JP5827784B2 - ビタミンｋ２を含む医薬及び栄養補助製品 - Google Patents

Description

本発明は、とりわけ、多価不飽和脂肪酸、魚油、及びオキアミ油のうちの１つ又は複数と組み合わせて、ビタミンＫ_２又はビタミンＫ_２クラスの化合物内の一化合物を含む医薬及び栄養補助製品、並びに骨、軟骨、及び心血管系に関連した障害の治療又は予防におけるそれらの使用に関する。詳細には、本発明は、骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化症、及び骨関節炎の治療及び／又は予防におけるそのような製品の使用にも関する。

ビタミンＫ_２
ビタミンＫ_２は、メナキノン（「ＭＫ」）と呼ばれる化合物の一群であり、これらはすべて、以下の構造式、すなわち、

を有する２−メチル−３−ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ポリプレニル化−１，４−ナフトキノンである。

様々なＭＫ相互の化学的相違は、側鎖におけるイソプレン単位の数に関するものである。様々なＭＫが、通常、ＭＫ−２、ＭＫ−３、ＭＫ−４、ＭＫ−６（以下略）と呼ばれる。数字はイソプレン単位の数（ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝６、．．．）を意味する。

ビタミンＫ_２という用語は、様々なＭＫ物質の、天然に存在する混合物を指す。ＭＫ−２からＭＫ−１３までは、動物及びヒト組織内に天然に存在している。ビタミンＫ_２の食物性供給源は、典型的には発酵食品であり、特筆するべきものは、チーズ及びカードチーズである。ある種のヒラメ及びウナギも、なんらかのビタミンＫ_２を含有していることがある。「納豆」は、発酵したダイズから産生され、日本では、「健康食品」として、人気のあるビタミンＫ_２の供給源となっている。ビタミンＫ_２の１日当たりの摂取量は、広範囲にわたって相違している可能性があり、通常は、数μｇから数ミリグラムまででありえ、概ね５０μｇ未満である。ビタミンＫ_２は、主として心血管系及び骨代謝に関連したヒト健康にいくつかの有益な作用を有することが主張されている。

骨粗鬆症
骨粗鬆症は、骨量の低減及び骨の微細構造の変化を特徴とする医学的状態である。世界中で２億人を超える女性が骨粗鬆症を有すると推定されている。骨粗鬆症及び骨粗鬆症性骨折は、主として高齢者人口の急速な増大の結果として、世界中で増加している。骨粗鬆症の治療には、現在、典型的なホルモン療法、カルシウム及びビタミンＤの摂取、並びにビスホスホネートを用いた薬物治療が含まれる。

アテローム性硬化症
アテローム性硬化症は、腕及び脚に加えて、脳、心臓、及び腎臓を含めたいくつかの重要臓器の動脈に影響を与えうる心臓血管疾患である。ほとんどの西側諸国では、アテローム性硬化症が主要死亡原因となっている。アテローム性硬化症による死亡の数は、すべての癌疾患による死亡を併せた数の約２倍である。アテローム性硬化症は、小児期ほどの早期に開始しうる緩徐に進行する疾患である。アテローム性硬化症では、動脈がそれらの弾性を失い、硬化する。この疾患の発症及び進行に関連した状態がいくつかあり、それらには、肥満、糖尿病、高血圧症、及び喫煙などの危険因子が含まれる。厳密に医学的に言えば、通常、アテローム性動脈硬化症は動脈内膜の炎症性疾患と定義されるが、動脈硬化症は、より広く定義され、中膜メンケベルク硬化症などの血管疾患の他の形態も含む。

関節症及び関節炎
関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、及び骨関節炎は、軟骨の疾患であり、それらは関節の変性を特徴とする。病理学的には、軟骨構造の変化がある。これらの疾患は関節で発症し、しばしば、Ｘ線によってこれらの疾患を容易に診断できる。これらの疾患の治療には、今日、いくつかのタイプの薬物が使用されている。これらには、単純な鎮痛剤、ＮＳＡＩＤ、ＣＯＸ２阻害薬、コルチコステロイド、及びグルコサミンが含まれる。

骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化症、関節症、及び関節炎へのビタミンＫの影響
最近何年かの間に、いくつかの刊行物が、骨粗鬆症へのビタミンＫ_２摂取の正の効果について記載している。例えば、Ｗ．Ｓａｋａｍｏｔｏら、Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １６，１６０４−１６１０（２００５年）；Ｍ．Ｋａｎｅｋｉ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｌｃｉｕｍ １５，６０５−６１０（２００５年）；Ｊ．Ｉｗａｍｏｔｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ １０，２５５７−２５７６（２００４年）；Ｋ．Ｎａｋａｙａｍａ、Ｈｏｒｕｍｏｎ ｔｏ Ｒｉｎｓｈｏ ５２，３３９−３４９（２００４年）；Ｓ．Ｓｈｉｏｍｉら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９７，９７８−９８１（２００２年）及びＴ．Ｈｏｓｏｉ、Ｂｏｎｅ（Ｏｓａｋａ） １４，９５−９７（２０００年）を参照されたい。

アテローム性動脈硬化又は同様な状態を治療するためのビタミンＫ_２又は納豆の使用に関するいくつかの刊行物がある。例えば、Ｙ．Ｏｚａｗａ、Ｇｉｆｕ Ｄａｉｇａｋｕ Ｉｇａｋｕｂｕ ５０，２０−２６（２００２年）；Ｌ．Ｊ．Ｓｃｈｕｒｇｅｒｓら、Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ｆｕｒ Ｋａｒｄｉｏｌｏｇｉｅ ９０（Ｓｕｐｐｌ．３），ｉｉｉ５７−ｉｉｉ６３（２００１年）；Ｙ．Ｓｅｙａｍａ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｌｃｉｕｍ ９，８７３−８７８（１９９９年）；Ｈ．Ｋａｗａｓｈｉｍａら、Ｊａｐ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ７５，１３５−１４３（１９９７年）及びＪ．Ｍ．Ｇｅｌｅｉｊｎｓｅら、ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ １３４，３１００−３１０５（２００４年）を参照されたい。

最近の論文において、Ｔ．Ｎｅｏｑｉら（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ５４，１２５５−１２６１（２００６年））は、血清ビタミンＫの低レベル状態が骨関節炎の罹患率の増加と関連していると報告した。

魚油、オキアミ油、及びｎ−３ ＰＵＦＡ
多価不飽和脂肪酸、別名ＰＵＦＡは、２つ以上の二重結合を含有する長鎖脂肪酸である。治療への応用、並びに食物的及び栄養的適用におけるそれらの可能性から、それらへの関心が生じている。それらは、動物、植物、藻類、真菌類、及び細菌類に存在し、膜、貯蔵油、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、及びリポタンパク質などの多くの脂質化合物で広範に見出される。それらは、選択された種子植物、及び一部の海産物供給源から商業的に生産されている。

ＰＵＦＡは、末端二重結合の位置が、その脂肪酸鎖の末端炭素原子から３Ｃであるか、又は６Ｃであるかに基づいて二系列に分類される。以下に一部の例を示す。オメガ−３又は（ｎ−３） ＰＵＦＡとも呼ばれるｎ−３系列ＰＵＦＡには、魚油及びオキアミ油などのオメガ−３脂肪酸に富んだ食用油、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、リノレン酸（ＬＡ）、並びにα−リノレン酸（ＡＬＡ）が含まれる。ｎ−６系列ＰＵＦＡには、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）及びアラキドン酸（ＡＡ）が含まれる。

オキアミは、北極域及び南極域に生息しているエビのような海洋動物の一群である。オキアミのサイズは、通常５から５０ｍｍの間である。数種のオキアミが存在する。北極種には、Ｔ．イナーミス（Ｔ．ｉｎｅｒｍｉｓ）、Ｔ．ラッシイ（Ｔ．ｒａｓｈｉｉ）、Ｔ．ロンギカウダ（Ｔ．ｌｏｎｇｉｃａｕｄａ）、及びＭ．ノルベジア（Ｍ．ｎｏｒｖｅｇｉａ）が含まれ、一方、南極種には、ナンキョクオキアミ（Ｅ．ｓｕｐｅｒｂａ）及びコオリオキアミ（Ｅ．ｃｒｙｓｔａｌｌｏｒｏｐｈｉａｓ）が含まれる。オキアミ及びオキアミ関連製品は、魚用の餌の成分として提案されている。例えば、韓国特許第２００５０３１３１９号、同第２００４０８７６１８号、特開２００３−０７０４２６号、米国特許第６１５３２５１号、欧州特許第７２９７０８号、ソビエト特許第１７８４１５２号、特開平０５−０３０９２３号、ＪＰ０４６５４５４号、及び特開昭６１−２７４６５３号を参照されたい。

