CN102527306B - 一种阵列式连续流动微流控芯片装置及其制作方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种阵列式连续流动微流控芯片装置及其制作方法与应用。该装置包括合成反应微芯片、分流微芯片和试剂加料池；所述合成反应微芯片中的各反应单元的反应腔体内设有多层栅栏和围堰式结构的拦坝，可以有效束缚固相合成载体，同时保证连续流体畅通；加料模块由分流微芯片和试剂加料池构成，可实现不同试剂向合成微芯片各反应单元的独立同时进样。本发明提供的微流控芯片装置可用于固相多步合成反应，其效率高，试剂用量少，制作成本低。

Description

一种阵列式连续流动微流控芯片装置及其制作方法与应用

技术领域

本发明涉及一种阵列式连续流动微流控芯片装置及其制作方法与应用，属于微反应器技术领域。

背景技术

芯片实验室(Lab on a chip)已发展成为当今世界上最前沿的科技领域之一(Sens.Actutors，B，1990，1，244-248.)，其以微流控芯片为核心技术，在化学、生物学、医学等领域都具有十分诱人的发展前景。微流控芯片技术是把化学和生物学等领域所涉及的前处理、加样、反应、分离、分析、细胞培养等基本操作单元集成或基本集成到方寸大小的芯片之上，以取代常规化学或生物实验室各种功能的一种技术平台。微流控芯片具有比表面积大，传质传热速率快，试剂消耗小，环境友好，易规模化集成与高通量反应等特点，使其在多方面应用中都彰显出优越性。

作为微流控芯片的应用之一，微反应器技术(Tetrahedron，2005，61：2733-2742；Chem.Rev.，2007，107，2300-2318.)正蓬勃发展。微反应器是一种单元反应界面尺度为微米量级的微型化学反应系统，其将微结构内在的优势应用到化学反应过程中。它的基本特征一是线性尺寸小，在微反应器内，随着线性尺度的减小，导致物理量梯度增加以及传质传热速率加快，使化学反应更快速地达到平衡；微反应器的另一特征是高表面积/体积比，由于减小了液流的厚度，相应的面积体积比与常规化学反应容器相比显著提高，从而可实现强放热及快混合。利用微反应技术进行化学反应，具有很多优点(微流控芯片实验室，科学出版社，第五章pp.113-147)，例如，可提高化学反应的产率和选择性，保证反应的安全性并减少环境问题；能大大降低研发成本，缩短研发周期；可形成芯片实验室平台，实现化学实验自动化，提高效率等。

按体系中存在的相的状况区分，微反应器大体可分为均相和非均相两类，均相微反应器一般是指体系中只存在液相的反应器，这种体系中反应物混合均匀，分子碰撞效率高，体系达到平衡块，反应速率高。但对于多组分，多步骤的反应，均相反应模式就具有了局限性，表现在反应副产物难以从体系中去除，难以得到纯度较高的终产物等。非均相反应体系很好地解决了这一问题，非均相微反应器有液液、气液以及气液固相之分。尤其是气固和液固反应，固相载体可固定于微反应器中，流体相与固相载体充分接触发生反应，反应结束后固载相与流体相易于分离。

目前固相微反应器大体集中于酶促微反应器(Anal.Chem.，2004，76：5498-5502.)，化学催化微反应器(Angew.Chem.Int.Ed.，2006，45，2761-2766.)，固相萃取微反应器(Anal.Chem.，2003，75：5328-5335.)，磁珠免疫微反应器(Lab Chip，2005，5：657-664.)等方面的研究。而作为固相反应的重要应用，用于固相化学合成反应的微反应器报道则相对较少。固相合成技术就是将反应物连接到带有活性基团的高聚物骨架上，通过流体相引入反应物与固载物发生化学合成反应，然后通过溶剂洗涤除去杂质和副产物，并且不影响载体上的目标化合物，最后采用适当的化学或物理方法将目标化合物裂解下来。固相合成技术适用于多步骤，多组分，循环进行的反应。固相合成中应用最广泛、最成熟的是多肽固相合成(J.Am.Chem.Soc.，1963，85，2149-2154.)。由诺贝尔奖获得者Merrifield创立并发展的固相多肽合成的方法以及基于此方法发展起来的组合化学技术对化学、医药及分子生物学等领域都起了巨大的推动作用。在此基础上，一些多聚生物分子例如寡核苷酸(NucleicAcids Res.，1981，9，1691-1706.)、寡糖(Science，1993，260，1307-1309.)的化学制备已经使用了固相多步合成方法。固相合成简化了化学反应过程，不需要复杂的分离技术，容易获得较高的产率，容易实现自动化。但常规容器的固相多步合成具有反应周期较长，试剂用量较大，合成装置昂贵等缺点。将微芯片反应器与固相合成技术相结合，不但可以充分体现常规固相合成反应的优点，还能发挥微流控芯片的优势，实现高效率、高通量、集成化、自动化、成本低廉及环境友好的固相多步合成反应。

