CN103755777B - 一种气控固相多肽合成微流控芯片装置及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种气控固相多肽合成微流控芯片装置及其应用。所述装置包括合成反应微流控芯片、试剂加料池阵列、多路气体电磁阀和恒压气源；所述合成反应微流控芯片内部设有流道结构，所述流道结构包括主流道和多条分支流道，所述主流道的接近所述出口处设有反应腔体，每条分支流道的一端与所述主流道连通；所述试剂加料池阵列包括多个试剂加料池，每个试剂加料池与所述合成反应微流控芯片连通；所述多路气体电磁阀设有共同的输入端与所述恒压气源连通，每路气体电磁阀设有输出端与每个试剂加料池连通；所述恒压气源用于向所述多路气体电磁阀输出设定压力范围的气压。本发明的装置能够用于连续流动的固相多肽合成。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，尤其涉及固相多肽合成技术领域，特别涉及一种气控固相多肽合成微流控芯片装置及其应用。
背景技术
固相化学合成是非均相反应的重要应用，由诺贝尔奖获得者Merrifield创立并在此后得到深入发展。固相多肽合成是固相化学合成最广泛的应用之一（J.Am.Chem.Soc.,1963,85,2149-2154.）。
固相多肽合成方法是将反应物连接到带有活性基团的高聚物骨架上，通过流体相引入反应物与固载物发生化学合成反应，并除去杂质和副产物，最后采用适当的化学方法将目标多肽裂解下来。固相多肽合成不需要复杂的分离技术，容易获得较高的产率，容易实现自动化。
然而，随着蛋白质组学的发展，对微量、快速合成的多肽需求越来越大，研究自动化的微量多肽合成技术及其装置具有重大意义。微量多肽固相合成技术目前只有少量报道（Science,2007,318,1888-1888.,Proteomics,2003,3,2135-2141.；发明专利申请：组装式化合物阵列芯片及制备方法，03112772.X），但是这些固相合成往往是静态反应，不能及时输送新鲜反应液，而且需要复杂昂贵的外部设备和特殊的反应试剂。因此，发展结构简单、可自动化的微量多肽固相合成方法具有十分诱人的前景。
自从上世纪九十年代出现微流控芯片技术以来，该领域已发展成为当今最有活力的科技领域之一（Sens.Actutors,B,1990,1,244-248.）。微流控芯片技术能把化学和生物实验室中的前处理、加样、反应、分离、分析及细胞培养等基本操作单元集成微型化的芯片上来，从而具有比表面积大、传质传热速率快、试剂消耗小、环境友好、易规模化集成与高通量反应等特点，使其在多方面应用中都彰显出优越性。
构建化学微反应器是微流控芯片的重要应用方向之一（Tetrahedron,2005,61:2733-2742；Chem.Rev.,2007,107,2300-2318.）。采用微流控芯片技术构建多肽固相合成微反应器，不但特别适合合成微量多肽，而且合成速度明显快于常规合成，并且容易实现自动化控制。
然而，固相多肽合成需要使用二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、三氟乙酸（TFA）等强有机溶剂和挥发性强酸，因此常规用于微流控芯片自动化控制的普通泵、阀等都难以直接运用，需要采取更为巧妙的设计方能保证在微流控芯片进行自动化固相多肽合成。
发明内容
本发明的目的在于提供一种气控固相多肽合成微流控芯片装置，用于连续流动的固相多肽合成，使用该装置能实现全自动的微流控芯片上固相多肽合成，并可通过并行化实现高通量的同时合成。
为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：
一种气控固相多肽合成微流控芯片装置，包括合成反应微流控芯片、试剂加料池阵列、多路气体电磁阀和恒压气源；
