JP5528941B2

JP5528941B2 - リソソームα−ガラクトシダーゼＡの増強方法

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Publication number: JP5528941B2
Application number: JP2010173733A
Authority: JP
Inventors: ジアン・キアン・ファン; 達石井
Original assignee: マウントシナイスクールオブメディシンオブニューヨークユニバーシティー
Priority date: 1998-06-01
Filing date: 2010-08-02
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2019-05-28
Also published as: US6274597B1; US20020156100A1; US8633221B2; US7514453B2; US7622485B2; ES2507515T3; US6916829B2; US8841322B2; CA2333965C; US20030119874A1; US20140206718A1; US20110076765A1; JP2003528799A; US9265780B2; DE69941429D1; CY1115583T1; CY1112845T1; WO1999062517A1; US7812033B2; PT2143420E

Description

１．発明の分野
本発明は、哺乳動物細胞中のリソソームα−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧａｌＡ）の活性を増大する方法、および、１−デオキシ−ガラクトノジリマイシン(galactonojirimycin)および関連化合物の投与によるスフィンゴ糖脂質蓄積症、特にファブリ病(Fabry disease)の治療方法に関する。

２．発明の背景
ファブリ病（１）は、スフィンゴ糖脂質からの末端α−ガラクトシル残基の加水分解を生じる酵素、即ち、リソソームαガラクトシダーゼＡ（α−ＧａｌＡ）のＸリンク遺伝性欠損によって発生するスフィンゴ糖脂質リソソーム蓄積症である。酵素活性の欠損は、主に脈管の内皮細胞中に中性スフィンゴ糖脂質、主としてグロボトリアオシルセラミド(globotriaosylceramide)（セラミドトリヘキソシド、ＣＴＨ）の進行性蓄積を生じ、この症状を呈する患者においては、早発心筋梗塞および発作を伴った腎機能不全を引き起こす（２）。この疾患は、臨床症状によって２つのグループに分類される。すなわち、全身性脈管障害を有する古典的タイプ、および心臓に限定された臨床症状を有する非古典的変異タイプである。最近、その疾患の非古典的変異タイプは、未解明の左の心室肥大を患った成人男性患者の１０％において確認され、その疾患に関する推定の発生頻度は増加している（３）。他のスフィンゴ糖脂質リソソーム蓄積症のように、この疾患を治療することが可能な方法としては、酵素補充療法、遺伝子療法、骨髄移植および基質妨害が示唆されている（４）。しかしながら、そのとき、この疾患に対する唯一の処置は対症療法である。従って、この疾患に対する新しい治療方法の開発が急務となっている。

変異酵素の残留性α−ＧａｌＡ活性に関する研究（５）では、幾つかの変異酵素が正常α−ＧａｌＡに対して類似の速度的性質を有するが、顕著な不安定性があることが明らかになった。これは、一般に典型的ファブリ患者よりも高い残留性α−ＧａｌＡ活性を示す非典型的変異タイプの患者の大部分に対する症例と考えられる。例えば（６）、ファブリ病の非典型的変異型の患者で確認された、Ｑ２７９Ｅの遺伝子型を保有する精製変異α−ＧａｌＡは、正常な酵素と同じｋｍおよびＶｍａｘを示したが、ｐＨ７．０、３０℃で３０分間酵素をインキュベートした際、正常な酵素は同条件下で安定していたのに対し、そのほとんどの酵素活性は失活していた。変異酵素および正常酵素はともに３７℃、ｐＨ５．０で安定していた。更に、細胞中の大多数の変異酵素タンパク質は、小胞体（ＥＲ）中に凝集体を形成して迅速に分解されたが（７）、このことは、この変異における酵素活性の欠損が主としてＥＲの不完全な流出によって生じ、酵素タンパク質の過度の分解が導かれる可能性を示唆している。本発明は、酵素がＥＲから順調に放出されることを補助し、変異酵素の分解を防止することに着目するものである。

本発明の方法は以下のモデルに基づくものである。変異酵素タンパク質は、ｐＨが約７であるＥＲ中において不適当な立体配座に折り畳まれる傾向がある。その結果、酵素が、ＥＲからゴルジ装置およびエンドソームを介してリソソームまでの正常な輸送経路から妨げられ、代わりに、分解に供せられる。一方、正常な立体配座を有する酵素タンパク質はリソソームまで順調に輸送され、その酵素はｐＨ５未満で比較的安定であるので、活性型で保持される。従って、変異酵素中での適切な立体配座を誘導し得る化合物は、その酵素に対するエンハンサとして役立つ可能性がある。本発明者は思いがけなく、低濃度でのα−ＧａｌＡに対する強力な競合的阻害剤は、変異α−ＧａｌＡ遺伝子を形質移入したＣＯＳ−１細胞、変異α−ＧａｌＡ過剰発現トランスジェニックマウスからの繊維芽細胞、およびファブリ患者からのリンパ芽球を含む、細胞中の変異酵素活性を増大することを確認した。

なお、上述の内容が本発明の操作のメカニズムであると考えているが、本発明の成功は、この正しいメカニズムに依存するものではない。

従って、本発明の１つの目的は、哺乳動物細胞中の、特にヒト細胞中の変異α−ＧａｌＡの分解を防止する方法を提供することである。

また、本発明の更なる目的は、哺乳動物細胞中の、特にヒト細胞中のα−ＧａｌＡ活性を増大する方法を提供することである。本発明の方法は、正常α−ＧａｌＡおよび変異α−ＧａｌＡの活性をともに増大するが、特にファブリ病のある形態に存在する変異α−ＧａｌＡの活性を増大する。