さらに、オキアミ及びオキアミベースの製品は、魚の釣り餌（ｆｉｓｈ ｂａｉｔ）として（例えば中国特許第１８２０６２６号を参照）、共役リノール酸と併用して、疾患を治療及び予防するために（米国特許出願公開第２００６０７８６２５号）、脂質の酸化を抑制するための添加物として（国際公開第２００５０７５６１３号）、肥料として（中国特許第１５０２５８９号）として、食品中で（特開２００４−０６５１５２号及び国際公開第２００３／００３８５７号）、心臓血管疾患、関節炎、皮膚癌、糖尿病、及び月経前症候群を治療するために（国際公開第２００２／１０２３９４号）、ざ瘡及び他の疾患を治療するための酵素の供給源として（米国特許第５９５８４０６号、同第５９４５１０２号、同第６０３０６１２号、国際公開第９６／２４３７１号、及び国際公開第９３／２４１４２号）、並びに多機能性酵素の供給源として（米国特許第６０３０６１２号）使用される。オキアミ酵素は、さらに、血栓症治療に用いること（国際公開第９５／３３４７１号）、及び歯科使用向け組成物を製造するための使用（国際公開第９５／３３４７０号）が提案されている。

オキアミ又はオキアミベースの産物は、殺菌剤として（特開平０７−０３３６１９）、及び抗糖尿病薬として（ＪＰ０４０４２３６９）も提案されており、オキアミ由来のタンパク質は、健康食品の製造用（特開平０１−１３７９５２）に提案されている。オキアミ及びオキアミ成分に関する他の特許文献は以下の通りである。すなわち、オキアミ脂肪酸を含む歯磨き剤（日本特許第２５６８８３３号）、クリルから抽出されたプロテアーゼを含有する皮膚洗浄用化粧品（特開昭６３−２１８６１０）、クリル由来の抗炎症性プロテイナーゼ（特開昭６１−０６８４１９）、血栓溶解剤（欧州特許第１７０１１５号）、消化促進剤としての酵素組成物（国際公開第８５／０４８０９号）、キチン調製物（ポーランド国特許第１１４３８７号）、カロテノイド調製物（ポーランド国特許第１１３３２８号）、カニ肉様食品（特開昭５７−１２５６７７、特開昭５７−０７９８６３、及び特開昭６７−０５０８４８）、降圧剤（特開昭５４−１１９０１１）、及びオキアミベースの食品（特開昭６０−０４６９４７号、特開昭６１−０２３９８７号、及び特開昭５５−０４０２１８号）である。

オキアミの総脂質含有量は種によって異なる。年間を通した総脂質含有量の変動もある。オキアミの脂質組成も、各種ごとに年間を通して変動する。オキアミの総脂質は、通常５から６０％の間である。オキアミの総脂質における総トリグリセリン及びワックスエステルのパーセントは、それぞれほぼゼロから７０％まで、広範にわたって変動しうる。トリグリセリン及びワックスエステルに加えて、オキアミ脂質、以下ではオキアミ油は、リン脂質、ステロール、遊離脂肪酸、及び脂肪族アルコールを含む。典型的なリン脂質には、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンのような化合物が含まれる。オキアミ油は、オキアミから得られた未精製油の形態にも、精製油又は加工油の形態にもなりうる。不飽和化合物及び多価不飽和化合物は、オキアミ油中の脂肪族化合物における大きい部分を形成している。オキアミ油中の主な脂肪酸成分は、以下の脂肪酸、すなわち、１４：０、１６：０、１６：１（ｎ−７）、１８：０、１８：１、１８：１（ｎ−９）、１８：１（ｎ−７）、１８：２ １５（ｎ−６）、１８：３（ｎ−３）、１８：４（ｎ−３）、２０：１（ｎ−９）、２０：５（ｎ−３）、２２：１（ｎ−１１）、２２：６（ｎ−３）である。

オキアミ油の組成に関する参照には、例えば、Ｓ．Ｆａｌｋ−Ｐｅｒｄｅｒｓｅｎら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｆｉｓｈ Ａｑｕａｔ．Ｓｃｉ．５７（Ｓｕｐｐｌ．３）１７８−１９１（２０００年）、Ｆ．Ａｌｏｎｚｏら、Ｍａｒｉｎｅ Ｅｃｏｌｏｇｙ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｓｅｒｉｅｓ ２９６，６５−７９（２００５年）、Ｎ．Ｋｕｓｕｍｏｔｏら、Ｊ．Ｏｌｅｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５３，４５−５１（２００４年）、及び本明細書中の参考文献を参照されたい。

骨粗鬆症及び心臓血管疾患を治療するための医薬製品がいくつか市販されているが、代替アプローチの緊急な必要性がまだ存在している。

驚いたことに、いまや、ビタミンＫ_２及び多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を、長期の貯蔵期限を有する安定した製剤中に共に処方できることが見出されている。

したがって、第１の態様では、本発明は、精製されているか、又は魚油若しくはオキアミ油の形態にある少なくとも１つのＰＵＦＡと組み合わせて、ビタミンＫ_２又はビタミンＫ_２クラスの化合物（ＭＫ）内の少なくとも１つの化合物を含む医薬又は栄養補助製品を提供する。

ビタミンＫ_２、とりわけＭＫ−７は、海産物油又はｎ−３ ＰＵＦＡの抗凝固作用を打ち消さないことも見出された。

より高分子のメナキノン、とりわけＭＫ−７及びそれより高分子のものは、海産物油の潜在的動脈石灰化誘導作用を打ち消すことがさらに見出された。

より高分子のメナキノン、とりわけＭＫ−７及びそれより高分子のものは、骨の健康への海産物油の潜在的に否定的な側面を打ち消すことがさらに見出された。

より高分子のメナキノン、とりわけＭＫ−７及びそれより高分子のものは、軟骨の健康への海産物油の潜在的に否定的な側面を打ち消すことがさらに見出された。

ＭＫ−７が他のＫ群ビタミンより良好に摂取されることが細胞培養研究でさらに見出された。ＭＫ−８及びＭＫ−９は、それよりいくらか少ないが、匹敵するレベルで摂取され、一方、ＭＫ−４及びビタミンＫ_１は、はるかに低い程度までしか摂取されない。

長鎖メナキノン、とりわけＭＫ−８及びＭＫ−９は、他の形態のビタミンＫより、経口抗凝固薬治療を妨げる可能性が小さいことが細胞培養研究でさらに見出された。

したがって、第２の態様では、本発明は、ヒト及び動物の心臓血管の健康、骨の健康、及び軟骨の健康のうちの少なくとも１つを増進するための、好ましくは、精製されているか、又は魚油若しくはオキアミ油の形態にある少なくとも１つのＰＵＦＡと組み合わせて、ＭＫ−７、ＭＫ−８、ＭＫ−９、及びＭＫ−１０のうちの少なくとも１つを含む医薬又は栄養補助製品を提供する。

第３の態様では、本発明は、ヒト及び動物の心臓血管の健康、骨の健康、及び軟骨の健康のうちの少なくとも１つを増進するための、好ましくは、精製されているか、又は魚油若しくはオキアミ油の形態にある少なくとも１つのＰＵＦＡと組み合わせた、ＭＫ−７、ＭＫ−８、ＭＫ−９、及びＭＫ−１０のうちの少なくとも１つの使用を提供する。前記使用の典型的かつ好ましい例は、心臓血管関連、骨関連、及び軟骨関連の疾患又は障害の１つを予防又は治療するための薬物を調製するための使用である。上記薬物は、単独の薬物として提供しても、キットとして提供してもよい。

第４の態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、骨粗鬆症、骨関節炎、又は軟骨の炎症性疾患若しくは変性疾患のうちの少なくとも１つの予防又は治療の方法であって、上記に定義された医薬若しくは栄養補助製品又は薬物をヒト又は動物に投与するステップを含む方法を提供する。

第５の態様では、本発明は、魚油、オキアミ油、及びＰＵＦＡを含有する食品及び食品栄養補助剤の負の側面を打ち消し、それによって前記海産物油及びＰＵＦＡの、公衆衛生に有益な側面を強化することに関する。

第６の態様では、本発明は、ビタミンＫ_２又はビタミンＫ_２クラスの化合物（ＭＫ）内の一化合物と、精製されているか、又は魚油若しくはオキアミ油の形態にある少なくとも１つのＰＵＦＡとを含むキットを提供する。

