JP4748926B2 - 皮膚化粧料及び飲食品 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物抽出物を有効成分とする抗酸化剤、抗炎症剤及び脂肪分解促進剤、並びに植物抽出物を配合した皮膚化粧料及び飲食品に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、特に生体成分を酸化させる要因として、活性酸素が注目されており、その生体への悪影響が問題となっている。
活性酸素の過剰な生成は、生体内の膜や組織を構成する生体内分子を攻撃し、各種疾患を誘発する。例えば、活性酸素は、コラーゲン等の生体組織を分解、変性又は架橋したり、油脂類を酸化して細胞に障害を与える過酸化脂質を生成したりすると考えられており、活性酸素によって引き起こされるこれらの障害が、シワ形成や弾力性低下といった皮膚の老化の原因になるものと考えられている。
【０００３】
活性酸素種の中でもヒドロキシルラジカルは最も反応性が高く、タンパク質やＤＮＡを切断し、脂質の過酸化を惹起することが知られ、生体内ではフェントン反応により、過酸化水素と金属イオンとの反応により生成する。したがって、活性酸素種の生成を抑制し、皮膚の老化症状を防止又は改善するには、皮膚における過酸化水素を消去することが有効であると考えられる。生体内で過酸化水素を優先的に消去することが知られているカタラーゼは、ヒト線維芽細胞内では加齢や紫外線曝露により、あるいは、ある種の先天性疾患により減少又は失活することが報告されていることから、このカタラーゼの産生を促進することにより皮膚の老化や皮膚疾患の予防・治療に有効であると考えられる。カタラーゼ産生促進作用又はカタラーゼ活性化作用を有する生薬としては、例えば、アマニン抽出物（特許文献１参照）、ナス抽出物、セイヨウニワトコ抽出物、ショウガ抽出物、オクラ抽出物（以上、特許文献２参照）が報告されている。
【０００４】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）は、腫瘍を壊死させる因子として見いだされたが、最近では腫瘍に対してだけでなく、正常細胞の機能を調節するメディエーター的な役割を担うサイトカインであると言われている。腫瘍壊死因子は炎症の初発から終息までの過程において重要な役割を担っているが、その持続的かつ過剰な産生は、組織障害を引き起こしたり、全身的には発熱やカケクシアの原因となり、炎症の悪化を引き起こしたりする。関節リューマチ、変形性関節症といった慢性炎症性疾患が代表的な例である。したがって、炎症性疾患においては腫瘍壊死因子の過剰な産生を抑制することが重要となる。過剰に産生された腫瘍壊死因子の産生抑制作用を有する生薬としては、例えば、シソ抽出液（非特許文献１参照）、ヒガンバナ科アルカロイドのリコリンとリコリシジノール（非特許文献２参照）が報告されている。
【０００５】
炎症性疾患の原因の一つとして血小板凝集によるものが知られている。血小板が凝集して活性化することにより、生理的には止血、病理的には血栓形成を生じる他、血小板の凝集は、動脈硬化の進展、ガン転移、炎症等に関与していると考えられている。このため、血小板の凝集を阻害・抑制する物質により炎症性疾患に対処する試みがなされている。血小板凝集抑制作用を有する生薬としては、例えば、カナリウム属植物の抽出物（特許文献３参照）、コウサンフウ抽出物（特許文献４参照）、藤茶抽出物（特許文献５参照）が報告されている。
【０００６】
体内の脂肪は、消費エネルギーに対して摂取エネルギーが過剰である場合、その過剰分が白色脂肪細胞の中性脂肪として蓄積されるものである。体脂肪の蓄積によって生じる肥満は美容上好ましくないばかりでなく、動脈硬化、糖尿病等の様々な疾病を引き起こす。昨今は飽食の時代であり、過食、運動不足、ストレス等による肥満が増加し、特に女性は外見上からもスリムな引き締まった体を切望する傾向にある。したがって、皮下脂肪等の蓄積は、健康上も好ましくなく、皮下脂肪等の減少又は蓄積の防止が重要な問題となっている。脂肪分解促進作用を有する生薬としては、例えば、ハトムギ抽出物、大麦抽出物、決明子抽出物、蕃石榴抽出物、プアール茶抽出物（以上、特許文献６参照）、ケイヒ抽出物、ジュ抽出物、茶抽出物、サルビア抽出物、ビワ抽出物（以上、特許文献７参照）が報告されている。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００１−１２２７３３号公報
【特許文献２】
特開２００１−１３９４２０号公報
【特許文献３】
特開２００２−５３４７８号公報
【特許文献４】
特開２００２−５３４７７号公報
【特許文献５】
特開２００１−９７８７３号公報
【特許文献６】
特開２００２−２７５０７８号公報
【特許文献７】
特開平１０−１５８１８１号公報
【非特許文献１】
「炎症」, Vol.13, No.4, p.337-340, 1993年発行
【非特許文献２】
「薬学雑誌」, Vol.121, No.2, p.167-171, 2001年発行
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、天然物の中から、腫瘍壊死因子産生抑制作用を通じて抗炎症作用を発揮する物質を見いだし、その物質を有効成分とした腫瘍壊死因子の過剰産生に起因する炎症性疾患の予防・治療剤（関節リウマチの予防・治療用途を除く）を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明の腫瘍壊死因子の過剰産生に起因する炎症性疾患の予防・治療剤（関節リウマチの予防・治療用途を除く）は、エンドウの若芽からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。本発明の炎症性疾患の予防・治療剤において、前記抽出物が腫瘍壊死因子産生抑制作用を有することが好ましい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において、「抽出物」には、抽出処理によって抽出原料から得られる抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１５】
