JP7043096B2 - 光架橋性ヒドロゲル材料の製造、原料、製品及び使用 - Google Patents
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- C07C235/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
- C07C235/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
- C07C235/12—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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- C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
- C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
- C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
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- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0069—Chondroitin-4-sulfate, i.e. chondroitin sulfate A; Dermatan sulfate, i.e. chondroitin sulfate B or beta-heparin; Chondroitin-6-sulfate, i.e. chondroitin sulfate C; Derivatives thereof
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Description
式I-2中、連結結合R1の一端がXに結合され、他端がR2,R3,R4,R5のうちのいずれか1つの基に結合されて環状構造を構成し、
式I-2中、R’は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、アルデヒド基、ケト基、エステル基、アミド基、ホスホン酸基、ホスホネート基、スルホン酸基、スルホネート基、スルホン基、スルホキシド基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキル基、アルキレン基、変性アルキル基又は変性アルキレン基等からなる群より選択され、
式I-2中、R1は、水素、エーテル結合置換基、エステル結合置換基、カーボネート結合置換基、ウレタン結合置換基、メルカプトカルボン酸エステル結合置換基又はリン酸エステル結合置換基等からなる群より選択され、
式I-2中、R2,R3,R4,R5は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、アルデヒド基、ケト基、カルボキシル基、エステル基、アミド基、ホスホン酸基、ホスホネート基、スルホン酸基、スルホネート基、スルホン基、スルホキシド基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキル基、アルキレン基、変性アルキル基又は変性アルキレン基等からなる群より選択される。
前記アルキレン基は、1-30の炭素原子を有する飽和若しくは不飽和の脂肪族直鎖又は分岐のアルキレン基であり、
前記変性アルキル基は、アルキル基の任意の炭素原子がハロゲン原子、-OH、-SH、-NO2、-CN、-CHO、-COOH、エステル基、アミド基、アリール基、アリーレン基、-CO-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、第一級アミノ基、第二級アミノ基、第三級アミノ基、四級アンモニウム塩基、飽和若しくは不飽和の単環式または二環式シクロアルキレン基、架橋脂肪族複素環からなる群より選択される少なくとも1つの基で置換された基であり、前記変性アルキル基は、1-30の原子を有し、その炭素-炭素単結が任意に炭素-炭素二重結合又は炭素-炭素三重結合で置換されていてもよく、
前記変性アルキレン基は、アルキレン基の任意の炭素原子がハロゲン原子、-OH、-SH、-NO2、-CN、-CHO、-COOH、エステル基、アミド基、アリール基、アリーレン基、-CO-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、第一級アミノ基、第二級アミノ基、第三級アミノ基、四級アンモニウム塩基、飽和若しくは不飽和の単環式または二環式シクロアルキレン基、架橋脂肪族複素環からなる群より選択される少なくとも1つの基で置換された基であり、前記変性アルキレン基は、1-30の原子を有し、その炭素-炭素単結合が任意に炭素-炭素二重結合又は炭素-炭素三重結合で置換されていてもよく、
前記エーテル結合置換基は、
前記エステル結合置換基は、
-CO(CH2)xCH3、-CO(CH2CH2O)xCH3、-CO(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等からなる群より選択され、ここで、x及びyは0以上の整数であり、
前記カーボネート結合置換基は、
-COO(CH2)xCH3、-COO(CH2CH2O)xCH3、-COO(CH2)x(CH2CH2O)yCH3からなる群より選択され、ここで、x及びyは0以上の整数であり、
前記ウレタン結合置換基は、
-CONH(CH2)xCH3、-CONH(CH2CH2O)xCH3、-CONH(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等からなる群より選択され、ここで、x及びyは0以上の整数であり、
前記メルカプトカルボン酸エステル結合置換基は、
-COS(CH2)xCH3、-COS(CH2CH2O)xCH3、-COS(CH2)x(CH2CH2O)yCH3からなる群より選択され、ここで、x及びyは0以上の整数であり、
前記リン酸エステル結合置換基は、
-POOO(CH2)xCH3、-POOO(CH2CH2O)xCH3、-POOO(CH2)x(CH2CH2O)yCH3からなる群より選択され、ここで、x及びyは0以上の整数であり、
前記アリール基は、5-10員芳香族単環又は芳香族縮合二環構造であり、
前記ヘテロアリール基は、環上にO、S、N又はSiからなる群より選択される少なくとも1つのヘテロ原子を含む5-10員芳香族単環又は芳香族縮合二環構造であり、
前記ハロゲン原子は、それぞれ独立してF、Cl、Br、Iからなる群より選択され、
前記脂肪族環は、飽和若しくは不飽和の3-10員単環又は多環式脂肪族環であり、
前記脂肪族複素環は、環上にO、S、N又はSiからなる群より選択される少なくとも1つのヘテロ原子を含む飽和若しくは不飽和の3-10員単環又は多環式脂肪族複素環であり、前記脂肪族複素環にS原子を含む場合、-S-、-SO-又は-SO2-のいずれかであり、前記脂肪族環又は複素環におけるHは、任意にハロゲン原子、ニトロ基、アリール基、アルキル基又は変性アルキル基で置換されていてもよく、
前記芳香環は、5-10員芳香族単環又は芳香族縮合二重環であり、
前記芳香族複素環は、環上O、S、N又はSiにからなる群より選択される少なくとも1つのヘテロ原子を含む5-10員芳香族単環又は芳香族縮合二重環であり、前記芳香環又は芳香族複素環におけるHは、任意にハロゲン原子、ニトロ基、アリール基、アルキル基又は変性アルキル基で置換されていてもよい。
1、式A-Iの構造を有するo-ニトロベンジル系光トリガーで修飾された感光性高分子誘導体(略称:A1)、
2、式A-IIの構造を有する二重結合官能基含有感光性高分子誘導体(略称:A2)、及び
3、式A-IIIの構造を有するo-ニトロベンジル系光トリガー及び二重結合官能基の両方を含む感光性高分子誘導体(略称:A3)、の3種類を含む。
式I-1、式I-2中、R1は、水素、エーテル結合置換基、エステル結合置換基、カーボネート結合置換基、ウレタン結合置換基、メルカプトカルボン酸エステル結合置換基又はリン酸エステル結合置換基等からなる群より選択され、
式I-1、式I-2中、R2,R3,R4,R5は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、アルデヒド基、ケト基、カルボキシル基、エステル基、アミド基、ホスホン酸基、ホスホネート基、スルホン酸基、スルホネート基、スルホン基、スルホキシド基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキル基、アルキレン基、変性アルキル基又は変性アルキレン基等からなる群より選択される。
必要に応じて、式A-II及び式A-III中、R’1,R’2、R’3は、互いに結合し、炭素原子と一緒になって飽和若しくは不飽和の脂肪族環又は複素環を形成する。
前記天然多糖類物質は、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アルギン酸、グルカン、アガロース、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、エチレングリコールキトサン、プロピレングリコールキトサン、キトサン乳酸塩、カルボキシメチルキトサン又はキトサン四級アンモニウム塩を含む。
前記タンパク質は、各種の親水性又は水溶性の動植物タンパク質、コラーゲン、血清タンパク質、シルクフィブロイン、エラスチンを含み、前記タンパク質の分解物は、ゼラチン又はポリペプチドを含む。
親水性若しくは水溶性の合成ポリマーは、2アーム型又はマルチアームポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、デンドリマー、合成ポリペプチド、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンを含む。
上記3種類の感光性高分子誘導体は、1種又は複数種の異なる基を同時に含む親水性若しくは水溶性高分子であってもよいか、又は1種又は複数種の異なる基を含む親水性若しくは水溶性高分子の混合物であってもよい。
o-ニトロベンジル系光トリガーが構造式I-1の構造である場合、
P1の一端がR2,R3,R4,R5のうちのいずれか1つ又は複数の基;R2,R3,R4,R5で形成された飽和若しくは不飽和の脂肪族環又は複素環;或いはR2,R3,R4,R5で形成された芳香環又は芳香族複素環に結合され、
o-ニトロベンジル系光トリガーが構造式I-2の構造である場合、
P1の一端がR2,R3,R4,R5のうちのいずれか1つ又は複数の基;R2,R3,R4,R5で形成された飽和若しくは不飽和の脂肪族環又は複素環;R2,R3,R4,R5で形成された芳香環又は芳香族複素環;或いはR1とR2,R3,R4,R5のうちのいずれか1つの基と結合して構成した環状鎖に結合され、
その連結結合は、ヒドロキシル系で得られた連結結合P1-O-からなる群より選択され、メルカプト系で得られた連結結合P1-S-からなる群より選択され、アミノ系で得られた連結結合P1-NH-からなる群より選択され、アルカン系で得られた連結結合P1-からなる群より選択され、エステル結合系で得られた連結結合P1-COO-からなる群より選択され、又はアミド結合系で得られた連結結合P1-CONH-からなる群より選択され、前記連結結合の一端がP1に結合され、他端が式A-Iで表される分子のベンゼン環に結合される。
o-ニトロベンジル系光トリガーが構造式I-1の構造である場合、
P1の一端がR2,R3,R4,R5のうちのいずれか1つ又は複数の基;R2,R3,R4,R5で形成された飽和若しくは不飽和の脂肪族環又は複素環;或いはR2,R3,R4,R5で形成された芳香環又は芳香族複素環に結合され、
P1の他端がR’4に結合され、
o-ニトロベンジル系光トリガーが構造式I-2の構造である場合、
P1の一端がR2,R3,R4,R5のうちのいずれか1つ又は複数の基;R2,R3,R4,R5で形成された飽和若しくは不飽和の脂肪族環又は複素環;R2,R3,R4,R5で形成された芳香環又は芳香族複素環;或いはR1とR2、R3、R4、R5のうちのいずれか1つの基と結合して構成した環状鎖に結合され、
その連結結合は、ヒドロキシル系で得られた連結結合-O-P1-Oからなる群より選択され-、メルカプト系で得られた連結結合-S-P1-S-からなる群より選択され、アミノ系で得られた連結結合-NH-P1-NH-からなる群より選択され、アルカン系で得られた連結結合-P1-からなる群より選択され、エステル結合系で得られた連結結合-COO-P1-COO-からなる群より選択され、又はアミド結合系で得られた連結結合-CONH-P1-CONH-からなる群より選択され、或いはその連結結合は、P1の両端に前記ヒドロキシル系、メルカプト系、アミノ系、アルカン系、エステル結合系、アミド結合系のうちの2種類以上が結合された連結結合からなる群より選択され、前記連結結合の一端がP1に結合され、他端が式A-IIIで表される分子のベンゼン環に結合される。
前記アルキレン基は、1-30の炭素原子を有する飽和若しくは不飽和の脂肪族直鎖又は分岐のアルキレン基であり、
前記変性アルキル基は、アルキル基の任意の炭素原子がハロゲン原子、-OH、-SH、-NO2、-CN、-CHO、-COOH、エステル基、アミド基、アリール基、アリーレン基、-CO-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、第一級アミノ基、第二級アミノ基、第三級アミノ基、四級アンモニウム塩基、飽和若しくは不飽和の単環式または二環式シクロアルキレン基、架橋脂肪族複素環からなる群より選択される少なくとも1つの基で置換された基であり、前記変性アルキル基は、1-30の原子を有し、その炭素-炭素単結合が任意に炭素-炭素二重結合又は炭素-炭素三重結合で置換されていてもよい。
前記変性アルキレン基は、アルキレン基の任意の炭素原子がハロゲン原子、-OH、-SH、-NO2、-CN、-CHO、-COOH、エステル基、アミド基、アリール基、アリーレン基、-CO-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、第一級アミノ基、第二級アミノ基、第三級アミノ基、四級アンモニウム塩基、飽和若しくは不飽和の単環式または二環式シクロアルキレン基、架橋脂肪族複素環からなる群より選択される少なくとも1つの基で置換された基であり、前記変性アルキレン基は、1-30の原子を有し、その炭素-炭素単結合が任意に炭素-炭素二重結合又は炭素-炭素三重結合で置換されていてもよい。
前記エステル結合置換基は、
-CO(CH2)xCH3、-CO(CH2CH2O)xCH3、-CO(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等からなる群より選択され、ここで、x及びyは0以上の整数であり、
前記カーボネート結合置換基は、
-COO(CH2)xCH3、-COO(CH2CH2O)xCH3、-COO(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等からなる群より選択され、ここで、x及びyは0以上の整数であり、
前記ウレタン結合置換基は、
-CONH(CH2)xCH3、-CONH(CH2CH2O)xCH3、-CONH(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等からなる群より選択され、ここで、x及びyは0以上の整数であり、
前記メルカプトカルボン酸エステル結合置換基は、
-COS(CH2)xCH3、-COS(CH2CH2O)xCH3、-COS(CH2)x(CH2CH2O)yCH3からなる群より選択され、ここで、x及びyは0以上の整数であり、
前記リン酸エステル結合置換基は、
-POOO(CH2)xCH3、-POOO(CH2CH2O)xCH3、-POOO(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等からなる群より選択され、ここで、x及びyは0以上の整数であり、
前記アリール基は、5-10員芳香族単環又は芳香族縮合二環構造であり、
前記ヘテロアリール基は、環上にO、S、N又はSiからなる群より選択される少なくとも1つのヘテロ原子を含む5-10員芳香族単環又は芳香族縮合二環構造であり、
前記ハロゲン原子は、それぞれ独立してF、Cl、Br、Iからなる群より選択され、
前記脂肪族環は、飽和若しくは不飽和の3-10員単環又は多環式脂肪族環であり、
前記脂肪族複素環は、環上にO、S、N又はSiからなる群より選択される少なくとも1つのヘテロ原子を含む飽和若しくは不飽和の3-10員単環又は多環式脂肪族複素環であり、前記脂肪族複素環にS原子を含む場合、-S-、-SO-又は-SO2-のいずれかであり、前記脂肪族環又は複素環におけるHは、任意にハロゲン原子、ニトロ基、アリール基、アルキル基又は変性アルキル基で置換されていてもよく、
前記芳香環は、5-10員芳香族単環又は芳香族縮合二重環であり、
前記芳香族複素環は、環上にO、S、N又はSiからなる群より選択される少なくとも1つのヘテロ原子を含む5-10員芳香族単環又は芳香族縮合二重環であり、前記芳香環又は芳香族複素環におけるHは、任意にハロゲン原子、ニトロ基、アリール基、アルキル基又は変性アルキル基で置換されていてもよい。
-H、-OH、-SH、-NH2、-F、-Cl、-Br、-I、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-NO2、-CN、-CHO、-COOH、-COONH2、-SO3H等を含む。
アルキル類置換基の好ましい構造は、例えば、直鎖アルキル基-(CH2)xCH3、分岐アルキル基-(CH2)x (CY’Y’’)yCH3(Y’、Y’’は、水素、アルキル基又は変性アルキル基である)等であり、ここで、x及びyは0以上の整数であり、
エーテル置換基の好ましい構造は、例えば、-O(CH2)xCH3、-O(CH2CH2O)xCH3、-O(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等であり、ここで、x及びyは0以上の整数であり、
チオエーテル置換基の好ましい構造は、例えば、-S(CH2)xCH3、-S(CH2CH2O)xCH3、-S(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等であり、ここで、x及びyは0以上の整数であり、
アミノ置換基の好ましい構造は、例えば、
エステル置換基の好ましい構造は、例えば、-COO(CH2)xCH3、-COO(CH2CH2O)xCH3、-COO(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等であり、ここで、x及びyは0以上の整数であり、
アミド置換基の好ましい構造は、例えば、-CONH(CH2)xCH3、-CONH(CH2CH2O)xCH3、-CONH(CH2)x(CH2CH2O)yCH3であり、ここで、x及びyは0以上の整数であり、
芳香族置換基の好ましい構造は、例えば、
前記o-ニトロベンジル系光トリガーは、環状構造を含まないo-ニトロベンジル系光トリガー及び環状o-ニトロベンジル系光トリガーの2つの構造を有する。環状o-ニトロベンジル系光トリガーは、cNBで示される。
