KR101829330B1 - 염증성 피부 노화 억제 물질 스크리닝 방법 - Google Patents

염증성 피부 노화 억제 물질 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역 세포에 염증 자극원을 처리하는 단계; 피부 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 시험 물질을 처리한 피부 세포에 염증 자극원을 처리한 면역 세포를 처리하는 단계; 및 면역 세포를 처리한 피부 세포의 MMP-1(Matrix Metalloproteinase-1) 농도를 측정하는 단계를 포함하는 염증성 피부 노화 억제 물질 스크리닝 방법을 개시한다.

Description

염증성 피부 노화 억제 물질 스크리닝 방법{Method for screening anti-inflammatory skin aging agent}
본 발명은 염증성 피부 노화 억제 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.
일반적으로 만성 피부 염증은 표피의 탄력을 저해하므로 주름살 생성의 주요 원인이 된다. 또한 피부에 염증이 생긴 후에는 멜라닌 색소의 침착이 증가하여 염증 부위가 짙은 갈색으로 변하기도 한다. 이와 같이 염증 반응은 피부 노화를 촉진한다. 한편, 노화된 피부는 면역력, 특히 피부 세포의 면역력이 저하되어 있어 각종 피부 감염에 취약하며, 혈청 내 자가 항체의 발생 빈도가 높아 자가 면역 피부 질환의 빈도도 높아진다. 또한 랑게르한스 세포의 수는 젊은 사람의 피부 보다 내인성 노화가 일어난 피부에 더 적으며, 광노화가 일어난 피부에는 더욱 더 적다. 따라서 노화된 피부는 약한 자극에도 염증이 발생할 가능성이 높으며, 발생한 염증은 또 다시 노화를 야기하므로 악순환이 계속된다.
본 발명은 효과적인 염증성 피부 노화 억제 물질 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면에 따른 염증성 피부 노화 억제 물질 스크리닝 방법은 면역 세포에 염증 자극원을 처리하는 단계; 피부 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 시험 물질을 처리한 피부 세포에 염증 자극원을 처리한 면역 세포를 처리하는 단계; 및 면역 세포를 처리한 피부 세포의 MMP-1(Matrix Metalloproteinase-1) 농도를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일측면에 따른 염증성 피부 노화 억제 물질 스크리닝 방법은 염증성 피부 노화 억제 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 일반적인 MMP-1이 아닌 염증성 사이토카인에 의해 생성된 MMP-1의 억제 여부를 판단하므로, 염증성 피부 노화 억제 물질을 보다 정확하게 스크리닝할 수 있다. 또한 하나의 특정 사이토카인을 이용하는 것이 아니라 실제로 면역 세포에서 자극에 의해 생성된 염증성 사이토카인을 이용함으로써, 보다 생체 상관성이 높은 염증성 피부 노화 억제 물질을 스크리닝할 수 있다. 그리고 하나의 염증성 사이토카인이 아닌 여러 염증성 사이토카인들에 의해 복합적으로 생성되는 MMP-1의 억제 여부를 한 번에 판단할 수 있다는 점에서 간편하고 효율적으로 염증성 노화 억제 물질을 스크리닝할 수 있다.
도 1은 LPS 종류와 농도 및 INF-γ 농도에 따른 THP-1 세포의 TNF-α 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 LPS 농도에 따른 THP-1 세포의 생육률(viability)을 나타낸 그래프이다.
도 3은 INF-γ 농도에 따른 THP-1 세포의 생육률을 나타낸 그래프이다.
도 4는 LPS와 INF-γ를 복합 처리한 경우 THP-1 세포의 생육률을 나타낸 그래프이다.
도 5는 LPS와 INF-γ를 복합 처리한 경우 염증성 사이토카인 생성 정도를 나타낸 것이다.
도 6은 LPS 및 INF-γ를 처리한 THP-1 세포에 의한 NHF 세포의 MMP-1 생성 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 글리시테인을 처리한 경우 THP-1 세포의 생육률을 나타낸 그래프이다.
도 8은 글리시테인 및 LPS와 INF-γ를 처리한 경우 THP-1 세포의 생육률을 나타낸 그래프이다.
