JP5759656B2 - 分流構成を用いて生化学検出を行う装置及びその稼動方法 - Google Patents

Description

本発明は、高速検出の実験装置に関し、特に、プロセスにおいて同一種の試薬を複数回注入する、及び複数種の試薬を注入する必要がある実験装置に関する。

生化学検出、特に、酵素結合免疫測定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）は、慣用の高速検出方法である。ＥＬＩＳＡは、高特異性、高速、鋭敏、低検出コスト、大量サンプルを同時に検出するなどの利点を有しているので、広い実際応用価値を持っている。ＥＬＩＳＡの原理は、抗原と抗体の特異的結合が、特定の抗原又は抗体を検出、又は初歩的定量することに用いられる、というものである。

サンドイッチ酵素結合免疫測定法（sandwich ELISA）を例にとると、実験において、捕捉抗体（capture antibody）、抗原（antigen）、酵素に結合される検出抗体（detection antibody labeled with HRP）、及び発色液を次々に添加する必要がある。各々のステップは培養時間（incubation time）及び洗浄（wash）プロセスが必要である。よって、酵素結合免疫吸着法全体では、長い運転時間（数時間〜数日間）及び複雑な実行プロセスが必要である。従来の実行方法は、９６穴マイクロタイタープレート（microtiter plate）にて行われるが、かかる方法は操作上、複数の反応槽にサンプル及び試薬を手動で複数回注入しなければならず、操作には極めて人手と時間がかかる。

上記問題を改善するために、２００１年、Ｌｅｅ等はマイクロ流体ディスクテージでＥＬＩＳＡを行うこと(ＣＤ＿ＥＬＩＳＡと称する)を提案した。このシステムは回転数制御を利用して検出流れにより試薬を順に解放でき、検出者は予め試薬を各貯蓄槽に注入するのみで、試薬の順序解放及び混合反応を自動的に実行し、ＥＬＩＳＡプロセスを完成することができる。

その原理は、下記の通りである。マイクロ流体ディスクに複数群のマイクロ流体流路を設置し、マイクロ流体流路に少なくとも２つの貯蓄槽を配置し、貯蓄槽の下方にマイクロ流体弁を配置する。マイクロ流体ディスクは低回転数で回転する場合、液体は貯蓄槽のマイクロ流体弁への入口に液体・気体界面を形成する。この時、液体の内部に遠心作用で形成された液体圧力があり、液体・気体界面に界面張力によって液体の前進を阻止する毛管圧力が形成される。液体圧力が毛管圧力より低い場合、液体が貯蓄槽に保留され、回転数が高くなると、液体圧力が大きくなり、毛管圧力より大きい場合、液体がマイクロ流体弁を突破し、貯蓄槽中の液体が解放される。

かかる構成は、検出プロセスを簡単化させ、その上、このシステムにおいて試薬体積の必要量が小さく且つ反応の表面積が大きいので、反応を早めて、全体の検出時間を１〜２時間までに短縮して完成することができる。

しかしながら、ＣＤ＿ＥＬＩＳＡを行う時に、解決すべき問題はまだ一部にある。プロセスにおいて５種類の試薬を添加する必要があることを仮定すると、各プロセスに５つのマイクロ流体弁が必要である。文献によれば、液体がマイクロ流体弁を突破するのに必要な回転数（突破回転数）は、外から内へ順に３２７、５４６、９６８、１１８０、１５０６回転数／分（ＲＰＭ）であることが分かる。（形状の制限により、隙間を拡大するように突破回転数を高めることができない）。回転数制御により試薬を順に解放する効果を達成できるようであるが、実際の検出において、突破回転数は一定の値ではなくて、突破回転数の平均値の±２０％の範囲にある。この際、順に試薬を解放する正確性に影響する。各マイクロ流体弁の突破回転数の差が十分大きくない場合、突破回転数範囲が重なり合う状態となり、同じ回転数で少なくとも２つのマイクロ流体弁が同時に突破される可能性があり、本来の検出プロセスが変更されて検出が失敗することに至る。

これに鑑み、２００９年、Ｃｈｏ等は、マイクロ流体弁の代わりにワックス弁を、液体解放を阻止する装置とすることを提案した。低融点のワックスで弁を阻止するので、液体がワックス弁を貯蓄層に突破して前進できない。液体を解放すべき時には、順にレーザ光でワックスを融解して弁を解放させて、順に解放する目的を達成する。そうすると、液体が弁を突破するタイミングを正確に制御して、解放順の間違いを回避することができる。しかしながら、かかる方法はディスクの製造の難しさを高めると共に、ワックス弁を融解するために精密な機械の制御が必要であり、全体の検出コストが高くなる。

