「動物の収容と世話に関するガイドライン」に従ってＡＡＡＬＡＣ認定の動物施設に収容された。全ての動物免疫化プロトコル及び実験は、オーバーバイエルン行政府（Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｐｐｅｒ Ｂａｖａｒｉａ）により承認され（許可番号５５．２－１－５４－２５３２－９０－１４）、ドイツ動物保護法並びに欧州議会及び理事会指令２０１０／６３に従って実施された。
ウサギを、全長ヒトＮＫＧ２Ｄ及びＤＡＰ１０を組換え発現するＣＨＯ細胞と交互に、全長ヒトＮＫＧ２Ｄ及びＤＡＰ１０をコードするプラスミド発現ベクターを使用して、マウスＩｇＧ１ Ｆｃ（ｄｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ ｍｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号９９））のＣ末端に融合した組換えヒトＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤタンパク質（ｈｉｓ ａｖｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ（配列番号９３））又は組換えヒトＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤで免疫化するか、又は遺伝子免疫化した。
抗原特異的力価を、免疫化動物由来の血清中のＥＬＩＳＡによって決定した（下記を参照されたい）。
Ｂ細胞数クローニング
ウサギ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＢ細胞クローニングのために単離した。マクロファージ及び単球を、ＨＥＫ２９３細胞の層への非特異的接着によって枯渇させた。上清中の細胞（末梢血リンパ球（ＰＢＬ））を抗原パニング工程に使用した。抗原特異的Ｂ細胞を、抗原被覆プレート（全長ヒトＮＫＧ２Ｄ及びＤＡＰ１０を組換え発現するｈｉｓ ａｖｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ（配列番号９３）又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞）への結合によって濃縮した。濃縮された細胞を、フローサイトメトリーによる単一細胞選別に供した。
ウサギＢ細胞をＳｅｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｓｅｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４；９（２））によって記載されるように培養し、上清をＥＬＩＳＡによるレベル１スクリーニングに使用した（下記を参照されたい）。
ＩｇＧ抗体の組換え発現のためのＶドメインのＰＣＲ増幅及びサブクローニング
全ＲＮＡをＢ細胞溶解物から調製し、逆転写酵素反応によってｃＤＮＡを生成するために使用した。ｃＤＮＡを使用して、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を、適切なプライマーを使用するＰＣＲによって増幅した。
ウサギモノクローナル二価抗体の組換え発現のために、オーバーハング方法によって、ＶＨ又はＶＬをコードするＰＣＲ産物を、ｃＤＮＡとして発現ベクターへとクローン化した（Ｈａｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３，５１５－５１８；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，２５１－２５６）。発現ベクターは、イントロンＡを含む５’ＣＭＶプロモーターと、３’ＢＧＨ ポリアデニル化配列とからなる発現カセットを含んでいた。発現カセットに加え、プラスミドは、ｐＵＣ１８由来の複製と、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のプラスミド増幅について、アンピシリン耐性を与えるβ－ラクタマーゼ遺伝子を含んでいた。塩基性プラスミドの３つの変異体を使用し、１つのプラスミドはＶＨ領域を受容するように設計されたウサギＩｇＧ定常領域を含み、２つの追加のプラスミドは、ＶＬ領域を受容するためのウサギ又はヒトカッパＬＣ定常領域のいずれかを含んだ。κ又はγ定常領域及びＶＬ／ＶＨ挿入物をコードする線形発現プラスミドは、重複するプライマーを用い、ＰＣＲによって増幅された。精製されたＰＣＲ産物を、Ｔ４ ＤＮＡ－ポリメラーゼと共にインキュベートし、一本鎖オーバーハングを生成した。ｄＣＴＰ添加によって反応を止めた。次の工程で、プラスミドと挿入物を合わせ、部位特異的な組換えを誘発するｒｅｃＡと共にインキュベートした。組換えプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で形質転換した。次の日、成長したコロニーを取り出し、プラスミド調製、制限分析及びＤＮＡシークエンシングによって、正しい組換えプラスミドについて試験した。ＥＬＩＳＡによるレベル２スクリーニング（下記を参照されたい）のために、単離した重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に一過性に同時トランスフェクトし、１週間後に上清を回収して、その後、顕微精製に供した。
実施例４．ＥＬＩＳＡによるＮＫＧ２Ｄ結合についての抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のスクリーニング
トランスジェニックウサギの免疫化に由来するクローンのスクリーニングのため、Ｂ細胞培養物の上清（レベル１スクリーニング、上記を参照されたい）又はサブクローニング及び微量精製されたＩｇＧ（レベル２スクリーニング、上記を参照されたい）のいずれかを使用した。
ヒトＮＫＧ２Ｄに対するタンパク質結合ＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃストレプトアビジン被覆プレート（マイクロコート、＃１１９７４９９８００１）を０．５μｇ／ｍｌの濃度で２５μｌ／ウェルのビオチン化ｈｉｓ ａｖｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ（配列番号９３）で被覆し、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。３×９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ緩衝液（１０×ＰＢＳ、Ｒｏｃｈｅ＃１１６６６７８９００１＋０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した後、２５μｌの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を、３μｇ／ｍｌの濃度で開始して１：３希釈で、又は代わりに元の試料の１：３０希釈で添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄（３×９０μｌ／ウェルＰＢＳＴ緩衝液）後、２５μｌ／ウェル抗ｈｕカッパ鎖ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）抱合体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ＡＰ５０２Ｐ、１：２０００）を添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後（３×９０μｌ／ウェルＰＢＳＴ緩衝液）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）基質（Ｒｏｃｈｅ、＃１１８３５０３３００１）を添加した。測定をＯＤ ３７０／４９２ｎｍで実施し、結果を以下の表２に要約する。
全ての抗体を、固定化されたｈｉｓ ａｖｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤに特異的且つ用量依存的に結合した。
カニクイザルＮＫＧ２Ｄに対するタンパク質結合ＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃストレプトアビジン被覆プレート（マイクロコート、＃１１９７４９９８００１）を０．２５μｇ／ｍｌの濃度で２５μｌ／ウェルのビオチン化ｄｉ ｃｙＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉ（配列番号９７）で被覆し、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。アッセイを、ヒトＮＫＧ２Ｄについて上記のように行った。
結果を表３に要約する。全ての抗体はカニクイザルＮＫＧ２Ｄに対して交差反応性であり、これは表面プラズモン共鳴によっても確認されている（実施例９を参照されたい）。
マウスＮＫＧ２Ｄに対するタンパク質結合ＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃストレプトアビジン被覆プレート（マイクロコート、＃１１９７４９９８００１）を１μｇ／ｍｌの濃度で２５μｌ／ウェルのビオチン化ｄｉ ｍｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉ（配列番号９８）で被覆し、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。アッセイを、ヒトＮＫＧ２Ｄについて上記のように行った。
結果を表４に要約する。抗体は、マウスＮＫＧ２Ｄに対して交差反応性ではないか、又は非常に弱い交差反応性しか示さない。
ヒトＮＫＧ２Ｄ細胞表面結合ＥＬＩＳＡ
２５μｌ／ウェルの全長ヒトＮＫＧ２Ｄ及びＤＡＰ１０を組換え発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１５０００細胞／ウェル）又は未改変ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３８４ウェルポリ－Ｄ－リジンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３５６６６２）に播種し、細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏ、＃４２４３０－２５＋１０％ＦＣＳ（ＰＡＮ、＃Ｐ３０－２００６）＋１μｇ／ｍｌピューロマイシン＋１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｒｏｃｈｅ、＃１１０７４４４０００１、５００倍））中３７℃で一晩インキュベートした。培地除去の翌日、２５μｌの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を、３μｇ／ｍｌの濃度で開始して１：３希釈で、又は代わりに元の試料の１：２０希釈で添加し、４℃で２時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ中１×９０μｌ）、室温で１０分間、３０μｌ／ウェルのグルタルアルデヒドを０．０５％（Ｓｉｇｍａ、＃Ｇ５８８２）の最終濃度まで添加することによって細胞を固定した。洗浄（２×９０μｌ／ウェルＰＢＳＴ緩衝液）後、２５μｌ／ウェル抗ｈｕカッパＰＯＤ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ＡＰ５０２Ｐ、１：２０００）を添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、番号１１８３５０３３００１）を加え、６～１０分間インキュベートした。測定をＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ２機器で、ＯＤ３７０／４９２ｎｍで行った。
結果を表５に要約する。全ての抗体は、このアッセイで結合を検出できなかった弱い結合因子のクローン０１３及び０１４を除いて、全長ヒトＮＫＧ２Ｄ及びＤＡＰ１０を組換え発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に特異的且つ用量依存的に結合した。これらの抗体はいずれもトランスフェクトされていないＨＥＫ２９３Ｔ参照細胞に結合しなかった。
実施例５．ＥＬＩＳＡによるＭＩＣ－Ｂ競合についての抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のスクリーニング。
３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、＃４６４７１８）を２μｇ／ｍｌの濃度で２５μｌ／ウェルの組換えヒトＭＩＣ－Ｂ（ＥＣＤ ＦＬ ＭＩＣ－Ｂ Ｆｃ ａｖｉ、配列番号１００及び１０１））によりコーティングし、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。３×９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ緩衝液（１０×ＰＢＳ（Ｒｏｃｈｅ、＃１１６６６７８９００１）＋０、１％Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した後、各ウェルを９０μｌのブロッキング緩衝液（１０×ＰＢＳ（Ｒｏｃｈｅ、＃１１６６６７８９００１）＋２％ウシ血清アルブミン画分Ｖ、無脂肪酸（Ｒｏｃｈｅ、＃１０７３５０８６００１）＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）と共に室温で１時間インキュベートした。並行して、組換えビオチン化ヒトＮＫＧ２Ｄを、ポリプロピレンプレート（Ｗｅｉｄｍａｎ、♯２３４９０－１０１）上で抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（３μｇ／ｍｌの濃度で開始する抗体の１：３希釈物を含む２μｇ／ｍｌ ＮＫＧ２Ｄ）と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄（３×９０μｌ／ウェルＰＢＳＴ緩衝液）後、２５μｌ／ウェルのＮＫＧ２Ｄ抗体混合物をアッセイプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。洗浄（３×９０μｌ／ウェルＰＢＳＴ緩衝液）後、２５μｌ／ウェルのポリ－ＨＲＰ４０－ストレプトアビジン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、＃６５Ｒ－Ｓ１０４ＰＨＲＰｘ）を１：２０００希釈で添加し、室温で１時間インキュベートした。さらなる洗浄工程（３×９０μｌ／ウェルＰＢＳＴ緩衝液）の後、２５μｌのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、＃１１８３５０３３００１）を各ウェルに添加した。測定をＯＤ ３７０／４９２ｎｍで行った。
結果を図２及び表６に示す。クローン０１３及び０１４の「陰性」阻害曲線は、抗体によって架橋されたＮＫＧ２Ｄのプレート上の固定化ＭＩＣ－Ｂへのより強い再結合によって説明することができる（０値は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体なしの、プレート固定化ＭＩＣ－Ｂへの組換えビオチン化ヒトＮＫＧ２Ｄの結合である）。したがって、そのようなプロファイルを有する抗体は、ＮＫＧ２Ｄに関して非阻害性である。ＭＩＣ－Ｂ相互作用他の８つの抗体は、異なる効力でＮＫＧ２ＤのそのリガンドＭＩＣ－Ｂへの結合を阻害する。
実施例６．アップスケールされたＩｇＧの発現、精製及び分析
抗体分子を、Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓細胞株２９３由来）において生成した。トランスフェクション「２９３－Ｆｒｅｅ」にはトランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用した。上記の各抗体重鎖及び軽鎖分子を個々の発現プラスミドから発現させた。トランスフェクションは、製造者の説明書に明記されているように実施した。免疫グロブリン含有細胞培養上清をトランスフェクションの３～７日後に回収し、精製するまで－８０℃で凍結した。例えばＨＥＫ２９３細胞におけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般情報は、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ７５，１９７－２０３（参照により本明細書に組み込まれる）に示されている。