도 9는 글리시테인을 처리한 경우 THP-1 세포의 TNF-α 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 10은 글리시테인 및 선택적으로 LPS와 INF-γ를 처리한 경우 염증성 사이토카인의 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 11은 글리시테인을 처리한 경우 NHF 세포의 생육률을 나타낸 그래프이다.
도 12는 LPS와 INF-γ를 처리한 THP-1 세포 및 글리시테인을 처리한 NHF 세포의 MMP-1 생성 정도를 나타낸 그래프이다.
본 명세서에서 "피부"라 함은, 동물의 체표를 덮는 조직을 의미하는 것으로서, 얼굴 또는 바디 등의 체표를 덮는 조직뿐만 아니라, 두피와 모발을 포함하는 최광의의 개념이다.
본 명세서에서, "염증성 피부 노화"는 염증에 의해 야기되거나, 염증을 동반하는 피부 노화를 포함한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
염증 반응에 의해 생성되는 TNF-α와 IL-1β 등과 같은 사이토카인(cytokine)은 혈관 내피(vascular endothelium)에 존재하는 수용체에 결합하여 여러 염증 관련 신호 경로(signaling pathway)를 활성화시킨다. 또한 이 때 세포 부착 분자(cell adhesion moleculre)의 발현이 증가되어 염증성 세포들의 분출(extravasation)이 일어나게 된다. 이러한 염증성 세포의 침투(infiltration) 후 여러 사이토카인이나 케모카인 등의 케모-어트랙티브 활성(chemo-attractive activity)이 있게 되고 이들이 염증이 일어난 부위로 이동하면서 면역 반응을 일으키게 된다.
이러한 염증성 사이토카인들은 매트릭스 메탈로프로테이나아제(Matrix Metalloproteinase)의 발현을 촉진하여 콜라겐 분해를 유도하므로 피부 노화를 일으키는데 결정적인 역할을 하며 생성된 사이토카인은 다시 수용체에 결합하여 연쇄 반응을 일으키게 된다. 따라서 임의의 물질이 염증성 사이토카인의 생성을 억제하고, 나아가 염증성 사이토카인에 의한 MMP-1의 생성을 억제할 수 있다면 염증성 피부 노화 억제 물질로 작용할 수 있다고 판단할 수 있을 것이다.
본 발명의 일측면은 면역 세포에 염증 자극원을 처리하는 단계; 피부 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 시험 물질을 처리한 피부 세포에 염증 자극원을 처리한 면역 세포를 처리하는 단계; 및 면역 세포를 처리한 피부 세포의 MMP-1(Matrix Metalloproteinase-1) 농도를 측정하는 단계를 포함하는 염증성 피부 노화 억제 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
면역 세포에 염증 자극원을 처리하면 여러 염증성 사이토카인들이 생성된다. 따라서 염증 자극원을 처리한 면역 세포, 보다 구체적으로는 염증 자극원을 처리한 면역 세포의 배지는 다양한 염증성 사이토카인을 포함하게 된다. 이러한 면역 세포를 피부 세포에 처리하면 염증성 사이토카인에 의해 피부 세포에서 피부 콜라겐의 분해를 촉진하는 MMP-1의 발현이 촉진된다. 상기 살펴본 바와 같이, 염증 및 MMP-1의 생성은 피부 노화의 주요 원인이며, 일단 생성되면 계속 연쇄 반응이 일어난다는 점에서 더욱 좋지 않다. 따라서 시험 물질을 피부 세포에 전처리하고 이후 염증성 사이토카인을 포함하는 면역 세포를 처리한 다음 피부 세포의 MMP-1 농도를 측정함으로써 시험 물질이 염증성 피부 노화를 억제할 수 있는 물질인지 여부를 판단할 수 있다. 