CN103570872B - 高强度光敏感水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高强度光敏感水凝胶及其制备方法和应用,由聚乙二醇甲基丙烯酸酯,2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和带有螺吡喃结构的含双键单体通过自由基聚合共聚而成,将这三种单体和引发剂溶解在溶剂中,通过引发剂引发它们分子上的不饱和键,通过自由基聚合反应制备出水凝胶。本发明的光敏感性水凝胶具有较高的抗拉伸和抗压缩能力,具有良好的生物相容性。并且该水凝胶具有吸附DNA转染细胞的能力以及通过光照调节细胞的贴附和脱贴附行为。
Description
技术领域
本发明高分子水凝胶技术领域,更加具体地说,涉及具有脱附细胞能力和转基因功效的高强度水凝胶的制备,即聚乙二醇甲基丙烯酸酯-共聚-2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪-共聚-含螺吡喃单体共聚物(PEGMA-co-PVDT-co-PSP)水凝胶的制备以及对其应用的研究。
背景技术
高分子水凝胶是一类具有较高的水含量并且在吸水后能够保持原有结构而不被溶解的三维网状聚合物,因其特征类似于软组织且生物相容性良好,因而在生物医学工程领域具有重要的应用价值。但是,对于传统水凝胶,凝胶中的水分子对高分子网络的稀释作用、交联点无序性分布和链节长短不一,以及在成胶过程中交联网络的不均一性造成水凝胶的力学性能很弱,难以用于承受较高载荷的软组织替代,甚至在移动过程中镊子等器物的触动也很容易使凝胶破损,因此限制了其作为生物材料的应用。近年来,科研人员在解决水凝胶较差的力学性能这一问题中取得了重要的进展,提出了许多构筑高强水凝胶的新观点、方法和制造技术。例如双网络(DN)凝胶(J.P.Gong,Y.Katsuyama,T.Kurokawa,Y.Osada,Double-NetworkHydrogelswithExtremelyHighMechanicalStrength.Adv.Mater.15(2003)1155-1158)、大分子微球复合凝胶(MMC)、纳米复合材料凝胶(NC)、环滑凝胶(TP)、四臂-聚乙二醇凝胶和偶极-偶极增强凝胶等。这些文献报道的技术主要是致力于增强水凝胶的强度,如拉伸、压缩、延展性和断裂能等。最近,我们课题组报道了一系列基于二氨基三嗪氢键的高强度凝胶(L.Tang,W.Liu,G.Liu,High-StrengthHydrogelswithIntegratedFunctionsofH‐bondingandThermoresponsiveSurface-MediatedReverseTransfectionandCellDetachmentAdv.Mater.22(2010)2652-2656)。其优异的力学强度源于凝胶本体中二氨基三嗪基团之间形成的刚性超分子六元环结构的氢键;同时,凝胶表面的二氨基三嗪可与DNA的碱基对形成氢键从而锚固DNA,这样可实现表面介导的反向转染或基质介导的转染。已有文献报道(Z.Cao,W.Liu,D.Liang,G.Guo,J.Zhang,DesignofPoly(vinyldiaminotriazine)-BasedNonviralVectorsviaSpecificHydrogenBondingwithNucleicAcidBasePairs.Adv.Funct.Mater.17(2007)246-252)线性聚2-乙烯基-4,6-二氨基,1,3,5-三嗪(PVDT)可以与质粒DNA形成复合物(PVDT/pDNA)在细胞内实现有效的基因转染。通过PVDT与凝胶表面的二氨基三嗪残基之间的强氢键作用可将PVDT/pDNA复合物吸附在凝胶表面,可有效提高转染效率。
发明内容