基于微芯片平台的固相合成技术目前也有相关报道(Science，2007，318，1888-1888.，Proteomics，2003，3，2135-2141.，发明专利：组合式化合物阵列芯片及制备方法，03112772.X)，但是这些固相合成往往是静态反应，不能及时输送新鲜反应液，而且需要复杂昂贵的外部设备和特殊的反应试剂。因此，发展成本低廉、装置简便的微芯片固相合成方法，并实现连续流动状态下以微流控芯片为平台的合成具有十分诱人的前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种阵列式连续流动微流控芯片装置及其制作方法与应用。

本发明提供的阵列式连续流动微流控芯片装置包括分流微芯片、试剂加料池和合成反应微芯片；所述分流微芯片包括基片A和与之键合在一起的盖片B，所述基片A上设有一路变多路的叉形分流管路，所述盖片B上设有分别与所述叉形分流管路的主路和叉形分路相连通的主路入口和数量相应的叉形分路出口；所述叉形分路出口通过管路与所述试剂加料池的入口相连通；所述试剂加料池的顶部设有开口和与之紧密配合的密封盖；所述合成反应微芯片包括基片a和与之键合在一起的盖片b，所述基片a上设有中心进样口和以之为轴心的呈辐射状分布的若干个反应单元，所述反应单元从所述中心进样口端至所述基片a的边缘端均依次由缓冲通道、分进样口、反应腔体和样品出口组成；所述中心进样口和样品出口均通过所述盖片b上设有的通孔开口于所述盖片b外；所述反应腔体内设有拦坝，所述拦坝固定在所述反应腔体的底部和两侧且与所述反应腔体的顶部设有间距；所述中心进样口和/或分进样口通过管路与所述试剂加料池的出口相连通。

上述的连续流动微流控芯片装置中，所述基片A、盖片B、基片a和盖片b的材料可均为玻璃；所述叉形分路的数量和反应单元的数量相等。

上述的连续流动微流控芯片装置中，所述缓冲通道可为蛇形缓冲通道；所述中心进样口、分进样口和样品出口可均为圆柱体形；所述反应腔体可为圆角矩形的长方体凹槽；所述反应腔体与所述样品出口之间设有另一个蛇形缓冲通道；所述试剂加料池可为底面上分别设有所述试剂加料池的入口和出口的圆柱体形；所述密封盖与所述试剂加料池可为螺纹密封连接，所述试剂加料池的材质可为聚四氟乙烯。

上述的连续流动微流控芯片装置中，所述拦坝可由围堰和设于所述围堰上的若干层栅栏组成；所述栅栏由若干个圆柱体形组成；所述若干层栅栏之间交错排列，可有效束缚固相反应载体，同时保证流路畅通；所述栅栏可为3层。

上述的连续流动微流控芯片装置中，所述叉形分路和所述反应单元的数量可均为6；所述主路入口与动力装置相连通，所述动力装置可为气动注射泵；所述装置包括与所述中心进样口、分进样口和样品出口均密封配合的双层嵌套管。

本发明还提供了上述连续流动微流控芯片装置的制作方法，包括如下步骤：

(1)将所述基片a的图形通过激光照排制成胶片掩膜；

(2)将所述胶片掩膜覆盖在匀胶铬板上，然后将所述匀胶铬板在紫外灯照射下进行曝光得到曝光后的匀胶铬板；

(3)将所述曝光后的匀胶铬板在质量百分含量为0.7％-0.8％的NaOH水溶液中显影得到显影后的匀胶铬板；

(4)将所述显影后的匀胶铬板置于去铬液中进行去铬得到去铬后的匀胶铬板，

(5)将所述去铬后的匀胶铬板置于刻蚀液中进行刻蚀后用质量百分含量为2％-4％的NaOH水溶液和所述去铬液去除残存的光胶层和铬层得到所述基片a；

(6)在所述盖片b上与所述基片a的中心进样口、分进样口和样品出口的位置相应处进行打孔；然后将所述基片a和盖片b进行清洗后置于浓硫酸中浸泡过夜或在煮沸的浓硫酸中浸泡2小时-4小时；

(7)将所述基片a和盖片b进行紧密贴合，然后在真空烘箱中进行真空预键合得到预键合的芯片；所述预键合的时间为1小时-2小时，所述预键合的温度为120℃-150℃；

(8)将所述预键合的芯片置于马弗炉中进行程序升温键合即得所述合成反应微芯片；

(9)将所述基片A的图形通过激光照排制成胶片掩膜；

(10)将所述胶片掩膜覆盖在匀胶铬板上，然后将所述匀胶铬板在紫外灯照射下进行曝光得到曝光后的匀胶铬板；

(11)将所述曝光后的匀胶铬板在质量百分含量为0.7％-0.8％的NaOH水溶液中显影得到显影后的匀胶铬板；

(12)将所述显影后的匀胶铬板置于去铬液中进行去铬得到去铬后的匀胶铬板；

(13)将所述去铬后的匀胶铬板置于刻蚀液中进行刻蚀后用质量百分含量为2％-4％的NaOH水溶液和所述去铬液去除残存的光胶层和铬层得到所述基片A；

(14)在所述盖片B上与所述基片A的主路入口和叉形分路出口的位置相应处进行打孔；然后将所述基片A和盖片B进行清洗后置于浓硫酸中浸泡过夜或在煮沸的浓硫酸中浸泡2小时-4小时；