本発明の好ましい実施形態では、ＰＵＦＡは、本明細書で使用される場合、オメガ−３ ＰＵＦＡ、例えば、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である。

本発明のこれらの態様及び他の態様について、以下の詳細な説明及び実施例で、より詳細に論じる。

凝固中の総トロンビン活性を反映する内因性トロンビン産生能（ＥＴＰ）を示す図である。プールされた正常血漿を参照として用い、高次構造特異的抗体に基づいたサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、カルボキシ化及び非カルボキシ化マトリックスＧｌａ−タンパク質（ＭＧＰ）分子種をモニターした。ＭＧＰカルボキシ化の変化は、１カ月後に有意であったが、３及び４カ月目の間には有意性が失われていた。下記実験２を参照されたい。 図１と同じ実験で、高次構造特異的なオステオカルシンキットを用いた、血清中のカルボキシ化及び非カルボキシ化オステオカルシン分子種を示す図である。オステオカルシンカルボキシ化の変化は、１カ月後に有意であったが、３及び４カ月目の間には有意性が失われていた。下記実験３を参照されたい。 魚油及びオキアミ油中に溶解したＭＫ−７の非常に優れた安定性を示す図である。試料を、密封されたガラスビン内に調製し、それぞれ室温、４０℃及び１００℃で暗所に保持した。規則的な時点に、試料を採取し、それらのＭＫ−７含有量を分析した。１００℃で２週間の後でさえ、ＭＫ−７の減失は観察されなかった。下記実験４を参照されたい。 細胞が存在しない３種の細胞培地（それぞれ、下記の３種の異なった細胞型を増殖させるのに使用した培地）中におけるビタミンＫ_１、ＭＫ−４、ＭＫ−７、ＭＫ−８、及びＭＫ−９の安定性を示す図である。下記実験５を参照されたい。 図５Ａ−Ｃは、３種の異なった細胞型における細胞性ビタミンＫ摂取の用量反応曲線を示す。細胞を８０％集密状態まで培養し、その後、ビタミンＫ（すなわち、Ｋ_１、ＭＫ−４、ＭＫ−７、ＭＫ−８、及びＭＫ−９）を様々な濃度で添加した。図５Ｄは、３種の細胞型におけるＭＫ−７摂取のプロットを同じスケールで示す。下記実験６を参照されたい。 図６Ａ−Ｃは、３種の異なった細胞型におけるビタミンＫ_１、ＭＫ−４、ＭＫ−７、ＭＫ−８、及びＭＫ−９の細胞内摂取を時間の関数として示す。細胞は、実験５に記載の培地中で培養した。すべての場合で、細胞が８０％集密状態に増殖した後に、これらのＫ群ビタミンの混合物を細胞に添加した。下記実験７を参照されたい。 図７Ａ−Ｃは、（Ｋエポキシド形成によって測定される）様々な形態のビタミンＫによって、ワルファリンの作用が迂回される程度を示す。より多くのＫＯが形成されるほど、ＤＴ−ジアホラーゼ酵素を介した迂回の程度が高い。実験８を参照されたい。 図８Ａ−Ｃは、ワルファリンの非存在下、但し細胞飢餓条件下で、様々な形態のビタミンＫが利用される程度を示す。再生されるビタミンＫ分子が少なくなる下記実験９を参照されたい。

定義
「多価不飽和脂肪酸」という用語は、本明細書で使用される場合、多価不飽和脂肪酸のトリグリセリド、生理的に許容できるエステル、遊離脂肪酸、又は生理的に許容できる塩の形態にあるいかなる多価不飽和脂肪酸も指す。より詳細には、この用語は、オメガ−３脂肪酸、並びに魚油及びオキアミ油などのオメガ−３脂肪性酸性に富んだ食用油を指すのに使用される。文献中では、オメガ−３脂肪酸は、（ｎ−３）多価不飽和脂肪酸又はｎ−３ ＰＵＦＡとして知られている。

本明細書で使用される場合、「オキアミ油」という用語は、オキアミにおけるすべての親油性成分を示すことが意図されており、未精製のオキアミ油、精製されたオキアミ油、オキアミ油由来の化合物、及びオキアミ油由来の成分の誘導体でありうる。

本明細書で使用される場合、魚油及びオキアミ油は、集合的に「海産物油」と呼ばれる。

「ビタミンＫ_２」という用語は、本明細書で使用される場合、天然存在のメナキノン（ＭＫ）又はそれらの混合物を指す。

「ビタミンＫ_２クラスの化合物のうちの一化合物」という用語は、本明細書で使用される場合、単一のメナキノン（ＭＫ）化合物を指す。

本明細書で使用される場合、「主としてＭＫ−７」という用語は、ＨＰＬＣ分析に従って、その組成物の全ビタミンＫ_２化合物のうち少なくとも９０％がＭＫ−７である組成物を指す。

発明の詳細な説明
本発明は、ビタミンＫ_２の薬理特性、及びとりわけ、より高分子のメナキノン（ＭＫ−７、ＭＫ−８、ＭＫ−９、及びＭＫ−１０）、並びに純粋な形態、又は魚油若しくはオキアミ油の形態にあるＰＵＦＡとのこれらの化合物の組み合わせに対する徹底的な研究における驚くべき特定の新知見に主として基づいている。これらの新知見は、特定の心臓血管関連、骨関連、及び軟骨関連の障害の予防又は治療に関する、医薬及び栄養補助食品分野の改善された製品についての新規な可能性及び課題を提供し、さらに、一般的に、ヒト及び動物の健康への有益な効果をもたらす。

これらの新知見について、以下に、より詳細に論じる。

魚油、オキアミ油、及びｎ−３ ＰＵＦＡの健康効果
心臓血管疾患への顕著な有益な効果を含めた、ｎ−３ ＰＵＦＡに関するいくつかの健康的側面が報告されている。Ｖａｎ Ｓｃｈｏｏｎｂｅｅｋら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ １３３，６５７−６６０（２００３年））によって概説されているように、ｎ−３ ＰＵＦＡ及び海産物油の有益な効果は、血小板活性の低減、より好ましい血液脂質プロフィール、及び血液凝固性の低減を含めた複数の機構に基づいている。

海産物油及びｎ−３ ＰＵＦＡの血液凝固低下効果は、主として、肝臓のビタミンＫ状態が低下し、同時にビタミンＫ依存性の第ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、及びＸ凝固因子が減少して、トロンビン産生能の低減がもたらされる結果と考えられる。Ｃ．Ｍ．Ａ．Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｙｓらは、「ｎ−６ではなく、ｎ−３ ＰＵＦＡの長期投与は、アンチトロンビンＩＩＩによるトロンビン不活性化は不変のまま、ビタミンＫ依存性のトロンビン産生能の低減を介して、血漿の凝固低下状態をもたらしうる」と結論した。ビタミンＫ依存性凝固因子合成の特異的阻害も、Ｃ．Ｌｅｒａｙら（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２，４５９−４６３（２００１年））によって報告された。これは、一部の食用油はヒトボランティアにおけるビタミンＫの吸収及び代謝を妨げうるというＬ．Ｊ．Ｓｃｈｕｒｇｅｒｓら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３，８７８−８８４（２００２年）の観察と一致している。ビタミンＫ代謝の妨害に関する直接的証明は、魚油及びｎ−３ ＰＵＦＡが肝臓（すなわち凝固因子が合成される場所）のビタミンＫレベルを減少させたことを示したＣ．Ｍ．Ａ．Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｙｓら（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０４，１３７−１４７（２００１年））によって与えられた。さらに、Ｍ．Ａｎｄｒｉａｍａｍｐａｎｄｒｙら（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３２１，４１５−４２１（１９９８年））は、魚油の穏やかな抗凝固効果がビタミンＫ_１摂取のわずかな増大によって完全に反転されたことを実証した。

驚いたことに、いまや、ビタミンＫ_２（顕著にはＭＫ−７）が魚油の有益な効果を反転させないことが見出されている。通常、１から１０μｇ／日の用量では、ＭＫ−７は、外因性トロンビン産生能（ＥＴＰ）に影響を与えなかった。ＥＴＰは、血栓症リスクの最も高感度な尺度である。したがって、ｎ−３ ＰＵＦＡ又は海産物油とビタミンＫ_２との混合物は、両方の種類の化合物の有益な効果を複合する。また、それらは、動物モデル及びヒトボランティアで相乗効果さえ示した。１日当たりの１００μｇ ＭＫ−７以上の用量では、海産物油のＥＴＰ低下効果が完全に反転された。ＭＫ−７のこれらの用量は１日当たり５グラムの海産物油摂取と結びついていることに留意するべきである。魚油又はオキアミ油の消費がさらに多い場合にも、ＥＴＰの妨害に必要な用量はさらに高い。

