JP5357545B2 - ２−アミノフェノール又はその誘導体を有効成分とする抗炎症剤 - Google Patents

Description

本発明は抗炎症剤に関するものであり、とりわけ、２−アミノフェノール又はその誘導体を有効成分とする抗炎症剤に関するものである。

炎症反応は、病原体から生体を防御するための重要な生体防御反応のひとつではあるものの、生体組織に対してもダメージを与えることから、過剰な炎症反応はかえって有害である。特に自己免疫疾患やアレルギー性疾患など、病原体が存在しない炎症反応は全く有害である。そこで、炎症反応を抑制するため、多種多様の抗炎症剤が開発されており、例えば、アスピリン、ジクロフェナク、インドメタシン、メフェナム酸などの非ステロイド系抗炎症剤、プレドニゾロン、酢酸ヒドロコルチゾン、ジフルプレドナートなどのステロイド系抗炎症剤があげられ、これらはすでに医薬品として使用されている。

ところで、炎症反応による主な症状は、「痛み」と「腫れ」である。炎症反応に伴う「痛み」はプロスタグランジンにより惹起される。プロスタグランジンの生成にはシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）が必須であることから、その阻害剤（ＣＯＸ阻害剤）は鎮痛効果を発揮する抗炎症剤として有用である。ＣＯＸは、アラキドン酸からプロスタグランジンを生成する酵素であり、２種類のアイソフォームが存在し、このうちＣＯＸ−１は、消化管、腎臓、血小板などにおいて構成的に発現しており、正常な生理機能の維持に欠かせない酵素である。一方、ＣＯＸ−２はインターロイキン−１α、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）などの炎症性サイトカインなどによって一過性に産生誘導され、炎症時に過剰発現する酵素であり、リウマチ、関節炎などの炎症性疾患や癌、胃潰瘍、アルツハイマー病、排卵分娩に関与していると報告されている。抗炎症剤としてのＣＯＸ阻害剤はＣＯＸ−２の活性阻害を目的としているものの、多くの抗炎症剤はＣＯＸ−１の活性をも阻害するため、腹痛などの副作用が問題となっている。そこで、ＣＯＸ−２選択的阻害剤が欧米を中心に開発され、胃腸障害や腎障害などの副作用が少なく、抗炎症剤として有望であった。しかしながら、シンムラ等著、『心血管系におけるシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２は敵か，味方か？−ＣＯＸ−２ハザードの分子メカニズム−』、インフィラメーション・アンド・レジェネレーション、第２５巻、第６号、第５１７乃至５２４頁、２００５年に記載のとおり、ＣＯＸ−２選択阻害剤のロフェコキシブを投与した大腸腺腫性ポリープ患者に、心筋梗塞などの心血管系の疾患が発生する確率が高いことが報告され、ＣＯＸ−２選択的阻害剤の安全性が不安視されている。よって、日本ではいまだ医薬品として認可されていない。

一方、炎症に伴う「腫れ」は、患部の血管が拡張し、白血球、リンパ球、マクロファージなどの免疫担当細胞が局所に集中することで起こる。血管の拡張は、一酸化窒素（ＮＯ）により誘導されることから、「腫れ」の症状を緩和するためには、ＮＯの産生阻害剤が有用である。ＮＯは、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）が、Ｌ−アルギニンを酸化することにより産生される。ＮＯＳには非誘導型と誘導型の２種類が存在し、このうち誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）はマクロファージ、内皮細胞、平滑筋細胞等に多く存在しており、炎症反応における重要な因子である。すなわち、ＮＯの産生を抑制するためには、ｉＮＯＳの活性阻害剤やｉＮＯＳの産生抑制剤が有効であり、ｉＮＯＳ活性阻害剤としては、Ｎ^Ｇ−ニトロ−Ｌ−アルギニン−メチル−エステル、イソチオ尿素誘導体、２−イミノピペリジン、Ｌ−カナバリンなどが挙げられる。

ところで、多くの炎症性疾患において、ＣＯＸ−２とｉＮＯＳが同時に過剰に発現しているという報告があり、炎症反応は上記２つの酵素の活性が大いに関わっていると考えられる。したがって、炎症症状を効率よく緩和するには、「痛み」と「腫れ」を引き起こすＣＯＸ−２とｉＮＯＳの活性を同時に抑制する必要がある。しかしながら、従来知られるＣＯＸ阻害剤又はＮＯＳ阻害剤は、酵素特異性が高く、ＣＯＸ又はｉＮＯＳのいずれかの活性を阻害するにすぎない。したがって、「痛み」と「腫れ」を同時に緩和することができる抗炎症剤が望まれている。

一方、２−アミノフェノール（別名：クエスチオマイシンＢ）は、下記化学式１で示される化合物であり、酸化重合して、下記化学式２で示される２−アミノフェノキサジン−３−オン（別名：クエスチオマイシンＡ）に比較的容易に変換する。２−アミノフェノール又はその誘導体は、抗菌活性を持つ物質として古くから知られており、特に、２−アミノフェノキサジン−３−オンは、強力な抗癌剤であるアクチノマイシンＤの基本骨格としても知られている。モトハシ等著、『ポテンシャル・アンチツモア・フェノキサジンズ』、メディカル・リサーチ・レビュー、第１１巻、第２５０乃至２５４頁、１９９１年には、２−アミノフェノキサジン−３−オン及びその誘導体が抗腫瘍活性を有していることが開示されており、特に、シマモト等著、『アンチツモア・エフェクツ・オブ・ア・ノベル・フェノキサジン・デリバティブ・オン・ヒューマン・リューケミア・セル・ラインズ・イン・ビトロ・アンド・イン・ビボ』、クリニカル・キャンサー・リサーチ、第７巻、第７０４乃至７０８頁、２００１年にはその誘導体の一つの２−アミノ−４，４α−ジヒドロ−４α，７−ジメチル−フェノキサジン−３−オンが、各種の腫瘍細胞に対して細胞障害活性を示すことが開示されている。さらに近年、２−アミノフェノキサジン−３−オンは、特開２００４−１４３１０１号公報ではウイルス性疾患の治療に、特開２００５−２７２３３４号公報ではクラミジア症の治療に、特開２００５−６０３２５号公報ではヘリコバクター属が関与する消化器疾患の治療に有効であることが開示されている。しかしながら、２−アミノフェノール誘導体が抗炎症作用を有していることは知られていない。

化学式１：

化学式２：

本発明は、従来の抗炎症剤よりも副作用が少なく、「痛み」や「腫れ」などの炎症症状の改善効果の高い抗炎症剤を提供することを課題とするものである。

本発明者等が鋭意研究したところ、２−アミノフェノール又はその誘導体は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）の活性を阻害することでプロスタグランジンＥ２の合成を阻害する作用、ｉＮＯＳの産生を抑制することでマクロファージによる一酸化窒素の合成を阻害する作用、及び、肥満細胞の脱顆粒反応の抑制作用を合わせ持つことを発見した。また、２−アミノフェノール又はその誘導体は、メラニン生成細胞に対して、メラニン合成を阻害する作用、及び、コラーゲン産生を増強する作用を有することも発見し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、２−アミノフェノール又はその誘導体を含有する抗炎症剤を提供することにより、前記課題を解決するものである。