(15)将所述基片A和盖片B进行紧密贴合，然后在真空烘箱中进行真空预键合得到预键合的芯片；所述预键合的时间为1小时-2小时，所述预键合的温度为120℃-150℃；

(16)将所述预键合的芯片置于马弗炉中进行程序升温键合即得所述合成分流微芯片；

(17)将所述分流微芯片、试剂加料池和合成反应微芯片相连通即得所述装置。

上述的制作方法中，所述曝光时间可为8秒；所述去铬液可由硝酸铈铵、冰醋酸和水组成，所述去铬液中硝酸铈铵的质量-体积浓度为0.2g/mL，所述去铬液中冰醋酸的体积百分含量为3.5％；所述刻蚀液可由质量百分含量为40％的氢氟酸水溶液、质量百分含量为65％的硝酸水溶液和水组成，所述氢氟酸水溶液、硝酸水溶液和水的体积比可为1∶0.7∶3.3。

上述的制作方法中，步骤(6)所述清洗的溶剂可依次为加有洗涤剂的去离子水、乙醇、丙酮、由氨水、质量百分含量为20％的过氧化氢水溶液和水的体积比为1∶1∶5组成的混合溶剂和由盐酸、质量百分含量为20％的过氧化氢水溶液和水的体积比为1∶1∶6组成的混合溶剂。

本发明还提供了上述装置在多肽固相合成中的应用。

上述应用的具体操作步骤如下：通过所述分进样口将分散于溶液中的固相载体分别注射到各所述反应腔体中，所述反应腔体中的拦坝将载体微球束缚，溶液顺利流过所述反应腔体，使用真空泵通过所述样品出口施加负压，将溶剂抽干，载体被成功固定；合成反应进行时，所述装置可实现两种模式的试剂引入，分别为(1)各所述反应单元注入同种试剂时，由注射泵通过所述中心进样口施加正压从而向所述反应腔体中引入反应溶液；(2)各所述反应单元注入不同种试剂时，开启各所述试剂加料池，将反应液加入到所述试剂加料池中，旋紧密封盖使其密封，由注射泵推动充气注射器，通过所述分流微芯片将充气推动力分流，推动与所述分流微芯片的多分路出口分别相连的试剂加料池，将不同的反应液引入到所述合成反应芯片的各反应腔体中；固相载体树脂洗涤步骤时，由注射泵通过所述中心进样口引入洗涤溶液；试剂引入，树脂洗涤可多步循环进行，直至目标化学物合成完毕；合成反应结束后，由注射泵通过所述中心进样口引入裂解液将反应产物由固相载体上裂解分离，在各所述样品出口处收集反应产物。

本发明提供的以玻璃微流控反应芯片为核心的阵列式连续流动微流控芯片装置，可实现快速、集成的固相多步合成反应。所述装置的合成反应微芯片具有多个平行的反应单元，单元间既相互连接又可独立反应，可同时进行不同序列的一系列化合物的合成反应；在阵列式合成微芯片的每个反应单元中设计了具有多层栅栏-围堰式结构拦坝的反应腔体，合成反应的固相载体可被固定于反应腔体中而反应液可自由流通；在中心进样口和分进样口之间设计了蛇形缓冲区域，很大程度上减小了液体的混流和杂质的引入；在阵列反应微芯片的上游设计了分流微芯片和试剂加料池，可实现多单元同时并独立进样；本装置在形式上采取了连续流动试剂输入模式，可不断向所述装置提供新鲜反应液，促进反应不断向正方向进行。本发明提供的装置可耐受酸性、碱性、有机溶剂等各种苛刻的反应条件。本发明提供的装置可实现多通道固相多步循环化学合成，具有微型化、集成化、高效率、低成本以及环境友好的优点。

附图说明

图1为本发明实施例1制作的合成微芯片的设计规格示意图。

图2为本发明实施例1制作的分流微芯片的设计规格示意图。

图3为本发明实施例1制作合成微芯片和分流微芯片的过程示意图。

图4为本发明实施例1制作的合成微芯片的结构示意图。

图5为本发明实施例1制作的试剂加料池的结构示意图。

图6为本发明实施例1制作的微流控芯片装置的结构示意图。

图7为本发明实施例1制作的合成腔体的结构示意图。

图8为本发明实施例2制备的亮氨酸脑啡肽和其标准样品的液相色谱图。

图9为本发明实施例3制备的AR1、AR2、AR3、AR4、AR5和AR6的液相色谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、阵列式连续流动微流控芯片装置的制作

(1)六通道合成反应微芯片的制作

六通道合成反应微芯片的制作过程如图3所示，其中，步骤A表示曝光步骤，步骤B表示显影步骤，步骤C表示去铬步骤，步骤D表示腐蚀步骤，步骤E表示去光胶去铬步骤，步骤F表示键合步骤。

