CN107964056B - 光偶合交联水凝胶材料的制备方法、原料、产品及应用 - Google Patents

光偶合交联水凝胶材料的制备方法、原料、产品及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及光偶合交联水凝胶材料的制备方法、原料、产品及应用。将组分A‑邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物溶于生物相容性介质得到溶液A；将组分B‑伯胺、联胺、酰肼、羟胺类高分子衍生物溶于生物相容性介质得到溶液B；将溶液A和溶液B混合均匀得到水凝胶前体溶液；水凝胶前体溶液在光源照射下，组分A中的邻硝基苄基产生的醛基或酮基与组分B中的伯胺、联胺、酰肼、羟胺基团以希夫碱的形式交联形成水凝胶。本发明还提供制备水凝胶用的试剂盒，以及水凝胶在组织工程和再生医学、3D打印及作为细胞、蛋白或药物载体上的应用。本发明可将水凝胶前体溶液喷涂或涂抹于组织表面在光照下实现原位凝胶，尤其适用于术后创面封闭和组织液渗漏封堵。

Description

光偶合交联水凝胶材料的制备方法、原料、产品及应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，尤其是涉及光偶合交联水凝胶材料的制备方法、原料、产品及应用。
背景技术
水凝胶是一类高度含水的具有三维网络交联结构的聚合物材料，由于其具有优异的生物相容性及一定的机械强度，可以高度拟合生物组织的微环境，因此广泛应用于组织工程和再生医学领域。原位固化的水凝胶在临床应用中具有优异的组织赋型性。当前，可原位固化的水凝胶根据成胶机理的不同主要有温敏型(如LeGoo，羟丁基壳聚糖等)、双组份注射型(如Fibrin Glue，Adherus AutoSpray等)、光敏型(如FocalSeal,ChonDux等)等。
其中，光敏型水凝胶材料由于其成胶过程中光的非物理接触、时空精确可控等优势，更具备临床的实际操作性。自由基引发的光聚合交联(Hubbellet.al.U.S.Pat.No.6060582A，issued May 9,2000)以及在它基础上进一步发展的thiol-ene反应(Christopher Bowman et.al.U.S.Pat.NO.US7288608B2,issued October 30,2007)是当前光引发自由基聚合交联制备水凝胶的两种典型方式。但是在自由基引发聚合交联的体系中，必须有小分子光引发剂的参与，而且光照产生的自由基不可避免会对细胞或生物组织造成损伤；此外，自由基对氧气也极其敏感，使得薄层原位水凝胶构筑十分困难；更为重要的是，由该方法原位构筑的水凝胶几乎没有组织粘附能力，使水凝胶的临床固定成为困扰，是该技术临床转化的壁垒。
为了规避自由基引发聚合交联方式的缺陷，朱麟勇研究组于2014年提出了基于邻硝基苄醇受紫外光照(365nm)产生醛基，进一步交联多胺基高分子衍生物制备水凝胶的非自由基光偶合交联技术(Yunlong Yang；Jieyuan Zhang；Zhenzhen Liu；Qiuning Lin；Xiaolin Liu；Chunyan Bao；Yang Wang；Linyong Zhu.Adv.Mater.2016,28,2724.；LinyongZhu et.al.PCT.No.2016082725 A1,issued Jun 2,2016)，在利用该技术实施临床上原位成胶的过程中完全规避了自由基的产生，能够有效解决自由基的毒性以及氧阻聚，具有优异的生物相容性，且胶层薄厚可调；同时，邻硝基苄醇受光照产生的醛基也会与组织表面富含的蛋白胺基交联，实现胶层与组织的化学键键连固定，解决传统光敏型水凝胶的组织粘附与整合等难题。然而，该体系还存在一些不足，如光固化波长较短(365nm)，光交联速度较慢(初始成胶时间在30s左右，完全成胶时间在2min左右)，合成较为繁琐等，因而限制了该类非自由基光偶合交联技术的临床转化。
发明内容
为了进一步发挥以上非自由基光偶合交联水凝胶材料生物相容性好、组织粘附力强的优势，以及克服其存在的缺陷，本发明在原有邻硝基苄基类光扳机分子结构的基础上进一步改进，合成了一系列新型结构的邻硝基苄基类光扳机用于构筑光偶合交联水凝胶。
本发明的第一个目的是提供一种邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物。
邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物，具有式I结构：
Figure GDA0002609531830000021
其中，R’选自氢、卤原子、羟基、巯基、胺基、硝基、氰基、醛基、酮基、酯基、酰胺基、膦酸基、膦酸酯基、磺酸基、磺酸酯基、砜基、亚砜基、芳基、杂芳基、烷基、亚烷基、改性烷基或改性亚烷基等，
R1选自氢、醚键类取代基、酯键类取代基、碳酸酯键类取代基、胺基甲酸酯键类取代基、巯基甲酸酯键类取代基或磷酸酯键类取代基等，
R2，R3，R4，R5可自由的选自氢、卤原子、羟基、巯基、胺基、硝基、氰基、醛基、酮基、酯基、酰胺基、膦酸基、膦酸酯基、磺酸基、磺酸酯基、砜基、亚砜基、芳基、杂芳基、烷基、亚烷基、改性烷基或改性亚烷基等，
P1与R2，R3，R4，R5中任意的一个或多个基团相连接，式I中，P1为一种亲水或水溶性天然高聚物或合成聚合物，或P1独立的选自多种亲水或水溶性天然高聚物或合成聚合物；
式I中，n≥2，即单条P1高分子链上的邻硝基苄基类光扳机(即式Ⅰ中括号内的结构)的平均个数大于或等于2；
当R’，R2选自氢，P1不连接于R4。
进一步地，所述烷基为具有1～30个碳原子的饱和或不饱和脂肪族直链或支链的烷基；
所述亚烷基为具有1～30个碳原子的饱和或不饱和脂肪族直链或支链的亚烷基；
所述改性烷基为烷基的任意碳原子被选自卤原子、-OH、-SH、-NO2、-CN、-CHO、-COOH、酯基、酰胺基、芳基、亚芳基、-CO-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、伯胺基、仲胺基、叔胺基、季铵盐基、饱和或不饱和的单环或双环亚环烃基、桥联脂杂环中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性烷基具有1～30个原子，其碳碳单键可任意地被碳碳双键或碳碳叁键替换；
所述改性亚烷基为亚烷基的任意碳原子被选自卤原子、-OH、-SH、-NO2、-CN、-CHO、-COOH、酯基、酰胺基、芳基、亚芳基、-CO-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、伯胺基、仲胺基、叔胺基、季铵盐基、饱和或不饱和的单环或双环亚环烃基、桥联脂杂环中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性亚烷基具有1～30个原子，其碳碳单键可任意地被碳碳双键或碳碳叁键替换；
所述醚键类取代基选自以下结构：
-(CH2)xCH3、-(CH2CH2O)xCH3、-(CH2)x(CH2CH2O)yCH3、或
Figure GDA0002609531830000022
等，其中x和y≥0且为整数；
所述酯键类取代基选自以下结构：
-CO(CH2)xCH3、-CO(CH2CH2O)xCH3、-CO(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等，其中x和y≥0且为整数；
所述碳酸酯键类取代基选自以下结构：
-COO(CH2)xCH3、-COO(CH2CH2O)xCH3、-COO(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等，其中x和y≥0且为整数；
所述胺基甲酸酯键类取代基选自以下结构：
-CONH(CH2)xCH3、-CONH(CH2CH2O)xCH3、-CONH(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等，其中x和y≥0且为整数；
所述巯基甲酸酯键类取代基选自以下结构：
-COS(CH2)xCH3、-COS(CH2CH2O)xCH3、-COS(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等，其中x和y≥0且为整数；
所述磷酸酯键类取代基选自以下结构：
-POOO(CH2)xCH3、-POOO(CH2CH2O)xCH3、-POOO(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等，其中x和y≥0且为整数；
所述芳基为5～10元芳香单环或芳香稠合双环结构；
所述杂芳基为环上含有选自O、S、N或Si中的至少一种杂原子的5～10元芳香单环或芳香稠合双环结构；
所述卤原子各自独立地选自F、Cl、Br、I。
对于式I结构，还存在一些优选结构，即R2，R3，R4，R5中至少两个相互连接，与碳原子一起形成饱和或不饱和的脂环或脂杂环，或形成芳环或芳杂环。
所述脂环为饱和或不饱和的3～10元单环或多环脂环；
所述脂杂环为环上含有选自O、S、N或Si中的至少一种杂原子的饱和或不饱和的3-10元单环或多环脂杂环，所述脂杂环上含有S原子时，其任选为-S-、-SO-或-SO2-；所述脂环或脂杂环上的H还可任意地被卤原子、硝基、芳基、烷基或改性烷基取代；
所述芳环为5～10元芳香单环或芳香稠合双环；
所述芳杂环为环上含有选自O、S、N或Si中的至少一种杂原子的5～10元芳香单环或芳香稠合双环；所述芳环或芳杂环上的H还可任意地被卤原子、硝基、芳基、烷基或改性烷基取代。
进一步地，脂环或脂杂环的优选结构包括：
Figure GDA0002609531830000031
等；
进一步地，芳环或芳杂环的优选结构包括：
Figure GDA0002609531830000032
等；
当式I结构中R2，R3，R4，R5中至少两个相互连接，与碳原子一起形成饱和或不饱和的脂环或脂杂环，或形成芳环或芳杂环时，P1还可以连接于R2，R3，R4，R5之间形成的饱和或不饱和脂环或脂杂环，或形成的芳环或芳杂环。
对于P1与R2，R3，R4，R5中任意的一个或多个基团相连接，或连接于R2，R3，R4，R5之间形成的饱和或不饱和脂环或脂杂环，或形成的芳环或芳杂环上时，
连接键选自羟基类所获得的连接键P1-O-；或选自巯基类所获得的连接键P1-S-；或选自胺基类所获得的连接键P1-NH-；或选自烷烃类所获得的连接键P1-；或选自酯键类所获得的连接键P1-COO-；或选自酰胺键类所获得的连接键P1-CONH-，该连接键的一端与P1相连，另一端连接在式I所示分子的苯环上。
邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物中的高分子P1可以是亲水或水溶性天然高聚物包括天然多糖类物质及其修饰物或降解物，蛋白及其修饰物或降解物等，所述天然多糖类物质包括透明质酸、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、海藻酸、葡聚糖、琼脂糖、肝素、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖或壳聚糖季铵盐等，所述蛋白包括各种亲水性或水溶性动植物蛋白、胶原蛋白、血清蛋白、丝素蛋白、弹性蛋白，所述蛋白降解物包括明胶或多肽等，亲水或水溶性合成聚合物包括两臂或多臂聚乙二醇、聚乙烯亚胺、合成多肽、聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等。
以上接枝或聚合的水溶或亲水性高分子衍生物中，单条高分子链上的邻硝基苄基类光扳机的平均个数大于或等于2(即n≥2)。
所述邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物可以是同时含有一种或一种以上不同基团的亲水或水溶性高分子，或者是一种或一种以上不同基团的亲水或水溶性高分子的混合物。所述亲水或水溶性高分子指亲水或水溶性天然高聚物，或亲水或水溶性合成聚合物。
R’的一些优选结构包括：
-H、-CH3、-CH2CH3、-CH＝CH-CH＝CH-CH3、-F、-Cl、-Br、-I、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-COOH、-Ph、
Figure GDA0002609531830000041
等。
R2，R3，R4，R5的一些优选结构包括：
-H、-OH、-SH、-NH2、-F、-Cl、-Br、-I、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-NO2、-CN、-CHO、-COOH、-COONH2、-SO3H等；
烷基类取代基优选结构，如直链烷基-(CH2)xCH3、支链烷基-(CH2)x(CY’Y”)yCH3(Y’，Y”为氢、烷基或改性烷基)等，其中x和y≥0且为整数；
醚类取代基优选结构，如-O(CH2)xCH3、-O(CH2CH2O)xCH3、-O(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等，其中x和y≥0且为整数；
硫醚类取代基优选结构，如-S(CH2)xCH3、-S(CH2CH2O)xCH3、-S(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等，其中x和y≥0且为整数；