本発明によれば、従来の抗炎症剤よりも副作用が少なく、また、炎症症状の緩和効果に優れる抗炎症剤を提供することができる。また、皮膚外用剤の形態の場合は、美白用化粧品として有用である。

本発明でいう２−アミノフェノールとは、下記化学式１で示される化合物であり、本発明の効果を発揮する限り、その起源や由来を問わず、市販品を用いることができる。本発明でいう２−アミノフェノールの誘導体とは、２−アミノフェノールの酸化重合体である下記化学式２で示される２−アミノフェノキサジン−３−オン及びそれを基本骨格とする誘導体を意味し、２−アミノフェノールと同等以上の効果を発揮する。２−アミノフェノキサジン−３−オンは、それを豊富に含む植物、細菌などから適宜の抽出・精製方法により製造したり、前駆体の２−アミノフェノールを酸化重合させて合成することができる。例えば、特開２００３−２８７８号公報に記載の、２−アミノフェノールとフェリシアン化カリウムなどの３価の鉄イオンとを反応させる方法や、特開平２−１９３９８４号公報に記載の、２−アミノフェノールとヒト又はウシのヘモグロビンとを反応させる方法により、合成することができる。

化学式１：

化学式２：

本発明で用いられる２−アミノフェノキサジン−３−オンの誘導体としては、例えば、天然に存在する誘導体として、２−アミノ−７−ヒドロキシ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ_５がヒドロキシ基、Ｒ_１乃至Ｒ_４が水素原子）、２−アミノ−７−メトキシ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ_５がメトキシ基、Ｒ_１乃至Ｒ_４が水素原子）、２−アセチルアミノ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ_１がアセチル基、Ｒ_２乃至Ｒ_５が水素原子）、２−アセチルアミノ−７−ヒドロキシ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ_１がアセチル基、Ｒ_５がヒドロキシ基、Ｒ_２乃至Ｒ_４が水素原子）、２−（Ｎ−ヒドロキシ）アセチルアミノ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ_１がアセチル基、Ｒ_２がヒドロキシ基、Ｒ_３乃至Ｒ_５が水素原子）、２−（２−ヒドロキシアセチル）アミノ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ_１がヒドロキシアセチル基、Ｒ_２乃至Ｒ_５が水素原子）、２−アセチルアミノ−７−メトキシ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ_１がアセチル基、Ｒ_５がメトキシ基、Ｒ_２乃至Ｒ_４が水素原子）、７−ヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシアセチル）アミノ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ_１がヒドロキシアセチル基、Ｒ_５がヒドロキシ基、Ｒ_２乃至Ｒ_４が水素原子）、２−アミノ−４，６，７−トリ−メトキシ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ_３乃至Ｒ_５がメトキシ基、Ｒ_１及びＲ_２が水素原子）などがあげられる。また、人工的な手法により、糖を付加して配糖体にしたり、ポリエチレングリコールやプルランなどの水溶性ポリマーを結合させたりすることができる。

一般式１：

（ただし、Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、水素原子（Ｈ）、ヒドロキシ基（ＯＨ）、アセチル基（ＣＯＣＨ_３）、ヒドロキシアセチル基（ＣＯＣＨ_２ＯＨ）から選ばれ、Ｒ_３乃至Ｒ_５は、それぞれ独立して、水素原子（Ｈ）、ヒドロキシ基（ＯＨ）、メトキシ基（ＯＣＨ_３）から選ばれる。）

本発明でいう一酸化窒素の合成阻害作用は、細胞におけるｉＮＯＳが量的に減少することによって発揮され、一酸化窒素の合成活性を有する細胞、例えば、マクロファージ細胞に本発明の化合物を添加して、当該細胞のｉＮＯＳの作用により産生するＮＯ量を測定することにより調べることができる。マクロファージ細胞としては、マウス由来の細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞や、マウスなどの実験動物から採取して用いることができる。産生するＮＯ量は常法のＧｒｉｅｓｓ法により測定できる。Ｇｒｉｅｓｓ法とは、ＮＯをスルファニルアミドとＮ−（１−ナフチル）エチレンジアミンの混合物（Ｇｒｉｅｓｓ試薬）中に添加し、ジアゾ化カップリング反応により生成する赤色のアゾ色素を５４０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＮＯの代謝物のＮＯ_２ ⁻を定量する方法である。

本発明でいうシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）活性阻害作用は、ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２及びアラキドン酸存在下において、試験試料としての本発明の化合物を添加することによって、プロスタグランジンＥ_２（ＰＧＥ２）の生成量を測定し、対照試料と比較することによって確認することができる。５０％阻害濃度（ＩＣ_５０値）は、非阻害の対照試料と比較し、ＰＧＥ２合成を５０％阻害するために必要な試験試料の濃度を表す。また、シクロオキシゲナーゼ活性を有する細胞に試験試料を添加して、ＰＧＥ２の生成量を測定することによっても確認することができる。また、ＣＯＸ−１／ＣＯＸ−２比とは、ＣＯＸ−１に対してのＩＣ_５０値とＣＯＸ−２に対してのＩＣ_５０値の比であり、この値が大きいほど、ＣＯＸ−２に対しての選択的阻害剤であることを意味する。

本発明でいうメラニンの合成を阻害する作用は、メラニン生成細胞、例えばマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６細胞に本発明の化合物を添加して適宜の期間培養し、細胞中のメラニン量を、例えば、４００乃至５００ｎｍの範囲内の波長の吸光度を測定することにより定量することができる。

上記のとおり、本発明で用いられる２−アミノフェノール又はその誘導体は、一酸化窒素合成阻害作用、シクロオキシゲナーゼ活性阻害作用や肥満細胞や好塩基性細胞の脱顆粒抑制作用を有していることから、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗アトピー剤の用途として、食品、化粧品、医薬部外品、医薬品としての多種多様の用途を有している。また、リンパ球Ｔ細胞のＴｈ２細胞への分化促進作用も有することから、乾癬やリュウマチをはじめとする自己免疫疾患の予防剤・治療剤としても使用することができる。さらに、メラニン合成を阻害する作用やコラーゲン産生増強作用を有していることから、皮膚外用剤の形態をとる時は、抗エイジング作用を有する美白用・美肌用の化粧品として有用である。本発明を皮膚外用剤の形態にする場合、抗炎症剤に含まれる有効成分としての２−アミノフェノール又はその誘導体の含有量は、通常、０．００００２乃至１％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．０００１乃至０．５％（ｗ／ｗ）であり、使用量としては、皮膚の症状に応じて適宜決定すればよく、１日１回乃至数回に分けて、通常、一回の使用量が皮膚１ｃｍ^２当たり０．１μｇ乃至１０ｍｇ、好ましくは１μｇ乃至５ｍｇである。

