JP6514298B2 - 高麗人参の実抽出物を含有する血行促進、血管老化防止及び虚血性心疾患治療用組成物 - Google Patents
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Description
本発明の上記及び他の目的、性質、並びに他の利点は、特許請求の範囲とともに、下記の詳細な説明からより明確に理解されるであろう。
本発明は、有効成分として高麗人参の実抽出物を含有し、血管内皮細胞でのNO生成を促進させることによって、血液循環を円滑にし、血管内皮細胞の生存を増進させ、血管内皮細胞の分化と移動を促進させ、血管新生を促進させる組成物を提供する。本発明の前記組成物は、血管内皮細胞での一酸化窒素(NO)生成を増加させることで陰茎の勃起を増進させ、この結果、男性性機能を改善するために、有効成分として高麗人参の実抽出物を含有してよく、また、さらにL−アルギニンを含有してもよい。
1)高麗人参の実の前処理:収穫した生高麗人参の実から種子を分離し除去した後、高麗人参の実の果肉と果皮を日光乾燥または熱風乾燥し、乾燥された高麗人参の実を得た。
2)高麗人参の実抽出物の調製:乾燥された高麗人参の実1kgにエタノール3Lを加えて還流抽出し、ろ過した後、40〜45℃で減圧濃縮して高麗人参の実抽出物300gを得た。
1)実施例1で得た高麗人参の実抽出物100gを水1Lに溶解させ、ジエチルエーテル500mlを加え、分液漏斗を用いて脂溶性成分を除去した。しかる後、残った水層に水飽和ブタノール500mlを加えた。この処理を3回繰り返し行った。その結果物のブタノール層を減圧濃縮して高麗人参の実抽出物(天然サポニン)60gを得た。
前記実施例1において高麗人参の実の代りに紅参の根を用いたことを除いては、実施例1と同じ方法で調製した。
1.ジンセノサイド(高麗人参サポニン)成分の分析
実施例1及び比較例1においてそれぞれ高麗人参の実と高麗人参の根抽出物を調製した後、これら抽出物にエーテル処理を施して脂溶性成分を除去した。その後、ブタノール(BuOH)により天然サポニン(crude saponin)を抽出し、濃縮した。HPLCを用いて抽出された天然サポニン中のジンセノサイド(高麗人参サポニン)の成分分析を実施し、その結果を下記表1に表した。
実施例1において調製した高麗人参の実抽出物は、高麗人参の根とは異なる「果実」であって、高麗人参の根にはほとんど含有されていないビタミン及びミネラル成分を含有しているものと考えられ、その成分分析を実施し、その結果を下記表2に表した。
ヒトの血管内皮細胞にはeNOS(内皮一酸化窒素合成酵素)が存在し、その活性が増加することでNO(酸化窒素)を生成させ、その結果、血管を拡張させ、血行を促進する役割を果たすようになる。ヒトの血管内皮細胞を培養した後、高麗人参の実抽出物(実施例1、2)と一般の紅参の根抽出物(比較例1)を培地に処理して生成されるNOの量を比較した。
血管の老化を抑制し、血管を新生させるうえで最も基本的な段階が血管内皮細胞の活性を促進させることであると言える。陽性対照群(VEGF;Vascular endothelial growth factor)と高麗人参の実抽出物(実施例1、2)の処理群おいて、血管内皮細胞の生存率を比較した。
血管新生を測定する一般的な方法の一つである細胞移動性を測定し分析した。細胞の移動性分析は、Boyden's chamber(トランスウェル)を用いた。24ウェルプレートにそれぞれ血清のないM199培養液600μlを入れ、培養液に高麗人参の実抽出物(実施例1、2をそれぞれ25、50、100μg/mL)及び陽性対照群を処理した後、トランスウェルの下面にゼラチン(1mg/ml)を塗抹し、上面に2×104個の細胞を付着させた。約4時間経過した後に上面の細胞を綿棒を利用して除去し、下面へ移動した細胞をヘマトキシリンとエオシンで染色し、染色された総細胞数を数えた。図3aは染色された血管内皮細胞の移動性を撮影した写真であり、図3bは細胞の移動性を無処理群の移動性と比較して示すグラフである。