組換え抗体を、プロテインＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）親和性クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）サイズ排除クロマトグラフィーを使用する親和性クロマトグラフィーによって２段階で上清から精製した。簡潔には、抗体を含有する清澄化した培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅプロテインＡ（５～５０ｍｌ）カラムにロードした。未結合タンパク質を平衡化緩衝液で洗い流した。抗体を１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ２．８）で溶出した。タンパク質含有画分を溶出液の１／１０の体積の２Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．０）で中和した。続く工程では、溶出したタンパク質画分をプールし、以下の３つの選択肢のうちの１つに従って処置した：ａ）Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心濾過装置（ＭＷＣＯ：３０Ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨｉＬｏａｄ １６／６０ゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードするか、又はｂ）２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨｉＬｏａｄ １６／６０ゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードするか、又はｃ）１０Ｋ Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で透析した。単量体抗体画分をプールした。精製された抗体及び誘導体のタンパク質濃度を、Ｐａｃｅ ｅｔ．ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４，２４１１－２４２３（参照により組み込まれる）によるアミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、バックグラウンド補正として３２０ｎｍでのＯＤを用いて２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を決定することによって決定した。抗体試料を急速凍結し、－８０℃で保存した。
抗体の均一性は、還元剤の存在下又は非存在下でＣＥ－ＳＤＳ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により確認した。還元条件下で、計算した分子量に類似する見かけの分子サイズでＣＥ－ＳＤＳ後にＩｇＧの軽鎖及び重鎖ポリペプチド鎖を識別した。
抗体の品質を、ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実行されるＢｉｏＳｕｉｔｅ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＳＥＣ、２５０Å、５μｍを使用する分析ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）によって確認した。クロマトグラフィー材料からの溶出は、２００ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ６．２を適用することによって行った。分析ＳＥＣのメインピークは、分析した全ての試料で９１％超をもたらした。
実施例７．ＦＡＣＳによるＮＫＧ２Ｄ結合についての抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＩｇＧ）のスクリーニング
ＮＫ－９２細胞への結合のＥＣ５０決定のため、抗体をＺｅｎｏｎ（商標）Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で予め標識した。ＩｇＧを５倍過剰のＺｅｎｏｎ試薬Ａで染色し、結合していない染色試薬を等量のＺｅｎｏｎ試薬Ｂでブロックした。１：３の段階で希釈系列を調製した後、９６ウェルプレート中のウェルあたり５．０×１０４個のＮＫ－９２細胞を、５０μＬの予め標識された抗体溶液と共に４℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２．５％ＦＣＳ）で２回洗浄し、７０μＬ緩衝液に再懸濁した。蛍光を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏデバイスを使用して測定し、ＥＣ５０を決定した（表７）。
抗体は、ＮＫ９２細胞に対する特異的且つ用量依存的な結合を示し、ＥＣ５０値は０．９８８μｇ／ｍＬ～０．０３１μｇ／ｍＬの範囲であった。弱い細胞結合因子であるクローン０１３、０１４及び５Ｃ５については、ＥＣ５０値を決定することができなかった。
実施例８．抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＩｇＧ）による標的細胞の再指向溶解
標的細胞のカルセイン標識
Ｐ８１５細胞（マウスＦｃγＲ発現マスト細胞株）を５０ｍＬファルコンチューブ中での遠心分離（３００×ｇ、５分）によって回収し、続いてＰ８１５増殖培地中で１．０×１０６細胞／ｍＬまで再懸濁した。５．０×１０６細胞あたり５０μＬのカルセイン－ＡＭを添加し、標識反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。細胞をＡＩＭ－Ｖアッセイ培地で３回洗浄し、６．０×１０５細胞／ｍＬに再懸濁した。
抗体処置
アッセイ培地中で抗体を８０μｇ／ｍＬに調整した。その後、４０μＬの予備希釈液を８０μＬのＡＩＭ－Ｖ培地と混合することによって、プレートスキームに従ってＶ底プレート中のＡＩＭ－Ｖ培地で１：３希釈液を調製した。Ｐ８１５細胞を６．０×１０５細胞／ｍＬに調整し、５０μＬ／ウェルの細胞懸濁液を抗体希釈液に添加して３．０×１０４細胞／ウェルとし、３７℃で３０分間インキュベートして、細胞のＦｃ受容体への抗体の結合を可能にした。
その後、プレートを４００×ｇで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。ＮＫ－９２細胞をアッセイ培地中７．５×１０５細胞／ｍＬに再懸濁した。Ｐ８１５細胞を２００μＬのＮＫ－９２細胞懸濁液（＝１．５×１０５細胞／ウェル＝Ｅ：Ｔ比１：５）中で再増殖させた。プレートを３７℃で４時間インキュベートした。
カルセイン放出
プレートを４２０×ｇで４分間遠心分離した後、上清を廃棄し、細胞を２００μＬのＰＢＳ（最終遠心分離４２０×ｇ、４分）で１回洗浄した。次いで、細胞を２００μＬ／ウェルの１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ ＰＢＳに再懸濁し、溶解した細胞１８０μＬを底が透明な黒色Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）Ａｓｓａｙ ＰＬａｔｅ、９６ウェルに移し、蛍光を測定した（励起フィルタ４８５ｎｍ、バンドパスフィルタ５３０ｎｍ）。「％細胞死滅」は、細胞をアッセイ培地中の２００μＬの１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００に再懸濁した場合の最大放出に対する測定値の商として決定した。
結果を図３に示す。試験した抗体は、様々な程度の細胞死滅を示した。特に、クローン３９５及び５Ｃ５について、活性化ＮＫ９２細胞による用量依存的な細胞死滅を観察することができた。
実施例９．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるヒト及びカニクイザルＮＫＧ２Ｄに対する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＩｇＧ）の速度論的速度定数及び親和性の決定
捕捉抗体（１０μｇ／ｍｌヒトＦａｂ捕捉キット、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃２８９５８３２５）の約１５００個の共鳴単位（ＲＵ）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用することによってｐＨ５．０でＢＩＡＣＯＲＥ Ｂ４０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＣＭ５チップ（ＧＥヘルスケア、＃ＢＲ－１００５－３０）上にカップリングさせた。サンプル及びシステムバッファーは、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ７．４であった。フローセルを２５℃に設定し、サンプルブロックを１２℃に設定し、ランニングバッファーで２回プライミングした。約１０μｇ／ｍｌの溶液を１０μｌ／分の流速で６０秒間注入することによって、抗体を捕捉した。会合は、溶液中の様々な濃度のｄｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉ（配列番号９６）又はｄｉ ｃｙＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ａｖｉ（配列番号９７）を、６００ｎＭ、３００ｎＭ、１５０ｎＭから開始して１：３希釈後に３０μｌ／分の流量で１８０秒間注入することによって測定した。解離段階を最大４５０秒間監視し、サンプル溶液からランニングバッファーに切り替えることで誘発した。流速３０μｌ／分及び追加の安定化時間１８０秒でグリシンｐＨ２．１溶液で２×９０秒洗浄することによって、表面を再生した。バルク屈折率の差を、抗ヒトＦａｂ表面から得られた応答を差し引くことによって補正した。ブランク注入も差し引いた（二重参照）。ＫＤ、ｋａ及びｋｄ（表８を参照されたい）の計算には、Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ １．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＴｒａｃｅＤｒａｗｅｒ １．６．１（Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＢ）のＬａｎｇｍｕｉｒ １：１モデルを使用した。
これらのアゴニスト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の親和性は、サブナノモル（クローン３９５）～マイクロモル（クローン０１４）の親和性の範囲である。それらの全てがカニクイザルＮＫＧ２Ｄと交差反応するが、クローン２９６については、ヒトＮＫＧ２Ｄ（３．８ｎＭ）に対する結合とカニクイザルＮＫＧ２Ｄ（７１０ｎＭ）に対する結合との間に１８７倍の差がある。クローン３９５は、３桁のピコモル濃度範囲で、全ての抗体のうちヒト及びカニクイザルＮＫＧ２Ｄに対して最も高い親和性を示す。
実施例１０．ＳＰＲによるヒトＮＫＧ２Ｄに対する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＩｇＧ）のエピトープビニング
ＳＡチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃ＢＲ－１００５－３１）のセンサー表面を、５０ｍＭ ＮａＯＨ中の１Ｍ ＮａＣｌの３回の１分間の注入でコンディショニングした後、リガンドを固定化した。約２００～３００共鳴単位（ＲＵ）のｍｏｎｏ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ Ｆｃ ｋｈ ａｖｉ（配列番号９４及び９５）を、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してセンサーチップ表面に連結した。リガンド注入後、１Ｍ ＮａＣｌ及び５０ｍＭ ＮａＯＨ中５０％イソプロパノールを使用した追加の洗浄を行った。サンプル及び系緩衝液は、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ７．４であった。フローセルを２５℃に設定し、サンプルブロックを１２℃に設定し、センサーチップ表面をランニングバッファーで２回プライミングした。第１及び第２の抗体を、それぞれ２００ｎＭの濃度で３０μｌ／分の流速で１８０秒間の「二重」注入によって注入した。固定化された抗原を第１の抗体で飽和させることが必須であった。解離段階を最大１２０秒間監視し、サンプル溶液からランニングバッファーに切り替えることで誘発した。流速３０μｌ／分で４０秒及び追加の安定化時間１８０秒でグリシンｐＨ２．１溶液で洗浄することによって、表面を再生した。バルク屈折率の差を、ブランク表面から得られた応答を差し引くことによって補正した。ブランク注入も差し引いた（二重参照）。結合応答をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ３．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって分析した。
第２の抗体は、そのエピトープが第１の抗体のエピトープと同じでないか又は重複しない場合にのみ、第１の抗体によって飽和された抗原に結合することができる。例示的なセンサーグラムを図４に示す。両方の抗体のエピトープが同一又は重複している場合、完全又は部分的な遮断が起こる。ブロッキングを、第１の抗体の結合レベルに対する第２の抗体の結合％（表９）として計算した（第１の抗体の結合レベルの値を１００％に設定した）。
表９それぞれの自己ブロッキング対照を含む、互いに対して試験した抗体の異なるパネル。値は、第１の抗体の結合応答に対する第２の抗体の結合のパーセンテージを表す。太字の数字は同時結合を示し、下線の数字は相互ブロッキングを示す。同時結合とブロッキングとの間のカットオフを３０％と定義した。
このＳＰＲに基づく競合アッセイによって、３つの異なるエピトープビンを確立することができた（表１０）。抗体の大部分は、エピトープビン２を表す２つの抗体（クローン５Ｃ５及び１３２）及びエピトープビン３を表す３つの抗体（クローン０１３、０１４及び３６６）を有するエピトープビン１に分類される。
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体クローン５Ｃ５、３２０、２３０、０１３、２９６及び３９５をさらなる分析のために選択した。
実施例１１．免疫細胞上のヒトＮＫＧ２Ｄへの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＩｇＧ）の特異的結合
ＮＫＧ２Ｄ陽性免疫細胞、即ち、ＮＫ細胞、γδＴ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞を使用して、選択された抗体クローンについてヒトＮＫＧ２Ｄへの結合を確認した。ヒトＣＤ８ Ｔ細胞、増殖ヒトＮＫ細胞及び増殖ヒトγδＴ細胞へのヒトＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫ細胞株ＮＫ９２に対する抗体の結合を、フローサイトメトリーによって評価した。非結合対照を実験に含めた（Ｆｃ領域にＬ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ Ｐ３２９Ｇ（「ＰＧＬＡＬＡ」）突然変異を有する非標的ＩｇＧ（配列番号８１及び８２のＶＨ及びＶＬ配列）。
方法
ヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２への結合