所述合成反应微流控芯片内部设有流道结构，所述流道结构包括主流道，所述主流道两端分别设有主进样口和出口，所述出口处设有过滤结构，所述主流道的接近所述出口处设有反应腔体，所述主流道一侧或两侧设有多条分支流道，每条分支流道的一端与所述主流道连通而另一端设有分支进样口；
所述试剂加料池阵列包括多个试剂加料池，每个试剂加料池设有输入端和输出端，所述输出端与所述合成反应微流控芯片上的一个分支进样口连通；
所述多路气体电磁阀设有共同的输入端，每路气体电磁阀设有输出端，所述输入端与所述恒压气源连通，每个输出端与每个试剂加料池的输入端连通；
所述恒压气源用于向所述多路气体电磁阀输出设定压力范围的气压。
作为本发明的优选方案，所述主流道的两侧交错设置多条分支流道，呈梳状排布，所述分支流道的与所述主流道连接处的横截面积比所述分支流道其它部分的横截面积小。这种独特的结构设计有助于减少来源于不同试剂加料池的不同氨基酸原料间的相互污染。
作为本发明的优选方案，所述合成反应微流控芯片由玻璃材质的盖片与基片键合而成，所述盖片上设有凹陷的槽状结构，所述基片为平整的玻璃片，所述盖片与基片键合后所述槽状结构被密封形成流道结构。这种结构的合成反应微流控芯片制备方法简单，密封性好，稳定可靠。
作为本发明的优选方案，所述反应腔体的横截面积比所述反应腔体两端的主流道的横截面积大。由于反应腔体的内腔空间较大，为反应提供较大的空间，因此反应能够充分进行；而且反应腔体相比两端的主流道内腔空间的增大降低了液体在反应腔体内的流速，避免固相多肽合成用载体被液流快速冲出反应腔体，而影响反应充分进行。
作为本发明的优选方案，所述主流道出口处的过滤结构为滤膜，所述滤膜的孔径小于固相多肽合成用载体的直径。滤膜能够有效拦截固相多肽合成用载体，避免被冲出主流道出口，同时又不影响反应废液的排出。本领域的技术人员能够理解，还可以采用其它过滤结构实现相同的功能。
作为本发明的优选方案，每路气体电磁阀的输出端与每个试剂加料池的输入端通过连接管线连通，所述连接管线设有防止液体回流进入气体电磁阀的单向阀。单向阀只允许连接管线中的气体从每路气体电磁阀的输出端流向每个试剂加料池的输入端，而不允许逆向流动，因此能够有效防止液体回流进入气体电磁阀，保证装置的稳定运行。
作为本发明的优选方案，所述试剂加料池采用聚四氟乙烯（Polytetrafluoroethene，PTFE）材质，所述试剂加料池包括池体和池盖，当池盖打开时可向池体中加入试剂，当池盖拧紧后密封池体。PTFE材料具有抗酸抗碱、抗各种有机溶剂的特点，几乎不溶于所有的溶剂，为本发明使用强酸和有机溶剂提供了保障，保证所述试剂加料池不会受到本发明所用的强酸和有机溶剂的影响而受损。
作为本发明的优选方案，所述恒压气源包括气泵、储气囊和压力传感器；所述压力传感器实时检测压力，当压力低于设定的阈值下限时，气泵开始工作，把气体泵入储气囊；当压力高于设定的阈值上限时，气泵停止工作，使得压力保持在设定压力范围内。恒压气源是本领域的技术人员熟知的，其基本构造主要包括上述气泵、储气囊和压力传感器，本领域技术人员可以根据已有知识和经验组装恒压气源，其设定压力范围可以根据本领域技术人员的经验和具体需要设置。
作为本发明的优选方案，所述合成反应微流控芯片上的主进样口、分支进样口和出口均为圆柱体形；所述流道结构的截面为半圆角矩形和/或半圆弧；所述主流道和/或分支流道的宽度和/或深度在数十微米至数百微米范围内。
本发明中，“多路”、“多条”、“多个”或其类似概念中的“多”一般是指2个以上（包括2个），比如2、4、8、16、24、48或64等。
本发明还提供上述方案所述的装置在多肽固相合成中的应用。