基于以上技术背景,本发明的目的在于提供一种高强度光敏感型PEGMA-co-PVDT-co-PSP水凝胶及其制备方法和应用。该光敏感性水凝胶具有较高的抗拉伸和抗压缩能力,具有良好的生物相容性。并且该水凝胶具有吸附DNA转染细胞的能力以及通过光照调节细胞的贴附和脱贴附行为。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现:
高强度光敏感水凝胶,由聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA),2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪(VDT)和带有螺吡喃结构的含双键单体(SP)通过自由基聚合共聚而成,将这三种单体和引发剂、交联剂溶解在溶剂中,通过引发剂引发它们分子上的不饱和键,通过自由基聚合反应制备出水凝胶。
在上述技术方案中,所述聚乙二醇甲基丙烯酸酯根据分子中聚乙二醇片段的大小,以调整其数均分子量,选择数均分子量300—800的低聚乙二醇甲基丙烯酸酯(OEGMA),由于在引发自由基聚合后,所述聚乙二醇甲基丙烯酸酯分子中的双键被引发实现自由基聚合,最终形成水凝胶网络,故对作为初始原料使用的聚乙二醇甲基丙烯酸酯的分子量及其分布不做特意要求。
在上述技术方案中,所述带有螺吡喃结构的含双键单体,命名为2-[1-丙烯酸-3’,3’-二甲基-6-硝基螺(吲哚-2’,2[2氢-1]苯并吡喃)酯]基丙烯酰胺;按照下述步骤进行制备:将羧基螺吡喃(化学命名为1-(β-羧乙基)-3’,3’-二甲基-6-硝基螺(吲哚-2’,2[2氢-1]苯并吡喃))、N-(2-羟乙基)丙烯酰胺和4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于四氢呋喃中,向其中滴加二环己基碳二亚胺(DCC),于室温20—25℃下反应至少24小时,优选24—30小时;将得到的沉淀洗涤后溶于苯中并再次过滤,所得溶液加入正己烷中,经沉淀得到纯化的带有螺吡喃结构的含双键单体(SP)。
其中所述羧基螺吡喃、N-(2-羟乙基)丙烯酰胺、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和二环己基碳二亚胺(DCC)的用量为等摩尔,即四个参与反应的物质的摩尔比为1:1:1:1。
所述羧基螺吡喃按照下述步骤进行制备【羧基螺吡喃参考文献J.Chen,F.Zeng,S.Wu,J.Zhao,Q.Chen,Z.Tong,ReversiblefluorescencemodulationthroughenergytransferwithABCtriblockcopolymermicellesasscaffolds.Chem.Commun.43(2008)5580–5582.】:
2,3,3-三甲基-3H-吲哚(0.06mol)和3-碘丙酸(0.06mol)溶于5ml甲基乙基酮,氮气保护下加热至100℃回流三小时。将上述反应所得季铵盐溶液溶于大量蒸馏水中,用1,2-二氯乙烷(DCE)反复洗涤溶液。蒸发掉水分,得到纯化的碘化l-(β-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚。上述碘化物和等摩尔的5-硝基水杨醛、哌啶溶于5ml甲基乙基酮中加热回流三小时。反应所得红棕色溶液在室温下放置过夜,将产生的黄色结晶颗粒用甲醇反复洗涤得到纯化的含羧基的螺吡喃。
制备上述本发明水凝胶的方法,按照下述步骤进行:
将聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA),2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪(VDT),带有螺吡喃结构的含双键单体(SP)和引发剂、交联剂溶解在溶剂中,通过引发剂引发三种单体的不饱和键,在隔绝氧气的条件下通过自由基聚合反应制备出既可脱附细胞又可介导基因转染的水凝胶。
