CN105536899B - 微流控芯片及其在农药检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种微流控芯片及其在农药检测中的应用，包括基材、以及分布于所述基材上的至少一个检测单元，所述基材沿一中心点可转动，每个所述检测单元分别包括一萃取池、一微通道和一检测池，所述微通道的两端分别连通于所述萃取池和检测池，所述萃取池、检测池和中心点共线，且所述萃取池和检测池分别位于所述中心点的近端和远端。本发明的微流控可实现多个样品的在线分离和平行检测，试剂和样品量耗损微量，大大降低了农药的检出限。

Description

微流控芯片及其在农药检测中的应用

技术领域

本申请属于环境检测和食品安全等领域，特别是涉及一种微流控芯片及其在农药检测中的应用。

背景技术

农药由于其很强的化学稳定性，易于残留在作物和土壤中或者其它环境中，当其浓度达到一定值时(残留量)，被人食用后就会在体内积累，引起慢性中毒。目前，我国农药残留污染类检测分为三种类型，有机磷农药、拟除虫菊酯类和杀菌剂，有机磷农药因在农业病虫害防治方面具有高效、安全、经济、方便、应用范围广等特点，是我国现阶段使用量最大的农药。中国环境优先检测有机污染物“黑名单”中列出的10种化学农药，其中有机磷类农药就占了7种。因此，有机磷农药残留是我国农药残留分析的重点。检测有机磷农药残留量的方法主要有色谱法(薄层色谱法，气相色谱法和液相色谱法)，这类检测方法处理复杂，需要配合昂贵的仪器，不适合现场检测。此外还有酶抑制法、QuEChERS、发光菌检测法、免疫法、化学发光法等等。

目前市场上检测农药残留的便携式仪器和速测卡(RP系列、YN系列、CL系列、GDYN系列、绿T系列)都是基于抑制酶法(乙酰胆碱酯酶)，而使用酶的方法价格昂贵，且酶活性不易维持，不易保存。酶抑制法是采用比色法检测，在实际检测中部分蔬菜可能出现假阳性“误检”现象，并且当待测样品中的色素，如叶绿素、胡萝卜素等含量过高时，会造成测得的透过率异常低，造成吸光度变化值的不准确，影响检测可靠性。另外，采用速测卡虽然可以起到快速简便的效果，但是可测范围窄，检测限高，一般低于1mg/kg的都无法识别，多数达不到农药检测国标值。

因此，开发一种其他类型的检测方法，尤其是无酶检测成为农药残留检测的研究热点。而集成提取和检测一体的技术仍然是开发农药残留检测的方向。

近年来，微流控芯片作为新型的分析平台，具有微型化、自动化、集成化等优点，已经受到环境检测等相关领域的广泛关注。搭建微流控芯片平台用于农药检测已经有部分报道，这些芯片检测在设计上没有充分发挥圆盘式芯片的优点，实际操作复杂，不利于多个样品同时检测，并且芯片适用范围窄，灵活性差。在芯片上实现高分辨率和高灵敏度的农药检测应用尚未有实质性的突破。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微流控芯片及其在农药检测中的应用，以克服现有技术中的不足。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本申请实施例公开了一种微流控芯片，包括基材、以及分布于所述基材上的至少一个检测单元，所述基材沿一中心点可转动，每个所述检测单元分别包括一萃取池、一微通道和一检测池，所述微通道的两端分别连通于所述萃取池和一检测池，所述萃取池、检测池和中心点共线，且所述萃取池和检测池分别位于所述中心点的近端和远端。

优选的上述的微流控芯片中，所述基材包括圆盘形的主体部、以及凸伸于所述主体部边缘的凸伸部，所述萃取池和微通道形成于所述主体部上，所述检测池形成于所述凸伸部上。

在一实施例中，基材为圆盘形，检测池形成于圆盘形基材的边缘处。

优选的上述的微流控芯片中，所述微通道包括阵列设置的多个环形的第一通道、以及连通于相邻两第一通道之间的第二通道。

优选的上述的微流控芯片中，所述基材上分布有多个检测单元，所述多个检测单元中的萃取池以中心点为圆心围成环形。

优选的上述的微流控芯片中，所述环形之间形成有一分配池，该分配池与每个萃取池之间分别通过一微通道连通。

优选的上述的微流控芯片中，所述基材包括上下叠加设置的第一芯片层和第二芯片层，所述微通道形成于所述第一芯片层和第二芯片层之间，所述萃取池和检测池凹设于形成于所述第一芯片层上。

