JP6326570B2 - （Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドの固体形態 - Google Patents

Description

本発明は、固相形態、例えば結晶及びアモルファス形態である（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド、それらの医薬組成物、及びそれらを用いる方法に関する。

ＣＦＴＲは、吸収性及び分泌性上皮細胞を含む種々の細胞型に発現されるｃＡＭＰ／ＡＴＰ−介在性アニオンチャネルであり、当該上皮細胞でそれは膜を通過するアニオンの流れ、並びに他のイオンチャネル及びタンパク質の活性を制御する。上皮細胞においては、ＣＦＴＲの正常機能は呼吸器及び消化器組織を含む体中の電解質輸送の維持に不可欠である。ＣＦＴＲは、それぞれ６つの膜貫通へリックス及びヌクレオチド結合ドメインを含有する、膜貫通ドメインのタンデムリピートからなるタンパク質をコードする約１４８０アミノ酸から構成される。２つの膜貫通ドメインは、チャネル活性及び細胞輸送を制御する、複数のリン酸化部位を有する、大きい、極性の、制御（Ｒ）−ドメインにより結合される。

ＣＦＴＲをコードする遺伝子が同定され、配列が決定されている（Ｇｒｅｇｏｒｙ、Ｒ. Ｊ. ｅｔ ａｌ.（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４７：３８２−３８６；Ｒｉｃｈ、Ｄ. Ｐ. ｅｔ ａｌ.（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４７：３５８−３６２参照）、（Ｒｉｏｒｄａｎ、Ｊ. Ｒ. ｅｔ ａｌ.（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：１０６６−１０７３）。この遺伝子の欠損はＣＦＴＲの変異を生じさせ、ヒトにおいて、最も一般的な致命的遺伝子疾患である嚢胞性線維症（「ＣＦ」）を引き起こす。嚢胞性線維症は、米国において、乳児約２，５００名に１名が発症する。米国の一般集団内で、最大１０００万人が、明らかな病気の影響がなく欠損遺伝子の１コピーを有する。対照的に、ＣＦ関連遺伝子の２コピーを有する個体は、慢性肺疾患を含む、ＣＦの、衰弱性で致死的な病態を発症する。

嚢胞性線維症の患者において、呼吸器上皮に内因性に発現しているＣＦＴＲの変異が頂端アニオン分泌の減少を導き、イオンおよび流体輸送のアンバランスの原因となる。結果として生じるアニオン輸送の低下は、肺における粘液蓄積増加及びこれに伴う微生物感染に関与し、最終的にＣＦ患者を死亡させる。呼吸器疾患に加えて、ＣＦ患者は、典型的には、胃腸障害および膵臓不全を患い、処置せず放置すれば、死亡する。さらに、嚢胞性線維症を有する男性の大部分は生殖能力がなく、嚢胞性線維症を有する女性の間では生殖能力が低下する。２コピーのＣＦ関連遺伝子の重篤な影響とは対照的に、１コピーのＣＦ関連遺伝子を有する個体は、コレラおよび下痢が原因の脱水に対する耐性増強を示し、その集団内でのＣＦ遺伝子の相対的に高い頻度を説明するようである。

ＣＦ染色体のＣＦＴＲ遺伝子の配列分析は、種々の疾患原因変異を明らかにしている（Ｃｕｔｔｉｎｇ、Ｇ. Ｒ. ｅｔ ａｌ.（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４６：３６６−３６９；Ｄｅａｎ、Ｍ. ｅｔ ａｌ.（１９９０）Ｃｅｌｌ ６１：８６３：８７０；ａｎｄ Ｋｅｒｅｍ、Ｂ−Ｓ. ｅｔ ａｌ.（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：１０７３−１０８０；Ｋｅｒｅｍ、Ｂ−Ｓ ｅｔ ａｌ.（１９９０）Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ８７：８４４７−８４５１）。科学及び医学文献によって報告されているとおり、今日までに、ＣＦ遺伝子における１０００を超える病因性変異が同定されている。最も優勢な変異はＣＦＴＲアミノ酸配列の５０８位のフェニルアラニンの欠失であり、一般にΔＦ５０８‐ＣＦＴＲと呼ばれる。この変異は、嚢胞性線維症の症例の約７０％において生じ、重篤な疾患と関連する。他の変異には、Ｒ１１７Ｈ及びＧ５５１Ｄが含まれる。

ΔＦ５０８‐ＣＦＴＲにおける残基５０８の欠失は、発生期タンパク質の正しい折りたたみを妨げる。これにより、変異タンパク質がＥＲを出られず、形質膜へ輸送されない。結果として、膜に存在するチャネル数は、野生型ＣＦＴＲを発現する細胞において認められるものより遙かに少なくなる。輸送障害に加えて、この変異は、不完全なチャネル開閉を生じる。合わせて、膜におけるチャネル数の減少および不完全開閉が上皮を横断するアニオン輸送の低下をもたらし、イオンおよび体液の不完全輸送に至る（Ｑｕｉｎｔｏｎ，Ｐ．Ｍ．（１９９０），ＦＡＳＥＢ Ｊ．４：２７０９−２７２７）。しかし、膜におけるΔＦ５０８‐ＣＦＴＲの数の減少が、たとえ野生型ＣＦＴＲより低くても、機能していることを示した研究がある（Ｄａｌｅｍａｎｓら（１９９１），Ｎａｔｕｒｅ Ｌｏｎｄ．３５４：５２６−５２８；Ｄｅｎｎｉｎｇら，前出；Ｐａｓｙｋ ａｎｄ Ｆｏｓｋｅｔｔ（１９９５），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１２３４７−５０）。ΔＦ５０８‐ＣＦＴＲに加えて、不完全な輸送、合成及び／又はチャネル開閉を生じるＣＦＴＲにおける他の疾患原因となる変異は、アップレギュレートもしくはダウンレギュレートされて、アニオン分泌を変化させ得、疾患の進行及び／又は重症度を変化させることがある。

ＣＦＴＲは、アニオンに加えて種々の分子を輸送するが、この役割（アニオンの輸送）が、上皮を通過するイオンおよび水を輸送するという重要な機構における１つの要素を表すことは明らかである。他の要素としては、細胞への塩化物イオンの取り込みを担う上皮Ｎａ^＋チャネル、ＥＮａＣ、Ｎａ^＋／２Ｃｌ⁻／Ｋ^＋共輸送体、Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅポンプおよび側底膜Ｋ＋チャネルが挙げられる。

これらの要素は、共同して働き、それらの細胞内での選択的発現および局在化を介して上皮を通過する指向性輸送を達成する。塩化物吸収は、頂端膜上に存在するＥＮａＣおよびＣＦＴＲおよび細胞の側底表面に発現されるＮａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅポンプおよびＣｌ−チャネルの協調した活性により行われる。管腔側からの塩化物の二次的な能動的輸送が細胞内塩化物の蓄積をもたらし、次いで、それはＣｌ⁻チャネルを介して細胞から受動的に離れて、方向性の輸送をもたらすことができる。側底表面上のＮａ^＋／２Ｃｌ⁻／Ｋ^＋共輸送体、Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅポンプおよび側底膜Ｋ^＋チャネルおよび管腔側のＣＦＴＲの配置が、管腔側のＣＦＴＲを介した塩化物の分泌を調整する。恐らく水それ自体が能動的に輸送されないため、上皮を通過するその流れは、ナトリウムおよび塩化物の大きな流れにより生じるわずかな経上皮浸透圧勾配に依存する。

上記のとおり、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲにおける残基５０８の欠失が発生期タンパク質の正しい折りたたみを妨げ、その結果、この変異タンパク質がＥＲから出られず、形質膜に移動できないと考えられている。結果として、成熟タンパク質が不十分な量しか形質膜に存在せず、上皮組織内の塩化物イオン輸送は顕著に低下する。実際に、小胞体（ＥＲ）機構によるＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターの不完全なＥＲプロセシングというこの細胞現象は、ＣＦ疾患についてのみならず、他の広い範囲の孤立性疾患および遺伝性疾患についても、基礎であることが示された。ＥＲ機構が機能不全となりうる２通りの機構は、分解に至るタンパク質がＥＲ排出されるためのカップリングの喪失、またはこれら不完全／ミスフォールドタンパク質のＥＲ蓄積のいずれかによるものである［Ａｒｉｄｏｒ Ｍら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，５（７），ｐｐ７４５−７５１（１９９９）；Ｓｈａｓｔｒｙ，Ｂ．Ｓ．ら，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，４３，ｐｐ１−７（２００３）；Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ，Ｊ．ら，Ｓｗｉｓｓ Ｍｅｄ Ｗｋｌｙ，１３２，ｐｐ２１１−２２２（２００２）；Ｍｏｒｅｌｌｏ，ＪＰら，ＴＩＰＳ，２１，ｐｐ．４６６−４６９（２０００）；Ｂｒｏｓｓ Ｐ．，ら，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔ．，１４，ｐｐ．１８６−１９８（１９９９）］。

（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドは、米国特許出願公開２００９０１３１４９２号（該公報は、そのすべてが引用によりここに組み込まれる）にＣＦＴＲ活性の調節剤、それゆえＣＦＴＲ介在性疾患、例えば嚢胞性線維症の処置に有用であるとして開示されている。しかし、治療剤として使用するために適切な医薬組成物に容易に用いられる、該化合物の安定な固体形態が必要である。

本発明は、以下の構造：

を有する（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド（ここでは以降「化合物１」と言う）の固体形態に関する。

化合物１及びそれらの薬学的に許容される組成物は、例えば、嚢胞性線維症のようなＣＦＴＲ介在性疾患の処置に又は重症度を軽減させるのに有用である。１つの態様としては、化合物１は、本明細書に記載され且つ特徴付けられるフォームＡと呼ばれる実質的に結晶性で塩のない形態であるものである。他の態様としては、化合物１は、本明細書に記載され且つ特徴付けられるアモルファス形態にあるものである。薬物としてのその有効性に関連する固体の性質は、固体の形態に依存しうる。例えば、薬物物質において、固体形態の種類は、例えば、融点、溶解速度、経口吸収性、バイオアベイラビリティ、毒性結果、及び更には臨床試験結果に違いを生じさせうる。

本明細書において記載される方法は、化合物１のフォームＡ又はアモルファス形態又は両方を含む本発明の組成物の調製に用いることができる。

図１は化合物１の粉末Ｘ線回折パターンを示す。

図２は化合物１の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレースを示す。

図３は化合物１の熱重量分析（ＴＧＡ）プロットを示す。

図４は化合物１のフォームＡの単結晶から計算したＸ線結晶回折パターンを示す。

図５はＤＣＭを溶媒として用いるスラリー技術（２週間）により調製した化合物１のフォームＡの実際の粉末Ｘ線回折パターンを示す。

図６は化合物１のフォームＡの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレースを示す。

図７はアセトニトリルからの高速蒸発法により調製した化合物１のフォームＡの実際の粉末Ｘ線回折パターンを示す。

図８はＥｔＯＡｃ及びヘプタンを用いた貧溶媒法により調製した化合物１のフォームＡの実際の粉末Ｘ線回折パターンを示す。

図９は単結晶Ｘ線分析に基づく化合物１のフォームＡの立体配座図を示す。

図１０は化合物１のフォームＡの積層順序を示す立体配座図を示す。

図１１は化合物１のフォームＡの固体状態^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（１５.０ｋＨｚスピン）を示す。

図１２は化合物１のフォームＡの固体状態^１９Ｆ ＮＭＲスペクトル（１２.５ｋＨｚスピン）を示す。

図１３は高速蒸発ロータリーエバポレーション法からの化合物１のアモルファス形態の粉末Ｘ線回折パターンを示す。

図１４は高速蒸発ロータリーエバポレーション法により調製した化合物１のアモルファス形態の変調示差走査熱量測定（ＭＤＳＣ）トレースを示す。

図１５は高速蒸発ロータリーエバポレーション法により調製した化合物１のアモルファス形態の熱重量分析（ＴＧＡ）プロットを示す。

図１６はスプレードライ法により調製した化合物１のアモルファス形態の粉末Ｘ線回折パターンを示す。

図１７はスプレードライ法により調製した化合物１のアモルファス形態の変調示差走査熱量測定（ＭＤＳＣ）トレースを示す。

図１８は化合物１のアモルファス形態の固体状態^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（１５.０ｋＨｚスピン）を示す。

図１９は化合物１のアモルファス形態の固体状態^１９Ｆ ＮＭＲスペクトル（１２.５ｋＨｚスピン）を示す。

定義

ここで使用される場合、他に示さない限り以下の定義を適用すべきである。

用語「ＣＦＴＲ」とは、ここで使用される場合、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子又は制御因子活性の能力のあるその変異体を意味し、ΔＦ５０８ ＣＦＴＲおよびＧ５５１Ｄ ＣＦＴＲが含まれるが、これらに限定されない（ＣＦＴＲ変異体については、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｔ．ｓｉｃｋｋｉｄｓ．ｏｎ．ｃａ／ＣＦＴＲ／を参照のこと））。

ここで使用される場合、用語「アモルファス」とは、無秩序な配列の分子からなり、明確な結晶格子を有しない固体の形態を意味する。

ここで使用される場合、「結晶」とは、構造ユニットが固定された幾何学的パターン又は格子に配列され、それにより結晶固体が強固な長距離秩序を有する化合物または組成物を意味する。結晶構造を構成する構造ユニットは、原子、分子又はイオンでありうる。結晶固体は、明確な融点を有する。

用語「調節」とは、ここで使用される場合、例えば活性を測定可能な量で増加または減少させることを意味する。

用語「化学的に安定な」とは、ここで使用される場合、化合物１の固体形態が、例えば４０℃／相対湿度７５％の特定の条件に、１日、２日、３日、１週間、２週間又はそれ以上の一定期間付したときに１種以上の異なる化合物に分解しないことを意味する。ある態様においては、２５％未満の化合物１の固体形態が分解し、ある実施態様においては、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約３％未満、約１％未満、約０.５％未満の化合物１が特定の条件下で分解する。ある実施態様においては、検出可能な量の固体形態の化合物１は分解しない。

用語「物理的に安定な」とは、本明細書において使用される場合、例えば４０℃／相対湿度７５％の特定の条件に、例えば１日、２日、３日、１週間、２週間又はそれ以上の一定期間付したときに、化合物１の固体形態が、化合物１の１種以上の異なる物理的形態（例えば、ＸＲＰＤ、ＤＳＣ等により測定して異なる固体形態）に変化しないことを意味する。ある実施態様においては、特定の条件に付したときに、２５％未満の化合物１の固体形態が１種以上の異なる物理的形態に変化する。ある実施態様においては、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約３％未満、約１％未満、約０.５％未満の化合物１の固体形態は、特定の条件に付したときに、１種以上の異なる物理的形態に変化する。ある実施態様においては、検出可能な量の固体形態の化合物１は１種以上の物理的に異なる固体形態の化合物１に変化しない。

語句「実質的にアモルファスの化合物１」は、ここで使用される場合、「アモルファス化合物１」、「実質的に結晶性の化合物１を含まないアモルファス化合物１」及び「実質的にアモルファスの（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド」と同義的に使用される。ある実施態様においては、実質的にアモルファスの化合物１とは、約３０％未満の結晶性化合物１、例えば、約３０％未満の結晶性化合物１、例えば、約２５％未満の結晶性化合物１、約２０％未満の結晶性化合物１、約１５％未満の結晶性化合物１、約１０％未満の結晶性化合物１、約５％未満の結晶性化合物１、約２％未満の結晶性化合物１を含む。

ここで使用される場合、語句「実質的に結晶性の化合物１のフォームＡ」とは「化合物１のフォームＡ」及び「実質的にアモルファス化合物１を含まない結晶性化合物１のフォームＡ」と同義的に使用される。ある実施態様においては、実質的に結晶性の化合物１のフォームＡは、約３０％未満のアモルファス化合物１又は他の固体形態、例えば、約３０％未満のアモルファス化合物１又は他の固体形態、例えば、約２５％未満のアモルファス化合物１又は他の固体形態、約２０％未満のアモルファス化合物１又は他の固体形態、約１５％未満のアモルファス化合物１又は他の固体形態、約１０％未満のアモルファス化合物１又は他の固体形態、約５％未満のアモルファス化合物１又は他の固体形態、約２％未満のアモルファス化合物１又は他の固体形態を有する。ある実施態様においては、実質的に結晶性の化合物１のフォームＡは約１％未満のアモルファス化合物１又は他の固体形態を有する。

用語「実質的に含まない」（句「実質的に形態Ｘを含まない」におけるような）とは、指定した化合物１の固体形態（例えば、本明細書においてアモルファス又は結晶固体形態と記載される）を言うとき、２０％（重量）未満の示した形態又は共形態（co−form）（例えば、化合物１の結晶又はアモルファス形態）が存在することを意味し、より好ましくは、１０％（重量）未満の示した形態が存在すること、より好ましくは５％（重量）未満の示した形態が存在すること、最も好ましくは１％（重量）未満の示した形態が存在することを意味する。

用語「実質的に純粋な」とは、指定した化合物１の固体の形態（例えば、本明細書に記載のアモルファス又は結晶性固体形態）を言うとき、指定した固体形態が、２０％（重量）未満の残りの成分、例えば化合物１の別の多形又は同形結晶形態又は共形態を含有することを意味する。実質的に純粋な化合物１の固体形態は、１０％（重量）未満の化合物１の別の多形又は同形の結晶形態、より好ましくは５％（重量）未満の化合物１の別の多形又は同形の結晶形態、及び最も好ましくは１％（重量）未満の別の化合物１の多形又は同形の結晶形態を含有することが好ましい。

ここで使用される場合、「分散体」は、分散相である１種の物質が、第２の物質（連続相又は媒体）中に、区別されたユニットとして分散している分散系を言う。分散相の大きさは、大幅に異なりうる（例えば、ナノメートル容積のコロイド粒子から、数ミクロンサイズまで）。一般には、分散相は、固体、液体又は気体でありうる。固体分散体である場合には、分散相及び連続相はいずれも固体である。薬学的な適用においては、固体分散体はアモルファスポリマー（連続相）中の結晶性の薬物（分散相）、あるいはアモルファスポリマー（連続相）中のアモルファスの薬物（分散相）を含むことができる。ある実施態様としては、アモルファス固体分散体は、分散相を構成するポリマー及び連続層を構成する薬物を含む。ある実施態様においては、分散体はアモルファス化合物１又は実質的にアモルファスの化合物１を含む。

用語「固体アモルファス分散体」は、一般に２以上の成分、通常薬物及びポリマーの固体分散体のことを言うが、化合物１がアモルファス又は実質的にアモルファス（例えば、実質的に結晶化合物１を含まない）であり、アモルファスの薬物の物理的安定性及び／又は溶解及び／又は溶解性が他の成分、例えば、界面活性剤又は他の薬学的賦形剤により促進されるならば、該他の成分も含むことが可能である。