在本发明的技术方案中,以(低)聚乙二醇甲基丙烯酸酯、2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、含螺吡喃单体为共聚单体,以聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA,Mn=575)作为交联剂。聚乙二醇二丙烯酸酯分子链中间为“氧-碳-碳-氧”单键相连的骨架结构(即聚乙二醇分子的主链结构—(CH2CH2O)n),采用热源或者光源使引发剂提供自由基,再由自由基引发低聚乙二醇甲基丙烯酸酯、2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和含螺吡喃单体中的双键,发生共聚交联。最终制备的水凝胶材料中,具有(低)聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和聚螺吡喃三种物质的链段。其中,2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪分子上的大量氨基间形成大量氢键,极大提高了水凝胶的韧性和强度,同时可以将质粒DNA固定在凝胶的表面,赋予该凝胶负载基因的功能;(低)聚乙二醇甲基丙烯酸酯能提供柔性的亲水链段,提高凝胶的亲水性;螺吡喃的引入,使水凝胶具有光敏性,在可见光下提高凝胶的疏水性,紫外光下提高凝胶的亲水性,从而使凝胶表面在紫外/可见光刺激下发生可逆的亲疏水变化,有利于控制细胞的贴附和脱附(含螺吡喃结构的分子可以在可见光和紫外光下分别异构化为闭环非离子结构和开环的两性离子结构)。上述三部分协同作用,使整个水凝胶材料体现出高吸水性,高力学强度,以及良好的生物相容性,同时具有双重功能:细胞脱附和基因转染。
利用引发剂提供的自由基引发(低)聚乙二醇甲基丙烯酸酯,VDT和SP共聚,利用交联剂PEGDA使其发生交联。其中引发剂可以选择高分子聚合领域中常用的热引发剂,如偶氮二异丁腈(ABIN)、过氧化苯甲酰(BPO),或者光引发剂,如1-[4-(2-羟乙氧基)-亚苯基]-2-羟基-2′,2′-二甲基乙酮(Irgacure2959)、甲基乙烯基酮、安息香。如果选择热引发剂,则需要首先利用惰性气体(如氮气、氩气或者氦气)排除反应体系中的氧气,避免阻聚作用;然后根据引发剂的活性和用量,将反应体系加热到所用引发剂的引发温度之上并保持相当长的时间,如1h以上或者更长(1-5h),以保证引发剂能够产生足够多的自由基,引发反应体系持续发生自由基聚合反应,最终制备本发明的水凝胶。如果选择光引发剂,则可以选用透明密闭的反应容器,在紫外光照射的条件下引发自由基聚合,由于光引发效率高于热引发,需要根据所选引发剂的活性和用量调整照射时间,照射时间可短于热引发的加热时间,如20分钟或者更长(30min-1h)。
在本发明的技术方案中,应当根据(低)聚乙二醇甲基丙烯酸酯、VDT、SP和使用的引发剂、交联剂的溶解性,选择能够完全溶解上述四种物质或者能够与上述四种物质完全互溶的溶剂,形成均匀反应体系,例如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜等。
在制备方案中,制备凝胶时,VDT和(低)聚乙二醇甲基丙烯酸酯的质量比为(1-3):1,光敏单体SP的质量为非光敏单体总量(VDT+(低)聚乙二醇甲基丙烯酸酯)的1%-6%,交联剂与单体质量总和的比为0.6-0.7:1,引发剂的质量为单体与交联剂总质量的2%-4%。在反应结束后,从反应容器中取出共聚物,去除未参加反应的单体、引发剂和溶剂后,浸泡在水中直至达到溶胀平衡(如浸泡7天,每隔12h更换一次水,达到溶胀平衡)。
本发明提供的一种高强度POEGMA-co-PVDT-co-PSP水凝胶是以(低)聚乙二醇甲基丙烯酸酯、2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和含螺吡喃单体为原料,在引发剂和交联剂存在下引发共聚交联制成。使水凝胶同时综合了(低)聚乙二醇甲基丙烯酸酯、2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和螺吡喃的性质,具有很高的吸水率,很强的抗拉伸和抗压缩能力,具有显著的光敏感性和良好的生物相容性。该水凝胶在室温下制备,制备方法简单,耗能低,产品易于长期保存和长途运输。如本发明的高强度光敏感水凝胶、或者依据制备方法制备的高强度光敏感水凝胶在调节细胞贴附行为中的应用,在可见光照射下实现细胞的贴附,在紫外光照射下实效细胞的脱贴附。