ＮＫ９２細胞の生存能を確認し、細胞を再懸濁し、１ｍｉｏ細胞／ｍＬの密度に調節した。１００μＬのこの細胞懸濁液（０．１ｍｉｏ細胞を含有）を、９６ウェルの丸底フラスコに播種した。プレートを４分間４００ｘｇで遠心分離し、上清を取り除いた。次に、４０μＬの希釈抗体又はＦＡＣＳ緩衝液を細胞に添加し、３０分間４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、２０μｌの希釈ＡＰＣ抗ヒトＦｃ特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９－１１６－１７０）を細胞に添加した。細胞をさらに３０分間、４℃にてインキュベートした。結合していない抗体を取り除いた後、細胞を再び、ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を固定するために、１％ＰＦＡを含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液をウェルに添加した。測定前に、細胞を１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＢＤ ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターを使用して蛍光を測定した。
ＣＤ８ Ｔ細胞への結合
新たに単離したＰＢＭＣの生存性を確認し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中１ｍｉｏ細胞／ｍｌの密度に調整した。１００μＬのＰＢＭＣ（０．１ｍｉｏ細胞を含有）を、９６ウェルの丸底フラスコに播種した。プレートを４分間４００ｘｇで遠心分離し、上清を取り除いた。次いで、ウェルあたり総体積２０μｌのＦｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）０．５μｌを添加し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。上清を除去し、次いで、４０μｌの希釈ＮＫＧ２Ｄ抗体を細胞に添加し、４℃でさらに３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、２０μｌの希釈ＦＩＴＣ抗ヒトＦｃ特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９－０９６－０９８）をＣＤ８ ＡＰＣ（クローンＳＫ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ３ ＰＥ／Ｃｙ７（クローンＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と共に細胞に添加して、ＮＫＧ２Ｄ抗体を検出し、ＣＤ８ Ｔ細胞をＰＢＭＣ内のＣＤ８及びＣＤ３陽性細胞として同定した。細胞をさらに３０分間、４℃にてインキュベートした。結合していない抗体を取り除いた後、細胞を再び、ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を固定するために、１％ＰＦＡを含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液をウェルに添加した。測定前に、細胞を１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＢＤ ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターを使用して蛍光を測定した。
増殖ＮＫ細胞への結合
増殖ＮＫ細胞の生存性を確認し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中１ｍｉｏ細胞／ｍｌの密度に調整した。１００μＬのこれらの細胞懸濁液（０．１ｍｉｏ細胞を含有）を、９６ウェルの丸底フラスコに播種した。プレートを４分間４００ｘｇで遠心分離し、上清を取り除いた。次いで、ウェルあたり総体積２０μｌのＦｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）０．５μｌを添加し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。上清を除去し、次いで、４０μｌの希釈ＮＫＧ２Ｄ抗体を細胞に添加し、４℃でさらに３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、２０μｌの希釈ＦＩＴＣ抗ヒトＦｃ特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９－０９６－０９８）を細胞に添加した。細胞をさらに３０分間、４℃にてインキュベートした。結合していない抗体を取り除いた後、細胞を再び、ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を固定するために、１％ＰＦＡを含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液をウェルに添加した。測定前に、細胞を１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＢＤ ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターを使用して蛍光を測定した。
増殖γδＴ細胞への結合
増殖γδＴ細胞の生存性を確認し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中１ｍｉｏ細胞／ｍｌの密度に調整した。１００μＬのこれらの細胞懸濁液（０．１ｍｉｏ細胞を含有）を、９６ウェルの丸底フラスコに播種した。プレートを４分間４００ｘｇで遠心分離し、上清を取り除いた。次いで、４０μｌの希釈ＮＫＧ２Ｄ抗体を細胞に添加し、４℃でさらに３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、２０μｌの希釈二次ＦＩＴＣ抗ヒトＦｃ特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９－０９６－０９８）を細胞に添加した。細胞をさらに３０分間、４℃にてインキュベートした。結合していない抗体を取り除いた後、細胞を再び、ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を固定するために、１％ＰＦＡを含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液をウェルに添加した。測定前に、細胞を１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＢＤ ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターを使用して蛍光を測定した。
増殖ヒトＮＫ細胞の生成
ＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０－０９２－６５７）を使用して、ＰＢＭＣからＮＫ細胞を単離した。このため、非ＮＫ細胞を間接的に磁気標識し、続いてＭＡＣＳセパレータを使用して磁気分離した。次いで、非標識ＮＫ細胞をＭＡＣＳカラムに通し、非ＮＫ細胞をカラムに保持した。
細胞単離後、ＮＫ細胞活性化／増殖キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、♯１３０－０９４－４８３）を用いてＮＫ細胞を培養した。ＮＫ増殖培養から開始する場合、抗ビオチンビーズ粒子に、ＣＤ３３５及びＣＤ２に対するビオチン化抗体をロードした。次いで、これらの粒子を１：２のビーズ対細胞比で細胞培養物に１回添加した。細胞を２４ウェル細胞培養プレートに１ｍｌあたり１００万細胞の細胞密度で入れた。ＮＫ細胞を６日間インキュベートし、毎日検査した。必要に応じて新鮮な培地を添加した。６日目に、細胞を再懸濁し、計数した。次いで、ＮＫ細胞を、さらなる培養のため１ｍｌ当たり１００万～１５０万細胞に維持した。ＮＫ細胞の増殖培地は、ＮＫ ＭＡＣＳ培地（２％ＮＫ ＭＡＣＳサプリメント（＃１３０－１０７－２１０）を含むＮＫ ＭＡＣＳ基礎培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅ、＃１３０－１０７－８７９、）、５％ヒトＡＢ血清及び５００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を含んでいた。
増殖ヒトγδＴ細胞の生成
増殖ヒトγδＴ細胞を生成するために使用されるプロトコルを、Ｒｉｎｃｏｎ－Ｏｒｏｚｃｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７５，２１４４－２１５１（参照により本明細書に組み込まれる）から適合させた。簡潔には、新たに単離したＰＢＭＣを、γδＴ細胞増殖培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＭＥＭ ＮＥＡＡ、１００μＭβ－メルカプトエタノール、１μｇ／ｍｌ ＩＰＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）に１ｍｉｏ細胞／ｍｌで再懸濁し、２４ウェル細胞培養プレートに播種した。培地の半分を３日目及び７日目に交換した。単離後１０日目に、ヒトＴＣＲγδ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０－０９２－８９２）を用いてγδＴ細胞を単離した。γδＴ細胞を、それらをさらに増殖させるため、γδＴ細胞増殖培地において１～２ｍｉｏ細胞／ｍｌで２４ウェル細胞培養プレートに維持した。
結果
選択された抗体５Ｃ５、３２０、２３０、０１３、２９６及び３９５は、試験された免疫細胞に濃度依存的に結合した（図５）。ＮＫＧ２Ｄの発現レベルは各免疫細胞サブセットで異なるが、ＥＣ５０値（表１１）によって示される結合強度は、全てのＮＫＧ２Ｄ陽性免疫細胞で各クローンについて同等であった。興味深いことに、ＮＫＧ２Ｄ抗体は、それらの結合挙動に関して２つの群にクラスター化した；群Ａはより高い全体的な結合を有し、群ＢはＮＫＧ２Ｄに対するより低い（Ａと比較して約半分）結合を有した（図５）。このパターンは、試験した全てのＮＫＧ２ Ｄ陽性免疫細胞（ＮＫ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞及びγδＴ細胞）で観察され、アゴニストＮＫＧ２Ｄ抗体の２つの群間の結合様式の違いを示した。
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＮＫＧ２Ｄを発現すると記載されている免疫細胞に特異的に結合する。ほとんどの抗体は低いＥＣ５０値（０．２８～１３．５ｎＭ）を有し、これは、ＮＫ細胞、γδＴ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞である異なる試験された免疫細胞サブセットに匹敵する、ＮＫＧ２Ｄに対する高い親和性結合を示す。
実施例１２．架橋抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＩｇＧ）によるＮＫＧ２Ｄ陽性免疫細胞の活性化
次に、ヒトＮＫＧ２Ｄ ＩｇＧ１抗体のアゴニスト活性を確認した。
ＮＫ９２細胞に対する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の活性
本発明者らは、指定の濃度の抗体をプロテインＡビーズにコーティングすることによって、架橋時のヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２上のＮＫＧ２Ｄの活性化を試験した。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を提示するプロテインＡビーズをＮＫ９２細胞と２４時間共インキュベートした。続いて、上清へのＮＫ９２細胞のＩＦＮγ放出を、ＮＫＧ２Ｄ活性化によって誘導されるＮＫ９２細胞の活性化についてのマーカーとしてサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）によって決定した。
全ての抗ＮＫＧ２Ｄ抗体をそれらのアゴニスト活性について試験し、その後、さらなる特性決定のため最良のアゴニストクローンを選択した。
図６では、一連の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の例をＩＦＮγ放出について試験し、それらの活性を、ＮＫ９２細胞のＩＦＮγ放出を誘導する活性がわずかであったベンチマークアゴニスト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ－２．０（Ｋｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８４，１１４３－１１５６）と比較した。
最良のアゴニスト性抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を、それらの機能活性をより詳細に再試験するために選択した。
選択された抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＮＫ９２細胞のＩＦＮγ放出を、効力の差を伴う架橋に依存して濃度依存的に誘導した（図７Ａ）。アゴニスト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体によるＮＫＧ２Ｄの活性化は、架橋抗体によってのみ誘導することができ、溶液中の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、この状況でＩＦＮγ放出を誘導するアゴニスト能力を有していなかった（図７Ｂ）。これは、本発明者らのアゴニスト性抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が、架橋剤の非存在下では免疫細胞活性化を誘導せず、したがって、これらの抗体では全身活性化が予想されないことを示す。
初代ヒトＮＫ細胞に対する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の活性
続いて、ヒトＮＫ９２細胞株に対してアゴニスト活性を示した抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を、より生理学的な細胞集団として増殖させた初代ヒトＮＫ細胞で試験した。同じ設定を使用して、この細胞型に対する抗体の機能活性を評価した。ＮＫ９２細胞で見られるように、試験した全ての抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＩＦＮγ及びＴＮＦαの上清への放出によって示される非結合アイソタイプ対照ＩｇＧ１と比較して、ヒトＮＫ細胞の活性化を誘導した（図８）。非結合アイソタイプコントロールＩｇＧ１（上記を参照されたい）は、ＩｇＧ１抗体がＮＫ細胞上のＦｃ受容体に結合して架橋する能力に起因して、いくらかのバックグラウンド活性を誘導した。これは、この設定におけるアゴニストＮＫＧ２Ｄ抗体の測定された効果が、活性化Ｆｃ受容体とＮＫＧ２Ｄとの組み合わせであり、Ｆｃ受容体単独の活性化（対照で見られる）と比較して優れていたことを意味する。
ヒトγδＴ細胞に対する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の活性
ＮＫ細胞上のアゴニスト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を試験した後、それらがγδＴ細胞を活性化できるかどうかも試験した。γδＴ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ誘発時に直接応答すると報告されている第２の細胞集団である。十分な量のγδＴ細胞を得るために、新たに単離したＰＢＭＣをＩＰＰ（イソペンテニルピロリン酸）及びＩＬ－２で活性化して、γδＴ細胞を優先的に増殖させた。増殖したγδＴ細胞を単離し、続いてプロテインＡビーズに結合したアゴニストＮＫＧ２Ｄ ＩｇＧ１抗体と共培養した。ここでも、非結合アイソタイプコントロール（上記を参照されたい）を実験に含めた。２４時間後、上清を回収し、上清中へのＴＮＦαの放出をＣＢＡによって決定した。試験したＮＫＧ２Ｄ抗体は上清へのγδＴ細胞のＴＮＦα放出を誘導し、他の試験した細胞サブセットについて見られるように抗体によるＮＫＧ２Ｄの活性化を示した（図９）。
方法
プロテインＡ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１０００１Ｄ）を再懸濁し、１０μｌのビーズ溶液を５ｍｌのＰＢＳ内で希釈した。続いて、希釈ビーズ溶液５０μｌを、１ウェルあたり約２００’０００ビーズに相当する９６ウェル丸底プレートの各ウェルに移した。１μｌのストックビーズ溶液が約２００万個のビーズを含むと仮定して計算を行った。プレートを４００×ｇで３分間遠心分離し、上清を除去した。次いで、ＰＢＳで希釈した抗ＮＫＧ２Ｄ抗体５０μｌをビーズに添加し、冷蔵庫内で１時間インキュベートして抗体をビーズに結合させた。