実施可能な製造方法一:カルボキシル基含有水溶性ポリマー又は高分子蒸留水に溶解し、活性官能基であるヒドロキシル基、メルカプト基又はアミノ基を含むo-ニトロベンジル小分子を加えた後、縮合剤である1-エチル-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC-HCl)及び活性化剤であるヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)を加え、その後、室温下で24-48時間撹拌する。反応終了後、反応液を透析バッグに入れ、希塩酸溶液により2-3日透析した後、凍結乾燥することにより、前記o-ニトロベンジルで修飾された感光性高分子誘導体を得る。
本発明において、二重結合で修飾された感光性高分子誘導体の製造方法は以下の3種類を含む。
実施可能な製造方法一:ヒドロキシル基又はアミノ基含有水溶性高分子を脱イオン水に溶解し、0-4℃に冷却し、アクリル酸無水物又はメタクリル酸無水物を加えた後、さらに5MのNaOHをゆっくりと滴下し、24時間反応させた後、反応液を透析バッグに入れ、脱イオン水により2-3日透析し、次いで凍結乾燥することにより、前記二重結合で修飾された感光性高分子誘導体を得る。
実施可能な製造方法一:o-ニトロベンジル系光トリガーを含む水溶性高分子を脱イオン水に溶解し、0-4℃に冷却し、アクリル酸無水物又はメタクリル酸無水物を加え、さらに5MのNaOHをゆっくりと滴下し、24時間反応させた後、反応液を透析バッグに入れ、脱イオン水により2-3日透析し、次いで凍結乾燥することにより、前記o-ニトロベンジル系光トリガー及び二重結合官能基の両方を含む感光性高分子誘導体を得る。
成分A-感光性高分子誘導体を生体適合性媒体に溶解し、感光性高分子溶液Aを得るステップと、
成分B-光開始剤を生体適合性媒体に溶解し、光開始剤溶液Bを得るステップと、
溶液Aと溶液Bとを均一に混合し、ヒドロゲル前駆体溶液を得、ヒドロゲル前駆体溶液を光源により照射することにより、光架橋してヒドロゲルを形成するステップと、を含む。その架橋方式は、成分Aにおけるo-ニトロベンジル系光トリガー及び/又は二重結合官能基並びに成分B-光開始剤は、光照射下でそれぞれラジカル架橋(即ち、o-ニトロベンジル系光トリガーのラジカル架橋及び二重結合官能基のラジカル架橋)が発生することである。
成分A-感光性高分子誘導体を生体適合性媒体に溶解し、感光性高分子溶液Aを得るステップと、
成分B-光開始剤を生体適合性媒体に溶解し、光開始剤溶液Bを得るステップと、
補助成分C-他の生体適合性高分子誘導体を生体適合性媒体に溶解し、高分子溶液Cを得るステップであって、前記補助成分C-他の生体適合性高分子誘導体は、アミノ、ヒドラジン、アシルヒドラジン若しくはヒドロキシルアミン官能基を含む高分子誘導体、又はメルカプト官能基を含む高分子誘導体であるステップと、
溶液A、溶液B及び溶液Cを均一に混合し、ヒドロゲル前駆体溶液を得、ヒドロゲル前駆体溶液を光源により照射することにより、光架橋してヒドロゲルを形成するステップと、を含む。その架橋方式は、成分Aにおけるo-ニトロベンジル系光トリガー及び/又は二重結合官能基並びに成分B-光開始剤は、光照射下でそれぞれラジカル架橋(即ち、o-ニトロベンジル系光トリガーのラジカル架橋及び二重結合官能基のラジカル架橋)が発生するとともに、成分Aにおけるo-ニトロベンジル系光トリガーが光照射により生成したアルデヒド基/ケト基と成分Cにおけるアミノ、ヒドラジン、アシルヒドラジン又はヒドロキシルアミン官能基とが光結合架橋し、生成したニトロソ基と成分Cにおけるメルカプト官能基とが光誘起ニトロソ架橋する複合型の光架橋である。
実施可能な製造方法一:カルボキシル基含有水溶性ポリマー又は高分子を蒸留水に溶解し、活性官能基であるアミノ基、アシルヒドラジン又はヒドロキシルアミンを含むメルカプト基を有する小分子を加えた後、縮合剤である1-エチル-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC-HCl)及び活性化剤であるヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)を加え、さらに、室温下で24-48時間撹拌し、反応終了後、反応液を透析バッグに入れ、希塩酸溶液により2-3日透析し、次いで凍結乾燥することにより、前記メルカプト基で修飾された高分子誘導体を得る。
ここで、成分A-感光性高分子誘導体は、
1、式A-Iの構造を有するo-ニトロベンジル系光トリガーで修飾された感光性高分子誘導体(略称:A1)、及び
2、式A-IIIの構造を有するo-ニトロベンジル系光トリガー及び二重結合官能基の両方を含む感光性高分子誘導体(略称:A3)、の2種類を含む。
(1)光効果速度が速く、1-2sでゲル化点に達し、10-20sで最終弾性率に達することができ、1回で多重光架橋が達成されるため、その光硬化速度は、単なる光開始ラジカル重合架橋及び光結合架橋よりも優れている。
(2)組織接着力が強く、組織表面でインサイチュゲル化することができ、また、光照射により生成したアルデヒド基/ケト基及びニトロソ基は、組織表面のメルカプト基、アミノカルボキシル基と反応することで、ヒドロゲルと周辺組織との化学的に結合して一体に融合することができ、ラジカル重合架橋に別途の下塗りが必要であるという問題が解決される。
(3)力学性能に優れ、良好な延性及び強度を有することで、従来のほとんどのヒドロゲルの機械的性能が悪く、壊れやすいという問題が解決される。
(4)生体適合性が良好で、原料が主に天然高分子材料に由来し、形成されたヒドロゲルが分解可能である。
(5)臨床操作が便利である。光架橋は、優れた時間と空間の制御性を有するため、使用際にヒドロゲル前駆体溶液を創面組織に塗るか、又はスプレーすることで、光照射下で迅速にゲル化して組織と融合することができ、下塗りの必要がなく、ワンステップで創面閉鎖が実現される。
(6)ゲルの化学構造、組成、分解性、強度及び厚さが調整可能であり、使用目的に応じてゲル材料の組成及び特性を調整することができ、特に創面でインサイチュで薄いゲルを形成することができ、術後創面の閉鎖及び修復、並びに組織液浸漏封止に適用できるとともに、止血材料及び組織工学足場材料として適用でき、3Dプリント用のバイオインクにも適用でき、さらに細胞、タンパク質又は薬物にインサイチュ担体を提供することができ、再生医学に効果的に使用することができる。
(2)成分A-1の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2 g,340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物1(65mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-1(1.85g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物1の標識率は約3.42%であった。
(3)成分A-2の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物3(68mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-2(1.92g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物3の標識率は約3.29%であった。
(3)成分A-3の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物5(79mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-3(1.73g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物5の標識率は約2.97%であった。
(3)成分A-4の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物7(70mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-4(1.78g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物7の標識率は約2.49%であった。
(3)成分A-5の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物9(74mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-5(1.76g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物9の標識率は約3.08%であった。
(3)成分A-6の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物11(79mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-6(1.79g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物11の標識率は約2.34%であった。
(3)成分A-7の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物13(90mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-7(1.72g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物13の標識率は約2.38%であった。
(3)成分A-8の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物15(82mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-8(1.86g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物15の標識率は約3.43%であった。
(3)成分A-9の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物17(86mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-9(1.82g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物17の標識率は約3.24%であった。
(3)成分A-10の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物19(80mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-10(1.88g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物19の標識率は約3.01%であった。
(3)成分A-11の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物21(91mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-11(1.76g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物21の標識率は約3.15%であった。
(3)成分A-12の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物23(80mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-12(1.88g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物23の標識率は約3.01%であった。
(2)成分A-13の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物24(87mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-13(1.73g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物24の標識率は約3.08%であった。
(3)成分A-21の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物33(65mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-21(1.76g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物33の標識率は約2.84%であった。
(3)成分A-22の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物35(69mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-22(1.83g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物35の標識率は約3.12%であった。
(3)成分A-25の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物41(62mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-25(1.82g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物41の標識率は約3.12%であった。
(3)成分A-26の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物43(64mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-26(1.87g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物43の標識率は約3.21%であった。
(3)成分A-28の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物47(65mg、0.2mmol)10mLを秤量してジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-28(1.85g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物47の標識率は約3.43%であった。
(3)成分A-29の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物49(65mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-29(1.86g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物49の標識率は約3.52%であった。
(3)成分A-30の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物51(65mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-30(1.82g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物51の標識率は約3.39%であった。
(3)成分A-31の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物53(75mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-31(1.87g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物53の標識率は約3.45%であった。
(3)成分A-34の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物57(65mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-34(1.82g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物57の標識率は約3.21%であった。
(3)成分A-35の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物59(65mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-35(1.87g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物59の標識率は約2.76%であった。
(3)成分A-36の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物61(65mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-36(1.76g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物61の標識率は約3.21%であった。
(2)成分A-42の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(1g、340kDa)を50mL水に溶解し、化合物62(0.2g、0.48mmol)、EDC-HCl(0.76g、3.96mmol)及びDPTS(0.12g、0.48mmol)を順に前記溶液に入れ、室温下で48時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、反応液を冷エタノールに入れ、複数回の再沈殿により精製し、回収された沈殿を乾燥させた後、無水DMSOに溶解し、p-トルエンスルホン酸を加えてジヒドロピラン保護基を除去することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-42(0.86g)を得た。その1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物62の修飾度は約10%であった。
(2)成分A-43の合成:1gキトサンを75mLイソプロパノールに加えてキトサンの懸濁液を調製し、その後、化合物63(0.2g、0.54mmol)、EDC-HCl(0.76g、3.96mmol)及びNHS(0.46g、4.0mmol)を順に前記溶液に加え、室温で48時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、混合物溶液を濾過し、濾液をメタノール/水の混合溶溶媒で3回透析し、メタノールで2回透析した後、凍結乾燥することにより、化合物63で標識されたキトサン(0.9g)を得た。化合物63で標識されたキトサンをDMSOに溶解し、p-トルエンスルホン酸を加えてジヒドロピラン保護基を除去することにより、感光性キトサン誘導体A-43を得た。その1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物63の修飾度は約12.5%であった。