本发明的有益效果为：本发明装置的多路气体电磁阀的每一路可以单独控制自动化开闭，实现每一轮多肽合成反应所需要原料的选择，实现整个多肽固相合成的全自动进行；本发明的多路连接方式，使得合成反应微流控芯片可以并行使用，实现多种多肽产物同时并行合成；利用单一恒压气源实现对试剂加料池阵列的选择性气体输送，克服现有技术中液体选择泵不能耐受固相合成的强有机溶剂环境的缺陷，实现对微反应器的自动控制；合成反应微流控芯片采用分支流道结构，每个分支只通过一种氨基酸原料，减小液体的混流和杂质的引入，并且可通过设置单独的预推和预清洗过程进一步排除污染；本发明在形式上采取连续流动试剂输入模式，可不断向所述装置提供新鲜反应液，促进反应不断向正方向进行；本发明的装置可实现多通道固相多步循环化学合成，具有微型化、集成化、高效率、低成本以及环境友好的优点。
附图说明
图1为本发明实施例1制作的合成反应微流控芯片的盖片结构示意图。
图2为本发明实施例1制作的合成反应微流控芯片的分解结构示意图。
图3为本发明实施例1制作的试剂加料池结构示意图。
图4为本发明实施例1制作的气控固相多肽合成微流控芯片装置的组装示意图。
图5为本发明实施例2合成的多肽产物的质谱结果图。
图6为本发明实施例2合成的多肽产物的液相色谱分析结果图。
附图标记：
1-主流道，2-主进样口，3-分支流道3，4-分支进样口，5-反应腔体，6-出口，7-盖片，8-基片，9-试剂加料池输入端接头，10-试剂加料池输出端接头，11-池盖，12-池体，13-多路气体电磁阀，14-多路气体电磁阀输入端，15-多路气体电磁阀输出端，16-试剂加料池，17-第一连接管线，18-第二连接管线，19-合成反应微流控芯片。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明的气控固相多肽合成微流控芯片装置进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施方式仅为本发明的优选具体实施方式，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明的气控固相多肽合成微流控芯片装置，包括合成反应微流控芯片、试剂加料池阵列、多路气体电磁阀和恒压气源。
其中，所述合成反应微流控芯片为玻璃材质，由盖片与基片两片玻璃键合而成。其中的盖片上有凹陷的图形（槽状结构），基片为平整的玻璃片，盖片和基片键合后得到完整的合成反应微流控芯片。当盖片与基片经键合成为整体后，盖片上的图形可被封闭从而成为完整的流道结构。流道结构设有进口和出口，即贯穿于整个盖片的小孔，使得合成反应微流控芯片从外观上能看见表面有主进样口、出口和分支进样口，而所述的流道结构则位于合成反应微流控芯片内部。
所述合成反应微流控芯片内部的流道结构包括：一条主流道，主流道两端分别有主进样口和出口；若干条分支流道，每条分支流道有一个分支进样口；主进样口、出口和分支进样口均钻有小孔，小孔贯穿整个盖片。
所述主流道一端有一个主进样口，另一端有一个出口，主进样口为固相载体和公共试剂（即除氨基酸原料外的其它试剂）的入口，出口为产物及废液的出口，主流道末端接近出口处有一个反应腔体，其宽度和深度比主流道大，可储存较多反应液及固相载体。
所述分支流道在主流道的两侧交错设置，依次呈梳状排布，每条分支流道的一端与主流道连通，另一端有分支进样口，每个分支进样口与一个对应的试剂加料池的输出端连通，可通入待合成的多肽序列中的一个特定氨基酸原料。所述分支流道的与所述主流道连接处的横截面积比所述分支流道其它部分的横截面积小，也就是说分支流道与主流道连接处较细，并且分支流道间交错，从而减少氨基酸原料间的相互污染。
所述主进样口、出口、分支进样口可以连接管线，主进样口管线中可通过固相载体和公共试剂；分支进样口管线与对应的试剂加料池连接，每个试剂加料池中储存一种反应原料（氨基酸）；出口处填充滤膜后再连接管线，滤膜孔径小于固相载体的直径，滤膜能够有效拦截固相多肽合成用载体，避免被冲出主流道出口，同时又不影响反应废液的排出。