インキュベーション後、プレートを４００×ｇで３分間再度遠心分離し、１５０μｌのＰＢＳ／ウェルで２回洗浄して、プロテインＡビーズによって捕捉されなかった抗体を除去した。ＮＫ９２、増殖ヒトＮＫ細胞又は増殖ヒトγδＴ細胞であり得るエフェクター細胞を計数し、生存率を確認した。ＮＫ９２及び増殖したＮＫ細胞を、１０％ＦＣＳ、１％グルタミン及び１０ｎｇ／ｍｌ Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０に再懸濁し、γδＴ細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ＧｌｕｔａＭａｘ及び１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を含むＲＰＭＩ１６４０に再懸濁した。１ｍｌあたり１ｍｉｏ細胞の濃度を有する１００μｌの細胞懸濁液を、プロテインＡビーズを含有する９６ウェル丸底プレートの各ウェルに播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。
２４時間のインキュベーション後、放出されたサイトカインを含有する上清を回収し、－２０℃で保存するか、又はＣＢＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）分析に直接使用した。エフェクター細胞に応じて、異なるサイトカインを分析した。ＣＢＡ分析を製造業者の指示に従って実施したが、５０μｌのビーズ及びサンプル量の代わりに２５μｌのビーズ及びサンプル量のみを使用し、それに応じて他の全ての試薬量を適合させた。分析を、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターを用いて行った。
実施例１３．架橋抗ＮＫＧ２Ｄ抗体によるＣＤ８ Ｔ細胞クローンの共刺激
ＮＬＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞クローン及びＭＡＲＴ１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞クローンを使用して、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の共刺激能を評価した。使用したＣＤ８ Ｔ細胞クローンはＮＫＧ２Ｄ陽性である。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の共刺激能に対処するために（一次刺激（「シグナル１」）を提供するＣＤ３抗体を用いて）、９６ウェルプレートを抗ヒト抗体でコーティングして抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を固定化し、抗マウス抗体でコーティングしてＣＤ３抗体を捕捉した。その後、ＣＤ８ Ｔ細胞をプレートに添加し、２４時間インキュベートした。刺激後、ＣＤ８ Ｔ細胞クローンを回収し、活性化についてＣＤ２５のアップレギュレーションを測定することによって分析した。さらに、ＣＤ３抗体の非存在下でＮＬＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞クローンを用いて同じ実験を行い、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がシグナル１の非存在下でＣＤ８ Ｔ細胞を直接活性化する可能性を評価した。ここでも、非結合アイソタイプコントロール（上記を参照されたい）を実験に含めた。
より詳細には、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体によるＣＤ８ Ｔ細胞クローンの共刺激を試験するために、９６ウェル丸底プレートを、２μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９－００６－０９８）及び２μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１１５－００５－０７１）を含む５０μｌのＰＢＳ／ウェルで４℃にて一晩コーティングした。翌日、１％ＢＳＡを含有する２００μｌのＰＢＳでプレートを３回洗浄した。次いで、１％ＢＳＡを含有する２００μｌのＰＢＳを各ウェルに添加し、３７℃で９０分間インキュベートして、遊離プラスチック表面をＢＳＡでブロックした。上清を除去した後、５０μｌ／ウェルのＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３１７３０４）中０．２５μｇ／ｍｌ及びそれぞれの抗ＮＫＧ２ＤヒトＩｇＧ１抗体又は対照を各ウェルに添加した。プレートを３７℃で９０分間インキュベートした。その後、プレートを、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ ２００μｌ／ウェルで３回洗浄し、ＣＤ８ Ｔ細胞クローン１００’０００細胞を夕方に添加するまで冷蔵庫に保存した。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ＣＤ８ Ｔ細胞クローンを回収し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、４℃で３０分間、ＣＤ８ ＦＩＴＣ（クローンＳＫ－１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５ ＰＥ（クローンＭ－Ａ２５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ６９ ＢＶ４２１又はＣＤ６９ ＡＰＣ（クローンＦＮ５０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。結合していない抗体を取り除いた後、細胞を再び、ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を固定するために、１％ＰＦＡを含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液をウェルに添加した。測定前に、細胞を１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。蛍光は、ＢＤ ＣａｎｔｏＩＩ又はＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いて測定した。
結果を図１０に示す。本発明者らは、本発明者らのアゴニストＮＫＧ２Ｄ抗体がＣＤ８ Ｔ細胞に対して排他的に共刺激能を有し、ここではＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を誘導したＣＤ３抗体によって送達される「シグナル１」に依存することを確認することができた。
実施例１４．アゴニスト性抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のヒト化３９５
アゴニスト性抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３９５を、トランスジェニックウサギの免疫化によって得た。ＶＬドメインは既にヒトであったが、ＶＨドメインはウサギ配列であり、ヒト化されなければならなかった。より正確には、ＶＬドメインは、３アミノ酸がＣＤＲＬ１（Ｓ２８Ｄ、Ｓ３１Ｇ、及びＹ３２Ａ）で成熟し、３アミノ酸がＣＤＲＬ３（Ｓ９１Ａ、Ｙ９２Ｎ、及びＴ９４Ｆ）で成熟したヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ１Ｄ－３９＃０１である。ＣＤＲＬ２に変更はなかった。さらに、２つの体細胞突然変異、Ｋ４５Ｎ及びＦ７１ＹがＦＲ２Ｌ及びＦＲ３Ｌにおいてそれぞれ認められる。このヒト可変ドメインは改変されなかった。抗体３９５の可変重鎖は、ＦＲ Ｈ１では８、ＨＣＤＲ１では４、ＦＲ Ｈ２ではなし、ＨＣＤＲ２では４、ＦＲ Ｈ３では６のフレームワーク領域及びＣＤＲにいくつかの体細胞突然変異を有する生殖系列ＲＡＢＢＩＴ＿ＩＧＨＶ１Ｓ７＃０１から成熟したウサギＶＨである。さらに、クローン３９５の免疫グロブリンＶＨドメインは、Ｋａｂａｔによる位置２１、５０、及び７９に３つのさらなるシステインを含含む。その生殖系列によれば、位置２１及び７９はジスルフィド架橋を形成する。生殖系列のパートナーＣ３５がトレオニンに成熟しているので、５０位のシステインはパートナーを有していない。
ヒト生殖細胞系はそのような特徴を示さないため、ヒト化は追加のジスルフィド架橋を排除した。発達上の理由から、クローン３９５のその標的ＮＫＧ２Ｄへの結合に過度に影響することを回避するために、Ｃ５０をその近縁類似体であるセリンに変異させた。アクセプターフレームワークとして選択されたヒト生殖系列はいずれもＫａｂａｔによる位置５０にセリンを有していない。
ｈＶＨ５＿５１、ｈＶＨ３＿２３及びｈＶＨ４＿５９をアクセプターフレームワークとして選択した。それらは、頻繁に使用されるヒト生殖細胞系を表し、抗体３９５のＶＨドメインと高度の配列類似性を有し、予測されるＡｂａｎｇｌｅ偏差は全くないか、又はわずかである（両方とも非改変ヒト軽鎖可変ドメインと対になった元のウサギ可変重鎖と比較したそれぞれのヒト化可変重鎖ドメインの配向の変化を表す）。さらに、抗体３９５のＶＨドメインのＣＤＲを、ＶＨ３＿２３に基づくフレームワークであり、安定な抗体として十分に特徴付けられたトラスツズマブのＶＨフレームワークに移植した。
図１１に示すヒト化配列を選択して発現させ、それらの結合及び機能について試験した。配列は、配列番号１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２及び１１３（配列Ｐ１ＡＥ４９７３、Ｐ１ＡＥ４９７５、Ｐ１ＡＥ４９７７、Ｐ１ＡＥ４９７８、Ｐ１ＡＥ４９７９、Ｐ１ＡＥ４９８０及びＰ１ＡＥ４９８１）にも示されている。配列Ｐ１ＡＥ４９７２（配列番号１０６）は、Ｃ５０Ｓ突然変異を有する抗体３９５（配列番号７９）の親ＶＨ配列に対応する。
これらの残基は抗原ＮＫＧ２Ｄへの結合部位から遠く離れていると考えられるため、いくつかの正突然変異をＨＣＤＲ２の末端で考慮した。一方、クローン３９５の元のアミノ酸により密接に付着するために、いくつかの復帰突然変異も考慮した。顕著な例は、ｈＶＨ３＿２３上のＳ４９Ｇ復帰突然変異である。いくつかの変異体では、Ｎ末端ＱＥモチーフは、それらのアミノ酸がＨＣＤＲ３の後ろに位置するとも考えられる。「ＣＤＲ４」ループは、このループが時折可変重鎖ドメインの第４のＣＤＲとして抗原と接触しているため、いくつかの変異体に再導入された配列ＩＤＱＳを特徴とする。
抗体３９５のヒト化ＶＨドメイン変異体及びその元のヒトＶＬドメインを使用して二重特異性ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ抗体を生成し、次いで、これを結合及び機能性について試験した（実施例１７及び１８を参照されたい）。
実施例１５．二重特異性ＮＫＧ２Ｄ抗体の生成
例示的な第２の特異性としてＣＥＡを使用して、いくつかの形式の二重特異性ＮＫＧ２Ｄ抗体を生成し、試験した。二重特異性抗体フォーマットは、Ｄ、Ｊ、Ｋ、Ｉ、Ｌ及びＭと呼ばれ、図１２に概略的に示されている。ＤフォーマットはＮＫＧ２Ｄ及びＣＥＡについては二価であり、ＪフォーマットはＮＫＧ２Ｄについては四価であり、ＣＥＡについては一価であり、Ｋ、Ｉ及びＬフォーマットはＮＫＧ２Ｄについては二価であり、ＣＥＡについては一価であるのに対して、ＭフォーマットはＮＫＧ２Ｄ及びＣＥＡについては一価である。異なる重鎖の場合、ノブ・イントゥ・ホール技術の適用によってヘテロ二量体化が達成された。軽鎖の誤対合を回避するため、Ｉフォーマットを除いて、ＣｒｏｓｓＭａｂ（Ｆａｂドメイン交差）技術を適用したが、Ｉフォーマットでは、これは必要ではない。二重特異性抗体の交差（これらの例ではＮＫＧ２Ｄ結合）Ｆａｂ部分（複数可）では、ＶＨ及びＶＬドメインは互いに交換されたが、特異的電荷突然変異（これらの例では、それぞれ１４７Ｅ／２１３Ｅ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス）及び１２３Ｒ／１２４Ｋ（Ｋａｂａｔ））は、非交差（これらの例ではＣＥＡ結合）Ｆａｂ（複数可）の定常ドメインＣＨ１及びＣＬに導入された。
ＩｇＧとして良好なアゴニスト活性を示したアゴニスト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体５Ｃ５、０１３、２３０、３２０及び３９５を、異なる二重特異性抗体フォーマットにおける機能評価のために選択した。ウサギＶＨドメインを含む抗体３９５では、結合又は機能に影響を及ぼすことなく、ＣＤＲＨ２中の不対システインＣ５０がセリンに置き換えられた。抗体Ｂ９（配列番号１１４～１１９、１２０及び１２１のＣＤＲ並びにＶＨ及びＶＬ配列；国際公開第２００７／０７１４２２号（配列番号２７～２９、３２～３４、２２及び２６）も参照されたい；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）及びｈｕＡ５Ｂ７（ＣＤＲ配列並びにＶＨ配列及びＶＬ配列、配列番号１２２～１２７、配列番号１２８及び配列番号１２９；その全体が参照により本明細書に組み込まれる、欧州特許出願第１９１８２５０５．８号及びその優先権を主張するＰＣＴ出願も参照されたい）を、第２の特異性のための例示的な抗ＣＥＡ抗体として使用した。
二重特異性抗体の産生
ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を一過性トランスフェクションすることにより、二重特異性抗体を生成した。細胞を遠心分離し、予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，＃１０７４３０２９）により培地を置き換えた。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃２３９６６－１）を加え、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２ｍｉｏ／ｍＬ）をベクター／ＰＥＩ溶液と混合して、フラスコに移し、５％ ＣＯ２雰囲気の振盪インキュベータ内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、サプリメントを含むＥｘｃｅｌｌ培地（全体積の８０％）を添加した（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｅｄｓ．Ｗ．Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ａ．Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ２０１４）。トランスフェクションの１日後に、補充液（Ｆｅｅｄ、全体積の１２％）を添加した。７日後に、遠心分離、及びその後の濾過（０．２μｍフィルタ）により細胞上清を回収し、後述の標準的な方法により、回収した上清を精製した。
二重特異性抗体の精製及び分析
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡ－アフィニティークロマトグラフィー（平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）によって細胞培養上清から精製した。溶出はｐＨ３．０で達成され、続いて試料をすぐにｐＨ中和した。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５、＃ＵＦＣ９０３０９６）によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
Ｐａｃｅ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４，２４１１－２４２３（１９９５）に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を測定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液（それぞれ、２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４，１２５ｍＭ ＮａＣｌ，２００ｍＭ Ｌアルギニンモノヒドロクロリド，ｐＨ６．７、又は２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，２５０ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ６．２）中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより２５℃にて、凝集内容物の測定を実施した。
