CN115591007A - 一种修复半月板撕裂的组织粘附剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种修复半月板撕裂的组织粘附剂的制备方法，先对透明质酸进行甲基丙烯酰化处理，制备甲基丙烯酰化透明质酸，接着用邻硝基苯甲醛修饰明胶，制备邻硝基苯甲醛修饰明胶，然后将甲基丙烯酰化透明质酸与邻硝基苯甲醛修饰明胶加入到去离子水中溶解，得到混合水凝胶溶液，加入光引发剂并混匀后，避光涂覆到经预处理的PDMS薄膜上，即得。本发明采用生物大分子明胶和透明质酸为主要成分修复半月板，具有仿生的优势，可控的化学修饰使这些组分具有便捷的可加工性，制得的组织粘附剂与软骨细胞具有良好的相容性，本发明还将水凝胶与PDMS薄膜相结合，提高了组织粘附剂材料的机械性能，并且在干燥和潮湿环境下均具有很好界面粘附性。

Description

一种修复半月板撕裂的组织粘附剂的制备方法
技术领域
本发明涉及一种修复半月板撕裂的组织粘附剂的制备方法，属于生物医学技术领域。
背景技术
半月板是位于膝关节股骨和胫骨间C形纤维软骨组织，在承重、减震和维持关节稳定性方面起着重要作用。半月板撕裂是常见的膝关节损伤之一，膝半屈、重力挤压、旋转及剪切力量等原因都容易导致半月板撕裂，例如在运动过程中长期挤压半月板会导致半月板后跟撕裂。因为半月板富有弹性且缺乏血管，自愈合能力差。半月板损伤除了会带来疼痛和膝关节功能障碍外，同时还可导致膝关节的退行性变化，如骨关节炎(OA)，严重影响患者的生活质量。
目前，临床治疗半月板撕裂主要是通过缝线技术，手术操作复杂，且因为缝线的存在会增加关节磨损，从而容易导致骨关节炎。生物水凝胶含水量高，可保持微环境的湿润性，具有良好的生物相容性和组织粘附性，在组织工程、再生医学等领域都有着广泛应用。
赖氨酸-聚氨酯基的组织胶粘剂
Figure BDA0003851010740000011
在腹部整形中已有良好的应用，
Figure BDA0003851010740000012
含有大量的活性-NCO基团，在接触到组织或组织液时可以与组织中的含活性氢基团反应形成界面粘附，但该粘合剂由于内部的活性氢基团很少，固化时间长(需要几十分钟)，结合强度弱，且醚基聚氨酯不易生物降解，故不适用于半月板撕裂；有学者通过络氨酸酶(TYR)偶联透明质酸(HA)和明胶(Gel)，制备了基于水凝胶的组织粘附剂，其具有可控的黏附性能，使用高浓度的TYR(2500U/ml)可在十分钟内观察到水凝胶的形成，但是在体内使用长时间暴露伤口会增加感染的风险，而且该材料料目前仅用在细胞阶段，机械性能无法保障能够满足半月板撕裂处的张力；还有学者探索了水凝胶和用二苯甲酮处理后的弹性体的结合强度(Nat Commun.2016；7:12028.)，采用二苯甲酮对弹性体表面进行改性后，再与水凝胶聚合物接枝，该技术适用于各类弹性体，包括PDMS、聚氨酯、乳胶等，以及各种韧性水凝胶如聚丙胺酸-壳聚糖、聚丙胺酸-透明质酸、聚乙二醇二丙烯酸酯-藻酸盐等含双键的聚合物。该技术所用水凝胶为合成水凝胶且在体内不降解，直接应用于体内会带来排异反应导致其他炎症的发生。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一种修复半月板撕裂的组织粘附剂的制备方法，该方法制得的组织胶粘剂具有良好的组织粘附性和机械性能，并与软骨细胞具有良好的相容性。
技术方案
一种修复半月板撕裂的组织粘附剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备甲基丙烯酰化透明质酸：对透明质酸进行甲基丙烯酰化的处理，得到甲基丙烯酰化透明质酸；
(2)制备邻硝基苯甲醛修饰明胶：将明胶加入到磷酸盐缓冲盐水中，搅拌溶解后，得到明胶溶液；将含羧基的邻硝基苯甲醇溶于二甲基亚砜中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，得到混合液；将混合液滴加到明胶溶液中，40-50℃下反应3-5h，将反应液用去离子水透析3-5天，冷冻干燥后，得到邻硝基苯甲醛基明胶；