合成反应微芯片的微通道尺寸设计如图1所示，将设计好的合成反应微芯片图形通过激光照排制成胶片掩膜；将该胶片掩膜覆盖在63.5mm×63.5mm×1.5mm的匀胶铬版(铬型：LRC；铬厚：145nm；胶厚：570nm)上，在紫外灯照射(365nm)下曝光8秒；曝光后的铬版在质量百分含量为0.7％的NaOH水溶液中显影，掩膜上的图形被复制到光胶层上；室温下将显影后的匀胶铬版放入到去铬液(该去铬液中硝酸铈铵的质量-体积浓度为0.2g/mL，冰醋酸的体积百分含量为3.5％)中腐蚀裸露的铬层；将去铬后的铬版置于刻蚀液(该刻蚀液由质量百分含量为40％的氢氟酸水溶液、质量百分含量为65％的硝酸水溶液和水组成，所述氢氟酸水溶液、硝酸水溶液和水的体积分别为12mL、8.4mL和39.6mL，三者的体积比为1∶0.7∶3.3)中，刻蚀时间为2小时；用质量百分含量为2％的NaOH水溶液和上述去铬液去除残存的光胶层及铬层；截取与基片同样大小的的玻璃盖片，在盖片上与基片的进样口处相对应的位置用微型台式钻床打孔，孔直径1.6mm；将基片和盖片在下列溶液中依次超声清洗15分钟：加有洗涤剂的去离子水、乙醇、丙酮、RCA-1(为质量百分含量为20％的过氧化氢水溶液和水的体积比为1∶1∶5组成的混合溶剂和由盐酸)、RCA-2(为质量百分含量为20％的过氧化氢水溶液和水的体积比为1∶1∶6组成的混合溶剂)，将清洗后的基片和盖片置入浓硫酸中浸泡过夜；用去离子水冲洗芯片并在流动的去离子水中将基片与盖片紧紧贴合，置于真空烘箱中进行真空预键合，预键合时间为1小时，预键合温度为150℃；将预键合好的芯片置于马弗炉中程序升温键合，升温程序为0-10-70-110-470min，30-130-130-600-600℃得到合成反应微芯片，基本无渗漏或劈裂现象。

上述制备的合成反应微芯片的结构如图4所示。

(2)叉形分流微芯片的制作

叉形分流微芯片的制作过程如图3所示。

叉形分流微芯片的微通道尺寸设计如图2所示，将设计好的微流控芯片图形通过激光照排制成胶片掩膜；将该胶片掩膜覆盖在32.0mm×32.0mm×1.5mm的匀胶铬版(铬型：LRC；铬厚：145nm；胶厚：570nm)上，在紫外灯照射(365nm)下曝光8秒；上进行曝光；曝光后的铬版在质量百分含量为0.8％的NaOH水溶液中显影，掩膜上的图形被复制到光胶层上；室温下将显影后的匀胶铬版放入到去铬液(该去铬液中硝酸铈铵的质量-体积浓度为0.2g/mL，冰醋酸和水的体积比为0.7∶20)中腐蚀裸露的铬层；将去铬后的铬版置于刻蚀液(该刻蚀液由质量百分含量为40％的氢氟酸水溶液、质量百分含量为65％的硝酸水溶液和水组成，所述氢氟酸水溶液、硝酸水溶液和水的体积分别为12mL、8.4mL和39.6mL，三者的体积比为1∶0.7∶3.3)中，刻蚀时间为2小时；用质量百分含量为4％的NaOH水溶液和上述去铬液去除残存的光胶层及铬层；截取与基片同样大小的的玻璃盖片，在盖片上与基片的主路入口和分路入口处相对应的位置用微型台式钻床打孔，孔直径1.6mm；将基片和盖片在下列溶液中依次超声清洗15分钟：加有洗涤剂的去离子水、乙醇、丙酮、RCA-1(为质量百分含量为20％的过氧化氢水溶液和水的体积比为1∶1∶5组成的混合溶剂和由盐酸)、RCA-2(为质量百分含量为20％的过氧化氢水溶液和水的体积比为1∶1∶6组成的混合溶剂)，将清洗后的基片和盖片置入浓硫酸中浸泡过夜；用去离子水冲洗芯片并在流动的去离子水中将基片与盖片紧紧贴合，置于真空烘箱中进行真空预键合，预键合时间为2小时，预键合温度为120℃；将预键合好的芯片置于马弗炉中程序升温键合，升温程序为0-10-70-110-470min，30-130-130-600-600℃得到分流微芯片，基本无渗漏或劈裂现象。

(3)试剂加料池的制作

试剂加料池构造如图5所示，其材质为聚四氟乙烯，该试剂加料池7的主腔体为圆柱形，腔体加工螺纹，制作与之配套的密封盖14；底面上加工双通结构管路，管路内径为1.6mm，分别与分流微芯片的分路出口和合成反应微芯片的中心进样口和分进样口相连。

(4)将上述制作的分流微芯片、试剂加料池和合成反应微芯片顺序连通后即得到六通道的阵列式连续流动微流控芯片装置，其结构如图6所示；图6中各标记如下，1中心进样口、2蛇形缓冲通道、3分进样口、4反应腔体、5样品出口、6合成反应微芯片、7试剂加料池、8分流微芯片、9主路入口、10叉形分路出口。