上記皮膚外用剤には、２−アミノフェノール又はその誘導体以外の美白作用やコラーゲン産生増強作用を有する物質を適宜配合することができる。例えば、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩類、アルコキシサリチル酸及びその塩類、トラネキサム酸及びその塩類、エラグ酸及びその塩類、リノール酸及びその塩類、コウジ酸及びその塩類、レゾルシン、グルタチオン、システイン、ハイドロキノン、テトラヒドロクルクミノイド、又はそれらの誘導体などが挙げられ、これら美白作用を有する物質を含有する、カミツレ、藍などの植物抽出物を用いることができる。このうち、Ｌ−アスコルビン酸誘導体、コウジ酸又はトレハロースとの組合せは、美白作用及び／又はコラーゲン産生増強作用を相乗的に高めるので特に好ましい。

上記成分の他に通常化粧品や医薬部外品、医薬品等に用いられる各種任意の成分を必要に応じて適宜配合することができる。例えば、水、エタノール、グリセリン、保湿剤、油性成分、乳化剤、乳化安定剤、増粘剤、防腐剤、粉体、顔料、色素、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、ｐＨ調整剤、香料、薬効成分等が挙げられる。

本発明の皮膚外用剤は、一般の皮膚化粧料に限定されるものではなく、例えば、美白用途やシワ、小ジワやシミの改善用途、さらには、ほくろ、太田母斑、扁平母斑、日焼け、火傷、虫刺され、打撲、アトピー性皮膚炎などの治療用途の医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤全般を包含するものである。また、その剤形も特に限定されず、目的に応じて選択することができる、例えば、液状、粉末状、固形状、乳液状、クリーム状、ゲル状等のいずれでもよく、化粧水、美容液、乳液、クリーム、パック料、マッサージ料、洗顔料、クレンジング料、日焼け止め料等のスキンケア化粧品、ボディーパウダー、ボディーローション等のボディーケア化粧料、下地料、ファンデーション、白粉、コンシーラー、アイカラー、口紅等のメーキャップ化粧料、軟膏、エアゾール、添付剤等への適用が可能である。

本発明を抗炎症剤に適用するには、上記皮膚外用剤以外にも、経口投与に適した形態であってよく、例えば、錠剤、トローチ、丸薬、水性懸濁液、油性懸濁液、分散性粉末又は顆粒、乳剤、ハードカプセル、ソフトカプセル、シロップ、エリキシルの形態が挙げられる。また、局所投与、非経口投与、吸入噴霧又は直腸投与によることもでき、これらに適した剤形とすることができる。

また、本発明の抗炎症剤は、上記の抗炎症作用を有する物質と併用することができ、さらに、他の作用を有する薬剤とともに投与することができる。例えば、アセトアミノフェン、フェナセチンなどの鎮痛剤、カフェインなどの増強剤、フェニルエフリン、フェニルプロパノールアミン、プソイドフェドリン、オキシメタゾリン、エピネフリン、ナファゾリン、キシロメタゾリン、プロピルヘキセドリン及びレボーデスオキシエフェドリンなどの充血除去薬、コデイン、ヒドロコドン、カラミフェン、カルベタペンタン、デキストラメトルファンなどの咳止め薬、Ｈ２−アンタゴニスト、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、シメチコン、利尿薬、鎮痛性抗ヒスタミン薬、非鎮痛性抗ヒスタミン薬などが挙げられ、これらの１種又は２種以上と併用することができる。

本発明の抗炎症剤は、多種多様の炎症性疾患に適用できる。炎症性疾患とは、炎症症状を呈する疾患を意味するものであり、例えば、関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、変形性関節炎、痛風性関節炎、大腸炎、小腸炎、クローン病、ギランバレー症候群、強皮症、繊維症、皮膚炎、乾癬、血管性浮腫、湿疹様皮膚炎、高増殖性皮膚疾患、糸球体腎炎、腎炎、胃炎、膵炎、結膜炎、鼻炎、歯肉炎、歯周病、アルツハイマー病、アテローム動脈硬化症、脈管炎、静脈炎、動脈炎、大動脈炎、ＰＴＣＡ後再狭窄、バイパス手術後再狭窄、移植拒絶反応、アナフィラキシー、敗血症、血栓症、虚血／再灌流障害、アトピーを含む各種アレルギー疾患などが上げられる。また、本発明の抗炎症剤は、ＰＧＥ２の産生を抑制することから、とりわけ、骨破壊を伴う疾患、例えば、関節リウマチ、歯周病、骨粗鬆症などに有効である。また、本発明の抗炎症剤は、炎症性疾患の治療だけでなく、鎮痛剤、解熱剤、躁鬱病をはじめとする神経疾患の予防剤・治療剤などの用途でも利用できる。さらに本発明の抗炎症剤は、ＣＯＸ−２が過剰発現している各種の癌の治療剤として、公知の抗癌剤と併用して利用することができる。

本発明の抗炎症剤は、医薬上許容可能な基材や添加剤や賦形剤を含む投与単位調合物の形で投与される。また、ヒトの疾患の治療又は予防のみならず、マウス、ラット、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ニワトリなどの家畜、家禽やペット等にも適用できる。

本発明の抗炎症剤における有効成分としての２−アミノフェノール又はその誘導体の含有量は、症状、剤形、投与形態、投与対象動物に応じて適宜決定すれば良く、通常０．０００１乃至１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．０００１乃至１％（ｗ／ｗ）である。また、投与量については、症状、剤形、投与形態に応じて適宜決定すれば良く、１日１回乃至数回に分けて、通常、１日の投与量が０．０１μｇ乃至２５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１μｇ乃至５ｍｇ／ｋｇである。

以下、実験で本発明の詳細を説明する。

＜実験１：２−アミノフェノキサジン−３−オンの合成＞
２−アミノフェノールを原料にして２−アミノフェノキサジン−３−オンを合成した。すなわち、５５０ｍｇ（５ｍｍｏｌ）の２−アミノフェノール（和光純薬工業株式会社販売）を５０ｍｌの蒸留水に懸濁し、それに０．１Ｎ塩酸の２２５ｍｌを加えた後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整した。この溶液に５００ｍｌの５ｍＭフェリシアン化カリウム水溶液を攪拌しながら５分間かけて滴下し、さらに２６℃で３０分間反応させた。反応液を減圧下で乾燥して得られた固形物を４５０ｍｌのメタノールに溶解し、遠心分離して未溶解の固形分を除去した後、再度減圧下で乾燥した。得られた固形物を２００ｍｌ酢酸エチルに溶解し、２００ｍｌの０．００５Ｎ塩酸水溶液を加え、攪拌した後、分液ロートで酢酸エチル層を回収した。この操作を３回繰り返した後、得られた酢酸エチル層を減圧下で液量が１５ｍｌになるまで濃縮し、これを常法にしたがい、シリカゲルクロマトグラフィーカラム（商品名『ワコーゲルＣ２００』、和光純薬工業株式会社販売）及び逆相Ｃ３０クロマトグラフィーカラム（商品名『デベロシルＣ３０』、野村化学株式会社販売、又は、商品名『ＨＷ−４０Ｆ』、東ソー株式会社販売）により精製し、２−アミノフェノキサジン−３−オン２２０ｍｇを得た。