心臓血管の健康
ビタミンＫ状態が乏しいことは、穏やかな抗凝固（すなわち抗血栓）効果を有しうるが、ビタミンＫは血管の健康の別の側面で必要である。マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）は、動脈血管壁で合成されるビタミンＫ依存性のタンパク質である。それは、ビタミンＫ依存性のカルボキシ化によって活性化され、そのカルボキシ化形態で、血管石灰化の強力な阻害剤として働く。アテローム性動脈硬化及び血管石灰化は血管壁のビタミンＫ状態が乏しいことと密接に関連していることがＳｃｈｕｒｇｅｒｓら（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５，１６２９−１６３３（２００５年））によって、高次構造特異的抗体を用いて実証された。また、前向き臨床試験において、Ｌ．Ａ．Ｊ．Ｌ．Ｍ．Ｂｒａａｍら（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ＆Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ９１，３７３−３８０（２００４年））は、高用量のビタミンＫ栄養補助（１ｍｇ／日）が、血管弾性について主要な利点を有することを見出した。本発明者らは、海産物油及びｎ−３ ＰＵＦＡが肝臓におけるビタミンＫ依存性タンパク質（凝固因子）の産生を好ましく低減するだけでなく、肝外組織のビタミンＫ状態も低減し、それゆえ、オステオカルシン及びマトリックスＧｌａ−タンパク質（ＭＧＰ）を含めた、肝外のビタミンＫ依存性タンパク質の活性化（グルタミン酸カルボキシ化による）も低減することを見出した。これは、心臓血管の健康、骨の健康、及び軟骨疾患発生への潜在的な有害転帰をもたらす、海産物油及びｎ−３ ＰＵＦＡの好ましくない副作用である。血管石灰化阻害剤であるＭＧＰのカルボキシ化の低減は、例えば、血管石灰化、高血圧症、心筋梗塞、及び心臓血管死の主要な危険因子である。

驚いたことに、いまや、より高分子のメナキノン、顕著にはＭＫ−７が、１から１０μｇ／日の間の用量で、海産物油の穏やかな抗凝固効果（ＥＴＰによって測定される）を打ち消さないが、同時にそれらは、ＭＧＰカルボキシ化を、海産物油を用いていない対象におけるレベルに近いレベルか、それを超えたレベルにさえ効果的に刺激することが見出されている。これは、下記実験２に記載されている。したがって、ＭＫ−７は、心臓血管の健康用に直接適用されている、海産物油及びｎ−３ ＰＵＦＡを含有する食品及び食品栄養補助剤から最大限に利益を得る必須成分である。

骨の健康
海産物油及びｎ−３ ＰＵＦＡは、骨の健康にも有益な効果を有することが見出されている。実験動物モデルでは、そのような油は、卵巣切除マウス及び食餌制限ラットの骨喪失を著しく減少させる（Ｄ．Ｓｕｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８，１２０６−１２１６（２００３年）；Ｓｕｎら、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６８，２６１３−２６１５（２００４年））。ビタミンＫ摂取量が低いこと、ビタミンＫ状態が乏しいこと、及びオステオカルシンカルボキシ化に障害があることが、骨粗鬆症の発症及び進行の危険因子であると多くの著者らによって報告されている。例えば、Ｓ．Ｌ．Ｂｏｏｔｈら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ７７，５１２−５１６（２００３年）、Ｐ．Ｓｚｕｌｃら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ９１，１７６９−１７７４（１９９３年）、Ｃ．Ｖｅｒｍｅｅｒら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ４３，３２５−３２５（２００４年）を参照されたい。ビタミンＫ摂取の増大によって、閉経後の女性の骨喪失速度の減少がもたらされることも実証されている（Ｌ．Ａ．Ｊ．Ｌ．Ｍ．Ｂｒａａｍら、Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ７３，２１−２６（２００３年）、Ｍ． Ｓｈｉｒａｋｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５，５１５−５２１（２０００年））。これらの研究で用いられる用量は、Ｋ_１の１ｍｇ／日からＫ_２の４５ｍｇ／日までの範囲である。この観点では、オステオカルシンカルボキシ化の、海産油によって誘導された減少は、骨の健康に関する海産物油の利点を部分的に不明瞭にしうる有害な副作用と見なされなければならない。報告されている高用量ビタミンＫ治療は、この副作用を打ち消しうるが、心臓血管疾病予防に有益であると報告されている穏やかな抗凝固効果も無効にするであろう。

驚いたことに、いまや、より高分子のメナキノン、顕著にはＭＫ−７が、１から１０μｇ／日の用量では、海産物油の穏やかな抗凝固効果（ＥＴＰによって測定される）を打ち消さず、同時に、オステオカルシンカルボキシ化を、海産物油を用いていない対象におけるレベルに近いレベルか、それを超えたレベルにさえ効果的に刺激することが見出されている。これは下記実験３に記載されている。したがって、ＭＫ−７は、骨の健康用に直接適用されている、海産物油及びｎ−３ ＰＵＦＡを含有する食品及び食品栄養補助剤から最大限に利益を得る必須成分である。

軟骨の健康
海産物油及びｎ−３ ＰＵＦＡは、骨関節炎、関節リウマチ、及び強直性脊椎炎で観測されるものなど、変性性関節疾患及び炎症性関節疾患を打ち消すことも見出されている。ｎ−６ ＰＵＦＡではなく、ｎ−３ ＰＵＦＡでの栄養補助は、変性性及び炎症性両方の側面の軟骨細胞代謝の低減を引き起こし、一方、正常組織のホメオスタシスには影響を与えないことが細胞培養研究で実証された（Ｃ．Ｌ．Ｃｕｒｔｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎｕｔｒ．Ｓｏｃ．６１，３８１−３８９（２００２年））。地域住民をベースにした研究も、骨関節炎、関節リウマチ、及び他の軟骨疾患の治療についての魚油及びｎ−３ ＰＵＦＡの積極的役割を示唆している（例えば、Ｌ．Ｇ．Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｄｒｕｇｓ ６３，８４５−８５３（２００３年）及びＭ．Ｊ．Ｊａｍｅｓら、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ，Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｓ ａｎｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ６８，３９９−４０５（２００３年）を参照されたい）。上述の通り、海産物油及びｎ−３ ＰＵＦＡは、肝臓におけるビタミンＫ依存性タンパク質（凝固因子）の産生を低減するだけでなく、肝外組織のビタミンＫ状態も低減して、それによって、オステオカルシン及びマトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）を含めた、肝外のビタミンＫ依存性タンパク質の活性化（グルタミン酸カルボキシ化による）を低減する。ＭＧＰは、軟骨によって合成されるタンパク質の中で最も量が多いものの１つであり、ビタミンＫは、グルタミン酸カルボキシ化によるその活性化に必要である。ＭＧＰカルボキシ化が乏しいことは、骨関節炎、関節リウマチ、及び強直性脊椎炎と関連している。明らかに、海産油によって誘導される、軟骨におけるビタミンＫ状態の低減を打ち消す方法が必要である。

驚いたことに、いまや、栄養的に適切な用量では、ＭＫ−７は、軟骨の健康に対する、海産物油の潜在的に否定的な側面を打ち消すことが見出されている。より高分子のメナキノン、顕著にはＭＫ−７は、１から１０μｇ／日の用量では、海産物油の穏やかな抗凝固効果（ＥＴＰによって測定される）を打ち消さず、同時に、オステオカルシンカルボキシ化及びＭＧＰカルボキシ化の両方を、海産物油を用いていない対象におけるレベルに近いレベルに、又はそれを超えたレベルにまで効果的に刺激したという事実は、海産油の栄養補助中において、ＭＫ−７が、関節中の軟骨を含めた、骨における最適なビタミンＫ状態を提供できることを実証している。したがって、ＭＫ−７は、軟骨の健康用に直接適用されている、海産物油及びｎ−３ ＰＵＦＡを含有する食品及び食品栄養補助剤から最大限に利益を得る必須成分である。

