JP6465885B2 - 最適化された官能的品質を備えるタンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物 - Google Patents

最適化された官能的品質を備えるタンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物 Download PDF

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Description

本発明は、最適化された感覚プロファイルを有し、これにより望ましくない風味を発生させることなくそれらを食品調製品に組み込むことを可能にするクロレラ属の微細藻類の新規なタンパク質に富むバイオマス組成物、及びさらにクロレラ属の微細藻類のタンパク質に富むバイオマス組成物の官能プロファイルを評価するための方法に関する。
クロレラ属がタンパク質や他の必須栄養素が豊富であるために潜在的食物源であることは、当業者には周知である。
クロレラ属は、特に４５％のタンパク質、２０％の脂肪、２０％の炭水化物、５％の食物繊維並びに１０％のミネラル及びビタミン類を含有する。
微細藻類のバイオマス（及び主としてそれらのタンパク質）の食品としての使用は、動物性タンパク質に対する世界的需要の増大を満たすための代替源を求めてますます多く検討されている（ＦＡＯ（食糧農業機関）による報告）。
さらに、欧州連合は、もう何年もにわたり植物タンパク質の構造的不足に悩まされており、近年の総量は現在南米から輸入されている大豆当量で表すと２，０００万トンを超える量になっている。
そこで一定のタンパク質に富む微細藻類の大量生産は、この「タンパク質不足」を緩和できる方法であると想定される。
詳細な分析及び栄養に関する研究は、これらの藻類タンパク質が従来型の植物性タンパク質と同等である、または品質が優れてさえいることを証明している。
それにもかかわらず、高額の製造コスト及び微細藻類に由来する材料を官能的に許容される食品調製品に組み込むことにおける技術的困難さのために、微細藻類タンパク質の広範囲に及ぶ流通はいまだその初期段階にある。
様々な種由来の高比率のタンパク質を有する微細藻類バイオマスが報告されている（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ（２００７），２５：２０７−２１０における表１を参照されたい）。
さらに、先行技術における一定数の特許出願、例えば国際公開第２０１０／０４５３６８号のような特許出願は、微細藻類バイオマスのタンパク質含有量をいっそう増加させられるように培養条件を調整することが可能であることを教示している。
しかしながら、上記微細藻類のバイオマスから微細藻類バイオマス粉末を工業的に製造することが所望される場合は、技術的観点からだけではなく、さらに製造される組成物の感覚プロファイルの観点からも依然として相当に大きな困難が存在する。
実際に、例えば屋外の池で光合成により培養された藻類を用いて、または光バイオリアクターを使用して製造された藻類粉末は市販で入手できるが、それらは濃緑色（クロロフィルに結び付いている）及び強度の不快な風味を有している。
食品製品中または栄養補助食品として調製された場合でさえ、これらの藻類粉末は常に食品製品または栄養補助食品にこの視覚的に魅力のない緑色を与え、不快な魚臭い風味または海藻の風味を有する。
さらに、藍藻類の特定の種が土臭い、またはカビ臭い臭気を発生する、悪臭のする化学分子、例えばゲオスミン（トランス−１，１０−ジメチル−トランス−９−デカロール）またはＭＩＢ（２−メチルイソボルネオール）を自然に生成することは公知である。
クロレラ属に関して、この分野において一般に許容される記述子は、他の緑野菜粉末、例えば粉末状大麦若葉または粉末状青麦とわずかに類似する「緑茶」の風味であるが、この風味はその高いクロロフィル含量に帰せられる。
それらの風味は、通常は強度の風味を備える野菜または柑橘類果汁と混合された場合にしか遮蔽されない。
このため、より多数及び多様な食品製品におけるそれらの使用を可能にする、好適な官能特性を備えるクロレラ属の微細藻類バイオマスの組成物が依然として必要とされているが、未だ満たされていない。
国際公開第２０１０／０４５３６８号
Ｂｅｃｋｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ，２００７，２５，ｐ．２０７−２１０
本出願人は、１１種の特定の化合物から選択された４種の揮発性有機化合物の全フレーバー値を特徴とする、最適化された感覚プロファイルを有する、タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物を提供することによりこの要求を満たすことが可能であることを見いだした。
そこで、本発明は、まず第１にタンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の官能特性を決定するための方法であって、１１種の揮発性有機化合物の含有量を決定する工程を含み、１１種の揮発性有機化合物が、ペンタナール、ヘキサナール、１−オクテン−３−オール、２−ペンチルフラン、オクタナール、３，５−オクタジエン−２−オール（または３−オクテン−２−オン）、３，５−オクタジエン−２−オン、ノナナール、２−ノネナール、（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナール及びヘキサン酸である方法に関する。
好ましくは、微細藻類バイオマスは、バイオマスの乾燥重量で５０％を超えるタンパク質を含み、及び微細藻類はクロレラ属の微細藻類である。
好ましくは、これら１１種の揮発性有機化合物各々の含有量は、ＳＰＭＥ／ＧＣによって、好ましくはＳＰＭＥ／ＧＣ−ＭＳによって決定する。
好ましくは、これら１１種の揮発性有機化合物各々の含有量は、これら１１種の揮発性有機化合物各々に対応するＳＰＭＥ／ＧＣ後のクロマトグラフィーピークの表面積によっ
て決定する。
好ましくは、これら１１種の揮発性有機化合物各々の含有量、具体的には１１種の揮発性有機化合物に対応するクロマトグラフィーピークの表面積が、それに対して官能特性が特に許容されない、または許容されると規定される、タンパク質に富む１種以上の基準微細藻類バイオマスの組成物の表面積と比較される。