所述合成反应微流控芯片中，所述主进样口、分支进样口和出口可均为圆柱体形；所述流道结构的截面可以为半圆角矩形和/或半圆弧；所述主流道和/或分支流道的宽度和/或深度在数十微米至数百微米范围内。
所述多路气体电磁阀的每一路气体电磁阀都有一个输出端，与一个对应的试剂加料池的输入端相连接，气体电磁阀输出端的连接管线可加单向阀防止液体回流进入电磁阀。所有路气体电磁阀设有共同的输入端，与同一个公共的恒压气源连接。气体电磁阀打开时，气体电磁阀输入端与气体电磁阀输出端连通，从而输出恒压气源产生的恒定压力；气体电磁阀关闭时，气体电磁阀输出端将关闭，不再输出压力。
所述试剂加料池阵列由多个试剂加料池组成。所述试剂加料池可以是聚四氟乙烯材质，包括池体和池盖，当池盖打开时可向池体中加入试剂，当池盖拧紧后密封池体。每个试剂加料池有一个输入端和一个输出端，输入端与对应的气体电磁阀的输出端连通，输出端与合成反应微流控芯片上一个分支进样口连通。当打开试剂加料池对应的气体电磁阀时，试剂加料池输入端通入空气，试剂加料池输出端可输出原料溶液至合成反应微流控芯片；当关闭试剂加料池对应的气体电磁阀时，试剂加料池输入端将关闭，试剂加料池的输出端不再输出原料，同时由于试剂加料池中密封有一部分空气，合成反应微流控芯片中的原料溶液不会倒流入试剂加料池。
所述恒压气源包括气泵、储气囊和压力传感器，其中压力传感器实时检测压力，当压力低于设定的阈值下限时，气泵开始工作，把气体泵入储气囊；当压力高于设定的阈值上限时，气泵停止工作，使得压力保持在设定压力范围内。恒压气源与所有气体电磁阀的输入端相连接。恒压气源是本领域的技术人员熟知的，其基本构造主要包括上述气泵、储气囊和压力传感器，本领域技术人员可以根据已有知识和经验组装恒压气源，其设定压力范围可以根据本领域技术人员的经验和具体需要设置。
所述恒压气源与多路气体电磁阀共同构成微量气体输送装置，通过电路板和软件控制该微量气体输送装置工作，实现对试剂加料池阵列的自动化控制，从而控制合成反应微流控芯片。通过电路板和软件控制微量气体输送装置的技术属于现有技术，并且在自动化领域有广泛应用，本领域的技术人员可以参考现有技术的做法实现。本发明通过电路板和软件控制该微量气体输送装置工作，可以实现对8-64路或更多路的气体电磁阀自动控制，液体泵出量可为数十至数百微升。
本发明的合成反应微流控芯片可以按照现有技术制作，一种通行的玻璃材质微流控芯片的制作方法包括如下步骤：
（1）将准备在盖片上制作的图形通过高分辨率打印机制成胶片掩膜；
（2）将匀胶铬版和掩膜放入紫外光刻机，曝光后在光刻胶上得到掩膜图案；
（3）将所述曝光后的匀胶铬版在质量百分含量为0.7-0.8%的NaOH水溶液中显影，使得待刻蚀为流道的部分光刻胶被洗掉，其余部分被光刻胶保护；
（4）将所述显影后的匀胶铬版置于去铬液中进行去铬；
（5）将所述去铬后的匀胶铬版置于玻璃刻蚀液中进行刻蚀后，再用质量百分含量为2%-4%的NaOH水溶液和所述去铬液去除残存的光胶层和铬层得到所述盖片；
（6）在所述盖片的主进样口、出口和分支进样口的位置打孔；然后将基片和盖片进行清洗后置于浓硫酸中浸泡过夜或在煮沸的浓硫酸中浸泡2-4小时；
（7）对齐基片和盖片，使两者贴合，然后在真空烘箱中除去水分使得基片和盖片紧密贴合，达到预键合效果；所述预键合的温度为120-150℃，时间为1-2小时；
（8）将所述预键合的芯片置于马弗炉中进行程序升温键合即得所述合成反应微流控芯片。
上述的制作方法中，所述匀胶铬版曝光时间可为4-6秒；所述去铬液可由硝酸铈铵、冰醋酸和水组成，所述去铬液中硝酸铈铵的质量-体积浓度可为0.2g/mL，所述去铬液中冰醋酸的体积百分含量可为3.5%；所述刻蚀液可由质量百分含量为40%的氢氟酸水溶液、质量百分含量为65%的硝酸水溶液和水组成，所述氢氟酸水溶液、硝酸水溶液和水的体积比可为1：0.7：3.3。