ここで使用される場合、用語「約」及び「大凡」が組成物の内容又は組成物の投与形態の用量、量、又は重量割合に関連して用いられる場合、用量、量、又は重量割合は、特定の用量、量、又は重量割合により得られるのと同等の薬理学効果を提供することを当業者により認識されるものを意味する。特に用語「約」又は「大凡」は、当業者が特定の値における許容できる誤差を意味し、それはある程度どのようにその値が測定又は決定されたかによる。特定の実施態様としては、用語「約」又は「大凡」は、標準偏差１、２、３又は４の範囲内であることを意味する。特定の実施態様としては、用語「約」又は「大凡」は、ある数値又は範囲の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０.５％、０.１％又は０.０５％以内を意味する。

略語「ＭＴＢＥ」及び「ＤＣＭ」は、それぞれメチルt−ブチルエーテルおよびジクロロメタンを意味する。

略語「ＸＲＰＤ」は粉末Ｘ線回折を意味する。

略語「ＤＳＣ」は示差走査熱量測定を意味する。

略語「ＴＧＡ」は熱重量分析を意味する。

他に示さない限り、本明細書に記載された構造は、また構造のすべての異性体（例えば、エナンチオマー的、ジアステレオマー的、及び幾何学的（又は配座的）形態を含むこと意味する；例えば、各不斉中心におけるR及びS配置、（Ｚ）及び（Ｅ）二重結合異性体、及び（Z）及び（E）配座異性体がある。それゆえ、本化合物の単一の立体異性体並びに、エナンチオマー的、ジアステレオマー的、及び幾何学的（又は配座的）混合物は本発明の範囲内である。化合物１の全ての互変異性形態が本明細書に含まれる。例えば、化合物１は互変異性体として存在してもよく、ここで、いずれも本明細書に含まれる：

加えて、他に示さない限り、本明細書に示した構造は、また１種以上の同位体濃縮原子の存在によってのみ異なる化合物を含む。例えば、１個以上の水素原子が、重水素又はトリチウムで置き換えられた、又は１個以上の炭素原子が^１３C−又は^１４C−濃縮原子によって置き換えられた化合物１は本発明の範囲内である。そのような化合物は、例えば、分析ツール、生物学的アッセイにおけるプローブ、又は改善された治療プロファイルを有する化合物として有用である。

１つの態様としては、本発明は、結晶フォームＡとして特徴付けられる（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドであることを特徴とする。

他の実施態様としては、フォームＡは、Ｃｕ Ｋα照射を用いて得られた粉末Ｘ線回折において、１９.３ないし１９.７°、２１.５ないし２１.９°及び１６.９ないし１７.３°における１個以上のピークにより特徴付けられる。他の実施態様としては、フォームＡは、約１９.５、２１.７及び１７.１°における１個以上のピークにより特徴付けられる。他の実施態様としては、フォームＡは、さらに２０.２ないし２０.６°におけるピークにより特徴付けられる。他の実施態様としては、フォームＡは、さらに約２０.４°におけるピークにより特徴付けられる。他の実施態様としては、フォームＡは、さらに１８.６ないし１９.０°におけるピークにより特徴付けられる。他の実施態様としては、フォームＡは、さらに約１８.８°におけるピークにより特徴付けられる。他の実施態様としては、フォームＡは、さらに２４.５ないし２４.９°におけるピークにより特徴付けられる。他の実施態様としては、フォームＡは、さらに約２４.７°におけるピークにより特徴付けられる。他の実施態様としては、フォームＡは、さらに９.８ないし１０.２°におけるピークにより特徴付けられる。他の実施態様としては、フォームＡは、さらに約１０.０°におけるピークにより特徴付けられる。他の実施態様としては、フォームＡは、さらに４.８ないし５.２°におけるピークにより特徴付けられる。他の実施態様としては、フォームＡは、さらに約５.０°におけるピークにより特徴付けられる。他の実施態様としては、フォームＡは、さらに２４.０ないし２４.４°におけるピークにより特徴付けられる。他の実施態様としては、フォームＡは、さらに約２４.２°におけるピークにより特徴付けられる。他の実施態様としては、フォームＡは、さらに１８.３ないし１８.７°におけるピークにより特徴付けられる。他の実施態様としては、フォームＡは、さらに約１８.５°におけるピークにより特徴付けられる。

他の実施態様としては、フォームＡは、実質的に図４に類似する回折パターンにより特徴付けられる。他の実施態様としては、フォームＡは、実質的に図５に類似する回折パターンにより特徴付けられる。

他の態様としては、本発明は、単斜晶系、C２空間群、及び以下の単位胞寸法：ａ＝２１.０９５２（１６）Å、α＝９０°、ｂ＝６.６２８７（５）Å、β＝９５.８６７（６）°、ｃ＝１７.７９１７（１５）Å、及びγ＝９０°を有する（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドの結晶形態であることを特徴とする。

他の態様としては、本発明は、フォームＡ及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物であることを特徴とする。他の実施態様としては、医薬組成物はさらに追加の治療剤を含む。他の実施態様としては、追加の治療剤は、粘液溶解剤、気管支拡張剤、抗生物質、抗感染症剤、抗炎症剤、ＣＦＴＲ賦活剤又は栄養剤から選択される。

他の態様としては、本発明は、（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドを溶媒中で有効な時間スラリー化することを含むフォームＡを調製する方法を特徴とする。他の実施態様としては、溶媒は、酢酸エチル、ジクロロメタン、ＭＴＢＥ、酢酸イソプロピル、水／エタノール、水／アセトニトリル、水／メタノール、又は水／イソプロピルアルコールである。他の実施態様としては、有効な時間は、２４時間ないし２週間である。他の実施態様としては、有効な時間は、２４時間ないし１週間である。他の実施態様としては、有効な時間は２４時間ないし７２時間である。

他の態様としては、本発明は、（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドを溶媒に溶解させ、溶媒を蒸発させることを含む、フォームＡの調製方法を特徴とする。他の実施態様としては、溶媒は、アセトン、アセトニトリル、メタノール又はイソプロピルアルコールである。

他の態様としては、本発明は、（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドを第１溶媒に溶解させ、（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドが溶解しない第２溶媒を加えることを含む、フォームＡの調製方法を特徴とする。他の実施態様としては、第１溶媒は、酢酸エチル、エタノール、イソプロピルアルコール又はアセトンである。他の実施態様としては、第２溶媒はヘプタン又は水である。他の実施態様としては、第２溶媒の添加は、第１溶媒及び（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドの溶液の攪拌中に行われる。

他の態様としては、本発明は、実質的にアモルファスである（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド固体であることを特徴とする。他の実施態様としては、アモルファスの（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドは、約５％未満の結晶性（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドを含む。

他の態様としては、本発明は、アモルファスの（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物であることを特徴とする。他の実施態様としては、医薬組成物は、さらに、追加の治療剤を含む。他の実施態様としては、追加の治療剤は、粘液溶解剤、気管支拡張剤、抗生物質、抗感染症剤、抗炎症剤、ＣＦＴＲ賦活剤又は栄養剤から選択される。

他の態様としては、本発明は、（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドを適切な溶媒に溶解させ、ロータリーエバポレーションにより溶媒を除去することを含む、アモルファスの（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドの調製方法を特徴とする。他の実施態様としては、溶媒はメタノールである。

他の態様としては、本発明は、アモルファスの（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド及びポリマーを含む固体分散体を特徴とする。他の実施態様としては、ポリマーは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）である。他の実施態様としては、ポリマーは、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）である。

他の実施態様としては、ポリマーは１０重量％ないし８０重量％の量で存在する。他の実施態様としては、ポリマーは３０重量％ないし６０重量％の量で存在する。他の実施態様としては、ポリマーは約４９.５重量％の量で存在する。

他の実施態様としては、（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドは１０重量％ないし８０重量％の量で存在する。他の実施態様としては、（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドは３０重量％ないし６０重量％の量で存在する。他の実施態様としては、（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドは約５０重量％の量で存在する。

他の実施態様としては、固体分散体は、さらに界面活性剤を含む。他の実施態様としては、界面活性剤はラウリル硫酸ナトリウムである。他の実施態様としては、界面活性剤は、０.１重量％ないし５重量％の量で存在する。他の実施態様としては、界面活性剤は、約０.５重量％の量で存在する。

他の実施態様としては、ポリマーが４９.５重量％の量のヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）であり、界面活性剤が０.５重量％の量のラウリル硫酸ナトリウムであり、そして（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドが５０重量％の量で存在する。

他の態様としては、本発明は、固体分散体及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を特徴とする。他の実施態様としては、医薬組成物はさらに追加の治療剤を含む。他の実施態様としては、追加の治療剤は、粘液溶解剤、気管支拡張剤、抗生物質、抗感染症剤、抗炎症剤、ＣＦＴＲ賦活剤又は栄養剤から選択される。

他の態様としては、本発明は、（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドをスプレードライすることを含む、アモルファスの（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドの製造方法を特徴とする。

他の実施態様としては、本方法は（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド及び適切な溶媒を組合わせ、続いて混合物をスプレードライしてアモルファスの（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドを得ることを含む。
他の実施態様としては、溶媒はアルコールである。
他の実施態様としては、溶媒はメタノールである。

他の実施態様としては、以下の方法を含む：a）（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド、ポリマー、及び溶媒の混合物を形成すること；そしてb）混合物をスプレードライして固体分散体を形成すること。

他の実施態様としては、ポリマーは、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）である。他の実施態様としては、ポリマーが固体分散体の１０重量％ないし８０重量％の量である。他の実施態様としては、ポリマーが固体分散体の約４９.５重量％の量である。他の実施態様としては、溶媒はメタノールである。他の実施態様としては、混合物は更に界面活性剤を含む。他の実施態様としては、界面活性剤はラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）である。他の実施態様としては、界面活性剤は固体分散体の０.１％重量ないし５重量％の量である。他の実施態様としては、界面活性剤は固体分散体の約０.５重量％の量である。

他の実施態様としては、ポリマーが、固体分散体の約４９.５重量％の量であるヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）であり、溶媒はメタノールであり、混合物がさらに固体分散体の約０.５重量％の量であるラウリル硫酸ナトリウムを含む。

他の態様としては、本発明は、フォームＡ、アモルファスの（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド、又はアモルファスの（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドの固体分散体の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるＣＦＴＲ介在性疾患の処置方法を特徴とする。

他の実施態様としては、ＣＦＴＲ介在性疾患は嚢胞性線維症、喘息、喫煙誘発性ＣＯＰＤ、慢性気管支炎、鼻副鼻腔炎、便秘、膵炎、膵機能不全、先天性両側精管欠損症（ＣＢＡＶＤ）に起因する男性不妊、軽度肺疾患、突発性膵炎、アレルギー性気管支肺アルペルギルス症（ＡＢＰＡ）、肝疾患、遺伝性肺気腫、遺伝性血色素症、血液凝固−線維素溶解欠乏症、プロテインC欠乏症、１型遺伝性血管浮腫、脂質プロセシング欠損症、家族性高コレステロール血症、１型乳糜血症、無βリポタンパク血症、リソソーム性蓄積症、Ｉ細胞病／偽ハーラー症、ムコ多糖症、サンドホフ病／テイ−サックス病、クリグラー・ナジャー症候群II型、多腺性内分泌障害／高インスリン血症、糖尿病、ラロン小人症、ミエロオキシダーゼ欠損症、原発性副甲状腺機能亢進症、メラノーマ、グリカノーシス（glycanosis）ＣＤＧ１型、先天性甲状腺機能亢進症、骨形成不全症、遺伝性低フィブリノーゲン血症、ACT欠損症、糖尿病性尿崩症（ＤＩ）、骨端軟骨性ＤＩ、腎性ＤＩ、シャルコー・マリー・トゥース症候群、ペリツェーウス・メルバッハー病（Perlizaeus-Merzbacher disease）、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻痺（progressive supranuclear plasy）、ピック病、数種のポリグルタミン神経障害、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調症Ｉ型（spinocerebullar ataxia type Ｉ）、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（dentatorubal pallidoluysian）、筋緊張性ジストロフィ、海綿状脳症、遺伝性クロイツフェルト・ヤコブ病（プリオンタンパク質プロセシング欠損による）、ファブリー病、シュトロイスラー・シャインカー症候群、ＣＯＰＤ、眼乾燥疾患、シェーグレン病、骨粗鬆症、骨減少症、ゴーラム症候群、塩素チャネル病、先天性筋強直症（トムソン型およびベッカー型）、バーター症候群ＩＩＩ型、デント病、驚愕過剰症、てんかん、驚愕過剰症、リソソーム蓄積症、アンジェルマン症候群、原発性線毛ジスキネジア（ＰＣＤ）、線毛の構造および／または機能の遺伝性障害、内蔵逆位を伴うＰＣＤ（カルタゲナー症候群としても公知）、内蔵逆位を伴わないＰＣＤ又は線毛体無形成から選択される。他の実施態様としては、ＣＦＴＲ介在性疾患は、嚢胞性線維症である。他の実施態様としては、対象は、ΔＦ５０８変異を有する嚢胞性線維症膜貫通型受容体（ＣＦＴＲ）を有する。他の実施態様としては、対象は、Ｒ１１７Ｈ変異を有する嚢胞性線維症膜貫通型受容体（ＣＦＴＲ）を有する。他の実施態様としては、対象は、Ｇ５５１Ｄ変異を有する嚢胞性線維症膜貫通型受容体（ＣＦＴＲ）を有する。

他の実施態様としては、方法は、追加の治療剤を投与することを含む。他の実施態様としては、治療剤は、粘液溶解剤、気管支拡張剤、抗生物質、抗感染症剤、抗炎症剤、ＣＦＴＲ賦活剤又は栄養剤から選択される。

他の態様としては、本発明は、フォームＡ、アモルファスの（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド、又はアモルファスの（Ｒ）−１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−２−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミドを含む固体分散体及びそれらの使用説明書を含むキットを特徴とする。

化合物１のフォームＡ及びアモルファス形態の調製方法

化合物１は出発点であり、ある実施態様としては、スキーム１−４に従い酸塩化物をアミン部分とカップリングさせることにより調製できる。

スキーム１ 酸塩化物部分の合成

スキーム２ 酸塩化物部分の合成の別法

スキーム３ アミン部分の合成

スキーム４ 化合物１の形成

化合物１のフォームＡの形成の方法

ある実施態様としては、フォームＡを、化合物１を適切な溶媒において、有効な時間スラリー化することにより調製する。他の実施態様としては、適切な溶媒は、酢酸エチル、ジクロロメタン、ＭＴＢＥ、酢酸イソプロピル、種々の割合の水／エタノール溶液、種々の割合の水／アセトニトリル溶液、種々の割合の水／メタノール溶液、又は種々の割合の水／イソプロピルアルコール溶液である。例えば、種々の割合の水／エタノール溶液には、水／エタノール １：９（体積／体積）、水／エタノール １：１（体積／体積）及び水／エタノール ９：１（体積／体積）を含む。種々の割合の水／アセトニトリル溶液には、水／アセトニトリル １：９（体積／体積）、水／アセトニトリル １：１（体積／体積）及び水／アセトニトリル ９：１（体積／体積）を含む。種々の割合の水／メタノール溶液には、水／メタノール １：９（体積／体積）、水／メタノール １：１（体積／体積）及び水／メタノール ９：１（体積／体積）を含む。種々の割合の水／イソプロピルアルコール溶液は、水／イソプロピルアルコール １：９（体積／体積）、水／イソプロピルアルコール １：１（体積／体積）および水／イソプロピルアルコール ９：１（体積／体積）を含む。

一般に、化合物１約４０ｍｇを、適切な溶媒約１.５ｍＬ（目標濃度２６.７ｍｇ／ｍｌ）中、室温で有効な時間スラリー化する。ある実施態様においては、有効な時間は、約２４時間ないし２週間である。ある実施態様においては、有効な時間は、約２４時間ないし約１週間である。ある実施態様においては、有効な時間は、約２４時間ないし約７２時間である。続いて固体を集める。

他の実施態様としては、フォームＡを、化合物１を適切な溶媒に溶解させ、続いて溶媒を蒸発させることにより調製する。ある実施態様としては、適切な溶媒は化合物１の溶解性が２０ｍｇ／ｍｌよりも大きいものである。例えば、溶媒は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン等を含む。

一般に、化合物１を適切な溶媒に溶解させ、濾過し、続いて低速蒸発又は高速蒸発させる。低速蒸発の例は、１個の穿刺孔を有するパラフィルムで、化合物１溶液を含むコンテナ、例えばバイアルをカバーすることである。高速蒸発の例は、化合物１溶液を含むコンテナ、例えばバイアルを覆わないで放置することである。続いて固体を集める。

他の態様としては、本発明は、化合物１を第１溶媒に溶解させ、化合物１が難溶性である第２溶媒（溶解性＜１ｍｇ／ｍｌ）を加えることを含むフォームＡの調製方法を特徴とする。例えば、第１溶媒は、化合物１が２０ｍｇ／ｍｌより大きい溶解性を有し、例えば、酢酸エチル、エタノール、イソプロピルアルコール又はアセトンがある。第２溶媒は、例えばヘプタン又は水である。

一般に、化合物１を第１溶媒に溶解させ、いかなる種結晶をも濾過して除去する。第２溶媒を、攪拌しながらゆっくり加える。固体を沈殿させ、濾過により集める。

アモルファス化合物１の調製方法

化合物１又は化合物１のフォームＡから出発し、化合物１のアモルファス形態をロータリーエバポレーション又はスプレードライ法により調製する。

化合物１をメタノールのような適切な溶媒に溶解させ、ロータリーエバポレーションによりメタノールを除去し、泡状生成物を残すことにより化合物１のアモルファス形態を製造する。ある態様においては、蒸発を促進するために温水浴を用いる。

化合物１のアモルファス形態はまたスプレードライ法を用いて化合物１のフォームＡから調製されうる。スプレードライは、液体試料を乾燥粒子形態に変換する方法である。場合により、例えば流動床乾燥又は真空乾燥のような第二の乾燥方法を用いて、残留溶媒を薬学的に許容されるレベルに減少させてもよい。典型的には、スプレードライは、高度に分散した液体懸濁液又は溶液と液滴の蒸発及び乾燥に十分な用量の熱気を接触させることを含む。スプレードライされる調製物は、選択されたスプレードライ装置を用いて微粒子化されうるあらゆる溶液、粗懸濁液、スラリー、コロイド分散液又はペーストであってもよい。標準的な方法においては、調製物は、溶媒を蒸発させ、乾燥した生成物を収集器（例えば、サイクロン）に運ぶ、フィルタを通した温気流にスプレーされる。続いて、用いた空気を溶媒と共に排出させるか、又は用いた空気をコンデンサに送り、溶媒を捕捉し、可能であれば再利用する。スプレードライを行うために市販の型の装置を用いてもよい。例えば、市販のスプレードライヤーはブチ社（Buchi Ltd）及びニロ社（Niro）（例えば、ニロ社により製造されたスプレードライヤーのPSDライン）により製造される（米国特許出願２００４／０１０５８２０号；米国特許出願２００３／０１４４２５７号参照）。

スプレードライは典型的には、約３％ないし約３０重量％、例えば、約４％ないし約２０重量％、好ましくは約１０％の固体物質負荷（すなわち、薬物及び賦形剤）を用いる。一般には、固体負荷の上限は、生成する溶液の粘度（例えば、ポンプで押し出すことのできる能力）及び溶液中の成分の溶解性に支配される。一般には、溶液の粘度は、生成する粉末生成物の粒子の大きさを決定しうる。