本発明はさらに、タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の官能特性を評価することを可能にする、揮発性有機化合物の分析プロファイルを規定するための方法であって：
− 許容される、及び許容されない官能特性の２つのコントロールを含む微細藻類バイオマス組成物を少なくとも１５人の感覚パネルによる官能特性の評価と結び付ける第１マトリックスの構築、
− 上記と同じ組成物と揮発性有機化合物の分析プロファイルによる前記組成物の特徴を関連付ける第２マトリックスの構築、及び
− 最適化された官能プロファイルを有する組成物をこのように揮発性有機化合物の分析プロファイルによって特徴付けることができることに基づいて関連モデルを生成するために第１マトリックスと第２マトリックスとを相関させること、を含む方法に関する。
好ましくは、微細藻類バイオマスは、バイオマスの乾燥重量で５０％を超えるタンパク質を含み、及び微細藻類はクロレラ属の微細藻類である。
好ましくは、感覚分析の記述子は：
− 次の臭気：野菜、マッシュ、ストック、酸敗したバター、チーズ、堆肥、発酵、ピーナッツ及びペンキ；並びに
− 次の色：黄色および緑色、を含む。
最後に、本発明は、タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物に全フレーバー値を与えることを可能にする単純化もデルを構築するために、低嗅覚閾値（すなわち、感覚パネルのメンバーにより知覚された全臭気に大きな影響を及ぼす）を有する揮発性有機化合物１１種中４種を選択することに関する。そこで、本発明は、タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の官能特性を決定するための方法であって、４種の揮発性有機化合物の含有量を決定する工程を含み、４種の有機化合物は、３，５−オクタジエン−２−オール（または３−オクテン−２−オン）、１−オクテン−３−オール、３，５−オクタジエン−２−オン及び（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナールである方法に関する。
この全フレーバー値は、次に３，５−オクタジエン−２−オール（または３−オクテン−２−オン）、１−オクテン−３−オール、３，５−オクタジエン−２−オン及び（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナールの個別フレーバー値の合計として表示される。
好ましくは、微細藻類バイオマスは、バイオマスの乾燥重量で５０％を超えるタンパク質を含み、及び微細藻類はクロレラ属の微細藻類である。
そこで本発明によるタンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物は、それらの全フレーバー値が低い、好ましくは官能的に許容されない基準微細藻類粉組成物の全フレーバー値に比較して０〜４０％である場合に最適化された感覚プロファイルを有する。
本発明はさらに、許容される感覚プロファイルを有するタンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物を選択するための方法であって、官能特性が上述の方法によって決定されること、及び組成物が上述の方法によって計算された全フレーバー値が官能的に許容されない基準微細藻類バイオマス組成物の全フレーバー値に比較して０〜４０％である場合に選択されることを特徴とする方法に関する。好ましくは、微細藻類バイオマスは、バイオマ
スの乾燥重量で５０％を超えるタンパク質を含み、及び微細藻類はクロレラ属の微細藻類である。
好ましくは、微細藻類はクロレラ属の微細藻類であり、より好ましくは、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）及びクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）よりなる群から選択され、特に好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）である。
好ましくは、微細藻類バイオマスは、バイオマスの乾燥重量で５０％を超えるタンパク質を含む。
組成物各々についてのペンキ記述子に対して得られた平均グレードである。 水性懸濁液中のＳＰＭＥによるサンプルから取り出された揮発性有機化合物のクロマトグラム（ＴＩＣ）である。 クロマトグラムの３．２〜３５．０分ゾーンについての全ピークの積算（水性懸濁液中のＳＰＭＥ）である。 水性懸濁液中のＳＰＭＥによるサンプルスペースから取り出された１１種の選択された化合物の相対含有量である。 １１種の選択された化合物に対する個別フレーバー値である。 ４種の化合物に基づく全フレーバー値である。
本発明の目的のために、タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物は、感覚パネルによる評価がこれらの微細藻類バイオマス組成物を含有する上記食品調製品の官能特性を損なうオフノート（ｏｆｆ−ｎｏｔｅｓ）が存在しないと結論した場合に、「最適化された感覚プロファイル」または「最適化された官能特性」を有する。
用語「官能特性」は、色及び臭気に関する食品の特性を意味するものとする。
これらのオフノートは、感覚を刺激するために必要とされる感覚刺激の最低値に対応する知覚閾値を特徴とする望ましくない特異的悪臭分子および／または芳香分子の存在に関連している。
「最適化された感覚プロファイル」または「最適化された官能特性」は、次に２種の感覚基準（色及び臭気）の評価スケール上の最高スコアを入手することによって感覚パネルによって表される。
用語「およそ」は、数値±その１０％、好ましくは±その５％を意味するものとする。例えば、「およそ１００」は、９０〜１１０、好ましくは９５〜１００を意味する。
用語「微細藻類バイオマス組成物」は、乾燥重量で微細藻類バイオマスを少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％含む組成物を意味するものとする。しかし、本組成物中には任意選択により他の成分を含むことができる。
用語「タンパク質に富む」は、バイオマス中の乾燥重量で５０％より多い、好ましくは５５％より多い、より好ましくはバイオマスの乾燥重量で６０％、６５％及び７０％よりさえも多いタンパク質含有量を意味するものとする。