更に、本発明の方法は哺乳類以外の細胞、例えば、昆虫細胞および酵素補充療法用のα−ＧａｌＡの生産を目的として使用される培養ＣＨＯ細胞などにおいても有用であると推測される。

本発明の方法に有効であると推測される化合物は、環中に酸素と置換する窒素を有するガラクトース誘導体およびグルコース誘導体であり、好ましくは、１−デオキシガラクトノジリマイシン(deoxygalactonojirimycin)および３，４−ｄｉｅｐｉ−α−ホモノジリマイシン(homonojirimycin)などのガラクトース誘導体である。なお、ガラクトース誘導体は、例えば次の構造によって表わされるように、Ｃ−３位の水酸基が水平方向で、Ｃ−４位の水酸基が軸方向であることを意味する。

式中、Ｒ_１はＨ、メチルまたはエチルを表わし、Ｒ_２およびＲ_３は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、単糖（例えば、−Ｏ−ガラクトース）、１〜３炭素アルキル、アルコキシまたはヒドロキシアルキル基（例えば、ＣＨ_２ＯＨ）を表わす。

また、α−ガラクトシダーゼに対する他の特異的競合阻害剤、例えば、カリステジン(calystegine)Ａ_３、Ｂ_２およびＢ_３、およびこれら化合物のＮ−メチル誘導体は、本発明の方法において有用であるはずである。カリステジン化合物は次式によって表わすことができる；

上式において、カリステジンＡ_３については、Ｒ_１＝Ｈであり、Ｒ_２＝ＯＨであり、Ｒ_３＝Ｈであり、Ｒ_４＝Ｈである；カリステジンＢ_２については、Ｒ_１＝Ｈであり、Ｒ_２＝ＯＨであり、Ｒ_３＝Ｈであり、Ｒ_４＝ＯＨである；カリステジンＢ_３については、Ｒ_１＝Ｈであり、Ｒ_２＝Ｈであり、Ｒ_３＝ＯＨであり、Ｒ_４＝ＯＨである；Ｎ−メチル−カリステジンＡ_３については、Ｒ_１＝ＣＨ_３であり、Ｒ_２＝ＯＨであり、Ｒ_３＝Ｈであり、Ｒ_４＝Ｈである；Ｎ−メチル−カリステジンＢ_２については、Ｒ_１＝ＣＨ_３であり、Ｒ_２＝ＯＨであり、Ｒ_３＝Ｈであり、Ｒ_４＝ＯＨである；Ｎ−メチル−カリステジンＢ_３については、Ｒ_１＝ＣＨ_３であり、Ｒ_２＝Ｈであり、Ｒ_３＝ＯＨであり、Ｒ_４＝ＯＨである。

また、本発明の更なる目的は、ファブリ病の患者に対する治療方法を提供することである。次式の化合物

（式中、Ｒ_１はＨ、ＣＨ_３またはＣＨ_３ＣＨ_２を表わし、Ｒ_２およびＲ_３は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、１〜６炭素アルキル、ヒドロキシアルキル、またはアルコキシ基（好ましくは１〜３）、または単糖を表わし、Ｒ_４およびＲ_５は独立してＨまたはＯＨを表わす）、または、２，５−ジデオキシ−２，５−イミノ−Ｄ−マンニトール、α−ホモノジリマイシン、３，４−ｄｉｅｐｉ−α−ホモノジリマイシン、５−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−ホモノジリマイシン、１−デオキシガラクトノジリマイシン、４−ｅｐｉ−ファゴミン(fagomine)、および１−デオキシ−ノジリマイシン、並びにそれらのＮ−アルキル誘導体からなる群から選択される化合物の薬学的有効量の投与によって、ファブリ病の患者において変異α−ＧａｌＡの活性を増大させることによりファブリ病の症状を緩和する。また、カリステジン化合物およびそれらの誘導体など他のα−ＧａｌＡの競合阻害剤は、ファブリ病を治療するのに有用であるはずである。

当業者は、本発明の方法で使用される化合物の有効量は、日常的な実験操作によって決定することが可能であるということを理解するであろう。しかしながら、その量は０．０１から１００μＭ、好ましくは０．０１から１０μＭ、最も好ましくは０．０５から１μＭの血清濃度を生じる量であると推測される。また、化合物の有効量は、１日当たり０．５から１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１日当たり０．５から１００ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは、１日当たり１から５０ｍｇ／ｋｇ体重であると推測される。化合物は、予備処方された投薬量で、単独で、場合によっては薬学的に許容し得る担体および賦形剤に加えて投与することができる。有効量の化合物を投与することによって、患者の症状を改善するのに十分な患者内の細胞のα−ＧａｌＡ活性を高めることができる。明らかに健常者で確認された酵素活性の低い範囲が平均値の約３０％であるので（２）、正常の３０％の酵素活性レベルがファブリ患者の症状を著しく改善し得ることが推測される。

本明細書に記載した化合物、および当業者に公知のα−ＧａｌＡに対する他の競合的阻害剤は、α−ＧａｌＡの細胞内活性を増大し、かつファブリ病を治療する方法において有用である。