上述的制作方法中，步骤（6）中将基片和盖片进行清洗的溶剂可依次为加有洗涤剂的去离子水，乙醇，丙酮，由氨水、质量百分含量为20%的过氧化氢水溶液和水的体积比为1：1：5组成的混合溶剂，以及由盐酸、质量百分含量为20%的过氧化氢水溶液和水的体积比为1：1：6组成的混合溶剂。
将合成反应微流控芯片、试剂加料池阵列、多路气体电磁阀和恒压气源相连通即得所述气控固相多肽合成微流控芯片装置。试剂加料池输出端通过连接管线与合成反应微流控芯片的分支进样口连通，该连接管线可用橡胶塞或密封胶进行密封。橡胶塞材质可为丁腈橡胶或氟橡胶，密封胶可为环氧胶，所用固化温度可为80-120℃，固化时间可为30-60分钟。气体电磁阀输出端与试剂加料池输入端也通过连接管线连通，该部分连接管线中可加入单向阀防止液体回流进入电磁阀。
本发明还提供上述装置在多肽固相合成中的应用。具体操作步骤如下：通过合成反应微流控芯片的主进样口注入多肽合成所需的固相载体，载体微球滞留在反应腔体中；合成多肽所需的氨基酸原料除第一个氨基酸预先已修饰到固相载体外，其余的氨基酸原料依次从分支流道通入，并经一段时间的连续流动反应进行合成，每轮合成之前，通过合成反应微流控芯片的主进样口进行脱保护，每轮合成之后通过主进样口进行清洗，除去多余的氨基酸原料；所有氨基酸原料均从试剂加料池由恒定气压驱动流入；气压由恒压气源提供，通过选择性打开多路气体电磁阀的某一路，把所对应的试剂加料池中的氨基酸原料泵入合成反应微流控芯片，其余试剂加料池由于输入端对应的气体电磁阀关闭，不能把其中的原料注入合成反应微流控芯片，同时试剂加料池中存在一段封闭的气体，保证合成反应微流控芯片中的原料不会倒流入这些试剂加料池。经过若干轮合成反应，在合成反应微流控芯片中获得目标多肽产物。最后可以通过裂解试剂的方式在合成反应微流控芯片原位裂解目标多肽产物，并在合成反应微流控芯片出口处收集目标多肽产物。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
实施例1、气控固相多肽合成微流控芯片装置的制作
（1）合成反应微流控芯片的制作
合成反应微流控芯片的制作过程包括：曝光、显影、去铬、玻璃湿法腐蚀、去光胶去铬和键合等步骤，具体如下：
将设计好的合成反应微流控芯片盖片的图形通过高分辨率打印机制成胶片掩膜；将该胶片掩膜和匀胶铬版（铬型：LRC；铬厚：145nm；胶厚：570nm）放在紫外光刻机中，曝光时间为5秒；曝光后的铬版在质量百分含量为0.7%的NaOH水溶液中显影，掩膜上的图形被复制到光胶层上；室温下将显影后的匀胶铬版放入到去铬液（该去铬液中硝酸铈铵的质量-体积浓度为0.2g/mL，冰醋酸的体积百分含量为3.5%）中除去裸露的铬层；将去铬后的铬版置于刻蚀液（该刻蚀液由质量百分含量为40%的氢氟酸水溶液、质量百分含量为65%的硝酸水溶液和水组成，所述氢氟酸水溶液、硝酸水溶液和水的体积比为1：0.7：3.3）中，刻蚀时间为2小时；用质量百分含量为2%的NaOH水溶液和上述去铬液去除残存的光胶层及铬层，即获得所述合成反应微流控芯片的盖片，在盖片上的进样口和出口处相对应的位置用微型台式钻床打孔，孔直径1.8mm。另截取与盖片同样大小的玻璃片，即基片。将基片和盖片在下列溶液中依次超声清洗15分钟：加有洗涤剂的去离子水、乙醇、丙酮、RCA-1（由氨水、质量百分含量为20%的过氧化氢水溶液和水的体积比为1：1：5组成的混合溶剂）和RCA-2（由盐酸、质量百分含量为20%的过氧化氢水溶液和水的体积比为1：1：6组成的混合溶剂），将清洗后的基片和盖片置入浓硫酸中浸泡过夜；用去离子水冲洗基片和盖片并在流动的去离子水中将基片与盖片紧紧贴合，置于真空烘箱中进行真空预键合，预键合温度为150℃，预键合时间为1小时；将预键合好的芯片置于马弗炉中程序升温键合，升温程序为：10分钟从室温升到130℃，在130℃保温70分钟，110分钟从130℃升温到600℃，在600℃保温470分钟，最后得到合成反应微流控芯片。