(2)成分A-47の合成:メルカプト基で修飾されたヘパリンHep-SH(1g)を50mL蒸留水に完全に溶解し、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt、0.3g、2.3mmol)を加えた後、メタノールに溶解した化合物64(0.5g、 1.6mmol)及び1-エチル-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC-HCl、0.5g、2.6mmol)を前記溶液に加えて室温で48時間反応させた後、塩化ナトリウムを含む希塩酸溶液(pH=3.5)で1日透析した後、さらに純水で1日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヘパリン誘導体A-47(0.86g)を得た。その1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物64の修飾度は約10.2%であった。
(2)成分A-48の合成:1gキトサンを75mLイソプロパノールに加えてキトサンの懸濁液を調製し、25mLのNaOH溶液(10mol/L)を5回で前記キトサンの懸濁液にゆっくりと加え、約30分間撹拌し続けた。その後、化合物65(0.2g)を前記溶液に加え、60℃の条件下で3時間反応させた。反応終了後、混合物溶液を濾過し、濾液をメタノール/水の混合溶溶媒で3回透析し、メタノールで2回透析した後、凍結乾燥することにより、化合物65で標識されたキトサン(0.92g)を得た。化合物65で標識されたキトサンをDMSOに溶解し、p-トルエンスルホン酸を加えてジヒドロピラン保護基を除去することにより、感光性キトサン誘導体A-48(0.84g)を得た。その1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物65の修飾度は約12.4%であった。
(3)成分A-50の合成:化合物67(0.28g、0.63mmol)、コモノマーPEG-MA(0.882g、2.52mmol)及び開始剤であるアゾビスイソブチロニトリル(11 mg)を秤量してシュレック管に加え、無水THFを加えて溶解し、複数回の凍結-真空引きの循環操作により処理した後、この反応系を75℃の条件下で24時間反応させた。反応終了後、反応液を冷ジエチルエーテルに入れ、複数回の再沈殿により精製し、回収された沈殿を乾燥させた後、無水DMSOに溶解し、p-トルエンスルホン酸を加えてジヒドロピラン保護基を除去することにより、感光性共重合体誘導体A-50(0.84g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物67の共重合体における含有量は約15.5%であった。GPCにより測定された合成高分子の分子量は約25kDaであった。配合比により計算した結果、nは12、xは10、yは40であった。
(2)成分A-51の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物68(69mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-51(1.85g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物68の標識率は約3.34%であった。
(4)成分A-52の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物71(109mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-52(1.92g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物71の標識率は約3.32%であった。
(3)化合物74の合成:実施例52の方法に従って、化合物73を原料として化合物74(収率70%)を製造した。1H NMR (400mHz, CDCl3): δ=7.71 (s, 1H), 7.22 (s, 1H), 4.86 (m, 1H), 4.42 (m, 1H), 4.13 (t, J=6.1 Hz, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.95 (s, 3H), 3.43 (d, J=5.6, 2H), 3.32 (dd, J=11.6, 5.7 Hz, 2H), 2.82 (t, J=5.9 Hz, 2H), 2.44 (t, J=7.2 Hz, 2H), 2.26 - 2.17 (m, 2H), 1.42 (s, 9H), 1.33 (d, J=6.9 Hz, 3H). MS (ESI): [M+H] 559.2402.
(4)成分A-53の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物74(112mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-53(1.75g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物74の標識率は約2.34%であった。
(4)成分A-54の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物77(133mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-54(1.8g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物77の標識率は約3.35%であった。
(2)成分A-55の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物78(85mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-55(1.89g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物78の標識率は約3.42%であった。
(2)成分A-56の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物79(89mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-56(1.87g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物79の標識率は約3.21%であった。
(2)成分A-57の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物80(83mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-57(1.74g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物80の標識率は約2.34%であった。
(2)成分A-58の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物81(94mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-58(1.72g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物81の標識率は約2.56%であった。
(2)成分A-59の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物82(83mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-59(1.74g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物82の標識率は約2.34%であった。
(2)成分A-60の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物83(90mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-60(1.72g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物83の標識率は約2.36%であった。
(2)成分A-62の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物85(109mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-62(1.92g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物85の標識率は約3.14%であった。
(2)成分A-63の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物86(109mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-63(1.88g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物86の標識率は約3.45%であった。
(2)成分A-64の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物87(109mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-64(1.85g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物87の標識率は約3.32%であった。
(2)成分A-67の合成:1gキトサンを75mLイソプロパノールに加えてキトサンの懸濁液を形成し、その後、化合物88(0.2g、0.40mmol)、EDC-HCl(0.76g、3.96mmol)及びNHS(0.46g、4.0mmol)を順に前記溶液に加え、室温で48時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、塩化ナトリウムを含む希塩酸溶液(pH=3.5)で1日透析した後、さらに純水で1日透析し、凍結乾燥することにより、感光性キトサン誘導体A-67(0.89g)を得た。その1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物88の修飾度は約12.5%であった。
(2)成分A-68の合成:PEG-4OH(1g、0.05mmol)を無水アセトニトリルに溶解し、K2CO3(55.3mg、0.4mmol)を加えて30分間撹拌した後、化合物89(0.20g、0.4mmol)を加え、室温下で24時間反応させ続けた。反応終了後、ほとんどの溶媒を除去し、ジエチルエーテル中で再沈殿させ、複数回洗浄し、吸引濾過し、乾燥させることにより、感光性ポリエチレングリコール誘導体A-68(0.85g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物89の修飾度は約95%であった。
(3)成分A-69の合成:化合物91(0.28g、0.63mmol)、コモノマーPEG-MA(0.882g、2.52mmol)及び開始剤であるアゾビスイソブチロニトリル(11mg)を秤量してシュレック管に加え、無水THFを加えて溶解し、複数回の凍結-真空引きの循環操作により処理した後、この反応系を75℃の条件下で24時間反応させた。反応終了後、反応液を冷ジエチルエーテルに入れ、複数回の再沈殿により精製することにより、感光性共重合体誘導体A-69(0.86g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物91の共重合体における含有量は約15.3%であった。GPCにより測定された合成高分子の分子量は約25kDaであった。配合比により計算した結果、nは12、xは10、yは40であった。
(2)成分A-70の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物92(65mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-70(1.8g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物92の標識率は約3.26%であった。
(4)成分A-71の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物95(80mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-71(1.87g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物95の標識率は約3.42%であった。
(2)成分A-72の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物96(82mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-72(1.84g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物96の標識率は約3.21%であった。
(2)成分A-74の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物98(82mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-74(1.88g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物98の標識率は約3.38%であった。
(2)成分A-75の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物99(86mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-75(1.85g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物99の標識率は約3.21%であった。
(2)成分A-76の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物100(80mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-76(1.69g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物100の標識率は約2.31%であった。
(2)成分A-77の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物101(91mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-77(1.82g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物101の標識率は約3.21%であった。
(2)成分A-80の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物104(80mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-80(1.86g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物104の標識率は約3.32%であった。
(2)成分A-81の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物105(80mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-81(1.89g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物105の標識率は約3.28%であった。
(2)成分A-82の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物106(80mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-82(1.91g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物106の標識率は約3.26%であった。
(2)成分A-85の合成:1gキトサンを75mLイソプロパノールに加えてキトサンの懸濁液を形成し、その後、化合物107(0.2g、0.56mmol)、EDC-HCl(0.76g、3.96mmol)及びNHS(0.46g、4.0mmol)を順に前記溶液に加え、室温で48時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、塩化ナトリウムを含む希塩酸溶液(pH=3.5)で1日透析した後、さらに純水で1日透析し、凍結乾燥することにより、感光性キトサン誘導体A-85(0.82g)を得た。その1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物107の修飾度は約11.3%であった。
(2)成分A-86の合成:PEG-4OH(1g、0.05mmol)を無水アセトニトリルに溶解し、K2CO3(55.3mg、0.4mmol)を加えて30分間撹拌した後、化合物108(0.15g、0.4mmol)を加え、室温下で24時間反応させ続けた。反応終了後、ほとんどの溶媒を除去し、ジエチルエーテル中で再沈殿させ、複数回洗浄し、吸引濾過し、乾燥させることにより、感光性ポリエチレングリコール誘導体A-86(0.93g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物108の修飾度は約95%であった。
(2)化合物110の合成:化合物109(0.64g、1.72mmol)及びトリエチルアミン(0.34g、3.44mmol)を乾燥ジクロロメタンに溶解し、氷浴条件下で、メタクリロイルクロリド(0.27g、2.58mmol)を前記溶液にゆっくりと滴下し、滴下終了後、室温条件下で一晩反応させた。反応終了後、減圧下で回転蒸発することにより溶媒を除去し、カラム精製により、化合物110(0.49g、65%)を得た。1H NMR (400mHz, CDCl3): δ=7.71 (s, 1H), 7.22 (s, 1H), 6.25 (s, 1H), 5.68 (s, 1H), 4.55 (s, 2H), 4.13 (t, J=6.1 Hz, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.95 (s, 3H), 3.79 (t, J=6.1 Hz, 2H), 3.74 (s, 2H), 3.70 (t, J=7.2 Hz, 2H), 3.56 (t, J=7.2 Hz, 2H), 1.87 (s, 3H). MS (ESI): [M+H] 427.1725.