＜実験２：マクロファージからのＮＯ、ＰＧＥ２産生抑制活性＞
マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７を、細胞濃度１×１０^６個／ｍｌになるように、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（以下、「ＦＣＳ」と略記する）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させて、細胞浮遊液を調製した。これを９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ播種し、２−アミノフェノキサジン−３−オンを最終濃度１．６乃至１００μＭになるように添加し、さらに、誘導剤として２μｇ／ｍｌリポ多糖及び１０ＩＵ／ｍｌＩＦＮ−γを添加し、上記培地を加えて液量を２００μｌとした。これを、３７℃で２日間培養した後、生細胞数をカウントし、培地上清を常法のＧｒｉｅｓｓ法に供してＮＯ量を、また、抗ＰＧＥ２抗体を用いる「ＰＧＥ２ＥＩＡキット」（アマシャムバイオサイエンス社販売）に供してＰＧＥ２量を測定した。比較例として、ＣＯＸ阻害剤であるインドメタシン（和光純薬工業株式会社販売）、アスピリン（和光純薬工業株式会社販売）、ＣＯＸ−２選択的阻害剤であるＮＳ−３９８（和光純薬工業株式会社販売）を用意し、上記と同様にして実験を行なった。また対照として、上記試料を添加しない系を設けた。結果を表１に示す。なお、表１における「ＱＡ」は２−アミノフェノキサジン−３−オン（クエスチオマイシンＡ）、「ＮＳ」はＮＳ−３９８、「ＩＮ」はインドメタシン、「ＡＳ」はアスピリンを意味し、各試料におけるＮＯ産生量、ＰＧＥ２産生量、マクロファージの増殖は、対照の測定値と比較した相対値で示した。

表１の結果に示すとおり、２−アミノフェノキサジン−３−オン（表１における「ＱＡ」）は、マクロファージの増殖を低下させることなく、ＮＯの産生及びＰＧＥ２の産生を抑制した。一方、比較例の他の抗炎症剤は、ＰＧＥ２の産生抑制効果は顕著であるものの、ＮＯの産生抑制効果はあまり発揮されず、これらの従来の抗炎症剤は、「痛み」の改善効果は期待できるものの、「腫れ」の改善効果は期待できないことが示唆された。
また、本実験で得られた各細胞抽出液に含まれるｉＮＯＳの量を、抗ｉＮＯＳ抗体を用いるウエスタンブロッテッィング解析により調べたところ、濃度依存的に２−アミノフェノキサジン−３−オンによりｉＮＯＳ量が減少した。よって、２−アミノフェノキサジン−３−オンによるＮＯの産生阻害活性は、ｉＮＯＳの量を減少させることによって発揮されるものと考えられた。

＜実験３：ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２阻害活性＞
上記実験２の結果を検証するために、ＰＧＥ２の合成系に必須の酵素であるＣＯＸの酵素活性が阻害されるかどうか調べた。『ＣＯＸインヒビタースクリーニングアッセイキット』（ケイマン社販売）により、ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２、及び、基質としてのアラキドン酸が存在する反応系に、試験試料として２−アミノフェノキサジン−３−オン又は２−アミノフェノールを後記表２の濃度となるように添加し、抗ＰＧＥ２抗体を用いたＥＩＡにより、生成したＰＧＥ２の量を測定し、ＣＯＸの活性量とした。なお、対照として試験試料を添加しない系を設け、その測定値と比較することにより、ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２の残存活性率を求めた。また試験試料の各濃度での残存活性率をグラフにプロットし、ＩＣ_５０の濃度を算出した。結果を表２に示す。

表２の結果から明かなとおり、２−アミノフェノール及び２−アミノフェノキサジン−３−オンは、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の活性を阻害した。その効果はＩＣ_５０値で比較すると、モル比で４乃至６倍、質量比で２乃至３倍程度、２−アミノフェノキサジン−３−オンの方が優れていた。また、ＣＯＸ−１／ＣＯＸ−２比は、２−アミノフェノールが約１、２−アミノフェノキサジン−３−オンが約１．３であり、アスピリン（ＣＯＸ−１／ＣＯＸ−２比＝０．２４）やインドメタシン（ＣＯＸ−１／ＣＯＸ−２比＝０．０３）などの非ステロイド系のＣＯＸ阻害剤よりも、ＣＯＸ−２選択性が高く、２−アミノフェノール又は２−アミノフェノキサジン−３−オンを内服薬として患者に適用した場合、胃痛などの副作用が従来の非ステロイド系のＣＯＸ阻害剤と比べて軽度になることが期待され、それらは、抗炎症剤、解熱剤、鎮痛剤などの内服用の医薬品として有用である。