本発明のためには、用語「微細藻類バイオマス」は、最も広い解釈で、例えば、微細藻類バイオマスの複数の粒子を含む組成物であると理解すべきである。微細藻類バイオマスは、全微細藻類細胞に由来する。
一定数の先行技術文献、例えば国際特許出願の国際公開第２０１０／０４５３６８号は、タンパク質に富むクロレラ属の微細藻類バイオマスの製造方法及び食品における使用について記載している。
このため本発明における問題の微細藻類は、クロレラ属の微細藻類、より具体的にはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、より具体的にはそれ自体は当業者には公知の何れかの方法により（培養が暗所で実施されるために、または菌株がもはやこれらの色素を生成しないように変異させられているどちらかのために）クロロフィル色素が取り除かれているが依然としてクロレラである。
具体的には、微細藻類は、非排他的にクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、クロレラ・ケスレリ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉ）、クロレラ・ミヌチシマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）、クロレラ種（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、クロレラ・ルテオビリディス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ）、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・レイシグリイ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｒｅｉｓｉｇｌｉｉ）、クロレラ・エリプソイデア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）、クロレラ・サッカロフィア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓａｃｃａｒｏｐｈｉｌａ）、パラクロレラ・ケスレリ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉ）、パラクロレラ・ベイジェリンキ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉｉ）、プロトテカ・スタグノラ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｓｔａｇｎｏｒａ）及びプロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）から選択できる。そこで、１つの極めて特定の実施形態では、微細藻類バイオマス組成物はクロレラバイオマス組成物であり、具体的にはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）バイオマス組成物である。
そこでこの特許出願国際公開第２０１０／０４５３６８号に記載された発酵法は、様々な感覚品質の一定数の微細藻類バイオマスの組成物の製造を可能にする。
このため、この文献に記載された方法は、特に食品用途のために許容される官能プロファイルを有するタンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物を、そのように実施するために個人のパネルによる官能的評価を組織化する必要性を伴わずに選択することを可能にする。
１．１１種の揮発性有機化合物を検出することによる感覚プロファイルの定義
本出願人は、タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の感覚プロファイルが特異的悪臭分子、具体的には特異的揮発性有機化合物の性質及び検出閾値によって規定できることを見いだした。
実際に、本出願人は、タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物中の含有量が上記組成物の官能特性を決定することを可能にする１１種の揮発性有機化合物を同定した。
これら１１種の揮発性有機化合物は次の：ペンタナール、ヘキサナール、１−オクテン−３−オール、２−ペンチルフラン、オクタナール、３，５−オクタジエン−２−オール
（または３−オクテン−２−オン）、３，５−オクタジエン−２−オン、ノナナール、２−ノネナール、（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナール及びヘキサン酸である。
そこで、本発明は、タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の官能特性を決定するための方法であって、これら１１種の揮発性有機化合物各々の含有量を決定する工程を含み、１１種の揮発性有機化合物は、ペンタナール、ヘキサナール、１−オクテン−３−オール、２−ペンチルフラン、オクタナール、３，５−オクタジエン−２−オール（または３−オクテン−２−オン）、３，５−オクタジエン−２−オン、ノナナール、２−ノネナール、（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナール及びヘキサン酸である方法に関する。
本方法は、他の揮発性有機化合物の含有量を決定する工程を排除しない。しかしながら、１１種の揮発性有機化合物は、タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の官能特性を決定するために十分である。
好ましくは、これらの揮発性有機化合物は、固相微量抽出法（ＳＰＭＥ）によってサンプリングされ、ガスクロマトグラフィーＧＣ、具体的にはＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー質量分析法）によって分析される。
揮発性画分は、タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物のサンプルから、ＳＰＭＥ繊維の存在下で十分な時間にわたり上記組成物を加熱する工程により抽出される。