上述盖片的详细结构如图1所示。图1中：主流道1，是反应原料、固相载体和公共试剂等进入芯片的主通道；在主流道1的起始端有主进样口2，是固相载体、脱保护试剂、裂解试剂等进入主流道1的入口；分支流道3，与主流道1连接，每条分支流道3可以通过一种特定的反应原料（氨基酸）；在在分支流道3的起始端有分支进样口4，氨基酸原料按加入多肽的顺序依次从不同的分支进样口4加入；在主流道1的末端接近出口处有一个反应腔体5，固相载体存储在反应腔体5中，合成反应也在反应腔体5中进行；在主流道1的末端有出口6，出口6处设有滤膜，可以防止固相载体流出芯片，废液从出口6排出，目标多肽产物经裂解后也从出口6排出。
上述制作的合成反应微流控芯片的分解结构如图2所示，盖片7与基片8键合成为整体，即合成反应微流控芯片。
（2）试剂加料池的制作
试剂加料池可以按照本领域技术人员的普通技能采用机械加工方法制作，单个试剂加料池结构如图3所示。图3中：试剂加料池有一个试剂加料池输入端接头9，该接头可通过连接管线与气体电磁阀输出端连接；试剂加料池有一个试剂加料池输出端接头10，该接头可通过连接管线与合成反应微流控芯片的分支进样口4连接；试剂加料池主体部分包括试剂加料池密封盖，即池盖11和试剂加料池池体12。试剂加料池材质为聚四氟乙烯，该试剂加料池主腔体为圆柱形，腔体加工螺纹，制作与之配套的密封盖；密封盖上设置双孔，孔径为1.2mm，分别插入不锈钢针。试剂加料池输出端与合成反应微流控芯片的分支进样口4相连，试剂加料池输入端与气体电磁阀输出端相连。
（3）微量气体输送装置的制作
微量气体输送装置由恒压气源和多路气体电磁阀组成。其中恒压气源由气泵、储气囊和气压传感器及相应管路构成，其中气压传感器可为电阻应变式气压传感器，可以从市场上购得（例如西安永红传感器有限公司生产的YHT3系列传感器），储气囊为机加工，管路为常规管线。多路气体电磁阀选用市售八联装微量气体电磁阀，例如日本SMC公司生产的联装气体电磁阀，根据需要还可以对其进行并联，获得最多64路的气体电磁阀。恒压气源提供范围恒定的输出气压，其输出端连接多路气体电磁阀输入端。多路气体电磁阀输出端连接上述的试剂加料池。恒压气源和多路气体电磁阀均通过电路控制，控制电路板通过CAN总线与USB接口CAN盒连接，并可由上位计算机控制。
（4）将上述制作的合成反应微流控芯片、试剂加料池和微量气体输送装置顺序连通后即得到本发明的气控固相多肽合成微流控芯片装置。组装后的气控固相多肽合成微流控芯片装置的整体结构如图4所示。图4中：所述装置包括多路气体电磁阀13；所述多路气体电磁阀13有一个多路气体电磁阀输入端14，与恒压气源的输出端相连接（示意图中未画出）；所述多路气体电磁阀13的每一路均有一个多路气体电磁阀输出端15。所述装置还包括试剂加料池16（实际使用试剂加料池组成的阵列，示意图中仅画出一个试剂加料池），试剂加料池16中储存多肽合成原料（氨基酸）；所述多路气体电磁阀输出端15与试剂加料池16的输入端之间通过第一连接管线17（示意图中仅画出一条，实际上每一多路气体电磁阀输出端15与每一试剂加料池16的输入端之间都有第一连接管线17）连通；试剂加料池阵列中的每一试剂加料池16与合成反应微流控芯片19中每一分支进样口4之间通过第二连接管线18（示意图中仅画出一条）连通。
使用本发明的气控固相多肽合成微流控芯片装置时，首先在对应的试剂加料池16中灌装氨基酸原料并密封，然后打开各器件的电源，在上位计算机上运行配套开发的软件，即可完成气体通路选择，定量气体输送，液体连续注射及液路切换、清洗等过程。