インビトロにおける阻害（１Ａ）、およびアルカロイド化合物によるα−ＧａｌＡの細胞内の増強（１Ｂおよび１Ｃ）を示す図である。用いたアルコロイド化合物は、（１）２，５−ジデオキシ−２，５−イミノ−Ｄ−マンニトール、（２）α−ホモノジリマイシン、（３）３，４−Ｄｉｅｐｉ−α−ホモノジリマイシン、（４）５−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−ホモノジリマイシン、（５）１−デオキシガラクトノジリマイシン、（６）４−ｅｐｉ−ファゴミン(Fagomine)、（７）１−デオキシ−ノジリマイシン、（Ｇａｌ）ガラクトースである。「方法」に記載しているように、変異α−ＧａｌＡ（Ｒ３０１Ｑ）のｃＤＮＡによって形質移入したＣＯＳ−１細胞中の細胞内α−ＧａｌＡ活性を分析した。（Ａ）方法のもとに阻害アッセイを実施した。化合物のＩＣ_５０は、各々、１．３ｍＭ（１）、２．６ｍＭ（２）、２．９μＭ（３）、０．６２ｍＭ（４）、４．７ｎＭ（５）、０．２５ｍＭ（６）、０．８ｍＭ（７）、および２４ｍＭ（Ｇａｌ、ガラクトース）であった。インビトロにおける阻害（１Ａ）、およびアルカロイド化合物によるα−ＧａｌＡの細胞内の増強（１Ｂおよび１Ｃ）を示す図である。用いたアルコロイド化合物は、（１）２，５−ジデオキシ−２，５−イミノ−Ｄ−マンニトール、（２）α−ホモノジリマイシン、（３）３，４−Ｄｉｅｐｉ−α−ホモノジリマイシン、（４）５−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−ホモノジリマイシン、（５）１−デオキシガラクトノジリマイシン、（６）４−ｅｐｉ−ファゴミン(Fagomine)、（７）１−デオキシ−ノジリマイシン、（Ｇａｌ）ガラクトースである。「方法」に記載しているように、変異α−ＧａｌＡ（Ｒ３０１Ｑ）のｃＤＮＡによって形質移入したＣＯＳ−１細胞中の細胞内α−ＧａｌＡ活性を分析した。（Ａ）方法のもとに阻害アッセイを実施した。化合物のＩＣ_５０は、各々、１．３ｍＭ（１）、２．６ｍＭ（２）、２．９μＭ（３）、０．６２ｍＭ（４）、４．７ｎＭ（５）、０．２５ｍＭ（６）、０．８ｍＭ（７）、および２４ｍＭ（Ｇａｌ、ガラクトース）であった。インビトロにおける阻害（１Ａ）、およびアルカロイド化合物によるα−ＧａｌＡの細胞内の増強（１Ｂおよび１Ｃ）を示す図である。用いたアルコロイド化合物は、（１）２，５−ジデオキシ−２，５−イミノ−Ｄ−マンニトール、（２）α−ホモノジリマイシン、（３）３，４−Ｄｉｅｐｉ−α−ホモノジリマイシン、（４）５−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−ホモノジリマイシン、（５）１−デオキシガラクトノジリマイシン、（６）４−ｅｐｉ−ファゴミン(Fagomine)、（７）１−デオキシ−ノジリマイシン、（Ｇａｌ）ガラクトースである。「方法」に記載しているように、変異α−ＧａｌＡ（Ｒ３０１Ｑ）のｃＤＮＡによって形質移入したＣＯＳ−１細胞中の細胞内α−ＧａｌＡ活性を分析した。（Ａ）方法のもとに阻害アッセイを実施した。化合物のＩＣ_５０は、各々、１．３ｍＭ（１）、２．６ｍＭ（２）、２．９μＭ（３）、０．６２ｍＭ（４）、４．７ｎＭ（５）、０．２５ｍＭ（６）、０．８ｍＭ（７）、および２４ｍＭ（Ｇａｌ、ガラクトース）であった。Ｔｇマウス（２Ａ）から取得した繊維芽細胞中のＤＧＪによるα−ＧａｌＡの増強を示す図である。ファブリ患者（２Ｂ）から取得したリンパ芽球中のＤＧＪによるα−ＧａｌＡの増強を示す図である。ＴｇＭ繊維芽細胞（Ａ）およびリンパ芽球（Ｂ）中のＤＧＪによるα−ＧａｌＡの増強の時間経過を示す図である。方法の項に従って細胞培養を実施した。添加したＤＧＪ濃度は２０μＭであった。ヒトリンパ芽球の遺伝子型はＲ３０１Ｑであった。●はＤＧＪ非含有で培養した変異細胞であり、○はＤＧＪ含有で培養した変異細胞であり、▲はＤＧＪ非含有で培養した正常リンパ芽球であり、△はＤＧＪ含有で培養された正常リンパ芽球である。ＴｇＭ繊維芽細胞（Ａ）およびリンパ芽球（Ｂ）中のＤＧＪによるα−ＧａｌＡの増強の時間経過を示す図である。方法の項に従って細胞培養を実施した。添加したＤＧＪ濃度は２０μＭであった。ヒトリンパ芽球の遺伝子型はＲ３０１Ｑであった。●はＤＧＪ非含有で培養した変異細胞であり、○はＤＧＪ含有で培養した変異細胞であり、▲はＤＧＪ非含有で培養した正常リンパ芽球であり、△はＤＧＪ含有で培養された正常リンパ芽球である。形質移入したＣＯＳ−１細胞（Ａ）、ＴｇＭ繊維芽細胞（Ｂ）およびＲ３０１Ｑ（Ｃ）の遺伝子型を有するリンパ芽球中のα−ＧａｌＡ増強のＤＧＪ濃度依存性を示す図である。細胞は、ＨａｍのＦ−１０培地（ＣＯＳ−１細胞、ＴｇＭ繊維芽細胞）またはＤＧＪ含有１０％ＦＣＳ（リンパ芽球）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で３７℃にて４日間、可変的な濃度で培養した。ＣＯＳ−１細胞へ形質移入したｃＤＮＡは変異α−ＧａｌＡ（Ｒ３０１Ｑ）をコードしていた。形質移入したＣＯＳ−１細胞（Ａ）、ＴｇＭ繊維芽細胞（Ｂ）およびＲ３０１Ｑ（Ｃ）の遺伝子型を有するリンパ芽球中のα−ＧａｌＡ増強のＤＧＪ濃度依存性を示す図である。細胞は、ＨａｍのＦ−１０培地（ＣＯＳ−１細胞、ＴｇＭ繊維芽細胞）またはＤＧＪ含有１０％ＦＣＳ（リンパ芽球）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で３７℃にて４日間、可変的な濃度で培養した。ＣＯＳ−１細胞へ形質移入したｃＤＮＡは変異α−ＧａｌＡ（Ｒ３０１Ｑ）をコードしていた。