繊維は、例えば、ｃａｒｂｏｘｅｎ及びポリジメチルシロキサン（ＣＡＲ／ＰＤＭＳ）、ジビニルベンゼン、ｃａｒｂｏｘｅｎ及びポリジメチルシロキサン（ＤＶＢ／ＣＡＲ／ＰＤＭＳ）、金属とポリジメチルシロキサンの合金（ＰＤＭＳ）、Ｃａｒｂｏｐａｃｋ−Ｚ（登録商標）繊維（黒鉛化カーボンブラック）、ポリアクリレート、Ｃａｒｂｏｗａｘ（登録商標）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＰＤＭＳ／ＤＶＢよりなる群から非排他的に選択されてよい。
好ましくは、ＤＶＢ／ＣＡＲ／ＰＤＭＳ繊維（ｄｆ５０／３０μｍ）が使用される。
ここで、本出願人は、湿式注出技術（水性懸濁液）を４０〜７０℃、好ましくは５０〜６５℃、特におよそ６０℃で少なくとも１０分間、好ましくは少なくとも１５分間、例えば１５分間〜１時間使用することを推奨する。
好ましくは、この抽出工程は、密閉容器内で実施する。例えば少なくとも１ｇ、とりわけ１ｇ〜１０ｇ及び特におよそ２ｇの十分量のサンプルが使用されなければならない。
これらの２ｇは、次に密閉ＳＰＭＥフラスコ（２０ｍＬ）中に配置された、１ｇのＣａＣｌ２、２００μＬのＨＣｌ及び２．３２μｇのヘキサナール−ｄ１２（内部標準）を含有する水７ｍＬ中に懸濁される。
揮発性有機化合物は、次に使用されるＳＰＭＥ繊維のタイプと適合する温度、例えば本出願人らの試験において使用した繊維については２２０〜２５０℃及びより正確には２３０℃で脱着させられ、分析システムに注入される。
好ましくは、分析はガスクロマトグラフィーＧＣ、具体的にはＧＣ−ＭＳによって実施される。
数種のＧＣ／ＭＳ装置、例えばＧＣ／Ｍａｓｓ Ｃｌａｒｕｓ分光計（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳＡ）、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ガスクロマトグラフ（
Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、ＵＳＡ）及びＡｇｉｌｅｎｔ ５９７３選択的質量検出計に結合されたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０Ｎガスクロマトグラフは市販で入手できる。
ＧＣ／ＭＳにおいて使用できるイオン化法は、例えば電子衝撃イオン化（ＥＩ）、化学衝撃イオン化（ＣＩ）、エレクトロスプレーイオン化、化学発光放電、電場脱着（ＦＤ）などを用いた質量分析法である。
抽出された揮発性物質は、本明細書ではより正確にはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＴＳＱ ＧＣ−ＭＳシステムのインジェクター内に脱着させ、次に１．５ｍＬ／分のヘリウムガスを含むＣＰｗａｘ５２（６０ｍ×０．２５ｍｍ、０．２５μｍ）カラム上で分離される。
温度プログラムは：
− ３分間は５０℃の等温、次に
− ５℃／分で２３０℃まで昇温、
− 次に２０分間の等温である。
検出は、電子衝撃（ＥＩ）質量分析法（ＭＳ）によって実施され、化合物はＮＩＳＴライブラリーのＥＩスペクトルとの比較によって同定される。
こうして、揮発性有機化合物に対応するクロマトグラフィーピークの高さまたは表面積は、上記化合物の量と相関する。
用語「ピークの表面積」は、ＳＰＭＥ−ＧＣ／ＭＳクロマトグラムにおける特定イオンの曲線下の表面積を意味するものとする。
好ましくは、１１種中１種の揮発性有機化合物の含有量は、この揮発性有機化合物に対応するＳＰＭＥ−ＧＣ／ＭＳクロマトグラムの特定イオンのピークの表面積によって決定される。
揮発性有機化合物の含有量は、特に基準製品の含有量と比較して決定される。
こうして、全体として、１１種の揮発性有機化合物の低い全含有量は、最適化された官能特性と関連している。これとは逆に、１１種の揮発性有機化合物のより高い全含有量は、中程度またはいっそう不良もしくは許容されない官能特性と関連している。
例えば、許容される官能特性を備える組成物の全含有量は、許容されない官能特性を備える組成物の全含有量の少なくとも２分の１、例えば少なくとも２分の１、３分の１または４分の１、及び最も要求の厳しい実施形態では、少なくとも１０分の１である場合に低い。
２．感覚パネルの定義及び記述子の選択
本発明は、タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の官能特性を試験するための方法であって、試験者パネルによる官能特性の評価を含む方法に関する。この評価は、特に下記に詳述する方法によって実施できる。
本出願人はさらに、微細藻類バイオマスの組成物の官能特性を評価することを可能にする揮発性化合物の分析プロファイルを規定するための方法であって：
− 好ましくは、許容される、及び許容されない官能特性の２つのコントロールを含む、タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物を少なくとも１５人の感覚パネルによる官
能特性の評価と結び付ける第１マトリックスの構築、
− 上記と同じ組成物と揮発性有機化合物の分析プロファイルによる前記組成物の特徴を関連付ける第２マトリックスの構築、及び
− 最適化された官能プロファイルを有する組成物をこのように揮発性有機化合物の分析プロファイルによって特徴付けることができることに基づいて関連モデルを生成するための第１マトリックスと第２マトリックスとを相関させることを含む方法に関する。
感覚パネルは、微細藻類バイオマスの組成物、具体的にはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）バイオマス組成物の様々なバッチの感覚特性を評価するために形成される。
タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の感覚特性を評価するために、少なくとも１５人、例えば１８人のパネルが呼び集められた。
この「専門家パネル」は、便宜的に「感覚プロファイル」と呼ばれるＱＤＡ（登録商標）（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）型の分析を実施することを可能にする（Ｓｔｏｎｅ，Ｈ．，Ｓｉｄｅｌ，Ｊ−Ｌ．，Ｏｌｉｖｉｅｒ，Ｓ．，Ｗｏｏｌｓｅｙ，Ａ．，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，Ｒ．Ｃ；（１９７４），Ｓｅｎｓｏｒｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８（１１），２４−３３）。