在该技术方案中，萃取池和检测池优选贯穿第一芯片层的上下表面。在另一实施例中，萃取池和检测池也可以为自第一芯片层表面凹设的凹槽，且未贯穿第一芯片层底面。

优选的上述的微流控芯片中，所述第一芯片层上形成有第三芯片层，所述分配池形成于所述第三芯片层上并贯穿所述第三芯片层上下表面，所述第三芯片层上还形成有多个进样孔，每个所述萃取池分别对应与一个所述进样孔连通。

优选的上述的微流控芯片中，连通于所述萃取池和分配池的微通道凹设形成于所述第三芯片层的底面或凹设形成于所述第二芯片层的上表面。

在一实施例中，基材可以仅设置第一芯片层和第二芯片层两层芯片，分配池开设于第二芯片层上。

相应的，本申请还公开了一种微流控芯片在农药检测中的应用，包括步骤：

(1)、待测样品分别从进样孔放入萃取池；

(2)、将整个微流控芯片放入离心机，设定离心速度，从分配池加入萃取剂后，启动离心机，试剂均匀分布进入萃取池，将待测区的农药萃取后，进入萃取池；

(3)、从分配池继续加入荧光淬灭剂和荧光试剂的混合物，提高离心速度，萃取液与荧光试剂反应后，充分混合进入检测池，用荧光分光光度计进行定量检测。

优选的，在上述的微流控芯片在农药检测中的应用中，所述步骤(2)中萃取剂为pH＝7.9的磷酸盐缓冲溶液和Tritonx-100表面活性剂的混合溶液；所述步骤(3)中荧光淬灭剂为PdCl₂，荧光试剂为钙黄绿素。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的微流控可实现多个样品的在线分离和平行检测，试剂和样品量耗损微量，大大降低了农药的检出限。并且采用PMMA材质，价格低廉，具有便携、经济、高效的特点，在农药残留定量分析检测中具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1所示为本发明具体实施例中微流控芯片的结构示意图；

图2所示为本发明具体实施例中第一芯片层的结构示意图；

图3所示为本发明具体实施例中第二芯片层的结构示意图；

图4所示为本发明具体实施例中第三芯片层的结构示意图。

具体实施方式

本实施例中，圆盘式微流控PMMA芯片表面有微结构和微通道，可通过离心机旋转产生的离心力驱动也可通过注射泵驱动，实现待测样品中农药的萃取并且与各试剂的混合、反应过程，通过荧光分光光度计定量检测芯片上农药残留的含量，该微流控芯片及方法可减少进样次数同时检测多个样品，试剂与样品用量微量。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

结合图1至图4所示，在最佳实施例中，微流控芯片包括上下依次叠加形成的第三芯片层1、第一芯片层2和第二芯片层3。

第三芯片层1、第一芯片层2和第二芯片层3的材质为PMMA、石英或玻璃，优选为PMMA。三层芯片层通过热压键合形成。

第一芯片层2包括圆盘形的主体部201、以及凸伸于主体部201边缘的4个凸伸部202，4个凸伸部等间距环形阵列分布。

第一芯片层2上形成有4个检测池，每个检测池分别包括一萃取池203、一微通道204和一检测池205，微通道204的两端分别连通于所述萃取池203和检测池205，其中萃取池205靠近主体部中心的近端，每个检测池分别形成于一凸伸部202上并上下贯穿第一芯片层2，萃取池203上下贯穿第一芯片层，微通道凹设形成于第一芯片层的下表面。4个萃取池围成环形。

萃取池和微通道之间形成有双面胶薄膜阀。

微通道204包括阵列设置的多个环形的第一通道、以及连通于相邻两第一通道之间的第二通道。

微通道204尺寸为微米级。

在该技术方案中，通过环形的通道实现分流-回流，从而起到加速混合的作用。

圆盘形主体部的直径优选是120mm，检测池的长度是34mm,微通道的尺寸是深宽分别是200μm×200μm。第一芯片层的厚度优选为10mm。

第二芯片层3为一空白的基材，其贴合于第一芯片层的下表面用以围成所述微通道、以及封挡于萃取池和检测池的下方。

第二芯片层3的厚度优选为1mm。

第三芯片层1的中部形成有圆形的分配池101，分配池101的四周环形阵列分布有4个进样孔102。分配池101与每个萃取池之间通过一微通道103连通，微通道103优选凹设形成于第三芯片层的下表面。每个进样孔102分别对应形成于一萃取池的上方，并与其对应的萃取池连通。