実施例１６．異なる二重特異性抗体フォーマットと異なるアゴニスト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体との比較
良好なアゴニスト活性（５Ｃ５、０１３、２３０、３２０）を有する選択された抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を、例示的な第２の特異性として抗ＣＥＡ抗体Ｂ９を使用して、Ｉフォーマットの二重特異性抗体に変換した。二重特異性抗体は、腫瘍細胞上のＣＥＡを介した架橋によって免疫細胞上のＮＫＧ２Ｄの活性化を誘導するはずである。
二重特異性抗体を、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイにおいて最適以下の固定濃度のＣＥＡ×ＣＤ３二重特異性抗体（ＣＥＡ－Ｔ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）、配列番号１３０～１３７（ＣＤ３ ＣＤＲ及びＶＨ／ＶＬ）、１３８～１４５（ＣＥＡ ＣＤＲ及びＶＨ／ＶＬ）及び１５４～１５７；「シグナル１」を提供するため）と組み合わせて、それらの機能活性について試験した。このアッセイでは、ＣＤ３活性化を介してＣＥＡ－ＴＣＢによって送達されるシグナル１の存在下でのＮＫＧ２Ｄの関与は、ＮＦＡＴの活性化の増加をもたらした。この活性化は、ルシフェラーゼ基質の添加時に発光の増加をもたらした。
図１３に示すように、試験した４つのＣＥＡ－ＮＫＧ２Ｄ構築物は全て、濃度依存的に、固定濃度のＣＥＡ－ＴＣＢの上で活性化を誘導することができた。抗ＮＫＧ２Ｄクローン３２０及び２３０を含有する構築物が最も高い活性を有し、抗ＮＫＧ２Ｄクローン０１３及び５Ｃ５を含む構築物がそれに続いた。これらの結果は、本発明者らの選択されたアゴニスト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が、この実施例ではＣＥＡ－ＴＣＢによるＣＤ３の関与を通して送達される「シグナル１」の存在下で、腫瘍細胞上のＣＥＡを介した架橋の際にＴ細胞活性化を増加させることができることを証明した。
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３２０を、種々の二重特異性抗体フォーマットのさらなる評価のために選択した。これは、試験されたＩフォーマットにおいて最も強力なものの中にあり、したがって、異なる二重特異性フォーマットのさらなる評価のための良好な候補であると考えられた。ＮＫＧ２Ｄをアゴナイズするための理想的な特性を有するフォーマットを同定することができるように、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＥＡについて異なる原子価を有する４つの追加の二重特異性フォーマットを設計した。二重特異性フォーマットＤ、Ｊ、Ｋ及びＬを、ここでも例示的な第２の特異性として抗ＣＥＡ抗体Ｂ９を使用して産生し、それらの機能活性を、ＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイで試験した。新しいフォーマットの活性を以前に試験したＩフォーマットと比較し、続いてＮＫＧ２Ｄ活性化を誘導する最も高い効力を有するフォーマットを選択した。フォーマットＤ及びＬは、以前に試験されたＩフォーマットの活性と同様に、最も高い効力を有した。フォーマットＫ及びＪは、他の試験されたフォーマットと比較してはるかに弱い活性を有し、したがってさらなる特性決定には考慮されなかった（図１４）。
二重特異性抗体フォーマットＤ、Ｊ、Ｋ、Ｌ及びＩの抗体３２０を、フローサイトメトリーによって測定して、ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ９２細胞及びＣＥＡを発現するＬＳ１８０細胞への結合についてさらに試験した。
ＮＫ９２細胞では、四価構築物Ｊが最も低いＥＣ５０値を有し、続いて同様に結合する３２０ ＩｇＧ及びＩフォーマットであり、フォーマットＫ、Ｌ及びＤが最も弱い結合を有する（図１５Ａ）。ＣＥＡ発現ＬＳ１８０細胞では、フォーマットＤ、Ｊ、Ｋ及びＩは、フォーマットＬと比較してＣＥＡへの結合が減少していた。フォーマットＬは、それぞれのＢ９ ＩｇＧと同等のＥＣ５０を有していたが、より高い全体的な結合を有していた（図１５Ｂ）。
次の工程では、選択されたフォーマットを、２つのさらなる強力なアゴニスト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、５Ｃ５及び０１３について試験した。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体５Ｃ５をフォーマットＤ、Ｊ及びＫに変換し、抗体０１３をフォーマットＤ及びＫに変換した。機能活性を、ＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイで試験し、それぞれのＩフォーマットの活性と比較した。抗体３２０で見られるように、抗体５Ｃ５（図１６Ａ）及び抗体０１３（図１６Ｂ）でも、以前に試験されたフォーマットＩは最も強力なフォーマットの１つであり、二価フォーマットＫは最も低い活性を有していた。
次いで、さらなる強力なアゴニスト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体である抗体３９５を、これまでのところ最も強力な二重特異性フォーマットである二重特異性Ｉフォーマットに変換した。また、抗体３９５を用いてＩｇＧ様１＋１フォーマット（Ｍフォーマット）を生成した。これらの構築物の機能活性を、ＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイで試験し、これまで試験した最も強力なものの１つであった抗体３２０を用いたＩフォーマットの機能活性と比較した。図１７に見られるように、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３９５を用いた両二重特異性フォーマットは、抗体３２０を用いたものよりも有意に強力であった。これらの２つのフォーマットを抗体３９５と比較すると、ＭフォーマットはＩフォーマットよりも全体的な活性が高く、したがってさらなる特性決定のために選択された（図１７）。
ＮＫ９２上のＮＫＧ２Ｄ（図１８Ａ）及びＬ１８０細胞上のＣＥＡ（図１８Ｂ）に対する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３９５の２つの二重特異性フォーマットＩ及びＭの結合を、フローサイトメトリーによって評価した。二価Ｉフォーマットは、対応する３９５ ＩｇＧとしてＮＫＧ２Ｄに同等に良好に結合した。一価フォーマットＭは、一価結合のために全体的な結合がより高かった（即ち、より多くの分子が結合する）が、ＥＣ５０値は、それぞれの３９５ ＩｇＧで見られたものと依然として類似していた。ＣＥＡ陽性ＬＳ１８０細胞では、Ｍフォーマットは、それぞれのＢ９ ＩｇＧと比較して、全体的な結合がより高く、ＥＣ５０値もより高かった。ＩフォーマットはＣＥＡへの弱い結合しか有さず、ＣＥＡ結合因子Ｂ９のＣ末端融合物がＣＥＡへの結合に悪影響を及ぼすことを示した。
抗体３９５による二重特異性Ｍフォーマット及び抗体３２０によるＩフォーマットをさらに特性決定するため、両方の構築物を、ＣＥＡ高ＭＫＮ－４５細胞、ＣＥＡ中ＬＳ－１８０細胞及びＣＥＡ低ＨＴ－２９細胞に対するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイで試験した。抗体３２０を用いたＩフォーマットは、ＣＥＡ高ＭＫＮ－４５細胞及びＣＥＡ中ＬＳ－１８０に対して良好な活性を有したが、ＣＥＡ低ＨＴ－２９細胞に対しては非常に弱い活性しか有さず（図１９Ａ）、抗体３９５を用いたＭフォーマットは、試験した３つ全てのＣＥＡ細胞株に対して良好な活性を有し（図１９Ｂ）、ＣＥＡ低細胞株では活性がわずかに低下しただけであった。
続いて、Ｍフォーマットのアゴニスト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３９５が、試験した他の全ての二重特異性構築物と比較して最も高い効力を有したことから、さらなる特性決定ためにフォーマットＭを選択した。次の工程として、ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞上に発現したＮＫＧ２Ｄへの二重特異性フォーマットＭの結合を、健康なドナーから新たに単離したＰＢＭＣを用いてフローサイトメトリーによって試験した。陰性対照として、ＮＫＧ２Ｄ陰性ＣＤ４ Ｔ細胞への結合を試験し、非結合対照を実験に含めた（Ｆｃ領域にＬ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ Ｐ３２９Ｇ（「ＰＧＬＡＬＡ」）突然変異を有する非標的ＩｇＧ（配列番号８１及び８２のＶＨ及びＶＬ配列）－上記も参照されたい）。予想通り、二重特異性構築物は、ＣＤ８ Ｔ細胞（図２０Ａ）及びＮＫ細胞（図２０Ｂ）に強い結合を示したが、ＣＤ４ Ｔ細胞（図２０Ｃ）には結合せず、一方、非結合対照は、試験した細胞型のいずれにも結合を示さなかった。
次いで、選択された二重特異性抗体（Ｍフォーマットの抗体３９５）の機能活性を、ＣＥＡ発現腫瘍細胞と新たに単離したＰＢＭＣとの共培養アッセイで試験して、ＴＣＢと組み合わせたＮＫＧ２Ｄ結合時のＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を評価した。初期活性化マーカーＣＤ６９及び後期活性化マーカーＣＤ２５のアップレギュレーションを、ＣＤ８ Ｔ細胞活性化のマーカーとして測定した。ＣＤ３×ＣＥＡ二重特異性抗体（ＣＥＡ－ＴＣＢ（２）、配列番号１３０～１３７（ＣＤ３ ＣＤＲ及びＶＨ／ＶＬ）、１４６～１５３（ＣＥＡ ＣＤＲ及びＶＨ／ＶＬ）及び１５８～１６１）と組み合わせたＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体の処置は、ＣＥＡ－ＴＣＢ（２）単独による処置と比較して、結腸直腸腺癌腫細胞株ＬＳ－１８０の存在下でＣＤ８ Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９のアップレギュレーションの増加を誘導した（図２１Ａ及びＢ）。ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体はまた、ＭＫＮ－４５細胞の存在下でＣＥＡ－ＴＣＢによって媒介されるＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を増強し、これは、ＣＥＡ－ＴＣＢ単独と比較してＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体とＣＥＡ－ＴＣＢとの組合せを用いたＣＤ８ Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９のアップレギュレーションの増加によって見ることができた（図２１Ｃ及びＤ）。
方法
Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイ
ＮＫＧ２Ｄ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄ）を、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｆｌｕｃ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）の安定なトランスフェクションによって生成した。細胞を、２％ＦＢＳ、１％ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及び２００μｇ／ｍｌハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｃｙｉｎ）を含有する改良ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地で培養した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞を腫瘍細胞株ＭＫＮ４５（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ４０９）、ＬＳ１８０（ＡＴＣＣ ＣＬ－１８７）、ＨＴ－２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３８）又はＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＲＭ－ＣＣＬ－２）と共培養した。アッセイは、アッセイ培地（２％ＦＣＳ及び１％ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））で行った。
トリプシンを用いて腫瘍細胞を剥離した。細胞を計数し、生存率を確認した。標的細胞をアッセイ培地に再懸濁し、白色平底９６ウェルプレートに１ウェルあたり６０ ０００細胞を播種した。次いで、Ｔ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）、ＮＫＧ２Ｄ二重特異性抗体を指定の濃度で添加した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞を計数し、生存率を確認し、１．６：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比に相当する０．１ｍｉｏ細胞を１ウェルあたりに播種した。また、２％エンドボリューム（ｅｎｄ－ｖｏｌｕｍｅ）のＧｌｏＳｅｎｓｏｒ ｃＡＭＰ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ１２９１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加した。示されたインキュベーション時間の後、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍ装置を使用して発光を測定した。
ＮＫ９２及び腫瘍細胞株への結合
ＮＫ９２細胞又は腫瘍細胞（ＭＫＮ－４５、ＬＳ１８０）の生存性を確認し、細胞を再懸濁し、１ｍｉｏ細胞／ｍｌの密度に調整した。１００μｌ／ウェルのこの細胞懸濁液（０．１ｍｉｏ細胞を含有する）を９６ウェル丸底プレートに播種した。プレートを４分間４００ｘｇで遠心分離し、上清を取り除いた。次に、４０μＬの希釈抗体又はＦＡＣＳ緩衝液を細胞に添加し、３０分間４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、２０μｌの希釈ＡＰＣ抗ヒトＦｃ特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９－１１６－１７０）を細胞に添加した。細胞をさらに３０分間、４℃にてインキュベートした。結合していない抗体を取り除いた後、細胞を再び、ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を固定するために、１％ＰＦＡを含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液をウェルに添加した。測定前に、細胞を１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＢＤフローサイトメーターを使用して蛍光を測定した。
ＰＢＭＣへの結合