附图说明
图1为羧基螺吡喃单体在氘代DMSO中的核磁谱图。
图2为双键修饰的螺吡喃单体在氘代DMSO中的核磁谱图。
图3为经可见光和紫外光照射的本发明水凝胶照片。
图4为L929细胞在本发明凝胶上贴附的显微镜照片,其中(A)是可见光下L929细胞在本发明凝胶上贴附的显微镜照片;(B)是经紫外光照射15min后细胞在凝胶表面脱附的显微镜照片;(C)是细胞脱除后凝胶表面残留细胞的显微镜照片。
图5为本发明水凝胶表面经局部照射紫外光15min后的显微镜照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案,使用药品来自sigma公司,等级为分析纯,低聚乙二醇甲基丙烯酸酯数均分子量为475,聚乙二醇二丙烯酸酯数均分子量为575。
首先,按照文献记载制备含羧基的螺吡喃
2,3,3-三甲基-3H-吲哚(0.06mol)和3-碘丙酸(0.06mol)溶于5ml甲基乙基酮,氮气保护下加热至100℃回流三小时。将上述反应所得季铵盐溶液溶于大量蒸馏水中,用1,2-二氯乙烷(DCE)反复洗涤溶液。蒸发掉水分,得到纯化的碘化l-(β-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚。上述碘化物和等摩尔的5-硝基水杨醛、哌啶溶于5ml甲基乙基酮中加热回流三小时。反应所得红棕色溶液在室温下放置过夜,将产生的黄色结晶颗粒用甲醇反复洗涤得到纯化的含羧基的螺吡喃。
其次,制备带有双键结构的螺吡喃单体
将0.05mol上述羧基螺吡喃与0.05molN-(2-羟乙基)丙烯酰胺、0.05mol4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于15ml四氢呋喃中,逐滴加入0.05mol二环己基碳二亚胺(DCC),室温反应24小时。将剩余溶液倒入大量蒸馏水中洗涤得到紫红色沉淀。将此沉淀溶于苯中并再次过滤。所得溶液加入大量正己烷中,经沉淀得到纯化的含有双键的螺吡喃单体(SP)。
使用核磁共振(德国BrukerAdvance400MHz高分辨超导核磁共振仪)对上述制备的产品进行分析,结果如附图1和2所示,图1与羧基螺吡喃参考文献中【J.Chen,F.Zeng,S.Wu,J.Zhao,Q.Chen,Z.Tong,ReversiblefluorescencemodulationthroughenergytransferwithABCtriblockcopolymermicellesasscaffolds.Chem.Commun.43(2008)5580–5582.】给出的核磁谱图一致;图2中,经双键修饰后,羧基-COOH的特征峰(δ12.2)消失,碳碳双键-CH=CH2的特征峰(δ5.6,6.1,6.2)出现,证明该小分子被成功地修饰上双键。
利用上述制备的带有双键结构的螺吡喃单体(SP)、低聚乙二醇甲基丙烯酸酯(OEGMA)和2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪(VDT)制备水凝胶,使用POVSPx-y-z表示,x-y-z代表OEGMA/VDT/SP的质量比。
实施例1:
将单体低聚乙二醇甲基丙烯酸酯(6mg)、2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪(6mg)、SP(0.6mg)和交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(8.4mg)加入到1.5ml离心管中,用210μl的DMSO溶解单体和交联剂后,加入光引发剂Irgacure2959(0.5mg)。将含有单体,交联剂和引发剂的溶剂注入密闭模具中,模具在紫外固化箱中照射30min,以引发自由基聚合。随后打开模具取出凝胶,用去离子水反复冲洗数次并浸泡7天,每隔12h更换上述去离子水。