例えコストを考慮せずに、ワックス弁の応用によってマイクロ流体弁の突破回転数が不安定である問題を解決しても、検出過程においては、大量の液体注入プロセスが、ＣＤ＿ＥＬＩＳＡの使用上の困難を招く。マイクロ流体ディスクに１２群のマイクロ流体流路があり、各々の群のマイクロ流体流路に５つの貯蓄層があると仮定すると、このシステムは検出前に試薬の注入が６０回必要であり、多量の人手及び時間がかかり、更に試薬揮発の問題がある。将来、製品への考慮で、必ずディスク製造の固定コストを償却することを前提として、経済的効果を達成するようにマイクロ流体ディスクにマイクロ流体流路をもっと多く設置する。１つのマイクロ流体ディスクに９６群のマイクロ流体流路を配置し各々の群のマイクロ流体流路に５つの貯蓄層を設けると、１群のマイクロ流体流路に試薬を５回注入する必要があり、システム全体を稼動すれば、試薬を４８０回注入する必要がある。そうすると、人手及び時間がかかるのみならず、人的過失による誤差が大幅に増加する恐れがある。

かかる問題を解決するための手段の１つは、分流流路の構成であり、１回注入することによって、遠心力の駆動で試薬を各反応槽に自動で均一的に配る。文献において、遠心力による分流メガニズムは、主に２種類に分かられる。第１類はシーケンス式分流であり、その構成は直列に並んでいる分流槽であり、各々の分流槽の出口はバルブで制御される。原理は、遠心力又は毛管力にて液体を駆動して各々の分流槽に順に充満させ、分流槽に流入した液体はバルブに規制されて進めず、余計な液体が流路末端を介して廃液槽に排出されて、各々の分流槽が同一量の液体で充満させられることである。最後に回転数を高めて、分流槽に充満する液体が弁を突破して反応槽に搬送され、液体を均一に配分する目的を達成する。Anderson（２００５）及びMark等（２００９）は、シーケンス式で分流することを提案した。しかしながら、この方式では液体が順番に充填するので、液体の分流にはかなり時間がかかる。また、毛管力は分流層に充満する時に不安定化し易いので、液体分流の失敗を招く。

他は分岐式分流であり、その構成は、１つが２つに分けられ、２つが４つに分けられる分岐流路構成である。その原理は、遠心力を利用して液体を駆動して分岐流路に流入させ、液体を分岐流路を介して少なくとも２つの分岐に分けて反応層に流入させることである。Ｌｅｅ等は２００９年に分岐式分流でＣＤ＿ＥＬＩＳＡを行うことを提案した。しかしながら、かかる構成は液体の分流時に、ディスクの回転によって発生したコリオリの力に影響されやすく、ディスクの回転方向と反対方向の流路の流量が大きくなって、液体の配分が不均一になることを招く。２０１０年にＬｉｎ等は流路の幾何形状から流速を低減してコリオリの力の影響を低減する方式により修正することを提案したが、テスト結果は１０００ＲＰＭに限られ、高回転数で効果を達成し得ない虞がある。したがって、この問題は依然として徹底的には解決できていない。

本発明の主な目的は、従来の技術にある欠陥及び不足に対して、これらを解決するために、分流構成を用いて生化学検出を行う装置及びその稼動方法を提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明は、下記の技術案を採用している。

円形扁平ディスク状の回転プラットホームと、この回転プラットホームに設けられる円形扁平ディスク状のマイクロ流体ディスクとを備える分流構成を用いて生化学検出を行う装置であって、
マイクロ流体ディスクはマイクロ流体構成層を備え、マイクロ流体構成層は円心から円周まで、
マイクロ流体構成層の円心に位置し、試薬注入孔が設けられる注入槽と、
放射状にマイクロ流体構成層に設けられ、注入槽に連通され、試薬がマイクロ流体構成層の円心から円周へ流れる少なくとも１つの液体流通用通路であるマイクロ流体流路と、
マイクロ流体構成層の円周に位置し、検出物注入孔が設けられ、マイクロ流体流路に連通され、試薬を反応させる少なくとも１つの検出槽と、
検出槽の近傍に位置し、検出槽に連通され、反応後の廃液を貯蓄する少なくとも１つの廃液槽と、を備え、
マイクロ流体流路は、
注入槽の外側に位置し、注入槽に連通され、注入槽から流入される試薬を均一に分流する分流槽と、
分流槽と検出槽との間に位置し、分流槽と検出槽に連通され、分流槽から検出槽への試薬の流入を制御する流れ抵抗部材と、を備える。

円形扁平ディスク状の回転プラットホームと、この回転プラットホームに設けられる円形扁平ディスク状のマイクロ流体ディスクとを備える分流構成を用いて生化学検出を行う装置であって、
マイクロ流体ディスクは少なくとも２つのマイクロ流体構成層を備え、マイクロ流体構成層は円心から円周まで、
マイクロ流体構成層の円心に位置し、試薬注入孔が設けられる注入槽と、
放射状にマイクロ流体構成層に設けられ、注入槽に連通され、試薬がマイクロ流体構成層の円心から円周へ流れる少なくとも１つの液体流通用通路であるマイクロ流体流路と、
マイクロ流体構成層の円周に位置し、検出物注入孔が設けられ、マイクロ流体構成層の異なる層に設けられ上下位置が対応する各々のマイクロ流体流路に連通され、試薬を反応させる少なくとも１つの検出槽と、
検出槽の近傍に位置し、検出槽に連通され、反応後の廃液を貯蓄する少なくとも１つの廃液槽と、を備え、
マイクロ流体流路は、
注入槽の外側に位置し、注入槽に連通され、注入槽から流入される試薬を均一に分流する分流槽と、
分流槽と検出槽との間に位置し、分流槽と検出槽に連通され、分流槽から検出槽への試薬の流入を制御する流れ抵抗部材と、を備える。