新たに単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の生存性を確認し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中１ｍｉｏ細胞／ｍｌの密度に調整した。１ウェルあたり１００μＬのＰＢＭＣ（０．１ｍｉｏ細胞を含有）を、９６ウェルの丸底フラスコに播種した。プレートを４分間４００ｘｇで遠心分離し、上清を取り除いた。次いで、ウェルあたり総体積２０μｌのＦｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）０．５μｌを添加し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。上清を除去し、次いで、４０μｌの希釈抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を細胞に添加し、４℃でさらに３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、２０μｌの希釈ＰＥ抗ヒトＦｃ特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９－１１６－１７０）をＣＤ３ ＦＩＴＣ（クローンＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８ ＡＰＣ／Ｃｙ７（クローンＳＫ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４ ＡＰＣ（クローンＲＰＡ－Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ５６ ＢＶ４２１（クローンＨＣＤ５６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と共に細胞に添加して、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を検出し、ＰＢＭＣ内のＣＤ８ Ｔ細胞をＣＤ８及びＣＤ３二重陽性細胞として、ＣＤ４ Ｔ細胞をＣＤ４及びＣＤ３二重陽性細胞として、ＮＫ細胞をＣＤ３陰性及びＣＤ５６陽性細胞として同定した。細胞をさらに３０分間、４℃にてインキュベートした。結合していない抗体を取り除いた後、細胞を再び、ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を固定するために、１％ＰＦＡを含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液をウェルに添加した。測定前に、細胞を１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＢＤフローサイトメーターを使用して蛍光を測定した。
Ｔ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）と組み合わせたＣＤ８ Ｔ細胞の活性化
ＰＢＭＣを健康なドナーの血液から単離し、アッセイの開始前に生存率を確認した。標的細胞（ＭＫＮ－４５又はＬＳ１８０）をトリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を用いて剥離し、生存率を確認した。標的細胞を、０．６ｍｉｏ細胞／ｍｌの密度でアッセイ培地（２％ＦＢＳ及び１％ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を含む高度ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））に再懸濁した。細胞を９６ウェルプレートに３０ ０００細胞／ウェルで播種した。抗体をアッセイ培地で希釈し、指定の濃度の希釈抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はＴＣＢを標的細胞に添加した。次いで、６ｍｉｏ細胞／ｍｌ（Ｅ：Ｔ １０：１）の細胞密度で単離したＰＢＭＣを添加し、３００ ０００細胞／ウェル及び２００μｌ／ウェルの最終体積を得た。アッセイをインキュベータ内で３７℃で４８時間インキュベートした。その後、ＰＢＭＣを採取し、フローサイトメトリーによって分析した。細胞を４００×ｇで４分間遠心分離し、ＰＢＳで１回洗浄した。Ａｑｕａ Ｌｉｖｅ ｓｔａｉｎ（Ｌ３４９５７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５０μｌのＰＢＳ（ＰＢＳで１：１０００に希釈）に添加し、室温で２０分間インキュベートした。その後、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、プレートを４００×ｇで４分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液で再び洗浄した。次いで、ＣＤ３ ＦＩＴＣ（クローンＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８ ＡＰＣ／Ｃｙ７（クローンＳＫ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ５６ ＢＶ４２１（クローンＨＣＤ５６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５ ＰＥ（クローンＭ－Ａ２５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ６９ ＡＰＣ（クローンＦＮ５０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ４４ ＡＦ７００（クローンＩＭ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含む抗体混合物３０μｌ／ウェルを細胞に添加した。細胞を冷蔵庫内で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ウェルあたり１％のＰＦＡを含有するＦＡＣＳバッファー１００μｌで再懸濁した。測定の前に、細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。分析は、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ装置を用いて行った。
実施例１７．表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ）を使用した、ヒトＮＫＧ２Ｄ及びヒトＣＥＡに対する抗体３９５のヒト化変異体を含むＭフォーマットの二重特異性ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ抗体の親和性の決定
抗体３９５のヒト化変異体を含むＭフォーマットの二重特異性ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ抗体の親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ２００装置を使用した表面プラズモン共鳴によって評価した。ＣＭ５チップ上に、抗ペンタ－Ｈｉｓ捕捉抗体（Ｑｉａｇｅｎ Ｐｅｎｔａ・Ｈｉｓ抗体、ＢＳＡ不含；＃３４６６０）を、フローセル２及び３上に約１２’０００ ＲＵで標準的なアミンカップリングによって固定化した。それぞれのリガンドとして、ｈｉｓ ａｖｉ ｈｕＮＫＧ２Ｄ ＥＣＤ（配列番号９３）をフローセル２上に捕捉し、ヒトＣＥＡのＡ２ドメインを含有するｈｕ Ｎ（Ａ２Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓ（配列番号２０８）をフローセル３上に約２０ ＲＵで捕捉した。続いて、抗体３９５のヒト化変異体を含むＭフォーマットの二重特異性ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ抗体を、８００～０．３６６ｎＭの範囲の３倍希釈で、１２０秒の接触時間、２５０又は１０００秒の解離時間及び３０μｌ／分の流速で分析物として注入した。抗Ｈ６タグ捕捉抗体のレベルでの再生は、１０ｍＭグリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．０の６０秒間の２パルスによって達成された。不動態化フローセル１、及び分析物のゼロ濃度に対して、データを二重参照した。分析物のセンサーグラムを単純な１：１ラングミュア相互作用モデルに当てはめた。両標的に対する親和定数［ＫＤ］を表１４に要約する。
アゴニスト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３９５のヒト化ＶＨドメイン変異体を含む二重特異性ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ抗体は、非ヒト化親ウサギＶＨドメインを有する構築物よりもわずかに低い親和性を有する（Ｐ１ＡＥ４９７２）。しかしながら、Ｐ１ＡＥ４９８０は、Ｐ１ＡＥ４９７２と非常に同等の親和性をヒトＮＫＧ２Ｄに対して有する（１３ｎＭ対１１ｎＭ）。ヒトＣＥＡ（Ａ２ドメイン）に対するこれらの二重特異性抗体の親和性は、それらが全て同じＣＥＡ結合因子（ｈｕＡ５Ｂ７）を含むので有意に異ならない。
ヒト化変異体Ｐ１ＡＥ４９８０（ＣＥＡ結合因子ｈｕＡ５Ｂ７と組み合わせたＭフォーマット）を、さらなる詳細な機能的特性決定のために選択した。さらに、この二重特異性分子は、動的光散乱（ＤＬＳ）（Ｔａｇｇ ６３℃）によって決定されるように熱的に安定であり、細胞株の開発に適している。
この好ましい分子Ｐ１ＡＥ４９８０（ＣＥＡ結合因子ｈｕＡ５Ｂ７と組み合わせたＭフォーマット）の効力をさらに増加させるために、ＣＥＡ結合因子ｈｕＡ５Ｂ７を親和性成熟結合因子に置き換えた（実施例１９を参照されたい）。
実施例１８．二重特異性Ｍフォーマットにおける抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３９５のヒト化変異体の機能的特性決定
アゴニスト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体３９５の親（Ｃ５０Ｓ突然変異を有する）及び７つのヒト化変異体を、第２の特異性としてＣＥＡ結合因子ｈｕＡ５Ｂ７を使用して、ＭフォーマットのＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体に変換した。二重特異性フォーマットのヒト化変異体のＮＫ９２上のＮＫＧ２Ｄへの結合を、親抗体３９５（Ｐ１ＡＥ４９７２、Ｃ５０Ｓ突然変異を含む）の結合と比較した。変異体Ｐ１ＡＥ４９８０は親抗体としてＮＫＧ２Ｄに匹敵する結合を示し、変異体Ｐ１ＡＥ４９７３、Ｐ１ＡＥ４９７５、Ｐ１ＡＥ４９７７及びＰ１ＡＥ４９７９の結合はわずかに減少し、変異体Ｐ１ＡＥ４９７８の結合はより強く減少し、変異体Ｐ１ＡＥ４９８１はＮＫＧ２Ｄに弱くしか結合しなかった（図２２、表１５）。
さらに、７つのヒト化変異体の機能活性を、ＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイで試験し、ＣＥＡ高発現腫瘍細胞株ＭＫＮ－４５（図２３Ａ及びＢ）及びＣＥＡ低発現腫瘍細胞株ＨＴ－２９（図２３Ｃ及びＤ）での親抗体３９５（Ｃ５０Ｓ突然変異を有する）の機能活性と比較した。試験した両方の腫瘍細胞株では、二重特異性フォーマットの３９５個全てのヒト化変異体が良好な活性を有していた。変異体Ｐ１ＡＥ４９８０の活性は常に、結合データと一致する親抗体の活性に非常に近かった。
次いで、ヒト化変異体Ｐ１ＡＥ４９８０を、ＮＫＧ２Ｄへの良好な結合を示し、ヒト化変異体の中で最も高い機能活性を有し、親抗体３９５に匹敵する活性を有することから、さらなる特性決定のため選択した。
次の工程では、本発明者らは、ＮＫＧ２Ｄ結合を介したＣＥＡ－ＴＣＢ活性の増強が、腫瘍細胞上に発現したＣＥＡを介したＮＫＧ２Ｄの架橋に依存するかどうかを試験した。ＦｏｌＲ１×ＣＤ３二重特異性抗体（ＦｏｌＲ１－ＴＣＢ）とＣＥＡ－ＴＣＢとの組合せを、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイにおいてＣＥＡ陰性、ＦｏｌＲ１陽性ＨｅＬａ細胞で試験した。この設定では、シグナル１はＦｏｌＲ１－ＴＣＢを介して送達され得るが、ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体は、ＨｅＬａ細胞上のＣＥＡ発現が欠如しているために架橋することができない。ＦｏｌＲ１－ＴＣＢはＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイを活性化することができたが、ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体の添加によって活性化を増強することはできなかった（図２４Ａ）。陽性対照として、ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体とＣＥＡ－ＴＣＢとの組合せを、ＣＥＡ発現ＨＴ－２９及びＭＫＮ－４５細胞で試験した。ここで、ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体を架橋し、ＣＥＡ－ＴＣＢ単独と比較して発光の強い増加によって測定されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄ細胞の活性化の増加を測定することができる（図２４Ｂ及び２４Ｃ）。
次いで、ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体の機能活性をシェッドＣＥＡ（ｓＣＥＡ）の存在下で試験した。ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体とＭＫＮ－４５上のＣＥＡ－ＴＣＢとの組合せを、漸増濃度のｓＣＥＡの存在下でＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイで試験した。
高濃度（＞５μｇ／ｍｌ）でのみ、ｓＣＥＡはＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体の活性に悪影響を及ぼした（図２５）。
次の工程では、可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドの存在がＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせたＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体の活性を妨害し得るかどうかも試験した。可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１３００－ＭＡ－０５０）及び可溶性ＵＬＢＰ２（ｓＵＬＢＰ２；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１２９８－ＵＬ－０５０）をＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体とＣＥＡ－ＴＣＢとの組合せに添加し、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄ細胞の活性化を試験し、可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドの非存在下での活性化と比較した。
ｎＭの可溶性ＭＩＣＡ又は可溶性ＵＬＢＰ２のいずれかの添加は、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイにおいてＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせたＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体の活性を変化させなかった（図２６）。これらの結果は、ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体の活性が可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドの存在によって影響されない／阻害されないことを示している。
実施例１９．抗体ｈｕＡ５Ｂ７の親和性成熟変異体を用いたＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体の生成