(3)制备混合水凝胶：将步骤(1)制得的甲基丙烯酰化透明质酸与步骤(2)制得的邻硝基苯甲醛修饰明胶加入到去离子水中充分溶解，得到混合水凝胶溶液；
(4)组织粘附剂的制备：往步骤(3)制得的混合水凝胶溶液中加入光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂，混合均匀后，得到加光引发剂后的水凝胶，避光将其在经预处理的PDMS薄膜(聚二甲基硅氧烷薄膜)上均匀涂覆(厚度不超过1mm)，得到组织粘附剂，避光保存。
使用时，将组织粘附剂覆盖在半月板撕裂处，用365nm紫外光固化40s即可。
进一步，步骤(1)中，对透明质酸进行甲基丙烯酰化的处理的方法为：室温下，将透明质酸溶于去离子水中，得到透明质酸溶液，调pH至8.5，然后将甲基丙烯酸酐滴加到透明质酸溶液中，搅拌反应3-5h并保持pH为7.5-8.5，反应结束后将反应液置于去离子水中透析至少5天，最后在-80℃下冷冻，得到甲基丙烯酰化透明质酸；所述透明质酸与甲基丙烯酸酐的摩尔比为1：(4-5)。
进一步，步骤(2)中，所述明胶、含羧基的邻硝基苯甲醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1:1:1。
进一步，步骤(3)中，所述混合水凝胶溶液中，甲基丙烯酰化透明质酸的浓度为10g/L，邻硝基苯甲醛修饰明胶的浓度为10～30g/L。
进一步，步骤(4)中，所述光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂的加入量为5g/L。
进一步，步骤(4)中，所述光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂的合成方法为：在氩气保护下，将二甲基苯基亚膦酸盐和2,4,6-三甲基苯甲酰氯在室温下反应过夜，反应结束后，加入溴化锂的2-丁酮溶液，加热至50℃，然后冷却至室温，静置3-6h后过滤，并用2-丁酮洗涤三次，最后用真空泵除去过量溶剂，得到光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂；所述二甲基苯基亚膦酸盐、2,4,6-三甲基苯甲酰氯和溴化锂的摩尔比为1:1:4。
进一步，步骤(4)中，所述PDMS薄膜的预处理方法为：将PDMS薄膜分别用甲醇和去离子水清洗后，再置于浓度为100g/L的二苯甲酮的无水乙醇溶液中浸泡10-15min，取出后用甲醇反复冲洗PDMS薄膜，最后用氮气吹干。
本发明的有益效果：本发明提供了一种修复半月板撕裂的组织粘附剂的制备方法，首先对透明质酸进行甲基丙烯酰化的处理，使其能够原位形成水凝胶的同时，带有碳碳双键，可以与处理后的PDMS交联，接着用邻硝基苯甲醛修饰明胶，明胶上的甲醛可以粘附半月板，起到粘结的桥梁作用，然后通过组分含量的调控，使得水凝胶的各性能优势最大化，最后水凝胶添加光引发剂-苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂(LAP)后均匀的涂覆在PDMS薄膜表面，制得组织粘附剂。本发明采用生物大分子明胶和透明质酸为主要成分修复半月板，具有仿生的优势，可控的化学修饰使得这些组分具有便捷的可加工性，制得的组织粘附剂材料与软骨细胞具有良好的相容性，本发明还将水凝胶与PDMS薄膜相结合，提高了组织粘附剂材料的机械性能，并且在干燥和潮湿环境下均具有很好界面粘附性，PDMS薄膜可有效防止水凝胶中水分的挥发。本发明方法制得的组织粘附剂使用简单，将其覆盖在半月板撕裂处，用365nm紫外光固化40s即可。
附图说明
图1为脱水实验测试结果；
图2为实施例1-3制备的加光引发剂后的水凝胶和PDMS膜间的剪切应力测试结果；
图3为实施例1-3制备的组织粘附剂的生物相容性测试结果；
图4为实施例1-3制备的组织粘附剂的生物毒性测试结果；
图5为采用实施例1制备的组织粘附剂处理6周后的软骨磨损情况；
图6为软骨切片的H&E染色图；