回転プラットホームは、凹部を介してマイクロ流体ディスクがその回転プラットホームに固定され、検出結果に影響しないようにその材質がアルミニウム又は非磁性物質であってもよい、少なくとも１つの凹部アラインメント装置を備える。マイクロ流体ディスクの材質はポリメチル・メタクリレート（polymethylmethacrylate, PMMA）である。

マイクロ流体構成層は、流れ抵抗部材と検出槽との間に位置し、流れ抵抗部材と検出槽に連通され、検出物注入孔が設けられる少なくとも１つの混合槽をさらに備えても良い。

マイクロ流体構成層は、検出槽と廃液槽との間に位置し、検出槽と廃液槽に連通され、検出槽から廃液槽への試薬の流入を制御する少なくとも１つの第２のマイクロ流体弁をさらに備えても良い。

分流槽の体積は少なくとも検出槽の体積の３倍以上である。各マイクロ流体流路における流れ抵抗部材とマイクロ流体構成層の円心との距離はいずれも等しい。流れ抵抗部材はマイクロ流体弁又は高抵抗緩衝流路であり、流れ抵抗部材はマイクロ流体弁の法式で実施されれば、その構成形状は矢羽形状である。

分流構成を用いて生化学検出を行う装置の稼動方法は、
ａ．試薬を注入する工程と、
ｂ．注入槽内の試薬を均一に各マイクロ流体流路の分流槽に流入させる、回転プラットホームを回転する工程と、
ｃ．回転プラットホームの回転数を所定の回転数にさらに増加した後、分留槽内の試薬が流れ抵抗部材を突破して検出槽に流入され、さらに検出槽内の試薬と混合し反応する工程と、
ｄ．反応結果を検出する工程と、
を備える。

本発明は、液体流動配分制御機能を加え、構成が円心に対して対称して、コリオリの力によるθ方向の干渉を避けられ、さらに、コリオリの力を利用して液体を分流層に流入させる。また、本構成は平行式の分流であり、同時に最短の時間で液体を均等に分流槽に分配することができる。また、本装置は毛管力の代わりに遠心力で液体が駆動されて分流槽に充満し、不規則な流動状態を低減する。したがって、本発明は元々のＣＤ＿ＥＬＩＳＡの利点を有するだけではなく、試薬の注入回数を大幅に低減し且つ液体を高速で安定的に配分することができる。

従来の技術における順次解放の構成においては、各マイクロ流体弁が異なる半径位置にあるので、それぞれ異なる突破回転数を有しているが、その突破回転数には実質的に幅があるので、高い回転数で、少なくとも２つのマイクロ流体弁が同時に突破される可能性がある。これでは本来の検出プロセスが変更され、試験の失敗を招く。本発明の分流構成はこのようなことを避けることができ、その原理は、分流槽がモータの回転数の変化に適応する時に発生するθ方向の慣性力を利用して液体を各分流槽に配り、さらにモータが回転する時に発生するｒ方向遠心力を利用して液面を平らにし且つ安定させ、この時、分流槽外側の流れ抵抗部材がマイクロ流体弁の方式で実施されれば、マイクロ流体弁が液体を阻止する。次いで、各マイクロ流体弁とマイクロ流体構成層の円心との距離がいずれも同じである（即ち、各マイクロ流体弁が同じ半径位置にある）ので、各マイクロ流体弁の突破回転数も等しいので、低い回転数で液体を各分流槽に配った後、高い回転数で液体にマイクロ流体弁を突破させて流体を検出層に搬送すればよい。回転数制御において高低の２種類の設定のみが必要とする。同時に、高回転数の作用で、マイクロ流体弁の表面の液体を除去し、弁の特性を回復することができ、その後、実験の必要に応じて、必要となるその他の試薬を添加し、マイクロ流体弁を突破する工程を繰り返せばよい。本発明の利点は、１種の試薬のみを同時に注入し、解放順序の間違いを心配する必要はなく、マイクロ流体弁が半径の同じ位置にあり、モータの回転数を容易に制御可能である、ことである。

同時に、本発明は人工注入の回数をも大幅に低減可能である。良好な経済効果を達成するために、通常、マイクロ流体ディスクには少なくとも２群のマイクロ流体流路を設けて同時に実験を行う。マイクロ流体ディスクには９６群のマイクロ流体流路を配置し、各々の群のマイクロ流体流路に５つの貯蓄層を設けると、１回の試験で試薬を４８０回注入する必要がある。本発明が提案する分流構成を用いて生化学検出を行う装置は、分流槽の稼動によって毎回注入された試薬を均一的に各マイクロ流体流路に配り、この時に、５種類の試薬は５回注入するのみで試薬が９６群のマイクロ流体流路に均一的に配られる。従来の技術は、同一効果を達成するには、注入する回数はマイクロ流体流路の増加につれて倍増していく。したがって、本発明は、操作時間についても、人手についても、極めて優位である。