其中，反应腔体4的结构如图7所示，图7中各标记如下，11围堰、12栅栏、13固相载体树脂。

本实施例制作的阵列式连续流动微流控芯片装置包括合成反应微芯片6，该合成反应微芯片6包括规格为63.5×63.5×1.5mm³的抛光玻璃制成的六通道辐射状微流控芯片作为基片(基片a)以及与之键合在一起的面积相同的玻璃盖片(盖片b)；基片a上设有中心进样口1，以中心进样口1为中心，向外辐射六个完全相同的辐射状反应单元；各反应单元从中心进样口1端至合成反应微芯片6的边缘端依次由蛇形缓冲通道2、分进样口3、反应腔体4和样品出口5组成；其中，蛇形缓冲通道2的宽度为50μm，深度为60μm；反应腔体4为圆角矩形的长方体凹槽，其宽度为600μm，深度为150μm，长度为1.3cm，反应腔体4的腔体内设有一个拦坝，该拦坝由围堰11和设之于该围堰11的上面的三层圆柱体形微柱栅栏12组成，围堰11的的高度为130μm，栅栏12的高度为20μm，三层栅栏12之间的行间距为10μm，每个栅栏微珠的间距为10μm，三层栅栏12之间呈交错排列；中心进样口1、分进样口3和样品出口5的内径均为1.6mm；分流微芯片8包括键合在一起的玻璃基片(基片A)与玻璃盖片(基片B)，该玻璃基片与玻璃盖片的规格均为32.0×32.0×1.5mm³，基片A上设有一路变六路的叉形分流管路，主路宽度为600μm，叉形六路管路的宽度为50μm，主路和叉形管路的深度均为60μm；试剂加料池7的材质为聚四氟乙烯，其主腔体为圆柱形，腔体加工螺纹，制作与之配套的密封盖14；底面上加工双通结构管路15，管路内径为1.6mm，分别与分流微芯片的分路出口和合成反应微芯片的中心进样口和分进样口相连。该装置设有与中心进样口1、分进样口3和样品出口5密封配合的双层嵌套管(图中未示出)，其中，内管为内径1.2mm，外径1.6mm的聚四氟乙烯管线，外管为内径1.6mm，外径2.2mm的不锈钢管路。

使用上述装置时，将主路入口9与气动注射泵相连，样品出口5与接收瓶相连即可。

实施例2、利用实施例1制作的连续流动微流控芯片装置进行各个反应单元的多肽合成反应

(1)固相载体的制备

常规容器固相多肽合成中使用的载体王树脂等交联度比较低，在有机溶剂氛围下发生溶胀。如果将溶胀的树脂填入微流控芯片反应腔体中，会发生变形而堵塞微通道。因此采用种子一步溶胀聚合法制备了适用于本发明的微流控芯片装置的高交联刚性载体微球，具体制备方法如下：

a、聚乙烯(PS)种子的制备：根据文献(Macromolecules，1990，23，3104-3109.)，制备了粒径约为10μm的PS种子。

b、反应体系油相包括单体对氯甲基苯乙烯(4-Vinylbenzyl chloride)2.5mL，交联剂二乙烯基苯(DVB)2.5mL，引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)0.1g；反应体系水相包括1g PS种子，1.2g聚乙烯醇(PVA)，0.12g十二烷基磺酸钠(SDS)，120mL去离子水；将上述油相与1/3的上述水相混合，超声乳化，逐滴加入至2/3的水相中，在混合体系中加入3.75mL甲苯和1.25mL正辛醇作为致孔剂；控制种子溶胀的溶胀温度为30℃，溶胀时间为24小时；聚合反应的升温梯度为55-60-65-70℃，反应时间为12小时，每隔3小时调高一个温度梯度，得到树脂基质。

c、用丙酮对上述制得的树脂基质进行索氏抽提以除去致孔剂，得交联度为50％的树脂微球；然后将得到的树脂微球分散到15mL含有0.55g对羟基苯甲醇的二氯甲烷(DCM)溶液中，反应12小时得羟甲基酚甲基聚苯乙烯树脂微球。

d、根据文献(Fmoc solid phase peptide synthesis，Oxford University Press，2000，ch.3，pp.47-48.)，将Fmoc保护的氨基酸偶联于上述制得的羟甲基酚甲基聚苯乙烯树脂微球之上；得到了Fmoc-Leu、Fomc-Ser和Fmoc-Phe三种氨基酸修饰的固相肽合成载体。根据文献(Fmoc solid phase peptide synthesis，Oxford University Press，2000，ch.3，pp.63.)，对上述制得的三种氨基酸修饰的固相肽合成载体的键合量进行测定，Fmoc-Leu树脂键合量为0.73mmol/g，Fomc-Ser树脂键合量为0.97mmol/g，Fmoc-Phe树脂键合量为0.70mmol/g。

(2)以上述制备的Fmoc-Leu修饰的固相肽合成载体作为固相载体，利用实施例1制作的阵列式连续流动微流控芯片装置合成亮氨酸脑啡肽。

根据文献(Int.J.Pept.Protein Res.，1990，35，161-214.)报道的方法合成多肽亮氨酸脑啡肽，其序列为Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu。