图7为软骨切片的Safranin-O染色图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中，采用的透明质酸购于华熙生物科技股份有限公司；甲基丙烯酸酐和明胶购于Sigma-Aldrich；羧基的邻硝基苯甲醇购于海宁侏罗纪生物科技有限公司；二甲基苯基亚膦酸盐购于海宁侏罗纪生物科技有限公司；但均不限于此。
下述实施例中，光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂的合成方法为：在氩气保护下，将二甲基苯基亚膦酸盐和2,4,6-三甲基苯甲酰氯在室温下反应过夜，反应结束后，加入溴化锂的2-丁酮溶液，加热至50℃，然后冷却至室温，静置4h后过滤，并用2-丁酮洗涤三次，最后用真空泵除去过量溶剂，得到光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂；所述二甲基苯基亚膦酸盐、2,4,6-三甲基苯甲酰氯和溴化锂的摩尔比为1:1:4。
实施例1
一种修复半月板撕裂的组织粘附剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备甲基丙烯酰化透明质酸：对透明质酸进行甲基丙烯酰化的处理，得到甲基丙烯酰化透明质酸；
对透明质酸进行甲基丙烯酰化的处理的方法为：室温下，将5.0g透明质酸(12.7mmol，1.0eq)溶于350mL去离子水中，得到透明质酸溶液，用氢氧化钠溶液调pH至8.5，然后将9mL甲基丙烯酸酐(60.8mmol，4.8eq)滴加到透明质酸溶液中，搅拌反应3h并保持pH为7.5-8.5，反应结束后将反应液置于去离子水中透析5天，最后在-80℃下冷冻，得到甲基丙烯酰化透明质酸；
(2)制备邻硝基苯甲醛修饰明胶：将10.0g明胶(2mmol，1.0eq)加入到100mL磷酸盐缓冲盐水中，50℃下搅拌溶解后，得到明胶溶液；将570mg含羧基的邻硝基苯甲醇(2mmol，1.0eq)溶于2mL二甲基亚砜中，然后加入384mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2mmol，1.0eq)和230mgN-羟基琥珀酰亚胺(2mmol，1.0eq)，得到混合液；将混合液滴加到明胶溶液中，45℃下反应4h，将反应液用去离子水透析3-5天，冷冻干燥后，得到邻硝基苯甲醛基明胶；
(3)制备混合水凝胶：将步骤(1)制得的甲基丙烯酰化透明质酸与步骤(2)制得的邻硝基苯甲醛修饰明胶加入到去离子水中充分溶解，得到混合水凝胶溶液；
所述混合水凝胶溶液中，甲基丙烯酰化透明质酸的浓度为10g/L，邻硝基苯甲醛修饰明胶的浓度为10g/L。
(4)组织粘附剂的制备：
取PDMS薄膜进行预处理，方法为：将PDMS薄膜分别用甲醇和去离子水清洗后，再置于浓度为0.5g/mL的二苯甲酮的无水乙醇溶液中浸泡10min，取出后用甲醇反复冲洗PDMS薄膜，最后用氮气吹干；
往步骤(3)制得的混合水凝胶溶液中加入5g/L的光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂，混合均匀后，得到加光引发剂后的水凝胶，将其避光涂覆到经预处理的PDMS薄膜上，得到组织粘附剂，避光保存。
实施例2
一种修复半月板撕裂的组织粘附剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备甲基丙烯酰化透明质酸：对透明质酸进行甲基丙烯酰化的处理，得到甲基丙烯酰化透明质酸；
对透明质酸进行甲基丙烯酰化的处理的方法为：室温下，将5.0g透明质酸(12.7mmol，1.0eq)溶于350mL去离子水中，得到透明质酸溶液，用氢氧化钠溶液调pH至8.5，然后将9mL甲基丙烯酸酐(60.8mmol，4.8eq)滴加到透明质酸溶液中，搅拌反应3h并保持pH为7.5-8.5，反应结束后将反应液置于去离子水中透析5天，最后在-80℃下冷冻，得到甲基丙烯酰化透明质酸；