形質移入したＣＯＳ−１細胞（Ａ）、ＴｇＭ繊維芽細胞（Ｂ）およびＲ３０１Ｑ（Ｃ）の遺伝子型を有するリンパ芽球中のα−ＧａｌＡ増強のＤＧＪ濃度依存性を示す図である。細胞は、ＨａｍのＦ−１０培地（ＣＯＳ−１細胞、ＴｇＭ繊維芽細胞）またはＤＧＪ含有１０％ＦＣＳ（リンパ芽球）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で３７℃にて４日間、可変的な濃度で培養した。ＣＯＳ−１細胞へ形質移入したｃＤＮＡは変異α−ＧａｌＡ（Ｒ３０１Ｑ）をコードしていた。形質移入したＣＯＳ−１細胞中のα−ＧａｌＡ増強のＤＥ−ＨＮＪ濃度依存性を示す図である。リンパ芽球中のＤＧＪ増強α−ＧａｌＡの安定化を示す図である。△はＤＧＪ非含有で培養したＲ３０１Ｑリンパ芽球、▲はＤＧＪ含有で培養したＲ３０１Ｑリンパ芽球である。ＤＧＪ含有下で培養したＴｇＮ繊維芽細胞中の［^１４Ｃ］−ＣＴＨ代謝のＴＬＣ分析を示す図である。ＴｇＮ繊維芽細胞は、４日間、０μＭ（レーン１）、２μＭ（レーン２）および２０μＭ（レーン３）でＤＧＪを含有しているＨａｍのＦ−１０培地−１０％ＦＣＳ中において３７℃で培養した。ＤＧＪ非含有の培地で洗浄した後、２．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Gibco, Gaithersburg, MD U.S.A.）中の［^１４Ｃ］−ＣＴＨ（200,000 cpm）を細胞に添加し、５時間培養した。２ｍｌの１％ＢＳＡおよび２ｍｌのＰＢＳで細胞をそれぞれ３回洗浄した。中性糖脂質をＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ（２：１）によって抽出し、穏やかなアルカリ処理、ＭｅＯＨ：ｎ−ヘキサン（１：１）を用いた抽出、およびＦｏｌｃｈ抽出（１９）によって精製した。ＤＧＪ含有下で培養した変異体リンパ芽球（Ｒ３０１Ｑ）中のα−ＧａｌＡのｍＲＮＡの検出を示す図である。ヒト変異体リンパ芽球（Ｒ３０１Ｑ）は、４日間、５０μＭのＤＧＪの含有下で、または非含有下で培養した。α−ＧａｌＡのｍＲＮＡは、競合ＲＴ−ＰＣＲ法（１５）により検出した。ＴｇＭ繊維芽細胞中で発現された変異α−ＧａｌＡ（Ｒ３０１Ｑ）のウェスタンブロットを示す図である。１０μｇのタンパク質を含有する細胞ホモジネートの上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ウェスタンブロットをウサギで得られた抗−α ＧａｌＡ抗体を用いて実施した。ＴｇＭ繊維芽細胞（Ａ）、２０μＭのＤＧＪ含有下で培養したＴｇＭ繊維芽細胞（Ｂ）、およびＴｇＮ繊維芽細胞（Ｃ）を用いたパーコール密度勾配遠心分離の結果を示す図である。Ｏｓｈｉｍａら（８）によって以前報告されたように、密度マーカー（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, U.S.A.）を用いてパーコール密度勾配遠心分離を行った。リソソーム標識酵素のβ−ヘキソサミニダーゼは、基質として４−メチルウンベリフェリル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンで分析した。実線はα−ＧａｌＡ活性であり、破線はβ−ヘキソサミニダーゼ活性である。ＴｇＭ繊維芽細胞（Ａ）、２０μＭのＤＧＪ含有下で培養したＴｇＭ繊維芽細胞（Ｂ）、およびＴｇＮ繊維芽細胞（Ｃ）を用いたパーコール密度勾配遠心分離の結果を示す図である。Ｏｓｈｉｍａら（８）によって以前報告されたように、密度マーカー（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, U.S.A.）を用いてパーコール密度勾配遠心分離を行った。リソソーム標識酵素のβ−ヘキソサミニダーゼは、基質として４−メチルウンベリフェリル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンで分析した。実線はα−ＧａｌＡ活性であり、破線はβ−ヘキソサミニダーゼ活性である。ＴｇＭ繊維芽細胞（Ａ）、２０μＭのＤＧＪ含有下で培養したＴｇＭ繊維芽細胞（Ｂ）、およびＴｇＮ繊維芽細胞（Ｃ）を用いたパーコール密度勾配遠心分離の結果を示す図である。Ｏｓｈｉｍａら（８）によって以前報告されたように、密度マーカー（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, U.S.A.）を用いてパーコール密度勾配遠心分離を行った。リソソーム標識酵素のβ−ヘキソサミニダーゼは、基質として４−メチルウンベリフェリル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンで分析した。実線はα−ＧａｌＡ活性であり、破線はβ−ヘキソサミニダーゼ活性である。ＤＧＪによる形質移入ＣＯＳ−１細胞中のα−ＧａｌＡの増大。ＣＯＳ−１細胞に形質移入されたｃＤＮＡは、Ｌ１６６Ｖ、Ａ１５６Ｖ、Ｇ３７３ＳおよびＭ２９６Ｉ上に変異を有するα−ＧａｌＡであった。添加したＤＧＪ濃度は２０μＭであった。ＴｇＭマウスへのＤＧＪ投与によるα−ＧａｌＡ活性の増大。ＴｇＭマウス（１つの群として４匹のマウス）の飲料源としてＤＧＪ溶液（０．０５ｍＭまたは０．５ｍＭ）を置いた。投与１週間後に、酵素活性を測定するため臓器をホモゲナイズした。データは、ＴｇＭマウスの活性から、ＤＧＪで飼養した非Ｔｇマウスから得られた内因性マウスα−ＧａｌＡ活性を減算したものである。示した酵素活性は平均値であり、標準偏差は１０％未満であった。