凝胶表面细胞培养与脱附:将得到的凝胶浸入医用酒精中灭菌4h后放入96孔板中,加入200μlDMEM培养基置换医用酒精。将L929细胞悬液加到有凝胶的培养板中培养24小时使其在凝胶表面贴附并铺展,再将培养板置于365nm紫外光下照射15min使凝胶中螺吡喃异构化为两性离子结构,凝胶表面变得更亲水,细胞从凝胶上脱落。通过MTT法测量从凝胶上脱附的细胞及残留在凝胶上的细胞测得细胞的脱附率为:86.5%。
凝胶表面介导的基因转染:将得到的凝胶浸入医用酒精中灭菌4h后放入96孔板中,加入200μlDMEM培养基置换医用酒精。凝胶浸入DMEM培养基24小时候后,将预先复合4h的含有1μg质粒DNA的PVDT/pDNA复合物(质量比0.3125:1)加入到有凝胶的孔板中。吸附24小时后,将培养至指数生长期的COS-7细胞悬液加入到已经吸附了DNA的凝胶中,培养24小时后,换培养液培养24小时。之后置于365nm紫外光下照射15min使细胞脱附,裂解细胞,测定其中的荧光素酶活性为:1.85×106。
实施例2:
将单体低聚乙二醇甲基丙烯酸酯(6mg)、2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪(12mg)、SP(0.9mg)和交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(12.6mg)加入到1.5ml离心管中,用315μl的DMSO溶解单体和交联剂后,加入光引发剂Irgacure2959(0.7mg)。将含有单体,交联剂和引发剂的溶剂注入密闭模具中,模具在紫外固化箱中照射30min,以引发自由基聚合。随后打开模具取出凝胶,用去离子水反复冲洗数次并浸泡7天,每隔12h更换上述去离子水。
凝胶表面细胞培养与脱附:将得到的凝胶浸入医用酒精中灭菌4h后放入96孔板中,加入200μlDMEM培养基置换医用酒精。将L929细胞悬液加到有凝胶的培养板中培养24小时使其在凝胶表面贴附并铺展,再将培养板置于365nm紫外光下照射15min使凝胶中螺吡喃异构化为两性离子结构,凝胶表面变得更亲水,细胞从凝胶上脱落。通过MTT法测量从凝胶上脱附的细胞及残留在凝胶上的细胞测得细胞的脱附率为:84.1%。
凝胶表面介导的基因转染:将得到的凝胶浸入医用酒精中灭菌4h后放入96孔板中,加入200μlDMEM培养基置换医用酒精。凝胶浸入DMEM培养基24小时候后,将预先复合4h的含有1μg质粒DNA的PVDT/pDNA复合物(质量比0.3125:1)加入到有凝胶的孔板中。吸附24小时后,将培养至指数生长期的COS-7细胞悬液加入到已经吸附了DNA的凝胶中,培养24小时后,换培养液培养24小时。之后置于365nm紫外光下照射15min使细胞脱附,裂解细胞,测定其中的荧光素酶活性为:3.89×106。
实施例3:
将单体低聚乙二醇甲基丙烯酸酯(6mg)、2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪(18mg)、SP(1.2mg)和交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(16.8mg)加入到1.5ml离心管中,用420μl的DMSO溶解单体和交联剂后,加入光引发剂Irgacure2959(0.9mg)。将含有单体,交联剂和引发剂的溶剂注入密闭模具中,模具在紫外固化箱中照射30min,以引发自由基聚合。随后打开模具取出凝胶,用去离子水反复冲洗数次并浸泡7天,每隔12h更换上述去离子水。