ＣＥＡ結合因子ｈｕＡ５Ｂ７は、抗体Ａ５Ｂ７のヒト化バージョンである。抗体Ａ５Ｂ７は例えば、Ｍ．Ｊ．Ｂａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９９７，２９（２），１６１－１７１により開示されており、その構造は、タンパク質構造データベースＰＤＢ（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ，Ｈ．Ｍ．Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，２８，２３５－２４２）中で、ＰＤＢ ＩＤ：１ＣＬＯとして見いだすことができる。Ａ５Ｂ７のＣＤＲ及び可変領域配列は、配列番号１２２（ＨＣＤＲ１）、１６２（ＨＣＤＲ２）、１２４（ＨＣＤＲ３）、１２５（ＬＣＤＲ１）、１２６（ＬＣＤＲ２）、１２７（ＬＣＤＲ３）、１６３（ＶＨ）及び１６４（ＶＬ）に示されている。ｈｕＡ５Ｂ７の生成は、欧州特許出願第１９１８２５０５．８号及びその優先権を主張するＰＣＴ出願に記載されている。ｈｕＡ５Ｂ７のＣＤＲ及び可変領域配列は、配列番号１２２（ＨＣＤＲ１）、１２３（ＨＣＤＲ２）、１２４（ＨＣＤＲ３）、１２５（ＬＣＤＲ１）、１２６（ＬＣＤＲ２）、１２７（ＬＣＤＲ３）、１２８（ＶＨ）及び１２９（ＶＬ）に示されている。
好ましい分子Ｐ１ＡＥ４９８０（上記の実施例１７を参照されたい）の効力をさらに増加させるため、ＣＥＡ結合因子ｈｕＡ５Ｂ７をその親和性成熟変異体に置き換えた。ｈｕＡ５Ｂ７の親和性成熟は、欧州出願番号第１９１８２５０５．８号及びその優先権を主張するＰＣＴ出願に記載されている。
ｈｕＡ５Ｂ７の選択された親和性成熟変異体のＣＤＲ配列及び可変領域配列を配列表に示し、対応する配列番号を以下の表１６に要約する。
全ての親和性成熟変異体の可変ドメインを合成し、（それぞれ、正しい重鎖／重鎖及び重鎖／軽鎖のペアリングのため）ｐＧＬＡＬＡ Ｆｃドメイン突然変異と組み合わせたノブ・トゥ・ホール及びＣｒｏｓｓＭａｂ技術に基づくＩｇＧ様ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ二重特異性抗体をコードするプラスミドにクローニングした。この実施例で調製した二重特異性分子の概略図を図２７に示す。ｈｕＡ５Ｂ７及びその親和性成熟変異体のＶＨ配列及びＶＬ配列を含む重鎖及び軽鎖（表１６を参照されたい）を、ＮＫＧ２Ｄに特異的な重鎖及び軽鎖（それぞれクローンＰ１ＡＥ４９８０、配列番号１１２及び８０のＶＨ配列及びＶＬ配列を含む）と組み合わせた。ＣＥＡ結合因子Ｐ０１１．１７７を含む例示的なこのような二重特異性抗体の配列を配列番号２１３、２１４、２１５及び２１６に示す。
構築物を、従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を使用して調製し、動物成分を含まない培地及び血清を含まない培地で増殖させた、一過性にトランスフェクトされた懸濁適応性ＣＨＯ Ｋ１細胞で発現させた。タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。溶出をｐＨ３．０で達成し、続いて試料を直ちに中和した。タンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
実施例２０．親和性成熟ＣＥＡ結合因子を含む二重特異性ＣＥＡ×ＮＫＧ２Ｄ抗体の特性決定
２つの親和性成熟ＣＥＡ結合因子Ｐ００２．１３９及びＰ００１．１７７を、上記の実施例１９に記載されているように二重特異性分子に変換した。これらの２つの分子の中ＣＥＡ発現ＬＳ１８０腫瘍細胞への結合を、親ヒト化Ａ５Ｂ７ ＣＥＡ結合因子（ｈｕＡ５Ｂ７）を含む対応する分子の結合と比較した。腫瘍細胞への分子の結合をフローサイトメトリーによって分析した（図２８）。親和性成熟ＣＥＡ結合因子Ｐ００２．１３９及びＰ００１．１７７を含む二重特異性分子は、親ｈｕＡ５Ｂ７結合因子を含む対応する分子よりもわずかに良好なＣＥＡへの結合を有していた。
次の工程では、これらの３つの二重特異性ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ抗体の機能活性を、ＭＫＮ４５細胞（図２９）並びにＬＳ１８０及びＨＴ２９細胞（図３０）に対するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイで決定した。親和性成熟ＣＥＡ結合因子Ｐ００２．１３９又はＰ００１．１７７を有する分子の活性は、いくつかの条件下で、ｈｕＡ５Ｂ７ ＣＥＡ結合因子を含む分子で測定された活性よりもわずかに強力であった。
上記の実施例１６に記載されるように実験を行った。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイのために、いくつかの例では、以下のように３８４ウェルプレートを使用した。１００００個の標的細胞を白色の平底３８４ウェルプレートに播種した。次いで、ＴＣＢ及び二重特異性ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ抗体を指定の濃度で添加し、１５０００個のＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞を、１．５：１のＥ：Ｔ比に対応して添加した。
実施例２１．ＮＫＧ２Ｄ結合因子Ｃ２６及びＡＤＩ２７７４３を使用した抗ＮＫＧ２Ｄ（二重特異性）抗体のクローニング、産生及び精製
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体Ｃ２６及びＡＤＩ２７７４３（国際公開第２０１８／１４８４４５号）の可変ドメインを合成し、ヒトＩｇＧ１又はＭフォーマットの二重特異性分子をコードするプラスミドにクローニングし（図１２Ｆ）（それぞれＰＧＬＡＬＡ Ｆｃドメイン突然変異を有する）。二重特異性抗体は、第２の結合因子として抗ＣＥＡ抗体ｈｕＡ５Ｂ７を含んでいた。産生された分子の完全なアミノ酸配列は、配列番号２２１～２２２（Ｃ２６ ＩｇＧ）、配列番号２２３～２２４（ＡＤＩ２７７４３ ＩｇＧ）、配列番号２２５、２２６、２２９及び２３０（Ｃ２６二重特異性）及び配列番号２２７～２３０（ＡＤＩ２７７４３二重特異性）に示されている。
従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を伴う、専有のベクターシステム、及び（元は、ＡＴＣＣより受託し、Ｅｖｉｔｒｉａにて懸濁培養液中での無血清増殖に適合した）懸濁適応性ＣＨＯ Ｋ１細胞を使用し、Ｅｖｉｔｒｉａ（スイス）により、得られた構築物を調製した。産生のため、Ｅｖｉｔｒｉａの独自の動物成分不含及び無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）及びその独自のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を使用した。
タンパク質は、標準プロトコルに従い、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。溶出をｐＨ３．０で達成し、続いて試料を直ちに中和した。タンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
実施例２２．Ｃ２６及びＡＤＩ２７７４３に対する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体Ｐ１ＡＥ４９８０の比較
ＮＫ９２細胞株上のＮＫＧ２Ｄへの結合
実施例２１からの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体Ｐ１ＡＥ４９８０、Ｃ２６及びＡＤＩ２７７４３を、ＮＫ９２細胞上のＮＫＧ２Ｄへの結合について試験した。
ＮＫ９２細胞は、２％ＦＢＳ、１％ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及び１０ｎｇ／ｍｌ Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を含有する改良ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。ＮＫ９２細胞の生存能を確認し、細胞を再懸濁し、１．５ｍｉｏ細胞／ｍＬの密度に調節した。１００μＬのこの細胞懸濁液（０．１５ｍｉｏ細胞を含有）を、９６ウェルの丸底フラスコに播種した。プレートを４分間４００ｘｇで遠心分離し、上清を取り除いた。次に、４０μＬの希釈抗体又はＦＡＣＳ緩衝液を細胞に添加し、３０分間４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、３０μｌの希釈二次ＰＥ抗ヒトＦｃ特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９－１１６－１７０）を細胞に添加した。細胞をさらに３０分間、４℃にてインキュベートした。結合していない抗体を取り除いた後、細胞を再び、ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。測定のために、細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＢＤフローサイトメーターを使用して蛍光を測定した。
図３１に示されるように、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体Ｐ１ＡＥ４９８０は、ＮＫ９２細胞に対する最も高い全体的な結合を示し、ＡＤＩ２７７４３及びＣ２６と比較して、細胞に結合した抗体の数が最も多いことを示している。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体Ｃ２６は、試験された最高濃度でＮＫ９２に非常に弱くしか結合しない。
実施例２１からの対応する二重特異性ＮＫＧ２Ｄ×ＣＥＡ抗体についても結合を試験した。
ＩｇＧで見られるように、ＮＫＧ２Ｄ結合因子としてＰ１ＡＥ４９８０を含む二重特異性抗体は、Ｃ２６又はＡＤＩ２７７４３のいずれかを含む二重特異性抗体と比較して、ＮＫ９２細胞に対する最も高い全体的な結合を示す（図３２）。
Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイにおける機能活性の試験
ＮＫＧ２Ｄ結合因子としてＣ２６、ＡＤＩ２７７４３又はＰ１ＡＥ４９８０のいずれかを含む二重特異性ＣＥＡ×ＮＫＧ２Ｄ抗体を、上記の実施例１６に記載されるように、腫瘍細胞株ＭＫＮ４５（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ４０９）及びＨＴ－２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３８）を用いて、５ｎＭ ＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせてＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイで試験した。
ＭＫＮ４５（図３３）又はＨＴ－２９（図３４）細胞の存在下でのＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄレポーター細胞アッセイは、ＮＫＧ２Ｄ結合因子としてＰ１ＡＥ４９８０を含む二重特異性抗体が、ＡＤＩ２７７４３又はＣ２６を含む二重特異性抗体と比較して、５ｎＭ ＣＥＡ－ＴＣＢと組み合わせたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄ細胞の最も高い活性化をもたらすことを示す。ＡＤＩ２７７４３を含む二重特異性抗体は、Ｐ１ＡＥ４９８０を含む二重特異性抗体と比較して、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄ細胞を適度に活性化する。Ｃ２６を含む二重特異性抗体は、両方の試験標的細胞株の存在下でＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＮＫＧ２Ｄ細胞を非常に弱く活性化するにすぎない。
実施例２３．野生型Ｆｃドメイン又はエフェクターサイレントＦｃドメインを含む抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の比較
野生型Ｆｃドメイン又はエフェクターサイレントＦｃドメインのいずれかを有する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体によるＮＫ細胞の活性化を評価した。このアッセイのため、抗体Ｐ１ＡＥ４９８０又は３９５を（単一特異性）ヒトＩｇＧ１フォーマットで使用した。
ＰＢＭＣを全血から新たに単離した。単離したＰＢＭＣを計数し、生存率を確認した。細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘに３ｍｉｏ細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルＵ底プレートに１ウェルあたりに播種した（３０００００細胞／ウェルとなる）。５０μｌの希釈抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を各ウェルに添加し、合計１５０μｌ／ウェルを得た。
プレートをインキュベータ内で３７℃で２４時間インキュベートし、次いで３５０×ｇで２分間遠心分離した。ＰＢＭＣを回収し、フローサイトメトリーによる分析のために別の９６ウェルＵ底プレートに播種した。細胞を４００×ｇで４分間遠心分離し、ＰＢＳで１回洗浄した。５０μｌの希釈Ａｑｕａ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色液（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｌ３４９６５で１：１０００希釈）を各ウェルに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。その後、１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、１％０．５ Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８、０．２５％ＮａＮ３（２０％））を添加し、プレートを４００×ｇで４分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液で再び洗浄した。次いで、３０μｌ／ウェルのＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３００４０６）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（商標）抗ヒトＣＤ５６（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３１８３２８）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ６９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３１０９１０）の抗体混合物を細胞に添加した。細胞を４℃で６０分間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、細胞を固定するため、ウェルあたり１％のＰＦＡを含有するＦＡＣＳバッファー１００μｌで再懸濁した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。翌日のＦＡＣＳ測定の前に、細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。分析を、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ装置を用いて行った。
図３５に示すように、野生型Ｆｃドメインを有する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＮＫ細胞上のＣＤ６９のアップレギュレーションを誘導し、これは活性化を示す。対照的に、エフェクターサイレントＦｃドメイン（ＰＧＬＡＬＡ突然変異を含む）を有する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＮＫ細胞上のＣＤ６９のアップレギュレーションを誘導しない。これは、本発明者らのアゴニスト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が、機能的Ｆｃドメインの非存在下でＮＫ又は他のＦｃγ受容体発現免疫細胞の全身的な活性化を誘導しないことを示している（しかしながら、標的細胞抗原に結合し、それを介して架橋すると、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞の局所活性化のみが誘導される）。
上述の発明を、理解を明確にする目的で、説明及び実施例によって、ある程度詳細に説明してきたが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。