胺基类取代基优选结构，如-NH(CH2)xCH3、-NH(CH2)x(CY’Y”)yCH3、-N(CY’Y”)x(CY’Y”)y、
Figure GDA0002609531830000042
(Y，Y’为氢、烷基或改性烷基)等，其中x和y≥0且为整数；
酯类取代基优选结构，如-COO(CH2)xCH3、-COO(CH2CH2O)xCH3、-COO(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等，其中x和y≥0且为整数；
酰胺类取代基优选结构，如-CONH(CH2)xCH3、-CONH(CH2CH2O)xCH3、-CONH(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等，其中x和y≥0且为整数；
芳香族类取代基优选结构，如-Ph、
Figure GDA0002609531830000043
等。
进一步优选，所述式I可选自以下组分A-1～组分A-49中的结构：
Figure GDA0002609531830000044
Figure GDA0002609531830000051
Figure GDA0002609531830000061
组分A-1～组分A-49中，n≥2，HA为透明质酸；CMC为羧甲基纤维素；Alg为海藻酸；CS为硫酸软骨素；PGA为聚谷氨酸；PEG为聚乙二醇；Chitosan为壳聚糖；Gelatin为明胶；PLL为聚赖氨酸；Dex为葡聚糖；Hep为肝素。
本发明目的一提供的组分A-邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物，其结构特征主要在于：
1)苯环上取代基或共轭体系的引入，使光扳机的吸收波长红移，摩尔吸收系数增大，使得在光固化中使用的365nm紫光波段光源改进到了405nm蓝光波段光源，光固化所需光强减弱，大大降低了强紫外光源产生的热感和细胞毒性；
2)邻硝基苄基光扳机与高分子的连接位置更加灵活，可以根据苯环上引入的不同取代基选择高分子的连接位置，相比于之前的分子结构，在合成上更加简单灵活，可以大幅度降低水凝胶的应用成本。因此，该类新型邻硝基苄基分子在原有分子结构的基础上，进一步提高了光解波长和光解效率，同时在其高分子衍生物的合成上也更加简单方便。
本发明的第二个目的是提供所述邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物的制备方法。
本发明中，邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物的制备方法为化学标记法或人工聚合的方法。
其中，化学标记法是利用高分子与邻硝基苄基类光扳机中所含的化学基团间的化学反应而连接，可以是含羧基的高分子与含羟基/巯基/胺基的邻硝基苄基类小分子标记(参考文献O.P.Oommen,S.Wang,M.Kisiel,M.Sloff,J.Hilborn,O.P.Varghese,Adv.Funct.Mater.2013,23,1273.)；也可以是含羟基的高分子与含羧基的或含溴的邻硝基苄基类小分子标记(参考文献K.Peng,I.Tomatsu,A.V.Korobko,A.Kros,Soft Matter2010,6,85；L.Li,N.Wang,X.Jin,R.Deng,S.Nie,L.Sun,Q.Wu,Y.Wei,C.Gong,Biomaterials2014,35,3903.)；也可以是含胺基的高分子与含羧基的或含溴的邻硝基苄基类小分子标记(参考文献L.Li,N.Wang,X.Jin,R.Deng,S.Nie,L.Sun,Q.Wu,Y.Wei,C.Gong,Biomaterials2014,35,3903.)等标记方法。
人工聚合的方法是利用邻硝基苄基衍生物功能单体与其它共单体共聚，可以是无规自由基聚合方法，也可以是控制自由基聚合方法(比如ATRP聚合、RAFT聚合方法)等。
本发明中，邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物的一些可实施的制备方法如下：
第一种可实施的制备方法为：将含有羧基的水溶性高分子于蒸馏水中溶解，加入含有活性官能团羟基或巯基或胺基的邻硝基苄基小分子后，加入缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)和活化剂羟基苯并三唑(HOBt)，然后在室温下搅拌24-48h。反应结束后，将反应液加入透析袋中用稀盐酸溶液透析2-3d，然后冷冻干燥，即可得到所述的邻硝基苄基修饰的高分子衍生物。
第二种可实施的制备方法为：将含有羧基的水溶性高分子于0.01mol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)中，搅拌至完全溶解，将邻硝基苄基小分子溶于二甲基亚砜后加入上述反应液，将4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)溶于MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋中，用去离子水透析2-3d，然后冷冻干燥，即可得到所述的邻硝基苄基修饰的高分子衍生物。
第一种可实施方式与第二种可实施方式中，上述含有羧基的水溶性高分子可以为聚乙二醇类、含羧基的多糖类(如：透明质酸、羧甲基纤维素、海藻酸等)、含羧基的蛋白或多肽类(如：明胶等)，优选为多臂羧基聚乙二醇、透明质酸、羧甲基纤维素、明胶。进一步优选为透明质酸。
第三种可实施的制备方法为：将含有羟基或胺基的水溶性聚合物于蒸馏水中溶解，加入含有活性官能团羧基的邻硝基苄基小分子后，加入缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)和催化剂对甲苯磺酸吡啶盐(DPTS)，然后在室温下搅拌24-48h。反应结束后，将反应液倒入难溶性溶剂中重沉淀(比如修饰的聚乙二醇衍生物可倒入乙醚中重沉淀，多糖类高分子衍生物可倒入乙醇中重沉淀)，然后溶于水中用透析袋透析2-3d，冷冻干燥后，即可得到所述的邻硝基苄基修饰的高分子衍生物。
第四种可实施的制备方法为：将含有羟基或胺基的水溶性聚合物于蒸馏水中溶解，加入含有活性官能团溴的邻硝基苄基小分子后，加入碳酸钾作为碱，在室温下反应24-48h。反应结束后，将反应液倒入难溶性溶剂(比如修饰的聚乙二醇衍生物可倒入乙醚中，修饰的多糖类高分子衍生物可倒入乙醇中)中重沉淀，然后溶于水中用透析袋透析2-3d，冷冻干燥后，即可得到所述的邻硝基苄基修饰的高分子衍生物。
第三种可实施方式与第四种可实施方式中，上述含有羟基或胺基的水溶性聚合物可以为含羟基或胺基的聚乙二醇类或天然多糖类或蛋白/多肽类，优选为多臂羟基聚乙二醇、多臂胺基聚乙二醇、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、羧甲基壳聚糖、壳聚糖乳酸盐类或天然多糖类，或聚赖氨酸、明胶等，进一步优选为乙二醇壳聚糖、多臂羟基聚乙二醇。
上述反应中，水溶性聚合物中的羧基、羟基或胺基与小分子邻硝基苄基类衍生物的摩尔比优选为1:0.1-2；胺基修饰的邻硝基苄基类小分子与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)、活化剂羟基苯并三唑(HOBt)的摩尔比优选为1:2:1.5；胺基修饰的邻硝基苄基类小分子与4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)的摩尔比优选为1:7.5；羧基修饰的邻硝基苄基类小分子与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)、催化剂DPTS的摩尔比优选为1:2:1.5；溴代的邻硝基苄基类小分子与碳酸钾的摩尔比优选为1:2。
第五种可实施的制备方法为：将邻硝基苄基可聚合单体衍生物与一种或几种可聚合共单体经过聚合即可得邻硝基苄基修饰的合成共聚物。经过多次溶解-重沉淀的方法将其纯化。
上述邻硝基苄基可聚合单体衍生物可以为丙烯酸酯类化合物、甲基丙烯酸酯类化合物、丙烯酰胺类化合物、甲基丙烯酰胺类化合物，优选为甲基丙烯酸酯类化合物和丙烯酰胺类化合物，进一步优选为甲基丙烯酸酯类化合物。
上述可聚合共单体中至少一种必须是水溶性共单体，可以为甲基丙烯酸聚乙二醇酯(PEG-MA)、丙烯酸聚乙二醇酯、甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酸(AA)、丙烯酸羟乙酯、丙烯酰胺(AM)等任意具有水溶性的可聚合单体，优选为甲基丙烯酸聚乙二醇酯(PEG-MA)。其它共单体根据不同的应用而选择。
上述邻硝基苄基可聚合单体衍生物与水溶性共单体的聚合摩尔比可以为1:20-1:2，优选为1:9-1:3，进一步优选为1:4。
上述聚合方法可以是无规自由基聚合、也可以是控制自由基聚合(比如RAFT聚合、ATRP聚合等)。优选为无规自由基聚合。即邻硝基苄基可聚合单体衍生物与共单体共溶于一定的溶剂中，加入自由基引发剂充分溶解后，经过三次冷冻-抽真空循环操作后，在加热条件下反应过夜。待反应结束后，将反应液倒入无水乙醚中沉淀，经过多次溶解-重沉淀的纯化过程，真空干燥后即可得到含邻硝基苄基的共聚合物。(参考文献G.Delaittre,T.Pauloehrl,M.Bastmeyer,C.Barner-Kowollik,Macromolecules 2012,45,1792-1802.)。
本发明的第三个目的是提供光偶合交联水凝胶材料制备方法。该光偶合交联水凝胶材料是以发明目的一所述邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物为原料制备的。
本发明的光偶合交联水凝胶材料制备方法包括以下步骤：将组分A-邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物溶于生物相容性介质得到溶液A；将组分B-含伯胺、联胺、酰肼或羟胺类高分子衍生物溶于生物相容性介质得到溶液B；将溶液A和溶液B混合均匀得到水凝胶前体溶液；水凝胶前体溶液在光源照射下，组分A中的邻硝基苄基在光激发下产生的醛基或酮基与组分B中的伯胺、联胺、酰肼或羟胺基团以希夫碱的方式交联形成水凝胶。
所述组分B-含伯胺、联胺、酰肼或羟胺类高分子衍生物，分别具有结构式B-Ⅰ、B-II、B-Ⅲ、B-Ⅳ：
Figure GDA0002609531830000081
其中，n≥2，P2、P3、P4、P5为亲水或水溶性天然高聚物或合成聚合物等。
其中，含伯胺类高分子衍生物，式B-Ⅰ所示结构，代表含n个胺基基团的水溶性或亲水性的高分子。含联胺类高分子衍生物，式B-II所示结构，代表含n个联胺基基团的水溶性或亲水性的高分子。含酰肼类高分子衍生物，式B-Ⅲ所示结构，代表含n个酰肼基基团的水溶性或亲水性的高分子。含羟胺类高分子衍生物，式B-Ⅳ所示结构，代表含n个羟胺基基团的水溶性或亲水性的高分子。
所述水溶性或亲水性高分子指亲水或水溶性天然高聚物及其修饰物，或亲水或水溶性合成聚合物及其修饰物。
亲水或水溶性天然高聚物包括天然多糖类物质及其修饰物或降解物，蛋白及其修饰物或降解物等，所述天然多糖类物质包括透明质酸、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、海藻酸、葡聚糖、琼脂糖、肝素、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖或壳聚糖季铵盐等，所述蛋白包括各种亲水性或水溶性动植物蛋白、胶原蛋白、血清蛋白、丝素蛋白、弹性蛋白，所述蛋白降解物包括明胶或多肽等。
亲水或水溶性合成聚合物包括两臂或多臂聚乙二醇、聚乙烯亚胺、合成多肽、聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等。
另外，所述的含伯胺、联胺、酰肼或羟胺类高分子衍生物也可以是同时含有以上一种或一种以上不同基团的亲水或水溶性高分子，或者含有一种或一种以上不同基团的亲水或水溶性高分子的混合物。
优选地，所述式B-Ⅰ可选自以下组分B-1～组分B-9中的结构；所述式B-II可选自以下组分B-10中的结构；所述式B-Ⅲ可选自以下组分B-11～组分B-13中的结构；所述式B-Ⅳ可选自以下组分B-14～组分B-15中的结构：
Figure GDA0002609531830000091
Figure GDA0002609531830000101
组分B-1至组分B-15中，n≥2，组分B-1为壳聚糖；组分B-2为乙二醇壳聚糖；组分B-3为羧甲基壳聚糖；组分B-4为明胶；组分B-5为聚赖氨酸；组分B-6为聚乙烯亚胺；组分B-7为两臂胺基聚乙二醇；组分B-8为四臂胺基聚乙二醇；组分B-9为胺基聚合物；组分B-10为联胺修饰的羧甲基纤维素；组分B-11～组分B-13为酰肼修饰的透明质酸；组分B-14为四臂羟胺聚乙二醇；组分B-15为羟胺修饰的葡聚糖。
本发明中，含伯胺、联胺、酰肼或羟胺类高分子衍生物的一些可实施的制备方法如下：
胺基修饰的水溶性聚合物可以是人工合成聚胺类高分子及其修饰物(如聚乙烯亚胺PEI、树枝体PAMAM，两臂或多臂胺基聚乙二醇)，或天然含胺基多糖类亲水或水溶性高分子及其修饰物或降解物(如乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖、壳寡糖等)；也可以是生物或经微生物表达后提取的蛋白及其改性物或降解物(如胶原，血清蛋白及明胶等)；也可以是人工合成或通过微生物表达并提取的含两个或两个胺基以上的亲水或水溶性多肽(如聚赖氨酸等)或丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺类聚合物及其修饰物。优选为明胶、乙二醇壳聚糖。