実験過程において、従来、分流槽から検出槽に流れる液体Ａは、後続の分流槽から流れる液体Ｂに代替される。若し、液体Ｂが液体Ａを完全に代替することができれば、検出信号の安定性を大幅に向上させることができる。したがって、分流槽の体積と検出槽の体積との関係は極めて重要である。分流槽の体積と検出槽の体積との比は、少なくとも３倍以上になってから、良好な代替効果を取得できる。構成によっては、体積比が６倍乃至１０倍にあげられて代替効果を向上させる。

流れ抵抗部材の作用はマイクロ流体弁の方式で実施される場合、幾何形状を利用して表面疎水性を変更、または増加し、低回転数の操作で、液体の前進を阻止する。マイクロ流体弁の構成については、円形のマイクロ流体弁、魚骨形状の弁等が考えられる。しかしながら、使用する検出試薬が蛋白質を含むのであれば、円形のマイクロ流体弁の管壁を直接に濡らし、さらに円形のマイクロ流体弁に弁の作用を失わせる。試薬が魚骨形状の弁を流れる場合、弁内に残留しやすく、試薬が互いに汚染することを招く。したがって、本発明は魚骨形状の弁の角度を少し調整して、矢羽形状に改良する。このような改良によって、マイクロ流体弁に液体を阻止する機能を留保するのみならず、マイクロ流体弁での液体の残留を避けて、前後に注入された試薬が互いに影響しあう欠点を解決する。

ある液体（例えば、Phosphate Buffer Solution with Tween-20, PBST）の操作では、液体が弁を通ると、弁の疎水性が永久に失効することに至る。このような場合、高回転数の作用でマイクロ流体弁の表面の液体を除去したとしても、弁の疎水性を回復できない。このような場合、流れ抵抗部材は高抵抗緩衝流路に変更することができる。高抵抗緩衝流路の幾何形状（例えば、深さ及び高さ）は、通常注入槽またはその他のマイクロ流体流路の幾何形状より遥かに小さい。注入槽と高抵抗緩衝流路を流れる液体の抵抗の差を利用して、液体が高抵抗緩衝流路を通る前にその液体を分流槽に充満させてから回転数を高めて、液体を均一に配る目的を達成する。

以上の説明は、片面片層分流構成を主として行われるが、本発明の分流構成は片面片層構に限られない。実験の必要に応じて、両面多層の構成に発展可能である。多層構成を用いる場合、マイクロ流体ディスクは、円心から円周まで、やはり注入槽、少なくとも１つのマイクロ流体流路、少なくとも１つの検出槽及び少なくとも１つの廃液槽を含む少なくとも２つのマイクロ流体構成層を含み、マイクロ流体流路も分流槽及び流れ抵抗部材を含む。また、マイクロ流体構成層は、少なくとも１つの混合槽及び少なくとも１つの第２のマイクロ流体弁を含んでもよく、その設置位置は片面片層の構成と同じである。

多層構成は、検出槽がマイクロ流体構成層の異なる層に配置され且つ上下位置が対応する各々のマイクロ流体流路に連通されることを特徴とする。即ち、マイクロ流体構成層には４層があれば、各々の層に少なくとも２本のマイクロ流体流路が設けられると、検出槽は４層のマイクロ流体構成層中の上下位置が対応する４本のマイクロ流体流路に同時に連通され、上下位置が対応する４本のマイクロ流体流路内の液体が同一検出槽に流入する。また、マイクロ流体構成層において、異なる層の注入槽が互いに連通せず、且つ各層の注入槽には独立な試薬注入孔が設けられる。また、同一マイクロ流体構成層にある各マイクロ流体流路における流れ抵抗部材と、マイクロ流体構成層の円心との距離はいずれも等しいが、異なる層では距離が等しくなくてもよい。

本発明は両面両層に限られず、実験過程において使用される試薬が多種類であれば、検出の必要に応じて、両面三層、四層、さらにもっと多くに拡張される。マイクロ流体弁を流れ抵抗部材とする場合、片面片層の構成よりも、多層構成の場合、異なる試薬が同一マイクロ流体弁を流れることはないので（異なる層の注入槽に注入されるからである）、試薬（特に蛋白質又は界面活性剤を含む試薬）がマイクロ流体弁を流れた後、マイクロ流体弁が失効して液体を阻止できなくなることを完全に回避でき、試薬が互いに汚染することも回避できる。多層構成を使用していない場合、マイクロ流体弁が突破されると、高い回転数を所定時間（例えば、１０分間）維持してマイクロ流体弁を乾燥させて液体を阻止する機能を回復させる必要がある。