(2)制备邻硝基苯甲醛修饰明胶：将10.0g明胶(2mmol，1.0eq)加入到100mL磷酸盐缓冲盐水中，50℃下搅拌溶解后，得到明胶溶液；将570mg含羧基的邻硝基苯甲醇(2mmol，1.0eq)溶于2mL二甲基亚砜中，然后加入384mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2mmol，1.0eq)和230mgN-羟基琥珀酰亚胺(2mmol，1.0eq)，得到混合液；将混合液滴加到明胶溶液中，45℃下反应4h，将反应液用去离子水透析3-5天，冷冻干燥后，得到邻硝基苯甲醛基明胶；
(3)制备混合水凝胶：将步骤(1)制得的甲基丙烯酰化透明质酸与步骤(2)制得的邻硝基苯甲醛修饰明胶加入到去离子水中充分溶解，得到混合水凝胶溶液；
所述混合水凝胶溶液中，甲基丙烯酰化透明质酸的浓度为10g/L，邻硝基苯甲醛修饰明胶的浓度为20g/L。
(4)组织粘附剂的制备：
取PDMS薄膜进行预处理，方法为：将PDMS薄膜分别用甲醇和去离子水清洗后，再置于浓度为0.5g/mL的二苯甲酮的无水乙醇溶液中浸泡10min，取出后用甲醇反复冲洗PDMS薄膜，最后用氮气吹干；
往步骤(3)制得的混合水凝胶溶液中加入5g/L的光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂，混合均匀后，得到加光引发剂后的水凝胶，将其避光涂覆到经预处理的PDMS薄膜上，得到组织粘附剂，避光保存。
实施例3
一种修复半月板撕裂的组织粘附剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备甲基丙烯酰化透明质酸：对透明质酸进行甲基丙烯酰化的处理，得到甲基丙烯酰化透明质酸；
对透明质酸进行甲基丙烯酰化的处理的方法为：室温下，将5.0g透明质酸(12.7mmol，1.0eq)溶于350mL去离子水中，得到透明质酸溶液，用氢氧化钠溶液调pH至8.5，然后将9mL甲基丙烯酸酐(60.8mmol，4.8eq)滴加到透明质酸溶液中，搅拌反应3h并保持pH为7.5-8.5，反应结束后将反应液置于去离子水中透析5天，最后在-80℃下冷冻，得到甲基丙烯酰化透明质酸；
(2)制备邻硝基苯甲醛修饰明胶：将10.0g明胶(2mmol，1.0eq)加入到100mL磷酸盐缓冲盐水中，50℃下搅拌溶解后，得到明胶溶液；将570mg含羧基的邻硝基苯甲醇(2mmol，1.0eq)溶于2mL二甲基亚砜中，然后加入384mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2mmol，1.0eq)和230mgN-羟基琥珀酰亚胺(2mmol，1.0eq)，得到混合液；将混合液滴加到明胶溶液中，45℃下反应4h，将反应液用去离子水透析3-5天，冷冻干燥后，得到邻硝基苯甲醛基明胶；
(3)制备混合水凝胶：将步骤(1)制得的甲基丙烯酰化透明质酸与步骤(2)制得的邻硝基苯甲醛修饰明胶加入到去离子水中充分溶解，得到混合水凝胶溶液；
所述混合水凝胶溶液中，甲基丙烯酰化透明质酸的浓度为10g/L，邻硝基苯甲醛修饰明胶的浓度为30g/L。
(4)组织粘附剂的制备：
取PDMS薄膜进行预处理，方法为：将PDMS薄膜分别用甲醇和去离子水清洗后，再置于浓度为0.5g/mL的二苯甲酮的无水乙醇溶液中浸泡10min，取出后用甲醇反复冲洗PDMS薄膜，最后用氮气吹干；
往步骤(3)制得的混合水凝胶溶液中加入5g/L的光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂，混合均匀后，得到加光引发剂后的水凝胶，将其避光涂覆到经预处理的PDMS薄膜上，得到组织粘附剂，避光保存。
性能测试：
1.脱水实验
取实施例1制备的加光引发剂后的水凝胶50μL滴加到经预处理的圆形PDMS薄膜(直径为2.5cm)上，设置实验组和对照组两个处理组，实验组用相同大小的经预处理的PDMS薄膜覆盖在水凝胶上，并在暴露于UV辐射之前按压，对照组不覆盖PDMS薄膜，实验组和对照组经UV固化后，均置于室温下放置8h，每间隔两小时记录重量变化。
图1为脱水实验测试结果，图中，纵坐标为Wt/W0，Wt表示在2、4、6、8小时后，材料的重量(mg)，W0为其原始重量(mg)，可以看出，对照组在前两小时内重量快速下降，且8小时后为初始重量的4.9％，表明水含量耗尽，而实验组(PDMS-水凝胶-PDMS)在8小时后，其重量为初始重量的93.1％，表明PDMS薄膜可以有效的防止水凝胶中水分的挥发。