이는 일반적인 MMP-1의 생성을 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법과 달리 염증성 사이토카인에 의한 MMP-1 생성을 억제하는 물질을 스크리닝하므로 시험 물질이 염증성 노화 억제 물질인지 여부를 보다 정확하게 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 염증 자극원에 의해 생성되는 사이토카인은 다양한 염증성 사이토카인을 포함한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 사이토카인은 GROα, I-309, sICAM-1, IL-1β, IL-1ra, IL-6, IL-8, IL-23, IP-10, MCP-1, MIF, MIP-1α, MIP-1β, Seprin E1, RANTES 및 TNF-α 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일측면에서, 면역 세포는 염증 자극원 처리에 의해 염증성 사이토카인을 생성하는 세포를 포함한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 면역 세포는 THP-1 세포(Human acute monocytic leukemia cell line)을 포함한다. 단핵식균세포들은 면역계를 구성하는 주요한 세포 집단 중 하나로, 식균 작용(phagocytosis)을 하는 것으로 알려져 있다. 식균 세포 중 혈액에 있는 세포를 단구(monocytes)라고 하며, 조직에 존재하는 세포를 대식 세포(macrophage)라고 부른다. THP-1 세포는 인간 유래 세포로, 조직에서 대식 세포로 분화될 수 있는 단핵구이며 배양 가능 기간이 길어 세포 실험에 유리하다는 장점을 가지므로, 본 발명에 보다 적합할 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 피부 세포는 정상 인간 피부 섬유 아세포(normal human fibroblast, NHF)를 포함한다. 진피층에 분포하는 섬유 아세포는 창상 치유에 중요한 역할을 하며, 조직 손상에 의한 염증 반응에 의해 수일 내에 빠르게 증식한다. 섬유 아세포는 세포외기질(extracellular matrix; ECM) 단백질의 주된 근원이며, 육아조직 (granulation)을 형성하는 교원질(collagen)과 섬유결합소(fibronectin)를 생산한다. 또한 모세관 및 기타 혈관과 네트워크를 형성하여 염증성 사이토카인에 빠르게 반응할 수 있다. 따라서, 본 발명에 보다 적합할 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 염증 자극원은 염증성 사이토카인을 생성할 수 있는 물질을 포함한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 염증 자극원은 LPS(Lipopolysaccharide) 및 INF-γ(Interferon-γ)를 포함한다.
LPS는 그람 음성 세균 표층의 펩티드글리칸을 둘러싸는 외막의 중요 구성 성분이다. LPS는 NF-κB를 핵으로 이동시키며, NF-κB는 주로 염증 및 면역 반응에 관여하는 여러 유전자의 프로모터 부위에 결합하여 이들 유전자를 발현시킨다. 따라서 LPS는 사람에게서 면역 조절 물질, 염증 유발 물질 등을 자극하는 것으로 알려져 있으며, 그 유래 균주에 따라 자극을 유도하는 정도가 다르다. 본 발명의 일측면에서, LPS는 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라(Salmonella) 속균 중 하나 이상에서 유래한 LPS를 포함한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 대장균에서 유래한 LPS는 E.coli 0111:B4, E.coli 055:B5 및 E.coli EH100 중 하나 이상에서 유래한 LPS를 포함한다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 살모넬라 속균에서 유래한 LPS는 살모넬라 티포사(S. typhosa) 및 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium) 중 하나 이상에서 유래한 LPS를 포함한다.
본 발명의 일측면에서, 세포 독성을 나타내지 않으면서도 염증성 사이토카인의 충분한 생성이 이루어지도록 하기 위해, LPS는 0.001 μM 내지 20 μM, 구체적으로 0.01 μM 내지 15 μM, 더 구체적으로 0.1 μM 내지 10 μM일 수 있다.