＜実験４：好塩基球の脱顆粒反応抑制活性＞
２−アミノフェノキサジン−３−オン（クエスチオマイシンＡ）が、マクロファージからの抗炎性メディエーターの遊離を阻害することが確認されたので、同様に炎症性メディエーターを遊離することが知られている好塩基球細胞への脱顆粒反応への影響を調べた。なお、脱顆粒率（％）及び脱顆粒抑制率（％）は、脱顆粒反応により細胞外に放出される顆粒中含まれるβ−ヘキソサミニダーゼ活性の測定に基づき、計算により求めた。
＜脱顆粒反応の測定に使用した細胞＞
ＩｇＥの架橋により脱顆粒反応を起こすことが知られているラットの好塩基球由来癌細胞ＲＢＬ−２Ｈ３（ヒューマンサイエンス振興財団・研究資源バンク販売、カタログ番号「ＪＣＲＢ００２３」）を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを補足したＭＥＭ培地（日水製薬社販売）で培養して使用した。
＜脱顆粒反応の誘発とβ−ヘキソサミニダーゼ活性の測定＞
この細胞を、常法によりトリプシン−ＥＤＴＡ処理してフラスコから回収し、細胞濃度が５×１０^５個／ｍｌになるように、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを補足したＭＥＭ培地に浮遊させて、細胞浮遊液を調製した。これを２４穴マイクロプレートに４００μｌずつ播種し、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガスインキュベーター内で、３乃至５時間培養後、０．６２５μｇ／ｍｌの抗ジニトロフェノール（以下、「ＤＮＰ」と略記する。）マウスＩｇＥ（シグマ−アルドリッチ社販売、１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを補足したＭＥＭ培地で希釈）を１００μｌ／穴ずつ添加して細胞をＩｇＥで感作した（抗ＤＮＰ−ＩｇＥ終濃度０．１２５μｇ／ｍｌ）。この細胞を、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガスインキュベーター内で、１晩培養後、培養上清を吸引除去し、Ｓｉｒａｇａｎｉａｎ緩衝液（１１９ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．４ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２５ｍＭ ピペラジン−Ｎ，Ｎ´´−ｂｉｓ（２−エタンスルホニック酸）（ＰＩＰＥＳ）、４０ｍＭ ＮａＯＨ ｐＨ７．２）を５００μｌ／穴ずつ添加して、各穴を２回洗浄した。０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５．６ｍＭ グルコース、１ｍＭ ＣａＣｌ_２を含むＳｉｒａｇａｎｉａｎ緩衝液（以下、「ＢＳＡを含むＳｉｒａｇａｎｉａｎ緩衝液」という）を、１６０μｌ／穴ずつ加え、３７℃で、１５分間加温した。被験試料として２−アミノフェノキサジン−３−オン（クエスチオマイシンＡ）、美白作用を有するアルブチン又はアレルギー性疾患治療剤のオキサトミド（陽性対照）の何れかを、表３に示す濃度となるように、ＢＳＡを含むＳｉｒａｇａｎｉａｎ緩衝液で希釈し、その何れかを２０μｌ／穴ずつ添加し、３７℃で、１５分間加温した（被験試料添加穴）。この被験試料の何れかを添加した被験試料添加穴に、ＢＳＡを含むＳｉｒａｇａｎｉａｎ緩衝液で５０μｇ／ｍｌとなるように希釈したＤＮＰ−アルブミン（シグマ−アルドリッチ社販売）を２０μｌ／穴ずつ添加し、３７℃で、１５分間加温した。この２４穴プレートを氷上で１０分間冷却後、上清を採取して、その１００μｌを９６穴マイクロプレートに分注し、当該上清中のβ−ヘキソサミニダーゼ活性を下記方法により測定した。また、これとは別に、陰性対照として、ＢＬ−２Ｈ３細胞を、抗体を含まないＦＣＳを補足したＭＥＭ培地を使用した以外は、被験試料添加穴と同じ条件で培養、処理して、その上清のβ−ヘキソサミニダーゼ活性を測定した（ＩｇＥ非感作穴）。また、このＩｇＥ非感作穴の一部は、培養上清を吸引除去後、ＢＳＡを含むＳｉｒａｇａｎｉａｎ緩衝液を添加して、各穴を２回洗浄後、ＢＳＡを含むＳｉｒａｇａｎｉａｎ緩衝液を２００μｌ／穴ずつ加えて、−８０℃で、凍結・解凍を２回繰り返し、細胞を破壊して、この破壊した細胞を含む液全量を回収し、１５００ｒｐｍで、１０分間遠心分離後、その上清１００μｌを９６穴マイクロプレートに分注し、全顆粒抽出物としてβ−ヘキソサミニダーゼ活性を測定した。
＜β−ヘキソサミニダーゼ活性の測定法＞
採取した被験試料添加穴の上清、ＩｇＥ非感作穴の上清又は全顆粒抽出物を加えた９６マイクロプレートの各々の穴に、基質として１ｍＭ ４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサニミド（ＰＮＡＧ）を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）５０μｌずつ添加して、３７℃で１時間保持し、０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．５）５０μｌずつ添加して反応を停止し、被験試料添加穴、ＩｇＥ非感作穴又は全顆粒抽出物穴の吸光度として、Ａ４０５−６５０の吸光度を測定し、脱顆粒率（％）及び脱顆粒抑制率（％）を、各々次数式１及び２にしたがって求めた。各被験試料添加時の脱顆粒反応の抑制の程度は脱顆粒の抑制作用が、『強い』（抑制率が５０％以上）、『弱い』（抑制率が５０％未満乃至３０％以上）、『なし』（抑制率が３０％未満乃至−３０％以上）、『促進』（抑制率が−３０％未満）の４段階で評価し、その結果を表３に示す。なお表３における「ＱＡ」は２−アミノフェノキサジン−３−オン（クエスチオマイシンＡ）、「ＡＢ」はアルブチン、又は、「ＯＸ」はオキサトミドを意味する。

数式１：

数式２：

なお、本実験では、β−ヘキソサミニダーゼ活性を指標に、脱顆粒率を求めたので、強いβ−ヘキソサミニダーゼ活性の抑制が認められた２−アミノフェノキサジン−３−オン（クエスチオマイシンＡ）にβ−ヘキソサミニダーゼ活性を直接抑制する作用がないことを、以下の方法により確認した。すなわち、上記実験で使用した最も高濃度の２−アミノフェノキサジン−３−オン（クエスチオマイシンＡ）を被験試料として使用し、脱顆粒反応抑制測定に使用した際の濃度と同じにするために、あらかじめＢＳＡを含むＳｉｒａｇａｎｉａｎ緩衝液で５倍に希釈したものを５０μｌ／穴で９６穴のマイクロウエルプレートに分注した。これとは別に、上記全顆粒抽出試料を５０μｌ／穴で９６穴のマイクロウエルプレートに分注した。これらの各穴に、１ｍＭ ＰＮＡＧを含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を５０μｌ／穴ずつ添加して、３７℃、１時間加温した。０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）を５０μｌ／穴ずつ添加して反応を停止し、Ａ４０５−６５０の吸光度を測定した。対照としてＢＳＡを含むＳｉｒａｇａｎｉａｎ緩衝液のみを添加して同様に測定をおこなった。β−ヘキソサミニダーゼ活性の阻害率（％）を次数式３にしたがって求めた。なお、測定は、被験試料及び全顆粒抽出試料について、各3穴を使用し、その平均を求めた。

数式３：

表３の結果から明かなとおり、２−アミノフェノキサジン−３−オンは、５μＭ以上で脱顆粒の抑制活性が認められ、１０乃至４０μＭで強い脱顆粒反応の抑制活性が認められた。また、陽性対照のオキサトミドは２３μＭ以上で脱顆粒の抑制活性が認められ、９４μＭでは強い抑制活性が認められた。アルブチンには脱顆粒の抑制活性は認められなかった。また、４０μＭの２−アミノフェノキサジン−３−オン添加時のβ−ヘキソサミダーゼ活性阻害率は−９．９％となり、溶媒として使用したＤＭＳＯを測定に使用した培地中の濃度では−８．６％となり、この物質自体やＤＭＳＯは当該酵素の活性を阻害しないことが確認されたので、この物質は好塩基球の脱顆粒反応自体を抑制することが明らかになった。この結果は、２−アミノフェノールや２−アミノフェノキサジン−３−オンなどの２−アミノフェノール誘導体は、好塩基球や肥満細胞などの脱顆粒反応を抑制するので、抗アレルギー剤として有用であることを物語っている。また、脱顆粒反応に引き続く炎症性に関わるメディエーターの放出も抑制されると考えられるので、２−アミノフェノールや２−アミノフェノキサジン−３−オンなどの２−アミノフェノール誘導体は、マクローファージを介する炎症反応のみでなく、好塩基球や肥満細胞を介した炎症反応も抑制できることを物語っている。なお、具体的なデータは示さないが、試験試料の溶媒として使用したＤＭＳＯは、本実験における培養条件では、測定結果に影響を及ぼす細胞障害性は認められなかった。