細胞培養研究
一連の細胞培養実験で、様々な条件下におけるビタミンＫ摂取及び代謝を調査した。以下の形態のビタミンＫ、すなわち、Ｋ_１、ＭＫ−４、ＭＫ−７、ＭＫ−８、及びＭＫ−９を比較した。３種の異なった細胞型、すなわち、血管平滑筋細胞、骨芽細胞様のＭＧ−６３細胞系、及び肝細胞様のＨｅｐＧ２細胞系でそれらを試験した。すべての実験において、各ビタミンを１μｍｏｌ／Ｌ含有する混合物としてビタミンを用いた。

すべての細胞で、ＭＫ−７が、他のＫ群ビタミンより良好に摂取されることが見出された。ＭＫ−８及びＭＫ−９は、幾分少なく摂取され、Ｋ_１及びＭＫ−４は、さらに少なく摂取された。

抗凝固物質であるワルファリンの存在下で、膜結合酵素ＶＫＯＲが阻害され、したがって、ビタミンＫが再生できないことも見出された。使用された後、ビタミンＫが酸化型（Ｋエポキシド）のまま残り、エポキシドの量が使用された程度を表す。長鎖メナキノン、とりわけＭＫ−９は還元できず、したがって、これらの条件では、カルボキシラーゼの補酵素として使用されないことが見出された。しかし、より水溶性のビタミンＫ_１、及びＭＫ−４は、細胞質酵素であるＤＴ−ジアホラーゼを還元に用い、経口抗凝固薬治療を妨害しうる。したがって、長鎖メナキノンは、他の形態のビタミンＫより、経口抗凝固薬治療を妨害する可能性が低い。これは重要な安全面であり、以前に公表されている動物実験（Ｃｒａｃｉｕｎ，Ａ．Ｍ．、Ｇｒｏｅｎｅｎ−ｖａｎ Ｄｏｏｒｅｎ，Ｍ．Ｍ．Ｃ．Ｌ．、Ｔｈｉｊｓｓｅｎ，Ｈ．Ｈ．Ｗ．、Ｖｅｒｍｅｅｒ，Ｃ．（１９９８年）、「ビタミンＫ欠失ラット及びブロディファコウム処置ラットで比較した、Ｋ群ビタミンによるプロトロンビン合成の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ Ｋ−ｖｉｔａｍｉｎｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｉｎ ｂｒｏｄｉｆａｃｏｕｍ−ｔｒｅａｔｅｄ ｒａｔｓ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３８０，７５−８１）と一致している。

ワルファリンの非存在下、及び富栄養培地中では、エポキシドが全く形成されない。培養培地中のウシ胎児血清の濃度が低減すれば、細胞の栄養状態が最適以下となる。これらの条件下でも、主として、ＭＫ−４及びＫ_１エポキシドが見出された。ここでの結論は、ワルファリン実験の結論と異なっているが、ＶＫＯＲによる還元のレベルで、長鎖メナキノンが優先的に使用され、Ｋ_１及びＭＫ−４との競合に成功する。したがって、長鎖メナキノンは、様々なタンパク質のγ−カルボキシ化に優先的に使用されると結論できる。これは、ビタミンＫの側鎖の長さが増大するに従って、そのミカエリス定数（Ｋｍ）が低減することを示す以前に公表された無細胞酵素動態研究（Ｂｕｉｔｅｎｈｕｉｓ，Ｈ．Ｃ．、Ｓｏｕｔｅ，Ｂ．Ａ．Ｍ．、Ｖｅｒｍｅｅｒ，Ｃ．（１９９０年）、「肝臓のビタミンＫ依存性カルボキシラーゼの補因子としてのビタミンＫ_１、Ｋ_２、及びＫ_３の比較（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｔａｍｉｎｓ Ｋ_１，Ｋ_２ ａｎｄ Ｋ_３ ａｓ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｃ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０３４，１７０−１７５）と一致している。

製品の製剤及び用量
いまや、ビタミンＫ_２及び多価不飽和脂肪酸を、長期の貯蔵期限を有する安定製剤中に共に処方ができることが見出されている。例えば、広範な濃度で魚油又はオキアミ油とＭＫ−７を混合した。これらの組成物は、１００℃で少なくとも２週間、４０℃で６カ月間、また室温で３年間、これらの条件下で安定なままであった。これらの研究の詳細は下記実験４に示されている。

上記に定義されているように、「多価不飽和脂肪酸」（ＰＵＦＡ）という用語は、そのトリグリセリド、生理的に許容できるエステル、遊離脂肪酸又は生理的に許容できる塩の形態にある、いかなるＰＵＦＡも指す。本発明によるＰＵＦＡ及びメナキノンの好ましい組成物は、主としてＭＫ−７と混合されたＰＵＦＡである。本発明によるＰＵＦＡ及びＭＫ物質の、より好ましい組成物は、ＨＰＬＣ分析による、組成物中の全ビタミンＫ_２化合物の少なくとも９５％がＭＫ−７であり、主要なビタミンＫ_２不純物がＭＫ−６である組成物である。本発明による組成物における、ＭＫ−７とＭＫ−６との間の典型的な比率は、９０対１０から９５対５の範囲である。

本発明による、ビタミンＫ_２又はビタミンＫ_２クラスの化合物内の一化合物とＰＵＦＡとの好ましい組成物は、ｎ−３ ＰＵＦＡから選択されたＰＵＦＡを含む組成物である。本発明による、より好ましいｎ−３ ＰＵＦＡは、２０：５脂肪酸であるエイコサペンタエノン酸（ＥＰＡ）と、２２：６脂肪酸であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である。

本発明による製品中の、さらに好ましいｎ−３ ＰＵＦＡ成分は、ＥＰＡとＤＨＡとの組み合わせである。ＥＰＡ：ＤＨＡの最も好ましい比率は、２：１から１：２の範囲内である。

本発明による最も好ましい組成物では、ＥＰＡ及びＤＨＡがトリグリセリド又はエチルエステルの形態にある。

本発明の製品及びキットの製剤は、全身投与（例えば、経口又は非経口投与）することが好ましい。本発明による最も好ましい剤形は、経口剤形、とりわけカプセル剤及び錠剤である。投与の用量及び経路は、個体の年齢及び性別、並びに障害又は疾患の重度及び性質などの因子に依存する。それらは、当業者、すなわち通常は医師が容易に決定できる。又は、通常、製品に添付されている製造会社の説明書に従うべきである。

錠剤及びカプセル剤は、当技術分野で知られている任意の従来法で調製できる。カプセル剤は、例えば、ビタミンＫ_２又はビタミンＫ_２化合物及び多不飽和脂肪酸に加えて、不活性な薬学的に許容できる成分、例えばデンプンを含む軟ゼラチンカプセル又は硬ゼラチンカプセルでありうる。本発明による錠剤は、例えば、直接圧縮法によって、又は粒剤の圧縮によって、通常の製錠機械を用いて調製されうる。本発明による錠剤は、ビタミンＫ_２又はビタミンＫ_２化合物及び不飽和脂肪酸に加えて、当技術分野でよく知られている薬学的に許容できる不活性成分を含みうる。そのような薬剤は、例えば、セルロース誘導体及びステアリン酸マグネシウムでありうる。本発明による錠剤は、胃抵抗性のコーティング、例えば、酢酸フタル酸セルロースでコーティングすることができる。

本発明による経口剤形、カプセル剤、及び錠剤は、それぞれ１００ｍｇから２ｇの間の重量を有する。錠剤又はカプセル剤それぞれの中のビタミンＫ_２又はビタミンＫ_２化合物の量は、とりわけ、疾患又は障害の重度及び性質、並びに患者の状態、性別、及び年齢などの因子に応じて、広範囲にわたって変動しうる。錠剤又はカプセル剤１個の中のビタミンＫ_２又はビタミンＫ_２クラスの化合物内の１つのビタミンＫ_２化合物の量は、通常、１から５００μｇの間であるが、それより多い量も可能である。ビタミンＫ_２、及び顕著にはＭＫ−７の好ましい用量は、１日当たり２から３００μｇの間、より好ましくは５〜５０μｇ、最も好ましくは１０〜２０μｇの間である。

錠剤又はカプセル剤それぞれの中の不飽和脂肪酸の量は、不飽和脂肪酸の性質、疾患の重度及び性質、患者の年齢、並びに錠剤又はカプセル剤の投与頻度に応じて変動しうる。錠剤又はカプセル剤それぞれの中の不飽和脂肪酸の量は、通常３００から１２００ｍｇの間、好ましくは４００から１０００ｍｇの間、最も好ましくは５００から９００ｍｇの間である。