発明の詳細な説明

＜略語＞
便宜のために本明細書で使用する略語を以下に記述する。α−ＧａｌＡは、ヒトリソソームのα−ガラクトシダーゼＡである。ＴｇＮマウスは、正常なヒトリソソームのα−ガラクトシダーゼＡを過剰発現するトランスジェニックマウスである。ＴｇＭマウスは、Ｇｌｎ（Ｒ３０１Ｑ）による３０１位置でのＡｒｇの単一アミノ酸置換を有する変異体ヒトリソソームのα−ガラクトシダーゼＡを過剰発現するトランスジェニックマウスである。ＴｇＮ繊維芽細胞は、ＴｇＮマウスから発生した繊維芽細胞である。ＴｇＭ繊維芽細胞は、ＴｇＭマウスから発生した繊維芽細胞である。ＤＧＪは、１−デオキシ−ガラクトノジリマイシンである。ＤＥ−ＨＮＪは、３，４−ｄｉ−ｅｐｉ−α−ホモノジリマイシンである。ｐＮＰ−α−Ｇａｌは、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトシドである。４−ｍＵ−α−Ｇａｌは、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトシドである。ＦＣＳはウシ胎児血清であり、ＰＢＳはリン酸緩衝食塩水であり、ＢＳＡはウシ血清アルブミンである。ＴＬＣは、薄層クロマトグラフィーである。ＣＴＨは、グロボトリアオシルセラミド(globotriaosylceramide)またはセラミドトリヘキソシドである。ＣＤＨはジヘキソシドセラミドであり、ＣＭＨはモノヘキソシドセラミドであり、ＥＲは小胞体である。

＜材料と方法＞
（材料）：
アルカロイド化合物は、植物、または植物生産物を部分的に化学的修飾した誘導体（９）の何れかから精製した。ＴｇＮマウスおよびＴｇＭマウスは、以前に報告されているように（１０、１１）調製した。ＴｇＮまたはＴｇＭの繊維芽細胞は、手順どおりにＴｇＮマウスまたはＴｇＭマウスから確立した。ヒトリンパ芽球は、正常成人またはファブリ病患者（６）からのエプスタイン−バールウィルス形質転換リンパ芽球ラインであった。ＣＯＳ−１細胞中で一時的に発現する正常および変異α−ＧａｌＡのｃＤＮＡは、報告（１２）どおりにクローン化した。アルカロイドに関するインビトロでの阻害研究でα−ＧａｌＡは述べられており、正常α−ＧａｌＡ遺伝子がコード化された組換えバキュロウイルスによって感染したＳｆ−９細胞を培地から精製した（１３）。［^１４Ｃ］−ＣＴＨは、化学物質の組み合わせとスフィンゴリピドセラミドＮ−デアシラーゼ反応（１４）により調製した。

（方法）：
細胞培養：
ＣＯＳ−１細胞、ＴｇＮおよびＴｇＭ繊維芽細胞は、１０％ＦＣＳおよび抗生物質を補充したＨａｍのＦ−１０培地で培養した。リンパ芽球は、１０％ＦＣＳおよび抗生物質を補充したＲＰＭＩ−１６４０で培養した。すべての細胞培養は、５％のＣＯ_２下で、３７℃において実施した。繊維芽細胞およびリンパ芽球に対するモデルとして、細胞内酵素活性のアッセイを始める前に、細胞（繊維芽細胞用については３×１０^５、およびリンパ芽球については５×１０^５）を４日間、２０μＭのＤＧＪを含有した、またはＤＧＪを含有していない好ましい培地１０ｍｌ中で培養した。