2.粘附性能测试
使用标准搭接剪切实验测试实施例1-3制备的加光引发剂后的水凝胶和PDMS膜间的剪切应力，具体测试方法为：用双面胶将两片二苯甲酮预处理后的PDMS膜(3cm长*2cm宽)分别粘合到两个玻片上，然后，将100μL加光引发剂的水凝胶均匀地散布在两片PDMS之间，并用365nm紫外光固化。使用万能材料测试设备夹住玻片的一侧，同时固定另一侧，以30mm/min的恒定速度拉伸试样，直至两块玻片分离。
使用以下公式计算PDMS的水凝胶粘合强度：
粘合强度＝F/A
其中F表示拉应力，A表示粘合面积，测试结果见图2。
图2的测试结果表明，随着邻硝基苯甲醛修饰明胶的量的增加，邻硝基苯甲醛修饰明胶和甲基丙烯酰化透明质酸之间的分子间氢键增多，导致粘附强度增强。
3.相容性测试
实验方法：从新西兰雄性白兔(3周龄)获取完整的股骨，并取出股骨上多余的浅表肌肉和筋膜组织。在超净台上将股骨的两端剪开，再用Dulbecco改良Eagle's培养基(DMEM，凯基)反复冲洗骨髓腔，以获得骨髓抽取物。提取物离心(1000rpm，5min)后倒掉上清液，加入完全DMEM培养基(10％胎牛血清+1％青链霉素+89％Eagle`s培养基)并使得细胞悬浮，然后将细胞接种在培养瓶中(5*104cell/cm2)，在37℃和5％CO2的培养箱中培养，并收集第二代细胞用于生物相容性测试和生物毒性测试。
(1)生物相容性测试：将实施例1-3制备的组织粘附剂光固化后分别铺在12孔板中，以预处理后的PDMS膜作为对照，将细胞悬滴在材料上(104cells/1ml/孔)，将孔板放在培养箱(37℃和5％CO2)中孵育48小时后，使用活/死细胞染色试剂(CalceinAM·PI)染色后，避光继续孵育半小时后，置于倒置荧光显微镜下观察细胞状态，并使用Image-Pro Plus6.0软件对活细胞的占比进行统计。结果见图3。
实施例1-3制备的组织粘附剂的生物相容性测试结果见图3，可以看出，所有组别的细胞活性均达到98％以上，且无显著性差异，这表明实施例1-3制备的组织粘附剂材料具有良好的生物相容性。
(2)CCK-8测定生物毒性：先使细胞在96孔板上贴壁(2000cells/100μL/孔)，将PDMS膜和实施例1-3制备的组织粘附剂经紫外光灭菌后分别置于完全DMEM培养基中浸泡24小时，然后用0.22μm过滤膜过滤后使用，对照组为未浸泡任何材料的完全DMEM培养基。将细胞在提取培养基中培养1、4、7天，然后移取培养基，用PBS清洗后，加入含10％CCK-8的完全DMEM，并将细胞再孵育1小时。最后使用酶标仪读取孔板在450nm下的吸光度(原理：在电子耦合试剂存在的情况下，WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物，其颜色深浅与细胞数成正比，故可根据吸光度反映细胞毒性)。生物毒性测试结果见图4。
由图4可以看出，采用不同材料浸泡后的完全DMEM培养基培养BMSCs，BMSCs的数量没有显著性差异，这说明PDMS膜和实施例1-3制备的组织粘附剂基本无毒性，具有很好的细胞相容性，不抑制细胞活力，可用于生物医学。
4.体内实验研究
实验方法：兔子为新西兰大白兔，体重2.5-3kg。实验是在无菌条件下进行。兔子全麻后，将其左膝关节外侧半月板偏上1/3处切断，然后将实施例1制备的组织粘附剂覆盖在半月板撕裂处，再经过紫外固化，随后缝合皮肤切口，作为材料处理组。此外，切断右侧半月板相同位置不加材料作为对照组(n＝4只动物)。术后第六周，将这些兔子安乐死，取出其膝关节，直接观察半月板愈合状态，然后为评估软骨磨损程度，将关节脱钙后，包埋在石蜡中，并横切成4μm厚的切片，然后用H&E和Safranin-O染色，进行组织学分析。
采用实施例1制备的组织粘附剂处理6周后的软骨磨损情况见图5，可以看出，材料处理组中，软骨表面相对光滑，不加组织粘附剂的对照组，软骨表面显示出明显磨损。
软骨切片的H&E染色图见图6，可以看出，对照组中，软骨细胞数量显著减少，其分布不如采用材料处理组均匀，并且由于自救，软骨细胞逐渐聚集。