提示されたデータは、海産物油の穏やかな抗凝固効果を妨害しないで、１日分の海産物油（約５ｇの用量における）当たり１０μｇの用量で、ＭＫ−７を混合できることを示している。したがって、約１μｇから少なくとも１０μｇの間のＭＫ−７用量（明らかに、前記範囲内では、より高用量であるほどよい）は、ヒト又は動物に投与された場合に有益であることが証明された。１日当たり１００μｇという高用量は、これらの用量がワルファリンの作用を打ち消すことが判明したので、ここに記載した目的には適用できない。ワルファリンは、ｎ−３ ＰＵＦＡよりもさらに強い血液凝固因子カルボキシ化阻害剤である。Ｓｃｈｕｒｇｅｒｓ，Ｌ．Ｊ．、Ｔｅｕｎｉｓｓｅｎ，Ｋ．Ｊ．Ｆ．、Ｈａｍｕｌｙａｋ，Ｋ．、Ｋｎａｐｅｎ，Ｍ．Ｈ．Ｊ．、Ｖｉｋ，Ｈ．、Ｖｅｒｍｅｅｒ，Ｃ．、「ビタミンＫ含有食品栄養補助剤：合成ビタミンＫ_１と納豆菌由来のメナキノン−７との比較（Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｉｅｔａｒｙ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ，ａｎｄ ｎａｔｔｏ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ−７）」、Ｂｌｏｏｄ １０９（２００７年）、３２７９−３２８３を参照されたい。

ビタミンＫ及び海産物油の用量も、海産物油の種類及び品質に応じて変動しうることが理解されよう。したがって、組成物中の一定の比率を維持するために、海産物油の混合物を用いることが推奨される。

ビタミンＫ_２又はビタミンＫ_２クラスの化合物内の一化合物も、例えば医薬組成物又は栄養補助組成物（食品栄養補助剤）中に、１又は複数種の多価不飽和脂肪酸（魚油及びオキアミ油が含まれる）とは別々に独立して処方できることも理解されよう。適した医薬組成物及び典型的な用量は、上述したものと同様であるか、又は当業者には既知である。適した栄養補助組成物及び典型的な用量は、例えば、欧州特許第１１５３５４８号に記載されている。この開示を参照により本明細書に組み込む。

本発明による組成物は、薬学的又は栄養補助的に活性な他の成分、例えば、ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体などのビタミン；ビスホスホネート、典型的にはアレンドロネートなどの活性薬化合物；又はＡＣＥ阻害剤、例えばエナラプリル、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、例えばロサルタン、β遮断断剤、例えばプロプラノロール、スタチンなどの血漿脂質還元成分、典型的にはシンバスタチンなどの心臓血管薬を任意選択で含むことができる。

本明細書の開示から理解されるであろうが、より高分子のメナキノン、すなわちＭＫ−７、ＭＫ−８、ＭＫ−９、及びＭＫ−１０の中では、通常、ＭＫ−７の使用が最も好ましい。ＭＫ−９の有益かつ有望な特性のため、及びＭＫ−９が合成によって容易に生成されることによるその利用可能性のため、ＭＫ−９も好ましい。

これより下記の実施例及び実験研究を参照して、本発明をさらに説明する。しかし、それらは、いかなる点でも、本発明を限定するものと理解するべきではない。

ＥＰＡエチルエステル、ＤＨＡエチルエステル、及びＭＫ−７を含むカプセル
９７％のＭＫ−７及び３％のＭＫ−６を含む油をＥＰＡエチルエステル及びＤＨＡエチルエステルと混合する。α−トコフェロールを添加し、この結果得られる油を５個の硬ゼラチンカプセルの中に充填する。

各カプセルは、
ＭＫ−７ ９７μｇ
ＭＫ−６ ３μｇ
ＥＰＡエチルエステル ４６３ｍｇ
ＤＨＡエチルエステル ３７５ｍｇ
α−トコフェロール ４ｍｇ
を含有する。

ビタミンＫ_２を含むタラ肝油
ビタミンＫ_２をタラ肝油（ＥＰＡＸ社（ノルウェー国所在））に溶解し、金属密封された緑色ガラスビン（２５０ｍｌ）の中に充填する。これらのビンは、ノルウェー市場販売用に「Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ_２ ｔｒａｎ」と標識される。

この製品の１日用量（５ｍｌ）は、
ビタミンＡ： ２５０μｇ
ビタミンＤ： １０μｇ
ビタミンＫ_２（ＭＫ−７）： １０μｇ
魚油： １．２ｇ、そのうちＤＨＡは０．４ｇ、ＥＰＡは０．６ｇであった
α−トコフェロール： ４ｍｇ
を含有する。

オキアミ油及びＭＫ−７を含むカプセル
トリグリセリン形態の多価不飽和脂肪酸、リン脂質、及び他の天然成分（Ｅｎｚｙｍｏｔｅｃ社（イスラエル国所在）から入手）を含むオキアミ油を、ＭＫ−７及びα−トコフェロールと混合する。この結果得られる油組成物を軟ゲルカプセル若しくは硬ゼラチンカプセルの中に充填するか、又は油含有顆粒若しくは溶媒として調製する。

各カプセルは、
ＭＫ−７ ９７μｇ
ＭＫ−６ ３μｇ
オキアミ油 ７００ｍｇ
α−トコフェロール ４ｍｇ
を含有する。

ビタミンＫ_２を含むオキアミ油
ビタミンＫ_２をオキアミ油に溶解し、金属密封されたガラスビン（２５０ｍｌ）の中に充填する。これらのビンは、ノルウェー市場販売用に「Ｋｒｉｌｌｏｌｊｅｔｒａｎ ｍｅｄ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ」と標識されるか、又は米国市場用及び英国市場用に「Ｋｒｉｌｌ ｏｉｌ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ」と標識される。１日用量（オキアミ油５ｍｌ）は、５から５００μｇの範囲のビタミンＫ_２を含有する。

オキアミ油及びビタミンＫ_２を含む魚餌
ビタミンＫ_２（１００ｍｇ）をオキアミ油（１ｋｇ）に溶解する。魚餌（Ｓｋｒｅｔｔｉｎｇ ＡＳ社（ノルウェー国スタバンゲル（Ｓｔａｖａｎｇｅｒ）所在）より入手）を粉砕する。ブレンダーを用いて、粉砕した魚餌（２０ｋｇ）をビタミンＫ_２を含むオキアミ油（１ｋｇ）と混合する。水を添加した。このセミウェット物質を篩（３ｍｍ）にかけ、４０℃で２４時間乾燥させて、粒状の魚餌を得る。

この粒状の魚餌は、約５％のオキアミ油及び２〜１００ｐｐｍのビタミンＫ_２を含有する。

ＭＫ−８カプセル
ＭＫ−８を含む油（ＨＰＣＬ分析は総ビタミンＫ_２の７０％超がＭＫ−８であることを示す）を軟ゼラチンカプセルの中に充填する。各カプセルは５μｇのＭＫ−８を含有する。

ＥＰＡエチルエステル、ＤＨＡエチルエステル、及びＭＫ−８、ＭＫ−９、及びＭＫ−１０の混合物を含むカプセル
ＭＫ−８、ＭＫ−９、及びＭＫ−１０の混合物を含む油を、ＥＰＡエチルエステル及びＤＨＡエチルエステルに混合する。α−トコフェロールを添加し、この結果得られる油を硬ゼラチンカプセルの中に充填する。

各カプセルは、
ＭＫ−８、ＭＫ−９、ＭＫ−１０ ５０μｇ
ＥＰＡエチルエステル ４６３ｍｇ
ＤＨＡエチルエステル ３７５ｍｇ
α−トコフェロール ４ｍｇ
を含有する。

ＭＫ８を含むタラ肝油
ＭＫ８（ＨＰＬＣ分析によれば６５％超）をタラ肝油に溶解し、金属密封された緑色ガラスビン（２５０ｍｌ）の中に充填する。これらのビンは、ノルウェー市場販売用に「Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ２ ｔｒａｎ」と標識される。

この製品の１日用量（５ｍｌ）は、
ビタミンＡ ２５０μｇ
ビタミンＤ １０μｇ
ＭＫ−８ １０μｇ
オメガ−３脂肪酸 １．２ｇ、そのうち、ＤＨＡは０．６ｇ、ＥＰＡは０．４ｇであった
ｄｌ−α−トコフェリル酢酸 ６ｍｇ
を含有する。