본 발명의 일측면에서, INF-γ(Interferon-γ)는 직접 염증 반응을 매개하여 염증성 사이토카인의 생성을 촉진하기 보다는 LPS를 보조하여 LPS에 의한 염증 자극 반응을 강화하는 역할을 한다. 따라서, LPS와 INF-γ를 함께 처리하는 경우 염증성 사이토카인이 보다 잘 생성될 수 있으며, 나아가 염증성 피부 노화 억제 물질을 보다 민감하게 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 세포 독성을 나타내지 않으면서도 본 발명이 의도하는 효과를 잘 나타내기 위해, INF-γ는 1 내지 2000 UNITs, 구체적으로 5 내지 1500 UNITs, 더 구체적으로 10 내지 1000 UNITs일 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 염증성 노화 억제 물질 스크리닝 방법은 피부 세포의 MMP-1 농도를 측정하는 단계 이후, 시험 물질을 처리한 피부 세포의 MMP-1의 농도가 시험 물질을 처리하지 않은 피부 세포의 MMP-1의 농도보다 낮은 경우, 시험 물질을 염증성 노화 억제 물질이라고 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 시험 물질을 처리한 피부 세포의 MMP-1의 농도가 시험 물질을 처리하지 않은 피부 세포의 MMP-1의 농도보다 높은 경우, 시험 물질을 염증성 노화 억제 물질이 아니라고 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 시험 물질을 처리한 피부 세포의 MMP-1 농도가 시험 물질을 처리하지 않은 피부 세포의 MMP-1의 농도보다 낮을수록 염증성 노화 억제 효과가 높은 물질이라고 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 시험 물질은 염증성 노화 억제 물질인지 여부를 판단하는 대상 물질을 의미한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 시험 물질은 식물을 예로 들 수 있는 천연물 및 그 추출물 또는 화학 합성물을 모두 포함할 수 있다.
이하, 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실험예 1] 자극원으로 적절한 LPS 균주의 확인
LPS는 그 유래 균주에 따라 자극을 유도하는 정도가 다르므로, 염증성 피부 노화 억제 물질 스크리닝에 적절한 LPS를 선택하고자 아래와 같은 실험을 실시하였다.
THP-1 세포(한국 세포주 은행에서 입수)를 6-웰에 5x105개씩 처리하고 37℃, 5% CO2 조건 하 10% (v/v) FBS, 페니실린 100 U/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml를 포함하는 RPMI-1640 배지(LONZA에서 입수)에서 24시간 배양시켰다. 이에 0, 0.1 및 1 ㎍/ml의 대장균에서 유래한 LPS 3종(각각 E.coli 0111:B4, E.coli 055:B5 및 E.coli EH100에서 유래) 및 살모넬라 속균에서 유래한 LPS 2종(각각 살모넬라 티포사(S. typhosa)와 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium)에서 유래)(시그마 알드리치에서 입수)과 0, 250, 500 및 1000 UNITs의 INF-γ(시그마 알드리치에서 입수)를 처리하고 24시간 배양하였다. 이후 배지를 1000rpm으로 3분 동안 원심 분리하고 상등액을 취한 뒤 TNF-α ELISA 키트를 이용하여 세포 배양액에 포함되어 있는 TNF-α의 농도를 구했으며, 이를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 볼 수 있듯이, LPS를 처리한 경우, E.coli 0111:B4, E.coli 055:B5, E.coli EH100, 살모넬라 티포사, 살모넬라 티피뮤리움 순으로 TNF-α의 생성량이 많았으며, 처리한 LPS 농도가 다른 경우에도 상기 순서는 유지되었다. 한편, 0.1 ㎍/ml의 LPS를 처리한 경우보다 1 ㎍/ml의 LPS를 처리한 경우에 TNF-α의 절대적인 생성량이 많았다. 이를 통해, 대장균, 구체적으로 E.coli 0111:B4 유래 LPS가 염증성 사이토카인 생성에 있어 인간 면역 세포에 가장 민감함을 알 수 있다.
또한, IFN-γ의 경우 농도에 상관없이 TNF-α의 생성에 영향을 미치지 않았다. 하지만 5종의 LPS 1 ㎍/ml와 IFN-γ 500 UNITs를 함께 처리한 경우에 LPS를 단독으로 처리한 경우보다 TNF-α 생성량이 현저하게 증가하였으며, 그 생성량은 E.coli 0111:B4, E.coli 055:B5, E.coli EH100, 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 티포사 순으로 높았다. 이를 통해 IFN-γ가 LPS에 의한 자극을 강화함을 알 수 있다.
[실험예 2] 자극원의 적정 농도 확인
염증성 피부 노화 억제 물질 스크리닝에 적절한 자극원의 농도를 결정하고자 아래와 같은 실험을 실시하였다.