スプレードライの技術及び方法は、Ｐｅｒｒｙ’ｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、６ｔｈ Ｅｄ.、Ｒ. Ｈ. Ｐｅｒｒｙ、Ｄ. Ｗ. Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｊ. Ｏ. Ｍａｌｏｎｅｙ、ｅｄｓ.）、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ ｂｏｏｋ ｃｏ.（１９８４）；及びＭａｒｓｈａｌｌ「Ａｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｐｒａｙ−Ｄｒｙｉｎｇ」 ５０、Ｃｈｅｍ. Ｅｎｇ. Ｐｒｏｇ. Ｍｏｎｏｇｒ. Ｓｅｒｉｅｓ ２（１９５４）に記載されている。一般に、スプレードライは、入力口の温度が約６０℃ないし約２００℃、例えば約９５℃ないし約１８５℃、約１１０℃ないし約１８２℃、約９６℃ないし約１８０℃、例えば、約１４５℃である。スプレードライは一般に、出力口の温度が約３０℃ないし約９０℃、例えば約４０℃ないし約８０℃、約４５℃ないし約８０℃、例えば、約７５℃で実施される。微粒子化流速は、一般に約４ｋｇ／時ないし約１２ｋｇ／時、例えば約４.３ｋｇ／時ないし約１０.５ｋｇ／時、例えば、約６ｋｇ／時又は約１０.５ｋｇ／時である。流加速度は、一般に約３ｋｇ／時ないし約１０ｋｇ／時、例えば、約３.５ｋｇ／時ないし約９.０ｋｇ／時、例えば、約８ｋｇ／時又は約７.１ｋｇ／時である。微粒子化比率は、一般に約０.３ないし１.７、例えば約０.５ないし１.５、例えば、約０.８又は約１.５である。

溶媒の除去は、続く乾燥工程、例えば、トレードライ、流動床乾燥（例えば室温付近ないし約１００℃）、真空乾燥、電磁波乾燥、ロータリードラム乾燥又はバイコニカル真空乾燥（例えば室温付近ないし約２００℃）を要しうる。

ある実施態様としては、固体分散体を流動床乾燥させる。

ある方法としては、溶媒は揮発性溶媒、例えば約１００℃未満の沸点を有する溶媒である。ある態様においては、溶媒は溶媒の混合物を含み、例えば揮発性溶媒又は揮発物及び不揮発性溶媒の混合物を含む。溶媒の混合物が用いられる場合には、例えば約１５％未満の、例えば約１２％未満の、約１０％未満の、約８％未満の、約５％未満の、約３％未満の又は約２％未満の不揮発性溶媒が存在するならば、混合物は１種以上の不揮発性溶媒を含むことができる。

好ましい溶媒は、化合物１が少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、（例えば、少なくとも約１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ又はそれより高い）の溶解性を有する溶媒である。より好ましくは、溶媒は、化合物１が少なくとも約２０ｍｇ／ｍｌの溶解性を有するものを含む。

試験しうる溶媒の例としては、アセトン、シクロヘキサン、ジクロロメタン、N，N−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、N，N−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、酢酸エチル、エチルエーテル、氷酢酸（ＨＡｃ）、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、N−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ペンタン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、酢酸イソプロピル及びトルエンを含む。共溶媒の例としては、アセトン／ＤＭＳＯ、アセトン／ＤＭＦ、アセトン／水、ＭＥＫ／水、ＴＨＦ／水、ジオキサン／水を含む。２溶媒系においては、溶媒は約０.１％ないし約９９.９％で存在しうる。好ましい態様としては、水を共溶媒としてアセトンと併用し、ここで水は約０.１％ないし約１５％、例えば約９％ないし約１１％、例えば、約１０％で存在する。好ましい態様としては、水を共溶媒としてＭＥＫと併用し、ここで水は約０.１％ないし約１５％、例えば約９％ないし約１１％、例えば、約１０％で存在する。ある態様としては、溶媒溶液は３種の溶媒を含む。例えば、アセトン及び水を第３の溶媒、例えばＤＭＡ、ＤＭＦ、ＤＭＩ、ＤＭＳＯ又はＨＡｃと混合できる。アモルファス化合物１が固体アモルファス分散体の成分である場合、好ましい溶媒は、化合物１とポリマーの両方を溶解する。適切な溶媒は上述したものを含み、例えば、ＭＥＫ、アセトン、水、メタノール、及びそれらの混合物がある。

粒子径及び乾燥温度範囲は、最適な固体分散体を調製するために変更されうる。当業者には理解されているであろうが、小粒子径では、溶媒の除去を改善しうる。しかし、出願人は、より小さな粒子は綿毛状粒子となり得て、それはある条件下では、下流のプロセシング、例えば錠剤化において最適な固体分散体を提供しないことを見出した。より高温では、化合物１の結晶化又は化学分解が起こりうる。より低温では、十分な量の溶媒を除去できない。本明細書の方法は、最適な粒子径及び最適な乾燥温度を提供する。

一般に、粒子径は、例えばD１０（μｍ）が約５未満、例えば、約４.５未満、約４.０未満又は約３.５未満、D５０（μｍ）は一般に約１７未満、例えば約１６未満、約１５未満、約１４未満、約１３未満であり、そしてD９０（μｍ）が一般に約１７５未満、例えば約１７０未満、約１７０未満、約１５０未満、約１２５未満、約１００未満、約９０未満、約８０未満、約７０未満、約６０未満、又は約５０未満である。一般に、スプレードライした粒子のかさ密度は約０.０８ｇ／ｃｃないし約０.２０ｇ／ｃｃ、例えば約０.１０ないし約０.１５ｇ／ｃｃ、例えば、約０.１１ｇ／ｃｃ又は約０.１４ｇ／ｃｃである。スプレードライした粒子のタップ密度は、一般に１０タップで、約０.０８ｇ／ｃｃないし約０.２０ｇ／ｃｃ、例えば約０.１０ないし約０.１５ｇ／ｃｃ、例えば約０.１１ｇ／ｃｃ又は約０.１４ｇ／ｃｃの範囲である；５００タップにつき、０.１０ｇ／ｃｃないし約０.２５ｇ／ｃｃ、例えば約０.１１ないし約０.２１ｇ／ｃｃ、例えば、約０.１５ｇ／ｃｃ、約０.１９ｇ／ｃｃ又は約０.２１ｇ／ｃｃである；１２５０タップにつき、０.１５ｇ／ｃｃないし約０.２７ｇ／ｃｃ、例えば約０.１８ないし約０.２４ｇ／ｃｃ、例えば、約０.１８ｇ／ｃｃ、約０.１９ｇ／ｃｃ、約０.２０ｇ／ｃｃ又は約０.２４ｇ／ｃｃである；及び２５００タップで、０.１５ｇ／ｃｃないし約０.２７ｇ／ｃｃ、例えば約０.１８ないし約０.２４ｇ／ｃｃ、例えば、約０.１８ｇ／ｃｃ、約０.２１ｇ／ｃｃ、約０.２３ｇ／ｃｃ又は約０.２４ｇ／ｃｃである。

ポリマー

アモルファス化合物１及びポリマー（又は固体状態担体）を含む固体分散体もまたここに含まれる。例えば、化合物１は固体アモルファス分散体の成分としてのアモルファス化合物として存在する。固体アモルファス分散体は、一般に化合物１及びポリマーを含む。ポリマーの例は、セルロースポリマー、例えば、ＨＰＭＣ又はＨＰＭＣＡＳ及びＰＶＰ／ＶＡのようなポリマーを含有するピロリドンを含む。ある態様においては、固体アモルファス分散体は、１種以上の追加の賦形剤、例えば界面活性剤を含む。

ある実施態様としては、ポリマーは、水性の媒体に溶解させることができる。ポリマーの溶解性は、ｐＨ−非依存性又はｐＨ−依存性でありうる。後者は、１種以上の腸溶性ポリマーを含みうる。用語「腸溶性ポリマー」は、胃の酸性環境下と比較して、酸性度の低い腸の環境において優先的に溶解するポリマー、例えば、酸性水性媒体には不溶だがｐＨ５−６より高い場合に溶解するポリマーを言う。適切なポリマーは化学的及び生物学的に不活性でなければならない。固体分散体の物理的安定性を改善するため、ポリマーのガラス遷移温度（Ｔｇ）はできるだけ高いべきである。例えば、好ましいポリマーは、薬物（すなわち、化合物１）と少なくとも等しいか又は高いガラス遷移温度を有する。他の好ましいポリマーは、薬物（すなわち、化合物１）の約１０ないし約１５℃の範囲内のガラス遷移温度を有する。ポリマーの適切なガラス遷移温度の例は、少なくとも約９０℃、少なくとも約９５℃、少なくとも約１００℃、少なくとも約１０５℃、少なくとも約１１０℃、少なくとも約１１５℃、少なくとも約１２０℃、少なくとも約１２５℃、少なくとも約１３０℃、少なくとも約１３５℃、少なくとも約１４０℃、少なくとも約１４５℃、少なくとも約１５０℃、少なくとも約１５５℃、少なくとも約１６０℃、少なくとも約１６５℃、少なくとも約１７０℃又は少なくとも約１７５℃（乾燥条件下で測定）を含む。理論に束縛されるわけではないが、根底のメカニズムは、Ｔ_ｇの高いポリマーは一般に、アモルファス固体分散体の物理的安定性に重要な因子である室温での分子運動性が低いと考えられる。

加えて、ポリマーの吸湿性はできるだけ低い、例えば約１０％未満でなければならない。この出願における比較のため、ポリマー又は組成物の吸湿性は相対湿度約６０％において特徴付けられる。好ましい態様としては、ポリマーは約１０％未満の吸水性であり、例えば約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満又は約２％未満の吸水性である。吸湿性は、また固体分散体の物理的安定性にも影響しうる。一般に、ポリマーに吸収される湿気は、ポリマー並びに生成した固体分散体のＴｇを大きく低下させ得て、それはさらに上述のとおり固体分散体の物理的安定性を減少させる。

ある実施態様としては、ポリマーは１種以上の水溶性ポリマー又は部分的に水溶性であるポリマーである。水溶性又は部分的に水溶性であるポリマーは、セルロース誘導体（例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ））又はエチルセルロース；ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）；アクリル酸、例えば、ポリメタクリレート（例えばオイドラジット（登録商標）E）；シクロデキストリン（例えばβ−シクロデキストリン）及びそれらの共重合体及び誘導体を含み、例えば、ＰＶＰ−ＶＡ（ポリビニルピロリドン−ビニルアセテート）を含むが、これらに限定されない。

ある実施態様においては、ポリマーはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、例えば、ＨＰＭＣ Ｅ５０、ＨＰＭＣE１５又はＨＰＭＣ６０ＳＨ５０）である。

ここに記載するとおり、ポリマーは、ｐＨ−依存性腸溶性ポリマーでありうる。そのようなｐＨ−依存性腸溶性ポリマーは、セルロース誘導体（例えばセルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ））、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣP）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）又はそれらの塩（例えばナトリウム塩（ＣＭＣ−Ｎａ））；セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルセルロースアセテートフタレート（ＨＰＣＡＰ）、ヒドロキシプロピルメチル−セルロースアセテートフタレート（ＨＰＭＣＡＰ）及びメチルセルロースアセテートフタレート（ＭＣＡＰ）、又はポリメタクリレート（例えばオイドラジット（登録商標）S）を含むが、これらに限定されない。ある実施態様においては、ポリマーは、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）。ある実施態様においては、ポリマーは、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネートHGグレード（ＨＰＭＣＡＳ−HG）である。

更に他の実施態様としては、ポリマーはポリビニルピロリドン共重合体、例えば、ビニルピロリドン／ビニルアセテート共重合体（PVP／VA）である。

化合物１が例えば、ＨＰＭＣ、ＨＰＭＣＡＳ又はPVP／VAポリマーのようなポリマーと固体分散体を形成する場合の実施態様においては、例えば、固体分散体の総重量に対するポリマーの相対的な量は約０.１〜９９重量％の範囲である。他に特定しない限り、本明細書中に記載した分散体における薬物、ポリマー及び他の賦形剤のパーセンテージは、重量パーセントである。ポリマーの量は、典型的には、少なくとも約２０％であり、好ましくは少なくとも約３０％、例えば少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％又は約５０％（例えば４９.５％）である。量は、典型的には約９９％以下であり、好ましくは約８０％以下、例えば、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下又は約５５％以下である。ある態様としては、ポリマーは分散体の総重量の約５０％までの量である（及び更に具体的には、約４０％と５０％の間、例えば約４９％、約４９.５％又は約５０％）。ＨＰＭＣ及びＨＰＭＣＡＳは、信越化学から種々のグレードで入手でき、例えば、ＨＰＭＣＡＳは、AS−LF、AS−MF、AS−HF、AS−LG、AS−MG、AS−HGを含み、多種を入手できる。これらの各グレードはアセテート及びスクシネートの置換パーセントにより変化する。

ある実施態様においては、化合物１とポリマーはほぼ等量で存在し、例えば、ポリマー及び薬物は、それぞれ分散体の約半分の重量パーセントを構成する。例えば、ポリマーは、約４９.５％で存在し、薬物は約５０％で存在する。

ある実施態様においては、化合物１及びポリマーは合わせて、スプレードライ前の非固体分散体において、総固体成分の１％ないし２０％ｗ／ｗ存在する。ある実施態様においては、化合物１及びポリマーは合わせて、スプレードライ前の非固体分散体において、総固体成分の５％ないし１５％ｗ／ｗ存在する。ある実施態様においては、化合物１及びポリマーは合わせて、スプレードライ前の非固体分散体において、総固体成分の約１１％ｗ／ｗ存在する。

ある実施態様においては、分散体は更に、他の少量の成分、例えば界面活性剤（例えばＳＬＳ）を含む。ある実施態様においては、界面活性剤は、分散体の約１０％未満、例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％又は約０.５％で存在する。

ポリマーを含む実施態様において、ポリマーは固体分散体の安定化に有効な量存在しなければならない。安定化は、化合物１の結晶化の阻害又は防止を含む。そのような安定化は、化合物１のアモルファスから結晶形態への変換を阻害する。例えば、ポリマーは、化合物１がアモルファスから結晶形態へ変換することを少なくとも一部（例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％又はそれより多く）防ぐ。安定化は、例えば、固体分散体ガラス遷移温度の測定、アモルファス物質の緩和速度の測定、又は化合物１の溶解性又はバイオアベイラビリティの測定により測定できる。

例えば、固体分散体、例えば、アモルファス固体分散体を形成するために化合物１と組み合わせて用いられる適切なポリマーは、以下の性質の１つ以上を有するべきである：

ポリマーのガラス遷移温度は、化合物１のガラス遷移温度より約１０−１５℃以上低くない。好ましくは、ポリマーのガラス遷移温度は化合物１のガラス遷移温度より高く、一般に所望の医薬品の貯蔵温度よりも少なくとも５０℃高い。例えば、少なくとも約１００℃、少なくとも約１０５℃、少なくとも約１０５℃、少なくとも約１１０℃、少なくとも約１２０℃、少なくとも約１３０℃、少なくとも約１４０℃、少なくとも約１５０℃、少なくとも約１６０℃、少なくとも約１６０℃、又はそれより高い。

ポリマーは比較的非吸湿性でなければならない。例えば、ポリマーは、標準的な条件下で貯蔵した場合に、約１０％未満の水、例えば約９％未満の、約８％未満の、約７％未満の、約６％未満の、又は約５％未満の、約４％未満の、又は約３％未満の水しか吸収してはならない。好ましくは、標準的な条件下で貯蔵したとき、実質的に吸収水を含まない。

ポリマーは、スプレードライ工程に適切な溶媒に、化合物１と比較して、同様の又はより良好な溶解性を有しなければならない。好ましい態様としては、ポリマーは、化合物１と同じ１種以上の溶媒又は溶媒系に溶解する。ポリマーは、少なくとも１種の非ヒドロキシ含有溶媒、例えば塩化メチレン、アセトン、又はそれらの混合物に溶解することが好ましい。

ポリマーは、例えば、固体分散体又は液体懸濁液で化合物１と組み合わせたとき、ポリマー非存在下の化合物１又は参照ポリマーと組合わせたときの化合物１と比較して、水性及び生理学的に関連する媒体において、化合物１の溶解性を増加させなければならない。例えば、ポリマーは、固体アモルファス分散体又は懸濁液から結晶化合物１に変換するアモルファス化合物１の量を減らすことにより、アモルファス化合物１の溶解性を増加させうる。

ポリマーは、アモルファス物質の緩和速度を減少させなければならない。

ポリマーは、化合物１の物理的及び／又は化学的安定性を増加させなければならない。

ポリマーは、化合物１の製造性を改善しなければならない。

ポリマーは、化合物１の取り扱い、投与又は貯蔵性の１つ以上を改善しなければならない。

ポリマーは、例えば、賦形剤である他の薬学的成分と好ましくない相互作用をしてはならない。

候補ポリマー（又は他の成分）の適切さは、本明細書に記載したスプレードライ法（又は他の方法）を用いてアモルファス組成物を形成することにより試験できる。候補組成物は、安定性、結晶形成に対する耐性、又は他の性質の点で比較し、及び例えば、そのままの（neat）アモルファス化合物１又は結晶性の化合物１の参照化合物の調製物に対して比較できる。例えば、候補組成物は、溶媒媒介性結晶化の開始時間を遅らせるか、又は制御された条件下で一定時間内の変換率が、参照物質と比較して少なくとも５０％、７５％、１００％又は１１０％良いかどうかを決定するために試験でき、又は候補組成物が結晶化合物１と比較して改善されたバイオアベイラビリティ又は溶解性を有するかどうかを決定するために試験できる。

界面活性剤

固体分散体または他の組成物は、界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤又は界面活性剤混合物は、固体分散体と水性媒体の間の界面張力を一般に低下させる。適切な界面活性剤又は界面活性剤混合物は、また、固体分散体の化合物１の溶解性及びバイオアベイラビリティを促進しうる。本発明に関連して使用するための界面活性剤は、脂肪酸エステル（例えばスパン（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えばツイン（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム（Ｄｏｃｕｓａｔｅ）、ジオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＳＳ）、モノステアリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＴＡＢ）、N−ラウロイルサルコシンナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ミニステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ゲルシール４４／１４、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ビタミン Ｅ ｄ−アルファトコフェリルポリエチレングリコール１０００サクシネート（ＴＰＧＳ）、レシチン、ＭＷ ６７７−６９２、グルタミン酸一ナトリウム一水和物、ラブラゾール、ＰＥＧ ８（カプリル／カプリン酸）グリセリル、トランスクトール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ソルトールＨＳ−１５、ポリエチレングリコール／ヒドロキシステアレート、タウロコール酸、プルロニックＦ６８、プルロニックＦ１０８、及びプルロニックＦ１２７（又は他のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（プルロニック（登録商標））又は飽和ポリグリコール化グリセリド（ゲルシール（登録商標）））を含むが、これらに限定されない。本発明と関連して用いられるそのような界面活性剤の具体例としては、スパン６５、スパン２５、ツイン２０、カプロイル９０、プルロニックＦ１０８、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ビタミン Ｅ ＴＰＧＳ、プルロニック類及び共重合体を含むが、これらに限定されない。ＳＬＳが一般に好ましい。

