JP7497340B2 - 活性化可能なインターロイキン１２ポリペプチド及びその使用方法 - Google Patents

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Description

関連出願
本出願は、２０１８年５月１４日に出願された米国仮出願第６２／６７１，２２５号、２０１８年１１月６日に出願された米国仮出願第６２／７５６，５０４号、及び２０１８年１１月６日に出願された米国仮出願第６２／７５６，５１５号の利益を主張するものである。上記出願の教示全体は、参照により、本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１９年５月１４日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは１０５３６５－００２２＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、サイズは２３２，５２０バイトである。
コミットメントの低い前駆体からの成熟免疫担当リンパ系細胞の発達、その後のそれらの抗原駆動免疫応答、及びこれらの望ましくない自己反応性応答の抑制は、共通γ鎖（γｃ）ファミリー（Ｒｏｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）ならびにＩｌ－１２、Ｉｌ－１８、及びＩｌ－２３等のファミリーメンバーの受容体を利用するサイトカイン（インターロイキン－２［ＩＬ－２］、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１等）に大きく依存し、調節される。ＩＬ－２は、Ｔｒｅｇ細胞の胸腺での発生に不可欠であり、成熟した末梢Ｔｒｅｇ及び抗原により活性化された従来のＴ細胞のいくつかの重要な側面を決定的に調節する。ＩＬ－２は、そのインビトロでの強力なＴ細胞増殖因子活性のため、一部には、この活性が、例えば、がん及びＡＩＤＳ－ＨＩＶ等の患者で免疫を直接促進する強力な手段、または望ましくない応答、例えば、移植拒絶及び自己免疫疾患等に拮抗する標的を提供したという理由で広く研究されてきた。ＩＬ－２を用いるインビトロ研究では、これらの研究についての強い理論的根拠が得られたが、インビボでのＩＬ－２の機能はＩＬ－２欠損マウスで最初に例証されているように明らかに、よりはるかに複雑であり、免疫欠如ではなく、急速で致死的な自己免疫症候群が観察された（Ｓａｄｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９３，１９９５）。後に、ＩＬ－２Ｒα（Ｉｌ２ｒａ）及びＩＬ－２Ｒβ（Ｉｌ２ｒｂ）をコードする遺伝子を個々に除去した際に、同様の観察が行われた（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｗｉｌｌｅｒｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
本発明は、免疫のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションに依存するがん及び他の疾患の治療における使用のための、条件付きで活性である、及び／または標的化されたサイトカインを指す。例えば、いくつかのサイトカインの抗腫瘍活性は十分に知られ、また記載されており、いくつかのサイトカインはすでにヒトで治療的に使用されている。インターロイキン－２（ＩＬ－２）及びインターフェロンα（ＩＦＮα）等のサイトカインでは、様々な種類の腫瘍、例えば、腎臓転移性癌腫、有毛細胞白血病、カポシ肉腫、黒色腫、多発性骨髄腫等の患者において陽性の抗腫瘍活性が示されている。ＩＦＮβ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＴＮＦβ、ＩＬ－１、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５及びＣＳＦのような他のサイトカインでは、いくつかの種類の腫瘍に対して特定の抗腫瘍活性が示されており、したがって、それらはさらなる研究課題である。
本明細書では、疾患または障害、例えば、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫障害、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病等の治療のための、治療用タンパク質、かかるタンパク質をコードする核酸、ならびにかかるタンパク質及び核酸を使用する組成物及び方法が提供される。
本発明は、ＩＬ－１２の条件付きで活性な変異型である融合タンパク質を特徴とする。一態様では、本発明の完全長ポリペプチドは、それらが機能的ＩＬ－１２ポリペプチドを含有していても、ＩＬ－１２受容体活性化活性が低下しているか、または最小限である。例えば、遮断部分、例えば、立体遮断ポリペプチド等を、活性サイトカインに順次連結するリンカーの切断等による活性化時、ＩＬ－１２、またはその機能的断片もしくは変異タンパク質は、その受容体と結合し、シグナル伝達を実行することができる。所望される場合、完全長ポリペプチドは、追加の有利な特性も提供する遮断ポリペプチド部分を含むことができる。例えば、完全長ポリペプチドはまた、血清中半減期も延長させ、及び／または完全長ポリペプチドをサイトカイン活性の所望の部位に指向もさせる、遮断ポリペプチド部分を含有することもできる。別法として、完全長融合ポリペプチドは、遮断ポリペプチド部分とは別個の、血清中半減期延長要素及び／または標的指向性ドメインを含有することができる。好ましくは、融合タンパク質は、インビボでの循環血中半減期を延長することができる少なくとも１つの要素またはドメインを含有する。好ましくは、この要素は、身体の所望の部位で酵素により除去され（例えば、腫瘍微小環境におけるプロテアーゼによる切断）、天然に存在するペイロード分子と実質的に同様の薬物動態学的特性をペイロード分子（例えば、ＩＬ２またはＩＦＮａ）に回復させる。融合タンパク質を所望の細胞または組織に指向させる。本明細書に記載されるように、標的指向は、所望の標的にも結合する遮断ポリペプチド部分の作用を介して、または標的指向性ドメインを介して達成される。好ましい標的上の標的抗原（例えば、腫瘍特異的抗原）を認識するドメインは、切断可能または切断不可能なリンカーを介してサイトカインに結合され得る。切断不可能なリンカーで結合された場合、標的指向性ドメインは、腫瘍内にサイトカインを保持することにさらに役立つ場合があり、保持ドメインとみなされ得る。標的指向性ドメインは、必ずしもペイロード分子に直接連結される必要はなく、融合タンパク質の別の要素に直接連結されてよい。これは、標的指向性ドメインが切断可能なリンカーで結合されている場合に特に当てはまる。
一態様では、ＩＬ－１２ポリペプチド、またはその機能的断片もしくは変異タンパク質、及び遮断部分、例えば、立体遮断ドメイン等を含む融合ポリペプチドが提供される。遮断部分は、直接またはリンカーを介してＩＬ－１２ポリペプチドに融合され、融合部位もしくはリンカーまたは遮断部分内あるいはそれらの近傍での融合ポリペプチドの切断（例えば、プロテアーゼが媒介する切断）によってＩＬ－１２ポリペプチドから分離させることができる。例えば、ＩＬ－１２ポリペプチドが、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーを介して遮断部分に融合される場合、ＩＬ－１２ポリペプチドは、プロテアーゼの媒介によるリンカーの切断時に遮断部分から遊離し、その受容体と結合することができる。リンカーは、所望のサイトカイン活性の部位、例えば、腫瘍微小環境内等にて切断され、オフターゲットのサイトカイン活性を回避し、サイトカイン療法の全体的な毒性を低減するよう設計される。
遮断部分は、血清中半減期延長要素としても機能することができる。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドはさらに、別々の血清中半減期延長要素を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドはさらに、標的指向性ドメインを含む。様々な実施形態では、血清中半減期延長要素は、任意選択で分岐もしくはマルチアーム型のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、完全長ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＦｃＲｎに対する結合性を維持する断片、Ｆｃ断片、あるいはＦｃＲｎに直接結合するかもしくはヒト血清アルブミンに結合するナノボディ等の水溶性ポリペプチドである。
血清中半減期延長要素に加えて、本明細書に記載する医薬組成物は、好ましくは、１つ以上の標的抗原または単一標的抗原上の１つ以上の領域に結合する、少なくとも１つ、もしくはそれ以上の標的指向性ドメインを含む。本明細書では、本発明のポリペプチド構成体は、例えば、対象の疾患特異的微小環境内または血液中でプロテアーゼ切断部位にて切断されること、及び標的指向性ドメイン（複数可）は標的細胞上の標的抗原に結合することが企図される。少なくとも１つの標的抗原が疾患、障害もしくは状態に関与し、及び／または関連している。例示的標的抗原には、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫障害、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病または宿主対移植片病に関連するものが含まれる。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、タンパク質、脂質または多糖等の細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷した赤血球、動脈プラーク細胞、または線維性組織細胞上にある。
標的抗原は、場合によっては、罹患した細胞または組織、例えば、腫瘍またはがん細胞の表面に発現されている。腫瘍の標的抗原としては、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰａ）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質２（Ｔｒｏｐ２）、フィブロネクチンＥＤＢ（ＥＤＢ－ＦＮ）、フィブロネクチンＥＩＩＩＢドメイン、ＣＧＳ－２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃ－Ｍｅｔ、ＦＯＬＲ１、及びＣＥＡが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示される医薬組成物には、罹患した細胞または組織上で発現されることが知られている２つの異なる標的抗原に結合する２つの抗原結合ドメインを含むタンパク質も含まれる。抗原結合ドメインの例示的な対としては、ＥＧＦＲ／ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ／ＣＥＡ、及びＨＥＲ－２／ＨＥＲ－３が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、独立して、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、非Ｉｇドメイン、または標的抗原に特異的に結合するリガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、細胞表面分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、及びＦＯＬＲ１のうちの少なくとも１つから選択される腫瘍抗原に特異的かつ独立して結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、２つの異なる抗原に特異的かつ独立して結合し、抗原のうちの少なくとも１つは、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、及びＦＯＬＲ１から選択される腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、保持ドメインとして機能し、切断不可能なリンカーを介してサイトカインに結合されている。
本明細書に記載されるように、サイトカイン遮断部分は、サイトカインに結合し、それによりサイトカインの同族受容体の活性化を遮断することができる。
本開示はまた、本明細書に記載される、条件付きで活性なタンパク質をコードする核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ等、ならびにそのような核酸を含有するベクター及び宿主細胞にも関する。
本開示はまた、条件付きで活性なタンパク質を含有する医薬組成物、条件付きで活性なタンパク質をコードする核酸、及びそのような核酸を含有するベクター及び宿主細胞にも関する。典型的には、医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容される担体及び／または添加物を含有する。
本開示はまた、前述のうちのいずれかの、条件付きで活性なタンパク質、条件付きで活性なタンパク質をコードする核酸、そのような核酸を含有するベクターまたは宿主細胞、及び医薬組成物を有効量にて、それを必要とする対象に投与することを含む治療方法にも関する。典型的には、対象は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫障害、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病もしくは宿主対移植片病を有するか、または発症するリスクがある。
本開示はまた、前述のうちのいずれかの、条件付きで活性なタンパク質、条件付きで活性なタンパク質をコードする核酸、そのような核酸を含有するベクターまたは宿主細胞、及び医薬組成物の、それを必要とする対象を治療するための使用にも関する。典型的には、対象は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫障害、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病もしくは宿主対移植片病を有するか、または発症するリスクがある。
本開示はまた、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫障害、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病または宿主対移植片病等の疾患を治療するための医薬品の製造のための、条件付きで活性なタンパク質、条件付きで活性なタンパク質をコードする核酸、そのような核酸を含有するベクターもしくは宿主細胞の使用にも関する。
プロテアーゼにより活性化される、遮断部分を含むサイトカインまたはケモカインを示す概略図である。遮断部分は、任意選択で、血清中半減期延長ドメインとして機能し得る。矢印の左側は、サイトカインが、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して遮断部分に接続されており、そのため、サイトカインがその受容体に結合する能力が遮断されていることを示す図である。矢印の右側は、炎症性または腫瘍の環境では、プロテアーゼがリンカー上のプロテアーゼ切断部位で切断して遮断部分を遊離させ、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示す図である。 ＨＳＡ（遮断部分）が目的のサイトカインまたはケモカインに直接結合され、プロテアーゼ切断部位は、ＨＳＡと目的のサイトカインまたはケモカインとの間にある、プロテアーゼにより活性化されるサイトカインまたはケモカインを示す概略図である。矢印の左側は、サイトカインが、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して遮断部分に接続されており、そのため、サイトカインがその受容体に結合する能力が遮断されていることを示す図である。矢印の右側は、炎症性または腫瘍の環境では、プロテアーゼがリンカー上のプロテアーゼ切断部位で切断して遮断部分を遊離させ、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示す図である。 ２つ以上のＨＳＡ（遮断部分）が目的分子に直接結合されている、プロテアーゼにより活性化されるサイトカインまたはケモカインを示す概略図である。所望される場合、ＨＳＡのうち１つ以上を、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカー等のリンカーを介してサイトカインまたはケモカインに結合させることができる。矢印の左側は、サイトカインが、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して遮断部分に接続されており、そのため、サイトカインがその受容体に結合する能力が遮断されていることを示す図である。矢印の右側は、炎症性または腫瘍の環境では、プロテアーゼがリンカー上のプロテアーゼ切断部位で切断して遮断部分を遊離させ、サイトカインが受容体と結合するのを可能にすることを示す図である。サイトカインはここで天然サイトカインと比較して同様のｐＫ特性を有する（例えば、半減期が短い）。 同じ種類または異なる種類の２つ以上のサイトカインを含む、プロテアーゼにより活性化されるサイトカインまたはケモカインを示す概略図であり、その各々が、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して結合ドメインに結合されている。矢印の左側は、サイトカインが、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して遮断部分に接続されており、そのため、サイトカインがその受容体に結合する能力が遮断されていることを示す図である。矢印の右側は、炎症性または腫瘍の環境では、プロテアーゼがリンカー上のプロテアーゼ切断部位で切断して遮断部分を遊離させ、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示す図である。 少なくとも１つのプロテアーゼ切断可能リンカーにより接続されている、サイトカインまたはケモカインポリペプチド、遮断部分、及び血清中半減期延長ドメインを含む、プロテアーゼにより活性化されるサイトカインまたはケモカインを示す概略図である。矢印の左側は、サイトカインが、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して遮断部分に接続されており、そのため、サイトカインがその受容体に結合する能力が遮断されていることを示す図である。サイトカインはまた、血清中での半減期を延長する別個の半減期延長要素にも結合されている。矢印の右側は、炎症性または腫瘍の環境では、プロテアーゼがリンカー上のプロテアーゼ切断部位で切断し、そのため、血清中半減期延長要素及び遮断部分を遊離させ、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示す図である。サイトカインはここで天然サイトカインと比較して同様のｐＫ特性を有する（例えば、半減期が短い）。 少なくとも１つのプロテアーゼ切断可能リンカーにより接続されている、サイトカインまたはケモカインポリペプチド、遮断部分、及び標的指向性ドメインを含む、プロテアーゼにより活性化されるサイトカインまたはケモカインを示す概略図である。矢印の左側は、サイトカインが、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して遮断部分及び標的指向性ドメインに接続されており、そのため、サイトカインがその受容体に結合する能力が遮断されていることを示す図である。矢印の右側は、炎症性または腫瘍の微小環境では、プロテアーゼが、リンカー内のプロテアーゼ切断部位で切断して標的指向性ドメイン及び遮断部分を遊離させ、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示す図である。 少なくとも１つのプロテアーゼ切断可能リンカーにより接続されている、サイトカインまたはケモカインポリペプチド、遮断部分、標的指向性ドメイン、及び血清中半減期延長ドメインを含み、サイトカインポリペプチドと標的指向性ドメインとがプロテアーゼ切断可能リンカーにより接続されている、プロテアーゼにより活性化されるサイトカインまたはケモカインを示す概略図である。矢印の左側は、プロテアーゼ切断可能リンカー（複数可）を介して標的指向性ドメイン、遮断部分、及び半減期延長要素に接続されており、そのため、それがその受容体に結合する能力が遮断されていることを示す図である。矢印の右側は、炎症性または腫瘍の環境では、プロテアーゼが、リンカー（複数可）上のプロテアーゼ切断部位で切断して半減期延長要素、標的指向性ドメイン、及び遮断部分を遊離させ、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示す図である。サイトカインはここで天然サイトカインと比較して同様のｐＫ特性を有する（例えば、半減期が短い）。 少なくとも１つのプロテアーゼ切断可能リンカーにより接続されている、サイトカインまたはケモカインポリペプチド、遮断部分、標的指向性ドメイン、及び血清中半減期延長ドメインを含む、プロテアーゼにより活性化されるサイトカインまたはケモカインを示す概略図である。矢印の左側は、サイトカインが、プロテアーゼ切断可能リンカー（複数可）を介して標的指向性ドメイン、遮断部分、及び半減期延長要素に接続されており、そのため、サイトカインがその受容体に結合する能力が遮断されていることを示す図である。矢印の右側は、炎症性または腫瘍の環境では、プロテアーゼが、リンカー（複数可）上のプロテアーゼ切断部位で切断して半減期延長要素及び遮断部分を遊離させ、サイトカインが受容体に結合するのを可能にすることを示す図である。標的指向性部分は結合されたまま残り、サイトカインを腫瘍微小環境内に維持する。サイトカインはここで天然サイトカインと比較して同様のｐＫ特性を有する（例えば、半減期が短い）。 免疫グロブリン分子の可変ドメインの構造を示す概略図である。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインは、３つの超可変ループ、または相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。Ｖドメインの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）がベータバレルの一端でクラスターを形成する。ＣＤＲは、免疫グロブリンフォールドのベータ鎖Ｂ－Ｃ、Ｃ’－Ｃ”、及びＦ－Ｇをつなぐループであるが、免疫グロブリンフォールドのベータ鎖ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”－Ｄ及びＥ－Ｆをつなぐ下部ループ、ならびに免疫グロブリンフォールドのＤ－Ｅ鎖をつなぐ上部ループは非ＣＤＲループである。 サイトカインまたはケモカインポリペプチド、血清アルブミン結合ドメイン（例えば、ｄＡｂ）である遮断部分、及びプロテアーゼ切断可能リンカーを含む、プロテアーゼにより活性化されるサイトカインまたはケモカインを示す概略図である。図示の例では、血清アルブミン結合ドメイン（例えば、ｓｄＡｂ）内の非ＣＤＲループはサイトカインＩＬ－１２に対する結合部位を形成することができる。この例では、血清アルブミンの結合部位は血清アルブミン結合ドメインのＣＤＲにより形成することができる。 プロテアーゼによる切断の前後にヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質で実施したＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイから得た結果を示すグラフである。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（登録商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。結果から、ＩＬ１２タンパク質融合タンパク質は活性であることが確認される。 図８ａ～８ｆは、ＭＭＰ９による切断の前後の、４つのＩＬ－１２融合タンパク質のＨＥＫ－ｂｌｕｅアッセイの結果を示す一連のグラフを示す。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。データは、完全融合タンパク質よりも切断型ＩＬ１２において活性が大きいことを示す。被験構成体は、ＡＣＰ０６（図８ａ）、ＡＣＰ０７（図８ｃ）、ＡＣＰ０８（図８ｂ）、ＡＣＰ０９（図８ｄ）、ＡＣＰ１０（図８ｅ）、ＡＣＰ１１（図８ｆ）であった。 図８ａ～８ｆは、ＭＭＰ９による切断の前後の、４つのＩＬ－１２融合タンパク質のＨＥＫ－ｂｌｕｅアッセイの結果を示す一連のグラフを示す。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。データは、完全融合タンパク質よりも切断型ＩＬ１２において活性が大きいことを示す。被験構成体は、ＡＣＰ０６（図８ａ）、ＡＣＰ０７（図８ｃ）、ＡＣＰ０８（図８ｂ）、ＡＣＰ０９（図８ｄ）、ＡＣＰ１０（図８ｅ）、ＡＣＰ１１（図８ｆ）であった。 タンパク質切断アッセイの結果を示す。融合タンパク質ＡＣＰ１１を切断形態及び非切断形態の両方でＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにかけた。ゲルに示されるように、切断は完了した。 誘導性サイトカインタンパク質の非限定的な例を示す概略図であり、構成体は、サイトカインの２つのサブユニット間に結合されたリンカーのプロテアーゼによる切断時に活性化される。 図１１ａ～図１１ｄは、プロテアーゼによる切断の前後にヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質で実施したＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイから得た結果を示すグラフである。アッセイを実施した。結果から、ＩＬ１２タンパク質融合タンパク質は活性であることが確認される。各増殖アッセイは、ＨＳＡを用いて、またはＨＳＡを用いずに実施された。 図１２は、Ｂ１６レポーターアッセイを使用して、未切断型の融合タンパ ク質の活性と比較した、ＭＭＰ９により切断された例示的ＩＦＮγ融合タンパク質（ＡＣＰ５１およびＡＣＰ５２）の活性を示す２つのグラフである。各融合タンパク質は、抗ＨＳＡ結合体および腫瘍標的化ドメインを含む。 ＨＥＫＢｌｕｅレポーターアッセイにおいて、切断されたＩＬ－１２ポリペプチドは活性であることを示す一連のグラフである。左上のパネルは、このアッセイにおいてマウスＩＬ－１２は活性であることを示す（陽性対照）。左下のパネル及び右下のパネルはそれぞれ、未切断型（四角）及び切断型（三角）の活性を示す。各々のＥＣ５０値を挿入表、右上のパネルに示す。 ＨＥＫＢｌｕｅレポーターアッセイにおいて、切断されたＩＬ－１２ポリペプチドは活性であることを示す一連のグラフである。左上のパネルは、このアッセイにおいてマウスＩＬ－１２は活性であることを示す（陽性対照）。左下のパネル及び右下のパネルはそれぞれ、未切断型（四角）及び切断型（三角）の活性を示す。各々のＥＣ５０値を挿入表、右上のパネルに示す。 １７．５μｇのＡＣＰ１１（四角）、１７５μｇのＡＣＰ３１（三角）、５２５μｇのＡＣＰ３１（丸）、ならびに対照としての２μｇのＡＣＰ０４（破線、三角）及び１０μｇのＡＣＰ０４（破線、菱形）で処置したマウスにおける経時的な腫瘍体積を示す。ビヒクル単体は大きい白丸で示される。データは、ＡＣＰ１１及びＡＣＰ０４（ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質）で処置したいずれのマウスにおいても腫瘍体積が用量依存的に経時的に減少することを示す。 ビヒクル単体（上段左）、２μｇのＡＣＰ０４（上段中央）、１０μｇのＡＣＰ０４（上段右）、１７．５μｇのＡＣＰ１１（下段左）、１７５μｇのＡＣＰ１１（下段中央）、及び５２５μｇのＡＣＰ１１（下段右）で処置した各マウスのマウス異種移植腫瘍モデルにおける経時的な腫瘍体積を示す一連のスパゲッティプロットである。各線は１匹のマウスを表す。 プロテアーゼで切断可能な融合タンパク質の例示として使用するＴｒｉＴａｃポリペプチドの特性を示す。 プロテアーゼで切断可能な融合タンパク質の例示として使用するＴｒｉＴａｃポリペプチドの特性を示す。 プロテアーゼで切断可能な融合タンパク質の例示として使用するＴｒｉＴａｃポリペプチドの特性を示す。 プロテアーゼで切断可能な融合タンパク質の例示として使用するＴｒｉＴａｃポリペプチドの特性を示す。 プロテアーゼで切断可能な融合タンパク質の例示として使用するＴｒｉＴａｃポリペプチドの特性を示す。 プロテアーゼで切断可能な融合タンパク質の例示として使用するＴｒｉＴ ａｃポリペプチドの特性を示す。