联胺修饰的高分子衍生物的制备方法为：将含有羧基的水溶性聚合物和二联胺于蒸馏水中溶解，加入缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)和活化剂羟基苯并三唑(HOBt)，然后在室温下搅拌24-48h。反应结束后，将反应液倒入透析袋中用稀盐酸溶液透析2-3d，然后冷冻干燥，即可得到所述的联胺修饰的高分子衍生物。
上述含有羧基的水溶性聚合物可以为羧基聚乙二醇类、含羧基的多糖类(如壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖、透明质酸、海藻酸、羧甲基纤维素等)，优选为多臂羧基聚乙二醇、透明质酸，进一步优选为透明质酸。
上述反应中，水溶性聚合物中的羧基与小分子二联胺的摩尔比优选为1:0.1-2；二联胺小分子与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)、活化剂羟基苯并三唑(HOBt)的摩尔比优选为1:2:1.5。
酰肼修饰的高分子衍生物的制备方法为：将含有羧基的水溶性聚合物和二酰肼于蒸馏水中溶解，加入缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)和活化剂羟基苯并三唑(HOBt)，然后在室温下搅拌24-48h。反应结束后，将反应液倒入透析袋中用稀盐酸溶液透析2-3d，然后冷冻干燥，即可得到所述的酰肼修饰的高分子衍生物。
上述含有羧基的水溶性聚合物可以为羧基聚乙二醇类、含羧基的多糖类(如壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖、透明质酸、海藻酸、羧甲基纤维素等)，优选为多臂羧基聚乙二醇、透明质酸，进一步优选为透明质酸。
上述反应中，小分子二酰肼可以为碳二酰肼、草酸二酰肼、丙二酸二酰肼、丁二酸二酰肼、戊二酸二酰肼、己二酸二酰肼、庚二酸二酰肼等任意二酰肼，优选为碳二酰肼、草酸二酰肼、己二酸二酰肼，进一步优选为碳二酰肼。水溶性聚合物中的羧基与小分子二酰肼的摩尔比优选为1:0.1-2；二酰肼小分子与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)、活化剂羟基苯并三唑(HOBt)的摩尔比优选为1:2:1.5。
羟胺修饰的高分子衍生物的制备方法为：将含有羟基的聚合物与N-羟基邻苯二甲酰亚胺溶于二氯甲烷溶液中，加入三苯基膦后，慢慢滴加二异丙基偶氮二羧酸酯并反应16-24h后，将聚合物在乙醚中沉淀出来，然后重新溶到二氯甲烷溶液中，加入水合肼反应1-3h后，即可得到羟胺修饰的高分子衍生物。
上述含有羟基的聚合物可以为聚乙二醇类，多糖类(如葡聚糖、壳聚糖)，优选为多臂羟基聚乙二醇。
上述反应中，聚合物中的羟基与N-羟基邻苯二甲酰亚胺、三苯基膦、二异丙基偶氮二羧酸酯、水合肼的摩尔比优选为1:10:10:10:10。
本发明目的三所述水凝胶的制备方法中，生物相容性介质选自蒸馏水、生理盐水、缓冲液或细胞培养基溶液，根据不同的应用，可选取不同的介质。
本发明目的三所述水凝胶的制备方法中，溶液A和溶液B混合均匀形成的水凝胶前体溶液中，邻硝基苄基基团与组分B中伯胺、联胺、酰肼或羟胺基团的摩尔比可以为1:0.02-50，优选为1:0.1-10，聚合物总浓度可以为0.1％wt-60％wt，优选为1％wt-10％wt。
本发明目的三所述水凝胶的制备方法中，光源的波长根据邻硝基苄基类光扳机的吸收波长来确定，可以为250-500nm，优选为300-450nm，进一步优选为395或405nm。
本发明制备方法采用的技术原理是：邻硝基苄基类光扳机在光激发下产生醛基或酮基，与含有伯胺、联胺、酰肼、羟胺基团的高分子衍生物以希夫碱的方式交联形成水凝胶，该种交联方式是在光激发下产生活性基团与其他相应的基团进行偶合反应，可称为光偶合交联。该类光偶合交联制备水凝胶的方法不仅克服了自由基交联的生物毒性，薄层成胶，组织粘附与整合等瓶颈，同时也解决了现有非自由基光偶合交联中光固化波长较短、光交联速率较慢、合成较为繁琐等问题，有望实质性推动光原位凝胶技术的临床应用。
本发明的第四个目的是提供光偶合交联水凝胶材料制备方法制得的产品。
本发明提供了用目的三所述方法制备得到的水凝胶，可以称为光偶合交联水凝胶。
本发明的第五个目的是提供用于光偶合交联水凝胶材料制备的试剂盒，包含：组分A-式Ⅰ所示邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物；组分B-式B-Ⅰ、式B-II、式B-Ⅲ、式B-Ⅳ所示伯胺、联胺、酰肼、羟胺类高分子衍生物；以及有关水凝胶制备及应用的说明书。
进一步地，本发明试剂盒中还可包含生物相容性介质，如蒸馏水、生理盐水、缓冲液和细胞培养基。
进一步地，本发明试剂盒中的说明书上记载着水凝胶的应用包括其在术后创面封闭、组织液渗漏封堵、止血材料、组织工程支架材料、3D打印的生物墨水及作为细胞、蛋白或药物载体上的应用。
本发明的第六个目的是提供光偶合交联水凝胶材料制备方法所制得产品的应用。
本发明提供了上述光偶合交联水凝胶用于制备术后创面封闭用品的应用。
本发明还提供了上述光偶合交联水凝胶用于制备组织液渗漏封堵用品的应用。
本发明还提供了上述光偶合交联水凝胶用于制备止血材料的应用。
本发明还提供了上述光偶合交联水凝胶用于制备组织工程支架材料-软骨修复材料的应用。
本发明还提供了上述光偶合交联水凝胶用于制备组织工程支架材料-骨修复材料的应用。
本发明还提供了上述光偶合交联水凝胶作为3D打印材料-生物墨水的应用。
本发明还提供了上述光偶合交联水凝胶在制备细胞、蛋白、药物载体上的应用。
本发明与现有技术相比具有下列创新点：
(1)苯环上取代基或共轭体系的引入，使光扳机的吸收波长红移，摩尔吸收系数增大，使得在光固化中使用的365nm紫光波段光源改进到了405nm蓝光波段光源，光固化所需光强减弱，大大降低了强紫外光源产生的热感和细胞毒性；
(2)邻硝基苄基光扳机与高分子的连接位置更加灵活，可以根据苯环上引入的不同取代基选择高分子的连接位置，相比于之前的分子结构，在合成上更加简单灵活，可以大幅度降低水凝胶的应用成本；
(3)凝胶的化学结构、组成和降解性以及强度、厚薄可调，可以根据不同的应用而灵活地调节凝胶材料的组成和性质，尤其可以在创面原位成薄胶，特别适用于术后创面的封闭和修复，也适用于组织液渗漏封堵，同时可作为止血材料，也可作为组织工程支架材料，也可以用于3D打印的生物墨水，还可以为细胞、蛋白或药物提供一种原位载体，有效应用于再生医学。
附图说明
注：NB0为文献报道的用于构筑水凝胶的邻硝基苄基类光扳机(Yunlong Yang；Jieyuan Zhang；Zhenzhen Liu；Qiuning Lin；Xiaolin Liu；Chunyan Bao；Yang Wang；Linyong Zhu.Adv.Mater.2016,28,2724.)。NB为本发明组分A-1中的邻硝基苄基类光扳机。其中，HA-NB0即为NB0标记的透明质酸高分子衍生物，HA-NB即为组分A-1。
图1为邻硝基苄基类光扳机(NB0和NB)的紫外吸收波长和摩尔吸光系数对比图。
图2为水凝胶前体溶液(2％HA-NB0/2％CMCh和2％HA-NB/2％CMCh)光照成胶的实时流变图。
图3为水凝胶(2％HA-NB0/2％CMCh和2％HA-NB/2％CMCh)的粘附力测试图。
图4为水凝胶(组分A-1/组分B-3)的生物相容性测试图。
图5为水凝胶(组分A-1/组分B-3)的创面封闭的效果直观图。
图6为水凝胶(组分A-1/组分B-3)作为止血材料的效果直观图。
图7为水凝胶(组分A-1/组分B-3)作为软骨组织工程支架材料的效果直观图。
图8为水凝胶(组分A-1/组分B-3)作为生物墨水的打印效果直观图。
具体实施方式
以下用实施例对本发明作更详细的描述。下面结合附图以及实施例对本发明作进一步描述，但这些实施例仅仅是对本发明最佳实施方式的描述，并不对本发明的范围有任何限制。本领域技术人员在不背离本发明精神和保护范围的情况下作出的其它任何变化和修改，仍包括在本发明保护范围之内。
实施例一：组分A-1的合成
Figure GDA0002609531830000121
(1)化合物1的合成：按参考文献Sarit S.Agasti.；Apiwat Chompoosor.；VincentM.Rotello.J.Am.Chem.Soc.2009,131,5728.公开的方法进行合成。
(2)化合物2的合成：将化合物1(1g，2.9mmol)和乙二胺(1.1mL)溶于甲醇(50mL)中，回流过夜反应后，减压旋蒸，将粗产物溶于甲醇中，在乙酸乙酯中重沉淀。经过多次溶解-重沉淀后，过滤、真空干燥即可得到化合物2(0.92g，产率85％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.91(s,1H),4.96(s,2H),4.13(t,J＝6.1Hz,2H),3.99(s,3H),3.32(dd,J＝11.6,5.7Hz,2H),2.82(t,J＝5.9Hz,2H),2.44(t,J＝7.2Hz,2H),2.26-2.17(m,2H).MS(ESI):[M+H]373.1373.
(3)组分A-1的合成：将透明质酸Hyaluronic acid(2g，340kDa)溶于100mL0.01mol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)，搅拌至完全溶解，称取化合物2(75mg，0.2mmol)溶于10mL二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，称取4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(0.4g，1.5mmol)溶于3mL MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏透明质酸衍生物A-1(1.82g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物2的标记率大约为3.06％。
实施例二：组分A-2的合成
Figure GDA0002609531830000131
(1)化合物3的合成：按参考文献James F.Cameron.；JeanM.J.Frechet.J.Am.Chem.Soc.1991,113,4303.公开的方法进行合成。
(2)化合物4的合成：将化合物3(1g，2.8mmol)和乙二胺(1.1mL)溶于甲醇(50mL)中，回流过夜反应后，减压旋蒸，将粗产物溶于甲醇中，在乙酸乙酯中重沉淀。经过多次溶解-重沉淀后，过滤、真空干燥即可得到化合物4(0.86g，产率80％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.91(s,1H),4.96(m,1H),4.13(t,J＝6.1Hz,2H),3.99(s,3H),3.32(dd,J＝11.6,5.7Hz,2H),2.82(t,J＝5.9Hz,2H),2.44(t,J＝7.2Hz,2H),2.26-2.17(m,2H),1.33(d,J＝6.9Hz,3H).MS(ESI):[M+H]387.1553.
(3)组分A-2的合成：将透明质酸Hyaluronic acid(2g，340kDa)溶于100mL0.01mol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)，搅拌至完全溶解，称取化合物4(77mg，0.2mmol)溶于10mL二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，称取4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(0.4g，1.5mmol)溶于3mL MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏透明质酸衍生物A-2(1.65g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物4的标记率大约为3.26％。
实施例四：组分A-4的合成
Figure GDA0002609531830000132
(1)化合物7的合成：按参考文献Isabelle Aujard.；Chouaha Benbrahim.；Ludovic Jullien.Chem.Eur.J.2006,12,6865.公开的方法进行合成。
(2)化合物8的合成：将化合物7(1g，2.7mmol)和乙二胺(1.1mL)溶于甲醇(50mL)中，回流过夜反应后，减压旋蒸，将粗产物溶于甲醇中，在乙酸乙酯中重沉淀。经过多次溶解-重沉淀后，过滤、真空干燥即可得到化合物8(0.95g，产率88％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.91(s,1H),4.96(s,1H),4.13(t,J＝6.1Hz,2H),3.99(s,3H),3.32(dd,J＝11.6,5.7Hz,2H),2.82(t,J＝5.9Hz,2H),2.44(t,J＝7.2Hz,2H),2.26-2.17(m,2H).MS(ESI):[M+H]398.1326.