＜実験５：２−アミノフェノキサジン−３−オン又は２−アミノフェノールのメラニン合成阻害効果＞
マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−６３２２）を１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁し、それを６穴プレートに２．０×１０^４個ずつ細胞を播種した。当該細胞が付着した後に、２−アミノフェノキサジン−３−オンを０．５μＭ、１μＭ、２μＭの濃度になるように、２−アミノフェノールを１μＭ、２μＭ、４μＭの濃度になるように、また、陽性対照としてのコウジ酸を０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭの濃度になるように添加し、常法にしたがって、５％ＣＯ_２雰囲気中で３７℃で５日培養した。また、対照として、試料を添加しないものを用意した。培養後、細胞を回収し、それぞれの生細胞数をカウントした後、リン酸緩衝液で洗浄し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で溶解し、３０分間煮沸し、常法にしたがい、市販のプレートリーダーにより、波長４５０ｎｍの吸光度を測定し、あらかじめメラニン標準品（シグマ社販売）により同一の波長の吸光度を測定して作成した検量線により、試料中のメラニン量を算出した。一方、タンパク質量は常法のブラッドフォード法により測定し、蛋白質１ｍｇ当りのメラニン量を算出し、さらに、数式４にしたがって、メラニン量（％）を算出した。また、数式５にしたがって、生細胞数（％）を算出した。結果を表４に示す。

数式４：

数式５：

表４の結果に示されるとおり、どの試料も高濃度ではＢ１６細胞の増殖を阻害することから、増殖を阻害しない濃度で比較すると、２−アミノフェノキサジン−３−オン又は２−アミノフェノールは、コウジ酸に比べて１，０００倍強いメラニン合成阻害作用を有していた。

＜実験６：他の成分との併用効果＞
実験５と同様の方法で、２−アミノフェノキサジン−３−オンと、コウジ酸、トレハロース又はアスコルビン酸グルコシドとの併用効果を調べた。マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−６３２２）を１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁し、それを６穴プレートに２．０×１０^４個ずつ細胞を播種した。当該細胞が付着した後に、下記表５に記載のとおり、実験１で合成した２−アミノフェノキサジン−３−オン、コウジ酸、トレハロース（商品名『トレハ』、株式会社林原商事販売）、アスコルビン酸−２−グルコシド（商品名『ＡＡ２Ｇ』、株式会社林原生物化学研究所販売）を添加し、常法にしたがって、５％ＣＯ_２雰囲気中で３７℃で５日培養した。また、対照として、試料を添加しないものを用意した。培養後、細胞を回収し、リン酸緩衝液で洗浄し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で溶解し、３０分間煮沸し、常法にしたがい、市販のプレートリーダーにより、波長４５０ｎｍの吸光度を測定し、あらかじめメラニン標準品（シグマ社販売）により同一の波長の吸光度を測定して作成した検量線により、試料中のメラニン量を算出した。一方、タンパク質量は常法のブラッドフォード法により測定し、蛋白質１ｍｇ当りのメラニン量を算出し、さらに、上記数式４にしたがって、メラニン量（％）を算出した。結果を表５に示す。

表５の結果が示すとおり、コウジ酸、トレハロース、アスコルビン酸−２−グルコシドは単独でもメラニン合成阻害作用を有するところ、これらを３−アミノフェノキサジン−２−オンと併用することにより、相乗的なメラニン合成阻害効果を発揮した。また、これらの物質を併用した場合、細胞毒性が軽減され、生細胞率を高く維持したまま、メラニン合成阻害効果が発揮された。

＜実験７：パネルテスト（皮膚外用剤）＞
本発明の皮膚外用剤の抗炎症作用とメラニン合成阻害効果がすでに日焼けした皮膚に対して発揮するかどうかパネルテストで調べた。パネラー２０名の腕に日光が照射されないように約１０ｃｍ^２の遮光粘着テープを添付し、半日海水浴をした後、その遮光粘着テープを剥がし、この皮膚部分を日焼け前の状態とした。２−アミノフェノキサジン−３−オン（試料Ａ）又は２−アミノフェノール（試料Ｂ）が配合されている後記実施例１の乳液又は対照として後記実施例１において２−アミノフェノキサジン−３−オン又は２−アミノフェノールが配合されていない乳液を日光が照射された腕の皮膚にそれぞれ、適当量を１日２回塗布してもらった。医師により、３日後に皮膚の炎症状態（痛み、腫れの有無）、７日後にメラニン沈着状態（皮膚の黒色度）を肉眼観察し、『効果あり』（日焼け前の状態に回復）、『やや効果あり』（日焼け前の状態までには回復していないものの、対照の乳液よりは効果に優れる）、『効果なし』（対照の乳液と同程度）、『悪化した』（対照の乳液よりも悪化した）の４段階評価で評価した。結果を表６に示す。

表６の結果が示すとおり、『効果あり』又は『やや効果あり』と判定したパネラーが、試料Ａ（２−アミノフェノキサジン−３−オン）のメラニン合成抑制効果で７０％、炎症抑制効果で８５乃至９０％を占めており、試料Ｂ（２−アミノフェノール）のメラニン合成抑制効果で６５％、炎症抑制効果で７５乃至８０％を占めていた。この結果は、２−アミノフェノキサジン−３−オン又は２−アミノフェノールを含有する皮膚外用剤は、メラニン合成抑制作用及び抗炎症作用に優れることを示している。

＜実験８：歯肉炎に対する治療効果＞
本発明の抗炎症剤が歯肉炎に対して治療効果を発揮するかどうかパネルテストで調べた。毎食後の歯磨きだけでは症状が改善しない歯肉炎患者１８名を３群に分け、毎食後の歯磨きの後に、２−アミノフェノキサジン−３−オン（試料Ａ）又は２−アミノフェノール（試料Ｂ）が配合されている後記実施例４の液剤１０ｍｌで１分間口中を漱いでもらった。また、対照として、２−アミノフェノキサジン−３−オン又は２−アミノフェノールを含まない液剤で同様に行った。２週間後に、医師の目視により、歯肉炎の状況を診断し、『効果あり』（歯肉炎がない状態に回復）、『やや効果あり』（試験前より歯肉炎が緩和された）、『効果なし』（試験前と比べて変化なし）、『悪化した』（試験前よりも悪化した）の４段階評価で評価した。結果を表７に示す。