本発明の実施例の回転プラットホームの平面模式図である。 本発明の実施例のマイクロ流体構成層の模式図である。 魚骨形状マイクロ流体弁（Ａ）、矢羽形状マイクロ流体弁（Ｂ）及び高抵抗緩衝流路（Ｃ）の模式図である。 本発明の両面両層構成の実施例の平面模式図である。 本発明の両面両層構成の実施例の側面断面模式図である。 本発明の稼動方法のフローチャートである。 本発明を利用するＥＬＩＳＡ実験のマイクロ流体構成層の模式図である。 本発明を利用するLipid test実験のマイクロ流体構成層の模式図である。

以下は、実際の稼動の流れ及び実施例にて、図面を参照して本発明がどのように従来の技術の欠陥を解決するかをさらに説明する。

図１は、本発明の実施例の回転プラットホーム１００の模式図であり、少なくとも１つの凹部１１０のアラインメント装置を含み、凹部１１０により図２に示すマイクロ流体ディスク２００を回転プラットホーム１００に固定できる。

マイクロ流体ディスク２００はマイクロ流体構成層３００を含み、図２に示すように、マイクロ流体構成層３００は円心から円周まで、注入槽３１０、分流槽３２１、流れ抵抗部材３２２、少なくとも１つの検出槽３３０及び少なくとも１つの廃液槽３４０を備えている。

そのうち流れ抵抗部材３２２は、円形のマイクロ流体弁又は図３（Ａ）に示す魚骨形状の弁が使用可能である。しかしながら、蛋白質を含む試薬を使用すると、円形のマイクロ流体弁は、弁の機能を失うが、魚骨形状のマイクロ流体弁は、前回の試験の試薬が残留しやすくて互いの汚染を招く。したがって、本発明は、その形状を図３（Ｂ）に示す矢羽形状に改良して、液体阻止の機能を保留し試薬の残留を避けることを提案する。また、ある液体（例えば、Phosphate Buffer Solution with Tween-20, PBST）を使用する必要があって弁の疎水性の失効を招くときは、図３（Ｃ）に示す高抵抗緩衝流路に変更可能である。

また、本発明は、実験の必要に応じて多面多層構成を提供可能である。図４は両面両層構成の実施例の平面図であり、図５は両面両層構成の側面断面図である。図５によれば、マイクロ流体ディスク２００はマイクロ流体構成層３００を４層備え、各々の層の構成は独立な試薬注入孔を有している。多層構成の試薬注入孔は、図５に示すように、それぞれ多層構成−第１層注入孔３１２、第２層注入孔３１３、第３層注入孔３１４、第４層注入孔３１５であるが、試薬の出口はいずれも共通の検出槽３３０に流れている。

図６は、分流構成を利用して生化学検出を行う装置の稼動方法のフローチャートである（酵素結合免疫測定を例とする）。その工程は、ａ．試薬を注入槽３１０又は検出槽３３０に注入する試薬注入工程と、ｂ．マイクロ流体弁を流れ抵抗部材３２２とする場合、マイクロ流体弁の突破回転数より低い回転数で回転して、注入槽３１０内の試薬を均一に各マイクロ流体流路３２０に流入させる、回転プラットホーム１００を回転する工程と、ｃ．回転プラットホーム１００の回転数を所定の回転数にさらに増加した後、分流槽３２１内の試薬が流れ抵抗部材を突破して検出層３３０に流入し、さらに検出槽３３０内の試薬と混合し反応する工程と、ｄ．反応結果を検出する工程と、を備えている。ただし、所定の回転数は固定値であり、マイクロ流体弁の位置、表面接触角及び幾何形状に基づいて決められる。工程ｃが終了した後、検出プロセスに応じて工程ｂ及び工程ｃを繰り返し、さらに工程ｄで反応結果を検出する。

片層構成を採用する場合の、稼動方法を以下に説明する。先ず、試薬Ｘを注入槽３１０又は検出槽３３０に注入する工程ａを行い、次に、モータを回転させた後、回転プラットホーム１００とマイクロ流体ディスク２００を一緒に回転させて、試薬を各分流槽３２１に均一に配る工程ｂを行い、試薬が回転数でマイクロ流体弁を突破できず分流槽３２１内に残り、液面が平らとなった時に、高い回転数で試薬にマイクロ流体弁を突破させて検出槽３３０に流入させる工程ｃを行い、次に、高い回転数を１０分維持して、マイクロ流体弁を乾燥させて、試薬を阻止する機能を回復し、次に、試験の必要に応じて、他の試薬Ｙを注入し、以上の工程を繰り返し、完成した後、反応結果を検出する工程ｄを行う。