具体合成步骤如下：

a、使用精密注射泵推动1mL注射器通过中心进样口1将分散于N’N-二甲基甲酰胺(DMF)中的Fmoc-Leu修饰的固相肽合成载体注入到反应腔体中，注入质量为2.54mg；反应腔体4中的三层栅栏12和围堰11式结构的拦坝将该载体微球束缚，而DMF溶液顺利流过反应腔体4。

b、脱保护：通过注射泵从中心进样口1注入脱保护试剂(质量百分含量为20％的六氢吡啶的DMF溶液)，注射流速为2μL/min，脱保护时间为5分钟。

c、洗涤树脂：使用真空泵通过样品出口5施加负压，将溶剂抽干；通过注射泵由中心进样口1注入DMF洗涤树脂，除去残余的脱保护试剂及反应后杂质，注射流速为300μL/min，洗涤时间为6分钟。

d、氨基酸偶联：将C端第二位氨基酸试剂Fmoc-Phe与苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)混合，加入活化试剂(摩尔浓度为0.4mol/L的N-甲基吗啡啉的DMF溶液)配成氨基酸偶联试剂；通过注射泵由中心进样口1将上述氨基酸偶联试剂引入到反应腔体4中，注入流速为2μL/min，偶联时间为20分钟。

e、洗涤树脂：使用真空泵通过样品出口5施加负压，将反应液抽干；注入DMF清洗树脂；注射流速为50μL/min，洗涤时间为6分钟。洗涤树脂之后，抽干洗涤液。

f、依次重复步骤b、c、d和e 3次，其中，步骤d中的氨基酸试剂依次为氨基酸试剂Fmoc-Tyr、Fmoc-Gly和Fmoc-Gly得到亮脑啡肽。

g、亮脑啡肽合成结束之后，注入脱保护试剂，使N端氨基酸的保护基团脱除，并注入DMF洗涤树脂。

h、溶剂置换：通过注射泵先后注入二氯甲烷、甲醇置换DMF溶剂；注射泵流速为25μL/min，置换时间分别为3分钟。

i、原位裂解：通过注射泵由中心进样口1注入裂解试剂(质量百分含量为97.5％的三氟乙酸(TFA)的水溶液)，注射流速为2μL/min，裂解时间为30分钟；在样品出口5处收集裂解产物即得肽亮氨酸脑啡肽。

(3)步骤(2)制备的裂解产物的分析与鉴定

a、将得到的裂解产物用乙醚沉淀，然后收集固体洗涤抽干。以反相液相色谱分析检测。色谱体系为：Hitachi L-7610脱气机，Hitachi L-7100四元梯度泵，Hitachi L-7420紫外-可见检测器，Hitachi L-7300柱温箱，Hitachi D-7000面板以及Rheodyne 7725i进样阀。色谱条件：色谱柱：TSK-gel ODS-100V(150mm×4.6mm i.d.)；淋洗梯度：0-30-35min，5-80-80％乙腈/水，0.1％TFA)；流速：1mL min-1；检测波长：220nm；灵敏度：0.01。其液相色谱图如图8所示；其中，亮氨酸脑啡肽的标准品购自Boehringer Co.Manheim，Germany。

b、收集色谱分离主峰进行质谱检测。检测仪器：Bruker Daltonics BIFLEX III基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱。质谱信号显示质荷比为556.4，578.4及594.3，分别为多肽肽亮氨酸脑啡肽YGGFL的[M+H]⁺，[M+Na]⁺及[M+K]⁺分子离子峰。

c、经反相液相色谱分析，多肽粗产物的纯度为91.8％。质谱鉴定也验证了合成序列的正确性。

利用本发明装置的五肽合成反应在四小时内可完成，相较于常规多肽合成中数十小时甚至几天的反应周期，反应效率大大提高。反应中还实现了原位裂解，而常规的多肽合成仪器不能实现原位裂解或需采用专用的裂解装置。

实施例3、以实施例2制备的Fmoc-Leu、Fomc-Ser和Fmoc-Phe修饰的固相肽合成载体作为固相载体，利用实施例1制作的连续流动微流控芯片装置进行集成化固相多肽合成反应

(1)根据文献(Combinatorial Chemistry，Oxford University Press，1998，ch.3，pp.42-43.)报道的方法合成抗β-内啡肽3E7mAb亲和多肽库中亲和活性较高的六种多肽YGAFLS(AR1)，YGAFS(AR2)，YGAFL(AR3)，YGGFLS(AR4)，YGAF(AR5)和YGALS(AR6)。