固体分散体の総重量に対する界面活性剤（例えばＳＬＳ）の量は、０.１−１５％でありうる。好ましくは約０.５％ないし約１０％であり、より好ましくは約０.５ないし約５％であり、例えば約０.５ないし４％、約０.５ないし３％、約０.５ないし２％、約０.５ないし１％又は約０.５％である。

特定の実施態様としては、固体分散体の総重量に対する界面活性剤の量は、少なくとも約０.１％であり、好ましくは約０.５％である。これらの実施態様において、界面活性剤は約１５％以下で存在し、好ましくは約１２％、約１１％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％又は約１％以下である。界面活性剤が約０.５重量％の量で存在する場合が好ましい。

候補界面活性剤（又は他の成分）は、発明で使用する適切さについてポリマーの試験において述べたのと類似の方法で試験できる。

用途、製剤及び投与

薬学的に許容される組成物

本発明の他の態様としては、本明細書中に記載の化合物１のフォームＡ又はアモルファス化合物１を含み、場合により医薬的に許容される担体、補助剤又は媒体を含む薬学的に許容される組成物を提供する。特定の態様としては、これらの組成物は、場合により１つ以上の追加の治療剤を含む。

上述したとおり、本発明の薬学的に許容される組成物は、追加的に医薬的に許容される担体、補助剤又は媒体を含み、これは、ここで使用される場合、所望の特定の投与形態に適した、溶媒、希釈剤、又は他の液体担体、分散体又は懸濁液剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤又は乳化剤、保存剤、固形結合剤、滑沢剤等のいずれかおよび全てを含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｅ. Ｗ. Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ.、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ.、１９８０）は、薬学的に許容される組成物の製剤化に用いる種々の担体及びそれらの製剤の公知の技術を開示する。従来の担体媒体が本発明の化合物と不適合である、例えば、望ましくない生物学的効果を生じるか、あるいは他の薬学的に許容される組成物のいずれかの成分と有害な方法で相互作用する場合を除いて、その使用は本発明の範囲に含まれる。医薬的に許容される担体として作用できる物質のいくつかの例としては、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、又はソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素ジナトリウム、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ろう、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、羊毛脂、糖、例えば乳糖、グルコース及びショ糖；デンプン、例えばトウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン；セルロース及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばココアバター及び坐剤ろう；油脂、例えば落花生油、綿実油；サフラワー油；ゴマ油；オリーブ油；コーン油及び大豆油；グリコール；例えば、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリル酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱性物質除去蒸留水；等張生理食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール及びリン酸緩衝溶液、並びに他の非毒性で混合可能な滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムを含むがこれらに限定されず、同様に着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤及び芳香剤、保存剤及び抗酸化剤もまた製剤者の判断により組成物中に存在していてもよい。

化合物及び薬学的に許容される組成物の用途

また別の態様として、本発明は、ＣＦＴＲに関わる病態、疾患、又は障害の処置方法を提供する。特定の態様としては、本発明は、ＣＦＴＲ活性の不全が関わる病態、疾患、又は障害の処置方法であって、本明細書中に記載の化合物１のフォームＡ又はアモルファス化合物１の固相形態を、それを必要とする対象、好ましくは哺乳類に投与することを含む方法を提供する。

ここで使用される場合「ＣＦＴＲ介在性疾患」は、嚢胞性線維症、喘息、喫煙誘発性ＣＯＰＤ、慢性気管支炎、鼻副鼻腔炎、便秘、膵炎、膵機能不全、先天性両側精管欠損症（ＣＢＡＶＤ）に起因する男性不妊、軽度肺疾患、突発性膵炎、アレルギー性気管支肺アルペルギルス症（ＡＢＰＡ）、肝疾患、遺伝性肺気腫、遺伝性血色素症、血液凝固−線維素溶解欠乏症、プロテインC欠乏症、１型遺伝性血管浮腫、脂質プロセシング欠損症、家族性高コレステロール血症、１型乳糜血症、無βリポタンパク血症、リソソーム性蓄積症、Ｉ細胞病／偽ハーラー症、ムコ多糖症、サンドホフ病／テイ−サックス病、クリグラー・ナジャー症候群II型、多腺性内分泌障害／高インスリン血症、糖尿病、ラロン小人症、ミエロオキシダーゼ欠損症、原発性副甲状腺機能亢進症、メラノーマ、グリカノーシスＣＤＧ１型、先天性甲状腺機能亢進症、骨形成不全症、遺伝性低フィブリノーゲン血症、ＡＣＴ欠損症、糖尿病性尿崩症（ＤＩ）、骨端軟骨性ＤＩ、腎性ＤＩ、シャルコー・マリー・トゥース症候群、ペリツェーウス・メルバッハー病（Perlizaeus-Merzbacher disease）、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻痺（progressive supranuclear plasy）、ピック病、数種のポリグルタミン神経障害、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調症Ｉ型（spinocerebullar ataxia type Ｉ）、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（dentatorubal pallidoluysian）、筋緊張性ジストロフィ、海綿状脳症、遺伝性クロイツフェルト・ヤコブ病（プリオンタンパク質プロセシング欠損による）、ファブリー病、シュトロイスラー・シャインカー症候群、ＣＯＰＤ、眼乾燥疾患、シェーグレン病、骨粗鬆症、骨減少症、ゴーラム症候群、塩素チャネル病、先天性筋強直症（トムソン型およびベッカー型）、バーター症候群III型、デント病、驚愕過剰症、てんかん、驚愕過剰症、リソソーム蓄積症、アンジェルマン症候群、原発性線毛ジスキネジア（ＰＣＤ）、線毛の構造および／または機能の遺伝性障害、内蔵逆位を伴うＰＣＤ（カルタゲナー症候群としても公知）、内蔵逆位を伴わないＰＣＤ又は線毛体無形成から選択される。

特定の実施態様としては、本発明は、本明細書に記載の化合物１のフォームＡ又はアモルファス化合物１の有効量をヒトに投与する過程を含む、該ヒトにおけるＣＦＴＲ介在性疾患の処置方法を提供する。

異なる好ましい態様としては、本発明は、本明細書に記載の化合物１のフォームＡ又はアモルファス化合物１をヒトに投与する過程を含む、該ヒトにおける嚢胞性線維症を処置する方法を提供する

本発明において、化合物１のフォームＡ又はアモルファス化合物１又はそれらの薬学的に許容される組成物の「有効量」は、上記疾患のいずれかを処置するか又は重症度を軽減するのに有効な量を意味する。

化合物１のフォームＡ又はアモルファス化合物１又はそれらの薬学的に許容される組成物は、上記疾患の１つ以上を処置するか又は重症度を軽減するのに有効な任意の量及び任意の経路を用いて投与してよい。

特定の実施態様としては、本明細書に記載の化合物１のフォームＡ又はアモルファス化合物１又はそれらの薬学的に許容される組成物は、呼吸器及び非呼吸器の上皮頂端膜において残存ＣＦＴＲ活性を示す嚢胞性線維症の患者において、疾患を処置するか又は重症度を軽減するのに有効である。上皮表面の残存ＣＦＴＲ活性の存在は、当該分野において知られた方法、例えば標準的な電気生理学的、生化学的又は組織化学的技術を使用して、容易に検出できる。そのような方法は、インビボ又はエクスビボにおける電気生理学的技術、汗又は唾液中におけるＣｌ⁻濃度の測定、又はエクスビボにおける細胞表面密度をモニターするための生化学的又は組織化学的技術を用いて、ＣＦＴＲ活性を同定する。そのような方法を用いることにより、最も一般的な変異であるΔＦ５０８、並びに、他の変異、例えばＧ５５１Ｄ変異又はＲ１１７Ｈ変異についてホモ接合又はヘテロ接合である患者を含む、種々の異なる変異についてヘテロ接合又はホモ接合である患者において、残存ＣＦＴＲ活性が容易に検出される。

ある実施態様としては、本明細書中に記載の化合物１のフォームＡ又はアモルファス化合物１又はそれらの薬学的に許容される組成物は、残存ＣＦＴＲ活性を示す特定の遺伝子型、例えばクラスＩＩＩ変異（制御又はゲーティング障害）、クラスＩＶ変異（伝導率変更）、又はクラスＶ変異（合成減少）（Ｌｅｅ Ｒ. Ｃｈｏｏ−Ｋａｎｇ、Ｐａｍｅｌａ Ｌ.、Ｚｅｉｔｌｉｎ、Ｔｙｐｅ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ａｎｄ Ｖ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｔａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ Ｄｅｆｅｃｔｓ ａｎｄ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｙ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：５２１−５２９、２０００）を示す嚢胞性線維症を処置又は重症度を軽減するのに役立つ。残存ＣＦＴＲ活性を示す他の遺伝子型の患者には、これらのクラスの１種に対してホモ接合性であるか、またはクラスＩ変異、クラスＩＩ変異もしくはそうした分類のない変異を含む任意の他の部類の変異とヘテロ接合性である患者が含まれる。

ある実施態様としては、本明細書に記載の化合物１のフォームＡ又はアモルファス化合物１又はそれらの薬学的に許容される組成物は、特定の臨床表現型、例えば典型的に上皮頂端膜における残存ＣＦＴＲ活性の量と相関する軽度から中度の臨床表現型の嚢胞性線維症患者の処置又は重症度の軽減に有効である。そのような表現型は、膵機能不全を示す患者又は突発性膵炎及び先天性両側精管欠損症、又は軽度肺疾患と診断された患者を含む。

必要となる正確な量は、患者の種、年齢、及び全身状態、感染の重症度、特定の薬剤、投与方法等に依存し、患者ごとに異なる。本発明の化合物は、投与の簡易化及び用量の統一性のため、投与単位形態に製剤化されることが好ましい。表現「投与単位形態」はここで使用される場合、処置される患者に適切な、物理的に区別されたユニットをいう。しかし、本発明の化合物及び組成物の一日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で、担当医によって判断されることは理解されるであろう。特定の任意の患者又は生物における、具体的な有効量レベルは、治療される疾患及び疾患の重症度；用いる特定の化合物の活性；用いる特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康度、性別及び食習慣；投与時間、投与経路、及び用いる特定の化合物の排泄速度；処置期間；特定の化合物と組み合わせて又は同時に用いる薬物及び医学分野においてよく知られている同様の因子を含む様々な因子に依存する。本明細書において使用される場合、用語「患者」又は「対象」は、動物、好ましくは哺乳類、及び最も好ましくはヒトである。

本発明の薬学的に許容される組成物は、ヒト及び他の動物に、処置する感染症の重症度に依存して、経口的、直腸的、非経腸的、嚢内、膣内、腹腔内、局所（散剤、軟膏剤、又は滴薬として）、口腔内、経口又は経鼻スプレー等により投与される。特定の態様としては、本発明の化合物を、所望の治療効果を得るために、対象の体重に応じて１日あたり、約０.０１ｍｇ／ｋｇないし約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇないし約２５ｍｇ／ｋｇで、１日１回以上、経口又は非経腸的に投与してよい。

特定の実施態様としては、化合物１のフォームＡ又はアモルファス化合物１の投与単位形態は１００ｍｇないし１，０００ｍｇの用量である。他の実施態様としては、化合物１のフォームＡ又はアモルファス化合物１の投与用量は、２００ｍｇないし９００ｍｇである。他の実施態様としては、化合物１のフォームＡ又はアモルファス化合物１の投与用量は、３００ｍｇないし８００ｍｇである。他の実施態様としては、化合物１のフォームＡ又はアモルファス化合物１の用量は、４００ｍｇないし７００ｍｇである。他の実施態様としては、化合物１のフォームＡ又はアモルファス化合物１の用量は、５００ｍｇないし６００ｍｇである。

注射用製剤、例えば、滅菌した水溶性又は油性注射用懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて当該分野において知られた技術によって調製されうる。滅菌の注射用製剤は、例えば１，３−ブタンジオール溶液のような、非毒性の非経腸的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液又は乳濁液でありうる。用いられうる許容可能な担体及び溶媒は、水、リンガー溶液、Ｕ.Ｓ.Ｐ.及び等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌固定油は、好都合に溶媒又は懸濁媒体として用いられる。この目的で、合成のモノ又はジグリセリドを含む固定油を含むあらゆる無菌の固定油を使用できる。加えて、脂肪酸、例えば、オレイン酸が注射剤の調製に用いられる。

注射用製剤は、例えば、バクテリア−保持フィルタで濾過することにより、又は使用前に滅菌水又は他の注射可能な媒体に溶解又は分散させることができる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことにより、滅菌される。

直腸又は膣内投与用組成物は、好ましくは、本発明の化合物と、周囲温度では固体であるが体温では液体であり、それゆえ直腸又は膣腔内では溶解し、活性化合物を放出する、適切な非刺激性の賦形剤又は担体、例えばココアバター、ポリエチレングリコール又は坐剤蝋を混合することにより調製できる坐剤である。

固体投与形態は、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、及び顆粒剤を含む。そのような投与形態においては、活性化合物は、少なくとも１種の不活性な、薬学的に許容される賦形剤又は担体、例えば、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム及び／又はａ）充填剤又は増量剤、例えば、デンプン、乳糖、ショ糖、グルコース、マンニトール、及びケイ酸、ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、ショ糖、及びアカシア、ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム、e）遅延剤、例えば、パラフィン、ｆ）吸収促進剤、例えば４級アンモニウム化合物、ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール、ｈ）吸収剤、例えば、カオリン及びベントナイトクレイ、及びｉ）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合、投与形態は、緩衝剤を含んでもよい。

類似の型の固体組成物はまた、乳糖又は乳糖並びに高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を用いた、軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル剤の充填剤として用いてもよい。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、及び顆粒剤の固体投与形態は、コーティング及びシェル、例えば腸溶性コーティング並びに薬学の製剤分野において知られている他のコーティングと共に調製できる。それらは場合により、不透明剤を含み得、また、腸管の特定の部分においてのみ又はそこで優先的に、必要に応じて遅延様式で活性成分を放出する組成物であり得る。使用され得る包埋組成物の例としては、ポリマー物質および蝋が挙げられる。同様の型の固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用して、軟質充填ゼラチンカプセル剤および硬質充填ゼラチンカプセル剤において充填剤として使用され得る。

活性化合物はまた、上記の１種以上の賦形剤を有するマイクロカプセル化形態でありうる。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤の固体投薬形態は、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶性コーティング、放出制御コーティングおよび製剤分野においてよく知られた他のコーティングとともに調製され得る。このような投与形態において、活性成分をショ糖、乳糖またはデンプンのような少なくとも１種の希釈剤と混合してよい。このような投与形態は、慣行どおり、不活性希釈剤、例えば、錠剤化滑沢剤および他の錠剤化補助剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロース以外のさらなる物質を含み得る。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、その投与形態はまた、緩衝化剤を含み得る。それらは、場合に応じて、不透明剤を含み得、また、腸管の特定の部分においてのみ又はそこで優先的に、場合に応じて、遅延様式で活性成分を放出する組成物であり得る。使用され得る包埋組成物の例としては、ポリマー物質および蝋が挙げられる。

本明細書中に記載の化合物１のフォームＡ又、アモルファス化合物１又はそれらの薬学的に許容される組成物はまた組合せ治療で用いることができ、すなわち、化合物１のフォームＡ又はアモルファス化合物１を１種以上の他の所望の治療剤または医療的手順と同時に、その前に、またはその後に投与できることも理解されるであろう。組み合わせレジメンにおいて使用する治療（治療剤または手順）の特定の組み合わせは、所望の治療剤および／または手順の適合性ならびに達成すべき所望の治療効果を考慮する。使用される治療が、同じ障害に対する所望の効果を達成し得る（例えば、本発明の化合物を同じ障害を処置するために使用される別の薬剤と同時に投与してよい）か、またはそれらが異なる効果を達成し得る（例えば、何らかの有害作用の制御）こともまた理解されるであろう。ここで使用される場合、特定の疾患又は状態を処置又は予防するために通常投与される追加の治療剤は、「処置される治療又は状態に適切である」として知られている。

ある実施態様としては、追加の薬剤は、粘液溶解剤、気管支拡張剤、抗生物質、抗感染症剤、抗炎症剤、本発明の化合物以外のＣＦＴＲ調節剤、及び栄養剤から選択される。

ある実施態様としては、追加の薬剤は、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸である。他の実施態様としては、追加の薬剤は、Ｎ−（５−ヒドロキシ−２，４−ジｔｅｒｔ−ブチル−フェニル）−４−オキソ−１Ｈ−キノリン−３−カルボキサミドである。他の実施態様としては、追加の薬剤は、表１から選択される。
表１


他の実施態様としては、追加の薬剤は、上述の薬剤の任意の組合せである。例えば、組成物は、化合物１、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸及びN−（５−ヒドロキシ−２，４−ジｔｅｒｔ−ブチル−フェニル）−４−オキソ−１Ｈ−キノリン−３−カルボキサミドを含んでよい。他の例としては、組成物は、化合物１、Ｎ−（５−ヒドロキシ−２，４−ジｔｅｒｔ−ブチル−フェニル）−４−オキソ−１Ｈ−キノリン−３−カルボキサミド、表１に記載の化合物のいずれか、すなわち表１の化合物１ないし１４、又はそれらの任意の組合せを含んでよい。

ある実施態様としては、追加の治療剤は抗生物質である。有用な抗生物質としては、トブラマイシン吸入パウダー（ＴＩＰ）を含むトブラマイシン、アジスロマイシン、アズトレオナムのエアロゾル化形態を含むアズトレオナム、そのリポソーム形態を含むアミカシン、その吸入による適切な形態の製剤を含むシプロフロキサシン、そのエアロゾル化形態を含むレボフラキサシン、及び２種の抗生物質、例えば、ホスホマイシンとトブラマイシンの組み合わせを含む。

他の実施態様としては、追加の薬剤は粘液溶解剤である。ここで有効な粘液溶解剤の例には、プルモザイム（登録商標）が含まれる。

他の実施態様としては、追加の薬剤は気管支拡張剤である。気管支拡張剤の例には、アルブテロール、硫酸メタプロテレノール、酢酸ピルブテロール、サルメテロール又は硫酸テトラブリンが含まれる。

他の実施態様としては、追加の薬剤は、肺気道表面液の回復に効果的なものである。そうした薬剤は、細胞の内外での塩の動きを向上させ、肺気道中の粘液をより水和し、したがってより容易に浄化されるようにする。そうした薬剤の例には、高張食塩水、デヌホソル四ナトリウム（［［（３Ｓ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１−イル）−３−ヒドロキシオキソラン−２−イル］メトキシ−ヒドロキシホスホリル］［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２，４−ジオキソピリミジン−１−イル）−３、４−ジヒドロキシオキソラン−２−イル］メトキシ−ヒドロキシホスホリル］オキシ−ヒドロキシホスホリル］リン酸水素）またはブロンキトール（bronchitol）（マンニトールの吸入用製剤）が含まれる。

他の実施態様としては、追加の薬剤は、抗炎症薬、すなわち肺の炎症を軽減できる薬剤である。ここで有用なそうした薬剤の例には、イブプロフェン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、シルデナフィル、吸入用グルタチオン、ピオグリタゾン、ヒドロキシクロロキンまたはシンバスタチンが含まれる。