Claims (51)

  1. ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体であって、
    （ｉ）配列番号７３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号７４、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４及び配列番号１０５からなる群から選択されるＨＣＤＲ２、並びに配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７６の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号７７のＬＣＤＲ２及び配列番号７８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
    （ｉｉ）配列番号６５のＨＣＤＲ１、配列番号６６のＨＣＤＲ２及び配列番号６７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号６８のＬＣＤＲ１、配列番号６９のＬＣＤＲ２及び配列番号７０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
    （ｉｉｉ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
    （ｉｖ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
    （ｖ）配列番号４９のＨＣＤＲ１、配列番号５０のＨＣＤＲ２及び配列番号５１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号５３のＬＣＤＲ２及び配列番号５４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
    （ｖｉ）配列番号５７のＨＣＤＲ１、配列番号５８のＨＣＤＲ２及び配列番号５９のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号６０のＬＣＤＲ１、配列番号６１のＬＣＤＲ２及び配列番号６２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
    （ｖｉｉ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
    （ｖｉｉｉ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
    （ｉｘ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２及び配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２及び配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
    （ｘ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２及び配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２及び配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ
    を含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体。
  2. 前記第１の抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号８０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
    （ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
    （ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
    （ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
    （ｖ）配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
    （ｖｉ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
    （ｖｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
    （ｖｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
    （ｉｘ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；或いは
    （ｘ）配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ
    を含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記抗体が、ＩｇＧ抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
  4. 前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ １ 抗体である、請求項３に記載の抗体。
  5. 前記抗体が完全長抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. 前記抗体が、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. 前記抗体が多重特異性抗体である、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
  8. 前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、請求項７に記載の抗体。
  9. 前記抗体が、第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 前記第２の抗原が、標的細胞抗原である、請求項９に記載の抗体。
  11. 前記標的細胞抗原が、腫瘍細胞抗原である、請求項１０に記載の抗体。
  12. 前記抗体が、第１のサブユニットと第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体。
  13. 前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ Ｆｃドメインである、請求項１２に記載の抗体。
  14. 前記ＩｇＧ Ｆｃドメインが、ＩｇＧ １ Ｆｃドメインである、請求項１３に記載の抗体。
  15. 前記Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメインである、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の抗体。
  16. 前記Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗体。
  17. 前記抗体がＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）に結合しない、請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗体。
  18. 前記第１の抗原結合ドメイン及び／又は前記第２の抗原結合ドメインがＦａｂ分子である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体。
  19. 前記第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっているＦａｂ分子である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体。
  20. 前記第２の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である、請求項９～１９のいずれか一項に記載の抗体。
  21. 前記第２の抗原結合ドメインがＦａｂ分子であり、前記定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換され（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換され（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換され（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、請求項９～２０のいずれか一項に記載の抗体。
  22. 前記第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、請求項９～１８のいずれか一項に記載の抗体。
  23. 前記第１の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である、請求項１～１８のいずれか一項又は請求項２２に記載の抗体。
  24. 前記第１の抗原結合ドメインがＦａｂ分子であり、前記定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換され（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換され（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、前記定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換され（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、請求項１～１８のいずれか一項又は請求項２２又は２３に記載の抗体。
  25. 前記第１の抗原結合ドメイン及び前記第２の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ分子であり、前記抗体が、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、（ｉ）前記第１の抗原結合ドメインが、前記Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、且つ前記第２の抗原結合ドメインが、前記Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃドメインの前記第２のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）前記第２の抗原結合ドメインが、前記Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、且つ前記第１の抗原結合ドメインが、前記Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃドメインの前記第２のサブユニットのＮ末端に融合されている、請求項６～２４のいずれか一項に記載の抗体。
  26. 前記Ｆｃドメインが、前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、請求項１２～２５のいずれか一項に記載の抗体。
  27. 前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基が、より大きな側鎖量を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、前記第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に配置可能な前記第１のサブユニットの前記ＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、前記Ｆｃドメインの前記第２のサブユニットの前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基が、より小さな側鎖量を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、前記第２のサブユニットの前記ＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中に、前記第１のサブユニットの前記ＣＨ３ドメイン内の前記突起が配置可能である、請求項１２～２６のいずれか一項に記載の抗体。
  28. 請求項１～２７のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離ポリヌクレオチド。
  29. 請求項２８に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
  30. ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体を産生する方法であって、（ａ）前記抗体の発現に好適な条件下で請求項２９に記載の宿主細胞を培養する工程と、（ｂ）前記抗体を回収する工程と、を含む、方法。
  31. 請求項１～２７のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
  32. 医薬として使用するための、請求項１～２７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項３１に記載の医薬組成物。
  33. 疾患の処置における使用のための、請求項１～２７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項３１に記載の医薬組成物。
  34. 前記疾患ががんである、請求項３３に記載の抗体又は医薬組成物。
  35. 前記使用が、Ｔ細胞活性化剤と組み合わせたものである、請求項３３又は３４に記載の抗体又は医薬組成物。
  36. 前記Ｔ細胞活性化剤が、ＣＤ３に結合する抗体である、請求項３５に記載の抗体又は医薬組成物。
  37. 前記ＣＤ３に結合する抗体が、ＣＤ３及び標的細胞抗原に結合する二重特異性抗体である、請求項３６に記載の抗体又は医薬組成物。
  38. 前記標的細胞抗原が、腫瘍細胞抗原である、請求項３７に記載の抗体又は医薬組成物。
  39. 医薬の製造における、請求項１～２７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項３１に記載の医薬組成物の使用。
  40. 疾患を処置するための医薬の製造における、請求項１～２７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項３１に記載の医薬組成物の使用。
  41. 前記疾患ががんである、請求項４０に記載の使用。
  42. 前記処置が、Ｔ細胞活性化剤と組み合わせたものである、請求項４０又は４１に記載の使用。
  43. 前記Ｔ細胞活性化剤が、ＣＤ３に結合する抗体である、請求項４２に記載の使用。
  44. 前記ＣＤ３に結合する抗体が、ＣＤ３及び標的細胞抗原に結合する二重特異性抗体である、請求項４３に記載の使用。
  45. 前記標的細胞抗原が、腫瘍細胞抗原である、請求項４４に記載の使用。
  46. 個体における疾患を処置するための医薬であって、有効量の請求項１～２７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項３１に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む、医薬。
  47. 前記疾患ががんである、請求項４６に記載の医薬。
  48. Ｔ細胞活性化剤の投与を更に含む、請求項４６又は４７に記載の医薬。
  49. 前記Ｔ細胞活性化剤が、ＣＤ３に結合する抗体である、請求項４８に記載の医薬。
  50. 前記ＣＤ３に結合する抗体が、ＣＤ３及び標的細胞抗原に結合する二重特異性抗体である、請求項４９に記載の医薬。
  51. 前記標的細胞抗原が、腫瘍細胞抗原である、請求項５０に記載の医薬。
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