多層構成を採用する場合、その相違点は、異なる試薬が異なる層の注入槽３１０に注入される工程ａにある。先ず、試薬Ｘを第１層のマイクロ流体構成層３００の注入槽３１０に注入し、次に回転プラットホームを回転する工程ｂを行い、次に回転プラットホーム１００の回転数を所定の回転数にさらに増加して、分流構成を用いて試薬Ｘを各検出槽３３０に均一に配る工程ｃを行い、さらに工程ａを繰り返して、試薬Ｙを第２層のマイクロ流体構成層３００の注入槽３１０に注入し、回転プラットホームを回転する工程ｂをもう１回行い、回転プラットホーム１００の回転数を所定の回転数にさらに増加して、分流構成を用いて各検出槽３３０に均一に配る工程ｃを行い、さらに、試薬Ｚを第３層のマイクロ流体構成層３００の注入槽３１０に注入し（工程ａ）、回転プラットホーム１００を回転し（工程ｂ）、回転プラットホーム１００の回転数を所定の回転数にさらに増加し（工程ｃ）、分流構成を用いて各検出槽３３０に均一に配り、最後に発色液を第４層のマイクロ流体構成層３００の注入槽３１０に注入し（工程ａ）、回転プラットホーム１００を回転し（工程ｂ）、回転プラットホーム１００の回転数を所定の回転数にさらに増加し（工程ｃ）、分流構成を用いて各検出槽３３０に均一に配り、終了後、反応結果を検出する工程ｄを行う。

多層構成を採用して検出する過程において、異なる試薬は異なる層の注入槽３１０に注入され、さらに異なる分流槽３２１、流れ抵抗部材３２２を流れて、最後に共通の検出槽３３０に流入されて反応して検出に供される。このように、試薬が互いに汚染されることを完全に回避し、マイクロ流体弁を流れ抵抗部材３２２とする場合、片層構成・複数種の試薬を使用する時に、試薬がマイクロ流体弁を突破した後、高回転数を所定時間維持してマイクロ流体弁を乾燥に回復させる工程を省略できる。

本実施例は、片面片層分流構成でマイクロ流体弁を流れ抵抗部材３２２とする場合、ＣＤＥＬＩＳＡを実行することを例として説明する。実施過程は図７に示している。

先ず、検出物注入孔３１６から１μｌの捕捉抗体を結合したビーズ、５０μｌの抗原、及び１μｌの酵素を標識した検出抗体を混合槽３５０に注入し、次いで、マイクロ流体ディスク２００を図１に示す回転プラットホーム１００に載置しモータ回転数８００ＲＰＭで回転する。この場合、混合液は第２のマイクロ流体弁３２３の作用で、混合槽３５０に維持され、比較的高い液面が保持される。次いで、磁場によってビーズを運動させて十分に混合し、１時間培養（incubation）して基本的結合を完成する。混合が終了した後、モータ回転数１５００ＲＰＭで、混合液に第２のマイクロ流体弁３２３を突破させる。この時、抗体と抗原の結合を完成したビーズは磁場又は幾何形状の作用で、検出槽３３０内に固定され、余計な混合液は廃液槽３４０に流れる。次いで、片層構成−注入孔３１１に洗浄液（Phosphate Buffer Saline with Tween-20, PBST）を５６０μｌ注入し、モータ回転数１０００ＲＰＭでマイクロ流体弁の作用と組み合わせて分流槽３２１に充満し、さらにモータ回転数４０００ＲＰＭにて回転して液体にマイクロ流体弁を突破させて液体を検出槽３３０に流し、検出槽３３０に洗浄液を７０μｌ配って、２分間洗浄する。同時に、マイクロ流体弁はモータ回転数４０００ＲＰＭ１０分間回転した後、乾燥し完了して弁の作用を回復する。実際の実験必要に応じて、この洗浄動作は複数回繰り返してもよい。最後に、片層構成−注入孔３１１に発色液（ＴＭＢ）を５６０μｌ注入して、検出槽３３０に発色液を７０μｌ配って、磁場の作用で、２０分間反応し、最後に、反応結果を検出する。

本実施例は、片面片層分流構成で、マイクロ流体弁を流れ抵抗部材３２２とする場合の脂質検出（Lipid test）を例として説明する。実験過程は図８に示す。本発明をこの検出に適用すると、健康検査の時間を短縮可能であり、検査の結果をより一層速く知ることができる。

この検査は酵素終点反応法（Enzymatic end point method）を利用して、血清中のトリグリセリド（Triglycerides, TG）の含有量を検出する。先ず、検出物注入孔３１６から検出槽３３０に血清を１μｌ注入する。次に、片層構成−注入口３１１に検出用試薬を２７２μｌ注入し、モータ回転数１０００ＲＰＭでマイクロ流体弁の作用と組み合わせて検出薬剤を分流槽３２１に充満し、さらにモータ回転数４０００ＰＲＭにて回転して液体にマイクロ流体弁を突破させて液体を検出槽３３０に流れ、検出槽３３０に検出薬剤を３４μｌ配る。次いで、モータを時計回り、反時計回りと交互に回転する方式（振幅：１５０°、周波数：１５Ｈｚ、時間：３０ｓ）で振動し混合して、全ての液体を検出槽３３０で均一に混合した後、検出を行う。

本発明が提供する装置及び方法は、生化学医学検出、特に試薬を複数回添加する必要のある検出項目、例えば、免疫検出に応用される。ＥＬＩＳＡを例にとると、捕捉抗体、抗原、検出抗体、洗浄液及び発色液等の５種類の試薬を順に注入する必要がある。１つのマイクロ流体ディスク２００に８群のマイクロ流体流路３２０を有することを例とすると、試薬を４０回中注入する必要がある。本発明の構成を応用すると、試薬を５回注入するのみで、１種の試薬を注入するごとに、液体配り機能を利用して試薬が各検出槽３３０に均一に流入し、ＥＬＩＳＡを実行する目的を達成する。