他の実施態様としては、追加の薬剤は、式Ｉの化合物以外のＣＦＴＲ調節剤、すなわち、ＣＦＴＲ活性調節の効果を有する薬剤である。そうした薬剤の例には、アタルレン（「ＰＴＣ１２４（登録商標）」；３−［５−（２−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル］安息香酸）、シナプルチド、ランコブチド（lancovutide）、デペレスタット（ヒト組換え好中球エラスターゼ阻害剤）、コビプロストン（７−｛（２Ｒ、４ａＲ、５Ｒ、７ａＲ）−２−［（３Ｓ）−１，１−ジフルオロ−３−メチルペンチル］−２−ヒドロキシ−６−オキソオクタヒドロシクロペンタ［ｂ］ピラン−５−イル｝ヘプタン酸）または（３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキシアミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が含まれる。

他の実施態様としては、追加の薬剤は栄養剤である。そうした薬剤の例には、Ｐａｎｃｒｅａｓｅ（登録商標）、Ｐａｎｃｒｅａｃａｒｂ（登録商標）、Ｕｌｔｒａｓｅ（登録商標）もしくはＣｒｅｏｎ（登録商標）、Ｌｉｐｒｏｔｏｍａｓｅ（登録商標）（以前はＴｒｉｚｙｔｅｋ（登録商標））、Ａｑｕａｄｅｋｓ（登録商標）を含むパンクレリパーゼ（パンクレアチン酵素補充療法剤（pancreating enzyme replacement））またはグルタチオン吸入剤が含まれる。ある態様では、追加の栄養剤はパンクレリパーゼである。

他の実施態様としては、追加の薬剤は、ゲンタマイシン、クルクミン、シクロホスファミド、４−酪酸フェニル、ミグルスタット、フェロジピン、ニモジピン、フィロキシンB、ゲニステイン、アピゲニン、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ修飾因子、例えば、ロリプラム、シルデナフィル、ミルリノン、タダラフィル、アムリノン、イソプロテレノール、アルブテロール、及びサルメテロール（almeterol）、デオキシスペルグアリン、ＨＳＰ９０阻害剤、ＨＳＰ７０阻害剤、プロテオソーム阻害剤、例えば、エポキソミシン、ラクタシスチン等から選択される化合物である。

他の実施態様としては、追加の薬剤は、国際公開第２００４０２８４８０号、国際公開第２００４１１０３５２号、国際公開第２００５０９４３７４号、国際公開第２００５１２０４９７号又は国際公開第２００６１０１７４０号に開示される化合物である。

他の実施態様としては、追加の薬剤は、ＣＦＴＲ調節活性を示すベンゾ（ｃ）キノリジニウム誘導体又はＣＦＴＲ調節活性を示すベンゾピラン誘導体である。

他の実施態様としては、追加の薬剤は、米国特許第７２０２２６２号、米国特許第６９９２０９６号、米国特許出願第２００６０１４８８６４号、米国特許出願第２００６０１４８８６３号、米国特許出願第２００６００３５９４３号、米国特許出願第２００５０１６４９７３号、国際公開第２００６１１０４８３号、国際公開第２００６０４４４５６号、国際公開第２００６０４４６８２号、国際公開第２００６０４４５０５号、国際公開第２００６０４４５０３号、国際公開第２００６０４４５０２号又は国際公開第２００４０９１５０２号に開示される化合物である。

他の実施態様としては、追加の薬剤は、国際公開第２００４０８０９７２号、国際公開第２００４１１１０１４号、国際公開第２００５０３５５１４号、国際公開第２００５０４９０１８号、国際公開第２００６０９９２５６号、国際公開第２００６１２７５８８号又は国際公開第２００７０４４５６０号に開示される化合物である。

これらの組合せは、嚢胞性線維症を含む本明細書に記載の疾患の治療に有用である。これらの組合せはまた本明細書中に記載されたキットにおいて有用である。

本発明の組成物中に存在する追加の治療薬の量は、その治療薬を唯一の活性剤として含む組成物で通常投与される量を超えない。好ましくは、本発明で開示する組成物中の追加の治療薬の量は、その治療薬を唯一の治療用活性剤として含む組成物中に通常存在する量の約５０％〜１００％の範囲である。

本明細書に記載の化合物１のフォームＡ及びアモルファス形態又はそれらの薬学的に許容される組成物はまた人工装具、人工弁、代用血管、ステントおよびカテーテルなどの埋込み型医療デバイスをコーティングするための組成物中に取り込むこともできる。したがって、本発明は、他の態様では、上記した本発明の化合物１のフォームＡ及び／又はアモルファス形態又はその薬学的に許容される医薬組成物およびここの分類及び下位の分類のものならびに前記埋込み型デバイスをコーティングするのに適した担体を含む、埋込み型デバイスをコーティングする組成物を含む。さらに他の態様では、本発明は、上記した本発明の化合物１のフォームＡ及び／又はアモルファス形態またはその薬学的に許容される組成物ならびに埋込み型デバイスをコーティングするのに適した担体を含む組成物でコーティングされた埋込み型デバイスを含む。適切なコーティング、およびコーティングされた埋込み型デバイスの一般的な調製法は、米国特許第６，０９９，５６２号、同第５，８８６，０２６号および同第５，３０４，１２１号に記載されている。コーティングはヒドロゲルポリマー、ポリメチルジシロキサン、ポリカプロラクトン、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、エチレン酢酸ビニルおよびその混合物などのような一般に生体適合性重合物質である。そのコーティングを、フルオロシリコーン、多糖、ポリエチレングリコール、リン脂質またはその組合せの適切なトップコートで場合によりさらに被覆して組成物に制御放出の特性を付与することができる。

ここに記載する本発明がより完全に理解されるように、以下の実施例を示す。これらの実施例は、例示のためだけのものであり、本発明をいかなる態様においても限定するものと解釈されるものではないことを理解すべきである。

方法及び材料

変調示差走査熱量測定（ＭＤＳＣ）及び示差走査熱量測定（ＤＳＣ）

化合物のアモルファス形態及びスプレードライ分散体のガラス遷移温度の試験に変調示差走査熱量測定（ＭＤＳＣ）を用いた。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を、結晶物質の融点を決定するため及び異なる多形を区別するために用いた。データは、ＴＡ ＤＳＣ Q２０００ 示差走査熱量測定計（TA Instruments、New Castle、DE）を用いて収集した。装置はインジウムで較正した。約１−５ｍｇの試料をアルミニウム製気密性パンに秤量し、１個の孔を有する蓋を圧着した。ＭＤＳＣについては、６０秒ごとに＋／−１℃で調節しながら２℃／分での加熱速度で、−２０℃ないし２２０℃で試料を走査した。ＤＳＣについては、１０℃／分の加熱速度で、２５℃ないし２２０℃で試料を走査した。データをＴｈｅｒｍａｌ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｑ Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）ソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ：２.７.０.３８０）で収集し、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ：４.４Ａ、ｂｕｉｌｄ：４.４.０.５）（TA Instruments、New Castle、DE）で分析した。

ＸＲＰＤ（粉末Ｘ線回折）

粉末Ｘ線回折を用いて、これまで製造したロットの物理的形態を特徴づけ、同定された多形を特徴付けた。化合物のＸＲＰＤデータは、ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ Ｘ’ｐｅｒｔ Ｐｒｏ粉末Ｘ線回折計（Almelo、the Netherlands）で収集した。ＸＲＰＤパターンは、室温で銅照射を用いて記録した（１.５４０６０Å）。Ｘ線を４５ｋＶ、４０ｍＡにおいてニッケルＫβ減縮フィルタを有するＣｕ封入管を用いて発生させた。入射ビーム光学は、試料及び分散光側への一定照射波長を確実にするため、種々の発散スリットを含む；走査モードで測定する２.１２°２シータの有効長で、高速直線固相検出器を用いた。粉末試料をゼロバックグラウンドシリコンホルダの意図した領域に充填し、良好な統計値を達成するためにスピニングを行った。刻み幅０.０１７°及び走査のステップ時間１５.５秒で対称的走査を４−４０°２シータで行った。データ収集ソフトは、Ｘ’ｐｅｒｔ Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２.２ｅ）である。データ分析ソフトは、Ｘ’ｐｅｒｔ Ｄａｔａ Ｖｉｅｗｅｒ（ｖｅｒｓｉｏｎ １.２ｄ）又はＸ’ｐｅｒｔ Ｈｉｇｈｓｃｏｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ：２.２ｃ）である。

熱重量分析（ＴＧＡ）

特徴付けしたロットの残存溶媒を調べるためにＴＧＡを用い、試料の分解が起こった温度を同定した。ＴＧＡデータはＴＡ Ｑ５００ Ｔｈｅｒｍｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ、ＤＥ）によって収集した。約２−５ｍｇの重量の試料を、加熱速度１０℃／分で２５℃ないし３００℃でスキャンした。データはＴｈｅｒｍａｌ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｑ Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）ソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ ２.５.０.２５５）で収集し、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ ４.４Ａ、ｂｕｉｌｄ ４.４.０.５）（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ、ＤＥ）で分析した。

化合物１のフォームＡ単結晶構造決定

回折データを封入管Ｃｕ Ｋα線源及びＡｐｅｘＩＩ ＣＣＤ検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ ＡｐｅｘＩＩ回折計で得た。構造をＳＨＥＬＸプログラム（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，Ｇ.Ｍ.，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ.、（２００８）A６４、１１２-１２２）を用いて解析し、精密化した。強度統計及び消滅則から、構造を解析し、C２空間群に精密化した。絶対配置を異常回折を用いて決定した。０.００（１８）に精密化されたフラックのパラメータは、本モデルが正しいエナンチオマー［（Ｒ）］を表すことを示唆する。

固相ＮＭＲ

固相ＮＭＲは、Ｂｒｕｋｅｒ−Ｂｉｏｓｐｉｎ ４ｍＭ ＨＦＸプローブを備えたＢｒｕｋｅｒ−Ｂｉｏｓｐｉｎ ４００ ＭＨｚ広口径スペクトロメータで行った。試料を４ｍｍ ＺｒO_２ロータに充填し、１２.５ｋＨｚの回転速度において、マジック角スピニング（ＭＡＳ）条件で回転させた。^１３Ｃ交差分極（ＣＰ）ＭＡＳ試験において適切なリサイクル遅延を設定するために、最初にプロトン緩和時間を^１Ｈ ＭＡＳ Ｔ_１飽和回復緩和試験を用いて行った。炭素ＣＰＭＡＳ試験のＣＰ接触時間を２秒とした。直線的傾斜（５０％ないし１００％）のＣＰプロトンパルスを用いた。ハルトマン−ハーン・マッチを外部標準試料（グリシン）で最適化した。フッ素ＭＡＳスペクトルをプロトンデカップリングで記録した。ＴＰＰＭ１５デカップリング配列を、^１３C及び^１９Ｆの両方の収集において磁場強度約１００ｋＨｚで行った。

ビトライド（登録商標）（水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム［又はＮａＡｌＨ_２（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３）_２］、６５ｗｇｔ％トルエン溶液）をＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。

２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボン酸Ｓａｌｔｉｇｏ（Ｌａｎｘｅｓｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの関連会社）から購入した。

化合物の構造を正確に表現していない可能性のある化合物の名前が本明細書のどこかにあった場合、構造が名前よりも優先的であり、支配的である。

化合物１の合成

酸部分

（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−メタノールの合成

市販の２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボン酸（１.０当量）をトルエン（１０体積）中でスラリー化する。温度を１５−２５℃に保ち、ビトライド（登録商標）（２当量）を滴下漏斗で滴下する。添加終了後、４０℃に昇温して２時間攪拌し、続いて１０％（ｗ／ｗ）ＮａＯＨ水溶液（４.０当量）を、温度を４０−５０℃に保ち、滴下漏斗で注意深く加える。さらに３０分攪拌後、４０℃で層を分離させる。有機相を２０℃に冷却し、水（２ｘ１.５体積）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮し、粗（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−メタノールを得て、それを直接次工程に用いる。

５−クロロメチル−２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソールの合成

（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−メタノール（１.０当量）をＭＴＢＥ（５体積）に溶解させる。触媒量のＤＭＡＰ（１ｍｏｌ％）を加え、ＳＯＣｌ_２（１.２当量）を滴下漏斗で加える。ＳＯＣｌ_２は、反応容器中の温度が１５−２５℃に維持される速度で加える。温度を１時間かけて３０℃に上げ、続いて２０℃に冷やし、温度を３０℃未満に維持しながら水（４体積）を滴下漏斗で加える。さらに３０分攪拌した後、層を分離させる。有機層を攪拌し、１０％（ｗ／ｖ）ＮａＯＨ水溶液（４.４体積）を加える。１５ないし２０分攪拌後、層を分離させる。続いて有機相を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮し、粗５−クロロメチル−２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソールを得て、それを直接次工程に用いる。

（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−アセトニトリル

５−クロロメチル−２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール（１当量）のＤＭＳＯ（１.２５体積）溶液に、温度を３０−４０℃に維持しながら、ＮａＣＮ（１.４当量）のＤＭＳＯ（３体積）中のスラリーを加える。混合物を１時間攪拌し、続いて水（６体積）に続き、ＭＴＢＥ（４体積）を加える。３０分間攪拌後、層を分離させる。水層をＭＴＢＥ（１.８体積）で抽出する。合わせた有機層を水（１.８体積）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮し、粗（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−アセトニトリル（９５％）を得て、それを直接次の工程に用いる。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ ７.４４（br s、１H）、７.４３（d、Ｊ＝８.４Ｈｚ、１H）、７.２２（dd、Ｊ＝８.２、１.８Ｈｚ、１H）、４.０７（s、２H）.

（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−１−エチルアセテート−アセトニトリルの合成

反応容器に窒素気流を通し、９００ｍＬのトルエンを加えた。窒素散布を１６時間以上行い、溶媒を脱気した。続いて反応容器に、Ｎａ_３ＰＯ_４（１５５.７g、９４９.５ｍｍｏｌ）、続いてビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（０）（７.２８ g、１２.６６ｍｍｏｌ）を加えた。１０％ｗ／ｗ ｔｅｒｔ−ブチルホスフィン（５１.２３g、２５.３２ｍｍｏｌ）のヘキサン溶液を、２３℃において窒素で浄化した添加漏斗で１０分かけて加えた。混合物を５０分攪拌し、５−ブロモ−２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール（７５ g、３１６.５ｍｍｏｌ）を１分かけて加えた。さらに５０分攪拌した後、混合物にシアノ酢酸エチル（７１.６ g、６３３.０ｍｍｏｌ）を５分かけて加え、続いて水（４.５ ｍＬ）を一度に加えた。混合物を７０℃に４０分かけて加熱し、ＨＰＬＣで１−２時間ごとに反応物から生成物への変換率を分析した。完全な変換が観測された後（典型的には５−８時間後に１００％変換）、混合物を２０−２５℃に冷却し、セライトパッドで濾過した。セライトパッドをトルエン（２ｘ４５０ｍＬ）で濯ぎ、合わせた有機層を真空下、６０−６５℃で３００ｍＬまで濃縮した。濃縮液に２２５ｍＬのＤＭＳＯを加え、７０−８０℃で溶媒の活発な蒸発が止むまで減圧濃縮した。溶液を２０−２５℃に冷却し、工程２の準備のため９００ｍＬまでＤＭＳＯで希釈した。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ ７.１６−７.１０（m、２H）、７.０３（d、Ｊ＝８.２Ｈｚ、１H）、４.６３（s、１H）、４.１９（m、２H）、１.２３（t、Ｊ＝７.１Ｈｚ、３H）.

（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−アセトニトリルの合成

上の（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−１−エチルアセテート−アセトニトリルのＤＭＳＯ溶液に、＜４０℃の内部温度を維持しながら３Ｎ ＨＣｌ（６１７.３ｍＬ、１.８５ｍｏｌ）を２０分かけて加えた。続いて、混合物を１時間かけて７５℃まで加熱し、ＨＰＬＣで１−２時間ごとに変換％を分析した。＞９９％の変換が観測された後（典型的には５−６時間後）、反応液を２０−２５℃に冷却し、ＭＴＢＥ（２ｘ５２５ｍＬ）で抽出し、抽出においては完全に相を分離させるために十分な時間をとった。合わせた有機抽出物を５％ ＮａＣｌ（２ｘ３７５ｍＬ）で洗浄した。続いて溶液を、冷却したレシーバーフラスコを備えた１.５−２.５Ｔｏｒｒの真空蒸留を行うのに適切な容器に移した。溶液を＜６０℃で減圧濃縮し、溶媒を除去した。続いて、生成した油状物から（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−アセトニトリルを１２５−１３０℃（オーブン温度）で１.５−２.０Ｔｏｒｒで得た。（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−アセトニトリルを、５−ブロモ−２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール（２工程）から６６％収率で透明な油状物として、ＨＰＬＣ純度９１.５％ＡＵＣ（ｗ／ｗアッセイで９５％に相当する）で得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ ７.４４（br s、１H）、７.４３（d、Ｊ＝８.４Ｈｚ、１H）、７.２２（dd、Ｊ＝８.２、１.８Ｈｚ、１H）、４.０７（s、２H）.

（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボニトリルの合成

（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−アセトニトリル（１.０当量）、５０重量％ ＫＯＨ水溶液（５.０当量）、１−ブロモ−２−クロロエタン（１.５当量）及びＯｃｔ_４ＮＢｒ（０.０２当量）を７０℃で１時間攪拌した。反応混合物を冷却し、続いてＭＴＢＥ及び水で後処理した。有機相を水及び食塩水で洗浄し、続いて溶媒を除去して（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボニトリルを得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ ７.４３（d、Ｊ＝８.４Ｈｚ、１H）、７.４０（d、Ｊ＝１.９Ｈｚ、１H）、７.３０（dd、Ｊ＝８.４、１.９Ｈｚ、１H）、１.７５（m、２H）、１.５３（m、２H）.

１−（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボン酸の合成

（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボニトリルを６Ｍ ＮａＯＨ（８当量）のエタノール（５体積）溶液を用いて８０℃で終夜、加水分解した。混合物を室温に冷却し、エタノールを減圧下蒸発させた。残渣を水及びＭＴＢＥに取り込み、１Ｍ ＨＣｌを加えて層を分離させた。続いてＭＴＢＥ層をジシクロヘキシルアミン（０.９７当量）で処置した。スラリーを０℃に冷却し、濾過し、ヘプタンで洗浄し、対応するＤＣＨＡ塩を得た。塩をＭＴＢＥ及び１０％クエン酸に取り込み、すべての固体が溶解するまで攪拌した。層を分離し、ＭＴＢＥ層を水及び食塩水で洗浄した。溶媒をヘプタンに交換し、続いて濾過し、５０℃で終夜真空オーブンで乾燥させ、１−（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボン酸を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ 計算値２４２.０４、実測値２４１.５８（M+１）+；^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ １２.４０（s、１H）、７.４０（d、Ｊ＝１.６Ｈｚ、１H）、７.３０（d、Ｊ＝８.３Ｈｚ、１H）、７.１７（dd、Ｊ＝８.３、１.７Ｈｚ、１H）、１.４６（m、２H）、１.１７（m、２H）.