THP-1 세포(한국 세포주 은행에서 입수)를 96-웰에 3x104개씩 처리하여 37℃, 5% CO2 조건 하 10% (v/v) FBS, 페니실린 100 U/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml를 포함하는 RPMI-1640 배지(LONZA에서 입수)에서 24시간 배양시켰다. 이에 0, 0.01, 0.1, 1 및 10 ㎍/ml의 대장균(E.coli 0111:B4) 유래 LPS(시그마 알드리치에서 입수), 0, 50, 100, 500, 및 1000 UNITs의 IFN-γ(시그마 알드리치에서 입수)를 혼합 처리하여 24시간 배양시켰다. 세포 계수 키트 시약을 웰 당 배지 부피의 1/10씩 처리하고 2시간 배양한 후 스펙트라 맥스(spectraMAX)로 O.D. 값을 측정하여 세포 생육력(viability)을 계산하였다. 이를 각각 도 2 내지 도 4에 나타내었다.
도 2에서 볼 수 있듯이, 0, 0.01, 0.1, 1 및 10 ㎍/ml의 LPS를 처리한 경우 모두 세포 독성이 나타나지 않으며, 농도 의존적으로 세포 증식을 촉진한다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 0, 50, 100, 500 및 1000 UNITs의 IFN-γ를 처리한 경우 모두 세포 독성이 나타나지 않는다. 또한 도 4에서 볼 수 있듯이, LPS와 IFN-γ를 함께 처리한 경우 모든 농도에서 세포 독성이 나타나지 않으며, 세포 증식 정도는 LPS의 농도와 양의 상관 관계를 나타낸다.
[실험예 3] 자극원 처리시 염증성 사이토카인 생성 확인
자극원 처리시 염증 반응에 의한 염증성 사이토카인 생성을 확인하고자 아래와 같은 실험을 실시하였다.
THP-1 세포(한국 세포주 은행에서 입수)를 6-웰에 5x105개씩 처리하여 37℃, 5% CO2 조건 하 10% (v/v) FBS, 페니실린 100 U/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml를 포함하는 RPMI-1640 배지(LONZA에서 입수)에서 24시간 배양시켰다. 이에 1 ㎍/ml의 LPS(E.coli 0111:B4)(시그마 알드리치에서 입수)와 500 UNITs의 IFN-γ(시그마 알드리치에서 입수)를 처리한 후 24시간 배양시켰다. 배지를 1000rpm으로 3분 동안 원심 분리하여 상등액을 취한 뒤 사이토카인 분석 키트(Cytokine array kit)를 이용하여 세포 배양액 중 대조군에 비해 증가한 염증성 사이토카인의 종류를 확인하였다. 도 5는 염증성 사이토카인의 발현 정도를 나타내며, 아래 표는 각 좌표에 해당하는 염증성 사이토카인의 목록이다.
좌표 타겟 좌표 타겟 좌표 타겟
A1, A2 양성 대조군
A3, A4 C5a B11, B12 IL-4 D5, D6 IP-10
A5, A6 CD40 리간드 B13, B14 IL-5 D7, D8 I-TAC
A7, A8 G-CSF B15, B16 IL-6 D9, D10 MCP-1
A9, A10 GM-CSF B17, B18 IL-8 D11, D12 MIF
A11, A12 GROα C3, C4 IL-10 D13, D14 MIP-1α
A13, A14 I-309 C5, C6 IL-12 P70 D15, D16 MIP-1β
A15, A16 sICAM-1 C7, C8 IL-13 D17, D18 Seprin E1
A17, A18 IFN-γ C9, C10 IL-16 E1, E2 양성 대조군
A19, A20 양성 대조군 C11, C12 IL-17 E3, E4 RANTES
B3, B4 IL-1α C13, C14 IL-17E E5, E6 SDF-1
B5, B6 IL-1β C15, C16 IL-23 E7, E8 TNF-α
B7, B8 IL-1ra C17, C18 IL-27 E9, E10 sTREM-1
B9, B10 IL-2 D3, D4 IL-32α E19, E20 음성 대조군
상기 결과에서 볼 수 있듯이, LPS와 IFN-γ 처리 후 THP-1 세포에서 총 16종의 사이토카인, 즉 GROα, I-309, sICAM-1, IL-1β, IL-1ra, IL-6, IL-8, IL-23, IP-10, MCP-1, MIF, MIP-1α, MIP-1β, Seprin E1, RANTES 및 TNF-α이 증가되었다. 즉, LPS와 IFN-γ를 처리하는 경우, THP-1 세포에서 다양한 염증성 사이토카인의 생성됨을 확인할 수 있다.