(3)组分A-4的合成：将透明质酸Hyaluronic acid(2g，340kDa)溶于100mL0.01mol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)，搅拌至完全溶解，称取化合物8(80mg，0.2mmol)溶于10mL二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，称取4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(0.4g，1.5mmol)溶于3mL MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏透明质酸衍生物A-4(1.92g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物8的标记率大约为3.14％。
实施例五：组分A-5的合成
Figure GDA0002609531830000141
(1)化合物9的合成：按参考文献Alexander G.Russell.；Dario M.Bassani.；JohnS.Snaith.J.Org.Chem.2010,75,4648.公开的方法进行合成。
(2)化合物10的合成：将化合物9(1g，2.6mmol)和乙二胺(1.1mL)溶于甲醇(50mL)中，回流过夜反应后，减压旋蒸，将粗产物溶于甲醇中，在乙酸乙酯中重沉淀。经过多次溶解-重沉淀后，过滤、真空干燥即可得到化合物10(0.79g，产率74％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.91(s,1H),4.96(s,1H),4.13(t,J＝6.1Hz,2H),3.99(s,3H),3.32(dd,J＝11.6,5.7Hz,2H),2.82(t,J＝5.9Hz,2H),2.44(t,J＝7.2Hz,2H),2.26-2.17(m,2H).MS(ESI):[M+H]417.1244.
(3)组分A-5的合成：将透明质酸Hyaluronic acid(2g，340kDa)溶于100mL0.01mol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)，搅拌至完全溶解，称取化合物10(83mg，0.2mmol)溶于10mL二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，称取4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(0.4g，1.5mmol)溶于3mL MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏透明质酸衍生物A-5(1.73g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物10的标记率大约为3.03％。
实施例六：组分A-6的合成
Figure GDA0002609531830000142
(1)化合物11的合成：按参考文献Alexandre Specht.；MauriceGoeldner.Angew.Chem.Int.Ed.2004,43,2008.公开的方法进行合成。
(2)化合物12的合成：将化合物11(1g，2.4mmol)和乙二胺(1.1mL)溶于甲醇(50mL)中，回流过夜反应后，减压旋蒸，将粗产物溶于甲醇中，在乙酸乙酯中重沉淀。经过多次溶解-重沉淀后，过滤、真空干燥即可得到化合物12(0.66g，产率62％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.91(s,1H),4.96(s,1H),4.13(t,J＝6.1Hz,2H),3.99(s,3H),3.32(dd,J＝11.6,5.7Hz,2H),2.82(t,J＝5.9Hz,2H),2.44(t,J＝7.2Hz,2H),2.26-2.17(m,2H).MS(ESI):[M+H]441.1274.
(3)组分A-6的合成：将透明质酸Hyaluronic acid(2g，340kDa)溶于100mL0.01mol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)，搅拌至完全溶解，称取化合物12(88mg，0.2mmol)溶于10mL二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，称取4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(0.4g，1.5mmol)溶于3mL MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏透明质酸衍生物A-6(1.63g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物12的标记率大约为2.15％。
实施例二十一：组分A-21的合成
Figure GDA0002609531830000151
(1)化合物34的合成：按参考文献Emmanuel Riguet.；ChristianG.Bochet.Org.Lett.2007,26,5453.公开的方法进行合成。
(2)化合物35的合成：将化合物34(1g，3.4mmol)和乙二胺(1.1mL)溶于甲醇(50mL)中，回流过夜反应后，减压旋蒸，将粗产物溶于甲醇中，在乙酸乙酯中重沉淀。经过多次溶解-重沉淀后，过滤、真空干燥即可得到化合物35(0.83g，产率76％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.05(d,J＝9.54Hz,1H),7.24(d,J＝2.72Hz,1H),6.92(dd,J＝9.54,2.72Hz,1H),4.85(s,2H),3.56-3.68(m,4H),3.49-3.56(m,2H),3.42-3.49(m,2H),3.32(t,J＝5.9Hz,2H),2.82(t,J＝5.9Hz,2H).MS(ESI):[M+H]324.1632.
(3)组分A-21的合成：将透明质酸Hyaluronic acid(2g，340kDa)溶于100mL0.01mol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)，搅拌至完全溶解，称取化合物35(65mg，0.2mmol)溶于10mL二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，称取4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(0.4g，1.5mmol)溶于3mL MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏透明质酸衍生物A-21(1.87g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物35的标记率大约为3.42％。
实施例二十二：组分A-22的合成
Figure GDA0002609531830000152
(1)化合物36的合成：按参考文献Isabelle Aujard.；Chouaha Benbrahim.；Ludovic Jullien.Chem.Eur.J.2006,12,6865.公开的方法进行合成。
(2)化合物37的合成：将化合物36(1g，3.2mmol)和乙二胺(1.1mL)溶于甲醇(50mL)中，回流过夜反应后，减压旋蒸，将粗产物溶于甲醇中，在乙酸乙酯中重沉淀。经过多次溶解-重沉淀后，过滤、真空干燥即可得到化合物37(0.78g，产率72％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.05(d,J＝9.54Hz,1H),7.28(d,J＝8.00Hz,2H),7.24(d,J＝2.72Hz,1H),6.92(dd,J＝9.54,2.72Hz,1H),6.78(d,8.00Hz,2H),4.96(s,2H),4.83(s,2H),3.32(t,J＝5.9Hz,2H),2.82(t,J＝5.9Hz,2H).MS(ESI):[M+H]346.1454.
(3)组分A-22的合成：将透明质酸Hyaluronic acid(2g，340kDa)溶于100mL0.01mol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)，搅拌至完全溶解，称取化合物37(69mg，0.2mmol)溶于10mL二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，称取4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(0.4g，1.5mmol)溶于3mL MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏透明质酸衍生物A-22(1.73g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物37的标记率大约为3.16％。
实施例二十五：组分A-25的合成
Figure GDA0002609531830000161
(1)化合物42的合成：按参考文献Emmanuel Riguet.；ChristianG.Bochet.Org.Lett.2007,26,5453.公开的方法进行合成。
(2)化合物43的合成：将化合物42(1g，3.6mmol)和乙二胺(1.1mL)溶于甲醇(50mL)中，回流过夜反应后，减压旋蒸，将粗产物溶于甲醇中，在乙酸乙酯中重沉淀。经过多次溶解-重沉淀后，过滤、真空干燥即可得到化合物43(0.93g，产率85％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.71(s,1H),7.22(s,1H),4.96(s,2H),4.24(s,2H),3.32(t,J＝5.9Hz,2H),3.27-3.21(m,2H),2.82(t,J＝5.9Hz,2H),2.75(t,J＝6.3Hz,2H),2.00-1.91(m,2H).MS(ESI):[M+H]309.1522.
(3)组分A-25的合成：将透明质酸Hyaluronic acid(2g，340kDa)溶于100mL0.01mol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)，搅拌至完全溶解，称取化合物43(62mg，0.2mmol)溶于10mL二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，称取4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(0.4g，1.5mmol)溶于3mL MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏透明质酸衍生物A-25(1.84g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物43的标记率大约为3.23％。
实施例二十六：组分A-26的合成
Figure GDA0002609531830000162
(1)化合物44的合成：按参考文献Singh,A.K.；Khade,P.K.Tetrahedron.2005,61,10007.公开的方法进行合成。
(2)化合物45的合成：将化合物44(1g，3.4mmol)和乙二胺(1.1mL)溶于甲醇(50mL)中，回流过夜反应后，减压旋蒸，将粗产物溶于甲醇中，在乙酸乙酯中重沉淀。经过多次溶解-重沉淀后，过滤、真空干燥即可得到化合物45(0.68g，产率62％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.31-7.12(m,5H),4.96(s,2H),4.83(s,2H),3.32(t,J＝5.9Hz,2H),2.82(t,J＝5.9Hz,2H).MS(ESI):[M+H]320.1254.
(3)组分A-26的合成：将透明质酸Hyaluronic acid(2g，340kDa)溶于100mL0.01mol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)，搅拌至完全溶解，称取化合物45(64mg，0.2mmol)溶于10mL二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，称取4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(0.4g，1.5mmol)溶于3mL MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏透明质酸衍生物A-26(1.73g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物45的标记率大约为3.12％。
实施例二十七：组分A-27的合成
Figure GDA0002609531830000171
(1)化合物46的合成：按参考文献Felix Friedrich.；Mike Heilemann.；Alexander Heckel.Chem.Commun.2015,51,15382.公开的方法进行合成。
(2)化合物47的合成：将化合物46(1g，3.0mmol)和乙二胺(1.1mL)溶于甲醇(50mL)中，回流过夜反应后，减压旋蒸，将粗产物溶于甲醇中，在乙酸乙酯中重沉淀。经过多次溶解-重沉淀后，过滤、真空干燥即可得到化合物47(0.68g，产率63％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.31-7.12(m,5H),4.96(s,2H),4.83(s,2H),3.32(t,J＝5.9Hz,2H),2.82(t,J＝5.9Hz,2H).MS(ESI):[M+H]360.1254.
(3)组分A-27的合成：将透明质酸Hyaluronic acid(2g，340kDa)溶于100mL0.01mol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)，搅拌至完全溶解，称取化合物47(72mg，0.2mmol)溶于10mL二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，称取4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(0.4g，1.5mmol)溶于3mL MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏透明质酸衍生物A-27(1.71g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物47的标记率大约为2.93％。
实施例二十八：组分A-28的合成
Figure GDA0002609531830000172
(1)化合物48的合成：按参考文献Grazyna Groszek.；Agnieszka Nowak-Krol.；Barbara Filipek.Eur.J.Med.Chem.2009,44,5103.公开的方法进行合成。
(2)化合物49的合成：将化合物48(1g，3.3mmol)和乙二胺(1.1mL)溶于甲醇(50mL)中，回流过夜反应后，减压旋蒸，将粗产物溶于甲醇中，在乙酸乙酯中重沉淀。经过多次溶解-重沉淀后，过滤、真空干燥即可得到化合物49(0.94g，产率86％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.04(s,1H),7.42(s,1H),4.96(s,2H),4.13(t,J＝6.1Hz,2H),3.99(s,3H),3.32(dd,J＝11.6,5.7Hz,2H),2.82(t,J＝5.9Hz,2H),2.44(t,J＝7.2Hz,2H),2.26-2.17(m,2H).MS(ESI):[M+H]328.1507.
(3)组分A-28的合成：将透明质酸Hyaluronic acid(2g，340kDa)溶于100mL0.01mol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)，搅拌至完全溶解，称取化合物49(65mg，0.2mmol)溶于10mL二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，称取4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(0.4g，1.5mmol)溶于3mL MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏透明质酸衍生物A-28(1.92g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物49的标记率大约为3.54％。
实施例二十九：组分A-29的合成
Figure GDA0002609531830000181
(1)化合物50的合成：按参考文献Thomas F.Greene.；Shu Wang.；MaryJ.Meegan.J.Med.Chem.2016,59,90.公开的方法进行合成。
(2)化合物51的合成：将化合物50(1g，3.3mmol)和乙二胺(1.1mL)溶于甲醇(50mL)中，回流过夜反应后，减压旋蒸，将粗产物溶于甲醇中，在乙酸乙酯中重沉淀。经过多次溶解-重沉淀后，过滤、真空干燥即可得到化合物51(0.97g，产率89％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.95(s,1H),7.12(s,1H),4.96(s,2H),4.13(t,J＝6.1Hz,2H),3.99(s,3H),3.32(dd,J＝11.6,5.7Hz,2H),2.82(t,J＝5.9Hz,2H),2.44(t,J＝7.2Hz,2H),2.26-2.17(m,2H).MS(ESI):[M+H]328.1507.