アミン部分

２−ブロモ−５−フルオロ−４−ニトロアニリンの合成
フラスコに３−フルオロ−４−ニトロアニリン（１.０当量）を加え、続いて酢酸エチル（１０体積）を加え、攪拌してすべての固体を溶解させた。N−ブロモコハク酸イミド（１.０当量）を内部温度が２２℃を維持するよう、少しずつ加えた。反応終了後、反応混合物を真空でロータリーエバポレータによって濃縮した。残渣を蒸留水（５体積）にスラリー化してコハク酸イミドを溶解し、除去した（コハク酸イミドは、水による後処理工程でも除去できる）。水をデカントし、固体を２−プロパノール（５体積）で終夜スラリー化した。生成したスラリーを濾過し、湿潤したケーキを２−プロパノールで洗浄し、N_２を通気させて、重量が一定になるまで、真空下５０℃で終夜乾燥した。黄色がかった褐色の固体を単離した（５０％収率、９７.５％ＡＵＣ）。他の不純物は、ブロモ−位置異性体（１.４％ＡＵＣ）及びジ−ブロモ付加体（１.１％ＡＵＣ）であった。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ８.１９（１ H、d、Ｊ＝８.１Ｈｚ）、７.０６（br. s、２ H）、６.６４（d、１ H、Ｊ＝１４.３Ｈｚ）.

ベンジルグリコール化−４−アンモニウム−２−ブロモ−５−フルオロアニリントシル酸塩の合成

N_２下、完全に乾燥させたフラスコに以下を添加した：活性化粉末４Åモレキュラー・シーブス（２−ブロモ−５−フルオロ−４−ニトロアニリンに対して５０重量％）、２−ブロモ−５−フルオロ−４−ニトロアニリン（１.０当量）、過塩素酸亜鉛二水和物（２０ｍｏｌ％）及びトルエン（８体積）。混合物を室温で、で３０分以下で攪拌した。最後に、（Ｒ）−ベンジルグリシジルエーテル（２.０当量）のトルエン（２体積）溶液を安定した気流の中で加えた。反応混合物は、８０℃（内部温度）に加熱し、約７時間又は２−ブロモ−５−フルオロ−４−ニトロアニリン＜５％ＡＵＣとなるまで攪拌した。

反応液を室温に冷まし、セライト（５０重量％）を加え、続いて酢酸エチル（１０体積）を加えた。生じた混合物を濾過してセライトを除去し、シーブスを酢酸エチル（２体積）で洗浄した。濾液を塩化アンモニウム溶液（４体積、２０％ｗ／ｖ）で洗浄した。有機層を炭酸水素ナトリウム溶液（４体積ｘ２.５％ｗ／ｖ）で洗浄した。有機層を真空下ロータリーエバポレータで濃縮した。生成したスラリーを酢酸イソプロピル（１０体積）に溶解させ、この溶液をブチハイドロゲネータ（Buchi hydrogenator）に移した。

ハイドロゲネータに５重量％ Ｐｔ（Ｓ）／Ｃ（１.５ｍｏｌ％）を加え、N_２下３０℃（内部温度）で混合物を攪拌した。反応混合物に、Ｎ_２、続いて水素を通気した。ハイドロゲネータの圧力を１Ｂａｒの水素に調節し、混合物を急速に攪拌した（＞１２００ｒｐｍ）。反応終了後、触媒をセライトパッドでろ過し、ジクロロメタン（１０体積）で洗浄した。濾液を真空下濃縮した。残った酢酸イソプロピルをジクロロメタン（２体積）で回収し、ロータリーエバポレータで濃縮し乾燥した。

生じた残渣をジクロロメタン（１０体積）に溶解させた。p−トルエンスルホン酸一水和物（１.２当量）を加え終夜攪拌した。生成物を濾過し、ジクロロメタン（２体積）で洗浄し、吸引乾燥した。湿潤したケーキを乾燥トレイに移し、真空オーブンに移し、４５℃のＮ_２気流で定常質量となるまで乾燥した。ベンジルグリコール化−４−アンモニウム−２−ブロモ−５−フルオロアニリントシル酸塩は、オフホワイトの固体として単離された。

キラル純度は、＞９７％ｅｅであると決定された。

（３−クロロ−３−メチルブチ−１−イニル）トリメチルシランの合成

プロパルギルアルコール（１.０当量）を容器に加えた。塩酸水溶液（３７％、３.７５体積）を加え、攪拌を開始した。固体のアルコールの溶解中、緩やかな吸熱（５−６℃）が見られる。生じた混合物を終夜（１時間）攪拌したところ、ゆっくりと濃赤色となった。３０Ｌのジャケット付き容器に水（５体積）を加え、続いて１０℃に冷却する。反応混合物の内部温度を２５℃未満に維持しながら、吸引によりゆっくりと水の中に移す。ヘキサン（３体積）を加え、生じた混合物を０.５時間攪拌する。相を安定させ、水相（ｐＨ＜１）を排水し、廃棄した。有機相をロータリーエバポレータを用いて真空下濃縮し、生成物を赤色の油状物として得た。

（４−（ベンジルオキシ）−３，３−ジメチルブチ−１−イニル）トリメチルシランの合成

方法A

この章におけるすべての当量及び容量の記載は、２５０g反応に基づく。削り屑状マグネシウム（６９.５g、２.８６ｍｏｌ、２.０当量）を３Lの４首反応容器に加え、窒素下、マグネティックスターラで０.５時間攪拌した。反応容器を氷水浴に浸した。塩化プロパルギル（２５０g、１.４３ｍｏｌ、１.０当量）のＴＨＦ（１.８Ｌ、７.２体積）溶液を、攪拌しながら、最初の発熱（〜１０℃）が見られるまでゆっくりと反応容器に加えた。グリニャール試薬形成を、^１Ｈ ＮＭＲ分光法を用いてIPCにより確認した。発熱が弱まると、残りの溶液をバッチ温度を＜１５℃に維持しながらゆっくりと加えた。添加に〜３.５時間要した。生成した暗緑色の混合物を２Lのキャップ付きのボトルにデカントした。

この章におけるすべての当量及び容量の記載は、５００g反応に基づく。２２Ｌ反応容器に、ベンジルクロロメチルエーテル（９５％、３７５ g、２.３１ｍｏｌ、０.８当量）のＴＨＦ（１.５Ｌ、３体積）溶液を加えた。反応容器を氷水浴で冷却した。先に調製した４つのうち２つのグリニャール試薬バッチを合わせ、続いて、バッチ温度を２５℃未満に維持しながら、ゆっくりとベンジルクロロメチルエーテル溶液に滴下漏斗を用いて加えた。反応混合物を終夜攪拌した（１６時間）。

この章におけるすべての当量及び容量の記載は、１ｋｇ反応に基づく。１５％塩化アンモニウム溶液を３０Ｌジャケット付き反応容器で調製した（８.５ｋｇ水中、１.５ｋｇ、１０体積）。溶液を５℃に冷却した。上述の２つのグリニヤール反応混合物を合わせ、続いて排気管（header vessel）を用いて塩化アンモニウム溶液中に移した。このクエンチにおいて発熱が見られたので、２５℃未満の内部温度を維持する速さで行った。添加が終わると、容器のジャケット温度を２５℃に設定した。ヘキサン（８Ｌ、８体積）を加え、混合物を０.５時間攪拌した。相が安定した後、水相（ｐＨ９）を排水し、廃棄した。残った有機相を水（２Ｌ、２体積）で洗浄した。有機相を２２Ｌロータリーエバポレータを用いて真空下濃縮し、オレンジ色の油状物として粗生成物を得た。

方法B

削り屑状マグネシウム（１０６g、４.３５ｍｏｌ、１.０当量）を２２Ｌ反応容器に加え、続いてＴＨＦ（７６０ｍＬ、１体積）に懸濁させた。容器を氷水浴で冷却し、バッチ温度が２℃になるようにした。塩化プロパルギル（７６０ｇ、４.３５ｍｏｌ、１.０当量）のＴＨＦ（４.５Ｌ、６体積）溶液をゆっくりと容器に加えた。
１００ｍＬを加えた後、添加をやめ、グリニャール反応が開始したことを示す、１３℃の発熱が観察されるまで混合物を攪拌した。発熱が弱まると、＜２０℃のバッチ温度を維持しながらさらに塩化プロパルギル溶液５００ｍＬをゆっくり加えた。グリニャール試薬の形成を^１Ｈ ＮＭＲ分光法を用いてIPCにより確認した。残りの塩化プロパルギル溶液を＜２０℃のバッチ温度を維持するようにゆっくりと加えた。添加は、〜１.５時間要した。生成した濃緑色の溶液を０.５時間攪拌した。グリニャール試薬形成を^１Ｈ ＮＭＲ分光法を用いてIPCにより確認した。非希釈のベンジルクロロメチルエーテルを反応容器の滴下漏斗に加え、続いて２５℃未満のバッチ温度を維持しながら、反応容器に滴下した。添加に１.０時間要した。反応混合物を終夜攪拌した。方法Aにおけるのと同じ方法および物質の相対量を用いて、水による後処理及び濃縮を行うことにより、オレンジの油状物として生成物を得た。

４−ベンジルオキシ−３，３−ジメチルブチ−１−インの合成

３０Lジャケット付き反応容器にメタノール（６体積）を加え、続いて５℃に冷却した。水酸化カリウム（８５％、１.３当量）を反応容器に加えた。水酸化カリウムが溶解すると１５−２０℃の発熱が見られた。ジャケット温度を２５℃に設定した。４−ベンジルオキシ−３，３−ジメチル−１−トリメチルシリルブチ−１−イン（１.０当量）のメタノール（２体積）溶液を加え、生じた混合物を、ＨＰＬＣでモニターして反応が終了するまで攪拌した。２５℃での典型的な反応時間は３−４時間である。反応混合物を水（８体積）で希釈し、続いて０.５時間攪拌した。ヘキサン（６体積）を加え、生じた混合物を０.５時間攪拌した。相を安定させ、続いて水層（ｐＨ１０−１１）を排水し、棄てた廃棄した。有機相をＫＯＨ（８５％、０.４当量）の水溶液（８体積）、続いて水（８体積）で洗浄した。続いて有機相をロータリーエバポレータを用いて濃縮し、表題物質を黄−橙色の油状物として得た。この物質の典型的な純度は、当初は単一の不純物が存在して８０％の範囲にある。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、C_６D_６）δ７.２８（d、２ H、Ｊ＝７.４Ｈｚ）、７.１８（t、２ H、Ｊ＝７.２Ｈｚ）、７.１０（d、１H、Ｊ＝７.２Ｈｚ）、４.３５（s、２ H）、３.２４（s、２ H）、１.９１（s、１ H）、１.２５（s、６ H）.

ベンジルグリコール化４−アミノ−２−（４−ベンジルオキシ−３，３−ジメチルブチ−１−イニル）−５−フルオロアニリンの合成

ベンジルグリコール化４−アンモニウム−２−ブロモ−５−フルオロアニリントシル酸塩の固体をＥｔＯＡｃ（５体積）及び飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（５体積）中で透明な有機層が得られるまで攪拌し、遊離塩基にした。生成した層を分離し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（５体積）に続き食塩水で洗浄し、真空下濃縮し、ベンジルグリコール化４−アンモニウム−２−ブロモ−５−フルオロアニリントシル酸塩を油状物として得た。

続いて、フラスコにベンジルグリコール化４−アンモニウム−２−ブロモ−５−フルオロアニリントシル酸塩（遊離塩基、１.０当量）、Ｐｄ（ＯＡｃ）（４.０ｍｏｌ％）、ｄｐｐｂ（６.０ｍｏｌ％）及び粉末状Ｋ_２ＣＯ_３（３.０当量）を加え、アセトニトリル（６体積）と共に室温で攪拌した。生成した反応混合物を、約３０分N_２で排気しながらバブリングして脱気した。続いて、アセトニトリル（２体積）に溶解させた４−ベンジルオキシ−３，３−ジメチルブチ−１−イン（１.１当量）を速い気流で加え、８０℃に加熱し、４−アンモニウム−２−ブロモ−５−フルオロアニリントシル酸塩が完全に消失するまで攪拌した。反応スラリーを室温に冷却し、セライトパッドで濾過しアセトニトリル（２体積）で洗浄した。濾液を真空下濃縮し、残渣を再度ＥｔＯＡｃ（６体積）に溶解した。有機層をＮＨ_４Ｃｌ溶液（２０％ ｗ／ｖ、４体積）で２回及び食塩水（６体積）で洗浄した。生成した有機層を濃縮し、褐色の油状物を得て、それをそのまま次の反応に用いた。

Ｎ−ベンジルグリコール化−５−アミノ−２−（２−ベンジルオキシ−１，１−ジメチルエチル）−６−フルオロインドールの合成

油状の粗ベンジルグリコール化４−アミノ−２−（４−ベンジルオキシ−３，３−ジメチルブチ−１−イニル）−５−フルオロアニリンをアセトニトリル（６体積）に溶解し、（ＭｅＣＮ）_２ＰｄＣｌ_２（１５ｍｏｌ％）を室温で加えた。生じた混合物を、約３０分Ｎ_２で排気しながら脱気した。続いて反応混合物をN_２雰囲気下、８０℃で終夜攪拌した。反応混合物を室温に冷まし、セライトパッドで濾過し、ケーキをアセトニトリル（１体積）で洗浄した。生成した濾液を真空下濃縮し、再度ＥｔＯＡｃ（５体積）に溶解させた。Ｄｅｌｏｘａｎｅ−ＩＩ ＴＨＰ（N−ベンジルグリコール化−５−アミノ−２−（２−ベンジルオキシ−１，１−ジメチルエチル）−６−フルオロインドールの理論上の収量に基づき５重量％）を加え、室温で終夜攪拌した。続いて混合物をシリカのパッドで濾過し（２.５インチの深さ、６インチの直径のフィルタ）、ＥｔＯＡｃ（４体積）で洗浄した。濾液を濃縮し、暗褐色残渣を得て、それをそのまま次の反応に用いた。

粗Ｎ−ベンジルグリコール化−５−アミノ−２−（２−ベンジルオキシ−１，１−ジメチルエチル）−６−フルオロインドールの再精製：

粗Ｎ−ベンジルグリコール化−５−アミノ−２−（２−ベンジルオキシ−１，１−ジメチルエチル）−６−フルオロインドールをジクロロメタン（〜１.５体積）に溶解し、シリカパッドで最初３０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタンで濾過し、不純物を棄てた。続いてシリカパッドを５０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタンで、濾液に薄い色が付くまで洗浄し、N−ベンジルグリコール化−５−アミノ−２−（２−ベンジルオキシ−１，１−ジメチルエチル）−６−フルオロインドールを単離した。この濾液を真空下濃縮し、褐色の油状物を得て、それを真空下室温で静置して結晶化させた。
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ ７.３８−７.３４（m、４ H）、７.３２−７.２３（m、６ H）、７.２１（d、１ H、Ｊ＝１２.８Ｈｚ）、６.７７（d、１H、Ｊ＝９.０Ｈｚ）、６.０６（s、１ H）、５.１３（d、１H、Ｊ＝４.９Ｈｚ）、４.５４（s、２ H）、４.４６（br. s、２ H）、４.４５（s、２ H）、４.３３（d、１ H、Ｊ＝１２.４Ｈｚ）、４.０９−４.０４（m、２ H）、３.６３（d、１H、Ｊ＝９.２Ｈｚ）、３.５６（d、１H、Ｊ＝９.２Ｈｚ）、３.４９（dd、１H、Ｊ＝９.８、４.４Ｈｚ）、３.４３（dd、１H、Ｊ＝９.８、５.７Ｈｚ）、１.４０（s、６ H）.

化合物１の合成

ベンジル保護された化合物１の合成

１−（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボン酸（１.３当量）をトルエン（１−（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボン酸に基づき２.５体積）にスラリー化し、混合物を６０℃に加熱した。ＳＯＣｌ_２（１.７当量）を滴下漏斗で加えた。生じた混合物を２時間攪拌した。トルエン及び過量のＳＯＣｌ_２をロータリーエバポレータで留去した。さらにトルエン（１−（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボン酸に基づき２.５体積）を加え、再度留去した。粗酸塩化物をジクロロメタン（２体積）に溶解させ、０−３℃（内部温度）に保ち、滴下漏斗で、N−ベンジルグリコール化−５−アミノ−２−（２−ベンジルオキシ−１，１−ジメチルエチル）−６−フルオロインドール（１.０当量）及びトリエチルアミン（２.０当量）のジクロロメタン（７体積）中の混合物に滴下した。生じた混合物を０℃で４時間攪拌し、続いて終夜室温に戻した。反応混合物に蒸留水（５体積）を加えて３０分以上攪拌し、層を分離した。有機相を２０重量％ K_２CO_３（４体積ｘ２）、続いて食塩水（４体積）で洗浄し、濃縮し、粗ベンジル保護化合物１を濃い褐色の油状物として得て、シリカパッド濾過を使用して更に精製した。

シリカゲルパッド濾過： 活性炭Ｄａｒｃｏ−Ｇ（ベンジル保護化合物１の理論上の収量に基づき１０重量％）の存在下、粗ベンジル保護化合物１を酢酸エチル（３体積）に溶解し、室温で終夜攪拌した。この混合物にヘプタン（３体積）を加え、シリカゲルパッド（粗ベンジル保護化合物１の２ｘ重量）で濾過した。シリカゲルパッドを酢酸エチル／ヘプタン（１：１、６体積）で濾液にほとんど色がつかなくなるまで洗浄した。濾液を真空下濃縮し、ベンジル保護化合物１を粘性のある赤褐色の油状物として得て、直接次の反応に用いた。

再精製： ベンジル保護化合物１を再度ジクロロメタン（ベンジル保護化合物１の理論上の収量に基づき１体積）に溶解し、シリカゲルパッド（粗ベンジル保護化合物１の２x重量）に載せた。シリカパッドをジクロロメタン（ベンジル保護化合物１の理論上の収量に基づき２体積）で洗浄し、濾液を棄てた。シリカパッドを３０％ 酢酸エチル／ヘプタン（５体積）で洗浄し、濾液を真空で濃縮し、ベンジル保護化合物１を粘性のある赤橙油状物として得て、次の工程に直接用いた。

化合物１の合成

方法A

２０Ｌ オートクレーブに３回、窒素ガスを通気し、続いて、パラジウム炭素（Ｅｖｏｎｉｋ Ｅ １０１ ＮＮ／Ｗ、５％ Ｐｄ、６０％ ｗｅｔ、２００ ｇ、０.０７５ｍｏｌ、０.０４当量）を加えた。オートクレーブに窒素を３回通気した。粗ベンジル保護化合物１（１.３ｋｇ、〜１.９ｍｏｌ）のＴＨＦ（８Ｌ、６体積）溶液をオートクレーブに、吸引によって加えた。容器に蓋をし、続いて、３回窒素ガスを通気した。穏やかな攪拌下、容器に３回水素ガスを通気し、窒素で希釈することにより大気中に排気した。オートクレーブを水素で加圧して３Ｂａｒとし、攪拌速度を８００ｒｐｍとした。急速な水素取り込みが観測された（溶解）。取り込みが弱まると、容器を５０℃に加熱した。