規格ＮＦ ＩＳＯ １１０３５：１９９５によって明らかにされたように、タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の嗅覚特性を包括的に記載するために、記述子生成セッションを開始した。
このため、高度に異質であると同定されたバッチのタンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物を３％水溶液として配置した。
各パネリストは、事前に水浴中で５５℃へ加熱されている密閉ガラス瓶中のこの溶液を評価し、製品から各パネリストが感知する全ての臭気を列挙する。
記述子生成セッション中、タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の臭気を記述するために、６０を超える用語が判定者によって列挙された。
記述子のリストは、１６の記述子のリストを得るために最初に質的に減少させられ（例えば：「芝生」の臭気＝「刈草」の臭気）、次にいくつかのＱＤＡ（登録商標）セッションがリストをさらに９つの感覚記述子へ減少させる（参照：ＩＳＯ ４１２１：１９８７）ことを可能にした。
好ましくは、下記の表に呈示した基準製品は、各記述子と関連している：
Figure 0006465885
「ペンキ」記述子は最も官能的に識別力があるので、本出願人は、製造されたタンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の様々なバッチの感覚的分類を確立するために「ペンキ」記述子を主要記述子として使用することを推奨する。
パネルのトレーニング
各記述子についての強度スケールの使用に関してパネルをトレーニングするために様々な演習を実施した（ＮＦ ＩＳＯ ０８５８７：１９９２、ＩＳＯ ０８５８６−１：１９９３、ＩＳＯ ０８５８６−２：１９９４）。
パネルの性能は、同一バッチのタンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物を用いてプロファイル演習を３回実施することによって最終的に妥当性が確認された；パネルは識別力、共感性及び再現性があると考えられたので（Ｐａｇｅｓ，Ｊ．，Ｌｅ，Ｓ．，Ｈｕｓｓｏｎ，Ｆ．，Ｕｎｅ ａｐｐｒｏｃｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｑｕｅｓ ｄｅ ｌａ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｅｎ ａｎａｌｙｓｅ ｓｅｎｓｏｒｉｅｌｌｅ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ［Ａ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｉｎ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ ｓｅｎｓｏｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ］，Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｄｅｓ ａｌｉｍｅｎｔｓ，２６（２００６），４４６−４６９に記載された方法）、このツールは、ＱＤＡ（登録商標）法を使用してタンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の様々なバッチの感覚分析のために使用できる。
感覚プロファイル
パネルは、各記述子についての強度スケールに関して順々に各タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物を分析する。
１つのプロファイルセッション（１サンプルについて）のための質問表は、下記の通りである：
Figure 0006465885
分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、記述子（フィッシャー検定に関連するｐ値がモデル「記述子〜組成物＋パネリスト」における組成物作用に対して０．２０未満である記述子）の識別能力を評価するために実施する。
組成物作用は、記述子の識別能力であると解釈されている；作用がない場合（臨界確率＞０．２０）、様々なバッチの組成物は、この基準によると識別されなかった。
臨界確率が小さいほど、記述子の識別力が大きくなる。
ペンキ記述子は、バッチの許容性を特徴付けるために最も重要な記述子の１つとして突出していた；この記述子に対して得られたグレードは、感覚分類に役立つであろう。
このためこの分類は、次に揮発性有機化合物の分析プロファイルを研究し、微細藻類バイオマスの組成物の不良な官能特性の原因となる分子を選択するための基礎として機能する。
こうして、微細藻類バイオマスの組成物の揮発性有機化合物のプロファイルが決定される。揮発性有機化合物のプロファイルは、当業者には公知の何れかの方法によって、および好ましくは上記に詳述したＳＰＭＥ／ＧＣ−ＭＳによって決定される。
揮発性化合物の分析は、極めて多数のピークを含む極めて複雑なＧＣ−ＭＳクロマトグラムを生じる。分散分析及び線形回帰によって、揮発性有機化合物は、感覚マトリックスについて得られた結果及びペンキ臭気と最高に相関する。
こうして、最適化された官能プロファイルは、揮発性有機化合物の分析プロファイルによって関連付けされ、特徴付けられる。
１つの好ましい実施形態では、選択される様々な有機化合物は、特に上記に規定した基準組成物と比較して、それらの全含有量に関して検討されることになる。具体的には、選択される揮発性有機化合物に対応するクロマトグラフィーピークの全表面積が検討及び比較される。
３．全臭気に大きな影響を及ぼす４種の揮発性有機化合物に基づく単純化モデル
この好ましい実施形態では、本出願人は、最適化された感覚プロファイルを有するタンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物に対する全フレーバー値を確立することが有益にも可能であることを見いだしたが、その全数値は上記で同定した１１種の有機化合物から選択された４種の揮発性有機化合物に基づく。