ＣＯＳ−１細胞中のα−ＧａｌＡの一時的発現
ＣＯＳ−１細胞（５×１０^５）は、６０ｍｍ皿につき、１．２ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で、１μｇのプラスミドＤＮＡおよび８μｌのリポフェクタミン(Lipofectamine)（Gibco, Gaithersburg ,MD U.S.A.）を用いて感染させた。６時間、３７℃で培養した後、２０％ＦＣＳを含有する同培地１．２ｍｌを添加し、その培養物を一晩培養した。その培地を２．４ｍｌの完全ＨａｍＦ−１０培地と取り換えた後、適切な濃度でアルカロイドを添加し、細胞内酵素活性のアッセイを始める前に、１日間更にそれを培養した。

α−ＧａｌＡの細胞内酵素アッセイ：
リン酸緩衝食塩水で２度洗浄した後、水２００μｌ中で細胞をホモゲナイズし、酵素アッセイのために、１０，０００×ｇの遠心分離によって得られた上澄み１０μｌを０．１Ｍのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）中で６ｍＭの４−ｍＵ−α−Ｇａｌおよび９０ｍＭのＮ−アセチルガラクトサミンによって構成された基質溶液５０μｌで３７℃にて培養した。データはすべて１０％未満の標準偏差を有する三回測定の平均である。酵素活性の１単位は、３７℃で毎時遊離された４−メチルウンベリフェロン１ｎｍｏｌとして定義した。

α−ＧａｌＡのインビトロにおける阻害アッセイ：
酵素活性は、基質としてｐＮＰ−α−Ｇａｌを用いて分析した。代表的な阻害反応は、０．０５Ｍのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）で全容量を１２０μｌとした、２００ｎｍｏｌのｐＮＰ−α−Ｇａｌ、適当な酵素、および阻害剤の混合物で実施した。１５分間、３７℃でのインキュベーションし、その反応を０．２Ｍのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．８）１ｍｌの添加によって中止し、４９０ｎｍにおける吸光度として遊離されたｐＮＰ量を測定した。

実施例１
α−ＧａｌＡ活性のインビトロにおける阻害および細胞内増大に関する双方の研究において、一連の植物アルカロイド（スキーム１、文献９）を使用した。阻害実験の結果は、図１Ａに示した。

試験した化合物のうち、α−ＧａｌＡに対する強力な競合的阻害剤として知られている１−デオキシ−ガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ、５）は、４．７ｎＭでＩＣ_５０の最も高い阻害活性を示した。α−３，４−Ｄｉ−ｅｐｉ−ホモノジリマイシン（３）は、２．９μＭでＩＣ_５０の有効な阻害剤であった。他の化合物は、０．２５ｍＭ（６）から２．６ｍＭ（２）の範囲にわたるＩＣ_５０の適度な阻害活性を示した。更に驚いたことに、これらの化合物は、正常の４％の残存性α−ＧａｌＡ活性を有するファブリ病の異型性変異から確認された、変異α−ＧａｌＡ遺伝子（Ｒ３０１Ｑ）を形質移入したＣＯＳ−１細胞中のα−ＧａｌＡ活性を著しく増大した。ＩＣ_５０の阻害剤の全３〜１０倍濃度でこれらの化合物を形質移入したＣＯＳ−１細胞を培養することによって、α−ＧａｌＡ活性は１．５〜４倍に増大した（図１Ｃ）。細胞内増大の有効性はインビトロでの阻害活性と対応しており、また、化合物を１０μＭ濃度で培地に添加した（図１Ｂ）。

実施例２
最も強力なインビトロにおける阻害剤および最も有効な細胞内エンハンサーのＤＧＪを、より詳細に特徴化するために選択した。ＴｇＭまたはＴｇＮの繊維芽細胞（図２Ａ）、および、Ｒ３０１ＱまたはＱ２７９Ｅ変異体の遺伝子型を有すつファブリ患者から得たリンパ芽球（図２Ｂ）にＤＧＪを添加した。ＴｇＭ繊維芽細胞で確認された酵素活性は、２０μＭのＤＧＪとの共培養によって６倍に増加し、正常の５２％に達した。更に、ＤＧＪはリンパ芽球に対して類似の効果を示し、Ｒ３０１ＱおよびＱ２７９Ｅにおいて８倍および７倍まで残存性酵素活性が増大し、それは、すなわち、正常の４８％および４５％であった。また、Ｔｇ正常（ＴｇＮ）繊維芽細胞および正常リンパ芽球中の酵素活性は、ＤＧＪを用いた培養法によって増加が確認された。

実施例３
ＴｇＭ繊維芽細胞並びに健常者およびＲ３０１Ｑ上に変異を有する患者のヒトリンパ芽球は、２０μＭのＤＧＪの存在下で培養した。ＤＧＪを含有しない場合の培養においては、ＴｇＭ繊維芽細胞または変異リンパ芽球中のα−ＧａｌＡ活性は変化しなかった（図３）。しかしながら、ＤＧＪを含有することによって、酵素活性はこれらの細胞培養において顕著な増加を示した。変異リンパ芽球中の酵素活性は、５日目で、ＤＧＪを含有しないで培養した正常リンパ芽球で確認されたものの６４％に達した。更に、正常リンパ芽球中の酵素活性は、ＤＧＪを含有した培養の後では３０％増大した。