(3)组分A-29的合成：将透明质酸Hyaluronic acid(2g，340kDa)溶于100mL0.01mol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)，搅拌至完全溶解，称取化合物51(65mg，0.2mmol)溶于10mL二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，称取4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(0.4g，1.5mmol)溶于3mL MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏透明质酸衍生物A-29(1.86g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物51的标记率大约为3.38％。
实施例三十：组分A-30的合成
Figure GDA0002609531830000191
(1)化合物52的合成：按参考文献Yu-Shan.；Mohane Selvaraj Coumar.；Hsing-Pang Hsieh.J.Med.Chem.2009,52,4941.公开的方法进行合成。
(2)化合物53的合成：将化合物52(1g，3.3mmol)和乙二胺(1.1mL)溶于甲醇(50mL)中，回流过夜反应后，减压旋蒸，将粗产物溶于甲醇中，在乙酸乙酯中重沉淀。经过多次溶解-重沉淀后，过滤、真空干燥即可得到化合物53(0.91g，产率83％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.64(s,1H),7.02(s,1H),4.96(s,2H),4.13(t,J＝6.1Hz,2H),3.99(s,3H),3.32(dd,J＝11.6,5.7Hz,2H),2.82(t,J＝5.9Hz,2H),2.44(t,J＝7.2Hz,2H),2.26-2.17(m,2H).MS(ESI):[M+H]328.1507.
(3)组分A-30的合成：将透明质酸Hyaluronic acid(2g，340kDa)溶于100mL0.01mol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)，搅拌至完全溶解，称取化合物53(65mg，0.2mmol)溶于10mL二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，称取4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(0.4g，1.5mmol)溶于3mL MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏透明质酸衍生物A-30(1.85g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物53的标记率大约为3.41％。
实施例三十二：组分A-32的合成
Figure GDA0002609531830000192
组分A-32的合成：将透明质酸Hyaluronic acid(2g，340kDa)溶于100mL 0.01mol/L2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)，搅拌至完全溶解，称取NB混合物(化合物2/化合物51，60mg，1:1)溶于10mL二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，称取4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(0.4g，1.5mmol)溶于3mL MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏透明质酸衍生物A-32(1.85g)，根据核磁氢谱图，可计算出NB混合物(化合物2/化合物51)的标记率大约为3.45％。
实施例三十六：组分A-36的合成
Figure GDA0002609531830000193
组分A-36的合成：将羧甲基纤维素Carboxymethyl cellulose(2g，90kDa)溶于100mL 0.01mol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)，搅拌至完全溶解，称取化合物2(75mg，0.2mmol)溶于10mL二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，称取4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(0.4g，1.5mmol)溶于3mL MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏羧甲基纤维素衍生物A-36(1.92g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物2的标记率大约为2.82％。
实施例三十七：组分A-37的合成
Figure GDA0002609531830000201
组分A-37的合成：将海藻酸Alginic acid(2g)溶于100mL 0.01mol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)，搅拌至完全溶解，称取化合物2(75mg，0.2mmol)溶于10mL二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，称取4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(0.4g，1.5mmol)溶于3mL MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏海藻酸衍生物A-37(1.89g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物2的标记率大约为3.13％。
实施例三十八：组分A-38的合成
Figure GDA0002609531830000202
组分A-38的合成：将硫酸软骨素Chondroitin sulfate(2g)溶于100mL 0.01mol/L2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液(pH＝5.2)，搅拌至完全溶解，称取化合物2(75mg，0.2mmol)溶于10mL二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，称取4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(0.4g，1.5mmol)溶于3mL MES缓冲溶液，分三次(每隔1h)加入上述反应液中，35℃下反应24h。然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏硫酸软骨素衍生物A-38(1.74g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物2的标记率大约为2.73％。
实施例三十九：组分A-39的合成
Figure GDA0002609531830000211
组分A-39的合成：将聚谷氨酸PGA(1g)溶于50mL蒸馏水中至完全溶解，加入羟基苯并三唑(HOBt，0.3g，2.3mmol)，然后将溶于甲醇中的化合物2(0.6g,1.6mmol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl，0.5g，2.6mmol)加入到上述溶液中室温反应48h后，先用含氯化钠的稀盐酸溶液(pH＝3.5)透析1d，再用纯水透析1d后，冷冻干燥即可得到光敏聚谷氨酸衍生物A-39(0.92g)，根据其核磁氢谱图，可以计算出化合物2的修饰度大约为18％。
实施例四十：组分A-40的合成
Figure GDA0002609531830000212
组分A-40的合成：将四臂聚乙二醇羧酸衍生物4-PEG-COOH(0.5g，10kDa)溶于20mL无水二甲基亚砜DMSO中至完全溶解，称取化合物2(130mg，0.4mmol)溶于5mL无水二甲基亚砜DMSO后加入上述反应液，加入0.2mL三乙胺TEA，再加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷PyBop(210mg，0.4mmol)，于室温下反应24h，然后在乙醚中重沉淀，将粗产物溶于水后倒入透析袋(MWCO 3500)中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到光敏聚乙二醇衍生物A-40(0.45g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物2的标记率大约为98％。
实施例四十一：组分A-41的合成
Figure GDA0002609531830000213
(1)化合物62的合成：按参考文献Pauloehrl,T.；Delaittre,G.；Bruns,M.；Meiβler,M.；
Figure GDA0002609531830000214
H.G.；Bastmeyer,M.；Barner-Kowollik,C.Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,9181.公开的方法进行合成。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.91(s,1H),4.96(s,2H),4.13(t,J＝6.1Hz,2H),3.99(s,3H),3.90-3.80(m,1H),3.79(t,J＝6.1Hz,2H),3.70(t,J＝7.2Hz,2H),3.63-3.52(m,1H),3.56(t,J＝7.2Hz,2H),2.00-1.34(m,6H).MS(ESI):[M+H]417.1527.
(2)组分A-41的合成：将透明质酸Hyaluronic acid(1g，340kDa)溶于50mL水中，将化合物62(0.2g，0.54mmol)、EDC-HCl(0.76g，3.96mmol)和DPTS(0.12g，0.48mmol)依次加入到上述溶液中，室温下搅拌反应48h。反应结束后，将反应液倒入冷的乙醇中多次重沉淀纯化，收集到的沉淀干燥后将其溶于无水DMSO中，加入对甲苯磺酸将二氢吡喃保护基团脱掉即可得到光敏透明质酸衍生物A-41(0.82g)。根据其核磁氢谱图，可计算出化合物62的修饰度大约为9.5％。
实施例四十二：组分A-42的合成
Figure GDA0002609531830000221
(1)化合物63的合成：按参考文献Pauloehrl,T.；Delaittre,G.；Bruns,M.；Meiβler,M.；
Figure GDA0002609531830000223
H.G.；Bastmeyer,M.；Barner-Kowollik,C.Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,9181.公开的方法进行合成。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.91(s,1H),4.96(s,2H),4.13(t,J＝6.1Hz,2H),3.99(s,3H),3.90-3.80(m,1H),3.63-3.52(m,1H),2.44(t,J＝7.2Hz,2H),2.26-2.17(m,2H),2.00-1.34(m,6H).MS(ESI):[M+H]415.1312.
(2)组分A-42的合成：将1g壳聚糖加入到75mL异丙醇中形成壳聚糖的悬浮液，然后将化合物63(0.2g，0.48mmol)、EDC-HCl(0.76g，3.96mmol)和NHS(0.46g，4.0mmol)依次加入到上述溶液中，室温下搅拌反应48h。反应结束后，将混合物溶液过滤，滤液用甲醇/水混合溶剂透析三次、甲醇透析两次后，冷冻干燥即可得到化合物63标记的壳聚糖(0.92g)。将化合物63标记的壳聚糖溶于DMSO中，加入对甲苯磺酸脱除二氢吡喃保护即可得到光敏壳聚糖衍生物A-42，根据其核磁氢谱图，可计算出化合物63的修饰度大约为11.5％。
实施例四十三：组分A-43的合成
Figure GDA0002609531830000222
组分A-43的合成：将聚赖氨酸PLL(1g)溶于50mL水中，将化合物63(0.2g，0.48mmol)、EDC-HCl(0.76g，3.96mmol)和NHS(0.46g，4.0mmol)依次加入到上述溶液中，室温下搅拌反应48h。反应结束后，将反应液倒入冷的乙醇中多次重沉淀纯化，收集到的沉淀干燥后将其溶于无水DMSO中，加入对甲苯磺酸将二氢吡喃保护基团脱掉即可得到光敏聚赖氨酸衍生物A-43(0.85g)。根据其核磁氢谱图，可计算出化合物63的修饰度大约为12.6％。
实施例四十四：组分A-44的合成
Figure GDA0002609531830000231
组分A-44的合成：将明胶Gelatin(1g)溶于50mL蒸馏水中至完全溶解，将化合物63(0.2g，0.48mmol)、EDC-HCl(0.76g，3.96mmol)和NHS(0.46g，4.0mmol)依次加入到上述溶液中，室温下搅拌反应48h。反应结束后，将反应液倒入冷的乙醇中多次重沉淀纯化，收集到的沉淀干燥后将其溶于无水DMSO中，加入对甲苯磺酸将二氢吡喃保护基团脱掉即可得到光敏明胶衍生物A-44(0.91g)，根据其核磁氢谱图，可以计算出化合物63的修饰度大约为15.3％。
实施例四十五：组分A-45的合成
Figure GDA0002609531830000232
组分A-45的合成：将葡聚糖Dextran(1g)溶于50mL水中，将化合物63(0.2g，0.48mmol)、EDC-HCl(0.76g，3.96mmol)和DPTS(0.12g，0.48mmol)依次加入到上述溶液中，室温下搅拌反应48h。反应结束后，将反应液倒入冷的乙醇中多次重沉淀纯化，收集到的沉淀干燥后将其溶于无水DMSO中，加入对甲苯磺酸将二氢吡喃保护基团脱掉即可得到光敏葡聚糖衍生物A-45(0.89g)。根据其核磁氢谱图，可计算出化合物63的修饰度大约为18.2％。
实施例四十六：组分A-46的合成
Figure GDA0002609531830000233
(1)化合物64的合成：按参考文献Pauloehrl,T.；Delaittre,G.；Bruns,M.；Meiβler,M.；
Figure GDA0002609531830000234
H.G.；Bastmeyer,M.；Barner-Kowollik,C.Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,9181.公开的方法进行合成。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.91(s,1H),4.96(s,2H),4.13(t,J＝6.1Hz,2H),3.99(s,3H),2.44(t,J＝7.2Hz,2H),2.26-2.17(m,2H).MS(ESI):[M+H]331.0743.
(2)组分A-46的合成：将巯基修饰的肝素Hep-SH(1g)溶于50mL蒸馏水中至完全溶解，加入羟基苯并三唑(HOBt，0.3g，2.3mmol)，然后将溶于甲醇中的化合物64(0.5g,1.6mmol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl，0.5g，2.6mmol)加入到上述溶液中室温反应48h后，先用含氯化钠的稀盐酸溶液(pH＝3.5)透析1d，再用纯水透析1d后，冷冻干燥即可得到光敏肝素衍生物A-46(0.85g)，根据其核磁氢谱图，可以计算出化合物64的修饰度大约为14.2％。
实施例四十七：组分A-47的合成
Figure GDA0002609531830000241
(1)化合物65的合成：按参考文献Pauloehrl,T.；Delaittre,G.；Bruns,M.；Meiβler,M.；
Figure GDA0002609531830000244
H.G.；Bastmeyer,M.；Barner-Kowollik,C.Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,9181.公开的方法进行合成。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.91(s,1H),4.96(s,2H),4.13(t,J＝6.1Hz,2H),3.99(s,3H),3.90-3.80(m,1H),3.63-3.52(m,1H),3.04(t,J＝7.2Hz,2H),2.00-1.34(m,6H).MS(ESI):[M+H]436.0318.