(3)成分A-87の合成:化合物110(0.28g、0.63mmol)、コモノマーPEG-MA(0.882g、2.52mmol)及び開始剤であるアゾビスイソブチロニトリル(11mg)を秤量してシュレック管に加え、無水THFを加えて溶解し、複数回の凍結-真空引きの循環操作により処理した後、この反応系を75℃の条件下で24時間反応させた。反応終了後、反応液を冷ジエチルエーテルに入れ、複数回の再沈殿により精製することにより、感光性共重合体誘導体A-87(0.85g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物110の共重合体における含有量は約14.6%であった。GPCにより測定された合成高分子の分子量は約25kDaであった。配合比により計算した結果、nは12、xは10、yは40であった。
(2)化合物112の合成:化合物111(10g,41.3mmol)を50mL無水酢酸に溶解し、氷浴条件下で50mL硝酸(65%)を滴下した。滴下した後、氷浴を取り外し、室温条件で30分間反応させ、反応終了後、反応系を600mL氷水にゆっくりと入れて黄色固体を析出させ、減圧濾過により黄色固体を得た後、エタノールで再結晶し、黄色の針状生成物である化合物112(9.72g,82%)を得た。1H NMR (400mHz, CDCl3): δ=10.42 (s, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.43 - 7.39 (m, 3H), 7.37 (d, J=7.0 Hz, 1H), 5.26 (s, 2H), 4.01 (s, 3H). MS (ESI): [M+Na] 310.0689.
(3)化合物113の合成:化合物112(9g、31.3mmol)を200mLメタノールに溶解し、氷浴条件下で水素化ホウ素ナトリウム(2.37g、62.6mmol)をゆっくりと加えた後、氷浴を取り外し、室温条件下で30分間反応させ、反応終了後、2mol/Lの塩酸を加えてPH=7に調整し、その後、減圧蒸留によりメタノールを除去し、100mL水を加え、酢酸エチルで3回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、回転乾燥により溶媒を除去して黄色固体生成物を得、エタノールで再結晶し、黄色固体生成物である化合物113(9.06g,92%)を得た。1H NMR (400mHz, CDCl3): δ=7.77 (s, 1H), 7.49-7.42 (m, 2H), 7.40 (dd, J=8.1, 6.4 Hz, 3H), 7.18 (s, 1H), 5.20 (s, 2H), 4.95 (s, 2H), 4.00 (s, 3H). MS (ESI): [M+Na] 312.0834.
(4)化合物114の合成:化合物113(3g、10.4mmol)を100mL乾燥テトラヒドロフランに溶解し、3回換気し、氷浴条件下でトリフェニルホスフィン(4.08g、15.6mmol)及び四臭化炭素(5.16g、15.6mmol)を同時に加えた後、氷浴を取り外し、室温条件下で2時間反応させ、反応終了後、6mL水を加えて反応系を停止し、その後、減圧下で回転蒸留によりテトラヒドロフランを除去し、飽和食塩水及び酢酸エチルで2回抽出し、さらに水及び酢酸エチルで3回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで有機相を乾燥させ、減圧下で回転蒸発により溶媒を除去し、乾式カラムクロマトグラフィー(PE:CH2Cl2=4:1)により分離することで、黄色粉末である化合物114(3.09g、85%)を得た。1H NMR (400mHz, CDCl3): δ=7.71 (s, 1H), 7.46-7.41 (m, 2H), 7.40-7.30 (m, 3H), 6.93 (s, 1H), 5.17-5.13 (m, 2H), 4.8-4.79 (m, 2H), 3.95 (s, 3H), 1.42(s, 9H). MS (ESI): [M+Na] 374.0003.
(5)化合物115の合成:化合物114(3g、8.5mmol)を120mLアセトンに溶解し、3回換気し、アルゴンの保護下でL-システインメチルエステル塩酸塩(2.9g、17mmol)及び水酸化ナトリウム(0.85g、21.25mmol)を加え、さらに3回換気し、室温条件下で2時間反応させ、反応終了後、反応系に4mol/Lの塩酸を加えてPH=7に調整し、減圧下で回転蒸留によりアセトンを除去し、飽和食塩水及び酢酸エチルで3回抽出した後、さらに水及び酢酸エチルで3回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾式カラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:CH3OH=100:3)により分離することで、黄色固体である化合物115(2.71g、78%)を得た。1H NMR (400mHz, CDCl3): δ=7.71 (s, 1H), 7.45 (d, J=7.0 Hz, 2H), 7.39 (t, J=7.2 Hz, 3H), 6.95 (s, 1H), 5.18 (s, 2H), 4.13 (q, J=13.6 Hz, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.65 (m, 1H), 2.91 (dd, J=13.7, 4.6 Hz, 1H), 2.75 (dd, J=13.6, 7.5 Hz, 1H).MS (ESI): [M+H] 407.1277.
(6)化合物116の合成:テトラエチレングリコール(22g、113.2mmol)を乾燥テトラヒドロフランに加え、金属ナトリウム(40mg、1.74mmol)を加えて気泡が発生し、ナトリウムが完全に溶解した後、アクリル酸tert-ブチル(8g、62.4mmol)を加え、室温下で20時間反応させ、反応終了後、1mol/Lの塩酸で反応系をPH=7に調整し、減圧下で回転蒸留によりテトラヒドロフランを除去し、飽和食塩水及び酢酸エチルで3回抽出し、さらに水及び酢酸エチルで3回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で回転蒸発により溶媒を除去することにより、さらに精製することなく、無色の油状液体である化合物116(16.0g、80%)を得た。1H NMR (400mHz, CDCl3): δ=3.78-3.69 (m, 4H), 3.69 - 3.54 (m, 14H), 2.52 (dd, J=4.3, 2.1 Hz, 2H), 1.45 (s, 9H). MS (ESI): [M+Na] 345.1872.
(7)化合物117の合成:化合物116(10g、31.2mmol)を乾燥ジクロロメタンに溶解し、乾燥トリエチルアミン(5.2mmL、37.4mmol)を加えた後、p-トルエンスルホニルクロリド(8.9g、46.8mmol)を40mL乾燥ジクロロメタンに加え、氷浴条件下で前記反応系に滴下し、滴下した後、氷浴を取り外し、室温下で6時間反応させた。反応終了後、そのまま反応系に200mL水を加え、ジクロロメタンで3回抽出し、有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、回転蒸発により溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:CH3OH=50:1)により分離することで、淡黄色油状液体である化合物117(12.6g、85%)を得た。1H NMR (400mHz, CDCl3): δ=7.79-7.74 (m, 2H), 7.32 (d, J=8.5 Hz, 2H), 4.21-3.90 (m, 2H), 3.66 (dd, J=5.7, 2.8 Hz, 4H), 3.62-3.35 (m, 12H), 2.47 (dd, J=8.3, 4.8 Hz, 2H), 2.42 (d, J=3.2 Hz, 3H), 1.42 (d, J=3.4 Hz, 9H). MS (ESI): [M+Na] 499.1964.
(8)化合物118の合成:化合物117(10g、21.0mmol)及び臭化リチウム(4.8g、31.5mmol)を30mL N,N-ジメチルホルムアミドに溶解し、80℃に加熱し、1時間反応させ、反応終了後、減圧下で回転蒸留によりN,N-ジメチルホルムアミドを除去し、水及びジクロロメタンで3回抽出し、有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で回転蒸発により溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー(CH2Cl2)により分離することで、淡黄色液体である化合物118(7.3g、90%)を得た。1H NMR (400mHz, CDCl3): δ=3.72 (t, J=6.3 Hz, 2H), 3.62 (t, J=6.6 Hz, 2H), 3.58 (dd, J=2.6, 1.5 Hz, 8H), 3.54 (d, J=2.2 Hz, 4H), 3.39 (t, J=6.3 Hz, 2H), 2.42 (t, J=6.6 Hz, 2H), 1.36 (s, 9H). MS (ESI): [M+Na] 409.1005.
(9)化合物119の合成:化合物118(5g、13.0mmol)を30mL乾燥ジクロロメタンに加え、10mLトリフルオロ酢酸を加え、室温下で30分間反応させ、反応終了後、減圧下で回転蒸発により溶媒を除去し、さらにジクロロメタン及び酢酸エチルでそれぞれ生成物を溶解し、減圧下で回転蒸発により溶媒を除去することによりトリフルオロ酢酸を完全に除去し、さらに精製することなく、黄色油状液体である化合物119(3.9g、92%)を得た。1H NMR (400mHz, CDCl3): δ=3.72 (t, J=6.3 Hz, 2H), 3.67 (t, J=6.3 Hz, 2H), 3.58 (dd, J=4.1, 1.7 Hz, 4H), 3.57 (s, 4H), 3.55 (s, 4H), 3.39 (t, J=6.3 Hz, 2H), 2.54 (t, J=6.3 Hz, 2H). MS (ESI): [M+Na] 353.0414.
(10)化合物120の合成:化合物115(2.0g、4.9mmol)及び化合物119(2.0g、5.9mmol)を40mL乾燥ジクロロメタンに溶解し、ヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシリピロールアルキル基(5.1g、9.8mmol)及び乾燥トリエチルアミン(1.4mL、9.8mmol)を加え、室温下で1時間反応させ、反応終了後、反応系に100mL水を加え、ジクロロメタン及び水で3回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧回転蒸発により溶媒を除去し、乾式カラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:CH3OH=100:3)により分離することで、黄色液体である化合物120(2.2g、62%)を得た。1H NMR (400mHz, CDCl3): δ= 7.71 (s, 1H), 7.45 (d, J=7.0 Hz, 2H), 7.39 (t, J=7.2 Hz, 3H), 6.95 (s, 1H), 5.18 (s, 2H), 4.42 (m, 1H),4.13 (q, J=13.6 Hz, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.68 - 3.63 (m, 2H), 3.62 - 3.55 (m, 4H), 3.58-3.53 (m, 12H), 3.37 (t, J=6.3 Hz, 2H),2.43 (t, J=5.8 Hz, 2H). MS (ESI): [M+Na] 741.1529.