これらの揮発性有機化合物は、それらの低嗅覚閾値の基準に基づいて選択される。全フレーバー値は、次に関係式：
全フレーバー値＝３，５−オクタジエン−２−オール（または３−オクテン−２−オン）、１−オクテン−３−オール、３，５−オクタジエン−２−オン及び（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナールの個別フレーバー値のΣ、にしたがって確立される。
全ＦＶ＝Σ ＦＶ（３，５−オクタジエン−２−オール）、ＦＶ（１−オクテン−３−オール）、ＦＶ（３，５−オクタジエン−２−オン）及びＦＶ［（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナール］、
式中、ＦＶ＝化合物ｘの濃度／化合物ｘの嗅覚閾値
以下の実施例に示すように、官能的に許容されない基準微細藻類バイオマスの組成物の全フレーバー値に比較して、０〜４０％の低い全フレーバー値を有するタンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物は確実に最適化された感覚プロファイルを有する。
本発明は、例示的及び非限定的であることが意図されている下記の実施例からより明確に理解されるであろう。
実施例１．感覚試験の定義
タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の知覚は、典型的な中性溶媒である水中での溶解度によって決定される。
このため感覚パネルは、上記に規定した方法にしたがって、特許出願の国際公開第２０１０／０４５３６８号の教示にしたがって調製された、タンパク質に富む微細藻類バイオマスの様々なバッチの感覚特性を評価するために形成された。
１８バッチの微細藻類バイオマス：バッチ１１、バッチ１２、バッチ１４、バッチ３３、バッチ３４、バッチ４２、バッチ４３、バッチ４４、バッチ５４、バッチ８１、バッチ８２、バッチ８３、バッチ８４、バッチ８５、バッチ９２、バッチ９３、バッチ１１１、バッチ１１２が試験された。
そのようなバッチの特性解析の結果は、高度に特徴的な「ペンキ」の臭気の記述子に基づいて与えられる。
データ処理：
分析は、Ｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ（自由販売）を使用して実施した：
Ｒバージョン２．１４．１（２０１１−１２−２２）
著作権（Ｃ）２０１１ Ｔｈｅ Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔ
ｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ
ＩＳＢＮ ３−９０００５１−０７−０
プラットフォーム：ｉ３８６−ｐｃ−ｍｉｎｇｗ３２／ｉ３８６（３２ビット）
このソフトウエアは、計算機能を含むモジュールのローディングを必要とする作業環境である。
プロファイルデータを処理するために使用されるモジュールは、下記の通りである：
− ＡＮＯＶＡのため：パッケージｃａｒバージョン２．０−１２
− 線形回帰のため：パッケージｓｔａｔｓバージョン２．１４−１
ＡＮＯＶＡは、１つの製品から次の製品への有意に異なる結果を示している：
Figure 0006465885
製品毎の得られた平均値は、下記の通りである：
Figure 0006465885
図１は、この「ペンキ」基準に基づいてパネリストによって与えられたグレードを考慮に入れた様々なバッチの分類を示している。
そこで分類は、「ペンキ」グレードの昇順で示すと下記の通りである：
バッチ９２＞バッチ１１１＞バッチ１２＞バッチ１１２＞バッチ４３＞バッチ４４＞バッチ３３＞バッチ１１＞バッチ８１＞バッチ１４＞バッチ８２＞バッチ３４＞バッチ４２＞バッチ９３＞バッチ８４＞バッチ５４＞バッチ８３＞バッチ８５。
このためバッチ９２は、このペンキ記述子について許容される官能特性のためのコントロールであると規定されている。
バッチ８５は、その役割として、このペンキ記述子について許容されない官能特性のためのコントロールであると規定されている。
現在では官能分類が確立されたため、本発明によると効率的にも、製造された組成物の品質を規定することを可能にするであろう基準分子標的を同定するためにこれらのサンプルのＳＰＭＥ／ＧＣ−ＭＳプロファイルを分析することができる。
実施例２．許容されない「ペンキ臭気」官能分類と関連する、ＳＰＭＥ／ＧＣ−ＭＳによる揮発性有機化合物（ＶＯＣ）の同定
１８の様々なバッチの微細藻類バイオマスの組成物のＳＰＭＥ／ＧＣ−ＭＳ分析を実施するために、本方法は上記に規定したように水性懸濁液中で実施する。
水性懸濁液中の製品上の揮発性化合物の分析
揮発性化合物は、マトリックス作用を減少させるために水性懸濁液中で分析し、内部標
準を加えた。
ＧＣ−ＭＳクロマトグラムは、視覚的には図２に図示したように、極めて多数の化合物を含み、極めて複雑なままである。
第１のアプローチは、クロマトグラフィープロファイルを比較する工程、全ピークを３．２〜３５．０分に積算する工程（ＴＩＣ、「全イオン電流」）、及びこれらの「未処理」結果が感覚分類への連結を可能にするかどうかをチェックする工程から構成される。
クロマトグラフィープロファイルと３．２〜３５．０分の全ピークの積算（ＴＩＣ「全イオン電流」）との比較−図３を参照されたい−は、感覚分類への連結を可能にしない。
クロマトグラムの高度の複雑性のために、許容される製品と許容されない製品を視覚的に識別することは困難である。
クロマトグラムの表面積の積算は、許容される製品と許容されない製品との明確な区別も可能にしない。
さらに、未処理データを用いるこのアプローチは、どの揮発性化合物がオフノートまたは望ましくない風味もしくは臭気の原因であるのかを識別することを可能にしない、それらの外観を特異的に監視することもない、それらが形成される方法に関する何らかの情報を有してもいない。
第２のアプローチは、官能分類に付随すると思われるＳＰＭＥ／ＧＣ−ＭＳクロマトグラム上で同定された揮発性化合物を列挙することによって上記モデルの揮発性有機化合物のリストに加える工程から構成された。