本明細書では、誘導性ＩＬ－１２を含む構成体を操作し使用するための方法及び組成物を開示する。ＩＬ－１２は強力な免疫アゴニストであり、そのため、サイトカインが腫瘍学の有望な治療剤とみなされるようになる。しかしながら、ＩＬ－１２及び他のサイトカインは治療域が非常に狭いことが証明された。ＩＬ－１２等のサイトカインは血清中半減期が短く、また極めて強力であると考えられている。結果として、サイトカインの治療的投与により望ましくない全身性の作用及び毒性が生じる。これらは、サイトカイン作用が意図される部位（例えば、腫瘍）で所望のサイトカインレベルを達成するために大量のサイトカインを投与する必要性により悪化した。残念なことに、サイトカインの生物学、及びそれらの活性を効果的に標的とし、制御できないために、サイトカインでは、腫瘍の治療において期待される臨床的利点は達成されなかった。
本明細書では、腫瘍学におけるＩＬ－１２の臨床用途を厳しく制限していた毒性及び短い半減期という問題を克服する融合タンパク質を開示する。融合タンパク質は、受容体アゴニスト活性を有するＩＬ－１２ポリペプチドを含有する。しかし、融合タンパク質との関連においては、ＩＬ－１２受容体アゴニスト活性は減弱され、循環血中半減期は延長される。融合タンパク質にはプロテアーゼ切断部位が含まれ、これらは、ＩＬ－１２活性の所望の部位（例えば、腫瘍）に関連するプロテアーゼによって切断され、所望の活性の部位において典型的には濃縮されるかまたは選択的に存在する。したがって、融合タンパク質は、優先的（または選択的）かつ効率的に活性の所望の部位で切断して、サイトカイン活性を活性の所望の部位、例えば、腫瘍微小環境等に実質的に制限する。腫瘍微小環境内等、活性の所望の部位でのプロテアーゼによる切断により、融合タンパク質よりもＩＬ－１２受容体アゴニストとしてはるかに活性な（典型的には融合タンパク質よりも少なくとも約１００倍活性である）融合タンパク質から、ある形態のＩＬ－１２を遊離させる。融合タンパク質の切断時に遊離するＩＬ－１２の形態は典型的には半減期が短く、天然に存在するＩＬ－１２の半減期と実質的に同様であることが多く、ＩＬ－１２サイトカイン活性を腫瘍微小環境にさらに制限する。融合タンパク質の半減期は延長されるが、循環融合タンパク質は減弱されており、活性サイトカインが腫瘍微小環境に指向されるため、毒性は劇的に低減または排除される。本明細書に記載される融合タンパク質は、初めて、サイトカインの活性を実質的に腫瘍微小環境に制限し、サイトカインの望ましくない全身性の作用及び毒性を劇的に低減または排除する、腫瘍を治療する有効治療量のサイトカインの投与を可能にする。
特別に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語、表記法及び他の科学用語はいずれも、本発明が関連する当業者により共通して理解される意味を持つことが意図される。場合によっては、共通して理解される意味を持つ用語は、分かりやすくするため、及び／またはすぐに参照できるようにするために本明細書で定義され、そのような定義を本明細書に含めることは、必ずしも当該技術分野で一般に理解されるものとの相違を表すものではないと解釈されるべきである。本明細書で記載または参照される技術及び手順は、一般によく理解されており、当業者による従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ４ｔｈ ｅｄ．（２０１２） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている、広く利用されている分子クローニング方法論等を使用して一般的に使用される。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を伴う手順は一般に、特に断りのない限り、製造者が定義するプロトコル及び条件に従って行われる。
「サイトカイン」は、特に免疫系の細胞によって分泌され、免疫系の調節因子である一群の免疫調節タンパク質（インターロイキンまたはインターフェロン等）のいずれかを指す周知の技術用語である。本明細書に開示される融合タンパク質で使用できるサイトカインポリペプチドとしては、ＴＧＦ－α及びＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３）等のトランスフォーミング増殖因子；インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－γ、インターフェロン－カッパ及びインターフェロン－オメガ等のインターフェロン；ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１及びＩＬ－２５等のインターロイキン；腫瘍壊死因子アルファ及びリンホトキシン等の腫瘍壊死因子；ケモカイン（例えば、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳ）、ならびにサイトカインの同族受容体を活性化するようなポリペプチドの断片（すなわち、前述のものの機能的断片）が挙げられるが、これらに限定されない。「ケモカイン」は、応答性細胞近傍へ向けられる走化性を誘導する能力のある小さなサイトカインのファミリーのいずれかを指す技術用語である。
サイトカインは血清中半減期が短く、わずか数分である場合が多いことが周知である。血清中半減期を延長することを意図した改変アミノ酸配列を有するが受容体アゴニスト活性は保持するサイトカインの形態でさえも、典型的には血清中半減期が短い。本明細書で使用する場合、「半減期が短いサイトカイン」とは、対象の血清中を循環する半減期が実質的に短時間である、例えば、血清中半減期が１０分未満、１５分未満、３０分未満、６０分未満、９０分未満、１２０分未満、２４０分未満、または４８０分未満であるサイトカインを指す。本明細書で使用する場合、半減期の短いサイトカインには、対象の体内で通常よりも長い半減期を達成するように、その配列が修飾されていないサイトカイン、及び血清中半減期を延長することを意図した改変アミノ酸配列を有するが、受容体アゴニスト活性は保持するポリペプチドが含まれる。この後者の場合、異種タンパク質ドメイン、例えば、真正な半減期延長要素、例えば、血清アルブミン等の付加を含めることを意図しない。典型的には、ＩＬ－１２ポリペプチド等の短い半減期サイトカインポリペプチドは、天然に存在するＩＬ－１２に匹敵する血清中半減期を有し、例えば、天然に存在するＩＬ－１２の５倍、４倍、３倍または２倍以内である。
「ソルターゼ」は、標的とするタンパク質もしくはペプチドに包埋されているかまたはその末端に結合しているカルボキシル末端の局在化シグナルを認識して切断することによってタンパク質を修飾するペプチド転移酵素である。ソルターゼＡは、標的タンパク質上のＴｈｒ残基とＧｌｙ残基の間のＬＰＸＴＧモチーフ（配列番号８０）（Ｘは、任意の標準アミノ酸）の切断を触媒し、Ｔｈｒ残基が酵素上の活性部位であるＣｙｓ残基に一過性に結合し、酵素－チオアシル中間体を形成する。ペプチド転移を完了させ、ペプチド－単量体複合体を作るために、Ｎ末端求核基、典型的にはオリゴグリシンモチーフを有する生体分子は中間体を攻撃し、ソルターゼＡを置換して２つの分子を連結する。
本明細書で使用する場合、用語「立体遮断物質」とは、サイトカインポリペプチドに、例えば、キメラポリペプチド（融合タンパク質）等の形態で、リンカー等の他の部分を介して共有結合で直接または間接的に結合させることができるが、それ以外の場合にはそのサイトカインポリペプチドには共有結合で結合しないポリペプチドまたはポリペプチド部分を指す。立体遮断物質は、サイトカインポリペプチドに非共有結合的に、例えば、静電結合、疎水結合、イオン結合または水素結合を介して結合することができる。立体遮断物質は、典型的には、それがサイトカイン部分に近接していること及び同等のサイズであることによりサイトカイン部分の活性を阻害するかまたは遮断する。
本明細書で使用及び記載される場合、「半減期延長要素」は、例えば、そのサイズ（例えば、腎臓ろ過カットオフ値を上回るよう）、形状、流体力学的半径、電荷を改変するか、または吸収、生体内分布、代謝、及び消失というパラメータを改変することによって、血清中半減期を延長させ、かつｐＫを改善するキメラポリペプチドの一部である。
本明細書で使用する場合、用語「活性化可能な」、「活性化する」、「誘導する」、及び「誘導性」とは、タンパク質、すなわち、融合タンパク質の一部であるサイトカインが、融合タンパク質からの追加要素の切断時に自身の受容体と結合して活性を実現する能力を指す。
本明細書で使用する場合、「プラスミド」または「ウイルスベクター」は、開示の核酸を分解されない状態で細胞に輸送し、かつ、送達先の細胞に核酸分子及び／またはポリペプチドの発現をもたらすプロモーターを含む、物質である。
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結される２つ以上のアミノ酸を意味するために広く使用される。タンパク質、ペプチド、及びポリペプチドはまた、本明細書ではアミノ酸配列を指すために同じ意味で使用される。本明細書では、分子を構成するアミノ酸の特定のサイズまたは数を示唆するためにはポリペプチドという用語は使用されないこと、本発明のペプチドは最大で数個からそれ以上のアミノ酸残基を含有することができることを認識されるべきである。
全体を通して使用する場合、「対象」は、脊椎動物、より具体的には、哺乳類（例えば、ヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラット、及びモルモット）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び他の任意の動物であり得る。かかる用語は特定の年齢または性別を意味しない。したがって、雌雄を問わず、成体及び新生の対象が包含されることが意図される。
本明細書で使用する場合、「患者」または「対象」は、同じ意味で使用されてよく、疾患または障害（例えば、がん）を有する対象を指し得る。患者または対象という用語には、ヒト対象及び獣医学の対象が含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「治療」、「治療する」、または「治療すること」とは、疾患もしくは状態の影響またはその疾患もしくは状態の症状を低減する方法を指す。したがって、開示の方法では、治療は、確立された疾患もしくは状態またはその疾患もしくは状態の症状の重症度における、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または実質的に完全な低減を指し得る。例えば、疾患を治療するための方法は、対象の疾患の１つ以上の症状において、対照と比較して１０％の低減がある場合、治療とみなされる。したがって、低減は、天然または対照でのレベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％～１００％の間の任意の低減率であり得る。治療は必ずしも疾患、状態、またはその疾患もしくは状態の症状の治癒または完全な除去を指すものではないと理解される。
本明細書で使用する場合、疾患または障害について「予防する」、「予防すること」、及び「予防」という用語は、行為、例えば、対象がその疾患または障害の１つ以上の症状を示し始める前、またはそれとほぼ同時に行われる、キメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸配列の投与等であって、その疾患もしくは障害の１つ以上の症状の発症または増悪を阻害するかまたは遅らせる行為を指す。
本明細書で使用する場合、「減少すること」、「低減すること」、または「阻害すること」への言及には、適切な対照のレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％またはそれより大きい変化が含まれる。そのような用語には、機能または特性、例えば、アゴニスト活性等の完全な消失が含まれ得るが、必ずしも含まれるわけではない。
「減弱されたサイトカイン受容体アゴニスト」は、そのサイトカイン受容体の天然に存在するアゴニストと比較して受容体アゴニスト活性が低下しているサイトカイン受容体アゴニストである。減弱されたサイトカインアゴニストは、その受容体の天然に存在するアゴニストと比較して、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍またはそれより低いアゴニスト活性を有してよい。本明細書に記載のサイトカインポリペプチドを含有する融合タンパク質が「減弱された」または「減弱された活性」を有すると記載されている場合、その融合タンパク質は、減弱されたサイトカイン受容体アゴニストであることを意味する。
「無傷の融合タンパク質」は、例えば、プロテアーゼによる切断等によって除去されているドメインがない融合タンパク質である。ドメインはプロテアーゼによる切断または他の酵素活性によって除去可能であり得るが、融合タンパク質が「無傷」の場合は、これは起こっていない。
本明細書で使用する場合、「部分」とは、分子の一部分であって、その分子内部で別個の機能を有し、別の分子の状況においてその機能がその部分によって実行され得るものを指す。部分は、特定の機能を有する化学物質であるか、または特定の機能を有する生物学的分子の一部分であってよい。例えば、融合タンパク質内部の「遮断部分」は、融合ポリペプチドの一部またはすべての活性を遮断することができる、融合タンパク質の一部分である。これは、血清アルブミン等のタンパク質ドメインであってよい。
一般に、サイトカインの治療的使用は、その全身毒性により強く制限される。例えば、ＴＮＦは当初、それが一部の腫瘍の出血性壊死を誘発する能力、及び様々な腫瘍株に対するインビトロでの細胞毒性作用について発見されたが、その後、強い炎症誘発性活性を有することが証明され、それが過剰産生状態になった場合、危険なほど人体に影響を及ぼす場合がある。全身毒性は、ヒトにおいて薬理学的に活性な量のサイトカインの使用に関連する根本的な問題であるため、このクラスの生物学的エフェクターの治療有効性を維持しつつ、その毒性作用を低減することを目的とした新規の誘導体及び治療的戦略が現在評価中である。
インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）は、別々にコードされた２つのサブユニット（ｐ３５及びｐ４０）のジスルフィド結合ヘテロ二量体であり、それらは、共有結合で連結されていわゆる生物活性ヘテロ二量体の（ｐ７０）分子を生じさせる（Ｌｉｅｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｊａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ヘテロ二量体（ＩＬ－１２及びＩＬ－２３）の形成とは別に、ｐ４０サブユニットはまた、単量体（ｐ４０）として、及びホモ二量体（ｐ４０２）としても分泌される。ｐ３５をｐ４０サブユニットに接続するリンカーを用いた一本鎖としてのヘテロ二量体の合成により、ヘテロ二量体の完全な生物学的活性が保存されることは当該技術分野で公知である。ＩＬ－１２は、感染に対する初期炎症反応、及び細胞性免疫に有利なＴｈ１細胞の発生において重要な役割を果たす。ＩＬ－１２の過剰産生は、それが、いくつかの自己免疫性炎症性疾患（例えば、ＭＳ、関節炎、１型糖尿病）の病因に関与しているため、宿主にとって危険であり得ることがわかっている。
ＩＬ－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）は、活性化Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞の表面に発現するＩＬ－１２Ｒβ１鎖及びＩＬ－１２Ｒβ２鎖からなるヘテロ二量体複合体である（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＩＬ－１２Ｒβ１鎖はＩＬ－１２ｐ４０サブユニットに結合するが、ＩＬ－１２Ｒβ２と会合したＩＬ－１２ｐ３５は、細胞内シグナル伝達能力を付与する（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＩＬ－１２Ｒを介したシグナル伝達は、シグナル伝達物質及び転写（ＳＴＡＴ）１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、及びＳＴＡＴ５の活性化因子をリン酸化し、活性化する、ヤヌスキナーゼ（Ｊａｋ２）及びチロシンキナーゼ（Ｔｙｋ２）のリン酸化を誘導する。ＩＬ－１２の細胞への特定の作用は主にＳＴＡＴ４の活性化によるものである。ＩＬ－１２は、Ｔｈ１表現型へのＣＤ４＋ Ｔ細胞の分化等、ＩＬ－１２の炎症誘発性活性の多くを媒介するサイトカイン、特にインターフェロン（ＩＦＮ）γを産生するようナチュラルキラー及びＴ細胞を誘導する（Ｍｏｎｔｅｐａｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
ＩＬ－１２は多面的サイトカインであり、その作用により自然免疫と適応免疫の間の相互接続が形成される。ＩＬ－１２は最初、ＰＭＡで誘導されたＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株から分泌される因子として記載された。その作用に基づき、ＩＬ－１２は、細胞傷害性リンパ球成熟因子及びナチュラルキラー細胞刺激性因子であるとされている。自然免疫と適応免疫との橋渡しをすること、及び自然の抗がん防御機構を統合するサイトカインであるＩＦＮγの産生を強力に刺激することから、ＩＬ－１２はヒトでの腫瘍免疫療法の理想的候補と思われた。しかしながら、臨床研究におけるＩＬ－１２の全身投与に関連する重篤な副作用、及びこのサイトカインの治療指数が非常に狭いことにより、がん患者におけるこのサイトカインの使用に対する意気込みが著しく弱められた（Ｌａｓｅｋ ｅｔ．ａｌ．，２０１４）。サイトカインの送達が腫瘍を標的とするＩＬ－１２療法に対する試みは、ＩＬ－１２療法に関するこれまでの問題のいくつかを軽減する可能性があり、現在、それらによるがんの臨床試験が行われている。
本発明は、直接的なＩＬ－１２療法及び他のサイトカインを使用する療法の欠点に対処するよう設計されており、例えば、サイトカイン遮断部分、例えば、立体遮断ポリペプチド、血清中半減期延長ポリペプチド、標的指向性ポリペプチド、プロテアーゼ切断可能リンカー等の連結ポリペプチド、及びその組み合わせ等を使用する。サイトカインは、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１ ＩＬ－２３）、インターフェロン（ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ及びＩＦＮガンマ等のＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦアルファ、リンホトキシン）、トランスフォーミング増殖因子（例えば、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳ）を含め、患者に投与した場合に極めて強力である。本明細書で使用する場合、「ケモカイン」は、応答性細胞近傍へ向けられる走化性を誘導する能力のある小さなサイトカインのファミリーを意味する。サイトカインは、強力な治療法を提供できるが、臨床的に管理が困難な望ましくない作用を伴い、これによりサイトカインの臨床用途が制限されている。本開示は、望ましくない作用が低減または排除された、患者で使用することができる新しい形態のサイトカインに関する。特に、本開示は、キメラポリペプチド（融合タンパク質）が含まれる医薬組成物、融合タンパク質をコードする核酸、及び対応するサイトカインと比較してサイトカイン受容体活性化活性が低下しているサイトカインまたはサイトカインの活性断片もしくは変異タンパク質を含有する前述の医薬製剤に関する。ただし、選択された条件下または選択された生物学的環境では、キメラポリペプチドはそれらの同族受容体を活性化し、しばしば、対応する天然に存在するサイトカインと同じかまたはそれより高い効力を有する。本明細書に記載されるように、これは、典型的には、サイトカイン、その活性断片もしくは変異タンパク質の受容体活性化機能を遮断または阻害するサイトカイン遮断部分を、サイトカイン活性の所望の部位（例えば、炎症部位または腫瘍）に存在する条件等の選択された条件下ではなく一般的な条件下で使用して達成される。
キメラポリペプチド及びキメラポリペプチドをコードする核酸は、任意の適切な方法を使用して作製することができる。例えば、キメラポリペプチドをコードする核酸は、組換えＤＮＡ技術、合成化学、またはこれらの技術の組み合わせを使用して作製され得、そしてＣＨＯ細胞等の適切な発現系において発現され得る。キメラポリペプチドは同様に、例えば、合成または半合成の化学技術等を使用した、適切な核酸の発現によって作製することができる。いくつかの実施形態では、遮断部分は、ソルターゼ媒介性の結合を介してサイトカインポリペプチドに結合させることができる。「ソルターゼ」は、標的とするタンパク質もしくはペプチドに包埋されているかまたはその末端に結合しているカルボキシル末端の局在化シグナルを認識して切断することによってタンパク質を修飾するペプチド転移酵素である。ソルターゼＡは、標的タンパク質上のＴｈｒ残基とＧｌｙ残基の間のＬＰＸＴＧモチーフ（配列番号８０）（Ｘは、任意の標準アミノ酸）の切断を触媒し、Ｔｈｒ残基が酵素上の活性部位であるＣｙｓ残基に一過性に結合し、酵素－チオアシル中間体を形成する。ペプチド転移を完了させ、ペプチド－単量体複合体を作るために、Ｎ末端求核基、典型的にはオリゴグリシンモチーフを有する生体分子は中間体を攻撃し、ソルターゼＡを置換して２つの分子を連結する。
サイトカイン遮断部分融合タンパク質を形成するために、サイトカインポリペプチドは、最初に、Ｎ末端にてポリグリシン配列でタグ付けされるか、または別法として、Ｃ末端にてＬＰＸＴＧモチーフ（配列番号８０）でタグ付けされる。遮断部分または他の要素にはそれぞれにペプチドが結合され、タグ付きポリペプチド用のアクセプター部位として機能する。自身のＮ末端を介して結合しているＬＰＸＴＧ（配列番号８０）アクセプターペプチドを保持するドメインへの結合の場合、ポリペプチドは、Ｎ末端のポリグリシンストレッチでタグ付けされる。自身のＣ末端を介して結合しているポリグリシンペプチドを保持するドメインへの結合の場合、ポリペプチドは、そのＣ末端にてＬＰＸＴＧ（配列番号８０）ソルターゼ認識配列でタグ付けされる。ソルターゼは、ポリグリシン配列及びＬＰＸＴＧ（配列番号８０）配列を認識すると、ポリマーのペプチドとタグ付きポリペプチドとの間にペプチド結合を形成する。ソルターゼの反応は、グリシン残基を中間体として切り離し、これは室温で起こる。
様々な機構を利用して、遮断部分により生じる阻害を除去または低減することができる。例えば、医薬組成物には、ＩＬ－１２ポリペプチド、ならびに遮断部分、例えば、立体遮断部分等とともに、ＩＬ－１２ポリペプチドとサイトカイン遮断部分との間またはサイトカイン遮断部分内部に位置するプロテアーゼ切断部位を含むプロテアーゼ切断可能リンカーが含まれ得る。プロテアーゼ切断部位が切断されると、遮断部分はサイトカインから解離することができ、次いで、サイトカインが、サイトカイン受容体を活性化することができる。
任意の適切なリンカーを使用することができる。例えば、リンカーは、グリシン－グリシン、ソルターゼ認識モチーフ、またはソルターゼ認識モチーフとペプチド配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号８１）もしくは（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（配列番号８２）（ここで、ｎは、１、２、３、４または５）を含むことができる。典型的には、ソルターゼ認識モチーフは、ペプチド配列ＬＰＸＴＧ（配列番号８０）を含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、共有結合は、サイトカインポリペプチドのＣ末端に結合している反応性リジン残基と、遮断物質または他のドメインのＮ末端に結合している反応性アスパラギン酸との間にある。他の実施形態では、共有結合は、サイトカインポリペプチドのＮ末端に結合している反応性アスパラギン酸残基と、前記遮断物質または他のドメインのＣ末端に結合している反応性リジン残基との間にある。
したがって、本明細書に詳述されるように、使用したサイトカイン遮断部分（ＩＬ－１２遮断部分）は立体遮断物質であり得る。本明細書で使用する場合、「立体遮断物質」とは、サイトカインポリペプチドに、例えば、キメラポリペプチド（融合タンパク質）等の形態で、リンカー等の他の部分を介して共有結合で直接または間接的に結合させることができるが、それ以外の場合にはそのサイトカインポリペプチドには共有結合で結合しないポリペプチドまたはポリペプチド部分を指す。立体遮断物質は、サイトカインポリペプチドに非共有結合的に、例えば、静電結合、疎水結合、イオン結合または水素結合を介して結合することができる。立体遮断物質は、典型的には、それがサイトカイン部分に近接していること及び同等のサイズであることによりサイトカイン部分の活性を阻害するかまたは遮断する。サイトカイン部分の立体阻害は、立体遮断物質からサイトカイン部分を空間的に分離することによって、例えば、立体遮断物質とサイトカインポリペプチドとを含有する融合タンパク質を、立体遮断物質とサイトカインポリペプチドの間の部位で酵素により切断することによって取り除くことができる。
本明細書でさらに詳述されるように、遮断機能は、医薬組成物中の追加の機能的成分、例えば、標的指向性ドメイン、血清中半減期延長要素、及びプロテアーゼ切断可能連結ポリペプチド等との組み合わせであっても、またそれらが存在することによるものであってもよい。例えば、血清中半減期延長ポリペプチドは立体遮断物質でもあり得る。
様々な要素により、所望のＩＬ－１２活性の部位に優先的にＩＬ－１２の送達と活性を保証し、血清中半減期延長戦略に優先的に連結させた遮断及び／または標的指向戦略を介してインターロイキンへの全身曝露を厳しく制限する。この血清中半減期延長戦略では、遮断型のインターロイキンは、長時間（好ましくは１～２週間またはそれ以上）循環するが、活性化型はインターロイキンの典型的な血清中半減期を有する。
本発明のいくつかの実施形態では、半減期延長要素は、リンカーを介してインターロイキンに連結され、作用部位で切断（例えば、炎症特異的または腫瘍特異的なプロテアーゼによって）されて、所望の部位でインターロイキンの完全な活性を遊離し、また、それを非切断型半減期延長から分離させる。そのような実施形態では、完全に活性な遊離インターロイキンは、非常に異なる薬物動態（ｐＫ）特性を有し、半減期は数週間ではなく数時間である。さらに、活性サイトカインへの曝露は、所望のサイトカイン活性の部位（例えば、炎症部位または腫瘍）に限定され、活性サイトカインへの全身曝露、ならびに関連する毒性及び副作用が低減される。