表７に示す結果から明らかなように、試料Ａ及び試料Ｂを用いた患者の歯肉炎の症状は軽減されたことから、２−アミノフェノキサジン−３−オン又は２−アミノフェノールは、歯肉炎の治療剤として有効であることが確認された。

＜実験９：胃炎に対する治療効果＞
本発明の抗炎症剤が胃炎に対して治療効果を発揮するかどうかパネルテストで調べた。胃炎患者１２名を３群に分け、２−アミノフェノキサジン−３−オン（試料Ａ）又は２−アミノフェノール（試料Ｂ）が配合されている後記実施例５の錠剤を毎夕食後に服用してもらった。また、対照として、２−アミノフェノキサジン−３−オン又は２−アミノフェノールを含まない錠剤で同様に行った。１週間後に、医師により、胃炎の状況を問診により診断し、『効果あり』（胃炎がない状態に回復）、『やや効果あり』（試験前より胃炎が緩和された）、『効果なし』（試験前と比べて変化なし）、『悪化した』（試験前よりも悪化した）の４段階評価で評価した。結果を表８に示す。

表８に示す結果から明らかなように、試料Ａ及び試料Ｂは胃炎の治療効果を発揮した。実験７及び８の結果は、２−アミノフェノキサジン−３−オン及び２−アミノフェノールが歯肉炎や胃炎などの炎症性疾患の治療剤として有効であることを示している。

＜実験１０：コラーゲン産生増強作用＞
アスコルビン酸存在下における２−アミノフェノキサジン−３−オンのコラーゲン産生増強作用をヒト胎児由来正常繊維芽細胞ＮＨＤＦを使用して調べた。また、２−アミノフェノキサジン−３−オン単独でコラーゲン産生増強作用があるかどうかを併せて調べた。さらに、２−アミノフェノキサジン−３−オンにＮＨＤＦ細胞に対する細胞障害性がないことを調べた。
＜試験試料＞
４ｍＭ ２−アミノフェノキサジン−３−オン（ＤＭＳＯに溶解）を、１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを補足したダルベッコのＭＥＭ培地（日水製薬社販売、以下、「Ｄ−ＭＥＭ」と略記す。）で希釈して、細胞培養に供した時の培地中の濃度が、表９に示す濃度になるように試験試料を調製した。
＜コラーゲン産生量の測定方法＞
ＮＨＤＦ細胞（クラボウ社販売、カタログ番号「ＫＦ−４００１」）を、１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを補足したＤ−ＭＥＭに懸濁して５×１０^５細胞／ｍｌに調製し、９６穴マイクロプレートに５０μｌ／穴ずつ播種した。アスコルビン酸として、培地中での安定性がアスコルビン酸よりも高いＬ−アスコルビン酸−２−グルコシド（株式会社林原商事販売、商品名『アスコフレッシュ』、以下、「ＡＡ−２Ｇ」と略記する）を使用した。３７℃で１日培養後、培養上清を除去し、試験試料の何れかと、１００μＭ ＡＡ−２Ｇ（終濃度５０μＭ）を含有する１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを補足したＤ−ＭＥＭ培地、又は、ＡＡ−２Ｇを含まない１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを補足したＤ−ＭＥＭ培地とを、各々１００μｌ／穴ずつ添加し、３７℃、５（ｖ／ｖ）％炭酸ガス存在下で３日培養後、培養上清を除去し、最初に添加したものと同じ濃度の被験試料と、１００μＭ ＡＡ−２Ｇを含む又はＡＡ−２Ｇを含まないＤ−ＭＥＭ培地とを、新たに調製して、各々１００μｌ／穴ずつ添加し、３７℃、５（ｖ／ｖ）％炭酸ガス存在下でさらに３日間培養した。対照として、１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを補足したＤ−ＭＥＭ培地又はＡＡ−２Ｇを含む１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを補足したＤ−ＭＥＭ培地のみを添加して、試験試料を添加した場合と同様に培養を行った。なお、全ての細胞培養液は、２−アミノフェノキサジン−３−オンの溶解に使用したＤＭＳＯの濃度が、一定（終濃度０．０５（ｖ／ｖ）％）になるように調整した。これらの細胞の培養上清を除去後、１ ｍｇ／ｍｌペプシン（Ｓｉｇｍａ社販売）を含む１Ｍ 酢酸溶液を５０μＬ／穴ずつ添加し、プレートミキサーを使用して、室温で４時間振とうしてペプシンによる消化をおこなった。このペプシン消化物をピペッティングしながら１．５ｍｌ容チューブに回収し、Ｓｉｒｃｏｌ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社販売）のＤｙｅ Ｒｅａｇｎｔを２００μｌ／チューブ添加後、室温で３０分間転倒混和して反応させ、反応液を遠心後（４℃、１５，０００ ｒｐｍ， １０分）、上清を完全除去して、沈澱物に５０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを加えて溶解後、Ａ５６０−６５０の吸光度を測定した。これとは別に、９６穴マイクロウエルプレートに、５μｇ／穴乃至０．０３９５μｇ／穴になるように、２倍段階希釈したコラーゲン（ＫＯＫＥＮ社販売）を添加し、ペプシン処理し、培養上清を除去した細胞と同様に、その消化物を処理し、Ａ５６０−６５０の吸光度を測定して標準曲線を作製した。この標準曲線に基づき、細胞のペプシン消化物に含まれるコラーゲン量を算出して、その結果を表９に示す。なお、実験は１試験試料の濃度につき３穴を使用して行い、結果はその平均値で示した。また、表９における「ＱＡ」は２−アミノフェノキサジン−３−オン（クエスチオマイシンＡ）を意味する。
＜細胞障害性試験＞
上記コラーゲン測定と同様に試験試料と、ＡＡ−２Ｇ含有又は無含有の１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを補足したＤ−ＭＥＭ培地で６日間培養した細胞の培養上清を除去後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））で洗浄し、Ｄ−ＭＥＭ培地で１０倍に希釈したアラマーブルー（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ、ＴＲＥＫ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ社販売）液を２００μｌ／穴添加し、３７℃で９０分培養後、蛍光強度（励起光：５４４ｎｍ、蛍光：５９０ｎｍ）を測定した。細胞生存率（％）は、試験試料を添加した穴の蛍光強度を、対照を添加した穴の蛍光強度で除し、１００倍して求めた。その結果を表９に併せて示す。

表９の結果から明らかなよう、培地に２−アミノフェノキサジン−３−オンとＡＡ−２Ｇを加えて培養した場合には、０．１２５或いは０．２５μＭとなるように２−アミノフェノキサジン−３−オンの添加量に比例してコラーゲン産生が増加し、０．５と０．２５μＭとなるように添加した場合にはほぼ同量のコラーゲン産生が認められた。また、１μＭ以上となるように添加した場合には、０．５又は０．２５μＭとなるように添加した場合に比べて、コラーゲンの産生量が減少した。これに対して、ＡＡ−２Ｇ無添加の場合には、コラーゲン産生の増強は認められなかった。また、２−アミノフェノキサジン−３−オンの濃度が０．５μＭ以下の場合には、細胞生存率はいずれも９２％以上となって、対照と最大８％程度の差しかなく、細胞障害性はないと判断した、これに対して１μＭ以上の濃度では、濃度に依存した細胞障害性が認められた。したがって、２−アミノフェノキサジン−３−オンが１μＭ以上の濃度では、ＮＨＤＦ細胞に対する細胞障害性によりコラーゲン産生増強作用の低下が発生したと思われる。