[실험예 4] THP-1 배양 배지에 의한 MMP-1 생성 확인
자극원을 처리한 THP-1 배양 배지에 의해 MMP-1이 생성되는지 여부를 확인하고자 아래와 같은 실험을 실시하였다.
THP-1 세포(한국 세포주 은행에서 입수)는 10% (v/v) FBS, 페니실린 100 U/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml를 포함하는 RPMI-1640 배지(LONZA에서 입수)를 포함하는 6-웰에 5x105개씩, NHF(Normal human fibroblast) 세포(LONZA에서 입수)는 10% (v/v) FBS, 페니실린 100 U/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml를 포함하는 DMEM 배지(LONZA에서 입수)를 포함하는 24-웰에 3x104개씩 처리하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양시켰다. THP-1 세포에는 LPS(E.coli 0111:B4)(시그마 알드리치에서 입수) 1 ㎍/m 및 IFN-γ(시그마 알드리치에서 입수) 500 UNITs을 처리하거나(자극 배지), 아무 것도 처리하지 않고(무자극 배지), NHF 세포는 무혈청 배지로 교환하여 24시간 배양시켰다. THP-1의 배지를 1000rpm으로 3분 동안 원심 분리하여 상등액을 취했다. NHF 세포에 무자극 THP-1 배지 및 자극 THP-1 배지를 처리한 것을 각각 무자극 배지 처리군 및 자극 배지 처리군으로 하고, 세럼-없는(serum free) DMEM을 처리한 것을 무처리 군으로 하였다. MMP-1 분석 키트로 NHF 세포의 MMP-1 농도를 측정하고, 무처리군 대비 무자극 배지 처리군과 자극 배지 처리군의 MMP-1의 농도비를 구하여 도 6에 나타내었다.
도 6에서 볼 수 있듯이, 무자극 배지 처리군의 경우 무처리군과 비슷한 농도의 MMP-1 생성이 확인된다. 반면, 자극 배지 처리군의 경우 무처리군에 비해 3배 가량 높은 MMP-1 생성이 확인된다. 즉, 자극원을 처리한 THP-1 배양 배지에는 여러 염증성 사이토카인이 존재하므로 이에 의해 NHF 세포에서 MMP-1이 생성됨을 확인할 수 있다.
[실험예 5] 시험 물질 및 자극원의 복합 처리시 그 적정 농도 확인
시험 물질 및 자극원의 복합 처리시 그 적정 농도를 확인하고자, 아래와 같은 실험을 실시하였다.
THP-1 세포(한국 세포주 은행에서 입수)를 96-웰에 3x104개씩 처리하여 37℃, 5% CO2 조건 하 10% (v/v) FBS, 페니실린 100 U/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml를 포함하는 RPMI-1640 배지(LONZA에서 입수)에서 24시간 배양시켰다. 시험 물질로 염증성 피부 노화 억제 물질로 알려진 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 μM의 글리시테인(Glycitein)을 처리하였으며, 선택적으로 자극원인 LPS(E.coli 0111:B4)(시그마 알드리치에서 입수) 1 ㎍/ml 및 IFN-γ(시그마 알드리치에서 입수) 500 UNITs을 처리한 후 24시간 배양시켰다. 세포 계수 키트 시약을 웰 당 배지 부피의 1/10씩 처리하고 2시간 배양한 후 스펙트라맥스로 O.D. 값을 측정하고, 대조군 대비 생육률을 도 7과 도 8에 나타내었다.
도 7에서 볼 수 있듯이, THP-1 세포에서 글리시테인은 10 μM 이하의 농도에서 세포 독성을 나타내지 않는다. 도 8에서 볼 수 있듯이, 글리시테인과 자극원인 LPS 및 IFN-γ를 함께 처리한 경우에도 세포 독성을 나타내지 않는다.
[실험예 6] 시험 물질 및 자극원 처리시 TNF-α 생성 확인
시험 물질 및 자극원 처리시 TNF-α 생성을 확인하고자, 아래와 같은 실험을 실시하였다.