软骨切片的Safranin-O染色图见图7，结果表明，材料处理组的软骨染色结果与正常软骨相近，即半月板受损部位对应的软骨层染色结果正常，而由于持续磨损后软骨基质的病理变化，对照组的软骨层变得半透明。

Claims (7)

1.一种修复半月板撕裂的组织粘附剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备甲基丙烯酰化透明质酸：对透明质酸进行甲基丙烯酰化的处理，得到甲基丙烯酰化透明质酸；
(2)制备邻硝基苯甲醛修饰明胶：将明胶加入到磷酸盐缓冲盐水中，搅拌溶解后，得到明胶溶液；将含羧基的邻硝基苯甲醇溶于二甲基亚砜中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，得到混合液；将混合液滴加到明胶溶液中，40-50℃下反应3-5h，将反应液用去离子水透析3-5天，冷冻干燥后，得到邻硝基苯甲醛基明胶；
(3)制备混合水凝胶：将步骤(1)制得的甲基丙烯酰化透明质酸与步骤(2)制得的邻硝基苯甲醛修饰明胶加入到去离子水中充分溶解，得到混合水凝胶溶液；
(4)组织粘附剂的制备：往步骤(3)制得的混合水凝胶溶液中加入光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂，混合均匀后，得到加光引发剂后的水凝胶，避光涂覆到经预处理的PDMS薄膜上，得到组织粘附剂，避光保存。
2.如权利要求1所述修复半月板撕裂的组织粘附剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，对透明质酸进行甲基丙烯酰化的处理的方法为：室温下，将透明质酸溶于去离子水中，得到透明质酸溶液，调pH至8.5，然后将甲基丙烯酸酐滴加到透明质酸溶液中，搅拌反应3-5h并保持pH为7.5-8.5，反应结束后将反应液置于去离子水中透析至少5天，最后在-80℃下冷冻，得到甲基丙烯酰化透明质酸；所述透明质酸与甲基丙烯酸酐的摩尔比为1：(4-5)。
3.如权利要求1所述修复半月板撕裂的组织粘附剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述明胶、含羧基的邻硝基苯甲醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1:1:1。
4.如权利要求1所述修复半月板撕裂的组织粘附剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述混合水凝胶溶液中，甲基丙烯酰化透明质酸的浓度为10g/L，邻硝基苯甲醛修饰明胶的浓度为10～30g/L。
5.如权利要求1所述修复半月板撕裂的组织粘附剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂的加入量为5g/L。
6.如权利要求1所述修复半月板撕裂的组织粘附剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂的合成方法为：在氩气保护下，将二甲基苯基亚膦酸盐和2,4,6-三甲基苯甲酰氯在室温下反应过夜，反应结束后，加入溴化锂的2-丁酮溶液，加热至50℃，然后冷却至室温，静置3-6h后过滤，并用2-丁酮洗涤三次，最后用真空泵除去过量溶剂，得到光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂；所述二甲基苯基亚膦酸盐、2,4,6-三甲基苯甲酰氯和溴化锂的摩尔比为1:1:4。
7.如权利要求1至6任一项所述修复半月板撕裂的组织粘附剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述PDMS薄膜的预处理方法为：将PDMS薄膜分别用甲醇和去离子水清洗后，再置于浓度为0.5g/mL的二苯甲酮的无水乙醇溶液中浸泡10-15min，取出后用甲醇反复冲洗PDMS薄膜，最后用氮气吹干。
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