実験１：骨関節炎、骨障害、及び関節リウマチにおけるオステオカルシンのカルボキシル化度
３つの患者群を募集し、同年齢及び同性の健常な対象と比較した。肝外のビタミンＫ状態の最も高感度な生物マーカーである、カルボキシル化オステオカルシンと非カルボキシル化オステオカルシンとの比率（ｃＯＣ／ｕｃＯＣ比）を測定することによって、各対象のビタミンＫ状態を記録した（Ｂ．Ｐａｎｉｓら、Ｂｏｎｅ、２００６年、３９：１１２３−１１２９）。骨関節炎及び軟骨疾患を患っている患者は比較的若く、若年の参照群（Ａ）と比較された。関節リウマチの患者は、より年配であり、したがって、より年配の参照群（Ｂ）と比較された。オステオカルシンの高次構造特異的アッセイは、Ｔａｋａｒａ社（日本国所在）から入手した。下記表１を参照されたい。

この実験は、骨関節炎、軟骨疾患、及び関節リウマチを有する対象におけるビタミンＫ状態（循環オステオカルシンのカルボキシル化度として表される）が、健康な集団と比較して有意に低減していることを実証する。

表１

実験２：長期にわたる魚油摂取中のＭＧＰカルボキシル化、及び１０μｇ／日のＭＫ−７摂取の効果
２０人の健康男性（４３±８歳）がこの試験に登録された。平均肥満度指数は２５．１±３．５ｋｇ／ｍ^２であった。すべての対象が、１日当たり５グラムの魚油（ＥＰＡ ３５％、ＤＨＡ ２５％、及び他のｎ−３ ＰＵＦＡ １０％を含有する）を４カ月間摂取した。この試験の最終３カ月の間、すべてのボランティアが、さらに１０μｇのＭＫ−７を供給する軟ゲルカプセル１個を毎日摂取した。血小板強化血漿を調製するため、毎月、血液試料をクエン酸中に収集した。凝固中の総トロンビン活性を反映する、内因性トロンビン産生能（ＥＴＰ）を、Ｈ．Ｃ．Ｈｅｍｋｅｒら（Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、２００３年、３３：４−１５）に従ってモニターした。プールされた正常血漿を参照として用い、ＶｉｔａＫ ＢＶ社（オランダ国マーストリヒト（Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ）所在）から入手した高次構造特異的抗体に基づいたサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、カルボキシル化及び非カルボキシル化マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）分子種をモニターした。図１を参照されたい。カルボキシル化ＭＧＰと非カルボキシル化ＭＧＰとの比率は、血管のビタミンＫ状態の尺度と考えられている。すべての値を、プールされた参照血漿の値に対する割合で表す。ＥＴＰの変化は、１カ月後に、統計的に有意であり（ｐ＜０．０５）、その後の数ヶ月にわたって有意なままであった。ＭＧＰカルボキシル化の変化も１カ月後に有意であったが、２、３、及び４カ月目の間には有意性が失われていた。

この実験は、ＭＧＰカルボキシル化を元のレベルに維持するのに必要な低用量のＭＫ−７によって、魚油誘発性の凝固性低下が打ち消されないことを実証する。

実験３：長期にわたる魚油摂取中のオステオカルシンカルボキシル化及び１０μｇ／日のＭＫ−７摂取の効果
上述の通りの同じ実験で、血清も収集し、Ｔａｋａｒａ社（日本国所在）の高次構造特異的オステオカルシンキットを用いて、上記血清中のカルボキシル化及び非カルボキシル化オステオカルシン分子種もモニターした。オステオカルシンカルボキシル化の変化は、１カ月後に有意であったが、３及び４カ月目の間では、有意性が失われていた。図２を参照されたい。この実験は、オステオカルシンカルボキシル化を元のレベルに維持するのに必要な低用量のＭＫ−７によって、魚油誘発性の凝固性低下が打ち消されないことを実証する。

実験４：魚油及びオキアミ油中のＭＫ−７の安定性
実施例２及び４に記載の組成物（それぞれ、魚油及びオキアミ油中にＭＫ−７が溶解している）を油１ｇ当たりＭＫ−７ ２μｇの最終濃度で調製した。試料を、密封されたガラスビン内に調製し、それぞれ室温、４０℃及び１００℃で暗所に保持した。規則的な時点に、試料を採取し、それらのＭＫ−７含有量を分析した。図３を参照されたい。１００℃で２週間の後でさえ、ＭＫ−７の減失は観察されなかった。この実験は、魚油及びオキアミ油中に溶解したＭＫ−７の非常に優れた安定性を実証する。

実験５〜９：細胞培養試験
この系列の細胞培養実験は、様々な条件下でのビタミンＫ摂取及び代謝について記載する。以下の形態のビタミンＫ、すなわち、Ｋ_１、ＭＫ−４、ＭＫ−７、ＭＫ−８、及びＭＫ−９を比較した。それらを、３種の異なった細胞型、すなわち血管平滑筋細胞、骨芽細胞様のＭＧ−６３細胞系、及び肝細胞様のＨｅｐＧ２細胞系で試験した。ビタミンは、すべての実験で、各ビタミンを１μｍｏｌ／Ｌ含有する混合物として使用した。すべてのデータが、三連の実験の平均値である。

様々な培地の組成（ｖ／ｖ）は以下の通りであった。

実験５
ここで、本発明者らは、細胞が存在していない３種の細胞培養培地における、様々な形態のビタミンＫ（各１μＭ）の安定性を検査した。データを図４に示す。

結論：３種の増殖培地すべてで、ビタミンＫ_１、ＭＫ−７、ＭＫ−８、及びＭＫ−９は、４８時間超にわたってかなり安定であったが、ＭＫ−４は、最初の２４時間で、ベースラインの７０から８０％の間の値にまでの減少を示し、４８時間後には、ベースラインの６０から７０％にまでの減少を示した。この減少の理由はまだ明らかではないが、ＭＫ−４の消失がビタミンＫの細胞内摂取のデータに影響を与えないような条件を選択しなければならない。ＭＫ−４の減失を最小限に抑えるために、以降のすべての実験を２４時間以内に行った。

実験６
細胞を８０％集密状態まで培養し、その後、様々な濃度でビタミンＫを添加した（図５Ａ〜Ｃ参照）。添加されたビタミンＫ濃度は、ｎｍｏｌ／Ｌ培養培地として示し、回収されたビタミンＫは、ｎｍｏｌ／ｇ細胞性タンパク質として示す。各ビタミンごとの異なったスケールに注意されたい。

結論：
１．すべてのビタミンの用量反応曲線は、５００から１０００ｎｍｏｌ／Ｌの間で水平である。したがって、本発明者は飽和条件で作業し、ＭＫ４が減少（現在のところ理解されていない）しても、以降の試験結果に影響を与えないであろう。
２．驚いたことに、様々な細胞によるビタミンＫ摂取にはおびただしい相違があり、血管平滑筋細胞から最高値が得られ、ＭＧ６３から最低値が得られた。これは図５Ｄに示されている。この図で、本発明者らは、３つの細胞型におけるＭＫ−７摂取を同一のスケールでプロットした。
３．すべての系で、しかし特に肝外細胞で、驚いたことに、ＭＫ−７がＫ群のビタミンの中で最もよく摂取された。これは以下の実験でさらに実証される。

実験７
Ｋ群ビタミンの細胞内摂取を経時的に追跡した。すべての場合で、細胞が８０％集密状態まで増殖した後に様々なＫ群ビタミンの混合物（培養培地中に最終濃度１μｍｏｌ／Ｌ）を細胞に添加した。データを図６に示す。驚いたことに、Ｋ群ビタミンの中で、ＭＫ−７が最もよく摂取された。ＭＫ−７を好む、この細胞の選択性の背後にある機序は十分に明らかではない。

結論：
１．摂取は４時間後に横ばいになり、８時間でプラトーに達する。
２．摂取の速度及びプラトーレベルの値は各ビタミンごとに異なる。
３．３種の細胞系すべてにおいて、ビタミンの中で、ＭＫ−７が最もよく摂取される。