実施例４
形質移入ＣＯＳ−１細胞、ＴｇＭ繊維芽細胞、およびＲ３０１Ｑの表現型を有するリンパ芽球中のα−ＧａｌＡ増大のＤＧＪ濃度依存性を試験した。

図４に示すとおり、形質移入ＣＯＳ−１細胞（図４Ａ）およびリンパ芽球（図４Ｃ）では、０．２〜２０μＭの範囲でＤＧＪの濃度の増加とともに酵素活性が増加し、ＴｇＭ繊維芽細胞（図４Ｂ）では０．２〜２００μＭの間で酵素活性が増大した。高濃度のＤＧＪの場合、増大効果は抑制された。

ＤＧＪ（図５）と比較した場合、ＤＥ−ＨＮＪは、高濃度（１〜１０００μＭ）において、酵素（Ｒ３０１Ｑ）の変異ｃＤＮＡを形質移入したＣＯＳ−１細胞中のα−ＧａｌＡの増大に関する同様の効果を示した。培地中、１ｍＭのＤＥ−ＨＮＪがＣＯＳ−１細胞の細胞内酵素活性を阻害しなかったことは明らかである。

実施例５
図６は、リンパ芽球中のＤＧＪ増大α−ＧａｌＡの安定性を測定するための実験を示す。細胞を４日間、２０μＭのＤＧＪを含有する１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地１０ｍｌ中で３７℃にて培養し、５×１０^５の細胞をＤＧＪ非含有の１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地１３ｍｌ中に移した。２ｍｌの培地を酵素アッセイのために毎日得た。ＤＧＪ非含有の培地の置換後に、ＤＧＪ含有での事前培養およびＤＧＪ非含有での事前培養との間に初期剰余の全α−ＧａｌＡ活性が維持されており（図６）、増大した酵素が少なくとも５日間細胞において安定していることが示唆されている。

実施例６
細胞内で増大した酵素の機能を研究するために、［^１４Ｃ］−ＣＴＨをＴｇＮ繊維芽細胞の培養物に加えた。

糖脂質の検出は、展開溶媒としてＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ：水（６５：２５：４）を用いた薄層クロマトグラフィーによって行い、Ｆｕｊｉ−ＢＡＳ画像診断システムによって視覚化した（図７）。α−ＧａｌＡによるＣＴＨの代謝産物である二ヘキソシドセラミド（ＣＤＨ）の量は、２０μＭのＤＧＪとともに培養した細胞、およびＤＧＪを含有しないで培養した細胞との間で比較可能であり（全中性糖脂質の４．５％対４．３％）、これにより、細胞内酵素は用いた濃度でのＤＧＪによって阻害されないことが示された。

実施例７
ＤＧＪがα−ＧａｌＡの生合成に影響を与えるか否か検討するために、ＤＧＪを用いて培養した変異リンパ芽球（Ｒ３０１Ｑ）中のα−ＧａｌＡのｍＲＮＡ濃度を、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法によって測定した（１５）。図８Ａは、α−ＧａｌＡのｍＲＮＡがＤＧＪ５０μＭを用いてのリンパ芽球の培養によって変化しなかったことを明らかに示している。

一方、ウェスタンブロット分析は、ＴｇＭ繊維芽細胞の酵素タンパク質が著しく増加していることを示し、その増加はＤＧＪの濃度に対応していた（図８Ｂ）。ＤＧＪを用いて培養した細胞中の低分子量（約４６ｋＤ）を有する比較的多くの酵素タンパク質は、高レベルの成熟酵素を示唆している（１６）。これらの結果は、酵素の増大におけるＤＧＪの作用がポスト転写事象であることを示している。

実施例８
増大した酵素がリソソームに運ばれることを確認するために、Ｔｇマウス繊維芽細胞で細胞下分画を行った（図８）。ＴｇＭ繊維芽細胞中の全般的酵素活性は低く、ゴルジ器官分画を含む１．０４２ｇ／ｍｌの密度マーカーで溶出された（２０）（図９Ａ）。２０μＭのＤＧＪを用いた培養では、ＴｇＭ繊維芽細胞中の酵素活性は全般的に高い酵素活性を示し、ほとんどの酵素が、リソソーム標識酵素ヘキソサミニダーゼの同一分画で溶出された（図９Ｂ）。更に、ＴｇＭ中のα−ＧａｌＡ活性の溶出パターンは、ＴｇＮ繊維芽細胞で確認されたものに変更した（図９Ｃ）。

実施例９
Ｒ３０１ＱおよびＱ２７９Ｅの遺伝子型は、異型性型のファブリ病患者から確認された。α−ＧａｌＡ活性の増大に関するＤＧＪの有効性をファブリ病の他の遺伝子型および表現型で試験した。この実験では、ファブリ病の典型的型を有する患者で確認された３つの変異α−ＧａｌＡｃＤＮＡ、Ｌ１６６Ｖ、Ａ１５６ＶおよびＧ３７３Ｓ、およびその疾患の異型性型を有する患者から確認された変異Ｍ２９６Ｉを使用した。図１０は、ＤＧＪの包含物は、試験した４つの遺伝子型すべてにおいて、特にＬ１６６Ｖ（７倍増加）およびＡ１５６Ｖ（５倍増加）に対する酵素活性を増加させることを示している。また、データは、本方法が異型性型にだけでなく、その疾患の典型的型にも有用であることを示している。