以下に詳述される遮断部分はまた、１つ以上の受容体への結合または活性化を促進するためにも使用することができる。この遮断は、特定の環境における遮断部分の除去によって、例えば、１つ以上の遮断部分をサイトカインに連結するリンカーのタンパク質分解性切断によって軽減され得る。
別の態様では、他のサイトカインを、例えば、がん治療用等、特に免疫刺激薬としての使用について改善するために適用することができる。例えば、この態様では、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１ ＩＬ－２３、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ及びＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、リンホトキシン、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３ ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、及びＣＣＬ２１等の薬物動態及び／または薬力学は、エフェクター細胞（例えば、エフェクトＴ細胞、ＮＫ細胞）及び／または細胞傷害性免疫応答促進細胞を、腫瘍内等所望の活性の部位にて、好ましくは全身性ではなく、最大限に活性化させる（例えば、樹状細胞の成熟を誘導する）よう調整することができる。
したがって、本明細書では、少なくとも１つのサイトカインポリペプチド、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３）、インターフェロン（ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ及びＩＦＮガンマ等のＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦアルファ、リンホトキシン）、トランスフォーミング増殖因子（例えば、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３）、ケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳ）等、または前述のうちのいずれかの機能的断片もしくは変異タンパク質を含む、医薬組成物が提供される。ポリペプチドには、典型的には、少なくとも１つのリンカーアミノ酸配列も含まれ、アミノ酸配列は、特定の実施形態では、内在性プロテアーゼによる切断を受けることができる。一実施形態では、リンカーは、ＨＳＳＫＬＱ（配列番号２４）、ＧＰＬＧＶＲＧ（配列番号８３）、ＩＰＶＳＬＲＳＧ（配列番号８４）、ＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号８５）、またはＳＧＥＳＰＡＹＹＴＡ（配列番号８６）を含むアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、キメラポリペプチドはさらに、インターロイキンポリペプチドの活性を遮断することができる遮断部分、例えば、立体遮断ポリペプチド部分等を含有する。遮断部分は、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメインまたは任意選択で分岐もしくはマルチアーム型のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。別法として、医薬組成物は、第１のサイトカインポリペプチドまたはその断片、及び遮断部分、例えば、立体遮断ポリペプチド部分を含み、遮断部分は、サイトカイン受容体上でサイトカインポリペプチドの活性を遮断し、特定の実施形態では、遮断部分はプロテアーゼ切断可能ドメインを含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン活性の遮断及び低減は、非常に短いリンカーを用いてインターロイキンドメインのＮ末端またはＣ末端に追加ドメインを結合させることにより簡単に達成される。そのような実施形態では、遮断は、遮断部分、または遮断物質をインターロイキンに繋ぎ止める短いリンカーが、プロテアーゼにより消化されることにより軽減されることが予測される。一旦ドメインが切り取られるかまたは遊離されると、サイトカイン活性の遮断を達成することはできなくなる。
医薬組成物、例えば、キメラポリペプチドは、２つ以上のサイトカインを含むことができ、それらは、同一サイトカインポリペプチドでも異なるサイトカインポリペプチドでもあり得る。例えば、２つ以上の異なる種類のサイトカインは補完的機能を有する。いくつかの例では、第１のサイトカインはＩＬ－１２であり、第２のサイトカインはＩＬ－２である。いくつかの実施形態では、２つ以上の異なる種類のサイトカインポリペプチドの各々は、他のサイトカインポリペプチドの活性を調節する活性を有する。２つのサイトカインポリペプチドを含有するキメラポリペプチドのいくつかの例では、第１のサイトカインポリペプチドはＴ細胞活性化であり、第２のサイトカインポリペプチドは非Ｔ細胞活性化である。２つのサイトカインポリペプチドを含有するキメラポリペプチドのいくつかの例では、第１のサイトカインは化学誘引物質、例えば、ＣＸＣＬ１０であり、第２のサイトカインは免疫細胞活性化因子である。
好ましくは、本明細書に開示の融合タンパク質に含まれるＩＬ－１２ポリペプチド（機能的断片を含む）は、受容体結合の親和性及び特異性または血清中半減期等、天然に存在するサイトカインの特性を改変するよう変異または操作されない。ただし、天然に存在する（野生型を含む）サイトカインからのアミノ酸配列の変化は、例えば、クローニングを容易にするため、及び所望の発現レベルを達成するために許容される。
遮断部分
遮断部分は、サイトカインがその受容体と結合及び／または活性化する能力を阻害する任意の部分であり得る。遮断部分は、サイトカインがその受容体と結合及び／または活性化する能力を、立体的に遮断することによって、及び／またはサイトカインに共有結合で結合することによって阻害することができる。適切な遮断部分の例には、サイトカインの同族受容体の、完全長またはサイトカイン結合断片または変異タンパク質が含まれる。サイトカインと結合する、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体 一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ型ナノボディ（ＶＨＨ）の可変ドメイン等）、ｄＡｂ等のような、抗体及びその断片を使用することもできる。サイトカインと結合する他の適切な抗原結合ドメインを使用することもでき、これには、抗体の結合及び／または構造を模倣する非免疫グロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ならびにＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン及びＣＴＬＡ４といった足場等の他の操作された足場に基づく結合ドメイン等が含まれる。適切な遮断ポリペプチドのさらなる例には、サイトカインのその同族受容体への結合を立体的に阻害または遮断するポリペプチドが含まれる。有利なことに、そのような部分はまた、半減期延長要素としても機能する。例えば、ＰＥＧ等の水溶性ポリマーへの結合により修飾されているペプチドは、サイトカインのその受容体への結合を立体的に阻害または防止することができる。血清アルブミン（ヒト血清アルブミン）、免疫グロブリンＦｃ、トランスフェリン等、ならびにそのようなポリペプチドの断片及び変異タンパク質等、血清中半減期が長いポリペプチドまたはその断片を使用することもできる。例えば、ＨＳＡ、免疫グロブリンまたはトランスフェリン等の血清中半減期の長いタンパク質に結合するか、またはＦｃＲｎもしくはトランスフェリン受容体のような形質膜に再利用される受容体に結合する抗体及び抗原結合ドメインはまた、特にそれらの抗原に結合した場合に、サイトカインを阻害することができる。そのような抗原結合ポリペプチドの例には、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ型ナノボディ（ＶＨＨ）の可変ドメイン等）、ｄＡｂ等が含まれる。サイトカインと結合する他の適切な抗原結合ドメインを使用することもでき、これには、抗体の結合及び／または構造を模倣する非免疫グロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ならびにＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン及びＣＴＬＡ４といった足場等の他の操作された足場に基づく結合ドメイン等が含まれる。
例示的な例では、ＩＬ－１２がキメラポリペプチド内のサイトカインである場合、遮断部分は、ＩＬ－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒβ１）またはベータ（ＩＬ－１２Ｒβ２）の第１の分子の完全長または断片もしくは変異タンパク質、抗ＩＬ－２単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）もしくはｓｃＦｖ、抗ＩＬ－１２Ｒβ１抗体もしくはその断片、抗ＩＬ－１２Ｒβ２抗体もしくはその断片、及び抗ＨＳＡ ｄＡｂもしくはｓｃＦｖ等であり得る。
本発明のさらなる態様
１．非ＣＤＲループと切断可能なリンカーとを含む結合部分に、機能的に連結されているサイトカイン部分を含む融合タンパク質であって、前記結合部分は、前記サイトカインのその受容体への結合及び／または前記サイトカインによる前記受容体の活性化をマスキングすることができる、前記融合タンパク質。
２．前記結合部分は、天然ペプチド、合成ペプチド、操作された足場、または操作されたバルク血清タンパク質である、態様１に記載の融合タンパク質。
３．前記操作された足場は、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨＨ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、免疫グロブリン様足場、ＤＡＲＰｉｎ、シスチンノットペプチド、リポカリン、３ヘリックスバンドル足場、プロテインＧ関連アルブミン結合モジュール、またはＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマー足場を含む、態様１または２に記載の融合タンパク質。
４．前記結合部分は、バルク血清タンパク質に結合することができる、態様１～２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
５．前記非ＣＤＲループは、可変ドメイン、定常ドメイン、Ｃ１セットドメイン、Ｃ２セットドメイン、Ｉドメイン、またはその任意の組み合わせに由来する、態様１～３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
６．前記結合部分はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、態様１～４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
７．前記結合部分は、前記バルク血清タンパク質に結合することができる、態様５に記載の融合タンパク質。
８．前記バルク血清タンパク質は半減期延長タンパク質である、態様６に記載の融合タンパク質。
９．前記バルク血清タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、第ＸＩＩＩ因子、またはフィブリノゲンである、態様６または７に記載の融合タンパク質。
１０．前記ＣＤＲループは、前記バルク血清タンパク質または前記免疫グロブリン軽鎖、またはその任意の組み合わせに対して特異的な結合部位を提供する、態様５～８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
１１．前記切断可能なリンカーが切断部位を含む、態様１～９のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
１２．前記切断部位はプロテアーゼによって認識される、態様１０に記載の融合タンパク質。
１３．前記結合部分は前記サイトカインに結合されている、態様１１に記載の融合タンパク質。
１４．前記結合部分は、共有結合で前記サイトカインに連結されている、態様１１または１１に記載の融合タンパク質。
１５．前記結合部分は、前記結合部分と前記サイトカインの間の特異的な分子間相互作用を介して、前記サイトカインのその標的への結合をマスキングすることができる、態様１１、１１、または１４に記載の融合タンパク質。
１６．前記非ＣＤＲループは、前記部分の前記サイトカインへの結合に対して特異的な結合部位を提供する、態様１１～１４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
１７．前記切断可能なリンカーの切断時、前記結合部分は、前記サイトカインから分離され、前記サイトカインがその標的に結合する、態様１１～１５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
１８．前記サイトカインはサイトカイン受容体に結合する、態様１～１６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
１９．前記サイトカイン受容体は、Ｉ型サイトカイン受容体、Ｉ型ＩＬ受容体、ＩＩ型ＩＬ受容体、ケモカイン受容体、または腫瘍壊死受容体スーパーファミリー受容体を含む、態様１７に記載の融合タンパク質。
２０．前記切断可能なリンカーは切断部位を含む、態様１～１８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
２１．前記切断部位はプロテアーゼによって認識される、態様２０に記載の融合タンパク質。
２２．前記プロテアーゼ切断部位は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、ゼラチナーゼ、またはアスパラギンペプチドリアーゼによって認識される、態様２１に記載の融合タンパク質。
２３．前記プロテアーゼ切断部位は、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カリクレイン、ｈＫ１、ｈＫ１０、ｈＫ１５、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、ストロメライシン、第Ｘａ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ－３、Ｍｉｒ１－ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ－１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１２、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異標的（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン－１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰ－α）、ジペプチジルペプチダーゼ、またはジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）、ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）、好中球エラスターゼ、カテプシンＧ、プロテイナーゼ３、好中球セリンプロテアーゼ４、マスト細胞キマーゼ、マスト細胞トリプターゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）によって認識される、態様２１に記載の融合タンパク質。
２４．非ＣＤＲループ、サイトカイン、及び切断可能なリンカー（Ｌ）を含む結合部分（Ｍ）を含む、条件付きで活性な結合タンパク質であって、前記非ＣＤＲループは、前記サイトカインに結合することができ、前記結合部分は、前記サイトカインのその受容体への結合を阻害すること、及び／または前記サイトカインによる前記受容体の活性化を阻害することができる、前記条件付きで活性な結合タンパク質。
２５．前記結合部分は、半減期延長タンパク質に結合することができる、態様２４に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
２６．前記結合部分は、天然ペプチド、合成ペプチド、操作された足場、または操作された血清バルクタンパク質である、態様２４または２５に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
２７．前記操作された足場は、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨＨ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、免疫グロブリン様足場、ＤＡＲＰｉｎ、シスチンノットペプチド、リポカリン、３ヘリックスバンドル足場、プロテインＧ関連アルブミン結合モジュール、またはＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマー足場を含む、態様２６に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
２８．前記非ＣＤＲループは、可変ドメイン、定常ドメイン、Ｃ１セットドメイン、Ｃ２セットドメイン、Ｉドメイン、またはその任意の組み合わせに由来する、態様２４～２７のいずれか１つに記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
２９．前記結合部分はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、態様２４～２８のいずれか１つに記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
３０．前記結合部分は、バルク血清タンパク質に対して特異的な結合部位を含む、態様２４～２９のいずれか１つに記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
３１．前記バルク血清タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、第ＸＩＩＩ因子、またはフィブリノゲンである、態様３０に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
３２．前記ＣＤＲは、前記バルク血清タンパク質または免疫グロブリン軽鎖、またはその任意の組み合わせに対して特異的な結合部位を提供する、態様２９～３１のいずれか１つに記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
３３．前記結合部分は、前記結合部分と前記サイトカインの間の特異的な分子間相互作用を介して、前記サイトカインのその標的への結合をマスキングすることができる、態様２９～３２のいずれか１つに記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
３４．前記非ＣＤＲループは、前記結合部分の前記サイトカインへの結合に対して特異的な結合部位を提供する、態様２９～３３のいずれか１つに記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
３５．前記サイトカインはサイトカイン受容体に結合する、態様２４～３４のいずれか１つに記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
３６．前記サイトカイン受容体は、Ｉ型サイトカイン受容体、Ｉ型ＩＬ受容体、ＩＩ型ＩＬ受容体、ケモカイン受容体、または腫瘍壊死受容体スーパーファミリー受容体を含む、態様３５に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
３７．前記切断可能なリンカーは切断部位を含む、態様２４～３６に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
３８．前記切断部位はプロテアーゼによって認識される、態様３７に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
３９．前記プロテアーゼ切断部位は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、ゼラチナーゼ、またはアスパラギンペプチドリアーゼによって認識される、態様３８に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
４０．前記プロテアーゼ切断部位は、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カリクレイン、ｈＫ１、ｈＫ１０、ｈＫ１５、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、ストロメライシン、第Ｘａ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ－３、Ｍｉｒ１－ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ－１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１２、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異標的（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン－１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰ－α）、ジペプチジルペプチダーゼ、またはジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）、ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）、好中球エラスターゼ、カテプシンＧ、プロテイナーゼ３、好中球セリンプロテアーゼ４、マスト細胞キマーゼ、マスト細胞トリプターゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）によって認識される、態様３８に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
４１．前記結合部分に結合した半減期延長ドメインをさらに含み、ここで、前記半減期延長ドメインは、前記結合タンパク質に安全スイッチを提供し、前記リンカーの切断時、前記サイトカインからの前記結合部分と前記半減期延長ドメインの分離によって前記結合タンパク質が活性化され、それにより、前記結合タンパク質が前記安全スイッチから分離される、態様２４に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
４２．前記リンカーの前記切断は腫瘍微小環境におけるものである、態様４１に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
４３．結合部分内部の非ＣＤＲループを介してサイトカインに結合する前記結合部分を含む条件付きで活性な結合タンパク質であって、前記結合部分がさらに半減期延長ドメインに連結され、かつ切断可能なリンカーを含み、前記結合タンパク質は、前記リンカーの切断によるその活性化より前の半減期が延長されており、活性化時、前記結合部分及び前記半減期延長ドメインは前記サイトカインから分離され、前記結合タンパク質は、その活性化状態では、半減期が延長されていない、前記条件付きで活性な結合タンパク質。
４４．前記リンカーの前記切断は腫瘍微小環境におけるものである、態様４３に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
インビボ半減期延長要素
好ましくは、キメラポリペプチドは、インビボ半減期延長要素を含む。天然では半減期が短い治療用分子のインビボ半減期を増加させることにより、有効性を犠牲にすることなく、より許容できる管理可能な投与レジメンが可能になる。本明細書で使用する場合、「半減期延長要素」は、例えば、そのサイズ（例えば、腎臓ろ過カットオフ値を上回るよう）、形状、流体力学的半径、電荷を改変するか、または吸収、生体内分布、代謝、及び消失というパラメータを改変することによって、インビボ半減期を増加させ、ｐＫを改善するキメラポリペプチドの一部である。ポリペプチドのｐＫを改善する例示的方法は、内皮細胞上のＦｃＲｎ受容体及びトランスフェリン受容体等、リソソームで分解されるのではなく細胞の形質膜に再利用される受容体に結合するポリペプチド鎖の要素の発現によるものである。３種のタンパク質、例えば、ヒトＩｇＧ、ＨＳＡ（または断片）、及びトランスフェリン等は、ヒト血清中では、そのサイズだけから予測されるよりはるかに長く存続し、これは、リソソームで分解されるのではなく再利用される受容体に対するそれらの結合能の作用である。これらのタンパク質、またはＦｃＲｎ結合を保持するそれらの断片は、それらの血清中半減期を延長させるために他のポリペプチドに日常的に連結される。一実施形態では、半減期延長要素は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメインである。ＨＳＡ（配列番号１）はまた、医薬組成物に直接結合させても短いリンカーを介して結合させてもよい。ＨＳＡの断片を使用してもよい。ＨＳＡ及びその断片は、遮断部分としても半減期延長要素としても機能することができる。ヒトＩｇＧもまた同様の機能を実行することができる。
血清中半減期延長要素はまた、血清アルブミン、トランスフェリン等の血清中半減期の長いタンパク質に結合する抗原結合ポリペプチドでもあり得る。そのようなポリペプチドの例には、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体 一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ型ナノボディ（ＶＨＨ）の可変ドメイン等）、ｄＡｂ等のような、抗体及びその断片が含まれる。他の適切な抗原結合ドメインには、抗体の結合及び／または構造を模倣する非免疫グロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ならびにＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン及びＣＴＬＡ４といった足場等の他の操作された足場に基づく結合ドメイン等が含まれる。抗原結合ポリペプチドのさらなる例には、所望の受容体に対するリガンド、受容体のリガンド結合部分、レクチン、及び１つ以上の標的抗原に結合するかまたは会合するペプチドが含まれる。