第三芯片层的厚度优选为3mm。

上述的微通道、萃取池、检测池、分配池和进样孔可以通过计算机数控磨床、激光刻蚀、LIGA技术、模塑法、热压法、化学腐蚀制备，也可通过软刻蚀技术制备。

微流控芯片的制作方法包括步骤：

1.用计算机辅助设计软件设计和绘制芯片中各层的微通道和微阀结构图形；

2.通过微加工技术在各层表面的微通道和结构，包括微通道、萃取池、检测池、分配池和进样孔；

3.通过热压键合法，将刻有微米级别的微结构基片和空白基片热压键合组成圆盘式微流控芯片。

微流控芯片可以通过在芯片上预留卡槽固定在离心机上。离心系统通过自组装设计，包括电动平台、频闪和固定磁铁底座。

检测农药残留的圆盘式微流控芯片的检测原理是甲拌磷等有机磷农药(分子结构中含有P＝S,P＝O),能与Pd2+形成比钙黄绿素-钯更稳定的配合物，使得钙黄绿素-钯配合物中的钙黄绿素被释放，溶液重显荧光。

本案中的微流控芯片可以用于菜叶检测，也可以是其他固体类食品。以下以菜叶甲拌磷的检测为例进行说明。

钙黄绿素-Pd反应液的制备：

取钙黄绿素储备液(1×10^-4)和Pdcl₂储备液各稀释20倍，用去离子水稀释至50ml,取等体积混合后，摇匀，即制得钙黄绿素-Pd反应液，避光保存。

标准曲线绘制：

配制甲拌磷农药浓度0.01，0.02，0.05，0.1，0.1，1浓度梯度，在芯片上分别加入一定量的农药标准液，钙黄绿素-Pd反应液和缓冲溶液PBS＝8.2，离心充分混合反应后，在λ_ex/λ_em＝454/510处测其荧光强度F，以F对甲拌磷浓度作标准曲线。

蔬菜样品的农药残留测定：

用计算机辅助设计软件CAD绘制圆盘式微流控芯片的微结构和微通道图形。通过数控CNC微加工系统分别在三层聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片上制备微结构和微通道。之后分别用乙醇和超纯水清洗各层芯片。通过热压键合各层芯片,将蔬菜叶约40mg剪碎放入萃取池中，加入磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.9)，启动离心，速度300rpm，待萃取液进入萃取池后，加入PdCl₂和钙黄绿素淬灭液(1:1，5×10^-6)，继续离心，速度1000rpm，待溶液进入检测池，测量荧光强度，在λ_ex/λ_em＝454/510处测其荧光强度。根据溶液的荧光强度和上述标准曲线即可求得样品中甲拌磷的含量。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (5)

1.一种微流控芯片，其特征在于，包括基材、以及分布于所述基材上的至少一个检测单元，所述基材沿一中心点可转动，每个所述检测单元分别包括一萃取池、一微通道和一检测池，所述微通道的两端分别连通于所述萃取池和检测池，所述萃取池、检测池和中心点共线，且所述萃取池和检测池分别位于所述中心点的近端和远端，所述微通道包括阵列设置的多个环形的第一通道、以及连通于相邻两第一通道之间的第二通道，所述基材上分布有多个检测单元，所述多个检测单元中的萃取池以中心点为圆心围成环形，所述环形之间形成有一分配池，该分配池与每个萃取池之间分别通过一微通道连通，所述基材包括上下叠加设置的第一芯片层和第二芯片层，所述微通道形成于所述第一芯片层和第二芯片层之间，所述萃取池和检测池凹设于形成于所述第一芯片层上，所述第一芯片层上形成有第三芯片层，所述分配池形成于所述第三芯片层上并贯穿所述第三芯片层上下表面，所述第三芯片层上还形成有多个进样孔，每个所述萃取池分别对应与一个所述进样孔连通。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述基材包括圆盘形的主体部、以及凸伸于所述主体部边缘的凸伸部，所述萃取池和微通道形成于所述主体部上，所述检测池形成于所述凸伸部上。

3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：连通于所述萃取池和分配池的微通道凹设形成于所述第三芯片层的底面或凹设形成于所述第二芯片层的上表面。

4.权利要求1所述的微流控芯片在农药检测中的应用，其特征在于，包括步骤：

(1)、待测样品分别从进样孔放入萃取池；

(2)、将整个微流控芯片放入离心机，设定离心速度100～300rpm，从分配池加入萃取剂后，启动离心机，试剂均匀分布进入萃取池，将待测区的农药萃取后，进入萃取池；

(3)、从分配池继续加入荧光淬灭剂和荧光试剂的混合物，提高离心速度至1000～3000rpm，萃取液与荧光试剂反应后，充分混合进入检测池，用荧光分光光度计进行定量检测。

5.根据权利要求4所述的微流控芯片在农药检测中的应用，其特征在于：所述步骤(2)中萃取剂为pH＝7.9的磷酸盐缓冲溶液和Tritonx-100表面活性剂的混合溶液；所述步骤(3)中荧光淬灭剂为PdCl₂，荧光试剂为钙黄绿素。