凝胶表面细胞培养与脱附:将得到的凝胶浸入医用酒精中灭菌4h后放入96孔板中,加入200μlDMEM培养基置换医用酒精。将L929细胞悬液加到有凝胶的培养板中培养24小时使其在凝胶表面贴附并铺展,再将培养板置于365nm紫外光下照射15min使凝胶中螺吡喃异构化为两性离子结构,凝胶表面变得更亲水,细胞从凝胶上脱落。通过MTT法测量从凝胶上脱附的细胞及残留在凝胶上的细胞测得细胞的脱附率为:82%。
凝胶表面介导的基因转染:将得到的凝胶浸入医用酒精中灭菌4h后放入96孔板中,加入200μlDMEM培养基置换医用酒精。凝胶浸入DMEM培养基24小时候后,将预先复合4h的含有1μg质粒DNA的PVDT/pDNA复合物(质量比0.3125:1)加入到有凝胶的孔板中。吸附24小时后,将培养至指数生长期的COS-7细胞悬液加入到已经吸附了DNA的凝胶中,培养24小时后,换培养液培养24小时。之后置于365nm紫外光下照射15min使细胞脱附,裂解细胞,测定其中的荧光素酶活性为:6.40×106。
实施例4:
将单体低聚乙二醇甲基丙烯酸酯(6mg)、2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪(12mg)、SP(0.18mg)和交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(12.7mg)加入到1.5ml离心管中,用309μl的DMSO溶解单体和交联剂后,加入光引发剂Irgacure2959(1.24mg)。将含有单体,交联剂和引发剂的溶剂注入密闭模具中,模具在紫外固化箱中照射30min,以引发自由基聚合。随后打开模具取出凝胶,用去离子水反复冲洗数次并浸泡7天,每隔12h更换上述去离子水。
凝胶表面细胞培养与脱附:将得到的凝胶浸入医用酒精中灭菌4h后放入96孔板中,加入200μlDMEM培养基置换医用酒精。将L929细胞悬液加到有凝胶的培养板中培养24小时使其在凝胶表面贴附并铺展,再将培养板置于365nm紫外光下照射15min使凝胶中螺吡喃异构化为两性离子结构,凝胶表面变得更亲水,细胞从凝胶上脱落。通过MTT法测量从凝胶上脱附的细胞及残留在凝胶上的细胞测得细胞的脱附率为:85%。
凝胶表面介导的基因转染:将得到的凝胶浸入医用酒精中灭菌4h后放入96孔板中,加入200μlDMEM培养基置换医用酒精。凝胶浸入DMEM培养基24小时候后,将预先复合4h的含有1μg质粒DNA的PVDT/pDNA复合物(质量比0.3125:1)加入到有凝胶的孔板中。吸附24小时后,将培养至指数生长期的COS-7细胞悬液加入到已经吸附了DNA的凝胶中,培养24小时后,换培养液培养24小时。之后置于365nm紫外光下照射15min使细胞脱附,裂解细胞,测定其中的荧光素酶活性为:4.10×106。
实施例5:
将单体低聚乙二醇甲基丙烯酸酯(6mg)、2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪(18mg)、SP(1.44mg)和交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(15.26mg)加入到1.5ml离心管中,用407μl的DMSO溶解单体和交联剂后,加入光引发剂Irgacure2959(1.22mg)。将含有单体,交联剂和引发剂的溶剂注入密闭模具中,模具在紫外固化箱中照射30min,以引发自由基聚合。随后打开模具取出凝胶,用去离子水反复冲洗数次并浸泡7天,每隔12h更换上述去离子水。
凝胶表面细胞培养与脱附:将得到的凝胶浸入医用酒精中灭菌4h后放入96孔板中,加入200μlDMEM培养基置换医用酒精。将L929细胞悬液加到有凝胶的培养板中培养24小时使其在凝胶表面贴附并铺展,再将培养板置于365nm紫外光下照射15min使凝胶中螺吡喃异构化为两性离子结构,凝胶表面变得更亲水,细胞从凝胶上脱落。通过MTT法测量从凝胶上脱附的细胞及残留在凝胶上的细胞测得细胞的脱附率为:80%。