いくつかの好ましい血清中半減期延長要素は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び任意選択で非ＣＤＲループを含むポリペプチドである。有利なことに、そのような血清中半減期延長要素は、サイトカインの血清中半減期を延長させることができ、また、サイトカイン阻害物質として（例えば、立体遮断、非共有結合の相互作用またはそれらの組み合わせを介して）、及び／または標的指向性ドメインとしても機能する。場合によっては、血清中半減期延長要素は、免疫グロブリン分子（Ｉｇ分子）に由来するドメインであるか、あるいは抗体の構造及び／または結合活性を模倣する、操作されたタンパク質足場である。Ｉｇは、任意のクラスまたはサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等）のものであってよい。Ｉｇ分子のポリペプチド鎖は、折り畳まれてループで連結された一連の平行なベータ鎖になる。可変領域では、ループのうちの３つが「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を構成し、分子の抗原結合特異性を決定する。ＩｇＧ分子は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖、またはその抗原結合性断片を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬで構成される。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分することができ、それらは、配列が超可変であり、及び／または抗原認識に関与し、及び／または通常構造的に定義されたループを形成し、より保存性の高いフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散在する。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へ向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４という順序で並んでいる。本開示のいくつかの実施形態では、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のアミノ酸配列の少なくとも一部またはすべては、本明細書に記載する結合部分の「非ＣＤＲループ」の一部である。図５に示すように、免疫グロブリン分子の可変ドメインは、２枚のシート状に並んだいくつかのベータ鎖を有する。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインは、３つの超可変ループ、または相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。Ｖドメインの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）がベータバレルの一端でクラスターを形成する。ＣＤＲは、免疫グロブリンフォールドのベータ鎖Ｂ－Ｃ、Ｃ’－Ｃ”、及びＦ－Ｇをつなぐループであるが、免疫グロブリンフォールドのベータ鎖ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”－Ｄ及びＥ－Ｆをつなぐ下部ループ、ならびに免疫グロブリンフォールドのＤ－Ｅ鎖をつなぐ上部ループは非ＣＤＲループである。本開示のいくつかの実施形態では、定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３の少なくともいくつかのアミノ酸残基は、本明細書に記載する結合部分の「非ＣＤＲループ」の一部である。非ＣＤＲループは、いくつかの実施形態では、ＩｇまたはＩｇ様分子のＣ１セットドメインのＡＢ、ＣＤ、ＥＦ、及びＤＥループ；ＩｇまたはＩｇ様分子のＣ２セットドメインのＡＢ、ＣＣ’、ＥＦ、ＦＧ、ＢＣ、及びＥＣ’ループ；ＩｇまたはＩｇ様分子のＩ（中間体）セットドメインのＤＥ、ＢＤ、ＧＦ、Ａ（Ａ１Ａ２）Ｂ、及びＥＦループのうち１つ以上を含む。
可変ドメイン内部では、ＣＤＲは抗原認識及び結合に関与すると考えられており、ＦＲ残基は、ＣＤＲの足場とみなされている。しかしながら、特定の場合には、ＦＲ残基のいくつかは抗原認識及び結合において重要な役割を果たす。Ａｇ結合に影響を与えるフレームワーク領域の残基は、２つのカテゴリーに分けられる。１つ目は、抗原と接触するＦＲ残基であり、そのため、それらは結合部位の一部であり、これらの残基のいくつかはＣＤＲに並んで近接する。他の残基は、ＣＤＲから離れて並んでいるが、分子の３－Ｄ構造においては近接しており、例えば、重鎖のループである。血清中半減期延長ドメイン（例えば、ＣＤＲを含むドメイン）は、少なくとも１つの非ＣＤＲループを含むことができる。いくつかの実施形態では、非ＣＤＲループは、サイトカイン、バルク血清タンパク質または他の標的抗原に結合するための結合部位を提供する。
血清中半減期延長要素は、ＣＤＲを含有することに加えて、または代替的に、非ＣＤＲループを含む。いくつかの実施形態では、非ＣＤＲループは、アルブミン等のバルク血清タンパク質等の所望の標的抗原に対して、またはサイトカイン部分もしくは他の標的とする抗原に対して特異的な抗原結合部位を生成するよう修飾される。非ＣＤＲループを修飾するために、様々な技術、例えば、部位特異的変異導入、ランダム変異誘発、非ＣＤＲループアミノ酸配列にとって外来性である少なくとも１つのアミノ酸の挿入、アミノ酸置換等を使用することができることが企図される。いくつかの例では、非ＣＤＲループに抗原ペプチドを挿入する。いくつかの例では、非ＣＤＲループを抗原ペプチドに置き換える。抗原結合部位を生成するための修飾は、場合によっては、１つの非ＣＤＲループにおいてのみである。他の場合には、２つ以上の非ＣＤＲループを修飾する。例えば、修飾は、図５に示される非ＣＤＲループ、すなわち、ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”Ｄ、ＥＦ、及びＤ－Ｅのいずれか１つにおいてである。場合によっては、修飾は、ＤＥループ内である。他の場合では、修飾は、ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”－Ｄ、Ｅ－Ｆの４つのループすべてにおいてである。
いくつかの例では、血清中半減期延長要素は二重結合特異性を有し、血清アルブミン等のバルク血清タンパク質と特異的に結合するＣＤＲ、及びサイトカインドメインと特異的に結合して遮断する非ＣＤＲループを含有する。他の例では、血清中半減期延長要素は、サイトカインドメインまたは他の標的抗原等の標的抗原と特異的に結合するＣＤＲ、及び血清アルブミン等のバルク血清タンパク質と特異的に結合する非ＣＤＲループを含有する。好ましくは、血清中半減期延長要素は、サイトカインドメインの同族のサイトカイン受容体への結合を、例えば、立体閉塞を介して、特異的分子間相互作用を介して、または両方の組み合わせで阻害する。
いくつかの実施形態では、血清中半減期延長要素は、非共有結合でサイトカインと直接結合し、その活性を阻害する。
特定の例では、結合部分は、ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”Ｄ、及びＥ－Ｆループのうちの１つ以上を介してサイトカインに結合し、ＢＣ、Ｃ’Ｃ”、及びＦＧループのうちの１つ以上を介してアルブミン等のバルク血清タンパク質に結合する。特定の例では、結合部分は、そのＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”Ｄ、またはＥＦループを介して、アルブミン等のバルク血清タンパク質に結合し、そのＢＣ、Ｃ’Ｃ”、またはＦＧループを介してサイトカインに結合する。特定の例では、結合部分は、そのＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”Ｄ、及びＥＦループを介してアルブミン等のバルク血清タンパク質に結合し、そのＢＣ、Ｃ’Ｃ”、及びＦＧループを介してサイトカインに結合されている。特定の例では、結合部分は、ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”Ｄ、及びＥ－Ｆループのうち１つ以上を介してアルブミン等のバルク血清タンパク質に結合し、ＢＣ、Ｃ’Ｃ”、及びＦＧループのうち１つ以上を介してサイトカインに結合する。
結合部分は、任意の種類のポリペプチドである。例えば、場合によっては、結合部分は、天然ペプチド、合成ペプチド、またはフィブロネクチン足場、または操作されたバルク血清タンパク質である。バルク血清タンパク質は、例えば、アルブミン、フィブリノゲン、またはグロブリンを含む。いくつかの実施形態では、結合部分は操作された足場である。操作された足場は、例えば、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨＨ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、免疫グロブリン様足場（Ｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ １２（７）：５６３－５７１で示唆されるように）、ＤＡＲＰｉｎ、シスチンノットペプチド、リポカリン、３ヘリックスバンドル足場、プロテインＧ関連アルブミン結合モジュール、またはＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマー足場を含む。
場合によっては、血清中半減期延長要素は、その非ＣＤＲループを介してサイトカインドメインに結合し、サイトカインドメインはさらに、本明細書に記載する標的指向性ドメインに接続される。場合によっては、血清中半減期延長要素は、バルク血清タンパク質に対する結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、バルク血清タンパク質に対する結合部位を提供する。バルク血清タンパク質は、いくつかの例では、グロブリン、アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＧ３、ＩｇＡモノマー、第ＸＩＩＩ因子、フィブリノゲン、ＩｇＥ、または五量体ＩｇＭである。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、免疫グロブリン軽鎖、例えば、Ｉｇκ遊離軽鎖またはＩｇλ遊離軽鎖等に対する結合部位を形成する。
例示的な条件付きで活性なタンパク質の１つを図６に示す。図示の例では、血清アルブミン結合ドメイン（例えば、ｄＡｂ）内の非ＣＤＲループはサイトカインＩＬ－１２に対する結合部位を形成することができる。この例では、血清アルブミンの結合部位は血清アルブミン結合ドメインのＣＤＲにより形成することができる。
血清中半減期延長要素は、任意の種類の結合ドメインであり得、これには、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、結合部分は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ由来ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）等である。他の実施形態では、結合部分は、非Ｉｇ結合ドメイン、すなわち、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、クニッツドメインペプチド、及びモノボディ等の抗体模倣物である。
他の実施形態では、血清中半減期延長要素は、水溶性ポリマー、またはＰＥＧ等の水溶性ポリマーに結合されているペプチドであり得る。本明細書で使用する場合、「ＰＥＧ」、「ポリエチレングリコール」及び「ポリ（エチレングリコール）」は同じ意味であり、任意の非ペプチド水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包含する。用語「ＰＥＧ」はまた、大部分、すなわち、５０％超に－ＯＣＨ２ＣＨ２－反復サブユニットが含有されるポリマーを意味する。特定の形態に関して、ＰＥＧは、任意の数の様々な分子量、ならびに構造または幾何学、例えば、「分岐」、「直鎖」、「フォーク型」、「多官能性」等をとることができ、詳細は以下に記載する。ＰＥＧは、特定の構造に限定されず、直鎖（例えば、封止末端、例えば、アルコキシＰＥＧまたは二官能性ＰＥＧ）、分岐またはマルチアーム型（例えば、フォーク型ＰＥＧまたはポリオールコアに結合しているＰＥＧ）、樹状（または星状）構造であり得、それぞれ、１つ以上の分解性結合がある場合とない場合がある。さらに、ＰＥＧの内部構造は、任意の数の異なる反復パターンで組織化することができ、また、ホモポリマー、交互コポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、及びブロックトリポリマーからなる群から選択され得る。ＰＥＧは、ポリペプチド及びペプチドに任意の適切な方法により結合させることができる。典型的には、Ｎ－ヒドロキシスクシンアミジル（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎａｍｉｄｙｌ）エステルＰＥＧ等の反応性ＰＥＧ誘導体を、システイン、リジン、アスパラギン、グルタミン、テオニン（ｔｈｅｏｎｉｎｅ）、チロシン、セリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸等の、アミン、スルフヒドリル、カルボン酸またはヒドロキシル官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸が含まれるペプチドまたはポリペプチドと反応させる。
標的指向性ドメイン及び保持ドメイン
特定の用途では、構成体がその所望される体内の部位に存在する時間を最大化することが望ましい場合がある。これは、キメラポリペプチド（融合タンパク質）にさらに１つのドメインを含めて、体内でのその移動に影響を与えることにより実現することができる。例えば、キメラ核酸は、ポリペプチドを体内の部位、例えば、腫瘍細胞もしくは炎症部位等に向けるドメイン（このドメインは「標的指向性ドメイン」と呼ばれる）をコードする、及び／またはポリペプチドを体内の部位、例えば、腫瘍細胞もしくは炎症部位等に保持するドメイン（このドメインは「保持ドメイン」と呼ばれる）をコードすることができる。いくつかの実施形態では、ドメインは、標的指向性ドメインとしても保持ドメインとしても機能することができる。いくつかの実施形態では、標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインは、プロテアーゼに富む環境に特異的である。いくつかの実施形態では、コードされた標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対して特異的であり、例えば、ＣＣＲ４受容体またはＣＤ３９受容体を標的とする。他の適切な標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインは、炎症組織で過剰発現される同族リガンド、例えば、ＩＬ－１受容体、またはＩＬ－６受容体の同族リガンドを有するものを含む。他の実施形態では、適切な標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインは、腫瘍組織で過剰発現される同族リガンド、例えば、Ｅｐｃａｍ、ＣＥＡまたはメソテリンの同族リガンドを有するものを含む。いくつかの実施形態では、標的指向性ドメインは、リンカーを介してインターロイキンに連結され、作用部位で切断（例えば、炎症またはがんに特異的なプロテアーゼによって）されて、所望の部位でインターロイキンの完全な活性を遊離する。いくつかの実施形態では、標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインは、リンカーを介してインターロイキンに連結され、作用部位で切断（例えば、炎症またはがんに特異的なプロテアーゼによって）されずに、サイトカインを所望の部位に留まらせる。
選択される抗原は、場合によっては、罹患した細胞または組織、例えば、腫瘍またはがん細胞の表面に発現されている。腫瘍への標的指向及び保持に有用な抗原としては、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰａ）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質２（Ｔｒｏｐ２）、フィブロネクチンＥＤＢ（ＥＤＢ－ＦＮ）、ＦＯＬＲ１、フィブロネクチンＥＩＩＩＢドメイン、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃ－Ｍｅｔ、ＦＯＬＲ１、及びＣＥＡが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示される医薬組成物には、罹患した細胞または組織上で発現されることが知られている２つの異なる標的抗原に結合する２つの標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインを含むタンパク質も含まれる。抗原結合ドメインの例示的な対としては、ＥＧＦＲ／ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ／ＣＥＡ、及びＨＥＲ－２／ＨＥＲ－３が挙げられるが、これらに限定されない。
適切な標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインには、抗原結合ドメイン、例えば、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体 一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ型ナノボディ（ＶＨＨ）の可変ドメイン等）、ｄＡｂ等の、抗体及びその断片が含まれる。他の適切な抗原結合ドメインには、抗体の結合及び／または構造を模倣する非免疫グロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ならびにＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン及びＣＴＬＡ４といった足場等の他の操作された足場に基づく結合ドメイン等が含まれる。抗原結合ポリペプチドのさらなる例には、所望の受容体に対するリガンド、受容体のリガンド結合部分、レクチン、及び１つ以上の標的抗原に結合するかまたは会合するペプチドが含まれる。
いくつかの実施形態では、標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインは細胞表面分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインは腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰａ）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質２（Ｔｒｏｐ２）、フィブロネクチンＥＤＢ（ＥＤＢ－ＦＮ）、ＦＯＬＲ１、フィブロネクチンＥＩＩＩＢドメイン、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、及びＦＯＬＲ１のうちの少なくとも１つから選択される腫瘍抗原に特異的かつ独立して結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、２つの異なる抗原に特異的かつ独立して結合し、抗原のうちの少なくとも１つは、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰａ）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質２（Ｔｒｏｐ２）、フィブロネクチンＥＤＢ（ＥＤＢ－ＦＮ）、ＦＯＬＲ１、フィブロネクチンＥＩＩＩＢドメイン、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、及びＦＯＬＲ１から選択される腫瘍抗原である。
標的及び／または保持の抗原は、腫瘍細胞で発現される腫瘍抗原であり得る。腫瘍抗原は、当該技術分野において周知であり、例えば、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰａ）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質２（Ｔｒｏｐ２）、フィブロネクチンＥＤＢ（ＥＤＢ－ＦＮ）、ＦＯＬＲ１、フィブロネクチンＥＩＩＩＢドメイン、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃ－Ｍｅｔ、ＦＯＬＲ１、ＰＳＭＡ、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、及びＣＥＡ、５Ｔ４、ＡＦＰ、Ｂ７－Ｈ３、カドヘリン－６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０５、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３５２、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＤＬＬ３、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＧＰＣ３、ｇｐＡ３３、ＦＬＴ－３、ｇｐＮＭＢ、ＨＰＶ－１６ Ｅ６、ＨＰＶ－１６ Ｅ７、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＳＬＣ３９Ａ６、ＭＡＧＥ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮａＰｉ２ｂ、Ｎｅｃｔｉｎ－４、Ｐ－カドヘリン、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＬＲ、ＰＳＣＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＬＴＲＫ５、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＩＭ１、Ｔｒｏｐ２、ＷＴ１が含まれる。
標的及び／または保持の抗原は、免疫チェックポイントタンパク質であり得る。免疫チェックポイントタンパク質の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ－１、ＯＸ４０、ＤＮＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ４８、ＣＤ７０、Ａ２ＡＲ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、またはＶＩＳＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。
標的及び／または保持の抗原は、タンパク質、脂質または多糖等の細胞表面分子であり得る。いくつかの実施形態では、標的及び／または保持の抗原は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷した赤血球、動脈プラーク細胞、炎症組織細胞または線維性組織細胞の上にある。標的及び／または保持の抗原は、免疫応答モジュレーターを含むことができる。免疫応答モジュレーターの例としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３、またはＧＩＴＲが挙げられるが、これらに限定されない。
標的及び／または保持の抗原は、サイトカイン受容体であり得る。サイトカイン受容体の例としては、Ｉ型サイトカイン受容体、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ受容体、Ｇ－ＣＳＦ受容体、Ｉ型ＩＬ受容体、Ｅｐｏ受容体、ＬＩＦ受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＴＰＯ受容体等；ＩＩ型サイトカイン受容体、例えば、ＩＦＮ－アルファ受容体（ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２）、ＩＦＢ－ベータ受容体、ＩＦＮ－ガンマ受容体（ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２）、ＩＩ型ＩＬ受容体等；ケモカイン受容体、例えば、ＣＣケモカイン受容体、ＣＸＣケモカイン受容体、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体、ＸＣケモカイン受容体等；腫瘍壊死受容体スーパーファミリー受容体、例えば、ＴＮＦＲＳＦ５／ＣＤ４０、ＴＮＦＲＳＦ８／ＣＤ３０、ＴＮＦＲＳＦ７／ＣＤ２７、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＴＮＦＲ１／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ／ＴＮＦＲ２／ＣＤ１２０ｂ等；ＴＧＦ－ベータ受容体、例えば、ＴＧＦ－ベータ受容体１、ＴＧＦ－ベータ受容体２等；Ｉｇスーパーファミリー受容体、例えば、ＩＬ－１受容体、ＣＳＦ－１Ｒ、ＰＤＧＦＲ（ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ）、ＳＣＦＲ等、が挙げられるが、これらに限定されない。
リンカー
上述のように、医薬組成物は、１つ以上のリンカー配列を含む。リンカー配列は、ポリペプチド間に柔軟性を提供して、例えば、遮断部分がサイトカインポリペプチドの活性を阻害することができるようにするのに役立つ。リンカー配列は、サイトカインポリペプチド、血清中半減期延長要素、及び／または遮断部分のうちのいずれかまたは全ての間に位置させることができる。本明細書に記載するように、リンカーのうちの少なくとも１つはプロテアーゼで切断可能であり、（１つ以上の）所望のプロテアーゼのための（１つ以上の）切断部位を含有する。好ましくは、所望のプロテアーゼは、サイトカイン活性の所望の部位（例えば、腫瘍微小環境）において豊富にされるかまたは選択的に発現される。したがって、融合タンパク質は、所望のサイトカイン活性の部位で優先的または選択的に切断される。
医薬組成物の成分の配向は主に設計の選択の問題であり、複数の配向が可能であること、また、いずれも本開示により包含されることが意図されることが認識される。例えば、遮断部分は、サイトカインポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に位置させることができる。
罹患した細胞または組織に関連することが知られているプロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、血清プロテアーゼ、カテプシン、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カリクレイン、ｈＫｌ、ｈＫ１０、ｈＫ１５、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、ストロメライシン、第Ｘａ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリ シン様プロテアーゼ、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ－３、Ｍｉｒｌ－ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ－１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１４、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン－１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰ－ａ）、ジペプチジルペプチダーゼ、メプリン、グランザイム及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で提供されるキメラ核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を切断することができるプロテアーゼは、例えば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、Ａディスインチグリン及びメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ）、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、腫瘍細胞表面プロテアーゼ、及びエラスターゼからなる群から選択され得る。ＭＭＰは、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）またはマトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ９）であり得る。