(11)化合物121の合成:化合物120(2g、2.8mmol)を20mLトリフルオロ酢酸に溶解し、45℃下8時間反応させ、反応終了後、減圧下で回転蒸留によりトリフルオロ酢酸を除去し、ジクロロメタン及び水で3回抽出し、有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で回転蒸発により溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:CH3OH=25:1)により分離することで、黄色液体である化合物121(1.4g、82%)を得た。1H NMR (400mHz, CDCl3): δ=7.60 (s, 1H), 6.79 (s, 1H), 4.73-4.66 (m, 1H), 3.99 (d, J=12.9 Hz, 2H), 3.97 (s, 3H),3.73 (s, 3H), 3.70 (d, J=6.3 Hz, 2H), 3.62 - 3.55 (m, 4H), 3.58-3.53 (m, 12H), 3.37 (t, J=6.3 Hz, 2H),2.43 (t, J=5.8 Hz, 2H). MS (ESI): [M+Na] 651.1026.
(12)化合物122の合成:化合物121(0.5g、0.8mmol)を400mLアセトンに溶解し、炭酸カリウム(0.2g、1.6mmol)を加え、75℃で還流しながら4時間反応させ、反応終了後、減圧濾過により不溶物を除去した後、回転乾燥によりアセトンを除去し、カラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:CH3OH=25:1)により分離することで、黄色固体である化合物122(0.27g、61%)を得た。1H NMR (400mHz, DMSO): δ= 7.71 (s, 1H), 7.17 (s, 1H),4.76 (s, 2H), 4.42 (m, 1H),3.97 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.72 (d, J=6.3 Hz, 2H), 3.62 - 3.55 (m, 4H), 3.52-3.39 (m, 14H), 2.49 - 2.35 (m, 2H). MS (ESI): [M+Na] 569.1782.
(13)化合物123の合成:化合物122(0.2g、3.7mmol)を20mL無水エチレンジアミンに溶解し、室温下で6時間反応させ、反応終了後、減圧下で回転蒸留によりエチレンジアミンを除去し、乾式カラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:CH3OH:トリエチルアミン=100:8:0.5)により分離することで、黄色粉末である化合物123(0.19g、89%)を得た。1H NMR (400mHz, DMSO): δ= 7.71 (s, 1H), 7.17 (s, 1H),4.76 (s, 2H), 4.42 (m, 1H),3.97 (s, 3H),3.72 (d,J=6.3 Hz, 2H), 3.62 - 3.55 (m, 2H), 3.52-3.39 (m, 16H), 2.86 (d, J=7.6 Hz, 2H), 2.76 (d, J=7.6 Hz, 2H), 2.49 - 2.35 (m, 2H). MS (ESI): [M+Na] 597.2211.
(2)成分A-89の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物124(111mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-89(1.82g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物124の標識率は約3.15%であった。
(2)成分A-90の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物125(111mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-90(1.87g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物125の標識率は約3.27%であった。
(2)成分A-91の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物126(118mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-91(1.73g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物126の標識率は約3.14%であった。
(2)成分A-93の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物128(118mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-93(1.73g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物128の標識率は約3.15%であった。
(2)成分A-94の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物129(115mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-94(1.84g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物129の標識率は約2.47%であった。
(2)成分A-95の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物130(115mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-95(1.75g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物130の標識率は約3.07%であった。
(2)成分A-98の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物133(106mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-98(1.78g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物133の標識率は約3.31%であった。
(2)成分A-99の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物134(115mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-99(1.84g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物134の標識率は約3.06%であった。
(2)成分A-100の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物135(124mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-100(1.84g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物135の標識率は約3.16%であった。
(2)成分A-101の合成:ヒアルロン酸Hyaluronic acid(2g、340kDa)を100mL 0.01mol/L 2-(N-モルホリン)エタンスルホン酸MES緩衝液(pH=5.2)に溶解し、完全に溶解するまで撹拌し、化合物136(132mg、0.2mmol)を秤量して10mLジメチルスルホキシドDMSOに溶解した後、前記反応液に加え、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩DMTMM(0.4g、1.5mmol)を秤量して3mL MES緩衝液に溶解し、3回で(1時間ごとに1回)前記反応液に加え、35℃下で24時間反応させた。その後、反応液を透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、脱イオン水により2-3日透析し、凍結乾燥することにより、感光性ヒアルロン酸誘導体A-101(1.77g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物136の標識率は約3.21%であった。
(2)成分A-104の合成:1gキトサンを75mLイソプロパノールに入れてキトサンの懸濁液を形成し、その後、化合物137(0.2g、0.35mmol)、EDC-HCl(0.76g、3.96mmol)及びNHS(0.46g、4.0mmol)を順に前記溶液に加え、室温で48時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、塩化ナトリウムを含む希塩酸溶液(pH=3.5)で1日透析した後、さらに純水で1日透析し、凍結乾燥することにより、感光性キトサン誘導体A-104(0.82g)を得た。その1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物137の修飾度は約12.5%であった。
(2)成分A-105の合成:PEG-4OH(1g、0.05mmol)を無水アセトニトリルに溶解し、K2CO3(55.3mg、0.4mmol)を加えて30分間撹拌した後、化合物138(0.23g、0.4mmol)を加え、室温下で24時間反応させ続けた。反応終了後、ほとんどの溶媒を除去し、ジエチルエーテル中で再沈殿させ、複数回洗浄し、吸引濾過し、乾燥させることにより、感光性ポリエチレングリコール誘導体A-105(0.85g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物138の修飾度は約95.3%であった。
(2)成分A-106の合成:化合物139(0.28g、0.63mmol)、コモノマーPEG-MA(0.882g、2.52mmol)及び開始剤であるアゾビスイソブチロニトリル(11mg)を秤量してシュレック管に加え、無水THFを加えて溶解し、複数回の凍結-真空引きの循環操作により処理した後、この反応系を75℃の条件下で24時間反応させた。反応終了後、反応液を冷ジエチルエーテルに入れ、複数回の再沈殿により精製し、感光性共重合体誘導体A-106(0.85g)を得た。1H-NMRスペクトルに基づいて算出された化合物139の共重合体における含有量は約15.4%であった。GPCにより測定された合成高分子の分子量は約25kDaであった。配合比により計算した結果、nは12、xは10、yは40であった。
本発明方法により37℃で表1に示される異なるヒドロゲル前駆体溶液を製造した。
レオロジー分析は、HAAKE MARSレオメーターを用い、37℃のテストプラットフォーム(φ=20mm)上でレオロジー試験を行った。本実施例において、ヒドロゲルのゲル化時間及び貯蔵弾性率に対する紫外光照射時間、光照射強度及び高分子誘導体の質量濃度の影響を検討した。図1は、実施例1で製造された成分A-1(即ち、HA-NB)、実施例107で製造された成分A-107(即ち、HAMA)、成分C-4(即ち、ゼラチン)、実施例155で製造された成分B-2(即ち、LAP)、実施例88で製造された成分A-88(即ち、HA-cNB)、実施例144で製造された成分A-144(即ち、HA-cNB-MA)、実施例155で製造された成分B-2(即ち、LAP)で調製されたヒドロゲル前駆体溶液の光照射でのゲル化曲線(レオロジー試験において、G’は貯蔵弾性率、G’’は損失弾性率であり、G’がG’’を超えた時点はゲル点である)である。従って、ゲル化速度及びゲル強度のいずれにも、単なるラジカル重合架橋及び光結合架橋により構築されるヒドロゲルの性能よりも優れている。図1から分かるように、溶液は約2sの時点でゲル化し始め、約10sの時点で完全にゲル化し、かつ完全にゲル化した時の弾性率は3500-10000Paに達した。さらに、ゲルの強度は、ゲル溶液の質量濃度に比例し、ゲルの質量濃度が高ければ高いほど、得られたゲルの強度が高くなる。他の異なる材料組成を有するヒドロゲル系のゲル点及びゲル強度は異なっており、具体的なデータを表2に示す。