凝胶表面介导的基因转染:将得到的凝胶浸入医用酒精中灭菌4h后放入96孔板中,加入200μlDMEM培养基置换医用酒精。凝胶浸入DMEM培养基24小时候后,将预先复合4h的含有1μg质粒DNA的PVDT/pDNA复合物(质量比0.3125:1)加入到有凝胶的孔板中。吸附24小时后,将培养至指数生长期的COS-7细胞悬液加入到已经吸附了DNA的凝胶中,培养24小时后,换培养液培养24小时。之后置于365nm紫外光下照射15min使细胞脱附,裂解细胞,测定其中的荧光素酶活性为:6.10×106。
对比例:
将单体低聚乙二醇甲基丙烯酸酯(12mg)和交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(8mg)加入到1.5ml离心管中,用200μl的DMSO溶解单体和交联剂后,加入光引发剂Irgacure2959(0.4mg)。将含有单体,交联剂和引发剂的溶剂注入密闭模具中,模具在紫外固化箱中照射30min,以引发自由基聚合。随后打开模具取出凝胶,用去离子水反复冲洗数次并浸泡7天,每隔12h更换上述去离子水。
凝胶表面细胞培养与脱附:将得到的凝胶浸入医用酒精中灭菌4h后放入96孔板中,加入200μlDMEM培养基置换医用酒精。将L929细胞悬液加到有凝胶的培养板中培养24小时使其在凝胶表面贴附并铺展,再将培养板置于365nm紫外光下照射15min使凝胶中螺吡喃异构化为两性离子结构,凝胶表面变得更亲水,细胞从凝胶上脱落。通过MTT法测量从凝胶上脱附的细胞及残留在凝胶上的细胞测得细胞的脱附率为:4.7%。
凝胶表面介导的基因转染:将得到的凝胶浸入医用酒精中灭菌4h后放入96孔板中,加入200μlDMEM培养基置换医用酒精。凝胶浸入DMEM培养基24小时候后,将预先复合4h的含有1μg质粒DNA的PVDT/pDNA复合物(质量比0.3125:1)加入到有凝胶的孔板中。吸附24小时后,将培养至指数生长期的COS-7细胞悬液加入到已经吸附了DNA的凝胶中,培养24小时后,换培养液培养24小时。之后裂解细胞,测定其中的荧光素酶活性为:5.82×105。
对于以上各组水凝胶,按相同步骤制备片状或柱状试样,使用WGW微机控制电子万能试验机(济南时代纪元仪器有限公司)进行力学性能测试。其中进行拉伸性能测试的样品的尺寸为20mm×5mm×0.4mm的片状凝胶。进行压缩性能测试的样品尺寸为直径4mm,高6mm的圆柱。拉伸测试速率为100mm/min,压缩速率为10mm/min。表1为上述实施例得到的水凝胶样品的各项性能参数。可见其具有较高的平衡吸水率,以及很好的力学性能。
表1.POEGMA-co-PVDT-co-PSP水凝胶的物理性能参数
--a指该凝胶太弱以至于无法测量其强度
以可见光和紫外光照射照射本发明水凝胶,如附图3所示,以实现本发明水凝胶的形态变化。利用本发明的水凝胶进行细胞实验如下:
水凝胶消毒后铺于96孔板中,经PBS溶胀平衡后,将L929细胞悬液以1×104/孔的密度接种到凝胶表面,将细胞置于37℃,5%CO2,100%湿度条件下培养24小时,使细胞贴附在凝胶表面。将凝胶置于365nm紫外光源(美国Spectronics公司,XL-1000,2mW/cm2)下照射15min,使细胞从凝胶表面脱附。紫外光照射前后凝胶表面的细胞状态均用OLYMPUSCKX41(日本Olympus公司)显微镜拍照观察。
细胞的脱附率用MTT法测试。MTT化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐。过程如下:凝胶表面培养细胞24小时后,紫外光下照射15min,用移液枪吹打使脱附的细胞悬浮在培养基中,再将每孔的培养基完全吸出,分别滴入到新的培养板中,将带有残留贴附细胞的凝胶的培养板与脱附下来的细胞所在的新培养板中每孔分别加入180μl的无血清的新鲜DMEM培养基和20μl浓度为5mg/ml的MTT溶液,继续培养4小时。吸走每孔的培养基,加入200μl的DMSO溶解形成的紫色结晶,测试每孔中DMSO溶液的吸光度。脱附率的定义为:脱附细胞的吸光度/(脱附细胞的吸光度+残余贴附细胞的吸光度)×100%。