実施例１０
１日当たり体重１キログラム当たり約３または３０ｍｇのＤＧＪ投薬量に対応する１週間の飲用源として０．０５または０．５ｍＭのＤＧＪ溶液を供給することによりＴｇマウスにＤＧＪを投与した。酵素活性は、各々、心臓で４．８倍および１８倍、腎臓で２．０倍および３．４倍、脾臓で３．１倍および９．５倍、肝臓で１．７倍および２．４倍を示した（図１１）。臓器における酵素活性の増加はＤＧＪ投薬量の増加に対応していた。変異遺伝子（Ｒ３０１Ｑ）が、心臓に制限される臨床症状を有している異型性変異型ファブリ患者で確認されたので、ＤＧＪの経口投与がＴｇＭマウスの心臓のα−ＧａｌＡ活性を特に増大するという事実は特に重要である。

＜考察＞
ゴルジ複合体への輸送が正しく折り畳まれたタンパク質および構築されたタンパク質に限定されており、精度管理の主要なプロセスが様々なシャペロンによって実施されることを確保するために、ＥＲが効率的な精度管理システムを保持していることが知られている（１７）。本出願中で示した結果の１つの説明は以下のとおりである。ファブリ病における幾つかの表現型では、不完全で可撓性の酵素の折り畳みを生じる一方、触媒中心は無損傷で残存する。阻害剤は、酵素触媒中心に対して通常高い親和性を有し、阻害剤の存在によって酵素触媒中心が付加され、折り畳みの屈曲性を低減して、おそらくは酵素の「適切な」立体配座を導く。その結果、酵素が「精度管理システム(quality control system)」を通過し、ゴルジ複合体に輸送され熟成に達することができる。一度ｐＨが酸性であるリソソームに酵素を輸送すれば、酵素は酸性条件下で安定しているので（６）、酵素は同じ立体配座で安定している傾向にある。そのような場合、阻害剤は、適切な立体配座を呈するように酵素に強いるシャペロンとして作用する。我々はそのような機能をもった低分子量化学物質に対する用語として「化学シャペロン」を使用する。

その化合物がリソソーム中の酵素触媒中心から円滑に解離し得るということは酵素の機能において重要である。本研究で使用する化合物は競合的阻害剤であるので、阻害剤の解離は２つの因子、ｉ）阻害剤濃度、および、ｉｉ）ｐＨに依存する。Ｄａｌｅら（１８）は、１−デオキシノジリマイシンのα−グルコシダーゼへの結合がｐＨ依存性であり、その場合、阻害剤はｐＨ６．５でｐＨ４．５に比べて８０倍以上しっかりと酵素に結合し、ノジリマイシン誘導体が非プロトン付加形態としての機能することを示唆することを示した。阻害剤は中性条件で酵素に結合し、ＤＧＪがプロトン化しやすい酸性条件で酵素から遊離することができるので、これは、図７で示した細胞中のα−ＧａｌＡの機能に関する結果を説明し得るものである。

本明細書で述べた結果は、ＤＧＪが、Ｒ３０１ＱおよびＱ２７９Ｅの遺伝子型を有するファブリ病の異型性変異を持つ患者のリンパ芽球における変異α−ＧａｌＡ活性を有効に増大することを示している。更に、古典的タイプおよび非古典的タイプを含むファブリ変異の他の表現型におけるＤＧＪの有効性を試験した。ＤＧＪは、異型性ファブリ病と診断された患者から得た３つの遺伝子型すべての細胞株、および高い残留酵素活性を有する典型的ファブリ型を保持する幾つかの細胞株において酵素活性を有効に増大した。本発明によれば、α−ＧａｌＡ阻害剤の投与法は、変異が触媒中心以外の部位で生じるファブリ患者に対する有効な治療であることが立証され、また、他のスフィンゴ糖脂質蓄積症にも有用であるはずである。

本明細書で引用した文献は引用によって本明細書に援用し、便宜のために下記に列挙する。

参考文献

特許請求の範囲に定義される本発明の範囲および意図から逸脱することなく、上述した本発明において種々の変更を行うことができることは認識されるであろう。

Claims

１−デオキシガラクトノジリマイシン及び薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含み、ファブリ病の治療において使用するための医薬組成物であって、
前記ファブリ病が異型ファブリ病である医薬組成物。
１−デオキシガラクトノジリマイシン及び薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含み、ファブリ病の治療において使用するための医薬組成物であって、
前記ファブリ病が高い残留酵素活性を有する典型的ファブリ病である医薬組成物。
１−デオキシガラクトノジリマイシン及び薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含み、ファブリ病の治療において使用するための医薬組成物であって、
患者がリソソームのα-ガラクトシダーゼＡの触媒中心以外の部位における変異を有する医薬組成物。
１−デオキシガラクトノジリマイシンの用量は、１日当たり０．５から１００ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項１〜３の何れか一項に記載のファブリ病の治療において使用するための医薬組成物。
１−デオキシガラクトノジリマイシンの用量は、１日当たり１から５０ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項４に記載のファブリ病の治療において使用される医薬組成物。