新鮮な豚腸ケーシングをいくつか取り、3.5cm×2.5cmのケーシング片に切り出した。次いで、502接着剤によりそれを6.5cm×2.5cmの強化ガラススライスに固定した。1つのガラススライスを取り、そこに接着された腸ケーシングの表面に一定成分のヒドロゲル前駆体溶液を150μL塗布した。次に、もう1つの強化ガラススライスを取り、腸ケーシングの位置が完全に対向するように、ヒドロゲル前駆体溶液が塗布されたガラススライス上に置いた。その後、押し出された過剰なヒドロゲル前駆体溶液を取り除いた。次に、395nm LED光源(20mW/cm2)を用いて腸ケーシングの部位に対して5分間照射することにより、ヒドロゲル前駆体溶液を2つの腸ケーシングの間でインサイチュゲル化させた。完全にゲル化した後、ガラススライスの一端を垂直固定し、他端をひもを介して水を入れる容器に接続させた。ついで、2つのガラススライスが断裂するまで容器に水を入れ続きた。その後、断裂した時の水及び容器の質量を記録し、重力、即ちガラススライスが断裂した時の引張力Fに換算し、以下の算式によりヒドロゲルの組織接着力を算出した。
ヒドロゲルの組織接着力=F/A
式中、Aは腸ケーシングの接着面積である。試験装置の模式図は図2に示される。他の異なる材料組成を有するヒドロゲル系の組織接着力は異なっており、具体的なデータを表3に示す。
力学的性能試験(引張試験及び圧縮試験を含む)は、GT-TCS-2000引っ張り試験機を用いて行った。引張試験の場合、長さ20mm、幅3mm、厚さ2mmのダンベル型試験片を用い、試験速度を5mm/minに設定した。圧縮試験の場合、直径10mm、高さ3mmの円柱状試験片を用い、試験速度を1mm/minに設定した。実施例1で製造された成分A-1(即ち、HA-NB)、実施例107で製造された成分A-107(即ち、HAMA)、成分C-4(即ち、ゼラチン)、実施例155で製造された成分B-2(即ち、LAP)、実施例88で製造された成分A-88(即ち、HA-cNB)、実施例144で製造された成分A-144(即ち、HA-cNB-MA)、実施例155で製造された成分B-2(即ち、LAP)を例としてヒドロゲルの引張特性及び圧縮性能を測定した。図3から分かるように、ヒドロゲル(HA-NB/HAMA/Gelatin/LAP)は、約75%まで圧縮されることができ、圧縮強度が約2MPaであり、ヒドロゲル(HA-cNB/HA-cNB-MA/LAP)は、約88%まで圧縮されることができ、圧縮強度が約1MPaである。他の異なる材料組成を有するヒドロゲル系の力学的性能は異なっており、具体的なデータを表4に示す。
本実験において、実施例1で製造された成分A-1(即ち、HA-NB)、実施例107で製造された成分A-107(即ち、HAMA)、成分C-4(即ち、ゼラチン)、実施例155で製造された成分B-2(即ち、LAP)、実施例88で製造された成分A-88(即ち、HA-cNB)、実施例144で製造された成分A-144(即ち、HA-cNB-MA)、実施例155で製造された成分B-2(即ち、LAP)を例として、CCK-8キットにより評価した。まず、96ウェルプレートに5×103細胞/ウェルの密度で線維芽細胞HDFを接種した後、培地を加え、37℃/5%CO2の条件下で24時間培養した。各群のサンプルを細胞培養液に溶解し、細胞が培養されているウェルプレートに加え、引き続き24時間培養した後、ウェルにおける細胞液を吸い出し、各ウェルに100μLの培地及び10μLのCCK-8溶液を加え、引き続き細胞を2時間インキュベートした。最後に、マイクロプレートリーダーにより各ウェルについて450nmでの吸光度を測定した。細胞生存率を下式にて算出した。
細胞生存率(%)=(実験群の吸光度の平均値/対照群の吸光度の平均値)×100%
図4から分かるように、この光架橋性ヒドロゲルは、比較的良好な生体適合性を有する。
他の異なる材料組成を有するヒドロゲル系の生体適合性は異なっており、具体的なデータを表5に示す。
実験において、SDラットの背部皮膚において直径1.8cmの皮膚完全欠陥傷口を作った。そして、400μLのヒドロゲル前駆体溶液(2%成分A-1/1%成分A-107/6%成分C-4/0.2%成分B-2)を傷口部位に充填した。この溶液が良好な流動性を有するので、傷口は、ヒドロゲル前駆体溶液に十分に充填、浸透され得る。次いで、395nm LED光源の照射により、皮膚の欠陥部位にインサイチュでヒドロゲルを形成することで創面閉鎖を実現した(図5)。さらに、インサイチュで成形されたヒドロゲル、事前に成形されたヒドロゲル、及び生理食塩水のみでの洗浄処理によるSDラットの背部皮膚傷口の7日内の修復効果を比較した結果、インサイチュで成形されたヒドロゲルによる傷口修復の速度は、他の2群よりも明らかいに速く、7日目における傷口の収縮面積が最も大きく、良好な修復効果を奏した。それに対し、事前に成形されたヒドロゲル材料は、傷口部位に十分に充填されにくかった。また、組織間には共有結合による隙間のない界面がないため、良好な組織統合性を有しない。新生細胞及び組織はヒドロゲル材料に速く入って足場材料としての作用を十分に発揮することが困難である。従って、事前に成形されたヒドロゲルの修復速度及び効果は、インサイチュで成形されたヒドロゲルよりも悪い。ヒドロゲルに充填されていない傷口の修復速度が最も遅く、光架橋性ヒドロゲルは細胞足場材料として傷口の修復に対して促進作用を有することを示している。
実験において、SDラットを用いて腹壁-盲腸摩擦による腹腔内癒着モデルを構築した。盲腸は、腹腔内で最も太く、通路が最も多く、血管分布が最も豊富な部分であるため、その対応する腹壁に損傷が発生したままで措置を取らない場合、腹腔内癒着の発生確率が極めて高いため、構築される癒着モデルは安定的である。手術の過程において、ヒドロゲル前駆体溶液(2%成分A-1/1%成分A-107/6%成分C-4/0.2%成分B-2)は、盲腸及び腹壁の傷口を十分に覆うことができ、垂直な組織面には光照射によるゲル化に十分な時間停滞することができる。30秒光照射後、得られたヒドロゲルが創傷部位に固定され、外科用メスで一定の力を加えてもヒドロゲルを創傷部位から剥離することができない。ヒドロゲル前駆体溶液を投与してから完全にゲル化するまでは1分間以内に制御することができる(図6)。手術後、無菌の環境下で前記SDラットを14日飼育した後、再度SDラットの腹腔を開き、腹腔内癒着状況を記録した。ヒドロゲルで処理された実験群の10匹ラットの中で、8匹は14日後に腸-腹壁癒着及び腸-腸癒着が発生せず、1匹は腹壁と盲腸の間に中程度の癒着が発生し、1匹は腸と腸の間に薄い癒着が発生した。また、前記腸-腹壁癒着が発生しなかった9匹のSDラットには、何らのヒドロゲル残留も観察されず、腹壁の傷口は完全に癒合した。それに対し、対照群の10匹ラットは、いずれも重度の腹壁-盲腸癒着が発生した。次に、実験群及び対照群の手術による傷口部位の組織切片に対してH&E染色により組織学的分析を行った。実験群のSDラットでは、14日後に盲腸及び腹壁の損傷がほぼ完全に回復し、表層が再上皮化した。一方、対照群のSDラットでは、14日後に盲腸の平滑筋と腹壁の筋肉組織とが完全に融合し、線維芽細胞及び炎症細胞が癒着部位に堆積していた。
実験において、SDラットの口腔に直径1.0cmの口腔潰瘍欠陥傷口を作った。次いで、200μLヒドロゲル前駆体溶液(2%成分A-1/1%成分A-107/6%成分C-4/0.2%成分B-2)を傷口部位に充填した。この溶液が良好な流動性を有するので、傷口は、ヒドロゲル前駆体溶液に十分に充填、浸透され得る。次いで、395nm LED光源の照射により、口腔の欠陥部位にインサイチュでヒドロゲルを形成することで口腔創面の閉鎖を実現した。接下来,さらに、インサイチュで成形されたヒドロゲル、事前に成形されたヒドロゲル、及び生理食塩水のみでの洗浄処理によるSDラット口腔傷口の7日内の修復効果を比較した結果、インサイチュで成形されたヒドロゲルによる傷口修復の速度は、他の2群よりも明らかいに速く、7日目における傷口の収縮面積が最も大きく、良好な修復効果を奏した。それに対し、事前に成形されたヒドロゲル材料は、傷口部位に十分に充填されにくかった。また、組織間には共有結合による隙間のない界面がないため、良好な組織統合性を有しない。新生細胞及び組織はヒドロゲル材料に速く入って足場材料としての作用を十分に発揮することが困難である。従って、事前に成形されたヒドロゲルの修復速度及び効果は、インサイチュで成形されたヒドロゲルよりも悪い。ヒドロゲルに充填されていない傷口の修復速度が最も遅く、光架橋性ヒドロゲルは細胞足場材料として口腔潰瘍の修復に対して促進作用を有することを示している。
ニュージーランド雄白ウサギを用い、2群(a:ヒドロゲル処理(2%成分A-1/1%成分A-107/6%成分C-4/0.2%成分B-2)群、b:非処理対照群)に分けて盲腸浸漏封止実験を行った。実験において、ウサギの盲腸に浸漏モデルを作り、次いでヒドロゲル前駆体溶液を傷口に塗り、十分に浸透させた後、光照射によりインサイチュでゲル化した。これによって、ゲル化後のヒドロゲルは、別途に固定せず、欠陥部位に強固に粘着することができる。手術から4週間後、空気を静脈注射することで実験ウサギを安楽死させ、盲腸を摘出し、修復効果を評価した。結果として、ヒドロゲルにより閉鎖した盲腸には浸漏が発生しなかった一方、ヒドロゲルで処理されていない盲腸には重度の浸漏が発生した。数週間の修復の後、ヒドロゲルで処理された盲腸の欠陥部位は顕著に修復されたので、ヒドロゲルは、浸漏を効果的に閉鎖するとともに、術後損傷組織の修復に有利であることを示している。
ニュージーランド雄白ウサギを用い、3群(a:ヒドロゲル処理(2%成分A-1/1%成分A-107/6%成分C-4/0.2%成分B-2)群、b:手術縫合線処理群、c:未処理対照群)に分けられ手術縫合実験を行った。実験において、ウサギの腹部に傷口縫合モデルを作った。a群では、ヒドロゲル前駆体溶液を傷口に塗り、十分に浸透させた後、光照射によりインサイチュでゲル化することにより、傷口の閉鎖を実現した。ヒドロゲルの優れた組織接着力により、組織縫合の効果が達成される。b群では、通常の手術縫合線で傷口を処理した。c群では、傷口を処理しなかった。手術から2週間後、空気を静脈注射することで実験ウサギを安楽死させ、修復効果を評価した。結果として、ヒドロゲルで処理された傷口は、手術縫合線群とほぼ同じ程度の良好な縫合効果を示した一方、処理されていない傷口は、効果的に接合することができなかった。4週間の修復の後、ヒドロゲルで処理された欠陥部位の組織は、接合し、顕著な修復効果が得られた。従って、ヒドロゲルは、傷口を効果的に縫合するとともに、術後損傷組織の修復に有利であることを示している。