实施例2、利用实施例1制作的装置进行固相多肽合成
固相载体选取商品化的王树脂，根据要合成的多肽序列，预先在树脂上连接多肽C端的氨基酸。本实施例准备合成的多肽序列为Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu。本例使用市售的Fmoc-Leu修饰的固相肽合成载体作为固相载体，利用实施例1制作的气控固相多肽合成微流控芯片装置合成该多肽。
具体合成步骤如下：
a、该步骤为手动操作步骤，装入合成载体。使用注射器从主进样口灌入分散于N’N-二甲基甲酰胺（DMF）中的Fmoc-Leu修饰的固相肽合成载体（树脂）至反应腔体中，固相肽合成载体干重约5mg；载体被束缚在反应腔体，DMF溶液从出口排出。
b、本步骤将装配整个装置，准备下一步骤合成时使用。将C端第二至五位氨基酸试剂Fmoc-Phe等分别与苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）混合，加入活化试剂（摩尔浓度为0.4mol/L的N-甲基吗啡啉的DMF溶液）配成氨基酸偶联试剂，加入相应试剂加料池，与对应的分支进样口连接；清洗溶剂、脱保护试剂也分别对应试剂加料池，通过三通接口与主进样口连接；装配整个合成装置，并在控制软件中设定以后各步骤的运行时间。
c、脱保护：软件控制打开脱保护试剂加料池对应的气体电磁阀，恒压气源开始往相应加料池中送气，脱保护试剂（质量百分含量为20%的六氢吡啶的DMF溶液）注入合成反应微流控芯片，脱保护时间为5分钟。
d、洗涤树脂：打开DMF溶剂试剂加料池对应的电磁阀；恒压气源开始往相应试剂加料池中送气，注入DMF洗涤树脂，除去残余的脱保护试剂及反应后杂质，洗涤时间为6分钟。
e、氨基酸偶联：打开C端第二位氨基酸Phe偶联试剂加料池对应的气体电磁阀；恒压气源开始往相应试剂加料池中送气，将上述氨基酸偶联试剂引入到反应腔体中，开始连续流动反应，偶联时间为20分钟。
f、按照d步骤洗涤树脂一次。
g、依次重复步骤c、d、e和f共3次，其中，步骤e中的氨基酸试剂依次为氨基酸试剂Fmoc-Gly、Fmoc-Gly和Fmoc-Tyr，得到目标序列。
h、目标序列合成结束之后，注入脱保护试剂，使N端氨基酸的保护基团脱除，并注入DMF洗涤树脂。
i、溶剂置换：使用注射泵从主进样口先后注入二氯甲烷、甲醇置换树脂中残留的DMF溶剂；置换时间分别为3分钟。
j、原位裂解：使用注射泵从主进样口注入裂解试剂（质量百分含量为97.5%的三氟乙酸（TFA）的水溶液），裂解时间为30分钟；在合成反应微流控芯片出口处收集裂解产物即得目标多肽。
k、分析鉴定：从合成反应微流控芯片收集的裂解产物，用乙醚沉淀，然后收集固体洗涤抽干。使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱验证产物正确性（图5）；使用反相液相色谱分析检测产物纯度（图6）。
利用本发明装置的五肽合成反应在三小时内可完成，相比常规多肽合成数十小时的反应周期，反应效率大大提高。装置在安装完成后，可设定软件运行参数，并实现自动化多肽合成。装置采用气体驱动反应流体，易于进行并行化操作，从而实现较高通量的自动化多肽合成。本装置还能够实现半自动化的原位裂解，常规的多肽合成仪器均不具备此功能。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种气控固相多肽合成微流控芯片装置，包括合成反应微流控芯片、试剂加料池阵列、多路气体电磁阀和恒压气源；