安全性のため、温度調節器は実働日ごとの終わりには切った。容器を水素で４Ｂａｒとし、続いて水素タンクから離した。

丸２日間の反応後、さらなるＰｄ／Ｃ（６０ｇ、０.０２３ｍｏｌ、０.０１当量）を反応混合物に加えた。これは窒素ガスを３回通気し、続いて触媒を、固体添加口を通じて加えることにより行った。前のとおりの反応を再開した。丸４日後、反応は、ＨＰＬＣにより出発物質だけでなく、モノベンジル中間体に対応するピークもが消失したため完了したとみなした。

反応混合物をセライトパッドにより濾過した。容器及びフィルタケーキをＴＨＦ（２Ｌ、１.５体積）で洗浄した。続いてセライトパッドを水で湿らせ、ケーキを適宜棄てた。合わせた濾液及びＴＨＦ洗浄液を、ロータリーエバポレータを用いて濃縮し、粗生成物を黒色油状物１ｋｇとして得た。

以下の精製におけるすべての当量および体積の記載は、粗生成物１ｋｇに基づく。粗黒色油状物を１：１ 酢酸エチル−ヘプタンに溶解した。混合物を酢酸エチル−ヘプタンで飽和させたシリカゲル（１.５ｋｇ、１.５重量.当量）を加えた焼結漏斗に載せた。シリカパッドを、まず１：１ 酢酸エチル−ヘプタン（６Ｌ、６体積）、続いて純酢酸エチル（１４Ｌ、１４体積）で流した。溶出液は４フラクション集め、ＨＰＬＣで分析した。

以下の精製におけるすべての当量および体積の記載は、粗生成物０.６ｋｇに基づく。フラクション３をロータリーエバポレーションで濃縮し、褐色泡状物質（６００ｇ）を得て、続いてＭＴＢＥ（１.８Ｌ、３体積）に再度溶解させた。暗褐色の溶液を終夜、周囲温度で攪拌し、その間に結晶化が起こった。ヘプタン（５５ｍＬ、０.１体積）を加え、混合物を終夜攪拌した。混合物をブフナー漏斗を用いて濾過し、フィルタケーキを３：１ ＭＴＢＥ−ヘプタン（９００ｍＬ、１.５体積）で洗浄した。フィルタケーキは１時間空気乾燥し、続いて周囲温度で１６時間真空乾燥させ、ＶＸｃ−６６１ ２５３ｇをオフホワイトの固体として得た。

以下の精製におけるすべての当量および体積の記載は、粗生成物１.４ｋｇに基づく。上記のシリカゲル濾過したフラクション２及び３及び前述の反応により得られた物質を合わせて濃縮し、１.４ｋｇの黒色の油状物を得た。混合物を上述したとおり再度シリカゲル濾過し（シリカゲル１.５ ｋｇ、３.５Ｌ、２.３体積の１：１ 酢酸エチル−ヘプタン、続いて９Ｌ、６体積の純酢酸エチルで溶出）、濃縮して、淡褐色の泡状固体を得た（３９０ｇ）。

以下の精製におけるすべての当量および体積の記載は、粗生成物３９０ｇに基づく。淡褐色の固体はＭＴＢＥに不溶であったため、メタノールに溶解させた（１.２Ｌ、３体積）。長距離蒸留塔（distillation head）を備えた４Ｌ Ｍｏｒｔｏｎ反応器を用いて混合物を２体積に蒸留し、戻した。ＭＴＢＥ（１.２Ｌ、３体積）を加え、混合物を蒸留して２体積に戻した。２回目のＭＴＢＥ（１.６Ｌ、４体積）を加え、蒸留して２体積に戻した。３回目のＭＴＢＥ（１.２Ｌ、３体積）を加え、蒸留して３体積に戻した。蒸留物をGCで分析したところ、〜６％のメタノールを含むことを示した。温度調節器を４８℃に設定した（ＭＴＢＥ−メタノール共沸化合物の沸点である５２℃よりも低い）。混合物を２０℃に２時間以上かけて冷却し、その間に比較的速い結晶化が起こった。混合物を２時間攪拌した後、ヘプタン（２０ｍＬ、０.０５体積）を加え、混合物を終夜（１６時間）攪拌した。混合物をブフナー漏斗を用いて濾過し、フィルタケーキを３：１ ＭＴＢＥ−ヘプタン（８００ｍＬ、２体積）で洗浄した。フィルタケーキを１時間空気乾燥し、続いて真空下周囲温度で１６時間乾燥し、化合物１ １３０ｇをオフホワイトの固体として得た。

方法B

ベンジル保護化合物１をＴＨＦ（３体積）に溶解させ、残存溶媒を除去した。ベンジル保護化合物１を再びＴＨＦ（４体積）に溶解させ、５ 重量％ Ｐｄ／Ｃ（２.５ｍｏｌ％、６０％ｗｅｔ、Ｄｅｇｕｓｓａ Ｅ５ E１０１ ＮＮ／Ｗ）を含有するハイドロゲネータに加えた。反応の内部温度を５０℃とし、N_２（ｘ５）に続き水素（x３）気流を通気した。ハイドロゲネータの圧力を水素で３Ｂａｒに調節し、混合物を急速に攪拌した（＞１１００ｒｐｍ）。反応終了時、触媒をセライトパッドで濾過し、ＴＨＦ（１体積）で洗浄した。濾液を真空下濃縮し、褐色の泡状残渣を得た。生じた残渣をＭＴＢＥ（５体積）に溶解させ、０.５Ｎ ＨＣｌ溶液（２体積）および蒸留水（１体積）を加えた。混合物を３０分以上攪拌し、生成した層を分離した。有機相１０重量％Ｋ_２ＣＯ_３溶液（２体積ｘ２）、続いて食塩水で洗浄した。有機層をシリカゲル（２５重量％）、ＤＥＬＯＸＡＮ−ＴＨＰ ＩＩ（５重量％、７５％ｗｅｔ）、及びＮａ_２ＳＯ_４を含有するフラスコに加え、終夜攪拌した。生じた混合物をセライトパッドで濾過し、１０％ＴＨＦ／ＭＴＢＥ（３体積）で洗浄した。濾液を真空下濃縮し、粗化合物１を薄い褐色の泡状物質として得た。

母液からの化合物１の回収：オプションA

シリカゲルパッド濾過：母液を真空下濃縮して褐色泡状物質を得て、ジクロロメタン（２体積）に溶解させ、シリカのパッド（粗化合物１の３x重量）で濾過した。シリカパッドを酢酸エチル／ヘプタン（１：１、１３体積）で洗浄し、濾液を棄てた。シリカパッドを１０％ＴＨＦ／酢酸エチル（１０体積）で洗浄し、濾液を真空下濃縮し、化合物１を薄い褐色の泡状物質として得た。引き続き上述の結晶化工程を行い、残存化合物１を単離した。

母液からの化合物１の回収：オプションB

シリカゲルカラムクロマトグラフィー：シリカゲルクロマトグラフィー（５０％ 酢酸エチル／ヘキサンないし１００％酢酸エチル）の後、所望の化合物を薄い褐色の泡状物質として単離した。引き続き上述の結晶化工程を行い、残存化合物１を単離した。

図１は化合物１のＸ線結晶回折パターンを示す。化合物１のＤＳＣトレースを図２に示す。図２のＤＳＣトレースは、化合物１が純粋な固相でないことを示す。化合物１のフォームＡと比較して、余分なピークが１１９℃に存在する化合物１のフォームＡ（図６参照）。化合物１のＴＧＡトレースを図３に示す。

化合物１はまた、ここに参照として引用する米国特許出願公開第２００９０１３１４９２号に開示されたいくつかの合成経路の１つを用いて調製することもできる。

化合物１のフォームＡの合成

スラリー法

ＥｔＯＡｃ、ＭＴＢＥ、酢酸イソプロピル、又はＤＣＭについては、化合物１約４０ｍｇを、上述のいずれかの溶媒１−２ｍＬに加えた。スラリーを室温で２４時間ないし２週間攪拌し、化合物１のフォームＡを懸濁液の遠心分離（フィルタ付き）によって得た。図５は、溶媒としてＤＣＭを用いて、この方法により得た化合物１のフォームＡのＸＲＰＤパターンを記載する。

ＥｔＯＨ／水溶液については、化合物１約４０ｍｇを３個のバイアルに加えた。第１のバイアルにはＥｔＯＨ １.３５ｍＬ及び水０.１５ｍＬを加えた。第２のバイアルにはＥｔＯＨ ０.７５ｍＬ及び水０.７５ｍＬを加えた。第３のバイアルにはＥｔＯＨ ０.１５ｍＬ及び水１.３５ｍＬを加えた。３個のすべてのバイアルを室温で２４時間攪拌した。続いて各懸濁液を別々に遠心分離し（フィルタ付き）、化合物１のフォームＡを得た。

イソプロピルアルコール／水溶液については、化合物１約４０ｍｇを３個のバイアルに加えた。第１のバイアルには、イソプロピルアルコール１.３５ｍＬ及び水０.１５ｍＬを加えた。第２のバイアルには、イソプロピルアルコール０.７５ｍＬ及び水０.７５ｍＬを加えた。第３のバイアルには、イソプロピルアルコール０.１５ｍＬ及び水１.３５ｍＬを加えた。３個のすべてのバイアルを室温で２４時間攪拌した。続いて各懸濁液を別々に遠心分離し（フィルタ付き）、化合物１のフォームＡを得た。

メタノール／水溶液については、化合物１約４０ｍｇをバイアルに加えた。メタノール０.５ｍＬ及び水１ｍＬを加え、懸濁液を室温で２４時間攪拌した。懸濁液を遠心分離し（フィルタ付き）、化合物１のフォームＡを得た。

アセトニトリルについては、化合物１約５０ｍｇをアセトニトリル２.０ｍＬの入ったバイアルに加えた。懸濁液を、室温で２４時間攪拌し、化合物１のフォームＡを遠心分離（フィルタ付き）により得た。

アセトニトリル／水溶液については、化合物１約５０ｍｇをアセトニトリル２.５ｍＬに加え、超音波により透明な溶液を得た。溶液を濾過し、バイアルに１ｍＬ残した。水２.２５ｍＬを加えて懸濁液とした。懸濁液を室温で２４時間攪拌し、化合物１のフォームＡを遠心分離（フィルタ付き）により得た。

低速蒸発法

化合物１約５５ｍｇをアセトン０.５ｍＬに溶解させ、超音波により透明な溶液を得た。溶液を濾過し、０.２ｍＬをバイアルに取った。バイアルを１個の穴を開けたパラフィルムでカバーし、静置した。再結晶した化合物１のフォームＡを濾過によって集めた。

高速蒸発法

イソプロピルアルコールについては、化合物１約４３ｍｇをイソプロピルアルコール２.１ｍＬに溶解させ、超音波により透明な溶液を得た。溶液をバイアルに濾過して入れ、カバーなしに静置した。再結晶した化合物１のフォームＡを濾過により集めた。

メタノールについては、化合物１約５８ｍｇをメタノール０.５ｍＬに溶解させ、超音波により透明な溶液を得た。溶液を濾過し、０.２ｍＬをカバーしないバイアルに取り、静置した。再結晶した化合物１のフォームＡを濾過によって集めた。

アセトニトリルについては、化合物１約５１ｍｇをアセトニトリル２.５ｍＬに溶解させ、超音波により透明な溶液を得た。溶液を濾過し、溶液の半分をカバーしないバイアルに取り、静置した。再結晶した化合物１のフォームＡを濾過によって集めた。図７は、この方法によって調製した化合物１のフォームＡのＸＲＰＤパターンを示す。

貧溶媒法

ＥｔＯＡｃ／ヘプタンについては、化合物１約３０ｍｇをＥｔＯＡｃ１.５ｍＬに溶解させ、超音波により透明な溶液を得た。溶液を濾過し、濾液に、ゆっくり攪拌しながらヘプタン２.０ｍＬを加えた。溶液をさらに１０分間攪拌し、静置した。再結晶した化合物１のフォームＡを濾過によって集めた。図８は、この方法によって調製した化合物１のフォームＡのＸＲＰＤパターンを示す。

イソプロピルアルコール／水については、化合物１約２１ｍｇをイソプロピルアルコール１.０ｍＬに溶解させ、超音波により透明な溶液を得た。溶液を濾過し、溶液０.８ｍＬを得た。ゆっくりと攪拌しながら水１.８ｍＬを加えた。さらに水０.２ｍＬを加えて、曇った懸濁液を得た。５分間攪拌を止めて透明な溶液を得た。溶液をさらに２分間攪拌し、静置した。再結晶した化合物１のフォームＡを濾過によって集めた。

エタノール／水については、化合物１約４０ｍｇをエタノール１.０ｍＬに溶解させ、超音波により透明な溶液を得た。溶液を濾過し、水１.０ｍＬを加えた。溶液を１日室温で攪拌した。再結晶した化合物１のフォームＡを濾過によって集めた。

アセトン／水については、化合物１約５５ｍｇをアセトン０.５ｍＬに溶解させ、超音波により透明な溶液を得た。溶液を濾過し、０.２ｍＬをバイアルに取った。水１.５ｍＬを加え、続いてさらに水０.５ｍＬを加えて曇った懸濁液を得た。懸濁液を１日室温で攪拌した。化合物１のフォームＡを濾過によって集めた。

以下の表２は、化合物１のフォームＡを形成させる種々の技術をまとめたものである。

化合物１のフォームＡの単結晶構造から計算したX−線回折パターンを図４に示す。表３は図１に示すピークを計算したリストである。

図５に化合物１のフォームＡの実際のＸ線結晶回折パターンを示す。表４は図５の実際のピークをリストする。

図６に化合物１のフォームＡのＤＳＣトレースを示す。化合物１のフォームＡの融点は約１７２−１７８℃である。

格子の大きさ及び充填を含む結晶構造関するさらなる詳細を提供する、化合物１のフォームＡについての単結晶データを得た。

結晶調製

メタノールの濃縮溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）からの低速蒸発により、化合物１のフォームＡを得た。０.２０×０.０５×０.０５ｍｍの寸法の化合物１のフォームＡの無色の結晶を選択し、鉱油を用いて浄化し、ＭｉｃｒｏＭｏｕｎｔに乗せ、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＰＥＸＩＩ回折装置の中心に置いた。方位行列及び初期セルパラメータを提供するために、逆格子空間において別れた４０フレームの３つのバッチを得た。最終セルパラメーラを完全なデータセットに基づいて得て、精密化した。

実験項

逆格子空間の回折データセットを、各フレームについて０.８３Åの分解能まで０.５°刻みの３０秒暴露により得た。データを室温［２９５（２）Ｋ］で収集した。強度の積分及びセルパラメーラの精密化をＡＰＥＸＩＩソフトウェアを用いて行った。データ収集後の結晶の観察で分解の兆候は示されなかった。

幾何：すべてのエネルギースペクトル密度（ｅｓｄ）（２個の最小二乗（l.s.）平面の間の二面対角におけるesdを除く）を全共分散行列を用いて見積もった。セルのｅｓｄは、距離、角度及びひずみ角のｅｓｄの見積もりにそれぞれ考慮される；セルパラメーラにおけるｅｓｄ間の相関は、結晶対象により定義される場合にのみ用いる。ｌ.ｓ.平面の関わるｅｓｄの見積もりには近似値（等方晶系）処理を行う。

データ収集：Ａｐｅｘ ＩＩ；セルの精密化：Ａｐｅｘ ＩＩ；データ整理：Ａｐｅｘ ＩＩ；構造解析に用いたプログラム：ＳＨＥＬＸＳ９７（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ、１９９０）；構造の精密化に用いたプログラム：ＳＨＥＬＸＬ９７（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ、１９９７）；分子グラフィックス：Ｍｅｒｃｕｒｙ；出版のための材料を調製するために用いたソフトウェア：ｐｕｂｌＣＩＦ。

精密化：ＡＬＬ反射に対するＦ２の精密化。荷重R因子ｗＲ及び適合度ＳはＦ^２に基づき、通常のＲ計数ＲはＦに基づくが、負Ｆ^２の場合Ｆはゼロとする。Ｆ^２＞２シグマ（Ｆ^２）の閾値表現は、Ｒ係数（gt）等を計算するためだけに用いられ、精密化のための反射の選択には関連がない。Ｆ^２に基づくＲ係数は統計的にはＦに対して約２倍であり、ＡＬＬデータに基づくＲ係数は更に大きい。

単結晶Ｘ線分析に基づく化合物１のフォームＡの立体配座図を図９及び１０に示す。４つの隣接する分子と４量体クラスタを形成する水素結合ネットワークを介して末端−OH基が結合している（図１０）。もう一方のヒドロキシル基は、隣接する分子からのカルボニル基と水素結合を形成するための水素結合ドナーとして作用する。結晶構造は、本分子の稠密充填結晶構造を示す。化合物１のフォームＡは単斜晶系、C２空間群で、以下の単位胞寸法：ａ＝２１.０９５２（１６）Å、ｂ＝６.６２８７（５）Å、ｃ＝１７.７９１７（１５）Å、β＝９５.８６７（６）°、γ＝９０°を有する。

化合物１のフォームＡの固体状態^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを図１１に示す。表８は関連するピークの化学シフトを表す。

化合物１のフォームＡの固体状態^１９Ｆ ＮＭＲスペクトルを図１２に示す。アスタリスクの付いたピークはスピニングサイドバンドを示す。表９は関連するピークの化学シフトを示す。

化合物１のアモルファス形態の合成

ロータリーエバポレーション法

化合物１のアモルファス形態は、またロータリーエバポレーションによっても得られる。化合物１（約１０ｇ）をＭｅＯＨ１８０ｍＬに溶解させ、５０℃浴で泡状物質を形成するまでロータリーエバポレーションを行った。ＤＳＣ（図１４）及びＸＲＰＤ（図１３）で化合物１のアモルファス形態を確認した。図１５は、この方法により調製した化合物１のアモルファス形態のＴＧＡトレースである。

スプレードライ法

ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート HGグレード（ＨＰＭＣＡＳ−ＨＧ）９.９５ｇをラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）５０ｍｇと共に５００ｍＬビーカーに測り取った。ＭｅＯＨ（２００ ｍｌ）を固体と混合した。物質を４時間攪拌した。最大限の溶解を確実にするために、２時間攪拌後溶液を５分間超音波にかけ、続いてさらに２時間攪拌した。非常に細かいＨＰＭＣＡＳの懸濁液が溶液中に残った。しかし、視覚的な観察によっては、ガム状部分は容器を傾けても容器の壁面に残っておらず、又は底に固まっていなかった。

化合物１のフォームＡ（１０ｇ）を５００ｍＬビーカーに注ぎ、系を継続して攪拌した。溶液を以下のパラメータを用いてスプレードライした：
製剤明細：化合物１のフォームＡ／ＨＰＭＣＡＳ／ＳＬＳ（５０／４９.５／０.５）
ブチミニスプレードライヤー
Ｔ入力口（設定値） １４５℃
Ｔ出力口（開始時） ７５℃
Ｔ出力口（終了時） ５５℃
窒素圧 ７５ｐｓｉ
アスピレータ １００％
ポンプ ３５％
ロタメータ（Rotometer） ４０ｍＭ
フィルタ圧 ６５ｍｂａｒ
コンデンサ温度 −３℃
実行時間 １時間