実験８
正常条件下では、すべての形態のビタミンＫが、それらのキノン形態で摂取され、それらがヒドロキノンに還元された後、γグルタミルカルボキシラーゼ酵素の補因子として活性となる。カルボキシル化中、それらはエポキシドへと酸化され、これらのエポキシドは、膜結合酵素であるＶＫＯＲで還元することができる。ＶＫＯＲは、クマリン誘導体として知られている薬物の標的となっており、この薬物は、上記酵素を不活性化し、それによって、Ｋエポキシドの再生を阻止する。ＤＴ−ジアホラーゼとして知られている第２の酵素系によって、ビタミンＫキノンは還元できる（エポキシドはできない）。したがって、ワルファリンなどのクマリン誘導体の作用は、余剰のビタミンＫによって拮抗される。また、ワルファリンの存在下で用いられるビタミンＫの各分子も、対応するエポキシドに変換され、それらは、それ以上使用できない。したがって、Ｋエポキシド濃度は、ワルファリン治療中に用いられるビタミンＫの量の直接的測定である。クマリン誘導体は、経口抗凝固薬として広く用いられており、それらの作用様式は、肝臓における凝固因子のカルボキシル化の阻害に基づいている。クマリン誘導体を用いた妨害は、それゆえ、ビタミンＫ栄養補助剤の潜在的危険性である。したがって、本発明者らは、様々なＫ群ビタミンがワルファリンを妨げるかどうか、そして、それはどの程度であるか調査した。記載の試験では、ビタミンＫを添加する１８時間前に、１０μｍｏｌ／Ｌのワルファリンを培地に添加した。Ｋ群ビタミンと共にインキュベートしている間も、この濃度のワルファリンが存在していた。結果を図７に示す。

ＭＧ６３細胞系では、本発明者らは、ＭＫ−４エポキシド（ＭＫ４−Ｏ）を同定できたのみであったが、他の系では、さらに多くのＫ群ビタミンが、それらのエポキシド形態で検出された。すべての場合で、より水溶性な形態のビタミンＫ（ＭＫ−４及びＫ_１）は、ワルファリンの影響を迂回できるが、疎水性度が増大すると、ワルファリンの妨害は、より少なくなることは明らかである。ＨｅｐＧ２細胞系は、血液凝固因子が合成される場所である肝細胞を代表するので、この系列で最も重要な細胞型はＨｅｐＧ２細胞系である。ワルファリンの妨害とビタミンＫ分子種の疎水性度との間には、逆相関関係があることが、図７から明白である。ＭＫ−９エポキシドはほとんど形成されなかった。現在、ＭＫ−１０及びＭＫ−１１は市販されていないが、これらの長鎖メナキノンは全く妨害しないであろうと外挿によって予測でき、経口抗凝固薬（クマリン）治療を受けている患者にさえ、サプリメントとして安全に与えることができる。

結論：
１．短鎖Ｋ群ビタミンであるＫ_１及びＭＫ−４は、実質的にワルファリンを妨げるが、長鎖メナキノンによる妨害は、より少ない。
２．ワルファリンの存在下におけるＫ群ビタミンの利用率は、側鎖の長さに逆相関関係にあり、ＭＫ−７＞ＭＫ−８＞ＭＫ−９である。
３．これらの実験に基づいて、ＭＫ−９及びＭＫ−１０は、臨床的に適切な形では経口抗凝固薬治療を妨害しないであろうと予測できる。

実験９
長鎖メナキノンが様々な細胞によって良好に吸収されること、及びワルファリン治療中にはそれらがほとんど使用されないことが実証された後には、非抑制的な（ワルファリンなしの）条件下で、これらのビタミンＫ分子種が積極的に使用されるということが、実証するべきこととして残っている。標準的な細胞培養条件下では、エポキシドが形成されないので、本発明者らは、培養培地中のウシ胎児血清を１％（ｖ／ｖ）に低減することによって、最適以下の生育条件を適用した。これは実質的なエポキシド形成をもたらした。結果を図８に示す。この場合も、短鎖ビタミンＫエポキシドは、血管平滑筋ＭＧ６３細胞で顕著に蓄積されることが見出された。本発明者らは、細胞飢餓条件下における長鎖メナキノンの優先的再生として、これらのデータを解釈する。或いは、これらのデータは、長鎖メナキノンが利用されていないと説明されうる。これは、１％ＦＣＳでＶＳＭＣ及びＭＧ６３を培養し、１形態のビタミンＫのみが存在していた実験（１μｍｏｌ／Ｌ）で除外された。カルボキシル化オステオカルシン（Ｔａｋａｒａ社（日本国所在））及びカルボキシル化マトリックスＧｌａ−タンパク質（ＶｉｔａＫ社（オランダ国所在））の高次構造特異的試験キットを用いて、血管平滑筋細胞ＭＧＰでは、ビタミンＫ_１、ＭＫ−４、及びＭＫ−７によってカルボキシル化が刺激され、２４時間のインキュベーションの後に培養培地中で以下のＭＧＰレベルに達したことを見出した。
Ｋ_１存在下におけるカルボキシル化マトリックスＧｌａタンパク質：１２．４ｎｇ／ｍＬ、ＭＫ−４存在下：１０．７ｎｇ／ｍｌ、及びＭＫ−７存在下：１３．５ｎｇ／ｍｌ。
Ｋ_１存在下におけるカルボキシル化オステオカルシン：３．２ｎｇ／ｍＬ、ＭＫ−４存在下：４．１ｎｇ／ｍＬ、ＭＫ−７：３．９ｎｇ／ｍＬ。

これらのデータは、Ｋ_１及びＭＫ−４と同様に、長鎖メナキノンがビタミンＫ依存性カルボキシラーゼの活性な補因子であり、エポキシドの不在の結果、優先的再生が生じるにちがいないことを実証する。

Claims (15)

1. 精製されているか、又は海産物油の形態にある、ＥＰＡ及びＤＨＡの１つである少なくとも１つのｎ‐３多価不飽和脂肪酸と組み合わせて、ＭＫ−７を含む、ヒト及び動物の心臓血管の健康、骨の健康、及び軟骨の健康のうちの少なくとも１つを増進するための医薬組成物であって、ＭＫ−７の用量が１日当たり５μｇ〜５０μｇの範囲にあるように処方されている上記医薬組成物。
2. 前記医薬組成物が、心臓血管関連、骨関連、及び軟骨関連の疾患又は障害の少なくとも１つを予防又は治療するための医薬である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 心臓血管の健康、骨の健康、及び軟骨の健康のうちの少なくとも１つを増進することが、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、骨粗鬆症、骨関節炎、又は軟骨の炎症性疾患若しくは変性疾患のうちの少なくとも１つの予防又は治療を含む、請求項１記載の医薬組成物。
4. 少なくとも１つのｎ−３多価不飽和脂肪酸が、魚油又はオキアミ油の形態にある、請求項１から３までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
5. 少なくとも１つのｎ−３多価不飽和脂肪酸が、ＥＰＡとＤＨＡの組み合わせである、請求項１から４までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
6. 前記医薬組成物が経口投与用に処方されている、請求項１から５までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
7. 前記医薬組成物が錠剤製剤又はカプセル製剤である、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 前記少なくとも１つのｎ−３多価不飽和脂肪酸が、トリグリセリド又はエチルエステルの形態にあるＥＰＡ及びＤＨＡの組み合わせである、請求項５に記載の組成物。
9. 用量が、１日当たり１０μｇ〜２０μｇの範囲にある、請求項１から８までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
10. 精製されているか、又は海産物油の形態にある、ＥＰＡ及びＤＨＡの１つである少なくとも１つのｎ‐３多価不飽和脂肪酸と組み合わせて、ＭＫ−７を含む、ヒト及び動物の心臓血管の健康、骨の健康、及び軟骨の健康のうちの少なくとも１つを増進するための栄養補助製品であって、ＭＫ−７の用量が１日当たり５μｇ〜５０μｇの範囲にあるように処方されている上記栄養補助製品。
11. 前記栄養補助製品が、心臓血管関連、骨関連、及び軟骨関連の疾患又は障害の少なくとも１つを予防又は治療するためのものである、請求項１０に記載の栄養補助製品。
12. 心臓血管の健康、骨の健康、及び軟骨の健康のうちの少なくとも１つを増進することが、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、骨粗鬆症、骨関節炎、又は軟骨の炎症性疾患若しくは変性疾患のうちの少なくとも１つの予防又は治療を含む、請求項１０記載の栄養補助製品。
13. 少なくとも１つのｎ−３多価不飽和脂肪酸が、魚油又はオキアミ油の形態にある、請求項１０から１２までのいずれか一項に記載の栄養補助製品。
14. 少なくとも１つのｎ−３多価不飽和脂肪酸が、ＥＰＡとＤＨＡの組み合わせである、請求項１０から１３までのいずれか一項に記載の栄養補助製品。
15. 前記少なくとも１つのｎ−３多価不飽和脂肪酸が、トリグリセリド又はエチルエステルの形態にあるＥＰＡ及びＤＨＡの組み合わせである、請求項１４に記載の栄養補助製品。

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