血管新生調節能の測定により細胞による管形成度合いを測定した。一般に、細胞の管形成能力はマトリゲルを用いて実験する。24ウェルプレートにマトリゲル250μlを塗抹した後、2.5×104個の細胞をマトリゲル上に付着させる。所定の時間間隔をおいて無処理群、陽性対照群(VEGF)、高麗人参の実抽出物処理群(実施例1、2)の管形成が生じることを観察し、適正な時点で細胞を固定染色して管形成が生じた度合いをコンピュータープログラムを用いて分析した。図4aは固定染色された細胞の写真であり、図4bは形成された管の長さを無処理群の管の長さと比較して示すグラフである。
血管新生調節能の測定により血管から周辺に発芽することを確認した。SDラットを使用し、実験群を無処理群、VEGF処理群、高麗人参の実抽出物(実施例1、実施例2)処理群に区分した。ラットの胸部位を切開して大動脈環(Aortic ring)を得、無血清DMEM培地に保管した後、各大動脈血管に対して培地にVEGFと高麗人参の実抽出物(実施例1、2)をそれぞれ処理し、37℃で約7日間培養して血管が周辺に発芽することを観察した。図5aは、大動脈血管の周辺に毛細血管形態の新しい血管が伸びていくことを光学顕微鏡を用いて観察した写真であり、図5bは、新しく発芽、形成された血管の長さと個数で血管発芽(Vessel Sprouting)の促進効果を評価した後、点数にて示したものである。
1.5%イソフルラン溶液とO2/N2Oとを混合したものを用いて約6〜8週齢の雄BALB/cマウスを麻酔させる。マウスの腹部にチタン材質のウィンドウ(直径19mm、内径14mm、厚さ0.7mm)をインプラントする。対照群としてVEGF 20ng、高麗人参の実抽出物(実施例1、2)をそれぞれマトリゲルに混ぜてからウィンドウ内側の組職中に挿入し、カバースリップを覆ってスナップリングで固定する。血管新生度合いを生体蛍光顕微鏡(intravital fluorescence microscopy)を用いてリアルタイムで目視する。4日が経過した後に血管新生度合いを確認するために、フルオレセインイソチオシアネート(fluorescein isothiocyanate、FITC)で標識されたデキストラン(MW 250,000 Sigma Chemical, St. Louis、Missouri)を、25mg/mlの濃度で50μlずつ、尾静脈に注入する。図6aは、ブルーライト(440〜475nm、励起波長530〜550nm、放出波長)を用いる電子倍増CCDカメラ(Photon Max 512;Princeton Instruments, Trenton, NJ)を利用して生体蛍光顕微鏡像(Zeiss Axiovert 200M microscopy、Oberkocchen、Germany)をリアルタイムで撮った写真であり、図6bは、MetaMorph(Universal Imaging Corp., Downingtown, PA)というプログラムを用いて分析した血管の変化を点数にて示すグラフである(0:変化が一番小さい;5:変化が一番大きい)。
1.マクロファージに対してLPSで誘導させたNO(酸化窒素)を抑制する効果(in vitro)
高麗人参の実抽出物の抗血管炎症効果を調べるために、大食細胞に対してLPSで誘導させたNO(酸化窒素)を抑制する実験を実施した。
細胞レベルでの結果を基に、動物モデルにおける高麗人参の実抽出物の血管炎症調節効能について実験を実施した。実験群を、無処理群とLPS誘導群と実施例1、実施例2の高麗人参の実抽出物処理群とに群分けし、マウスを各実験群当たり5匹ずつ割り当てした。