以上のべたように、本発明は、試薬を注入する総回数を低減でき、且つ毎回、１種の試薬のみを注入する。各流れ抵抗部材３２２とマイクロ流体構成層３００との円心の距離はいずれも等しいので、使用者はマイクロ流体ディスク２００を比較的高い回転数に回転するように操作して試薬を解放でき、頻繁に多段回転数に変更する必要はない。マイクロ流体弁間の突破回転数の不安定性を考慮する必要もなく、試薬間は互いに汚染する恐れはない。したがって、本発明は、操作工程を大幅に低減し、使用者の操作の利便性を向上させ、人的エラーの出現確率を低減して、真に将来の生化学医学検出にとって良好な選択枝となる。

以上は、本発明の具体的な実施例に過ぎず、本発明の保護範囲は、これに限られていない。当業者の誰でも本発明に開示された技術範囲内で、変形案又は代替案を容易に想到し得るが、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。したがって、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲の記載に基づく特許発明の技術的範囲を基準とすべきである。

１００ 回転プラットホーム
１１０ 凹部
２００ マイクロ流体ディスク
３００ マイクロ流体構成層
２００ マイクロ流体ディスク
３００ マイクロ流体構成層
３１０ 注入槽
３１１ 片層構成−注入孔
３１２ 多層構成−第１層注入孔
３１３ 多層構成−第２層注入孔
３１４ 多層構成−第３層注入孔
３１５ 多層構成−第４層注入孔
３１６ 検出物注入孔
３２０ マイクロ流体流路
３２１ 分流槽
３２２ 流れ抵抗部材
３２３ 第２マイクロ流体弁
３３０ 検出槽
３４０ 廃液槽
３５０ 混合槽

Claims (22)