THP-1 세포(한국 세포주 은행에서 입수)를 6-웰에 5x105개씩 처리함과 동시에 0, 0.1, 1 및 10 μM의 글리시테인을 처리하였다. 10% (v/v) FBS, 페니실린 100 U/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml를 포함하는 RPMI-1640 배지(LONZA에서 입수)에서 37℃, 5% CO2 조건 하 24시간 배양시킨 뒤 LPS(E.coli 0111:B4)(시그마 알드리치에서 입수) 1 ㎍/ml 및 IFN-γ(시그마 알드리치에서 입수) 500 UNITs를 자극원으로 처리하였다. 다시 24시간 배양시킨 뒤 배지를 1000rpm으로 3분 동안 원심 분리하고 상등액을 취하였다. TNF-α ELISA 키트를 이용하여 세포 배양액에 포함되어 있는 TNF-α의 농도를 구하고 이를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 볼 수 있듯이, 글리시테인의 처리 농도가 높을수록 자극원에 의한 TNF-α의 농도가 낮아짐을 알 수 있다. 즉, TNF-α의 농도 측정을 통해 시험 물질의 염증 억제 효과 정도를 판단할 수 있다.
[실험예 7] 시험 물질 및 자극원 처리시 염증성 사이토카인 생성 확인
시험 물질 및 자극원 처리시 염증성 사이토카인 생성을 확인하고자, 아래와 같은 실험을 실시하였다.
THP-1 세포(한국 세포주 은행에서 입수)를 6-웰에 5x105개씩 처리함과 동시에 글리시테인 10 μM 을 처리 하였다. 10% (v/v) FBS, 페니실린 100 U/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml를 포함하는 RPMI-1640 배지(LONZA에서 입수)에서 37℃, 5% CO2 조건 하 24시간 배양시킨 뒤 LPS(E.coli 0111:B4)(시그마 알드리치에서 입수) 1 ㎍/ml 및 IFN-γ(시그마 알드리치에서 입수) 500 UNITs를 자극원으로 처리하고 다시 24시간 배양시켰다. 한편, 아무 것도 처리하지 않거나 자극원만을 처리한 세포를 대조군으로 하였다. 배지를 1000rpm으로 3분 동안 원심 분리하고 상등액을 취하였다. 사이토카인 어레이 키트(R&D 센터)를 이용하여 세포 배양액에 포함되어 있는 염증성 사이토카인을 확인하였다. 양성 대조군 대비 각 처리군의 사이토카인 양을 도 10에 나타내었다.
도 10에서 볼 수 있듯이, 자극원 처리에 의해 생성된 염증성 사이토카인들은 글리시테인에 의해 그 정도가 감소된다. 즉, 염증성 사이토카인의 농도 측정을 통해 시험 물질의 염증 억제 효과 정도를 판단할 수 있다.
[실험예 8] 시험 물질 및 자극원의 복합 처리시 적정 농도 확인
시험 물질 및 자극원의 복합 처리시 그 적정 농도를 확인하고자, 아래와 같은 실험을 실시하였다.
NHF 세포(LONZA에서 입수)를 96-웰에 1x104개씩 처리하여 10% (v/v) FBS, 페니실린 100 U/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml를 포함하는 DMEM 배지(LONZA에서 입수)에서 37℃, 5% CO2 조건 하 24시간 배양시켰다. 이에 자극원인 LPS(E.coli 0111:B4)(시그마 알드리치에서 입수) 1 ㎍/ml와 IFN-γ(시그마 알드리치에서 입수) 500 UNITs, 및 글리시테인 0, 0.1, 0.5, 1, 5 및 10 μM을 농도별로 처리한 후 24시간 배양시켰다. 세포 계수 키트 시약을 웰 당 배지 부피의 1/10씩 처리하고 2시간 배양한 후 스펙트라맥스(spectraMAX)로 O.D. 값을 측정하여 음성 대조군 대비 생육률(viability)(%)를 계산하여 도 11에 나타내었다.
도 11에서 볼 수 있듯이, 시험 물질인 글리시테인과 자극원을 복합 처리하는 경우 세포 독성이 나타나지 않는다.