局部脱细胞的方法:在紫外光照射过程中用锡纸制成的遮光罩遮盖部分区域,可使部分细胞保留在凝胶表面。
由附图4可知,(A)中可以看出,可见光下细胞在凝胶表面可以均匀铺展生长,状态良好,经紫外光照射后,细胞在凝胶表面逐渐回缩,15min后便回缩成球状,从凝胶表面脱附,如(B)所示。用移液枪温和地吹打后,细胞从表面脱离,形成细胞悬液,凝胶表面有少量细胞残余,如(C)所示。导致这一现象的原因是水凝胶中的光敏成分SP在可见光下成疏水的闭环结构,使凝胶表面呈现较疏水的状态,有利于细胞粘附生长,而在紫外照射下,SP迅速异构化为亲水的开环结构,使凝胶表面变得更亲水,不利于细胞粘附,细胞从表面逐渐脱附下来。
由图5可以看出,将凝胶部分遮盖后照射紫外光可以达到局部细胞脱附的效果。在经紫外局部照射后用移液枪对整个凝胶表面进行吹打,未经照射的部分细胞依然保持原有的铺展粘附的状态,而经紫外照射的部分细胞基本脱落。这是由于凝胶的照射部位发生了亲水性转变,而遮盖部位依然保持原疏水的状态。
可知如本发明的高强度光敏感水凝胶、或者依据制备方法制备的高强度光敏感水凝胶在调节细胞贴附行为中的应用,在可见光照射下实现细胞的贴附,在紫外光照射下实效细胞的脱贴附。
以上对本发明做了示例性的描述,应该说明的是,在不脱离本发明的核心的情况下,任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (5)
1.高强度光敏感水凝胶,其特征在于,由聚乙二醇甲基丙烯酸酯,2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和带有螺吡喃结构的含双键单体通过自由基聚合共聚而成,将这三种单体和引发剂、交联剂溶解在溶剂中,通过引发剂引发它们分子上的不饱和键,通过自由基聚合反应制备出水凝胶;所述带有螺吡喃结构的含双键单体为2-[1-丙烯酸-3’,3’-二甲基-6-硝基螺(吲哚-2’,2[2氢-1]苯并吡喃)酯]基丙烯酰胺;所述交联剂为聚乙二醇二丙烯酸酯。
2.根据权利要求1所述的高强度光敏感水凝胶,其特征在于,所述聚乙二醇甲基丙烯酸酯根据分子中聚乙二醇片段的大小,以调整其数均分子量,选择数均分子量300—800的低聚乙二醇甲基丙烯酸酯;所述交联剂为聚乙二醇二丙烯酸酯Mn=575。
3.根据权利要求1所述的高强度光敏感水凝胶,其特征在于,制备凝胶时,2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和聚乙二醇甲基丙烯酸酯的质量比为(1-3):1,带有螺吡喃结构的含双键单体的质量为非光敏单体2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和聚乙二醇甲基丙烯酸酯总量的1%-6%,交联剂与单体聚乙二醇甲基丙烯酸酯,2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和带有螺吡喃结构的含双键单体质量总和的比为0.6-0.7:1,引发剂的质量为聚乙二醇甲基丙烯酸酯、2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、带有螺吡喃结构的含双键单体与交联剂总质量的2%-4%;所述溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜。
4.根据权利要求1所述的高强度光敏感水凝胶,其特征在于,所述引发剂选择高分子聚合领域中常用的热引发剂或者光引发剂。
5.根据权利要求4所述的高强度光敏感水凝胶,其特征在于,所述高分子聚合领域中常用的热引发剂为偶氮二异丁腈、过氧化苯甲酰,所述光引发剂为1-[4-(2-羟乙氧基)-亚苯基]-2-羟基-2′,2′-二甲基乙酮、甲基乙烯基酮、安息香。
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