本明細書に開示する方法において有用なプロテアーゼを表１に示し、例示的プロテアーゼとそれらの切断部位を表１ａに示す。
表１．炎症及びがんに関連するプロテアーゼ
表１ａ：例示的プロテアーゼ及びプロテアーゼ認識配列

本明細書では、ポリペプチド配列を含む医薬組成物が提供される。すべてのペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質（それらの断片を含む）の場合と同様、キメラポリペプチド（アミノ酸配列変異型）のアミノ酸配列において、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の性質または機能を改変しない追加の修飾が起こり得ることが理解される。そのような修飾には、保存的アミノ酸置換が含まれ、以下でさらに詳細に考察される。
本明細書で提供する組成物は所望の機能を有する。組成物は、少なくともＩＬ－１２サイトカインポリペプチド、遮断部分、例えば、立体遮断ポリペプチド等、ならびに任意選択の血清中半減期延長要素、及び任意選択の標的指向性ポリペプチド、さらに組成物中の各ポリペプチドを接続する１つ以上のリンカーで構成される。第１のポリペプチド、例えば、ＩＬ－１２ポリペプチドは、活性物質として提供される。遮断部分は、インターロイキンの活性を遮断するために提供される。リンカーポリペプチド、例えば、プロテアーゼで切断可能なポリペプチドは、活性物質の意図される標的で特異的に発現されるプロテアーゼで切断されるよう提供される。任意選択で、遮断部分は、インターロイキンポリペプチドと結合することによって第１のポリペプチドの活性を遮断する。いくつかの実施形態では、遮断部分、例えば、立体遮断ペプチドは、プロテアーゼ切断可能リンカーを介してインターロイキンに連結され、作用部位で切断（例えば、炎症特異的プロテアーゼによって）されて、所望の部位でサイトカイン完全活性を遊離する。
プロテアーゼ切断部位は、天然に存在するプロテアーゼ切断部位であっても、または人工的に操作されたプロテアーゼ切断部位であってもよい。人工的に操作されたプロテアーゼ切断部位は、切断が起こる所望の環境、例えば、腫瘍等に特異的な２つ以上のプロテアーゼによって切断することができる。プロテアーゼ切断部位は、少なくとも１つのプロテアーゼ、少なくとも２つのプロテアーゼ、少なくとも３つのプロテアーゼ、または少なくとも４つプロテアーゼによって切断可能であり得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン－グリシン、ソルターゼ認識モチーフ、またはソルターゼ認識モチーフとペプチド配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号８１）もしくは（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（配列番号８２）（ここで、ｎは、１、２、３、４または５）を含む。一実施形態では、ソルターゼ認識モチーフは、ペプチド配列ＬＰＸＴＧ（配列番号８０）を含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。一実施形態では、共有結合は、サイトカインポリペプチドのＣ末端に結合している反応性リジン残基と、遮断部分または他の部分のＮ末端に結合している反応性アスパラギン酸との間にある。一実施形態では、共有結合は、サイトカインポリペプチドのＮ末端に結合している反応性アスパラギン酸残基と、遮断部分または他の部分のＣ末端に結合している反応性リジン残基との間にある。
切断及び誘導性
本明細書に記載されるように、融合タンパク質においてはサイトカインポリペプチドの活性は減弱されており、腫瘍微小環境内等、活性の所望の部位でのプロテアーゼによる切断により、融合タンパク質よりもサイトカイン受容体アゴニストとしてはるかに活性な融合タンパク質から、ある形態のサイトカインを遊離させる。例えば、融合ポリペプチドのサイトカイン受容体活性化（アゴニスト）活性は、別個の分子実体としてのサイトカインポリペプチドのサイトカイン受容体活性化活性よりも少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍小さくてよい。融合タンパク質の一部であるサイトカインポリペプチドが別個の分子実体として存在するのは、その分子実体が、サイトカインポリペプチドと実質的に同一なアミノ酸を含有し、追加のアミノ酸を実質的に含まず、他の分子と（共有結合または非共有結合によって）会合していない場合である。必要に応じて、別個の分子実体としてのサイトカインポリペプチドには、発現及び／または精製を助けるためのタグまたは短い配列等のいくつかの追加のアミノ酸配列が含まれてよい。
他の例では、融合ポリペプチドのサイトカイン受容体活性化（アゴニスト）活性は、融合タンパク質中のプロテアーゼ切断可能リンカーの切断により産生されるサイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体活性化活性よりも少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、または約１０００倍小さい。言い換えれば、融合タンパク質中のプロテアーゼ切断可能リンカーの切断により産生されるサイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体活性化（アゴニスト）活性は、融合タンパク質のサイトカイン受容体活性化活性よりも少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍大きい。
ポリペプチド置換
本明細書に記載するポリペプチドには、所望の機能が維持される限り、対応する天然に存在するタンパク質（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＨＳＡ）と同じアミノ酸配列を有する成分（例えば、サイトカイン、遮断部分）を含めること、または天然に存在するタンパク質とは異なるアミノ酸配列を有することができる。開示されるタンパク質及びそれらをコードする核酸の任意の既知の修飾及び誘導体または発生し得るものを定義する１つの方法は、特定の既知の参照配列に対する同一性の点で配列変異型を定義することによるものであることが理解される。具体的には、本明細書で提供されるキメラポリペプチドに対して少なくとも、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの同一性を有するポリペプチド及び核酸を開示する。例えば、本明細書に記載の核酸またはポリペプチドのうちのいずれかの配列に対して少なくとも、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの同一性を有するポリペプチドまたは核酸を提供する。当業者は、２つのポリペプチドまたは２つの核酸の同一性を決定する方法を容易に理解する。例えば、同一性は、同一性がその最高レベルになるように２つの配列を整列させた後に計算することができる。
同一性を計算する別の方法は、公開されているアルゴリズムによって実施することができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ ２：４８２（１９８１）の局所的同一性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の同一性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）、または検査によって、行われてもよい。
同じ種類の同一性を核酸について、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８－５２（１９８９）、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６－７７１０（１９８９）、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１－３０６（１９８９）に開示されるアルゴリズムによって得ることができ、それらは、少なくとも核酸アラインメントに関連する材料については参照により本明細書に組み込まれる。いずれの方法も、典型的には、使用することができること、また、場合によっては、これらの様々な方法の結果が異なる場合があることが理解されるが、当業者は、これらの方法のうちの少なくとも１つで同一性が見出された場合に、その配列が、記述の同一性を有し、かつ本明細書に開示されると言われることを理解する。
タンパク質の修飾には、アミノ酸配列の修飾が含まれる。アミノ酸配列での修飾は、アレル変異として（例えば、遺伝子多型による）自然に生じ得るか、環境の影響により（例えば、紫外光への曝露による）生じ得るか、または誘発された点変異体、欠失変異体、挿入変異体及び置換変異体等人の介入によって（例えば、クローン化ＤＮＡ配列の変異誘発による）作られ得る。これらの修飾により、アミノ酸配列の変化をもたらすこと、サイレント突然変異を提供すること、制限部位を修飾すること、または他の特定の変異を提供することができる。アミノ酸配列の修飾は、典型的には、置換修飾、挿入修飾または欠失修飾という３つの種類のうちの１つ以上に該当する。挿入には、アミノ末端及び／またはカルボキシル末端での融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。挿入は、通常、アミノ末端またはカルボキシル末端での融合の挿入よりも小さい、例えば、約１～４個の残基の挿入である。欠失は、タンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基除去を特徴とする。典型的には、タンパク質分子内の任意の一部位で約２～６個以下の残基を欠失させる。アミノ酸置換は、典型的には、単一の残基の置換であるが、一度にいくつかの異なる位置で発生させることができ、挿入は、通常、約１～１０個のアミノ酸残基上であり、欠失は、約１～３０個の残基の範囲である。欠失または挿入は、好ましくは、隣接する対で、すなわち、２個の残基の欠失または２個の残基の挿入で行われる。置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組み合わせを組み合わせて、最終構成体に到達してよい。変異は、読み枠の外に配列を配置してはならず、好ましくは、二次的ｍＲＮＡ構造を生成し得る相補領域を生じさせることがない。置換修飾は、少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている修飾である。そのような置換は一般に以下の表２に従って行われ、保存的置換と呼ばれる。
表２．例示的アミノ酸置換
特定のアミノ酸置換を含め、修飾は、既知の方法によって行われる。例えば、修飾は、ポリペプチドをコードするＤＮＡのヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって行われ、それにより、修飾をコードするＤＮＡが生成され、その後、組換え細胞培養においてＤＮＡを発現させる。既知配列を有するＤＮＡの所定の部位における置換変異を行う技術は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異がある。
修飾を選択して結合を最適化することができる。例えば、親和性成熟技術は、相補性決定領域（ＣＤＲ）内にランダム変異を導入することによってｓｃＦｖの結合を改変するために使用することができる。そのようなランダム変異は、放射線、化学的変異原、エラープローンＰＣＲ等、様々な技術を使用して導入することができる。複数ラウンドの変異及び選択を、例えば、ファージディスプレイ等を使用して実行することができる。
本開示はまた、本明細書に記載のキメラポリペプチドをコードする核酸、ならびにそのような核酸の、キメラポリペプチドを製造するため、及び治療目的のための、使用に関する。例えば、本発明には、キメラポリペプチドをコードするＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ）、ならびにそのようなＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の治療的使用が含まれる。
例示的組成物
本発明の例示的な融合タンパク質は、上記の要素を様々な指向で組み合わせる。この項で記載する指向は例としての指向を意味するものであり、限定的なものとみなされるべきではない。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＩＬ－１２ポリペプチド、遮断部分及び半減期延長要素を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチドを、半減期延長要素と遮断部分の間に位置させる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチドは、遮断部分及び半減期延長要素に対するＮ末端である。そのようないくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチドは遮断部分の近位にあり、そのようないくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチドは半減期延長要素の近位にある。ＩＬ－１２ポリペプチドが切断時に活性であり得るように、少なくとも１つのプロテアーゼ切断可能リンカーがすべての実施形態に含まれていなければならない。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチドは、遮断部分及び半減期延長要素に対するＣ末端である。追加要素は、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカーによって、または直接融合によって互いに結合させてよい。
いくつかの実施形態では、使用される遮断ドメインは半減期を延長させることができ、そのような２つの遮断ドメイン間にＩＬ－１２ポリペプチドを位置させる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチドを、２つの遮断ドメイン間に位置させ、そのうちの一方は、半減期を延長させることができる。
いくつかの実施形態では、２つのサイトカインは同じ構成体に含まれる。いくつかの実施形態では、サイトカインにはそれぞれ２つの遮断ドメインが接続され（１分子内に合計３つ）、２つのサイトカインドメイン間に１つの遮断ドメインがある。いくつかの実施形態では、薬物動態学的特性を最適化するために１つ以上の追加の半減期延長ドメインを含めてよい。
いくつかの実施形態では、３つのサイトカインは同じ構成体に含まれる。いくつかの実施形態では、第３のサイトカインは、２つのサイトカイン間の遮断ドメインの代わりに他の２つのサイトカインを遮断するように機能し得る。
融合タンパク質で使用するための好ましい半減期延長要素は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、血清アルブミンと結合する抗体または抗体断片（例えば、ｓｃＦＶ、ｄＡｂ）、ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ、または前述のうちのいずれかの断片である。いくつかの好ましい実施形態では、遮断部分は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、または血清アルブミンに結合する抗体もしくは抗体断片、サイトカインと結合してサイトカイン受容体の結合の活性化もしくは活性化を防止する抗体、別のサイトカイン、または前述のうちのいずれかの断片である。追加の標的指向性ドメインを含む好ましい実施形態では、標的指向性ドメインは、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、及びフィブロネクチン等、がん細胞の表面で豊富になっている細胞表面タンパク質と結合する抗体である。
治療方法及び医薬組成物
さらに、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫障害、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、もしくは移植片対宿主病等の疾患もしくは障害を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法を提供する。典型的には医薬組成物として投与される、本明細書に開示する融合タンパク質を有効量にて投与することを、それを必要とする対象に行う方法。いくつかの実施形態では、方法はさらに、そのような疾患または障害を有するかまたは発症するリスクがある対象を選択することを含む。医薬組成物は、好ましくは、炎症部位で活性化される、遮断されたＩＬ－１２ポリペプチド、その断片もしくは変異タンパク質を含む。一実施形態では、キメラポリペプチドは、ＩＬ－１２ポリペプチド、その断片または変異タンパク質及び血清中半減期延長要素を含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドは、ＩＬ－１２ポリペプチド、その断片または変異タンパク質及び遮断部分、例えば、立体遮断ポリペプチドを含み、かかる立体遮断ポリペプチドは、ＩＬ－１２ポリペプチド、その断片または変異タンパク質の活性を立体的に遮断することができる。別の実施形態では、キメラポリペプチドは、ＩＬ－１２ポリペプチド、その断片または変異タンパク質、遮断部分、及び血清中半減期延長要素を含む。
炎症は、病原体、損傷した細胞、刺激物質等の有害な刺激に対する体組織の複雑な生物学的応答の一部であり、免疫細胞、血管、分子メディエーターが関与する防御反応である。炎症の機能は、細胞傷害の最初の原因を排除し、元の傷害及び炎症過程により損傷を受けた壊死細胞及び壊死組織を取り除き、組織修復を開始することである。炎症は、感染により生じるか、症状として生じるか、または疾患、例えば、がん、アテローム性動脈硬化症、アレルギー、ミオパシー、ＨＩＶ、肥満、もしくは自己免疫疾患として生じ得る。自己免疫疾患は、自己抗原に対する異常な免疫応答から生じる慢性病態である。本明細書に開示するポリペプチドで治療され得る自己免疫疾患としては、狼瘡、セリアック病、１型真性糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、及び全身性エリテマトーデスが挙げられるが、これらに限定されない。
医薬組成物は、１つ以上のプロテアーゼ切断可能リンカー配列を含むことができる。リンカー配列は、それぞれのポリペプチドが第１のポリペプチドの活性を阻害することができるよう、ポリペプチド間に柔軟性を提供するのに役立つ。リンカー配列は、サイトカインポリペプチド、その断片または変異タンパク質、遮断部分、及び血清中半減期延長要素のうちのいずれかまたは全ての間に位置させることができる。任意選択で、組成物は、２つ、３つ、４つ、または５つのリンカー配列を含む。リンカー配列、２つ、３つ、または４つのリンカー配列は同一または異なるリンカー配列であり得る。一実施形態では、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳ（配列番号８７）、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号８８）、またはＧ（ＳＧＧＧ）２ＳＧＧＴ（配列番号８９）を含む。別の実施形態では、リンカーは、ＨＳＳＫＬＱ（配列番号２４）、ＧＰＬＧＶＲＧ（配列番号８３）、ＩＰＶＳＬＲＳＧ（配列番号８４）、ＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号８５）、及びＳＧＥＳＰＡＹＹＴＡ（配列番号８６）からなる群から選択されるプロテアーゼ切断可能配列を含む。
適切なリンカーは、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）～２０アミノ酸、２アミノ酸～１５アミノ酸、３アミノ酸～１２アミノ酸等の異なる長さであり得、これには、４アミノ酸～１０アミノ酸、アミノ酸～９アミノ酸、６アミノ酸～８アミノ酸、または７アミノ酸～８アミノ酸が含まれ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０のアミノ酸であってよい。
いくつかの実施形態では、リンカーは、カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カテプシンＧ、エラスターゼ、ＰＲ－３、グランザイムＭ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、トリプターゼ、または腫瘍細胞表面プロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼによって切断される。
さらに、がんを有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法を提供する。方法は、典型的には医薬組成物として投与される、本明細書に開示するキメラポリペプチド（融合タンパク質）を有効量にて投与することを、それを必要とする対象に行うことを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、がんを有するかまたは発症するリスクがある対象を選択することを含む。医薬組成物は、好ましくは、腫瘍部位で活性化される、遮断されたサイトカイン、その断片もしくは変異タンパク質を含む。好ましくは、腫瘍は固形腫瘍である。がんは、結腸癌、肺癌、黒色腫、肉腫、腎細胞腫、乳癌であり得る。
方法ではさらに、がんを治療する１つ以上の追加の薬剤、例えば、化学療法薬（例えば、アドリアマイシン、セルビジン、ブレオマイシン、アルケラン、ベルバン、オンコビン、フルオロウラシル、チオテパ、メトトレキサート、ビサントレン、ノアントロン（Ｎｏａｎｔｒｏｎｅ）、チグアニン（Ｔｈｉｇｕａｎｉｎｅ）、シタリビン（Ｃｙｔａｒｉｂｉｎｅ）、プロカラビジン（Ｐｒｏｃａｒａｂｉｚｉｎｅ））、腫瘍免疫療法薬（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ－１、抗ＣＤ４７、抗ＧＤ２）、細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ－Ｔ、Ｔ細胞療法）、腫瘍溶解性ウイルス等の投与を行うことを含む。
本明細書では、キメラポリペプチド及び薬理学的に許容される担体を含有する医薬製剤または組成物が提供される。本明細書で提供される組成物は、インビトロまたはインビボでの投与に好適である。薬理学的に許容される担体とは、生物学的または他の点で望ましくないということがない材料を意味し、すなわち、かかる材料は、望ましくない生物学的作用を引き起こすか、またはそれが含有されている医薬製剤もしくは組成物の他の成分と有害な様態で相互作用することなく、対象に投与される。担体は、有効成分の分解を最小限にするよう、また、対象における有害な副作用を最小限にするよう選択される。
適切な担体及びそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されている。典型的には、適切な量の薬理学的に許容される塩を製剤中に用いて製剤を等張性にするが、所望であれば、製剤は高張性または低張性であり得る。薬理学的に許容される担体の例としては、滅菌水、生理食塩水、リンゲル液のような緩衝液、及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは一般に、約５～約８または約７～７．５である。他の担体には、免疫原性ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクス等の徐放性調製物が含まれる。マトリクスは、例えば、フィルム、リポソーム、または微粒子等の成形物品の形態にある。特定の担体が、例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に応じて、より好ましい場合がある。担体は、ヒトまたは他の対象に対するキメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸配列の投与に適したものである。
医薬製剤または組成物は、局所または全身的な治療が所望されるか否かに応じて、及び治療される領域に応じて、いくつかの方法で投与される。組成物は、いくつかの投与経路のいずれかを介して投与され、これには、局所、経口、非経口、静脈内、関節内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮、肝内、頭蓋内、噴霧／吸入を含むか、または気管支鏡検査を介した設置によるものが含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は、腫瘍内、関節内、髄腔内等、局所的に（非全身的に）投与される。
非経口投与用調製物には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、及びエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油、例えば、オリブ油等、及び注入可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチル等である。水性担体には、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれ、生理食塩水及び緩衝媒体が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体及び栄養補充薬、電解質補充薬（リンゲルデキストロースに基づくもの等）等が含まれる。例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス等のような保存剤及び他の添加剤が任意選択で存在する。
局所投与用製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴薬、坐剤、スプレー剤、液剤及び粉末が含まれる。従来の医薬担体、水性基剤、粉末基剤もしくは油性基剤、粘稠剤等が任意選択で必要であるかまたは望ましい。
経口投与用組成物には、粉末もしくは顆粒、水もしくは非水性媒体に溶解させた懸濁液もしくは溶液、カプセル、小袋またはテーブルズが含まれる。粘稠剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が任意選択で望ましい。
任意選択で、キメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸配列は、ベクターによって投与される。インビトロまたはインビボで、例えば、発現ベクターを介して、核酸分子及び／またはポリペプチドを細胞に送達するために使用することができるいくつかの組成物及び方法がある。これらの方法及び組成物は、ウイルス系送達システム及び非ウイルス系送達システムの２つの種類に大別することができる。そのような方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書に記載する組成物及び方法とともに使用するために容易に適合可能である。そのような組成物及び方法は、インビトロまたはインビボで細胞をトランスフェクトまたは形質導入するため、例えば、コードされたキメラポリペプチドを発現し、好ましくは分泌する細胞株を製造するため、または核酸を対象に治療的に送達するために使用することができる。本明細書に開示するキメラ核酸の成分は、典型的には、融合タンパク質をコードするようインフレームで機能的に連結される。