具体合成步骤如下：

a、使用精密注射泵推动1mL注射器通过分进样口3将分散于DMF中的实施例2制备的羟甲基酚甲基聚苯乙烯树脂微球分别注入到反应腔体4中，每个反应腔体4中注入实施例2制备的偶联有不同氨基酸的六份树脂。每个反应腔体4中的固相载体类型和质量分别为：Fmoc-Ser修饰的固相肽合成载体，2.07mg；Fmoc-Ser修饰的固相肽合成载体，1.98mg；Fmoc-Leu修饰的固相肽合成载体，2.59mg；Fmoc-Ser修饰的固相肽合成载体，2.34mg；Fmoc-Phe修饰的固相肽合成载体，2.13mg；Fmoc-Ser修饰的固相肽合成载体，2.45mg。各个单元反应腔体4中的三层栅栏12和围堰11式结构的拦坝将上述固相载体微球束缚，而DMF溶液顺利流过腔体。

b、脱保护：由注射泵从中心进样口注入脱保护试剂，注射流速为12μL/min，脱保护时间为5分钟。

c、洗涤树脂：使用真空泵通过样品出口5施加负压，将溶剂抽干。由注射泵从中心进样口1注入DMF洗涤树脂，除去残余的脱保护试剂及反应后杂质，注射流速为300μL/min，洗涤时间为6分钟。

d、氨基酸偶联：将各反应单元所合成序列的Fmoc-氨基酸与HBTU混合，加入活化剂配成氨基酸偶联试剂。打开旋塞，将上述偶联试剂加入到试剂加料池7中；由注射泵推动充气注射器，通过一路变六路的分流微芯片8将充气推动力分为六份，推动与分流微芯片8相连的氨基酸加料池，将不同的氨基酸偶联试剂引入到反应腔体4中，注入流速为12μL/min，偶联时间为20分钟。

e、洗涤树脂：使用真空泵通过样品出口5施加负压，将反应液抽干。注入DMF清洗树脂。注射流速为300μL/min，洗涤时间为6分钟。洗涤树脂之后，抽干洗涤液。

f、根据每个反应腔体4中合成多肽的长度，依次重复步骤b、c、d和e的次数为氨基酸残基数减1。

g、六个反应腔体4内的多肽合成结束之后，由中心进样口1注入脱保护试剂，使N端氨基酸的保护基团脱除，并注入DMF洗涤树脂。

h、溶剂置换：由注射泵从中心进样口1先后注入二氯甲烷、甲醇置换DMF溶剂，注射流速为150μL/min，置换时间分别为3分钟。

i、原位裂解：由注射泵从中心进样口1注入裂解试剂(质量百分含量为97.5％的三氟乙酸(TFA)的水溶液)，注射流速为12μL/min，裂解时间为30分钟。在六个反应腔体4的样品出口5处收集裂解产物。

(2)裂解产物的分析与鉴定

a、将从六个样品出口5处接收的裂解产物用乙醚沉淀，收集固体洗涤抽干。以反相液相色谱分析检测。色谱体系与实施例2中的色谱体系相同。色谱条件：色谱柱：TSK-gel ODS-100V(150mm×4.6mm i.d.)；淋洗梯度：0-20-25min，5-80-80％乙腈/水，0.1％TFA)；流速：1mL min-1；检测波长：220nm；灵敏度：0.01。

b、将收集的各色谱分离主峰进行质谱检测。检测仪器：Bruker Daltonics BIFLEXIII基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱。六种产物的质谱图如图9所示，AR-1谱图中，质谱信号显示质荷比为657.3，679.3及695.3，分别对应多肽YGAFLS的[M+H]⁺，[M+Na]⁺及[M+K]⁺分子离子峰；AR-2谱图中，质谱信号显示质荷比为544.2，566.2及582.1，分别对应多肽YGAFS的[M+H]⁺，[M+Na]⁺及[M+K]分子离子峰；AR-3谱图中，质谱信号显示质荷比为570.4及608.1，分别对应多肽YGAFL的[M+H]⁺及[M+K]⁺分子离子峰；AR-4谱图中，质谱信号显示质荷比为643.3，665.3及681.3，分别对应多肽YGGFLS的[M+H]⁺，[M+Na]⁺及[M+K]⁺分子离子峰；AR-5谱图中，质谱信号显示质荷比为457.1，479.1及495.1，分别对应多肽YGAF的[M+H]⁺，[M+Na]⁺及[M+K]⁺分子离子峰；AR-5谱图中，质谱信号显示质荷比为510.2，532.2及548.2，分别对应多肽YGALS的[M+H]⁺，[M+Na]⁺和[M+K]⁺分子离子峰。6种产物的液相色谱图如图9所示。

c、经反相液相色谱分析，6种产物的纯度分别为90.8％，88.7％，91.5％，73.4％，90.2％和89.7％。质谱鉴定证明了合成序列的正确性。本发明的装置可在短时间内同时合成具有较高纯度的一系列不同长度，不同序列的多肽。本发明提供的微流控装置具有高效率、集成化、低成本的特点，有望发展成基于微流控芯片系统的集成化多肽合成-在线识别筛选平台。

Claims (9)

1.一种阵列式连续流动微流控芯片装置，其特征在于：所述装置包括分流微芯片、试剂加料池和合成反应微芯片；所述分流微芯片包括基片A和与之键合在一起的盖片B，所述基片A上设有一路变多路的叉形分流管路，所述盖片B上设有分别与所述叉形分流管路的主路和叉形分路相连通的主路入口和数量相应的叉形分路出口；所述叉形分路出口通过管路与所述试剂加料池的入口相连通；所述试剂加料池的顶部设有开口和与之紧密配合的密封盖；所述合成反应微芯片包括基片a和与之键合在一起的盖片b，所述基片a上设有中心进样口和以之为中心的呈辐射状分布的若干个反应单元，所述反应单元从所述中心进样口端至所述基片a的边缘端均依次由缓冲通道、分进样口、反应腔体和样品出口组成；所述中心进样口和样品出口均通过所述盖片b上设有的通孔开口于所述盖片b外；所述反应腔体内设有拦坝，所述拦坝固定在所述反应腔体的底部和两侧且与所述反应腔体的顶部设有间距；所述中心进样口和分进样口均通过管路与所述试剂加料池的出口相连通；