この結果は、２−アミノフェノールや２−アミノフェノキサジン−３−オンなどの２−アミノフェノール誘導体は、アスコルビン酸の存在下において、０．１２５μＭ以上の濃度でコラーゲン産生を増強し、その効果は、０．２５μＭ以上の濃度で顕著になることを物語っている。また、２−アミノフェノールや２−アミノフェノキサジン−３−オンなどのその誘導体を含有する皮膚外用剤は、コラーゲン産生増強作用に優れ、抗炎症や美白用のみでなく、抗シワ用やアンチエイジング用としても有用なことを物語っている。

以下、実施例で本発明の実施の形態を説明する。

＜乳液＞
Ａ アクリル酸メタクリル酸アルキル共重合体 ０．２質量％
キサンタンガム ０．２質量％
精製水 ７３．０質量％
Ｂ グリセリン ３．０質量％
エタノール １７．０質量％
水酸化ナトリウム ０．０５質量％
精製水 ２．５質量％
アスコルビン酸リン酸マグネシウム ３．０質量％
エデト酸ニナトリウム ０．０５質量％
実験１で製造した２−アミノフェノキサジン−３−オンまたは２−アミノフェノール（和光純薬工業株式会社販売）
１．０質量％
常法にしたがい、Ａ成分を均一に加熱混合した後、冷却し、Ｂ成分を加えて皮膚外用剤を得た。
本品は、抗炎症効果に優れ、好塩基球やマストセルの脱顆粒反応を抑制する作用を有しているのでアトピー症の治療にも有効である。また、本品は、メラニンの合成を阻害し、コラーゲン産生を臓器用することから、皮膚に適用することにより、日焼けによる肌の炎症や、くすみ、シミ、ソバカス、シワ、小ジワの発生を抑制することから、透明感のある美しい肌にする乳液である。

＜パック化粧料＞
Ａ ポリビニルアルコール １６．０質量％
無水ケイ酸 ０．５質量％
ポリエチレングリコール ０．５質量％
ポリオキシプロピレンメチルグルコシド ５．０質量％
グリセリン ５．０質量％
精製水 ６０．９４質量％
Ｂ エチルアルコール １０．０質量％
防腐剤 ０．０１質量％
Ｃ エデト酸ニナトリウム ０．０５質量％
実験１で製造した２−アミノフェノキサジン−３−オンまたは２−アミノフェノール（和光純薬工業株式会社販売） １．０質量％
精製水 １．０質量％

成分Ａを混合し、７０℃に加熱して溶解し、成分Ｂを混合し溶解した。冷却した後、成分Ｃを均一に分散し、パック化粧料を得た。
本品は、抗炎症効果に優れ、好塩基球やマストセルの脱顆粒反応を抑制する作用を有しているのでアトピー症の治療にも有効である。また、本品は、メラニンの合成を阻害し、コラーゲン産生を増強することから、皮膚に適用することにより、日焼けによる肌の炎症や、くすみ、シミ、ソバカス、シワ、小ジワの発生を抑制することから、透明感のある美しい肌にするパック化粧料である。

＜歯磨＞
以下の処方で歯磨を製造した。
不溶性メタリン酸ナトリウム ２６．０質量％
グリセリン ２５．０質量％
第２リン酸カルシウム １５．０質量％
ラウリル硫酸ナトリウム １．５質量％
トラガントガム １．４質量％
香料 １．０質量％
実験１で製造した２−アミノフェノキサジン−３−オンまたは２−アミノフェノール（和光純薬工業株式会社販売） ０．１質量％
サッカリン ０．１質量％
銅クロロフィリンナトリウム １．０質量％
水 ２８．９質量％
本品は、抗炎症効果に優れ、コラーゲン産生増強作用を有していることから、歯肉炎を軽減し、歯周病、歯槽膿漏の治療又は予防に適している。

＜液剤＞
安定剤として１％（ｗ／ｗ）トレハロースを含む生理食塩水に、２−アミノフェノキサジン−３−オンを１μｇ／ｍｌになるように、又は、２−アミノフェノールを０．１μｇ／ｍｌになるように溶解し、常法にしたがって精密濾過して滅菌して液剤を得た。
本品は、ＣＯＸ阻害活性、一酸化窒素合成阻害活性及び脱顆粒抑制活性を有していることから、内服液、注射液、うがい薬として、リウマチ、歯周病、骨粗鬆症、胃炎、アトピー症を含むアレルギーなどの各種炎症性疾患、癌やアルツハイマー病の治療又は予防剤、鎮痛剤、解熱剤などに利用できる。

＜錠剤＞
無水結晶性α−マルトース粉末（商品名『ファイントース』、株式会社林原商事販売）に２−アミノフェノキサジン−３−オン又は２−アミノフェノールを均一に混合し、常法によって打錠して、一錠２００ｍｇ当り、２−アミノフェノキサジン−３−オン又を１μｇ、２−アミノフェノールを０．１μｇ含む錠剤を得た。
本品は、ＣＯＸ阻害活性、一酸化窒素合成阻害活性及び脱顆粒抑制活性を有していることから、経口投与により、リウマチ、歯周病、骨粗鬆症、胃炎、アトピー症を含むアレルギーなどの各種炎症性疾患、癌、アルツハイマー病の治療又は予防剤、鎮痛剤や解熱剤として利用できる。

叙述のとおり、２−アミノフェノール又はその誘導体は、ＮＯ合成阻害作用、ＰＧＥ２合成阻害作用及び脱顆粒反応抑制作用を有していることから、抗炎症剤、抗アレルギー剤などとして有用である。また、メラニン合成を阻害すること及びコラーゲン産生増強作用を有するから、美白、抗シワ、アンチエイジングなどを目的とした皮膚外用剤としても有用である。

Claims (1)

1. ２−アミノフェノール又は一般式１で表される２−アミノフェノール誘導体を有効成分として含有する美白用皮膚外用剤。
   一般式１：
   

   

   （ただし、Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、水素原子（Ｈ）、ヒドロキシ基（ＯＨ）、アセチル基（ＣＯＣＨ_３）、ヒドロキシアセチル基（ＣＯＣＨ_２ＯＨ）から選ばれ、Ｒ_３乃至Ｒ_５は、それぞれ独立して、水素原子（Ｈ）、ヒドロキシ基（ＯＨ）、メトキシ基（ＯＣＨ _３ ）から選ばれる。）