SDラットを用いてヒドロゲルの止血効果を評価した。3群(a:ゼラチンスポンジ群、b:ヒドロゲル処理(2%成分A-1/1%成分A-107/6%成分C-4/0.2%成分B-2)群、c陽性対照群)に分けて肝臓止血実験を行った。実験ラットを抱水クロラール(4%水溶液)の腹腔注射(注射量:0.9ml/100g)により麻酔した後、シェーバーを用いてラット前胸部位の毛を完全に剃り、ヨードチンキで消毒した。次いで、胸腔の中線に沿って約4cm切開し、胸腔を開いて肝臓部位を露出させた。肝臓の左葉に約2cmの切り口を作った。a群では、ゼラチンスポンジで止血した。b群では、切り口にヒドロゲル前駆体溶液を加えて切り面を覆い、395nm LEDで2分間照射することでゲル化して止血した。c群では、処理せず、肝臓の切り口で滲み出た血を自然に凝固させ、ガーゼで滲み出た血を取り除いた後、減量法により出血量及び出血時間を記録した(図7)。実験終了後、a群では、切り面のゼラチンスポンジをラット体内に残して縫合した。b群では、ヒドロゲルが切り口のインサイチュで架橋することで切り面の傷口を離間し、肝臓を胸腔に戻して縫合した。c群では、処理せずにそのまま縫合した。14日後、SDラット肝臓の回復状況を観察した。過量の麻酔剤である抱水クロラール(4%水溶液、2.7ml/100g)を腹腔注射することでラットを安楽死させ、胸腔中線に沿って胸腔を開き、3軍のラット肝臓の回復状況を観察し、写真を撮って記録した。また、肝臓損傷部位に組織をサンプリングし、4%ホルマリン溶液で2日固定し、脱水処理後、パラフィン包埋を行い、スライサーを用いて組織切片(厚さ:5μm)を作った。最後にサンプルをH&E染色し、光学顕微鏡で撮影して観察、記録した。実験結果として、b群では、肝臓の回復状況が良好であり、ヒドロゲルが完全に分解し、癒着の発生がなく、肝臓の切り口に新生肝臓組織が形成された。a群では、ラット体内のゼラチンスポンジが分解せず、ラットの臓器と網膜の癒着がひどかった。c群では、肝臓と網膜の癒着が広範囲で存在していた。実験群では、H&E染色後、肝臓表面が滑らかで潤いがあり、血管の分布が豊富で、肝臓の界面がはっきり見えた一方、癒着が発生した肝臓は、H&E染色後、肝臓の界面に凹凸があり、肝臓と網膜組織が癒着し、界面に炎症細胞が堆積していた。
ニュージーランド雄白ウサギを用い、3群(a:ヒドロゲル処理(2%成分A-1/1%成分A-107/6%成分C-4/0.2%成分B-2)群、b:ボーンワックス処理群、c:未処理対照群)に分けて骨断面止血実験を行った。実験において、ウサギの大腿骨に骨断面出血モデルを構築した。a群では、ヒドロゲル前駆体溶液を傷口に塗り、十分に浸透した後、光照射によりインサイチュでゲル化させることにより、骨断面出血に対する効果的な閉鎖が実現され、ヒドロゲルの優れた組織接着力及び光硬化速度により、タイムリーかつ効果的な止血効果を奏した。b群では、通常のボーンワックスで出血傷口を処理した。c群では、出血傷口を処理しなかった。手術から8週間後、空気の静脉注射により実験ウサギを安楽死させ、サンプリングして修復効果を評価した。結果として、ヒドロゲルで処理された傷口は効果的に止血され、ボーンワックス群の効果とほぼ同じであった一方、処理されていない傷口には持続的な出血があった。2週間の修復により、元の傷口出血部位は、ヒドロゲル処理により組織が顕著に回復したのに対し、ボーンワックスで処理された傷口は回復しておらず、これは、主にボーンワックスが体内で分解しないからである。しかし、ヒドロゲルは、骨断面の止血を効果的に達成できるとともに、術後の損傷組織の修復に有利である。
ニュージーランド雄白ウサギを用い、3群(a:ヒドロゲル処理(2%成分A-1/1%成分A-107/6%成分C-4/0.2%成分B-2)群、b:止血鉗子処理群;c:未処理対照群)に分けて動脈止血実験を行った。実験において、ウサギの大腿動脈に出血モデルを構築した。a群では、ヒドロゲル前駆体溶液を傷口に塗り、十分に浸透させた後、光照射によりインサイチュでゲル化させることで、大腿動脈出血に対する効果的な閉鎖が実現され、ヒドロゲルの優れた組織接着力及び光効果速度により、タイムリーかつ効果的な止血効果を奏した。b群では、通常の止血鉗子で出血傷口を処理した。c群では、出血傷口を処理しなかった。手術から2週間後、空気の静脉注射により実験ウサギを安楽死させ、サンプリングして修復効果を評価した。結果として、ヒドロゲルで処理された傷口は効果的に止血され、止血鉗子による効果とほぼ同じであった一方、処理されていない傷口には持続的な出血があった。2週間の修復により、元の傷口出血部位は、ヒドロゲル処理により組織が顕著に回復したので、ヒドロゲルは、大腿動脈の止血を効果的に達成できるとともに、術後の損傷組織の修復に有利である。
ニュージーランド雄白ウサギを用い、3群(a:ヒドロゲル処理(2%成分A-1/1%成分A-107/6%成分C-4/0.2%成分B-2)群、b:ゼラチンスポンジ処理群、c:未処理対照群)に分けて心臓止血実験を行った。実験において、ウサギの心臓に出血モデルを構築した。a群では、ヒドロゲル前駆体溶液を傷口に塗り、十分に浸透させた後、光照射によりインサイチュでゲル化させることで、心臓出血に対する効果的な閉鎖が実現され、ヒドロゲルの優れた組織接着力及び光効果速度により、タイムリーかつ効果的な止血効果を奏した。b群では、通常のゼラチンスポンジで出血傷口を処理した。c群では、出血傷口を処理しなかった。手術から2週間後、空気の静脉注射により実験ウサギを安楽死させ、サンプリングして修復効果を評価した。結果として、ヒドロゲルで処理された傷口は効果的に止血され、ゼラチンスポンジによる止血効果よりよい一方、処理されていない傷口には持続的な出血があった。2週間の修復により、元の傷口出血部位は、ヒドロゲル処理により組織が顕著に回復し、且つ修復効果がゼラチンスポンジよりよいので、ヒドロゲルは、心臓止血を効果的に達成できるとともに、術後の損傷組織の修復に有利である。
ニュージーランド雄白ウサギを用い、3群(a:軟骨細胞が包まれたヒドロゲル(2%成分A-1/1%成分A-107/6%成分C-4/0.2%成分B-2)群、即ちGel+軟骨細胞群;b:単なるヒドロゲル(2%成分A-1/1%成分A-107/6%成分C-4/0.2%成分B-2)群、即ち、Gel群;c:未処理対照群、即ち、Control群)に分けて関節軟骨の修復実験を行った。実験において、ヒドロゲル前駆体溶液は、十分に浸透してウサギの関節軟骨の欠陥部位に充填することができ、光照射によりゲル化した後、別途に固定される必要がなく、欠陥部位に強固に粘着することができる。手術から12週間後、空気を静脈注射することで実験ウサギを安楽死させ、損傷関節を摘出し、修復効果を評価した。ウサギ関節軟骨の損傷部位の写真結果から分かるように、12週間後、Gel+軟骨細胞群では、関節欠陥部位に滑らかな新生軟骨組織が形成され、古い軟骨組織と良好に融合した。Gel群では、軟骨もある程度に修復されたが、手術による軟骨創傷の輪郭が依然として見られた。Control群では、軟骨組織は、ほぼ修復されておらず、損傷部位に明らかな穴が残っていた。次いで、H&E染色法により前記各群軟骨の修復状況を評価した。H&E染色結果として、Gel+軟骨細胞群及びGel群は、いずれも新生組織が形成され、古い軟骨組織と良好に融合したが、Gel+軟骨細胞群の新生組織は、厚さがGel群よりよく、且つ表面が平らであり、Control群では、明らかな新生組織が発見されにくかった。さらに、サフラニンO及び免疫組織化学染色法により新生軟骨の成分を分析した。Gel+軟骨細胞群及びGel群の新生軟骨組織は、いずれもサフラニンO染色活性を示しており、該新生軟骨組織内に正常軟骨の糖タンパク質成分が含まれることを示している。また、Gel+軟骨細胞群及びGel群の新生軟骨組織は、いずれもII型コラーゲンの染色活性を示しており、該軟骨組織に大量のII型コラーゲンが含まれることを示している。前記サフラニンO及び免疫組織化学染色の結果は、新しい光架橋性ヒドロゲル材料により軟骨を修復することにより、新たに形成された軟骨組織は透明な軟骨であることを証明した。
SDラットを用い、ランダムに3群(a:ヒドロゲル(2%成分A-1/1%成分A-107/6%成分C-4/0.2%成分B-2)+ヒドロキシアパタイトの実験群、b:ヒドロゲル処理(2%成分A-1/1%成分A-107/6%成分C-4/0.2%成分B-2)群、c:未処理対照群)に分けて頭蓋骨修復実験を行った。実験において、4%の抱水クロラール溶液(0.9mL/g(体重))で腹腔麻酔し、ヨードチンキで消毒した。その後、外科用メスを用いてラット頭蓋骨の頭皮を開いた。歯リングドリルを用いてラットの頭蓋骨に左右対称的に直径5mmの完全頭蓋骨欠陥モデルを構築した。実験群では、200μLのヒドロゲル前駆体溶液をSDラットの頭蓋骨欠陥部位に充填し、傷口の縁に浸透させ、395nm LED光源(20mW/cm2)で30秒照射することで完全にゲル化させ、最後に縫合線でラットの頭皮を縫合した。対照群では、SDラット頭蓋骨欠陥モデルを構築した後、いかなる処理せずに、そのまま頭皮を縫合した。前記SDラットを無菌、37℃の環境で8週間飼育した。その後、micro-CT走査結像により各群のSDラット頭蓋骨の修復状況を評価した。結果として、未処理対照群では、SDラットの頭蓋骨欠陥はほぼ修復されておらず、ヒドロゲルで充填された頭蓋骨欠陥部位の縁には新し骨が形成されたが、新生骨組織の量が小さく、ほとんどの欠陥部位は良好に修復されていないのに対して、ヒドロゲル+ヒドロキシアパタイトで充填された頭蓋骨欠陥位置は、ほぼ修復されており、大量の新生骨組織が欠陥部位に形成された。次いで、Van Gieson染色法により頭蓋骨の組織切片に対して組織学染色分析を行った。結果として、ヒドロゲル+ヒドロキシアパタイトで処理されたSDラットの頭蓋骨欠陥部位に完全な新生骨組織が形成された一方、ヒドロゲルのみで処理された頭蓋骨欠陥部位に少量の新生骨組織しか形成されず、ほとんどの欠陥部位での骨組織は依然として欠陥状態であった。対照群では、新生骨組織がほぼ形成されなかった。この組織染色結果は、ヒドロキシアパタイトが包まれたヒドロゲルが骨欠陥に対して良好な修復効果を有することをさらに実証した。
ブタを動物モデルとし、軟骨材料としてヒドロゲル+軟骨細胞、骨材料としてヒドロゲル+ヒドロキシアパタイト+BMSCを用い、2群(a:それぞれ軟骨細胞及びBMSCが包まれたヒドロゲル(2%成分A-1/1%成分A-107/6%成分C-4/0.2%成分B-2)群、即ち、Gel+細胞群;b:単なるヒドロゲル(2%成分A-1/1%成分A-107/6%成分C-4/0.2%成分B-2)群、即ち、Gel群)に分けて関節骨/軟骨複合欠陥の修復実験を行った。実験において、まず骨材料を骨欠陥部位に充填し、ゲル前駆体溶液を十分に浸透させ、光照射によりゲル化させることにより、ヒドロゲルは骨欠陥部位に強固に粘着し、次いで、軟骨材料を軟骨欠陥部位に充填し、光照射によりゲル化させることにより、軟骨欠陥部位に強固に粘着した(図8)。手術から6ヶ月後、実験用ブタを安楽死させ、損傷関節を摘出して修復効果を評価した。Gel+細胞群では、関節欠陥部位に滑らかな新生軟骨組織及び骨組織が形成され、古い軟骨/骨組織と良好に融合するとともに、軟骨組織と骨組織も良好に融合した。Gel群では、骨/軟骨組織は、ほぼ修復されず、損傷部位には依然として明らかな穴が残っていた。次いで、H&E染色法により前記各群軟骨の修復状況を評価した。H&E染色の結果として、Gel+細胞群では、新生組織が形成され、古い軟骨組織と良好に融合した一方、Gel群では、明らかな新生組織が発見されにくかった。さらに、サフラニンO及び免疫組織化学染色法により新生軟骨の成分を分析した。Gel+細胞群では、新生軟骨組織は、サフラニンO染色活性を示しており、該新生軟骨組織内に正常軟骨の糖タンパク質成分が含まれることを示している。また、Gel+細胞群の新生軟骨組織は、II型コラーゲンの染色活性を示しており、該軟骨組織に大量のII型コラーゲンが含まれることを示している。前記サフラニンO及び免疫組織化学染色の結果は、新しい光架橋性ヒドロゲル材料により軟骨を修復することにより、新たに形成された軟骨組織は透明な軟骨であることを証明した。次いで、Van Gieson染色法により骨の組織切片に対して組織学染色分析を行った。結果として、Gel+細胞群では、骨欠陥部位に少量の新生骨組織しか形成されず、ほとんどの欠陥部位での骨組織は依然として欠陥状態であった。この組織染色結果は、細胞を含むヒドロゲルが骨欠陥に対して良好な修復効果を有することをさらに実証した。