(2)组分A-47的合成：将1g壳聚糖加入到75mL异丙醇中形成壳聚糖的悬浮液，25mL的NaOH溶液(10mol/L)分五次慢慢加入到上述壳聚糖的悬浮液中并继续搅拌半小时左右。然后将化合物65(0.2g)加入到上述溶液中并在60℃条件下反应3h。反应结束后，将混合物溶液过滤，滤液用甲醇/水混合溶剂透析三次、甲醇透析两次后，冷冻干燥即可得到化合物65标记的壳聚糖(0.97g)。将化合物65标记的壳聚糖溶于DMSO中，加入对甲苯磺酸脱除二氢吡喃保护即可得到光敏壳聚糖衍生物A-47(0.86g)，根据其核磁氢谱图，可计算出化合物65的修饰度大约为19.2％。
实施例四十八：组分A-48的合成
Figure GDA0002609531830000242
组分A-48的合成：将PEG-4OH(1g，0.05mmol)溶于无水乙腈中，加入K2CO3(55.3mg，0.4mmol)搅拌30min后，加入化合物65(0.17g，0.4mmol)于室温下继续反应24h。反应结束后，将大部分溶剂除掉，在乙醚中重沉淀，并多次洗涤，然后将化合物65标记的聚乙二醇溶于DMSO中，加入对甲苯磺酸脱除二氢吡喃保护即可得到光敏聚乙二醇衍生物A-48(0.82g)，根据核磁氢谱图，可计算出化合物65的修饰度大约为95％。
实施例四十九：组分A-49的合成
Figure GDA0002609531830000243
(1)化合物66的合成：将化合物65(0.5g，1.29mmol)和乙二醇(0.24g，3.87mmol)溶于无水乙腈中，加入K2CO3(0.5g，3.87mmol)做碱，回流过夜反应。待反应结束后，减压旋蒸掉溶剂，过柱纯化，即可得到化合物66(0.34g，72％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.91(s,1H),4.96(s,2H),4.13(t,J＝6.1Hz,2H),3.99(s,3H),3.90-3.80(m,1H),3.79(t,J＝6.1Hz,2H),3.70(t,J＝7.2Hz,2H),3.63-3.52(m,1H),3.56(t,J＝7.2Hz,2H),2.00-1.34(m,6H).MS(ESI):[M+H]417.1527.
(2)化合物67的合成：将化合物66(0.64g,1.72mmol)和三乙胺(0.34g，3.44mmol)溶于干燥的二氯甲烷中，冰浴条件下，甲基丙烯酰氯(0.27g，2.58mmol)慢慢逐滴加入到上述溶液中，滴加完后室温条件下过夜反应。反应结束后，减压旋蒸掉溶剂，过柱纯化即可得到化合物67(0.49g，65％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.91(s,1H),6.25(s,1H),5.68(s,1H),4.96(s,2H),4.13(t,J＝6.1Hz,2H),3.99(s,3H),3.90-3.80(m,1H),3.79(t,J＝6.1Hz,2H),3.70(t,J＝7.2Hz,2H),3.63-3.52(m,1H),3.56(t,J＝7.2Hz,2H),2.00-1.34(m,6H),1.87(s,3H).MS(ESI):[M+H]485.1742.
(3)组分A-49的合成：称取化合物67(0.28g，0.63mmol)、共单体PEG-MA(0.882g，2.52mmol)和引发剂偶氮二异丁腈(11mg)加入到史莱克管中，并加入无水THF溶解，经过多次冷冻-抽真空循环操作处理后，将该反应体系于75℃条件下反应24h。反应结束后，将反应液倒入冷的乙醚中多次重沉淀纯化，收集到的沉淀干燥后将其溶于无水DMSO中，加入对甲苯磺酸将二氢吡喃保护基团脱掉即可得到光敏共聚物A-49(0.81g)。根据核磁氢谱图，可计算出化合物67在共聚物中的含量大约为15.2％。根据GPC测得合成高分子的分子量在25kDa左右，根据投料比计算可得n为12，x为10，y为40。
实施例五十：组分B-10的合成
Figure GDA0002609531830000251
组分B-10的合成：将羧甲基纤维素CMC(400mg)溶于50mL蒸馏水中至完全溶解，加入羟基苯并三唑(HOBt，153mg)、二联胺(90mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl，90mg)加入到上述溶液中室温反应48h后，先用含氯化钠的稀盐酸溶液(pH＝3.5)透析1d，再用纯水透析1d后，冷冻干燥即可得到联胺修饰的羧甲基纤维素(410mg)。TBNS方法测试联胺的接枝率约为12％。
实施例五十一：组分B-11的合成
Figure GDA0002609531830000252
组分B-11的合成：将透明质酸HA(400mg)溶于50mL蒸馏水中至完全溶解，加入羟基苯并三唑(HOBt，153mg)、碳二酰肼(CDH，90mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl，90mg)加入到上述溶液中室温反应48h后，先用含氯化钠的稀盐酸溶液(pH＝3.5)透析1d，再用纯水透析1d后，冷冻干燥即可得到HA-CDH(410mg)。TBNS方法测试酰肼的接枝率约为15％。
实施例五十二：组分B-12的合成
Figure GDA0002609531830000253
组分B-12的合成：将透明质酸HA(400mg)溶于50mL蒸馏水中至完全溶解，加入羟基苯并三唑(HOBt，153mg)、草酸二酰肼(ODH，90mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl，90mg)加入到上述溶液中室温反应48h后，先用含氯化钠的稀盐酸溶液(pH＝3.5)透析1d，再用纯水透析1d后，冷冻干燥即可得到HA-ODH(410mg)。TBNS方法测试酰肼的接枝率约为11％。
实施例五十三：组分B-13的合成
Figure GDA0002609531830000261
组分B-13的合成：将透明质酸HA(400mg)溶于50mL蒸馏水中至完全溶解，加入羟基苯并三唑(HOBt，153mg)、己二酸二酰肼(ADH，90mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl，90mg)加入到上述溶液中室温反应48h后，先用含氯化钠的稀盐酸溶液(pH＝3.5)透析1d，再用纯水透析1d后，冷冻干燥即可得到HA-ADH(410mg)。TBNS方法测试酰肼的接枝率约为14％。
实施例五十四：组分B-14的合成
Figure GDA0002609531830000262
组分B-14的合成：称取四臂羟基聚乙二醇(PEG-4OH，2g，97.3μmol)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺(634.6mg，3.89mmol)溶于干燥的二氯甲烷中，然后在冰浴条件下慢慢加入三苯基膦(1.02g，3.89mmol)并反应约30min。将偶氮二羧酸二异丙酯(765.9μL，3.89mmol)溶于干燥的二氯甲烷中慢慢滴加到上述溶液中并在室温下反应1d。反应结束后，将N-羟基邻苯二甲酰亚胺修饰的四臂聚乙二醇用乙醚重沉淀。然后将上述物质(0.25g，11.8μmol)重新溶解于乙腈中，加入一水合肼(22.9μL，473μmol)继续搅拌2h。然后向该混合物溶液中加入二氯甲烷并抽滤。将滤液减压旋蒸除掉溶剂，即可得到羟胺修饰的四臂聚乙二醇(PEG-4ONH2)。
实施例五十五：组分B-15的合成
Figure GDA0002609531830000263
组分B-15的合成：称取葡聚糖(Dextran，2g，97.3μmol)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺(634.6mg，3.89mmol)溶于干燥的二氯甲烷中，然后在冰浴条件下慢慢加入三苯基膦(1.02g，3.89mmol)并反应约30min。将偶氮二羧酸二异丙酯(765.9μL，3.89mmol)溶于干燥的二氯甲烷中慢慢滴加到上述溶液中并在室温下反应1d。反应结束后，将N-羟基邻苯二甲酰亚胺修饰的葡聚糖用乙醚重沉淀。然后将上述物质(0.25g，11.8μmol)重新溶解于乙腈中，加入一水合肼(22.9μL，473μmol)继续搅拌2h。然后向该混合物溶液中加入二氯甲烷并抽滤。将滤液减压旋蒸除掉溶剂，即可得到羟胺修饰的葡聚糖(Dex-ONH2)。
实施例五十六：邻硝基苄基类光扳机的紫外吸收测试
在本实施例中，将邻硝基苄基类光扳机NB0和NB溶于甲醇(80μmol L-1)中，取3.0mL转移至紫外比色池中，于紫外-可见分光光度计中测量其紫外-可见吸收光谱图，并根据朗伯-比尔定律分别计算出分子的摩尔吸收系数。从图1中看出，组分A-1中的邻硝基苄基类光扳机NB(370nm)的吸收波长明显要长于文献报道的邻硝基苄基类光扳机NB0(360nm)，并能够达到405nm以上，且摩尔吸收系数也有一定的提高。因此，该类分子能够用405nm的光源照射成胶，有效解决了原有分子365nm光源照射的缺陷。此外，其他不同结构光扳机的最大吸收波长如表1所示。
表1
组分 最大吸收波长λmax(nm)
NB<sub>0</sub> 360
A-1 370
A-2 372
A-4 375
A-5 375
A-6 378
A-21 386
A-22 410
A-25 385
A-26 450
A-27 480
A-28 367
A-29 367
A-30 367
A-49 370
注：NB0为文献报道的用于构筑水凝胶的邻硝基苄基类光扳机(Yunlong Yang；Jieyuan Zhang；Zhenzhen Liu；Qiuning Lin；Xiaolin Liu；Chunyan Bao；Yang Wang；Linyong Zhu.Adv.Mater.2016,28,2724.)。NB为本发明组分A-1中的邻硝基苄基类光扳机。其中，HA-NB0即为NB0标记的透明质酸高分子衍生物，HA-NB即为组分A-1。
实施例五十七：光偶合交联方法制备水凝胶
按照本发明方法，于37℃下操作，制得不同的水凝胶前体溶液，如表2所示。
表2
Figure GDA0002609531830000271
将上述不同凝胶溶液分别在405nm(20mW/cm2)条件下照射一定时间，即可得到不同化学组成的水凝胶。不同的凝胶材料具有不同的生物效应，可以根据不同的应用针对性地选择凝胶材料的组成。
注：组分A…为组分A-5～A-48；组分B…为组分B-5～B-14。
表1中1-20wt％为水凝胶前体溶液优选的质量浓度范围。
实施例五十八：光偶合交联水凝胶流变测试
在本实施例中，流变分析采用HAAKE MARS流变仪，在37℃的测试平台
Figure GDA0002609531830000272
上进行流变测试。本实施例研究了紫外光照时间、光照强度和高分子衍生物的质量浓度对水凝胶成胶时间和储存模量的影响。图2为用实施例一制备的组分A-1(即为HA-NB)和组分B-3(即为羧甲基壳聚糖CMCh)以质量比2％wt:2％wt配制的水凝胶前体溶液在光照下的成胶曲线，以及2％HA-NB0和2％CMCh配制水凝胶的成胶曲线(流变测试中，G’为储存模量，G”为损耗模量，当G’超过G”时即为凝胶点)。从图2中看出，实施例一制备的组分A-1(HA-NB)构筑的水凝胶前体溶液在约15s时开始成胶，直至60s左右完全成胶，且完全成胶时的模量可以达到1000Pa左右，因此，无论在成胶速度，还是在凝胶强度上都明显优于原有邻硝基苄基光扳机构筑水凝胶(HA-NB0)的性能。此外，凝胶的强度与凝胶溶液的质量浓度成正比，凝胶的质量浓度越大，所成凝胶的强度越大。其它不同材料组成的水凝胶体系的凝胶点和凝胶强度也有所不同，具体数据如表3所示。
表3
水凝胶材料组成(A/B) 成胶点(s) 凝胶强度(Pa)
HA-NB<sub>0</sub>/CMCh(2％wt：2％wt) 30 200
组分A-1/组分B-3(2％wt：2％wt) 15 650
组分A-1/组分B-3(4％wt：4％wt) 12 2200
组分A-1/组分B-4(2％wt：2％wt) 25 430
组分A-1/组分B-10(2％wt：2％wt) 16 580