所述拦坝由围堰和设于所述围堰上的若干层栅栏组成；所述栅栏由若干个圆柱体组成；所述若干层栅栏之间交错排列。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述基片A、盖片B、基片a和盖片b的材料均为玻璃；所述叉形分路的数量和反应单元的数量相等。

3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述缓冲通道为蛇形缓冲通道；所述中心进样口、分进样口和样品出口均为圆柱体形；所述反应腔体为圆角矩形的长方体凹槽；所述反应腔体与所述样品出口之间设有另一个蛇形缓冲通道；所述试剂加料池为底面上分别设有所述试剂加料池的入口和出口的圆柱体形；所述密封盖与所述试剂加料池为螺纹密封连接。

4.根据权利要求3所述的装置，其特征在于：所述栅栏为3层。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的装置，其特征在于：所述叉形分路和所述反应单元的数量均为6；所述主路入口与动力装置相连通，所述动力装置为气动注射泵；所述装置包括与所述中心进样口、分进样口和样品出口均密封配合的双层嵌套管。

6.权利要求1-5中任一所述装置的制作方法，包括如下步骤：

（1）将所述基片a的图形通过激光照排制成胶片掩膜；

（2）将所述胶片掩膜覆盖在匀胶铬板上，然后将所述匀胶铬板在紫外灯照射下进行曝光得到曝光后的匀胶铬板；

（3）将所述曝光后的匀胶铬板在质量百分含量为0.7%-0.8%的NaOH水溶液中显影得到显影后的匀胶铬板；

（4）将所述显影后的匀胶铬板置于去铬液中进行去铬得到去铬后的匀胶铬板；

（5）将所述去铬后的匀胶铬板置于刻蚀液中进行刻蚀后用质量百分含量为2%-4%的NaOH水溶液和所述去铬液去除残存的光胶层和铬层得到所述基片a；

（6）在所述盖片b上与所述基片a的中心进样口、分进样口和样品出口的位置相应处进行打孔；然后将所述基片a和盖片b进行清洗后置于浓硫酸中浸泡过夜或在煮沸的浓硫酸中浸泡2小时-4小时；

（7）将所述基片a和盖片b进行紧密贴合，然后在真空烘箱中进行真空预键合得到预键合的芯片；所述预键合的时间为1小时-2小时，所述预键合的温度为120℃-150℃；

（8）将所述预键合的芯片置于马弗炉中进行程序升温键合即得所述合成反应微芯片；

（9）将所述基片A的图形通过激光照排制成胶片掩膜；

（10）将所述胶片掩膜覆盖在匀胶铬板上，然后将所述匀胶铬板在紫外灯照射下进行曝光得到曝光后的匀胶铬板；

（11）将所述曝光后的匀胶铬板在质量百分含量为0.7%-0.8%的NaOH水溶液中显影得到显影后的匀胶铬板；

（12）将所述显影后的匀胶铬板置于去铬液中进行去铬得到去铬后的匀胶铬板；

（13）将所述去铬后的匀胶铬板置于刻蚀液中进行刻蚀后用质量百分含量为2%-4%的NaOH水溶液和所述去铬液去除残存的光胶层和铬层得到所述基片A；

（14）在所述盖片B上与所述基片A的主路入口和叉形分路出口的位置相应处进行打孔；然后将所述基片A和盖片B进行清洗后置于浓硫酸中浸泡过夜或在煮沸的浓硫酸中浸泡2小时-4小时；

（15）将所述基片A和盖片B进行紧密贴合，然后在真空烘箱中进行真空预键合得到预键合的芯片；所述预键合的时间为1小时-2小时，所述预键合的温度为120℃-150℃；

（16）将所述预键合的芯片置于马弗炉中进行程序升温键合即得所述合成分流微芯片；

（17）将所述分流微芯片、试剂加料池和合成反应微芯片相连通即得所述装置。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述去铬液由硝酸铈铵、冰醋酸和水组成，所述去铬液中硝酸铈铵的质量-体积浓度为0.2g/mL，所述去铬液中冰醋酸的体积百分含量为3.5%；所述刻蚀液由质量百分含量为40%的氢氟酸水溶液、质量百分含量为65%的硝酸水溶液和水组成，所述氢氟酸水溶液、硝酸水溶液和水的体积比为1：0.7：3.3。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：步骤（6）所述清洗的溶剂依次为加有洗涤剂的去离子水、乙醇、丙酮、由氨水、质量百分含量为20%的过氧化氢水溶液和水的体积比为1：1：5组成的混合溶剂和由盐酸、质量百分含量为20%的过氧化氢水溶液和水的体积比为1：1：6组成的混合溶剂。

9.权利要求1-5中任一所述装置在多肽固相合成中的应用。

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