６つのサンプルのＧＣ−ＭＳ嗅覚検査分析からある揮発性化合物が特に突出した；主に、おそらくオフノートまたは望ましくない風味もしくは臭気の原因であると思われるタンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の脂質画分の分解に由来するアルデヒド類。
そこでこの第２のアプローチでは、様々な製品のＧＣ−ＭＳ嗅覚測定法及びＧＣ−ＭＳによって選択されるこれらの分子の一部を観察することが決定された。
代表的な揮発性有機化合物を選択するために、ＳＰＭＥ−ＧＣ／ＭＳ測定の変動性を前提に１つの組成物を他の組成物から実際に区別できるように一連の分散分析が実施される。
モデルは下記の通りである：揮発性有機化合物〜組成物；フィッシャー検定と関連している臨界確率が０．０５未満である化合物だけが保持される。
２−ノネナール及び３，５−オクタジエン−２−オンの化合物を対象とするＡＮＯＶＡの２つの実施例を本明細書に呈示する：
Figure 0006465885
Figure 0006465885
第１の揮発性有機化合物（２−ノネナール）上では、組成物作用が有意である（臨界確率＜０．０００２５）であると思われるが、これは測定の変動性を前提に製品間に有意差があることを意味する。
第２の化合物（３，５−オクタジエン−２−オン、ピーク２）上では、組成物作用は有意ではない（臨界確率＞０．０５）。そこで、試験のためには、２−ノネナールが保持されるが、３，５−オクタジエン−２−オンは保持されないであろう。
揮発性化合物の第１選択後、線形回帰モデルが確定される：これは各化合物による「ペンキ」変量を１つずつ説明することを含んでいる。
このため存在する多数のモデルと同様に、化合物が構築される。モデルは下記である：ペンキ〜化合物。
観察された許容されない官能分類（オフノート）の原因であると同定された最終リストの化合物を選択するために、スチューデント検定に関連する臨界確率が０．０５未満である（線形回帰係数の無効についての検定）化合物だけが保持されるであろう。
モデルに関連するＲ2は、化合物によって説明される変動性率を定量するための指標である。あまり高くはないが、有意である可能性がある；この理由から、（パネルによって記述されるペンキ臭気に小さな影響しか及ぼさないが、有意な影響を及ぼす化合物を無視しないように）臨界確率にしたがって化合物を選択することが選択される。
Figure 0006465885
Figure 0006465885
これらの２種の化合物ヘキサナール及び３，５−オクタジエン−２−オン（ピーク１）について、臨界確率は０．０５未満であるので、このためそれらはパネルによって記述されたペンキ臭気と相関している。
１１種の試験化合物は、「ペンキ」記述子と明確に相関することが見いだされている。
Figure 0006465885
図４に示したように、許容されない製品は、許容されるサンプルよりもこれら１１種の揮発性化合物がはるかに多く含まれていると思われる。
統計分析は、全１１種の分子が有意である（２１．２４分での３，５−オクタジエン−２−オンの第２ピークを除く）ことを確証している。
結論として、これら１１種の分子（ペンタナール、ヘキサナール、１−オクテン−３−オール、２−ペンチルフラン、オクタナール、３，５−オクタジエン−２−オール（もしくは３−オクテン−２−オン）、３，５−オクタジエン−２−オン（２つのピークの第１）、ノナナール、２−ノネナール、（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナール、ヘキサン酸）を観察すると、水性懸濁液中に配置された製品の揮発性物質を分析する工程によって、「ペンキ」基準に基づいて許容される製品と許容されない製品を識別することを可能にする。
単純化モデルの作製
モデルを単純化するために、本発明によるタンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の全臭気に最大の影響を及ぼす化合物、すなわち極度に低い嗅覚閾値を備える化合物を保持することが決定される。
これらの個別フレーバー値（＝化合物の濃度／化合物の嗅覚閾値）は図５に表示した。
各化合物の濃度及び嗅覚閾値を考慮に入れると、４種の化合物：３，５−オクタジエン−２−オールまたは３−オクテン−２−オン（フローラル・ゼスト）、１−オクテン−３−オール（マッシュルーム溶媒、ペンキ、マッシュルーム・インク）、３，５−オクタジエン−２−オン（２つのピークの第１、フローラル）及び（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナール（油酸化）が、本発明によるタンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の感覚特性にとって特に重要であると思われる。
これら４種の化合物の個別記述子は、本発明による許容されないタンパク質に富む微細藻類バイオマスの組成物の全知覚臭気を極めて良好に結び付ける。
このため、これら４種の化合物に基づいてタンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物についての全フレーバー値を確立することが可能である：
全フレーバー値＝３，５−オクタジエン−２−オール（または３−オクテン−２−オン）、１−オクテン−３−オール、３，５−オクタジエン−２−オンおよび（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナールの個別フレーバー値のΣ
図６に示したように、今後は、タンパク質に富む微細藻類バイオマスの組成物の様々なバッチを容易に２群に分類することができる：
− 許容される：これらはバッチ１１１、９２、１２、１１２、４３、３３、３３、８１、１４、４４、８２及び３４である；
− 許容されない：これらはバッチ８３、８４及び８５である。
実施例１による官能的に許容されない品質のバッチであるバッチ８５は、１００％のフレーバー値を有することに留意されたい。
このバッチ８５のケースでは、このため許容されるバッチは、実際には、許容されない基準微細藻類の４種の組成物の全フレーバー値に比較して０〜４０％の全フレーバー値を有している。
バッチ４２、９３及び５４は、４種の官能的化合物に基づくと、基準バッチ８５の全フレーバー値よりはるかに高い全フレーバー値を有する。
しかしながら、バッチ８５は、「ペンキ」記述子単独に基づいて許容されないと規定されたことに留意されたい。