図8に示すように、高麗人参の実抽出物(実施例1、実施例2)は、LPSで誘導される炎症因子の生成を抑制する効果を示し、特に実施例1が最も優れた効果を示した。これは、高麗人参の実抽出物が血管炎症を抑制し且つ虚血性疾患での血管炎症を調節するのに有効であることを示す。
1)抗酸化効果
紫外線(UV)照射によって細胞から生成される活性酸素(ROS;Reactive oxygen species)を除去する能力を比較する実験により抗酸化効果を調査した。陽性対照群として一般に抗酸化効果を比較するのに用いられるトロロックス(trolox)を用い、これを紅参抽出物とも比較した(図9)。また、試験物質で処理していない群を対照群として用いた。
図9に示すように、本発明(実施例1)による高麗人参の実抽出物は、ヒトHaCaT角質形成細胞単層培養システム(human HaCaT keratinocytes monolayer culture system)において対照群に比べてUVによって生成された活性酸素を有意的に消去する効果を示した。これは、抗酸化物質の活性指標として用いられるトロロックスの活性と同程度の優れた活性であり、有意的な消去活性のない紅参抽出物と対照される結果である。すなわち、本発明の実施例1による高麗人参の実抽出物は、皮膚老化の原因になる活性酸素を有意的に消去することによりしわ生成、弾力低下及び色素沈着などを予防する効果を奏することを確認した。
ヒト線維芽細胞を105個/ウェルの濃度で12ウェルプレート培養器において培養した後、実施例1の高麗人参の実抽出物1ppm及び10ppmを含む培地に取り替えた。培養3日目に細胞を採取し、ELISA法を用いて生成されたI型プロコラーゲンの量を定量した。その結果は、試験物質を含まない対照群を100として測定した値との比較値で算出し、陽性対照群としてTGF−b(transforming growth factor-b)を用いた。
ヒト線維芽細胞を105個/ウェルの濃度で12ウェルプレート培養器において培養した。次いで、紫外線B(UVB)を40mJ/cm2で照射した後、実施例1の高麗人参の実抽出物1ppm及び10ppmを含む培地に取り替えた。培養2日目に細胞を採取し、ELISA方法を用いて生成されたMMP−1(マトリックス・メタロプロティナーゼ I)の量を定量した。その結果は、試験物質を含まない紫外線対照群を100として測定した値との比較値で算出し、陽性対照群としてはTGF−b(形質転換増殖因子−b)を用いた。
ヒト線維芽細胞を105個/ウェルの濃度で12ウェルプレート培養器において培養した。次いで、紫外線A(UVA)を15J/cm2で照射した後、実施例1及び比較例1の高麗人参の実抽出物0.1ppm、1ppm及び10ppmを含む培地に取り替えた。培養2日目に細胞を採取し、ウェスタンブロッティングを用いて生成されたシクロオキシゲナーゼ−2(cyclooxygenase-2、COX-2)の量を定量した。試験物質で処理していない紫外線対照群を100として濃度計で測定した値との比較値を下記表3に表した。
ヒト角質形成細胞を105/ウェル個の濃度で12ウェルプレート培養器において培養した。次いで、紫外線Bを30mJ/cm2で照射した後、実施例1の高麗人参の実抽出物及び比較例1の紅参抽出物をそれぞれ0.1ppm、1ppm及び10ppm含む培地に取り替えた。培養6〜24時間後に細胞を採取し、ELISA(Pharmingen 555212)方法を用いて生成された腫瘍壊死因子−α(TNF−α)の量を定量し、試験物質で処理していない紫外線対照群を100として測定した値との比較値を下記表4に表した。