化合物１のアモルファス形態約１６ｇ（８０％収率）を回収した。化合物１のアモルファス形態をＸＲＰＤ（図１６）及びＤＳＣ（図１７）によって確認した。

化合物１のアモルファス形態の固体状体^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを図１８に示す。表１０は関連するピークの化学シフトを示す。

化合物１のアモルファス形態の固体状態^１９Ｆ ＮＭＲスペクトルを図１９に示す。アスタリスクの付いたピークはスピニングサイドバンドを示す。表１１は関連するピークの化学シフトを示す。

以下の表１２は、化合物１の追加の分析データを示す。

アッセイ

化合物によるΔＦ５０８−ＣＦＴＲ矯正特性の検出及び測定のためのアッセイ

化合物によるΔＦ５０８−ＣＦＴＲ調節特性のアッセイのための膜電位光学法

電位感受性ＦＲＥＴセンサーを利用する光学膜電位アッセイは、ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＴｓｉｅｎにより（Ｇｏｎｚａｌｅｚ, Ｊ. Ｅ. ａｎｄ Ｒ. Ｙ. Ｔｓｉｅｎ （１９９５） ”Ｖｏｌｔａｇｅ ｓｅｎｓｉｎｇ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ” Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ６９（４）：１２７２−８０, ａｎｄ Ｇｏｎｚａｌｅｚ, Ｊ. Ｅ. ａｎｄ Ｒ. Ｙ. Ｔｓｉｅｎ （１９９７） ”Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈａｔ ｕｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ” Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ４（４）：２６９−７７参照）、蛍光変化を測定するための機器、例えば電位／イオンプローブリーダー（ＶＩＰＲ）（Ｓｅｅ, Ｇｏｎｚａｌｅｚ, Ｊ. Ｅ., Ｋ. Ｏａｄｅｓ, ｅｔ ａｌ. （１９９９） ”Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ ａｎｄ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｏｎ−ｃｈａｎｎｅｌ ｔａｒｇｅｔｓ” Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ ４（９）：４３１−４３９参照）と組み合わせて記載されている。

これらの電位感受性アッセイは、膜可溶性、電位感受性色素であるＤｉＳＢＡＣ_２（３）と、原形質膜の外側のリーフレットに結合し、ＦＲＥＴドナーとして働く蛍光リン脂質であるＣＣ２−ＤＭＰＥの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）における変化に基づく。膜電位（Ｖ_ｍ）の変化は、負に帯電したＤｉＳＢＡＣ_２（３）の原形質膜を通す再分配およびそれに応じたＣＣ２−ＤＭＰＥからのエネルギー伝達量の変化をもたらす。蛍光放出の変化は、９６または３８４ウェルマイクロタイタープレート中の細胞をベースにしたスクリーニングを行うために設計された統合された液体ハンドラーおよび蛍光ディテクターであるＶＩＰＲ^{（登録商標）}ＩＩを使用してモニターできる。

１. 矯正化合物の同定

ΔＦ５０８−ＣＦＴＲに関連する輸送欠損を矯正する小分子を同定するために、シングル・アディションＨＴＳアッセイ形態を開発した。細胞を、無血清培地中、１６時間、３７℃で、試験化合物の存在下または非存在下（陰性対照）インキュベートした。陽性対照として、３８４ウェルプレートに播種した細胞を、１６時間、２７℃でインキュベートして、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを「温度補正」した。細胞をその後３回クレブス・リンゲル液で濯ぎ、電位感受性色素を負荷した。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを活性化するために、１０μＭ フォルスコリン、ＣＦＴＲポテンシエータ、ゲニステイン（２０μＭ）を無Ｃｌ⁻培地と共に各ウエルに添加した。無Ｃｌ⁻培地の添加は、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ活性化に応答したＣｌ⁻流出を促進し、得られた膜脱分極をＦＲＥＴベースの電位センサー色素を使用して光学的にモニターした。

２.ポテンシエータ化合物の同定

ΔＦ５０８−ＣＦＴＲポテンシエータ化合物を同定するため、二重付加（double-addition）ＨＴＳアッセイ形式を開発した。最初の付加においては、無Ｃｌ⁻培地を試験化合物あり又はなしで加えた。２２秒後、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを活性化するため、２回目の２−１０μＭフォルスコリン含有無Ｃｌ⁻培地を加えた。両添加後の細胞外Ｃｌ⁻濃度は２８ｍＭであり、それがΔＦ５０８−ＣＦＴＲ活性化に応答してＣｌ⁻流出が促進され、得られた膜脱分極を光学的にＦＲＥＴ−ベース電位センサー色素でモニターした。

３.溶液
浴溶液＃１：（ｍＭ） ＮａＯＨ中、ＮａＣｌ １６０、ＫＣｌ ４.５、ＣａＣｌ_２ ２、ＭｇＣｌ_２ １、ＨＥＰＥＳ １０、ｐＨ７.４
無塩化物浴溶液：浴溶液＃１における塩化物塩をグルコン酸塩に置き換える
ＣＣ２−ＤＭＰＥ：ＤＭＳＯ中で１０ｍＭストック溶液を調製し、−２０℃で保存した
ＤｉＳＢＡＣ_２（３）：ＤＭＳＯ中で１０ｍＭストック溶液を調製し、−２０℃で保存した

４.細胞培養

ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定的に発現するＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞を膜電位の光学的な測定において用いる。細胞を１７５ｃｍ^２培養フラスコで、２ｍＭグルタミン、１０ ％ウシ胎児血清、１ｘＮＥＡＡ、β−ＭＥ、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを添加した、ダルベッコ変法イーグル培地に３７℃、５％CO_２及び湿度９０％で維持した。すべての光学的アッセイにおいて、細胞を、３８４−ウエルマトリゲル−コーティングプレートに３０，０００／ウエルを播種し、３７℃で２時間培養し、続いて２４時間２７℃でポテンシエーターアッセイのために培養した。矯正アッセイについては、細胞は、２７℃又は３７℃で、化合物あり又はなしで１６−２４時間時間培養した。

ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ調節特性を有する化合物の電気生理学的アッセイ

１.ウッシングチャンバーアッセイ

ウッシングチャンバー実験をΔＦ５０８−ＣＦＴＲを発現する分極上皮性細胞で行い、光学アッセイで同定されたΔＦ５０８−ＣＦＴＲモジュレーターをさらに特徴付けした。Ｃｏｓｔａｒ Ｓｎａｐｗｅｌｌ細胞培養インサート上で増殖させたＦＲＴ^{ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ}上皮性細胞をウッシングチャンバー（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ, Ｉｎｃ., Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, ＣＡ）にマウントし、単層を電圧固定法システムを使用して連続的に短絡（ｓｈｏｒｔ−ｃｉｃｕｉｔｅｄ）させた（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ, Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ, ＩＡ及びＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ, Ｉｎｃ., Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, CA）。経上皮性抵抗を２mVパルスの適用により測定した。これらの条件下、ＦＲＴ上皮は４ＫΩ／cm^２またはそれ以上の抵抗を証明した。溶液を２７℃に維持し、空気でバブリングした。電極オフセット電位および流体抵抗性を、無細胞インサートを使用して補正した。これらの条件下、電流は、頂端膜に発現されるΔＦ５０８−ＣＦＴＲを通るＣｌ⁻の流れを反映する。Ｉ_ＳＣをＭＰ１００Ａ−ＣＥインターフェース及びＡｃｑＫｎｏｗｌｅｄｇｅソフトウェア（ｖ３.２.６;ＢＩＯＰＡＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ, Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ, ＣＡ）を使用してデジタルで獲得した。

２.矯正化合物の同定

典型的プロトコルは側底から頂端膜Ｃｌ⁻濃度勾配を使用した。この勾配を設定するために、通常のリンゲルを側底膜に使用し、一方頂端ＮａＣｌを等モル量グルコン酸ナトリウムで置き換えて（ＮａＯＨでｐＨ７.４に滴定）、上皮を通して大きなＣｌ⁻濃度勾配を得た。全実験を無傷の単層で行った。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを完全に活性化するために、フォルスコリン（10μｍ）、ＰＤＥ阻害剤、ＩＢＭＸ（１００μｍ）を適用し、続いてＣＦＴＲポテンシエータ、ゲニステイン（５０μｍ）を添加した。

他の細胞型でも観察される通り、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定に発現するＦＲＴ細胞の低温でのインキュベーションは、原形質膜のＣＦＴＲの機能的密度を増加させる。矯正化合物の活性を決定するために、細胞を１０μMの試験化合物と２４時間、３７℃でインキュベートし、その後３回洗浄して、その後記録した。化合物処理細胞のｃＡＭＰ−およびゲニステイン仲介Ｉ_ＳＣを２７℃および３７℃対照で標準化し、活性パーセントとして示す。細胞の矯正化合物との前インキュベーションは、３７℃対照と比較して、ｃＡＭＰ−およびゲニステイン仲介Ｉ_ＳＣを顕著に増加させた。

３.ポテンシエータ化合物の同定

典型的プロトコルは側底から頂端膜Ｃｌ⁻濃度勾配を使用した。この勾配を設定するために、通常のリンゲルを側底膜に使用し、ニスタチン（３６０μg／ｍｌ）で透過処理し、一方頂端ＮａＣｌを等モル量グルコン酸ナトリウムで置き換えて（ＮａＯＨでｐＨ７.４に滴定）、上皮を通して大きなＣｌ⁻濃度勾配を得た。全実験をニスタチン透過処理３０分後に行った。フォルスコリン（10μｍ）及び全試験化合物を細胞培養インサートの両側に添加した。推定ΔＦ５０８−ＣＦＴＲポテンシエータの効果を、既知ポテンシエータ、ゲニステインと比較した。

４.溶液
基底外側溶液（mM）：ＮａＣｌ（１３５）、ＣａＣｌ_２（１．２）、ＭｇＣｌ_２（１．２）、Ｋ_２ＨＰＯ_４（２．４）、ＫＨＰＯ_４（０．６）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（１０）、およびデキストロース（１０）。溶液をＮａＯＨでｐＨ７.４に滴定。
頂端溶液（mM）：ＮａＣｌをグルコン酸Ｎａ（１３５）で置き換えた以外側底溶液と同一。

５.細胞培養

ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを発現するフィッシャーラット上皮性（ＦＲＴ）細胞（ＦＲＴ^{ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ}）を、我々の光学アッセイで同定した推定ΔＦ５０８−ＣＦＴＲモジュレーターのウッシングチャンバー実験に使用した。細胞をＣｏｓｔａｒ Ｓｎａｐｗｅｌｌ細胞培養インサートで培養し、５日間、３７℃および５％ＣＯ_２で５％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ml ペニシリン、および１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン添加クーン変法ハムＦ−12培地で培養した。化合物のポテンシエータ活性の特徴付けに使用する前に、細胞を２７℃で１６−４８時間培養して、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを補正した。矯正化合物の活性を決定するために、細胞を２７℃又は３７℃で、化合物有りまたは無しで２４時間インキュベートした。

６.全細胞記録
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定に発現する、温度および試験化合物補正したＮＩＨ３Ｔ３細胞における巨視的ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ電流（Ｉ_{ΔＦ５０８}）を、有孔パッチ、全細胞記録を使用してモニターした。簡単に言うと、Ｉ_{ΔＦ５０８}の電位固定記録を、室温で、Ａｘｏｐａｔｃｈ 200Ｂパッチクランプ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ., Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ, ＣＡ）を使用して行った。全記録を１０kHzのサンプリング周波数で獲得し、１ｋＨｚで低域フィルタ処理した。ピペットは、細胞内溶液で満たしたとき５−６MΩの抵抗性を有した。これらの記録条件下、計算したＣｌ⁻（ＥＣｌ）の逆転電位は室温で−２８mVであった。全記録は、シール抵抗性＞２０GΩおよびシリーズ抵抗性＜１５MΩを有した。パルス発生、データ獲得、および分析を、Ｃｌａｍｐｅｘ ８（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ.）と関連したＤｉｇｉｄａｔａ １３２０ A/Dインターフェースを備えたＰＣを使用して行った。浴は＜２５０μｌの食塩水を含み、無重力駆動灌流系を使用して２ml／分の速度で連続的に灌流した。

７.矯正化合物の同定

原形質膜における機能的ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの密度を増加させる矯正化合物の活性を決定するために、我々は、上記の有孔パッチ記録技術を使用して、矯正化合物で２４時間処理後の電流密度を測定した。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを完全に活性化するために、１０μM フォルスコリンおよび２０μM ゲニステインを細胞に添加した。我々の記録条件下で、２７℃で２４時間インキュベーション後の電流密度は、３７℃で２４時間インキュベーション後に見られるより高かった。これらの結果は、低温インキュベーションの原形質膜におけるΔＦ５０８−ＣＦＴＲの密度に対する既知の効果と一致する。矯正化合物のＣＦＴＲ電流密度に対する効果を決定するために、細胞を１０μMの試験化合物と２４時間、３７℃でインキュベートし、電流密度を２７℃および３７℃対照（％活性）と比較した。記録の前に、細胞を３回細胞外記録培地で洗浄し、何らかの残った試験化合物を除いた。１０μMの矯正化合物とのプレインキュベーションは、３７℃対照と比較して、顕著にｃＡＭＰ−およびゲニステイン依存性電流を増加させた。

８.ポテンシエータ化合物の同定

ΔＦ５０８−ＣＦＴＲポテンシエータが、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞における巨視的ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ Ｃｌ⁻電流（Ｉ_{ΔＦ５０８}）を増加させる能力を、有孔−パッチ−記録技術を使用して試験した。光学アッセイにより同定されたポテンシエータは、光学アッセイにおいて見られたのと同様の強度および効果で、Ｉ_{ΔＦ５０８}の増加を用量依存性に惹起した。試験した全細胞において、ポテンシエータ適用前および適用中の逆転電位は約−３０ｍＶであり、それは計算したＥ_Ｃｌ（−２８ｍＶ）である。

９.溶液
細胞内溶液（ｍＭ）：Ｃｓ−アスパルテート（９０）、ＣｓＣｌ（５０）、ＭｇＣｌ２（１）、ＨＥＰＥＳ（１０）、及び２４０μｇ／ｍｌ アンホテリシン−Ｂ（ＣｓＯＨで７.３５にｐＨ調節）。
細胞外溶液（ｍＭ）：Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＤＧ）−Ｃｌ（１５０）、ＭｇＣｌ_２（２）、ＣａＣｌ_２（２）、ＨＥＰＥＳ（１０）（ＨＣｌで７．３５にｐＨ調節）。

１０.細胞培養

ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞を全細胞記録に使用する。細胞を３７℃で５％ＣＯ_２および９０％湿度に、２ｍＭ グルタミン、１０％ウシ胎児血清、１×ＮＥＡＡ、β−ＭＥ、１×ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを補ったダルベッコ改変イーグル培地中、１７５cm^２培養フラスコで維持する。全細胞記録のために、２,５００−５,０００細胞をポリ−Ｌ−リシン被覆ガラスカバースリップに播種し、２４−４８時間、２７℃で培養し、その後ポテンシエータの活性の試験に使用し；そして矯正化合物有りまたは無しで３７℃でコレクターの活性を測定する。

１１.単一チャネル記録

ＮＩＨ３Ｔ３細胞において安定に発現される温度補正ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの一チャネル活性およびポテンシエータ化合物の活性を、切断した裏返し膜パッチを使用して観察した。簡単に言うと、一チャネル活性の電位固定記録を、室温で、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂパッチクランプ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ.）を使用して行った。全記録を１０ｋＨｚのサンプリング周波数で獲得し、４００Hzで低域フィルタ処理した。パッチピペットをＣｏｒｎｉｎｇ Ｋｏｖａｒ Ｓｅａｌｉｎｇ ＃７０５２グラス（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ, Ｉｎｃ., Ｓａｒａｓｏｔａ, ＦＬ）から製造し、細胞外溶液で満たしたとき５−８MΩの抵抗性を有した。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを切除後、１ｍＭ Ｍｇ−ＡＴＰ、および７５ｎＭのｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ、触媒サブユニット（PKA；Promega Ｃｏｒｐ. Ｍａｄｉｓｏｎ, ＷＩ）の添加により活性化した。チャネル活性が安定した後、パッチを無重力駆動微小灌流系を使用して灌流した。流入をパッチに隣接して置き、１−２秒以内での完全な溶液交換をもたらした。急速な灌流中ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ活性を維持するために、非特異的ホスファターゼ阻害剤Ｆ⁻（１０ｍＭ ＮａＦ）を浴溶液に添加した。これらの記録条件下、チャネル活性は、パッチ記録の間（６０分まで）一定のままであった。細胞内から細胞外溶液への正電荷の移動により生じた電流（アニオンは逆方向に移動）を正電流として示す。ピペット電位（Ｖ_ｐ）は８０ｍＶに維持した。

チャネル活性を、≦２活性チャネルを含む膜パッチから分析した。同時開放する最大数が、実験中のチャネルの活性の数を決定した。一チャネル電流振幅を決定するために、１２０秒のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ活性を記録したデータを「オフライン」で１００Ｈｚでフィルタし、次いでＢｉｏ−Ｐａｔｃｈ分析ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｌｏｇｉｃ Ｃｏｍｐ. Ｆｒａｎｃｅ）を使用してマルチガウス関数で適合させた全点振幅ヒストグラムの構築に使用した。全顕微鏡的電流および開放可能性（Ｐ_ｏ）を１２０秒のチャネル活性から計算した。Ｐ_ｏをＢｉｏ−Ｐａｔｃｈソフトウェアを使用して、またはＰ_ｏ＝Ｉ／ｉ（Ｎ）（ここで、Ｉ＝平均電流、ｉ＝一チャネル電流振幅、およびＮ＝パッチ中の活性チャネル数）の相関から決定した。

１２.溶液
細胞外溶液（ｍＭ）：ＮＭＤＧ（１５０）、アスパラギン酸（１５０）、ＣａＣｌ２（５）、ＭｇＣｌ２（２）、及びＨＥＰＥＳ（１０）（トリス塩基でｐＨ７．３５に調整）。細胞内溶液（ｍＭ）：ＮＭＤＧ−Ｃｌ（１５０）、ＭｇＣｌ２（２）、ＥＧＴＡ（５）、ＴＥＳ（１０）、及びトリス塩基（１４）（ＨＣｌでｐＨ７.３５に調整）。

１３.細胞培養

ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞を、切除−膜パッチ−クランプ記録に使用する。細胞を３７℃で、５％ＣＯ_２および９０％湿度に、２mM グルタミン、１０％ウシ胎児血清、１×ＮＥＡＡ、β−ＭＥ、１×ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、および２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを補ったダルベッコ改変イーグル培地で１７５ｃｍ^２培養フラスコ中維持する。一チャネル記録のために、２,５００−５,０００細胞をポリ−Ｌ−リシン被覆カバーガラスに播種し、２４−４８時間、２７℃培養して、その後使用する。

上述の方法を用い、化合物１の活性、すなわち、ＥＣ５０を測定し表１３に示す。

Claims (1)

1. 下記式：
   で示される化合物、またはその塩。