所述合成反应微流控芯片内部设有流道结构，所述流道结构包括主流道，所述主流道两端分别设有作为固相多肽合成用载体和公共试剂的入口的主进样口、以及产物和废液的出口，所述出口处设有过滤结构，所述主流道的接近所述出口处设有反应腔体，所述反应腔体与主进样口之间的主流道的一侧或两侧设有多条分支流道，每条分支流道的一端与所述主流道连通而另一端设有分支进样口；
所述试剂加料池阵列包括多个试剂加料池，每个试剂加料池设有输入端和输出端，每个试剂加料池的输出端与所述合成反应微流控芯片上的一个分支进样口连通；
所述多路气体电磁阀设有共同的输入端，每路气体电磁阀设有输出端，多路气体电磁阀共同的输入端与所述恒压气源连通，每路气体电磁阀的输出端与一个试剂加料池的输入端连通；
所述恒压气源用于向所述多路气体电磁阀输出设定压力范围的气压。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述反应腔体与主进样口之间的主流道的两侧交错设置多条分支流道，呈梳状排布，所述分支流道的与所述主流道连接处的横截面积比所述分支流道其它部分的横截面积小。
3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述合成反应微流控芯片由玻璃材质的盖片与基片键合而成，所述盖片上设有凹陷的槽状结构，所述基片为平整的玻璃片，所述盖片与基片键合后所述槽状结构被密封形成流道结构。
4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述反应腔体的横截面积比所述反应腔体两端的主流道的横截面积大。
5.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述主流道出口处的过滤结构为滤膜，所述滤膜的孔径小于固相多肽合成用载体的直径。
6.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，每路气体电磁阀的输出端与一个试剂加料池的输入端通过连接管线连通，所述连接管线设有防止液体回流进入气体电磁阀的单向阀。
7.根据权利要求1-6任一项所述的装置，其特征在于，所述试剂加料池采用聚四氟乙烯材质，所述试剂加料池包括池体和池盖，当池盖打开时可向池体中加入试剂，当池盖拧紧后密封池体。
8.根据权利要求1-6任一项所述的装置，其特征在于，所述恒压气源包括气泵、储气囊和压力传感器；所述压力传感器实时检测压力，当压力低于设定的阈值下限时，气泵开始工作，把气体泵入储气囊；当压力高于设定的阈值上限时，气泵停止工作，使得压力保持在设定压力范围内。
9.根据权利要求1-6任一项所述的装置，其特征在于，所述合成反应微流控芯片上的主进样口、分支进样口和出口均为圆柱体形；所述流道结构的截面为半圆角矩形和/或半圆弧；所述主流道和/或分支流道的宽度和/或深度在数十微米至数百微米范围内。
10.权利要求1-9任一项所述的装置在多肽固相合成中的应用，其中：
通过合成反应微流控芯片的主进样口注入多肽合成所需的固相载体，载体微球滞留在反应腔体中；合成多肽所需的氨基酸原料除第一个氨基酸预先已修饰到固相载体外，其余的氨基酸原料依次从分支流道通入，并经一段时间的连续流动反应进行合成，每轮合成之前，通过合成反应微流控芯片的主进样口进行脱保护，每轮合成之后通过主进样口进行清洗，除去多余的氨基酸原料；所有氨基酸原料均从试剂加料池由恒定气压驱动流入；气压由恒压气源提供，通过选择性打开多路气体电磁阀的某一路，把所对应的试剂加料池中的氨基酸原料泵入合成反应微流控芯片，其余试剂加料池由于输入端对应的气体电磁阀关闭，不能把其中的原料注入合成反应微流控芯片，同时试剂加料池中存在一段封闭的气体，保证合成反应微流控芯片中的原料不会倒流入这些试剂加料池；
经过若干轮合成反应，在合成反应微流控芯片中获得目标多肽产物。
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