本明細書で使用する場合、プラスミドまたはウイルスベクターは、開示の核酸を分解されない状態で細胞に輸送し、かつ、送達先の細胞に核酸分子及び／またはポリペプチドの発現をもたらすプロモーターを含む物質である。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンドビス、及び他のＲＮＡウイルス等であり、これらのウイルスでＨＩＶ骨格を有するものが含まれる。また、これらのウイルスの特性を共有し、ベクターとしての使用に適した任意のウイルスファミリーも好ましい。レトロウイルスベクターは、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９７）により概説されており、ベクター及びその製造方法について参照により本明細書に組み込まれる。複製欠損アデノウイルスの構築が記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１２１３－２０（１９８７）、Ｍａｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２－８３（１９８６）、Ｈａｊ－Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７－７４（１９８６）、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１２２６－３９（１９８７）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：８６８－７２（１９９３））。これらのウイルスのベクターとしての利点と使用は、それらが最初の感染細胞内で複製できるが、新しい感染性ウイルス粒子を形成することができないため、他の細胞型に伝播することができる範囲が制限されることである。組換え型アデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質、及び他の多くの組織部位への直接のインビボ送達後に高効率を達成することが示されている。他の有用な系には、例えば、複製ワクシニアウイルスベクター及び宿主限定非複製ワクシニアウイルスベクターが含まれる。
提供されるポリペプチド及び／または核酸分子は、ウイルス様粒子を介して送達することができる。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ウイルスの構造タンパク質に由来するウイルスタンパク質（複数可）で構成されている。ウイルス様粒子を作製及び使用するための方法は、例えば、Ｇａｒｃｅａ ａｎｄ Ｇｉｓｓｍａｎｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：５１３－７（２００４）に記載されている。
提供されるポリペプチドは、サブウイルス密集体（ｓｕｂｖｉｒａｌ ｄｅｎｓｅ ｂｏｄｉｅｓ）（ＤＢ）によって送達することができる。ＤＢは、膜融合によってタンパク質を標的細胞に輸送する。ＤＢを作製及び使用するための方法は、例えば、Ｐｅｐｐｅｒｌ－Ｋｌｉｎｄｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２７８－８４（２００３）に記載されている。
提供されるポリペプチドは、外被凝集体によって送達することができる。外被凝集体を作製及び使用するための方法は、国際公開公報第ＷＯ２００６／１１０７２８号に記載されている。
非ウイルス系送達方法には、核酸分子及びポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを含めることができ、ここで、核酸は、発現制御配列に機能的に連結される。適切なベクター骨格には、例えば、プラスミド、人工染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣ、またはＰＡＣ等の当該技術分野で日常的に使用されるものが含まれる。多数のベクター及び発現系が、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｐａｌ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）等の企業から市販されている。ベクターは、典型的には、１つ以上の調節領域を含有する。調節領域には、限定することなく、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答配列、タンパク質認識部位、誘導性要素、タンパク質結合配列、５’及び３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、及びイントロンが含まれる。そのようなベクターはまた、ＣＨＯ細胞等の適切な宿主細胞での発現によってキメラポリペプチドを作製するために使用することもできる。
哺乳類宿主細胞においてベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々な供給源から得てよく、例えば、ポリオーマウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）等のウイルスのゲノムから得るか、または異種哺乳類プロモーター、例えば、β－アクチンプロモーターもしくはＥＦ１αプロモーターから得るか、またはハイブリッドもしくキメラプロモーター（例えば、β－アクチンプロモーターに融合させたＣＭＶプロモーター）から得てよい。もちろん、宿主細胞または関連種からのプロモーターもまた本明細書では有用である。
エンハンサーとは、一般に、機能する転写開始部位からの距離が一定ではなく、転写単位に対して５’でも３’でもあり得るＤＮＡ配列を指す。さらに、エンハンサーは、イントロン内部にあり得、またコード配列自体の内部にもあり得る。それらは、通常、長さが１０～３００塩基対（ｂｐ）であり、シスで機能する。エンハンサーは通常、近傍のプロモーターからの転写を増加させるよう機能する。エンハンサーには、転写の調節を媒介する応答配列を含有させることもできる。哺乳類の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、及びインスリン）から多くのエンハンサー配列が知られており、典型的には、一般的な発現には真核細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーである。
プロモーター及び／またはエンハンサーは誘導性であり得る（例えば、化学的または物理的に調節される）。化学的に調節されるプロモーター及び／またはエンハンサーは、例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、または金属の存在によって調節され得る。物理的に調節されるプロモーター及び／またはエンハンサーは、例えば、温度及び光等の環境要因によって調節され得る。任意選択で、プロモーター領域及び／またはエンハンサー領域は、構成的プロモーター及び／またはエンハンサーとして作用して、転写される転写単位の領域の発現を最大化することができる。特定のベクターでは、プロモーター領域及び／またはエンハンサー領域は、細胞型特異的な様態で活性であり得る。任意選択で、特定のベクターでは、プロモーター領域及び／またはエンハンサー領域は、細胞型に関係なく、すべての真核細胞において活性であり得る。この種の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、及びレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）である。
ベクターにはまた、例えば、複製起点及び／またはマーカーも含めることができる。マーカー遺伝子は、細胞に対し、選択可能な表現型、例えば抗生物質耐性等を付与することができる。マーカー産物は、ベクターが細胞に送達されたかどうか、送達された後は、それが発現されているかどうかを決定するために使用される。哺乳類細胞の選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、及びブラストサイジンである。そのような選択マーカーが哺乳動物宿主細胞に首尾よく移されると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合に生き残ることができる。他のマーカーの例には、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及びルシフェラーゼが含まれる。さらに、発現ベクターには、発現されたポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を容易にするよう設計されたタグ配列が含まれ得る。タグ配列、例えば、ＧＦＰ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ－ｍｙｃ、ヘマグルチニン、またはＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ；Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ．）等の配列は、典型的には、コードされたポリペプチドとの融合体として発現される。そのようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかを含め、ポリペプチド内のどこにでも挿入することができる。
本明細書で使用する場合、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質という用語は、ペプチド結合によって連結される２つ以上のアミノ酸を意味するために広く使用される。タンパク質、ペプチド、及びポリペプチドはまた、本明細書ではアミノ酸配列を指すために同じ意味で使用される。本明細書では、分子を構成するアミノ酸の特定のサイズまたは数を示唆するためにはポリペプチドという用語は使用されないこと、本発明のペプチドは最大で数個からそれ以上のアミノ酸残基を含有することができることを認識されるべきである。全体を通して使用する場合、対象は脊椎動物であり得、より具体的には、哺乳類（例えば、ヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラット、及びモルモット）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び他の任意の動物であり得る。かかる用語は特定の年齢または性別を意味しない。したがって、雌雄を問わず、成体及び新生の対象が包含されることが意図される。本明細書で使用する場合、患者または対象は、同じ意味で使用されてよく、疾患または障害（例えば、がん）を有する対象を指し得る。患者または対象という用語には、ヒト対象及び獣医学の対象が含まれる。
疾患もしくは障害を発症するリスクのある対象は、その疾患もしくは障害への遺伝的素因があり得、例えば、家族病歴を有するか、またはその疾患もしくは障害を引き起こす遺伝子変異があるか、またはその疾患もしくは障害の早期兆候もしくは症状を示す。現在疾患または障害を有する対象は、その疾患または障害の１つまたは２つ以上の症状を有しており、その疾患または障害と診断されている場合がある。
本明細書に記載する方法及び薬剤は、予防的処置及び治療的処置の両方に有用である。予防的使用の場合、治療的有効量の、本明細書に記載するキメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードするキメラ核酸配列を、発症前（例えば、がんまたは炎症の明らかな徴候の前）または早期発症中（例えば、がんまたは炎症の初期の徴候及び症状時）に対象に投与する。予防的投与は、がんまたは炎症の症状の発現前に数日から数年間行うことができる。予防的投与は、例えば、がんに対する遺伝的素因があると診断された対象の予防的治療において使用することができる。治療的治療では、がんまたは炎症（例えば、自己免疫疾患）の診断または発症後に、治療的有効量の、本明細書に記載のキメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸配列を対象に投与することが行われる。予防的使用はまた、患者が、炎症が予測される治療、例えば、化学療法等を受けている場合にも適用され得る。
本明細書に教示される方法に従って、対象は、有効量の薬剤（例えば、キメラポリペプチド）を投与される。有効量及び有効投与量という用語は、同じ意味で使用される。有効量という用語は、所望の生理学的応答を生じさせるために必要な任意の量として定義される。薬剤を投与するための有効量及びスケジュールは、経験的に決定されてよく、そのような決定を行うことは、当業者の技量の範囲内である。投与のための投与量範囲は、疾患または障害の１つ以上の症状が影響を受ける（例えば、低減または遅延する）、所望の効果をもたらすために十分に多いものである。投与量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応等のような実質的な有害副作用を引き起こすほど大量であってはならない。一般的、投与量は、年齢、状態、性別、疾患の種類、疾患もしくは障害の程度、投与経路、または他の薬物がレジメンに含まれるか否かにより変動し、当業者により決定され得る。投与量は、禁忌があった場合には、個々の医師が調整することができる。投与量は変動し得るとともに、１回分以上の用量を連日、１日または数日間投与され得る。所与のクラスの医薬品に適切な投与量について、手引を文献に見出することができる。
本明細書で使用する場合、治療、治療する、または治療することという用語は、疾患もしくは状態の影響またはその疾患もしくは状態の症状を低減させる方法を指す。したがって、開示の方法では、治療とは、確立された疾患もしくは状態またはその疾患もしくは状態の症状の重症度における、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の低減を指し得る。例えば、疾患を治療するための方法は、対象の疾患の１つ以上の症状において、対照と比較して１０％の低減がある場合、治療とみなされる。したがって、低減は、天然または対照でのレベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％～１００％の間の任意の低減率であり得る。治療は必ずしも疾患、状態、またはその疾患もしくは状態の症状の治癒または完全な除去を指すものではないと理解される。
本明細書で使用する場合、疾患または障害を予防する、予防すること、及び予防という用語とは、行為、例えば、対象がその疾患または障害の１つ以上の症状を示し始める前、またはそれとほぼ同時に行われる、キメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸配列の投与等の行為であって、その疾患もしくは障害の１つ以上の症状の発症または増悪を阻害するかまたは遅らせる行為を指す。本明細書で使用する際、減少、低減、または阻害に関する言及は、対照レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の変化を含む。このような用語は、完全な排除を含み得るが、必ずしもそれを含むとは限らない。
開示される方法及び組成物に、使用され得るか、それらと併用され得るか、それらの調製において使用され得るか、またはそれらの産物である、材料、組成物、及び成分が開示される。これら及び他の材料は、本明細書において開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示される場合、これらの化合物の様々な個々及び集約的組み合わせ及び順列のそれぞれに関する具体的な言及が明確に開示されない場合があるが、それぞれが具体的に企図され、本明細書に記載されることが理解される。例えば、ある方法が開示及び考察され、その方法を含む、いくつかの分子に対して行われ得るいくつかの修飾が考察される場合、その方法のあらゆる組み合わせ及び順列、ならびに可能な修飾は、明らかに他の意味が明示されない限り、具体的に企図される。同様に、これらの任意の部分集合または組み合わせもまた、具体的に企図され開示される。この概念は、本開示の全態様に適用され、これには、開示される組成物を使用する方法でのステップが含まれるが、これに限定されない。したがって、実施され得る多様な追加ステップある場合、これらの追加ステップの各々は、開示される方法の任意の具体的な方法のステップまたは方法のステップの組み合わせを用いて実施可能であること、及びそのような組み合わせまたは組み合わせの部分集合の各々が具体的に企図され、開示されるとみなされるべきであることが理解される。
本明細書で引用した刊行物及びそれらを引用した理由となる材料は、参照によりそれら全体が具体的に本明細書に組み込まれる。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。本明細書で提供される概要を踏まえ、他の様々な実施形態を実施してよいことが理解される。
実施例１：ＭＭＰ９プロテアーゼによる融合タンパク質のプロテアーゼ切断
当業者であれば、タンパク質切断アッセイを設定する方法に精通しているであろう。１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１００ｕｇのタンパク質を１ｕｇの活性ＭＭＰ９（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＳＡＥ００７８－５０またはＥｎｚｏカタログＢＭＬ－ＳＥ３６０）で切断し、室温で最大１６時間インキュベートした。消化されたタンパク質は、その後、機能解析で使用するか、または試験前に－８０℃で保存することができる。当該技術分野において周知の方法を使用してＳＤＳ ＰＡＧＥにより切断の程度をモニターした。図９に示すとおりである。
実施例２：ＨＥＫ Ｂｌｕｅアッセイ
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ１２細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培地中に２５０，０００細胞／ウェルの濃度にて懸濁播種し、組換え型ｈＩＬ１２、キメラＩＬ１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または活性化可能なｈＩＬ１２の希釈系列を用いて、３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間刺激した。非切断型及び切断型の活性化可能なｈＩＬ１２の活性を試験した。切断型誘導性ｈＩＬ１２を活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって生成した。ＩＬ１２活性を、比色に基づくアッセイである試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量により評価した。図７、８、１１および１３に示すとおりである。
実施例３：脾細胞Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイ
Ｔ－Ｂｌａｓｔを、ＰＨＡとの６日間インキュベーション及び組換え型ｈＩＬ１２との２４時間インキュベーションでマウス脾細胞から誘導した。その後、Ｔｂｌａｓｔを、２００，０００細胞／ウェルの濃度で、４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培地に懸濁播種し、組換え型ｈＩＬ１２またはキメラＩＬ１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）またはマウスＩＬ１２の希釈系列を用いて、３７℃、５％ＣＯ２にて７２時間刺激した。非切断型及び切断型のＩＬ１２の活性を試験した。切断型誘導性ｈＩＬ１２を活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって生成した。ＩＬ１２活性を、ｍＩＦＮγ ａｌｐｈａＬＩＳＡを使用したＩＦＮγ産生の下流定量によって評価した。
実施例４：プロテアーゼ活性化融合タンパク質のインビボ送達は腫瘍増殖の低下をもたらす
キメラポリペプチドを調べてインビボでの生物学的効果を有する可能性があるか否かを決定する。これらの実験では、腹腔内に注入された腫瘍細胞が迅速かつ優先的に、大網に見られる一連の組織化された免疫凝集体である乳斑に最初に結合して増殖する系を使用する（Ｇｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６９：１７３９－５２（２００６））。この系では、融合タンパク質を腹腔内に複数回送達することができること、また、解離した大網細胞を調べることによって腫瘍増殖を分析できることから、腫瘍増殖に対する融合タンパク質治療の効果を調べる好都合な方法が提供される。これらの実験では、インビトロでＭＭＰ２及びＭＭＰ９の両方を発現する、急速に増殖する腫瘍細胞株であるＣｏｌｏｎ３８細胞株が使用され得る。大網組織は通常、比較的少量のＭＭＰ２及びＭＭＰ９を発現するが、Ｃｏｌｏｎ３８腫瘍が大網に存在する場合はＭＭＰレベルが増加する。この腫瘍モデルを使用して、腫瘍増殖に影響を与えるＩＬ－２変異タンパク質融合タンパク質の能力を調べる。Ｃｏｌｏｎ３８細胞を腹腔内注射し、１日間結合及び増殖させた後、腹腔内により融合タンパク質で連日処置する。７日目、動物を屠殺し、フローサイトメトリー及びコロニー形成アッセイを使用して大綱を腫瘍増殖について調べる。
実施例５：ＣＤ２０を標的とする例示的な活性化可能なインターロイキンタンパク質の構築
活性化可能なインターロイキンドメインの生成
ヒトＩＬ－１２ｐ３５鎖標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２９４５９である。ヒトＩＬ－１２ｐ４０鎖標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２９４６０である。ＩＬ－１２ｐ３５及びＩＬ－１２ｐ４０を発現構成体にクローニングする。プロテアーゼ切断部位をＩＬ－１２ｐ３５ドメインとＩＬ－１２ｐ４０ドメインの間に誘導する。腫瘍内または腫瘍細胞上に存在するＣＤ２０ポリペプチドに結合することができるＩＬ－１２ポリペプチドを以下のとおり作製する。（１）ＩＦＮｇポリペプチド配列をコードする核酸配列と、（２）１つ以上のポリペプチドリンカーの核酸配列と、を含有するよう、核酸を生成する。活性化可能なインターロイキンプラスミド構成体は、任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓ、または他のアフィニティータグを有することができ、ＨＥＫ２９３または他の適切なヒトもしくは哺乳類の細胞株に電気穿孔し、精製する。検証アッセイには、プロテアーゼ存在下でＩＬ－１２刺激に対して応答性であるＴ細胞を使用するＴ細胞活性化アッセイが含まれる。
ｓｃＦｖ ＣＤ２０結合ドメインの生成
ＣＤ２０は、Ｂリンパ球に存在する細胞表面タンパク質の１つである。ＣＤ２０抗原は、Ｂ細胞の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％以上に見られるものを含め、正常及び悪性のプレＢリンパ球と成熟Ｂリンパ球に見られる。抗原は、造血幹細胞、活性化Ｂリンパ球（形質細胞）及び正常組織では見られない。そのため、主にマウス由来であるいくつかの抗体、すなわち、１Ｆ５、２Ｂ８／Ｃ２Ｂ８、２Ｈ７、及び１Ｈ４が記載されている。
したがって、ヒト抗ＣＤ２０抗体またはヒト化抗ＣＤ２０抗体を使用して、活性化可能なインターロイキンタンパク質のＣＤ２０結合ドメインのｓｃＦｖ配列を生成する。ヒトまたはヒト化のＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を取得し、構成体のコドンを、任意選択で、ホモサピエンスの細胞での発現用に最適化する。ｓｃＦｖにおけるＶＬドメインとＶＨドメインの出現順序を変更し（すなわち、ＶＬ－ＶＨ、またはＶＨ－ＶＬの配向）、サブユニット「Ｇ４Ｓ」（配列番号８７）または「Ｇ４Ｓ」（配列番号８７）の３つのコピー（Ｇ４Ｓ）３（配列番号９０）が可変ドメイン同士をつないで、ｓｃＦｖドメインを作製する。抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖプラスミド構成体は、任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓ、または他のアフィニティータグを有することができ、ＨＥＫ２９３または他の適切なヒトまたは哺乳類の細胞株に電気穿孔し、精製する。検証アッセイには、ＦＡＣＳによる結合分析、Ｐｒｏｔｅｏｎを使用する動態解析、及びＣＤ２０発現細胞の染色が含まれる。
活性化可能なインターロイキンタンパク質をコードするＤＮＡ発現構成体のクローニング
図１０に示すとおり、プロテアーゼ切断部位ドメインを有する活性化可能なインターロイキン構成体を使用して、活性化可能なインターロイキンタンパク質を、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖドメイン及び血清中半減期延長要素（例えば、ＨＳＡ結合ペプチドまたはＶＨドメイン）と組み合わせて構築する。ＣＨＯ細胞での活性化可能なインターロイキンタンパク質の発現用に、すべてのタンパク質ドメインのコード配列を哺乳類発現ベクター系にクローニングする。簡単に言えば、活性化可能なインターロイキンドメイン、血清中半減期延長要素、及びＣＤ２０結合ドメインをコードする遺伝子配列を、ペプチドリンカーＬ１及びＬ２とともに別々に合成し、サブクローニングする。次いで、得られる構成体を、ＣＤ２０結合ドメイン－Ｌ１－ＩＬ－１２ｐ３５－Ｌ２－プロテアーゼ切断ドメイン－Ｌ３－ＩＬ－１２ｐ４０－Ｌ４－抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ－Ｌ５－血清中半減期延長要素の順序で互いに連結して最終構成体を得る。すべての発現構成体は、タンパク質の分泌及び精製を促進するため、それぞれ、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端ヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）タグ（配列番号９１）のコード配列を含むように設計される。
安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞における活性化可能なインターロイキンタンパク質の発現
ＣＨＯ細胞発現系（Ｆｌｐ－Ｉｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＨＯ－Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）由来細胞（Ｋａｏ ａｎｄ Ｐｕｃｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９６８；６０（４）：１２７５－８１）を使用する。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが提供する標準細胞培養プロトコルに従って接着細胞を継代培養する。
懸濁液中での増殖に適応させるために、細胞を組織培養フラスコから剥離させ、無血清培地に入れる。懸濁液に適応した細胞を、１０％ＤＭＳＯを含む培地で凍結保存する。
分泌された活性化可能なインターロイキンタンパク質を安定して発現する組換え型ＣＨＯ細胞株は、懸濁液適応細胞のトランスフェクションによって生成される。抗生物質ハイグロマイシンＢによる選択時、生存細胞密度を週２回測定し、細胞を遠心分離にかけ、最大密度０．１×１０６生存細胞／ｍＬで新鮮な選択培地に再懸濁する。選択の２～３週間後、活性化可能なインターロイキンタンパク質を安定して発現する細胞プールを回収し、その時点で、細胞を振とうフラスコ内の標準培地に移す。タンパク質ゲル電気泳動またはフローサイトメトリーを実行して、組換え型分泌タンパク質の発現を確認する。安定した細胞プールをＤＭＳＯ含有培地中で凍結保存する。