本発明の組成物に皮膚老化抑制効能があるか否かを研究するために無毛マウスを動物モデルとして選定した。実験群を、一般飼料群(対照群)と一般飼料+高麗人参の実抽出物群(実施例1)とに群分けし、6〜7週齢の雌無毛マウスを各群当たり10匹を割り当てした。12週間経口投与した後、マウスに対してUV(紫外線)を照射した。
本発明の組成物が既に生成されたしわに対する改善効能があるか否かを研究するために無毛マウスを動物モデルとして選定した。実験群を、一般飼料群(対照群)と一般飼料+高麗人参の実抽出物群(実施例1)とに群分けし、6〜7週齢の雌無毛マウスを各群当たり10匹を割り当てした。UV(紫外線)を照射してしわを誘発させた後、前記各群に一般飼料と一般飼料+高麗人参の実抽出物を12週間経口投与した。
投与前と後における同一部位に対する皮膚しわをビジオメーターシステム(C+K社製)を用いて測定し比較した。皮膚しわの変化量は下記式2で求め、その結果を図13に示した。
1)マウスのメラニン細胞を用いたメラニン生成抑制
実施例1の高麗人参の実抽出物のメラニン生成抑制効果を調べるために、マウスのメラニン細胞を用いてメラニン生成抑制効果を測定した。
本発明の組成物が健康機能補助食品として美白効果を奏するか否かを研究するために、茶色テンジクネズミ(guinea pig)を動物モデルとして選定した。全ての実験群の動物(各群当たり10匹)に紫外線を照射して最小紅斑量を測定した。全ての動物に最小紅斑量の紫外線を1日1回ずつ、3日間で照射した。実験群は、一般飼料群と一般飼料+紅参抽出物群と一般飼料+高麗人参の実抽出物群(実施例1)とに群分けした。各群の動物に対して5週間自由給食させた。色素沈着は色差計を用いてL値(明度)を測定した後、L値の変化量(各測定日のL値と紫外線照射前のL値との差)を比較し、その結果を下記表6に表した。
1)ヒアルロン酸生産能促進
ヒアルロン酸は細胞間隙内に水分を保持する機能をする成分であって、皮膚保湿効果と直接的に関連する皮膚結合タンパク質である。
本発明の組成物が皮膚保湿効果を奏するか否かを研究するために無毛マウスをモデルとして選定した。実験群を、一般飼料群(対照群)と一般飼料+紅参抽出物群と一般飼料+高麗人参の実抽出物群(実施例1)とに群分けし、6〜7週齢の雌無毛マウスを各群当たり10匹を割り当てした。12週間経口投与した後、表皮と真皮のヒアルロン酸の含量をヒアルロン酸測定用キットを用いて比較し、その結果を下記表8に表した。
高麗人参の実抽出物を血管内皮細胞に処理したときに、陰茎勃起に重要な信号伝達物質であると知られている一酸化窒素(NO)の生成増加を観察した。L−アルギニンを一緒に処理したことを除いては、試験例2と同じ方法で実験を実施した。図14は、共焦点レーザー顕微鏡(Atto Bioscience、USA))で撮った写真でり、図15は、蛍光強度をImage-Pro Plus v4.5 software(Media Cybernetics, San Diego, CA, USA)で分析して示すグラフである。図14及び図15において、conは対照群、RGは比較例1の紅参抽出物処理群、GBは実施例1の高麗人参の実抽出物処理群を意味し、RG 50は紅参抽出物50μg/ml、RG 100は紅参抽出物100μg/ml、L−arginine 250はL−アルギニン250μM、L−arginine 500はL−アルギニン500μM、GB 50は高麗人参の実抽出物50μg/ml、GB 100は高麗人参の実抽出物100μg/mlを処理したことを意味する。
一酸化窒素生成酵素の基質であると知られたL−アルギニンと一酸化窒素(NO)の生成を促進させる高麗人参の実抽出物とを併用して処理したとき、一酸化窒素の生成が増加するか否かを観察した。
実施例1の高麗人参の実抽出物50mg、注射用滅菌蒸留水適量、pH調節剤適量を混合し、その混合物を通常の注射剤の製法によってアンプル(2ml)に入れて注射剤を得た。