组分A-1/组分B-11(2％wt：2％wt) 14 1230
组分A-1/组分B-14(2％wt：2％wt) 15 950
组分A-2/组分B-3(2％wt：2％wt) 13 730
组分A-28/组分B-3(2％wt：2％wt) 15 680
组分A-32/组分B-3(2％wt：2％wt) 11 1650
组分A-36/组分B-3(2％wt：2％wt) 17 450
组分A-37/组分B-3(2％wt：2％wt) 19 540
组分A-38/组分B-3(2％wt：2％wt) 26 430
组分A-39/组分B-3(2％wt：2％wt) 24 380
组分A-40/组分B-3(2％wt：2％wt) 22 780
组分A-42/组分B-3(2％wt：2％wt) 15 670
组分A-43/组分B-3(2％wt：2％wt) 25 450
组分A-44/组分B-3(2％wt：2％wt) 26 320
组分A-45/组分B-3(2％wt：2％wt) 24 580
组分A-49/组分B-3(2％wt：2％wt) 18 660
实施例五十九：光偶合交联水凝胶粘附力测试
在本实施例中，取新鲜猪肠衣若干，将其裁剪成3.5cm×2.5cm大小的肠衣片。然后利用502胶水将其固定在6.5cm×2.5cm大小的钢化玻璃片上。取上述钢化玻璃片，在其中一片粘结肠衣面上涂抹150μL的一定组分的水凝胶前体溶液。然后，将另一片玻璃片置于此片玻璃片上方，使上下两片粘附肠衣的位置完全相对。此时，擦去多余的被挤出的水凝胶前体溶液。然后利用405nm LED光源(20mW/cm2)对肠衣部位进行光照5min，使水凝胶前体溶液在两片肠衣之间原位成胶。成胶完全后，将玻璃片的一端垂直固定，另一端通过细绳连接上能够盛水的容器。随后不断向容器中加入定量水，直到两片玻璃片断开为止。其后，记录下此时水和容器的质量，将其转化成重力也就是玻璃片断裂时的拉力F，利用以下公式计算水凝胶的组织黏附力：
水凝胶组织黏附力＝F/A
其中A为肠衣的粘接面积，测试装置示意图如图3所示。其它不同材料组成的水凝胶体系的组织粘附力也有所不同，具体数据如表4所示。
表4
Figure GDA0002609531830000281
Figure GDA0002609531830000291
实施例六十：光偶合交联水凝胶力学性能测试
在本实施例中，力学性能测试(包括拉伸测试和压缩测试)采用GT-TCS-2000拉力机，拉伸测试样品为长20mm，宽3mm，厚2mm的哑铃型试样，测试速度为5mm/min，压缩测试样品为直径10mm，高3mm的圆柱形试样，测试速度为1mm/min，以实施例一制备的组分A-1(即为HA-NB)和组分B-3(即为羧甲基壳聚糖CMCh)以质量比2％wt:2％wt配制的水凝胶前体溶液在光照下制备水凝胶为例，测试该水凝胶的拉伸性能和压缩性能。该水凝胶能够拉伸至150％左右，拉伸强度为40kPa左右；压缩至75％左右，压缩强度为500kPa左右。其它不同材料组成的水凝胶体系的力学性能也有所不同，具体数据如表5所示。
表5
Figure GDA0002609531830000292
Figure GDA0002609531830000301
实施例六十一：光偶合交联水凝胶生物相容性测试
在本实验中，以实施例一制备的组分A-1(即为HA-NB)和组分B-3(即为羧甲基壳聚糖CMCh)为例，通过CCK-8试剂盒进行评价。首先，在96孔板中种植成纤维细胞HDFs，细胞密度为5×103细胞/孔，然后加入培养基，在37
Figure GDA0002609531830000302
养24h。将各组测试样品溶解于细胞培养液中，加入到培养有细胞的孔板中，继续培养24h，然后将孔中的细胞液吸出，向每个孔中加入100μL的培养基和10μL的CCK-8溶液，继续孵育细胞2h。最后，用酶标仪检测每个孔中450nm的吸光度。细胞存活率计算如下：
Cell Viability(％)＝(实验组吸光度的平均值/控制组吸光度的平均值)×100％
从图4中看出，该类光偶合交联水凝胶具有较好的生物相容性。
此外，体内免疫炎症反应测试中，以实施例一制备的组分A-1(即为HA-NB)和组分B-3(即为羧甲基壳聚糖CMCh)为例，将水凝胶植入兔子皮下，选取不同时间点分别通过组织切片染色分析该类水凝胶对机体产生的炎症反应。
其它不同材料组成的水凝胶体系的生物相容性也有所不同，具体数据如表6所示。
表6
水凝胶材料组成(A/B) 存活率(％) 水凝胶材料组成(A/B) 存活率(％)
组分A-1/组分B-3 98 组分A-37/组分B-3 94
组分A-1/组分B-3 93 组分A-38/组分B-3 93
组分A-1/组分B-4 91 组分A-39/组分B-3 97
组分A-1/组分B-10 94 组分A-40/组分B-3 92
组分A-1/组分B-11 95 组分A-42/组分B-3 94
组分A-1/组分B-14 91 组分A-43/组分B-3 93
组分A-2/组分B-3 92 组分A-44/组分B-3 92
组分A-28/组分B-3 98 组分A-45/组分B-3 97
组分A-32/组分B-3 97 组分A-49/组分B-3 93
组分A-36/组分B-3 96
以上不同组分的水凝胶材料中组分A与组分B关系均为2％wt：2％wt。
实施例六十二：光偶合交联水凝胶应用于术后创面封闭
本实施例中，在SD大鼠背部皮肤构造直径1.8cm的皮肤完全缺损伤口。然后将400μL水凝胶前体溶液(2％组分A-1/2％组分B-3)填充到伤口部位。由于该溶液具有良好的流动性，伤口可以被水凝胶前体溶液充分填充和渗透。然后，在405nm LED光源照射下，在皮肤缺损处原位制备了水凝胶，实现了对创面的封闭(如图5所示)。接下来，对比了原位成型的水凝胶，预先成型的水凝胶和仅用生理盐水清洗处理的SD大鼠背部皮肤伤口在7天内的修复效果。原位成型的水凝胶伤口修复速率要明显快于其他两组，7d时伤口收缩的面积最大，起到了良好的修复效果。而预先成型的水凝胶材料难以充分的填充伤口部位；另外，同组织间不具有共价连接的无缝界面，缺乏良好的组织整合性。新生细胞和组织难以快速的进入到水凝胶材料中，使其充分发挥支架材料的作用。因此，预先成型的水凝胶修复速率和效果要差于原位成型的水凝胶。没有水凝胶填充的伤口修复速率最慢，说明了该光交联水凝胶作为细胞支架材料对伤口修复具有促进作用。
其他不同材料组成的水凝胶体系(组分A：组分A-1～组分A-49；组分B：组分B-1～组分B-15)属于光偶合交联水凝胶，同样可以应用于术后创面封闭。
实施例六十三：光偶合交联水凝胶应用于肠漏封堵
采用新西兰雄性大白兔，分为两组进行盲肠渗漏封堵实验：a：水凝胶处理(2％组分A-1/2％组分B-3)组；b：不做处理的对照组。实验中，在兔子盲肠处制造渗漏的模型，然后将水凝胶前体溶液涂抹到伤口处，待充分渗透后光照原位成胶，成胶后水凝胶能牢固的黏附在缺损处，不需要额外的固定。在手术4周后，通过静脉注射空气的方法处死实验中的兔子，并提取盲肠对实验修复效果进行评价。结果显示，使用水凝胶封堵的盲肠没有发生渗漏的情况，而没用水凝胶处理的盲肠发生了严重的渗漏。经过几周的修复，原来盲肠有缺损的部位经水凝胶处理过后得到了明显的修复，因此，该水凝胶不仅能够有效封堵渗漏，还有利于术后受损组织的修复。
其他不同材料组成的水凝胶体系(组分A：组分A-1～组分A-49；组分B：组分B-1～组分B-15)属于光偶合交联水凝胶，同样可以应用于肠漏封堵。
实施例六十四：光偶合交联水凝胶应用于止血材料
采用SD大鼠，对水凝胶的止血效果进行评价，分为三组进行肝脏止血实验：a：明胶海绵组；b：水凝胶(2％组分A-1/2％组分B-3)组；c阳性对照组。实验大鼠通过水合氯醛(4％水溶液)腹腔注射进行麻醉，注射计量为0.9ml/100g，深度麻醉后，用剃毛器将大鼠前胸部位毛剃光，碘酒消毒。然后沿着胸腔中线切开大约4cm长切口，打开胸腔，暴露肝脏部位。在肝脏左叶做一约2cm切口。a组用明胶海绵进行止血；b组在切口处加水凝胶前体溶液覆盖切面，405nm LED光照2min成胶止血；c组不做任何处理，让肝脏切口渗血自然凝固，用纱布吸去渗血，通过减重法记录出血量，和出血时间(如图6所示)。实验结束后，a组将粘附在切面的明胶海绵一并留在大鼠体内进行缝合。b组水凝胶在切口原位交联并将切面伤口隔离，将肝脏放回胸腔，缝合。c组不做处理直接缝合。14d后，观察SD大鼠肝脏恢复情况，通过腹腔注射过量麻醉剂水合氯醛(4％水溶液，2.7ml/100g)处死大鼠，沿胸腔中线打开胸腔，观察三组大鼠肝脏恢复情况，并拍照记录。同时对肝脏损伤部位组织取样，标本用4％福尔马林溶液固定2d，脱水处理后，石蜡包埋，在用切片机进行组织切片操作，样片厚度5μm。最后对标本进行H&E染色，用光学显微镜拍照观察记录。实验结果显示，b组肝脏恢复良好，水凝胶降解完全，未发生粘连，肝脏切口长出新生肝脏组织。a组大鼠体内明胶海绵仍未降解，并且大鼠普遍器脏与网膜粘连严重。c组普遍存在肝脏与网膜粘连的情况。H&E染色显示实验组肝脏表面光滑圆润，有丰富的血管分布，肝脏界面清晰。而发生粘连的肝脏经H&E染色发现肝脏界面凹凸不平，肝脏与网膜组织粘连在一起，界面处有沉积的炎症细胞。
其他不同材料组成的水凝胶体系(组分A：组分A-1～组分A-49；组分B：组分B-1～组分B-15)属于光偶合交联水凝胶，同样可以应用于止血材料。
实施例六十五：光偶合交联水凝胶应用于软骨组织工程
采用新西兰雄性大白兔，分为三组进行关节软骨的修复实验：a：包裹有软骨细胞的水凝胶(2％组分A-1/2％组分B-3)组，即Gel+软骨细胞组；b：单纯的水凝胶组，即Gel组；c：不做处理的对照组，即Control组。在实验中，该水凝胶前体溶液可以充分的渗透并且填充兔子关节软骨的缺损处，光照成胶后牢固的黏附在缺损处，不需要额外的固定。在手术12周后，通过静脉注射空气的方法处死实验中的兔子，并提取损伤关节对实验修复效果进行评价。兔子关节软骨损伤处大体观照片结果显示，12周后Gel+软骨细胞组在关节缺损处长出了光滑的新生软骨组织，同时和旧的软骨组织进行了良好的整合；在Gel组中软骨也进行了一定的修复，但是还可以看出手术时软骨创伤的轮廓；而在Control组中，软骨组织基本没有修复的情况，损伤处还是明显的空洞(如图7所示)。接下来，进一步利用H&E染色的方法评价了上述各组软骨的修复情况。H&E染色结果显示，Gel+软骨细胞组和Gel组都有新生的组织生成并且同旧的软骨组织整合良好；但是Gel+软骨细胞组的新生组织的厚度要好于Gel组，并且表面平整；而在Control组中难以找到明显新生组织的迹象。另外，采用番红-O和免疫组化染色的方法对新生软骨的成分进行了分析。在Gel+软骨细胞组和Gel组中，新生的软骨组织都表现出了番红-O染色活性，证明该新生的软骨组织内含有正常软骨的糖蛋白成分。同时，Gel+软骨细胞组和Gel组的新生软骨组织都表现出II型胶原的染色活性，证明该软骨组织中含有大量的II型胶原。上述番红-O和免疫组化染色结果证明利用新型光交联水凝胶材料进行软骨修复时，新生的软骨组织是透明软骨。
其他不同材料组成的水凝胶体系(组分A：组分A-1～组分A-49；组分B：组分B-1～组分B-15)属于光偶合交联水凝胶，同样可以应用于软骨组织工程。
实施例六十六：光偶合交联水凝胶应用于骨缺损修复
采用SD大鼠，进行颅骨修复实验，并将上述SD大鼠随机分成3组：a：水凝胶+羟基磷灰石的实验组；b：水凝胶(2％组分A-1/2％组分B-3)组；c：不用材料处理的对照组。实验中，用4％的水合氯醛溶液(0.9mL每克体重)对其进行腹腔麻醉，碘酒消毒。然后，利用外科手术刀片打开大鼠颅骨处头皮。利用牙环钻在老鼠颅骨左右处对称制造直径5mm的完全颅骨缺损模型。在实验组中，取200μL的水凝胶前体溶液填充到SD大鼠颅骨缺损处，使其充分向伤口边缘充分渗透；用405nm LED光源(20mW/cm2)光照30s使其完全成胶；最后用缝合线缝合老鼠的头皮。在对照组中，制造好SD大鼠颅骨缺损模型后，直接缝合头皮，不做其他任何处理。上述SD大鼠在无菌，37℃的环境中饲养8周的时间。然后，利用micro-CT扫描成像的方式对各组中SD大鼠颅骨的修复情况进行了评价。结果显示，在没有进行任何处理的对照组中，SD大鼠的颅骨缺损基本没有进行任何的修复，而用水凝胶填充的颅骨缺损处边缘有新生的成骨形成，但是新生骨组织的量较少，大部分缺损处并没有得到良好的修复，而用水凝胶+羟基磷灰石填充的颅骨缺损处基本得到了修复，大量的新生骨组织在缺损处形成。接着利用Van Gieson染色法对颅骨的组织切片进行了组织学染色分析。结果显示，水凝胶+羟基磷灰石处理的SD大鼠的颅骨缺损处都长出了完整的新生骨组织，而只用水凝胶处理的颅骨缺损处只有少量新生骨组织生成，大部分缺损处的骨组织依旧是缺损状态，在对照组中，几乎没有新生的骨组织生成。该组织染色结果进一步证实了包裹有羟基磷灰石的水凝胶对骨缺损有良好的修复效果。