1. 円形扁平ディスク状の回転プラットホームと、当該回転プラットホームに設けられる円形扁平ディスク状のマイクロ流体ディスクとを備える分流構成を用いて生化学検出を行う装置であって、
   当該マイクロ流体ディスクはマイクロ流体構成層を備え、当該マイクロ流体構成層は円心から円周まで、
   当該マイクロ流体構成層の円心に位置し、試薬注入孔が設けられる注入槽と、
   放射状に当該マイクロ流体構成層に設けられ、当該注入槽に連通され、試薬が当該マイクロ流体構成層の円心から円周へ流れる少なくとも１つの液体流通用通路であるマイクロ流体流路と、
   当該マイクロ流体構成層の円周に位置し、第１の検出物注入孔が設けられ、当該マイクロ流体流路に連通され、当該試薬を反応させる少なくとも１つの検出槽と、
   当該検出槽の近傍に位置し、当該検出槽に連通され、反応後の廃液を貯蓄する少なくとも１つの廃液槽と、を備え、
   当該マイクロ流体流路は、
   当該注入槽の外側に位置し、当該注入槽に連通され、当該注入槽から流入される当該試薬を均一に分流する分流槽と、
   当該分流槽と当該検出槽との間に位置し、当該分流槽と当該検出槽に連通され、当該分流槽から当該検出槽への当該試薬の流入を制御する矢羽形状マイクロ流体弁と、を備え、
   当該少なくとも１つの廃液槽は、各々排出口を備える、
   分流構成を用いて生化学検出を行う装置。
2. 前記マイクロ流体構成層は、前記矢羽形状マイクロ流体弁と前記検出槽との間に位置し、前記矢羽形状マイクロ流体弁と前記検出槽に連通され、第２の検出物注入孔が設けられる少なくとも１つの混合槽を備える、ことを特徴とする請求項１に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置。
3. 前記マイクロ流体構成層は、前記検出槽と前記廃液槽との間に位置し、前記検出槽と前記廃液槽に連通され、前記検出槽から前記廃液槽への試薬の流入を制御する少なくとも１つの第２のマイクロ流体弁を備える、ことを特徴とする請求項１に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置。
4. 前記回転プラットホームの周辺外側には、円周に少なくとも１つの凹部が配置され、前記マイクロ流体ディスクが当該凹部を介して前記回転プラットホームに固定される、ことを特徴とする請求項１に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置。
5. 前記回転プラットホームの材質は、アルミニウムである、ことを特徴とする請求項１に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置。
6. 前記マイクロ流体ディスクの材質は、ポリメチル・メタクリレートである、ことを特徴とする請求項１に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置。
7. 前記分流槽の体積は、少なくとも前記検出槽の体積の３倍以上である、ことを特徴とする請求項１に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置。
8. 各マイクロ流体流路における前記矢羽形状マイクロ流体弁と前記マイクロ流体構成層の円心との距離はいずれも等しい、ことを特徴とする請求項１に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置。
9. 円形扁平ディスク状の回転プラットホームと、当該回転プラットホームに設けられる円形扁平ディスク状のマイクロ流体ディスクとを備える分流構成を用いて生化学検出を行う装置であって、
   当該マイクロ流体ディスクは少なくとも２つのマイクロ流体構成層を備え、当該マイクロ流体構成層は円心から円周まで、
   当該マイクロ流体構成層の円心に位置して試薬注入孔が設けられる注入槽と、
   放射状に当該マイクロ流体構成層に設けられ、当該注入槽に連通され、試薬が当該マイクロ流体構成層の円心から円周へ流れる少なくとも１つの液体流通用通路であるマイクロ流体流路と、
   当該マイクロ流体構成層の円周に位置し、検出物注入孔が設けられ、当該マイクロ流体構成層の異なる層に設けられ且つ上下位置が対応する各々の当該マイクロ流体流路に連通され、当該試薬を反応させる少なくとも１つの検出槽と、
   当該検出槽の近傍に位置し、当該検出槽に連通され、反応後の廃液を貯蓄する少なくとも１つの廃液槽と、を備え、
   当該マイクロ流体流路は、
   当該注入槽の外側に位置し、当該注入槽に連通され、当該注入槽から流入される当該試薬を均一に分流する分流槽と、
   当該分流槽と当該検出槽との間に位置し、当該分流槽と当該検出槽に連通され、当該分流槽から当該検出槽への試薬の流入を制御する矢羽形状マイクロ流体弁と、を備え、
   当該少なくとも１つの廃液槽は、各々排出口を備え、
   当該少なくとも２つのマイクロ流体構成層各々の、当該分流槽と当該矢羽形状マイクロ流体弁各々との距離は、異なっている、
   分流構成を用いて生化学検出を行う装置。
10. 前記マイクロ流体構成層は、前記矢羽形状マイクロ流体弁と前記検出槽との間に位置し、前記矢羽形状マイクロ流体弁と前記検出槽に連通され、検出物注入孔が設けられる少なくとも１つの混合槽を備える、ことを特徴とする請求項９に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置。
11. 前記マイクロ流体構成層は、前記検出槽と前記廃液槽との間に位置し、前記検出槽と前記廃液槽に連通され、前記検出槽から前記廃液槽への前記試薬の流入を制御する少なくとも１つの第２のマイクロ流体弁を備える、ことを特徴とする請求項９に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置。
12. 前記回転プラットホームの周辺外側には、円周に少なくとも１つの凹部が配置され、前記マイクロ流体ディスクが当該凹部を介して前記回転プラットホームに固定される、ことを特徴とする請求項９に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置。
13. 前記回転プラットホームの材質は、アルミニウムである、ことを特徴とする請求項９に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置。
14. 前記マイクロ流体ディスクの材質は、ポリメチル・メタクリレートである、ことを特徴とする請求項９に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置。
15. 前記マイクロ流体構成層において、異なる層の注入層が互いに連通されず、且つ各層の当該注入層に独立の試薬注入孔が設けられる、ことを特徴とする請求項９に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置。
16. 前記分流槽の体積は、少なくとも前記検出槽の体積の３倍以上である、ことを特徴とする請求項９に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置。
17. 同一の前記マイクロ流体構成層に位置する各前記矢羽形状マイクロ流体弁と前記マイクロ流体構成層の円心との距離はいずれも等しい、ことを特徴とする請求項９に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置。
18. 前記請求項１乃至１７のいずれか１に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置の稼動方法であって、
    ａ．前記請求項１乃至１７のいずれか１に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置を用意する工程
    ｂ．注入槽に試薬を注入する工程と、
    ｃ．前記注入槽内の前記試薬を均一に各マイクロ流体流路の分流槽に流入させる、前記回転プラットホームを回転する工程と、
    ｄ．検出槽と前記検出槽に連通された廃液槽とに残留したガスを排出口から排気する工程と、
    ｅ．当該回転プラットホームの回転数を所定の回転数にさらに増加した後、前記分流槽内の前記試薬が矢羽形状マイクロ流体弁を突破して検出槽に流入し、さらに前記検出槽内の前記試薬と混合し反応する工程と、
    ｆ．反応結果を検出する工程と、
    を備える分流構成を用いて生化学検出を行う装置の稼動方法。
19. 前記工程ｅにおける所定の回転数の値は、固定値である、ことを特徴とする請求項１８に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置の稼動方法。
20. 前記工程ｅは、試薬が流れ前記抵抗部材を突破した後、引続き所定時間回転して、前記試薬を阻止する機能を回復するように前記矢羽形状マイクロ流体弁を乾燥させる工程を含んでいる、ことを特徴とする請求項１８に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置の稼動方法。
21. 前記所定時間は、１０分間である、ことを特徴とする請求項２０に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置の稼動方法。
22. 前記工程ｅが終了した後、検出プロセスに応じて前記工程ｃ及び前記工程ｅを繰り返し、さらに前記工程ｆで反応結果を検出する、ことを特徴とする請求項１８に記載の分流構成を用いて生化学検出を行う装置の稼動方法。