実施例2の高麗人参の実抽出物100mg、異性化糖10g、マンニトール5gを適量の精製水に溶解させた。これにレモン香を適量加えてから前記成分を混合し、さらに精製水を加えて総量を100mlにした。この結果物を茶色のボトルに充填し滅菌して液剤を得た。
実施例1の高麗人参の実抽出物50mg、L−カルニチン80〜140mg、大豆油180mg、ヤシ油2mg、植物性硬化油8mg、黄ロウ4mg及びレシチン6mgを混合し、通常の方法によって1カプセル当たり400mgずつ充填して軟カプセル剤を得た。
実施例2の高麗人参の実抽出物50mg、ガラクトオリゴ糖200mg、乳糖60mg及び麦芽糖140mgを混合し、流動層乾燥機を用いて顆粒化した後、糖エステル6mgを添加して打錠機で打錠して錠剤を得た。
実施例2の高麗人参の実抽出物50mg、無水結晶ぶどう糖250mg及び澱粉550mgを混合し、流動層顆粒機を用いて顆粒化して顆粒剤を得た。
実施例1の高麗人参の実抽出物50mg、ぶどう糖10g、クエン酸0.6g、及びオリゴ糖シロップ25gを混合し、これに精製水300mLを加えてからボトルに200mLずつ充填する。その後、130℃で4〜5秒間滅菌してドリンク剤を得た。
実施例1の高麗人参の実抽出物の調製の際に固形分60%以上になるように濃縮し、低温で熟成して100%エキス製品を得た。
実施例1の高麗人参の実抽出物0.9g、糖0.3g、澱粉1.91g及びグリセリン0.56gを混合し、製丸機を用いて丸剤を得た。
[1]
高麗人参の実エタノール抽出物を有効成分として含有する血行促進用組成物。
[2]
前記抽出物が、エタノール及びその後のブタノールの順次抽出物である、項目1に記載の血行促進用組成物。
[3]
前記抽出物が、油除去抽出物である、項目2に記載の血行促進用組成物。
[4]
前記油除去が、前記エタノール抽出と前記ブタノール抽出の間である、項目3に記載の血行促進用組成物。
[5]
高麗人参の実エタノール抽出物を有効成分として含有する血管老化防止用組成物。
[6]
前記抽出物が、エタノール及びその後のブタノールの順次抽出物である、項目5に記載の血管老化防止用組成物。
[7]
前記抽出物が、油除去抽出物である、項目6に記載の血管老化防止用組成物。
[8]
前記油除去が、前記エタノール抽出と前記ブタノール抽出の間である、項目7に記載の血管老化防止用組成物。
[9]
高麗人参の実エタノール抽出物を有効成分として含有する血管炎症治療用組成物。
[10]
前記抽出物が、エタノール及びその後のブタノールの順次抽出物である、項目9に記載の血管炎症治療用組成物。
[11]
前記抽出物が、油除去抽出物である、項目10に記載の血管炎症治療用組成物。
[12]
前記油除去が、前記エタノール抽出と前記ブタノール抽出の間である、項目11に記載の血管炎症治療用組成物。
[13]
前記組成物が、血管生成を促進する、項目1〜12のいずれか1項に記載の組成物。
[14]
前記組成物が、虚血性心疾患を治療する、項目1〜12のいずれか1項に記載の組成物。
[15]
前記虚血性心疾患は、動脈硬化、狭心症、または心筋梗塞である、項目14に記載の虚血性心疾患治療用組成物。
[16]
前記組成物が、局所の血流不足を治療する、項目1〜12のいずれか1項に記載の組成物。
Claims (1)
- 高麗人参の実エタノール抽出物を有効成分として含有し、該高麗人参の実エタノール抽出物は、プロトパナキサジオール、プロトパナキサトリオール、ビタミン及びミネラルを含み、大食細胞におけるNO生成を抑制することによる血管炎症治療用組成物であって、
前記高麗人参の実エタノール抽出物が、前記プロトパナキサジオール(PD)とプロトパナキサトリオール(PT)とを、PD/PTが0.73の割合で含む、血管炎症治療用組成物。
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