活性化可能なインターロイキンタンパク質は、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株の１０日間流加培養で、細胞培養上清への分泌により産生される。１０日後、典型的には、培養生存率７５％超で細胞培養上清を回収する。産生培養物から試料を１日おきに採取し、細胞密度と生存率を評価する。回収日に、細胞培養上清を遠心分離によって除去し、以降の使用前に真空ろ過する。
細胞培養上清中のタンパク質発現量と産物の完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析する。
活性化可能なインターロイキンタンパク質の精製
活性化可能なインターロイキンタンパク質を、ＣＨＯ細胞培養上清から２段階の手順で精製する。第１のステップで、構築物をアフィニティークロマトグラフィーに供し、その後、第２のステップでＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００での分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供する。試料は緩衝液交換され、限外ろ過によって典型的濃度の１ｍｇ／ｍＬ超まで濃縮される。最終試料の純度と均一性（通常９０％超）を、還元条件下及び非還元条件下でのＳＤＳ ＰＡＧＥ、それに続く抗ＨＳＡまたは抗イディオタイプ抗体を使用するイムノブロッティング、ならびに分析ＳＥＣによってそれぞれ評価する。精製されたタンパク質を、使用時まで等量分割にて－８０℃で保存する。
実施例６：フローサイトメトリーによる抗原親和性の決定
先行実施例の活性化可能なインターロイキンタンパク質を、ヒトＣＤ２０＋細胞及びカニクイザルＣＤ２０＋細胞に対するそれらの結合親和性について試験する。
先行実施例の活性化可能なインターロイキンタンパク質の１００μＬの系列希釈及び少なくとも１つのプロテアーゼとともにＣＤ２０＋細胞をインキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、細胞を、同じ緩衝液中で０．１ｍＬの１０μｇ／ｍＬマウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体とともに氷上で４５分間インキュベートする。２回目の洗浄サイクルの後、前回と同じ条件下、細胞を０．１ｍＬの１５μｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とともにインキュベートする。対照として、細胞を、活性化可能なインターロイキンタンパク質を用いずに抗Ｈｉｓ ＩｇＧとともにインキュベートし、その後、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とともにインキュベートする。次に、細胞を再度洗浄し、死細胞を排除するために、２μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。１×１０４の生細胞の蛍光を、ＭＸＰソフトウェアを使用するＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００ ＭＰＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＩｎｃｙｔｅソフトウェアを使用するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定する。ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して細胞試料の平均蛍光強度を計算する。二次試薬及び三次試薬単独で染色した細胞の蛍光強度値を減算後、次に、その値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用バージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）の１部位結合（双曲線）を求める方程式を用いたＫＤ値の計算に使用する。
ＣＤ２０の結合性及び交差反応性をヒトＣＤ２０＋腫瘍細胞株で評価する。交差反応性のＫＤ比を、組換え型ヒト抗原または組換え型カニクイザル抗原を発現するＣＨＯ細胞株について決定されたＫＤ値を使用して計算する。
実施例７：細胞毒性アッセイ
先行実施例の活性化可能なインターロイキンタンパク質を、そのＣＤ２０＋標的細胞に対する免疫応答の媒介についてインビトロで評価する。
蛍光標識したＣＤ２０＋ＲＥＣ－１細胞（マントル細胞リンパ腫細胞株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３００４）を、先行実施例の活性化可能なインターロイキンタンパク質及び少なくとも１つのプロテアーゼの存在下で、ランダムドナーから単離されたＰＢＭＣまたはエフェクター細胞としてのＣＢ１５ Ｔ細胞（標準化Ｔ細胞株）とともにインキュベートする。加湿インキュベーター内で３７℃にて４時間インキュベートした後、標的細胞から上清への蛍光色素の放出を分光蛍光光度計で測定する。先行実施例の活性化可能なインターロイキンタンパク質を用いずにインキュベートされた標的細胞及びインキュベーション終了時にサポニン添加によって完全に溶解された標的細胞をそれぞれ、陰性対照及び陽性対照として使用する。
測定した残存する生きている標的細胞に基づいて、特定の細胞溶解のパーセンテージを次式に従って計算する：［１－（生きている標的（試料）の数／生きている標的（自然発生的））の数］×１００％。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して非線形回帰／４－パラメータロジスティックフィットによりシグモイド型用量反応曲線及びＥＣ５０値を計算する。所与の抗体濃度について得られた溶解値を使用して、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用した４パラメータロジスティックフィット分析によりシグモイド用量反応曲線を計算する。
実施例８：活性化可能なインターロイキンタンパク質の薬物動態
先行実施例の活性化可能なインターロイキンタンパク質を半減時間消失について動物試験で評価する。
活性化可能なインターロイキンタンパク質を、伏在静脈への０．５ｍｇ／ｋｇのボーラス注射としてカニクイザルに投与する。別のカニクイザル群は、サイズは同等であるが血清中半減期延長要素を欠くサイトカインの投与を受ける。第３及び第４の群はそれぞれ、血清中半減期延長要素を有するサイトカイン、及びＣＤ２０と血清中半減期延長要素とを有するサイトカインの投与を受け、いずれも活性化可能なインターロイキンタンパク質とサイズが同等である。各試験群は５匹のサルで構成される。示されている時点で血清試料を採取して段階希釈し、ＣＤ２０に対する結合ＥＬＩＳＡを使用してタンパク質の濃度を決定する。
被験物質血漿濃度を使用して薬物動態解析を実施する。各被験物質の群平均血漿データは、投与後時間に対してプロットされた場合、多指数プロファイルに従っている。データは、分布相及び消失相について、ボーラス投与量及び一次速度定数を用いて標準の２コンパートメントモデルにより適合される。静脈内投与のデータの最良適合を求める一般方程式は、ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔであり、式中、ｃ（ｔ）は、時間ｔにおける血漿濃度であり、Ａ及びＢはＹ軸上の切片であり、α及びβはそれぞれ、分布相及び消失相の見かけの一次速度定数である。α相はクリアランスの初期相であり、動物のすべての細胞外液へのタンパク質の分布を反映し、減衰曲線の第２またはβ相の部分は真の血漿クリアランスを表す。そのような方程式を適合させるための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ａ＝Ｄ／Ｖ（α－ｋ２１）／（α－β）、Ｂ＝Ｄ／Ｖ（β－ｋ２１）／（α－β）であり、α及びβ（α＞βの場合）は二次方程式ｒ２＋（ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０）ｒ＋ｋ２１ｋ１０＝０の根であり、Ｖ＝分布容積、ｋ１０＝消失速度、ｋ１２＝コンパートメント１からコンパートメント２への移動速度、ｋ２１＝コンパートメント２からコンパートメント１への移動速度、及びＤ＝投与した用量、という推定パラメータを使用する。
データ分析：濃度対時間プロファイルのグラフを、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（商標）Ｖ．３．０９ Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９８６－１９９７．Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｐａ．）を使用して作成する。測定感度未満（ＬＴＲ）として報告された値はＰＫ分析に含めず、グラフに表わさない。薬物動態パラメータを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｖ．３．１ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９８－１９９９．Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）を使用してコンパートメント分析によって決定する。薬物動態パラメータを、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ Ｗ Ａ ａｎｄ Ｋｅａｒｎｓ Ｇ Ｌ，１９９９，ＩＮ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に記載のように算出する。
先行実施例の活性化可能なインターロイキンタンパク質は、血清中半減期延長要素を欠くタンパク質と比較して、消失半減時間の増加等、改善された薬物動態パラメータを有すると予想される。
実施例９：異種移植腫瘍モデル
先行実施例の活性化可能なインターロイキンタンパク質を異種移植モデルで評価する。
雌の免疫欠損ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスに致死量以下で照射し（２Ｇｙ）、４×１０６のＲａｍｏｓ ＲＡ１細胞を右背側腹に皮下接種する。腫瘍が１００～２００ｍｍ３に達したら、動物を３つの処置群に割り付ける。群２及び群３（動物８匹ずつ）に１．５×１０７の活性化ヒトＴ細胞を腹腔内注射する。３日後、群３の動物は引き続き、５０μｇの先行実施例の活性化可能なインターロイキンタンパク質により合計９回の静脈内投与（１日１回×９日）で処置される。群１及び群２はビヒクルのみで処置する。体重及び腫瘍体積を３０日間測定する。
先行実施例の活性化可能なインターロイキンタンパク質で処置された動物は、それぞれのビヒクル処置対照群と比較して、腫瘍増殖において統計的に有意な遅延を有することが予想される。
本明細書において本発明の好ましい実施形態を示し、また記載してきたが、そのような実施形態が例として提供されているだけであることは当業者には明らかであろう。ここで、当業者は、本発明から逸脱することなく多数の変形、変更、及び代用を想定するであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替案が本発明の実施において採用され得ることを理解されるべきである。以下の特許請求の範囲により本発明の範囲が定義されること、ならびにこれらの特許請求の範囲に含まれる方法及び構造、ならびにそれらの均等物が、それにより包含されることが意図される。
実施例１０：ＭＣ３８実験
インビトロでＭＭＰ９を発現する、急速に増殖する結腸腺癌細胞株であるＭＣ３８細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べた。
実施例１０ａ：ＭＣ３８ ＩＦＮａ及びＩＬ－１２
薬剤及び処置：
手順：
潰瘍形成を低減する細胞を移植するためマウスにイソフルランによる麻酔をかけた。ＣＲ雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、側腹皮下への５×１０５のＭＣ３８腫瘍細胞含有０％マトリゲルにより準備した。細胞注入量は０．１ｍＬ／マウスであった。マウスは開始日に８～１２週齢であった。腫瘍が平均サイズ１００～１５０ｍｍ３に達した時点でペアマッチを実施し、処置を開始した。体重は、開始時、その後は週２回、終了まで測定された。キャリパーでの測定を週２回、終了まで行った。いかなる有害反応も直ちに報告された。３０％超の体重減少が１回観察された、または２５％超の体重減少が３回連続して測定された個々の動物は、安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超のいかなる群も投与を中止し、その群は安楽死させなかったが、回復させる。体重減少が２０％超である群内で、個々の体重減少のエンドポイントに達した個体は安楽死させた。体重減少に関連する群処置が元の体重の１０％以内の減少まで回復した場合、より低い用量またはより少ない頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置の体重回復％の例外は、個々の場合に応じて許可された。エンドポイントは腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々にモニターした。実験の終点は、腫瘍体積が１５００ｍｍ３または４５日目のいずれか早く達した方とした。応答個体はその後も追跡された。終点に達した際、動物を安楽死させる。
実施例１１：血清アルブミン結合ドメインである遮断部分を含有する、条件付きで活性な融合タンパク質
この実施例では、誘導性活性を有する、すなわち、典型的には遮断部分と活性部分の間のリンカーの切断時に活性部分からの遮断部分の分離によって、誘導されるまでは不活性である、融合タンパク質、好ましくはサイトカインの作製及び活性を記載する。融合タンパク質は、ＣＤＲループを介して血清アルブミンと結合する単一抗体可変ドメイン（ｄＡｂ）を含有し、１つ以上の非ＣＤＲループ（例えば、Ｃループ）を介して活性部分（ここでは抗ＣＤ３ ｓｃＦＶ）に結合する。血清アルブミン結合性遮断部分は、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して活性部分に機能的に連結され、活性部分は、プロテアーゼで切断可能ではないリンカーを介して標的指向性ドメイン（ここでは抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ｄＡｂまたは抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）ｄＡｂ）に機能的に連結される。これらの融合タンパク質は、プロテアーゼ切断可能リンカーの切断、それに続く抑制性アルブミン結合ドメインの遊離時に活性化される不活性タンパク質として投与することができる。融合タンパク質中の抗ＣＤ３ ｓｃＦＶは、本開示に記載の融合タンパク質において所望されるサイトカインの代替である。所望のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、インターフェロン）またはその機能的断片もしくは変異タンパク質、標的指向性ドメイン、及びサイトカインまたはその機能的断片もしくは変異タンパク質と結合及び阻害もするアルブミン結合ｄＡｂを含有する、同様の融合タンパク質は、本明細書に記載及び例示される方法を使用して調製することができる。所望のサイトカインまたはその機能的断片もしくは変異タンパク質と結合しその活性を阻害する抗血清アルブミンｄＡｂにより、サイトカインの立体的マスキング（結合している血清アルブミンに対するサイトカインの近接による）及びサイトカインの特異的マスキング（サイトカインへの非ＣＤＲループ（例えば、Ｃループ）を介した結合による）の両方が提供され得る。所望のサイトカインまたはその機能的断片もしくは変異タンパク質と結合しその活性を阻害する抗血清アルブミンｄＡｂは、適切な方法を使用して、例えば、抗血清アルブミン結合ｄＡｂの非ＣＤＲループ（例えば、Ｃループ）にアミノ酸配列多様性を導入し、所望のサイトカインへの結合についてスクリーニングすること等によって得ることができる。選択には、ファージディスプレイ等、任意の適切な方法を使用することができる。例えば、使用され得る例示的な抗血清アルブミンｄａｂは以下の配列を有しており、Ｃループ（太字下線部）内のアミノ酸配列を多様化（例えば、ランダム化）して、得られるｄＡｂを、ＣＤＲ相互作用を介した血清アルブミンへの結合、及び非ＣＤＲループ相互作用を介したサイトカインへの結合についてスクリーニングを行うことができる。所望される場合、既知のサイトカイン結合ペプチドのアミノ酸配列をＣループに導入することができる。
Ａ．ＰｒｏＴｒｉＴＡＣのプロテアーゼ活性化はインビトロでの活性の大幅な増強をもたらす
精製ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（プロドラッグ）、切断不可能ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ［プロドラッグ（切断不可能）］、及びプロテアーゼ活性化ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（活性薬物）を模倣する組換え型活性薬物断片を、ＥＬＩＳＡアッセイにおける組換え型ヒトＣＤ３への結合、フローサイトメトリーアッセイにおける精製したヒト初代Ｔ細胞への結合、及びＴ細胞依存性細胞傷害アッセイにおける機能的効力について試験した。
ＥＬＩＳＡでは、適応濃度の可溶性ＰｒｏＴｒｉＴＡＣタンパク質を、固定化した組換え型ヒトＣＤ３ｅ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに、１５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを添加したＰＢＳ中で室温にて１時間インキュベートした。ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してプレートを遮断し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＰＢＳを使用して洗浄し、非競合的抗ＣＤ３イディオタイプモノクローナル抗体１１Ｄ３を使用し、その後、ペルオキシダーゼ標識二次抗体及びＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して検出した。
フローサイトメトリーでは、示された濃度の可溶性ＰｒｏＴｒｉＴＡＣタンパク質を、２％ウシ胎児血清含有ＰＢＳと１５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンとの存在下、精製したヒト初代Ｔ細胞とともに４℃で１時間インキュベートした。プレートを２％ウシ胎児血清含有ＰＢＳで洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７標識非競合的抗ＣＤ３イディオタイプモノクローナル抗体１１Ｄ３を使用して検出し、ＦｌｏｗＪｏ １０（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用してデータを分析した。
Ｔ細胞依存性細胞傷害アッセイにおける機能的効力の場合、示された濃度の可溶性ＰｒｏＴｒｉＴＡＣタンパク質を、精製した休止ヒトＴ細胞（エフェクター細胞）及びＨＣＴ１１６がん細胞（標的細胞）とともにインキュベートし、その際、エフェクター：標的細胞の比を１０：１にして３７℃で４８時間インキュベートした。ＨＣＴ１１６標的細胞株はルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクトされており、ＯＮＥ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により特定のＴ細胞媒介性細胞殺滅を測定することができた。
Ｂ．ＰｒｏＴｒｉＴＡＣはげっ歯類腫瘍異種移植モデルにおいて強力なプロテアーゼ依存性の抗腫瘍活性を示す
免疫不全状態ＮＣＧマウスにおける、増殖したヒトＴ細胞と混合したＨＣＴ１１６皮下異種移植腫瘍において、ＰｒｏＴｒｉＴＡＣを、そのインビボでの抗腫瘍活性について評価した。具体的には、第０日目、マウス１匹につき、５×１０６のＨＣＴ１１６細胞を２．５×１０６の増殖したＴ細胞と混合した。ＰｒｏＴｒｉＴＡＣの投与を翌日から開始し、１日１回×１０のスケジュールで腹腔内注入により実施した。示されている時間において、腫瘍体積測定値をキャリパー測定を使用して求め、式Ｖ＝（長さ×幅×幅）／２を使用して計算した。
Ｃ．例示的ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ三重特異性分子の発現、精製及び安定性
タンパク質産生
誘導性融合タンパク質分子をコードする配列を、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に、リーダー配列の後、６×ヒスチジンタグの前にクローニングした（配列番号９１）。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ１４５２７）をＥｘｐｉ ２９３培地中０．２～８×１ｅ６細胞／ｍｌでＯｐｔｉｍｕｍ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆｌａｓｋｓ（Ｔｈｏｍｓｏｎ）内に浮遊状態で維持した。Ｅｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１４６３５）プロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３細胞に精製プラスミドＤＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション後４～６日間維持した。別の方法では、融合タンパク質分子をコードする配列を哺乳類発現ベクターｐＤＥＦ３８（ＣＭＣ ＩＣＯＳ）にクローニングしてＣＨＯ－ＤＧ４４ ｄｈｆｒ－細胞にトランスフェクトし、安定なプールを生成し、精製前に最大１２日間、産生培地で培養した。条件培地中の例示的融合タンパク質の量は、標準曲線用の対照融合タンパク質を使用して、プロテインＡチップ付きＯｃｔｅｔ ＲＥＤ ９６装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｐａｌｌ）を使用して定量した。いずれかの宿主細胞からの条件培地をろ過し、アフィニティークロマトグラフィー及び脱塩クロマトグラフィーによって部分的に精製した。続いて、融合タンパク質は、イオン交換によってポリッシュされ、画分プールと同時に添加物含有中性緩衝液中に製剤化される。最終純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及びＡｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ ＳＥＣ ２００ １．７ｕ ４．６×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用する分析ＳＥＣを使用して評価し、１２９０ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍで中性ｐＨの添加物を用いて水性／有機移動相に分割し、Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ ＣＤＳソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）でピークを積分した。ＣＨＯ宿主細胞から精製された融合タンパク質は以下に示すＳＤＳ－ＰＡＧＥに示す。
安定性評価
２つの製剤にして精製された融合タンパク質を滅菌チューブにさらに等量分割し、１回が－８０℃及び室温で１時間超で構成される凍結融解サイクルを５回、または３７℃で１週間のインキュベーションによってストレスを与えた。ストレスを受けた試料は、ＵＶ透過９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６３５）をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２及びＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）とともに使用したＵＶ分光測定法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ならびに分析ＳＥＣによって濃度及び濁度について評価し、ストレスを受けていない対照試料についての同じ分析と比較した。２９３宿主細胞から精製された単一の例示的ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ分子についての対照及びストレスを受けた試料の分析ＳＥＣによるクロマトグラムのオーバーレイを以下に示す。
結果は、ＰｒｏＴｒｉＴＡＣがＣＨＯ安定プールからの通常のＴｒｉＴＡＣと同等の収率で生成されたこと、また、タンパク質が、凍結融解の繰り返し後及び３７℃で１週間の後も安定であったことを示している。
Ｄ．３週間のカニクイザル薬物動態試験におけるインビボでのＰｒｏＴｒｉＴＡＣの機能的マスキング及び安定性の実証
ＰＳＭＡ指向性ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（配列番号７４）、切断不可能ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（配列番号７５）、マスキングなし／切断不可能ＴｒｉＴＡＣ（配列番号７８）、及び活性薬物を模倣するプロテアーゼ活性化ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（配列番号７６）の１回量をカニクイザルに０．１ｍｇ／ｋｇで静脈内注射により投与した。示されている時点で血漿試料を採取した。ＰｒｏＴｒｉＴＡＣの濃度を、ビオチン化組換え型ヒトＰＳＭＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたリガンド結合アッセイ、及びスルホタグ付き抗ＣＤ３イディオタイプ抗体クローニング１１Ｄ３をＭＳＤアッセイ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ， ＬＬＣ）で使用して決定した。薬物動態パラメータを、静脈内ボーラス投与経路と一致する非コンパートメント方法を使用したＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ薬物動態ソフトウェアを使用して推定した。
インビボでのプロドラッグ変換速度を計算するため、循環血中活性薬物の濃度を、以下の連立微分方程式［Ｐはプロドラッグの濃度であり、Ａは活性薬物の濃度であり、ｋａは循環血中プロドラッグ活性化の速度であり、ｋｃ，Ｐはプロドラッグのクリアランス速度であり、ｋｃ，Ａは活性薬物のクリアランス速度である］を解くことにより推定した。
プロドラッグ、活性薬物、及び切断不可能なプロドラッグ対照（ｋｃ，ＮＣＬＶ）のクリアランス速度をカニクイザルにおいて経験的に決定した。循環血中プロドラッグ活性化の速度を推定するため、切断可能なプロドラッグと切断不可能なプロドラッグの間のクリアランス速度の差は、循環血中の非特異的な活性化のみから生じると仮定した。したがって、循環血中でプロドラッグが変換されて活性薬物になる速度は、切断不可能なプロドラッグのクリアランス速度から切断可能なプロドラッグのクリアランス速度を減算することによって推定した。
循環血中プロドラッグの初期濃度を経験的に決定し、活性薬物の初期濃度をゼロと仮定した。
結果及び考察