3Dプリント技術は、近年急速に発展している三次元成形技術であり、既に幅広く使用されている。現在、3Dプリント技術は、熱溶解積層(FDM)、光硬化成形(SLA)、レーザー焼結(SLS)、連続液面製造(CLIP)等を含む。しかし、細胞プリントに適した方式は、主にFDM方式である。細胞プリントの材料は、主にヒドロゲル材料であるため、3Dプリント用のバイオインク-印刷可能なヒドロゲル材料の開発及びヒドロゲル材料のプリント解像度の向上は、当分野の基本的な問題となっている。実施例1で製造された成分A-1(即ち、HA-NB)、実施例107で製造された成分A-107(即ち、HAMA)、成分C-4(即ち、ゼラチン)、実施例155で製造された成分B-2(即ち、LAP)、実施例88で製造された成分A-88(即ち、HA-cNB)、実施例144で製造された成分A-144(即ち、HA-cNB-MA)、実施例155で製造された成分B-2(即ち、LAP)を例として、一定の質量濃度のヒドロゲル前駆体溶液を細胞と均一に混合した後、低温プリントバレルに入れ、プリント温度を約25℃に制御し、最適なプリント状態を得るために、温度の調整によりバイオインクの粘度を調整した。その後、適切なプリント圧力及びプリント速度を確定して異なる構造のバイオプリントを行い、プリント終了後、光照射によりヒドロゲルを架橋させる(又はプリントしながら光を照射する)ことにより細胞が含まれかつ構造を有するヒドロゲルを得た後、3D細胞培養を行った(図9)。
DLP(デジタル光処理)3Dプリント技術は、近年開発されてきた新しい光硬化印刷方式であり、SLA(三次元光硬化成形)型のプリンターに比べて、DLPは、速いプリント速度及び高い解像度によりほとんどの印刷方式が比較できない優位性を有する。現在、歯科モデル、ジュエリーデザインなどの分野にはある程度の見通しがある。市販されているプリントインクは、光硬化樹脂のみであり、ヒドロゲルは、新しいバイオインクとしてまだ注目されておらず、特にDLPプリントに適したヒドロゲル材料がないからである。本発明の複合型光架橋性ヒドロゲル材料は、速い光硬化速度、優れた機械的特性により3Dプリントに非常に適するとともに、より高いプリント精度を有する。実施例1で製造された成分A-1(即ち、HA-NB)、実施例107で製造された成分A-107(即ち、HAMA)、成分C-4(即ち、ゼラチン)、実施例155で製造された成分B-2(即ち、LAP)、実施例88で製造された成分A-88(即ち、HA-cNB)、実施例144で製造された成分A-144(即ち、HA-cNB-MA)、実施例155で製造された成分B-2(即ち、LAP)を例として、一定の質量濃度のヒドロゲル前駆体溶液を細胞と均一に混合した後、液体タンクに入れ、最適なプリント状態を得るために、光源の強度、露出時間などのパラメーターを調整することでバイオインクのプリント状況を調整するした。それによって、細胞が含まれかつ構造を有するヒドロゲルを得、3D細胞培養の研究を行うことができる。
ヒドロゲルは、水中で膨潤可能であるが、溶解しない架橋高分子ネットワークである。ほとんどヒドロゲルは水で構成されるため、非常に良好な生体適合性を有し、特に薬物及び生物活性大分子の担体として適用される。ヒドロゲル材料中に包まれた薬物又は生物活性大分子は、分子の拡散散作用及び材料の分解作用により薬物の徐放効果を実現する。以下、薬物の被覆及び放出を例として説明する。実施例1で製造された成分A-1(即ち、HA-NB)、実施例107で製造された成分A-107(即ち、HAMA)、成分C-4(即ち、ゼラチン)、実施例155で製造された成分B-2(即ち、LAP)、実施例88で製造された成分A-88(即ち、HA-cNB)、実施例144で製造された成分A-144(即ち、HA-cNB-MA)、実施例155で製造された成分B-2(即ち、LAP)を例として、生理食塩水に溶解し、一定の質量濃度のヒドロゲル前駆体溶液を調製し、一定量の薬物分子を加え、200μLの前記溶液を円形金型に入れ、光照射によりヒドロゲルを形成し、次いで、24ウェル細胞培養プレートに入れ、一定量の生理食塩水を加えて薬物放出実験を行った。UV照射試験により溶液における薬物の放出量を分析し、それに基づいて薬物放出に対するこの材料の効果を評価した。
Claims (11)
- 請求項1に記載の環状o-ニトロベンジル系光トリガーの構造を含む感光性高分子誘導体であって、
前記感光性高分子誘導体は、以下の成分A-88から成分A-106の構造からなる群より選択され、
- 請求項1に記載の環状o-ニトロベンジル系光トリガーの構造を含む感光性高分子誘導体であって、
前記感光性高分子誘導体は、以下の成分A-144から成分A-154の構造からなる群より選択され、
- 成分A-感光性高分子誘導体を生体適合性媒体に溶解して感光性高分子溶液Aを得るステップと、
成分B-光開始剤を生体適合性媒体に溶解して光開始剤溶液Bを得るステップと、
溶液A及び溶液Bを均一に混合してヒドロゲル前駆体溶液を得、光源でヒドロゲル前駆体溶液を照射することにより、成分Aにおけるo-ニトロベンジル系光トリガー及び成分B-光開始剤は光照射下でそれぞれラジカル架橋が生じることで、ヒドロゲルが形成されるステップと、
を含む光架橋性ヒドロゲル材料の製造方法であって、
前記成分A-感光性高分子誘導体は、請求項2及び請求項3に記載の感光性高分子誘導体から選択され、
成分B-光開始剤、即ち、光照射によりラジカルを生成可能な物質は、成分B-1、成分B-2若しくは成分B-3の構造式で表される水溶性光開始剤又は水に分散可能な光開始剤であることを特徴とする、方法。
- 成分A-感光性高分子誘導体を生体適合性媒体に溶解し、感光性高分子溶液Aを得るステップと、
成分B-光開始剤を生体適合性媒体に溶解し、光開始剤溶液Bを得るステップと、
補助成分C-他の生体適合性高分子誘導体を生体適合性媒体に溶解し、高分子溶液Cを得るステップであって、前記補助成分C-他の生体適合性高分子誘導体は、アミノ基、ヒドラジン、アシルヒドラジン又はヒドロキシルアミン官能基を含む高分子誘導体であるステップと、
溶液A、溶液B及び溶液Cを均一に混合してヒドロゲル前駆体溶液を得、光源でヒドロゲル前駆体溶液を照射することにより、成分Aにおけるo-ニトロベンジル系光トリガー及び成分B-光開始剤は、光照射下でそれぞれラジカル架橋が生じるとともに、成分Aにおけるo-ニトロベンジル系光トリガーが光照射下で生成したアルデヒド基/ケト基と成分Cにおけるアミノ基、ヒドラジン、アシルヒドラジン又はヒドロキシルアミン官能基とが架橋し、生成したニトロソ基が成分Cにおけるメルカプト官能基と光誘起ニトロソ架橋を生じることで、ヒドロゲルが形成されるステップと、
を含み、ことを特徴とする、請求項4に記載の方法。 - 前記アミノ基、ヒドラジン、アシルヒドラジン又はヒドロキシルアミン官能基を含む高分子誘導体は、それぞれ構造式C-I、C-II、C-III、C-IVの構造を有し、メルカプト官能基含有高分子誘導体は、構造式C-Vの構造を有し、
前記親水性若しくは水溶性の天然高分子ポリマーは、天然多糖類物質、タンパク質を含み、
前記天然多糖類物質は、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アルギン酸、グルカン、アガロース、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、エチレングリコールキトサン、プロピレングリコールキトサン、キトサン乳酸塩、カルボキシメチルキトサン又はキトサン四級アンモニウム塩を含み、
前記タンパク質は、各種の親水性又は水溶性の動植物タンパク質、コラーゲン、血清タンパク質、シルクフィブロイン、エラスチンを含み、前記タンパク質分解物は、ゼラチン又はポリペプチドを含み、
前記親水性若しくは水溶性の合成ポリマーは、2アーム型又はマルチアームポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、デンドリマー、合成ポリペプチド、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンを含み、
前記式C-Iは、以下の成分C-1から成分C-9の構造からなる群より選択され、前記式C-IIは、以下の成分C-10の構造からなる群より選択され、前記式C-IIIは、以下の成分C-11から成分C-13の構造からなる群より選択され、前記式C-IVは、以下の成分C-14から成分C-15の構造からなる群より選択され、前記式C-Vは、以下の成分C-16から成分C-21の構造からなる群より選択され、
- 請求項7に記載の成分A-感光性高分子誘導体、請求項8に記載の成分B-光開始剤、及び請求項8に記載の光架橋性ヒドロゲル材料の製造と使用に関連する説明書を含むキット。
- 補助成分Cをさらに含み、
前記補助成分Cは、他の生体適合性高分子誘導体であり、アミノ基、ヒドラジン、アシルヒドラジン又はヒドロキシルアミン官能基を含む高分子誘導体を含み、
前記アミノ基、ヒドラジン、アシルヒドラジン又はヒドロキシルアミン官能基を含む高分子誘導体は、それぞれ構造式C-I、C-II、C-III、C-IVの構造を有し、メルカプト官能基含有高分子誘導体は、構造式C-Vの構造を有し、
前記親水性若しくは水溶性の天然高分子ポリマーは、天然多糖類物質、その修飾物又は分解物、タンパク質、その修飾物、改質物及び分解物を含み、
前記天然多糖類物質は、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アルギン酸、グルカン、アガロース、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、エチレングリコールキトサン、プロピレングリコールキトサン、キトサン乳酸塩、カルボキシメチルキトサン又はキトサン四級アンモニウム塩を含み、
前記タンパク質は、各種の親水性又は水溶性の動植物タンパク質、コラーゲン、血清タンパク質、シルクフィブロイン、エラスチンを含み、前記タンパク質分解物は、ゼラチン又はポリペプチドを含み、
前記親水性若しくは水溶性の合成ポリマーは、2アーム型又はマルチアームポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、デンドリマー、合成ポリペプチド、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンを含み、
前記式C-Iは、以下の成分C-1から成分C-9の構造からなる群より選択され、前記式C-IIは、以下の成分C-10の構造からなる群より選択され、前記式C-IIIは、以下の成分C-11から成分C-13の構造からなる群より選択され、前記式C-IVは、以下の成分C-14から成分C-15の構造からなる群より選択され、前記式C-Vは、以下の成分C-16から成分C-21の構造からなる群より選択され、
- 術後創面閉鎖-皮膚修復材料又は薬物の製造における前記光架橋性ヒドロゲル材料の使用、
術後創面閉鎖-術後癒着防止材料又は薬物の製造における前記光架橋性ヒドロゲル材料の使用、
術後創面閉鎖-口腔潰瘍材料又は薬物の製造における前記光架橋性ヒドロゲル材料の使用、
組織液浸漏封止-腸管壁浸漏封止材料又は薬物の製造における前記光架橋性ヒドロゲル材料の使用、
組織液浸漏封止-手術縫合材料又は薬物の製造における前記光架橋性ヒドロゲル材料の使用、
止血材料-肝臓止血材料又は薬物の製造における前記光架橋性ヒドロゲル材料の使用、
止血材料-骨断面止血材料又は薬物の製造における前記光架橋性ヒドロゲル材料の使用、
止血材料-動脈止血材料又は薬物の製造における前記光架橋性ヒドロゲル材料の使用、
止血材料-心臓止血材料又は薬物の製造における前記光架橋性ヒドロゲル材料の使用、
組織工学足場材料-軟骨修復材料又は薬物の製造における前記光架橋性ヒドロゲル材料の使用、
組織工学足場材料-骨修復材料又は薬物の製造における前記光架橋性ヒドロゲル材料の使用、
組織工学足場材料-骨/軟骨複合欠陥修復材料又は薬物の製造における前記光架橋性ヒドロゲル材料の使用、
3Dプリント材料-バイオインクとしての前記光架橋性ヒドロゲル材料の使用、及び
細胞、タンパク質、薬物担体の製造における前記光架橋性ヒドロゲル材料の使用、を含むことを特徴とする、請求項7に記載の光架橋性ヒドロゲル材料の使用。
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