バッチ４２、９３及び５４は、揮発性有機化合物の分析に関して、明らかに揮発性有機化合物間の相乗作用によって特に影響を受ける。
これは、基準１１種中の４種の揮発性有機化合物の選択に基づく単純化モデルがタンパク質に富む微細藻類バイオマスの組成物を２つの独特で容易に同定可能な群に分類することを可能にするという事実を損なわせない。

Claims (9)

  1. タンパク質に富む微細藻類バイオマスの組成物の官能特性を決定するための方法であって、１１種の揮発性有機化合物の含有量を決定する工程を含み、前記１１種の揮発性有機化合物がペンタナール、ヘキサナール、１−オクテン−３−オール、２−ペンチルフラン、オクタナール、３，５−オクタジエン−２−オール（または３−オクテン−２−オン）、３，５−オクタジエン−２−オン、ノナナール、２−ノネナール、（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナール及びヘキサン酸であり、前記微細藻類バイオマスがバイオマスの乾燥重量で５０％を超えるタンパク質を含むこと、及び前記微細藻類がクロレラ属の微細藻類であることを特徴とする方法。
  2. 前記１１種の揮発性有機化合物の含有量が、ＳＰＭＥ／ＧＣ、好ましくはＳＰＭＥ／ＧＣ−ＭＳによって決定される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記１１種の揮発性有機化合物の含有量が、ＳＰＭＥ／ＧＣ後のクロマトグラフィーピークの表面積によって決定されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記１１種の揮発性有機化合物の含有量、具体的には前記１１種の揮発性有機化合物に対応するクロマトグラフィーピークの表面積が、それに対して官能特性が特に許容されない、または許容されると規定される、タンパク質に富む１種以上の基準微細藻類バイオマスの表面積と比較されることを特徴とする、請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の方法。
  5. タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の官能特性を評価することを可能にする、揮発性有機化合物の分析プロファイルを規定するための方法であって：
    − a) 許容される及び許容されない官能特性の２つのコントロールを含む微細藻類バイオマス組成物を少なくとも１５人の感覚パネルによる官能特性の評価と結び付ける第１マトリックスの構築、
    − b) 上記と同じ、ステップa)の許容される及び許容されない官能特性の２つのコントロールを含む微細藻類バイオマス組成物と揮発性有機化合物の分析プロファイルによる前記組成物の特徴を関連付ける第２マトリックスの構築、及び
    − c) 最適化された官能プロファイルを有する組成物を揮発性有機化合物の分析プロファイルによって特徴付けることができることに基づいて関連モデルを生成するために第１マトリックスと第２マトリックスとを相関させること
    を含み、
    最適化された官能プロファイルは、前記微細藻類バイオマス組成物を含む食品調製品の官能特性を損なうオフノートが存在しないことを示し、
    − 前記微細藻類バイオマスが、バイオマスの乾燥重量で５０％を超えるタンパク質を含むこと、及び前記微細藻類はクロレラ属の微細藻類であることを特徴とする方法。
  6. ステップa)の官能特性の評価が、
    − 次の臭気：野菜、マッシュポテト、ストック、酸敗したバター、チーズ、堆肥、発酵、ピーナッツ及びペンキ；並びに
    − 次の色：黄色及び緑色、
    を含む記述子の分析を含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  7. タンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物の官能特性を決定するための方法であって、４種の揮発性有機化合物の含有量を決定する工程を含み、前記４種の有機化合物が、３，５−オクタジエン−２−オール（または３−オクテン−２−オン）、１−オクテン−３−オール、３，５−オクタジエン−２−オン及び（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナールである工程、並びに３，５−オクタジエン−２−オール（または３−オクテン−２−オン）、１−オクテン−３−オール、３，５−オクタジエン−２−オン及び（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナールの個別フレーバー値の合計から全フレーバー値を計算する工程を含み、並びに、
    化合物ｘのフレーバー値が、化合物ｘの濃度／化合物xの嗅覚閾値であり、
    前記微細藻類バイオマスが、バイオマスの乾燥重量で５０％を超えるタンパク質を含むこと、及び前記微細藻類がクロレラ属の微細藻類であることを特徴とする方法。
  8. 許容される官能プロファイルを有するタンパク質に富む微細藻類バイオマス組成物を選択するための方法であって、前記官能特性が請求項１ないし４及び請求項７のいずれか一項に記載の方法によって決定されること、及び前記組成物は、請求項７に記載の方法によって計算された前記全フレーバー値が官能的に許容されない基準微細藻類バイオマス組成物の全フレーバー値に比較して０〜４０％である場合に選択されることを特徴とし、前記微細藻類バイオマスがバイオマスの乾燥重量で５０％を超えるタンパク質を含むこと及び前記微細藻類がクロレラ属の微細藻類であることを特徴とする方法。
  9. 請求項１ないし請求項４及び請求項７のいずれか一項に記載の方法であって、前記微細藻類が、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）及びクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）よりなる群から選択され、より好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）であることを特徴とする方法。
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