[실험예 9] 시험 물질 및 자극원 처리시 MMP-1 생성 확인
시험 물질 및 자극원 처리시 MMP-1 생성을 확인하고자, 아래와 같은 실험을 실시하였다.
THP-1 세포(한국 세포주 은행에서 입수)는 10% (v/v) FBS, 페니실린 100 U/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml를 포함하는 RPMI-1640 배지(LONZA에서 입수)를 포함하는 6-웰에 5x105개씩, NHF 세포(LONZA에서 입수)는 10% (v/v) FBS, 페니실린 100 U/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml를 포함하는 DMEM 배지(LONZA에서 입수)를 포함하는 24-웰에 3x104개씩 처리하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 배양시켰다. THP-1 세포에 LPS(E.coli 0111:B4)(시그마 알드리치에서 입수) 1 ㎍/ml 와 IFN-γ(시그마 알드리치에서 입수) 500 UNITs를 처리하여 자극 처리 배지로 하고, 자극원을 처리하지 않은 배지를 무처리 배지로 하였다. NHF 세포에는 글리시테인을 무혈청 배지로 10 μM씩 처리하여 24시간 배양시켰다. 상기 처리한 THP-1의 배지를 1000rpm으로 3분 동안 원심 분리하여 상등액을 취한 후 NHF 세포에 처리하고, 무처리군에는 세럼 없는(serum free) DMEM(LONZA에서 입수)을 처리하였다. 24시간 배양 후 MMP-1 분석 키트로 NHF 세포의 MMP-1 농도를 측정하고, 아무 것도 처리하지 않은 군 대비 MMP-1의 농도비를 도 12에 나타내었다.
도 12에서 볼 수 있듯이, 자극 처리 배지에서는 무처리 배지에 비해 3배 가량 높은 MMP-1이 생성된다. 또한 글리시테인을 처리하는 경우 자극 배지 처리에 의한 MMP-1 생성이 감소된다.
시험 물질이 자극원에 의한 MMP-1 생성을 억제할 수 있다는 것은, 염증에 의한 콜라겐 분해를 억제할 수 있으며 나아가 염증성 피부 노화를 억제할 수 있음을 의미한다. 즉, 상기와 같이 시험 물질을 처리하여 피부 세포의 MMP-1 생성이 억제되는지 여부를 확인함으로써, 시험 물질이 염증성 피부 노화를 억제할 수 있는지 여부를 확인할 수 있다. 특히 이는 특정 염증성 사이토카인이 아닌 여러 사이토카인에 의한 MMP-1 생성 억제 여부를 판단할 수 있다는 점에서 여러 사이토카인에 기인한 염증성 피부 노화를 억제하는 물질을 한 번에 간편하고 효율적으로 판단할 수 있다.

Claims (6)

  1. 면역 세포에 염증 자극원을 처리하는 단계;
    분리된 피부 세포에 시험 물질을 처리하는 단계;
    시험 물질을 처리한 피부 세포에 염증 자극원을 처리한 면역 세포를 처리하는 단계;
    면역 세포를 처리한 피부 세포의 MMP-1(Matrix Metalloproteinase-1) 농도를 측정하는 단계; 및
    상기 MMP-1 농도가 감소하는 경우 상기 시험 물질을 염증성 피부 노화 억제 물질로 판단하는 단계를 포함하는 염증성 피부 노화 억제 물질 스크리닝 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    면역 세포는 THP-1 세포(Human acute monocytic leukemia cell)를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 피부 노화 억제 물질 스크리닝 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    피부 세포는 정상 인간 피부 섬유 아세포(normal human fibroblast, NHF)를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 피부 노화 억제 물질 스크리닝 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    염증 자극원은 LPS(Lipopolysaccharide) 및 IFN-γ(Interferon-γ)를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 피부 노화 억제 물질 스크리닝 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    LPS는 대장균(Escherichia coli) 유래 LPS를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 피부 노화 억제 물질 스크리닝 방법.
  6. 제 4 항에 있어서,
    LPS는 0.001 μM 내지 20 μM이고, IFN-γ는 1 내지 2000 UNITs인 것을 특징으로 하는 염증성 피부 노화 억제 물질 스크리닝 방법.
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