この実施例１１の結果は、サイトカインまたはその機能的断片もしくは変異タンパク質あるいは抗ＣＤ３ ｓｃＦＶ等、所望の治療活性を有するポリペプチドを含有する融合タンパク質は、治療活性が、血清アルブミンと活性ポリペプチドの両方に結合するマスキングドメインによってマスキングされるよう調製することができることを示す。マスキングドメインは、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して活性ドメインに機能的に連結されている。結果は、この型の融合タンパク質が、腫瘍等、治療活性の所望の位置でのプロテアーゼ切断時に活性化される、不活性タンパク質として投与可能であることを示している。
実施例１１で使用される融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７１～７８として示す。
例としての融合タンパク質構成体を表３に詳細に示す。表３において、「Ｌ」は「リンカー」の略語であり、「ｃｌｅａｖ．ｌｉｎｋ．」は「切断可能なリンカー」の略語である。他の略語で「ｍＩＦＮｇ」はマウスインターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）を示し、「ｈＡｌｂｕｍｉｎ」はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を示し、「ｍＡｌｂｕｍｉｎ」はマウス血清アルブミンを示す。
表３：構成体順列表
配列表
参照による組み込み
本明細書で引用したすべての特許及び非特許刊行物の開示全体は、それぞれ、あらゆる目的のために参照することによりその全体が組み込まれる。
他の実施形態
上記の開示は、独立した有用性を有する複数の別個の発明を包含し得る。これらの発明の各々を、その好ましい形態（複数可）で開示してきたが、多数の変形が可能であるため、本明細書に開示及び例示されるその具体的な実施形態は限定的な意味で考慮されるべきではない。本開示の主題は、本明細書で開示される様々な要素、特徴、機能、及び／または特性の、すべての新規かつ非自明の組み合わせと組み合わせ構成要素が含まれる。以下の特許請求の範囲は、特に、新規かつ非自明であるとみなされる特定の組み合わせ及び組み合わせ構成要素を指摘する。特徴、機能、要素、及び／または特性の他の組み合わせ及び組み合わせ構成要素で具体化された発明は、本出願、本出願からの優先権を主張する出願、または関連出願において特許請求され得る。そのような特許請求の範囲もまた、異なる発明を対象とするのか、または同じ発明を対象とするのか、また、元の特許請求の範囲と比較して範囲が広いか、狭いか、等しいか、もしくは異なるかということにかかわらず、本開示の発明の主題に含まれるとみなされる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
式
［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｄ］または［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｂ］または［Ｂ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｄ］
［式中、
Ａは、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）ポリペプチドであり、
Ｂは、半減期延長要素であり、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立してポリペプチドリンカーであり、ここで、Ｌ１は、プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーであり、Ｌ２は、任意選択でプロテアーゼ切断可能であるポリペプチドリンカーであり、
Ｄは、ＩＬ－１２遮断部分である］の融合ポリペプチドであって、
前記融合ポリペプチドは減弱されたＩＬ－１２受容体アゴニストであるが、（ｉ）前記Ｌ１プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーの切断時、または（ｉｉ）前記Ｌ２がプロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーである場合はＬ１とＬ２の両方の切断時、生成される前記融合ポリペプチドの前記ＩＬ－１２ポリペプチド含有断片は、天然に存在するＩＬ－１２ポリペプチドと同等の効力及び半減期のＩＬ－１２受容体アゴニストである、前記融合ポリペプチド。
(項目２)
ａ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）ポリペプチド［Ａ］、
ｂ）ＩＬ－１２遮断部分［Ｄ］、及び
ｃ）プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカー［Ｌ］
のそれぞれのうちの少なくとも１つを含む融合ポリペプチドであって、
前記ＩＬ－１２ポリペプチドと前記ＩＬ－１２遮断部分とは、前記プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーによって機能的に連結され、前記融合ポリペプチドはＩＬ－１２受容体活性化活性が減弱されており、前記融合ポリペプチドの前記ＩＬ－１２受容体活性化活性は、前記プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーの切断により産生される前記ＩＬ－１２ポリペプチドを含有するポリペプチドのＩＬ－１２受容体活性化活性よりも少なくとも約１０倍低い、前記融合ポリペプチド。
(項目３)
［Ａ］は前記融合ポリペプチドのＮ末端である、項目２に記載の融合ポリペプチド。
(項目４)
［Ａ］は、式
［Ａ１］－［Ｌ３］－［Ａ２］または［Ａ２］－［Ｌ３］－［Ａ１］を有し、式中、
Ａ１は、ＩＬ－１２ｐ４０サブユニットポリペプチドであり、
Ａ２は、ＩＬ－１２ｐ３５サブユニットポリペプチドであり、
Ｌ３は、任意選択でプロテアーゼ切断が可能なポリペプチドリンカーである、項目１～３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目５)
［Ａ］は、式［Ａ１］－［Ｌ３］－［Ａ２］を有し、Ｌ３は、プロテアーゼ切断が可能ではない、項目４に記載の融合ポリペプチド。
(項目６)
前記切断型ポリペプチドの断片を含有する前記ＩＬ－１２ポリペプチドのアゴニスト活性が、前記非切断型融合ポリペプチドのアゴニスト活性と比較して少なくとも１０倍増大している、項目１～５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目７)
前記アゴニスト活性を、ＨＥＫ Ｂｌｕｅレポーター細胞アッセイを使用して評価する、項目６に記載の融合ポリペプチド。
(項目８)
各プロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーは、独立して、カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カテプシンＧ、カテプシンＬ、エラスターゼ、ＰＲ－３、グランザイムＭ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＡＤＡＭメタロプロテアーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、トリプターゼ、及び腫瘍細胞表面プロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼによる切断を受けることができる配列を含む、項目１～７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目９)
各プロテアーゼ切断可能ポリペプチドは、独立して、同じプロテアーゼのための２つ以上の切断部位、もしくは異なるプロテアーゼによって切断される２つ以上の切断部位を含むか、または前記プロテアーゼ切断可能ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、２つ以上の異なるプロテアーゼの切断部位を含む、項目８に記載の融合ポリペプチド。
(項目１０)
ＩＬ－１２遮断部分は、前記融合ポリペプチドによる前記ＩＬ－１２受容体の活性化を阻害する、項目１～９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目１１)
前記ＩＬ－１２遮断部分は前記ＩＬ－１２ポリペプチドに非共有結合で結合する、項目１～１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目１２)
前記ＩＬ－１２遮断部分は前記ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットポリペプチドと結合する、項目１～１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目１３)
前記ＩＬ－１２遮断部分は前記ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットポリペプチドと結合する、項目１～１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目１４)
前記ＩＬ－１２遮断部分はＩＬ－１２ ｐ７０と結合する、項目１～１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目１５)
前記ＩＬ－１２遮断部分は、前記ＩＬ－１２に対する同族受容体のリガンド結合ドメインもしくは断片、前記ＩＬ－１２ポリペプチドと結合する単一ドメイン抗体、ＦａｂもしくはｓｃＦｖ、または抗体もしくは抗体断片であって、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ、及び前記ＩＬ－１２の受容体と結合するｓｃＦｖから選択される前記抗体もしくは抗体断片、を含む、項目１～１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目１６)
前記ＩＬ－１２遮断部分は半減期延長要素でもある、項目１～１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目１７)
前記ＩＬ－１２遮断部分は、前記ＩＬ－１２のアゴニスト活性を立体的に遮断する、項目１～１０または１６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目１８)
前記ＩＬ－１２遮断部分は、ヒト血清アルブミンであるか、またはヒト血清アルブミンを動員する抗原結合ポリペプチドである、項目１７に記載の融合ポリペプチド。
(項目１９)
前記ＩＬ－１２は、前記プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーがプロテアーゼによって切断された後、前記ＩＬ－１２遮断部分から自由に解離する、項目１～１８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目２０)
前記融合ポリペプチドは前記ＩＬ－２受容体に結合する、項目１～１９のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
(項目２１)
少なくとも１つの半減期延長要素をさらに含む、項目１～２０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目２２)
前記半減期延長要素は、ヒト血清アルブミンであるか、またはヒト血清アルブミンと結合する抗原結合ポリペプチドである、項目２１に記載の融合ポリペプチド。
(項目２３)
前記半減期延長要素は免疫グロブリンＦｃである、項目２１に記載の融合ポリペプチド。
(項目２４)
前記非共有結合の会合はｐＨ依存性である、項目１１に記載の融合ポリペプチド。
(項目２５)
ＩＬ－１２受容体活性化は、標準的なインビトロ受容体活性化アッセイ、ならびにモルに基づく等量の前記ＩＬ－１２ポリペプチド及び融合ポリペプチドを使用して決定される、項目１～２４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目２６)
ＩＬ－１２は、前記プロテアーゼ切断可能配列がプロテアーゼによって切断された後、前記ＩＬ－１２遮断部分及び／または半減期延長要素から自由に解離する、項目１～２５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目２７)
半減期延長要素［Ｂ］をさらに含み、式
［Ｂ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２］－［Ｄ］
［式中、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立してポリペプチドリンカーであり、Ｌ１は、プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーであり、Ｌ２は、任意選択でプロテアーゼ切断が可能なポリペプチドリンカーである］を有する、項目２～２３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目２８)
Ｌ２はプロテアーゼ切断可能リンカーである、項目２７に記載の融合ポリペプチド。
(項目２９)
Ｌ１は、第１のプロテアーゼに対する基質であり、Ｌ２は、第２のプロテアーゼに対する基質である、項目１または３～２８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目３０)
腫瘍特異抗原結合ペプチドをさらに含む、項目１～２９のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
(項目３１)
前記腫瘍特異抗原結合ペプチドは、切断不可能なリンカーによって前記ＩＬ－１２ポリペプチドに連結される、項目３０に記載の融合ポリペプチド。
(項目３２)
前記腫瘍特異的抗原結合ペプチドは、切断可能なリンカーによって、前記ＩＬ－１２ポリペプチド、前記半減期延長要素または前記ＩＬ－１２遮断部分に連結される、項目３０に記載の融合ポリペプチド。
(項目３３)
ＩＬ－１２のドメイン間にリンカーをさらに含む、項目１～３２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目３４)
前記プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーのプロテアーゼ切断により産生される前記ＩＬ－１２ポリペプチド含有断片の血清中半減期は、天然に存在するＩＬ－１２の半減期と同等である、項目３～３２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目３５)
項目１～３４のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
(項目３６)
項目３５に記載の核酸を含むベクター。
(項目３７)
項目３６に記載のベクターを含む宿主細胞。
(項目３８)
項目３７に記載の宿主細胞を、所望のポリペプチドの発現及び採取に適切な条件下で培養することを含む、医薬組成物を製造する方法。
(項目３９)
ｉ）有効量の、項目１～３４のいずれかに記載の融合ポリペプチドと、ｉｉ）薬理学的に許容される添加物とを含む医薬組成物。
(項目４０)
腫瘍を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、項目１～３４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを投与することを含む、前記方法。
(項目４１)
医薬品として使用するための、項目１～３４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目４２)
腫瘍の治療における、それを必要とする対象での使用のための、項目１～３４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
(項目４３)
腫瘍を治療することを、それを必要とする対象において行うための医薬組成物であって、有効成分として、項目１～３４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを含む、前記医薬組成物。

Claims (28)

  1. 式
    ［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｂ］または［Ｂ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｄ］
    ［式中、
    ［Ａ］は、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）ポリペプチドであり、
    ［Ｂ］は、半減期延長要素であり、前記半減期延長要素が、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンに結合する抗原結合ポリペプチド、または免疫グロブリンＦｃであり、
    ［Ｌ１］は、プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーであり、［Ｌ２］は、任意選択でプロテアーゼ切断可能であるポリペプチドリンカーであり、Ｌ２がプロテアーゼ切断可能である場合、Ｌ２がプロテアーゼにより切断可能である少なくとも１つ配列を含み、［Ｄ］は、ＩＬ－１２遮断部分であり、前記遮断部分が、ＩＬ－１２に結合する抗体、ＩＬ－１２に結合する抗体の抗原結合断片、または、ＩＬ－１２に対する同族受容体のリガンド結合ドメインもしくは断片である］の融合ポリペプチドを含む条件付きで活性であるＩＬ－１２であって、
    前記融合ポリペプチドは、減弱されたＩＬ－１２受容体活性化活性を有し、
    前記融合ポリペプチドのＩＬ－１２受容体活性化活性は、前記ＩＬ－１２ポリペプチドを含むポリペプチドの前記ＩＬ－１２受容体活性化活性よりも少なくとも約１０倍低く、前記ＩＬ－１２ポリペプチドは、前記プロテアーゼ切断可能リンカーＬ１の切断により、または、［Ｌ２］がプロテアーゼ切断可能である場合に［Ｌ１］および［Ｌ２］の両方の切断により産生され、
    前記ＩＬ－１２受容体活性化活性は、ＨＥＫ Ｂｌｕｅレポーター細胞アッセイを使用してモルに基づく等量の前記ＩＬ－１２ポリペプチド及び前記融合ポリペプチドで評価される、前記条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  2. ａ）ＩＬ－１２ｐ３５およびＩＬ－１２ｐ４０から選択されるＩＬ－１２サブユニットポリペプチドを含むインターロイキン１２（ＩＬ－１２）ポリペプチド、
    ｂ）ＩＬ－１２遮断部分であって、ＩＬ－１２に結合する抗体もしくは抗体の抗原結合断片、または、ＩＬ－１２に対する同族受容体のリガンド結合ドメインもしくは断片を含む、ＩＬ－１２遮断部分
    ｃ）プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカー、及び
    ｄ）半減期延長要素であり、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンに結合する抗原結合ポリペプチド、または免疫グロブリンＦｃである、半減期延長要素
    のそれぞれのうちの少なくとも１つを含む融合ポリペプチドを含む条件付きで活性であるＩＬ－１２であって、
    前記ＩＬ－１２ポリペプチドと前記ＩＬ－１２遮断部分とは、前記プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーによって機能的に連結され、前記融合ポリペプチドは、減弱されたＩＬ－１２受容体活性化活性を有しており、前記融合ポリペプチドのＩＬ－１２受容体活性化活性は、前記プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーの切断により産生される前記ＩＬ－１２ポリペプチドを含有するポリペプチドのＩＬ－１２受容体活性化活性よりも少なくとも約１０倍低く、前記ＩＬ－１２受容体活性化活性は、ＨＥＫ Ｂｌｕｅレポーター細胞アッセイを使用してモルに基づく等量の前記ＩＬ－１２ポリペプチド及び前記融合ポリペプチドで評価される、前記条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  3. ［Ａ］は、式
    ［Ａ１］－［Ｌ３］－［Ａ２］または［Ａ２］－［Ｌ３］－［Ａ１］を有し、式中、
    ［Ａ１］は、ＩＬ－１２ｐ４０サブユニットポリペプチドであり、
    ［Ａ２］は、ＩＬ－１２ｐ３５サブユニットポリペプチドであり、
    ［Ｌ３］は、任意選択でプロテアーゼ切断が可能なポリペプチドリンカーである、請求項１に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  4. ［Ａ］は、式［Ａ１］－［Ｌ３］－［Ａ２］を有し、Ｌ３は、プロテアーゼ切断が可能ではない、請求項３に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  5. 各プロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーは、独立して、カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、エラスターゼ、ＰＲ－３、グランザイムＭ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＡＤＡＭメタロプロテアーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、トリプターゼ、及び腫瘍細胞表面プロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼによる切断を受けることができる少なくとも１つの配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  6. 前記Ｌ２がプロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーである、請求項１に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  7. 前記Ｌ１が第１のプロテアーゼに対する基質であり、前記Ｌ２が第２のプロテアーゼに対する基質である、請求項１に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  8. 各プロテアーゼ切断可能ポリペプチドは、独立して、同じプロテアーゼのための２つ以上の切断部位、もしくは異なるプロテアーゼによって切断される２つ以上の切断部位を含むか、または前記プロテアーゼ切断可能ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、２つ以上の異なるプロテアーゼの切断部位を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  9. ＩＬ－１２遮断部分は、前記融合ポリペプチドによる前記ＩＬ－１２受容体の活性化を阻害する、請求項１～８のいずれか一項に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  10. 前記ＩＬ－１２遮断部分は前記ＩＬ－１２ポリペプチドに非共有結合で結合する、請求項１～９のいずれか一項に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  11. 前記ＩＬ－１２遮断部分は前記ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットポリペプチドと結合する、請求項１～９のいずれか一項に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  12. 前記ＩＬ－１２遮断部分は前記ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットポリペプチドと結合する、請求項１～９のいずれか一項に条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  13. 前記ＩＬ－１２遮断部分は、前記ＩＬ－１２ポリペプチドに結合する、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ、またはｓｃＦｖを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  14. 前記ＩＬ－１２は、前記プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーがプロテアーゼによって切断された後、前記ＩＬ－１２遮断部分から自由に解離する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  15. 腫瘍特異抗原結合ペプチドをさらに含む、請求項１～１４のいずれかに記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  16. 前記腫瘍特異抗原結合ペプチドは、切断不可能なリンカーによって前記ＩＬ－１２ポリペプチドに連結される、請求項１５に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  17. 前記腫瘍特異的抗原結合ペプチドは、切断可能なリンカーによって、前記ＩＬ－１２ポリペプチド、前記半減期延長要素または前記ＩＬ－１２遮断部分に連結される、請求項１５に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  18. 前記カテプシンが、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、または、カテプシンＧである、請求項５に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  19. 前記マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）が、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、またはＭＭＰ１４である、請求項５に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  20. 前記半減期延長要素は、ＩＬ－１２ｐ３５に機能的に連結されている、請求項１～１９のいずれか一項に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  21. 前記半減期延長要素は、ＩＬ－１２ｐ４０に機能的に連結されている、請求項１～２０のいずれか一項に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  22. 前記ＩＬ－１２ｐ３５が、ＩＬ－１２ｐ４０に結合してヘテロ二量体を形成する、請求項２０に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  23. 前記ＩＬ－１２ｐ４０が、ＩＬ－１２ｐ３０に結合してヘテロ二量体を形成する、請求項２１に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  24. 前記ＩＬ－１２に対する同族受容体は、ＩＬ－１２Ｒベータ１（ＩＬ－１２Ｒβ１）またはＩＬ－１２Ｒベータ２（ＩＬ－１２Ｒβ２）である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２。
  25. 請求項１～２４のいずれかに記載の条件付きで活性であるＩＬ－１２をコードする核酸。
  26. 請求項２５に記載の核酸を含むベクター。
  27. 請求項２６に記載のベクターを含む宿主細胞。
  28. 請求項２７に記載の宿主細胞を、所望のポリペプチドの発現及び採取に適切な条件下で培養することを含む、医薬組成物を製造する方法。
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