其他不同材料组成的水凝胶体系(组分A：组分A-1～组分A-49；组分B：组分B-1～组分B-15)属于光偶合交联水凝胶，同样可以应用于骨缺损修复。
实施例六十七：光偶合交联水凝胶应用于3D打印的生物墨水
3D打印技术是近些年来迅速发展的一种三维成型技术，已被广泛应用，目前3D打印技术包括熔融沉积式(FDM)、光固化成型(SLA)、激光烧结式(SLS)、连续液面制造式(CLIP)等。但是适用于带细胞打印的方式目前主要是FDM的方式，带细胞打印的材料主要是水凝胶材料，因此，发展3D打印的生物墨水-可打印的水凝胶材料以及提高水凝胶材料打印的分辨率是该领域研究的基本问题。以实施例一制备的组分A-1和组分B-3为例，将一定质量浓度的水凝胶前体溶液均匀混合细胞后，装入低温打印桶中，控制打印温度在25℃左右，通过温度来调整生物墨水的粘稠度，以获得最佳的打印状态，然后确定合适的打印压力和打印速度，进行不同结构的生物打印，打印完成后通过光照交联水凝胶(或是边打印边光照)，从而获得带细胞且带结构的水凝胶，进行3D细胞培养(如图8所示)。
其他不同材料组成的水凝胶体系(组分A：组分A-1～组分A-49；组分B：组分B-1～组分B-15)属于光偶合交联水凝胶，同样可以应用于3D打印的生物墨水。
实施例六十八：光偶合交联水凝胶应用于药物的包裹与释放
水凝胶是一种能够在水中溶胀但不溶解的交联高分子网络，由于水凝胶大部分由水组成，因此具有非常好的生物相容性，特别适用于药物和生物活性大分子的载体。包裹于水凝胶材料中的药物或生物活性大分子通过分子的扩散作用和材料的降解作用实现药物持续释放的效果。以药物包裹与释放为例具体介绍如下：以实施例一制备的组分A-1和组分B-3，将其溶于生理盐水中，配成一定质量浓度的水凝胶前体溶液，加入一定量的药物分子，取200μL上述溶液置于圆形模具中光照成水凝胶，接着放入24孔细胞培养板中，加入一定量的生理盐水进行药物释放实验，通过紫外测试分析溶液中药物的释放量，以此来评价该材料对药物的释放效果。
其他不同材料组成的水凝胶体系(组分A：组分A-1～组分A-49；组分B：组分B-1～组分B-15)属于光偶合交联水凝胶，同样可以应用于药物的包裹与释放。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物，选自以下组分中的结构：
Figure FDA0002905249860000011
Figure FDA0002905249860000021
其中，P1为一种亲水或水溶性天然高聚物或合成聚合物，或P1独立的选自多种亲水或水溶性天然高聚物或合成聚合物；
亲水或水溶性天然高聚物包括天然多糖类物质及其修饰物或降解物，蛋白及其修饰物、改性物和降解物；
所述天然多糖类物质包括透明质酸、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、海藻酸、葡聚糖、琼脂糖、肝素、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖或壳聚糖季铵盐；
所述蛋白包括各种亲水性或水溶性动植物蛋白、胶原蛋白、血清蛋白、丝素蛋白、弹性蛋白，所述蛋白降解物包括明胶或多肽；
亲水或水溶性合成聚合物包括两臂或多臂聚乙二醇、聚乙烯亚胺、合成多肽、聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；
n≥2。
2.如权利要求1所述的邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物，选自以下组分A中的结构：
Figure FDA0002905249860000022
Figure FDA0002905249860000031
Figure FDA0002905249860000041
组分A中，n≥2，HA为透明质酸；CMC为羧甲基纤维素；Alg为海藻酸；CS为硫酸软骨素；PGA为聚谷氨酸；PEG为聚乙二醇；Chitosan为壳聚糖；Gelatin为明胶；PLL为聚赖氨酸；Dex为葡聚糖；Hep为肝素。
3.权利要求1所述邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物的制备方法，其特征在于，采用化学标记法或人工聚合的方法制备，
化学标记法是利用高分子与邻硝基苄基类光扳机中所含的化学基团间的化学反应而连接，包括以下标记方法：
含羧基的高分子与含羟基、巯基或胺基的邻硝基苄基类小分子标记，
含羟基的高分子与含羧基或含溴的邻硝基苄基类小分子标记，
含胺基的高分子与含羧基或含溴的邻硝基苄基类小分子标记；
人工聚合的方法是利用邻硝基苄基衍生物功能单体与其它共单体共聚，聚合方法包括无规自由基聚合方法和控制自由基聚合方法。
4.权利要求3所述邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物的制备方法，其特征在于，选择以下方法中的任一种：
A、将含有羧基的水溶性高分子于蒸馏水中溶解，加入含有活性官能团羟基或巯基或胺基的邻硝基苄基类小分子后，加入缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和活化剂羟基苯并三唑，搅拌反应，反应结束后，将反应液加入透析袋中用稀盐酸溶液透析，然后冷冻干燥，即得到邻硝基苄基修饰的高分子衍生物；
B、将含有羧基的水溶性高分子于2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液中，搅拌至完全溶解，将含羟基、巯基或胺基的邻硝基苄基类小分子溶于二甲基亚砜后加入上述反应液，将4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐溶于MES缓冲溶液加入上述反应液中反应，然后将反应液倒入透析袋中，用去离子水透析，然后冷冻干燥，即得到邻硝基苄基修饰的高分子衍生物；
C、将含有羟基或胺基的水溶性高分子于蒸馏水中溶解，加入含有活性官能团羧基的邻硝基苄基类小分子后，加入缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和催化剂对甲苯磺酸吡啶盐，然后在室温下搅拌反应，反应结束后，将反应液倒入难溶性溶剂中重沉淀，然后溶于水中用透析袋透析，冷冻干燥后，即得到邻硝基苄基修饰的高分子衍生物；
D、将含有羟基或胺基的水溶性高分子于蒸馏水中溶解，加入含有活性官能团溴的邻硝基苄基类小分子后，加入碳酸钾作为碱，反应，反应结束后，将反应液倒入难溶性溶剂中重沉淀，然后溶于水中用透析袋透析，冷冻干燥后，即得到邻硝基苄基修饰的高分子衍生物；
E、将邻硝基苄基可聚合单体衍生物与一种或几种可聚合共单体经过聚合即得邻硝基苄基修饰的合成共聚物；
所述邻硝基苄基可聚合单体衍生物为丙烯酸酯类化合物、甲基丙烯酸酯类化合物、丙烯酰胺类化合物或甲基丙烯酰胺类化合物，
所述可聚合共单体中至少一种必须是水溶性共单体，所述可聚合共单体为甲基丙烯酸聚乙二醇酯、丙烯酸聚乙二醇酯、甲基丙烯酸、丙烯酸、丙烯酸羟乙酯、丙烯酰胺。
5.一种光偶合交联水凝胶材料制备方法，包括以下步骤：将组分A-如权利要求1所述邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物溶于生物相容性介质得到溶液A；将组分B-含伯胺、联胺、酰肼或羟胺类高分子衍生物溶于生物相容性介质得到溶液B；将溶液A和溶液B混合均匀得到水凝胶前体溶液；水凝胶前体溶液在光源照射下，组分A中的邻硝基苄基在光激发下产生的醛基或酮基与组分B中的伯胺、联胺、酰肼或羟胺基团以希夫碱的方式交联形成水凝胶。
6.根据权利要求5所述光偶合交联水凝胶材料制备方法，其特征在于，
所述组分B-含伯胺、联胺、酰肼或羟胺类高分子衍生物分别具有结构式B-Ⅰ、B-Ⅱ、B-Ⅲ、B-Ⅳ：
Figure FDA0002905249860000051
其中，n≥2，P2、P3、P4、P5为亲水或水溶性天然高聚物或合成聚合物；
亲水或水溶性天然高聚物包括天然多糖类物质及其修饰物或降解物，蛋白及其修饰物、改性物和降解物；
所述天然多糖类物质包括透明质酸、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、海藻酸、葡聚糖、琼脂糖、肝素、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖或壳聚糖季铵盐；
所述蛋白包括各种亲水性或水溶性动植物蛋白、胶原蛋白、血清蛋白、丝素蛋白、弹性蛋白，所述蛋白降解物包括明胶或多肽；
亲水或水溶性合成聚合物包括两臂或多臂聚乙二醇、聚乙烯亚胺、合成多肽、聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮。
7.根据权利要求5所述光偶合交联水凝胶材料制备方法，其特征在于，所述组分B选自以下结构：
Figure FDA0002905249860000052
Figure FDA0002905249860000061
组分B-1至组分B-15中，n≥2。
8.一种光偶合交联水凝胶材料，由权利要求5或6或7所述方法制备而得到。
9.一种用于权利要求8所述光偶合交联水凝胶材料制备的试剂盒，包含：组分A-如权利要求1或2所述邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物；组分B-含伯胺、联胺、酰肼或羟胺类高分子衍生物；以及有关水凝胶制备及应用的说明书；
所述组分B-含伯胺、联胺、酰肼或羟胺类高分子衍生物分别具有结构式B-Ⅰ、B-Ⅱ、B-Ⅲ、B-Ⅳ：
Figure FDA0002905249860000062
其中，n≥2，P2、P3、P4、P5为亲水或水溶性天然高聚物或合成聚合物；
亲水或水溶性天然高聚物包括天然多糖类物质及其修饰物或降解物，蛋白及其修饰物、改性物和降解物；
所述天然多糖类物质包括透明质酸、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、海藻酸、葡聚糖、琼脂糖、肝素、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖或壳聚糖季铵盐；
所述蛋白包括各种亲水性或水溶性动植物蛋白、胶原蛋白、血清蛋白、丝素蛋白、弹性蛋白，所述蛋白降解物包括明胶或多肽；
亲水或水溶性合成聚合物包括两臂或多臂聚乙二醇、聚乙烯亚胺、合成多肽、聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮。
10.一种用于权利要求8所述光偶合交联水凝胶材料制备的试剂盒，其特征在于，包含：组分A-如权利要求1或2所述邻硝基苄基类光扳机修饰的高分子衍生物；组分B-含伯胺、联胺、酰肼或羟胺类高分子衍生物；以及有关水凝胶制备及应用的说明书；所述组分B选自以下结构：
Figure FDA0002905249860000071
组分B-1至组分B-15中，n≥2。
11.如权利要求8所述光偶合交联水凝胶材料的应用，包括以下应用：
所述光偶合交联水凝胶用于制备术后创面封闭用品的应用，
所述光偶合交联水凝胶用于制备组织液渗漏封堵用品的应用，
所述光偶合交联水凝胶用于制备止血材料的应用，
所述光偶合交联水凝胶用于制备组织工程支架材料-骨修复材料的应用，
所述光偶合交联水凝胶作为3D打印材料-生物墨水的应用，
所述光偶合交联水凝胶在制备细胞、蛋白、药物载体上的应用。
12.如权利要求8所述光偶合交联水凝胶材料的应用，其特征在于，所述光偶合交联水凝胶用于制备组织工程支架材料-软骨修复材料的应用。
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