抽出原料としては、エンドウ（Pisum sativum L.）の若芽を使用する。エンドウの若芽としては、エンドウの草丈が３０ｃｍ位になったときに先端１０ｃｍ位を摘み取ったものを使用することが好ましい。エンドウの蔓先１０ｃｍ位の若芽を摘み取ったものを特にトウミョウ（豆苗）といい、中国では古くから高級野菜として食されている。エンドウの若芽（トウミョウ）は、中国ではガン予防、貧血予防等を有する野菜として食されているが、抗酸化作用、抗炎症作用及び脂肪分解促進作用を有することはこれまで知られていなかった。
【００１６】
エンドウの若芽からの抽出物の組成は不明であるが、植物の抽出に一般に使用される抽出方法によって、エンドウの若芽から、抗酸化作用、抗炎症作用又は脂肪分解促進作用を有する抽出物を得ることができる。抽出原料は、例えば、乾燥後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供される。この際、抽出原料の乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、エンドウの若芽は、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１７】
抽出溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することができる。
抽出溶媒として使用できる水には、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用できる水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１８】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００１９】
水と親水性有機溶媒との混合液を抽出溶媒として使用する場合、低級アルコールの場合には水１０質量部に対して１〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合には水１０質量部に対して１〜４０質量部、多価アルコールの場合には水１０質量部に対して１０〜９０質量部添加することが好ましい。
【００２０】
抽出にあたり特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温又は還流加熱下で、任意の装置を使用することができる。具体的には、抽出溶媒を満たした処理槽に抽出原料を投入し、必要に応じて時々攪拌しながら、３０分から２時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物を得ることができる。抽出溶媒量は通常、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）であり、抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９５℃で１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０〜８０℃で３０分〜４時間程度である。
【００２１】
得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００２２】
得られた抽出液は、そのままでも抗酸化剤、抗炎症剤又は脂肪分解促進剤として使用することができるが、濃縮、乾燥又は製剤化したものの方が利用しやすい。抽出物の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合、保存や取扱いを容易にするために、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容され得るキャリアーその他任意の助剤を添加することができ、抽出物を粉末状、果粒状、錠剤状等、任意の剤形に製剤化することができる。
【００２３】
エンドウの若芽からの抽出物は特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱臭、脱色を目的とする精製を行うことも可能であるが、化粧料や飲食品等に添加する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。脱臭、脱色等を目的とする精製は、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができる。
【００２４】
以上のようにして得られるエンドウの若芽からの抽出物は、抗酸化作用、抗炎症作用又は脂肪分解促進作用を有しており、それぞれの作用を利用し、抗酸化剤、抗炎症剤又は脂肪分解促進剤の有効成分として使用することができる。
【００２５】
エンドウの若芽からの抽出物の抗酸化作用は、カタラーゼ合成促進作用に基づいて発揮される。但し、エンドウの若芽からの抽出物の抗酸化作用は、カタラーゼ合成促進作用に基づいて発揮される抗酸化作用に限定されるわけではない。エンドウの若芽からの抽出物は、カタラーゼ合成促進作用を有しているので、カタラーゼ合成促進剤の有効成分として利用することもできる。
【００２６】
エンドウの若芽からの抽出物の抗炎症作用は、腫瘍壊死因子産生抑制作用及び／又は血小板凝集抑制作用に基づいて発揮される。但し、エンドウの若芽からの抽出物の抗炎症作用は、上記作用に基づいて発揮される抗炎症作用に限定されるわけではない。エンドウの若芽からの抽出物は、腫瘍壊死因子産生抑制作用又は血小板凝集抑制作用を有しているので、腫瘍壊死因子産生抑制剤及び血小板凝集抑制剤の有効成分として利用することもできる。
【００２７】
本発明の抗酸化剤は、カタラーゼ合成促進作用を通じて活性酸素や生体内ラジカルを消去し、肌荒れ、皮膚の老化及びこれらに伴って生じる各種皮膚疾患を予防及び／又は改善することができる。また、本発明の抗炎症剤は、腫瘍壊死因子産生抑制作用及び／又は血小板凝集抑制作用を通じて、炎症性疾患を予防及び／又は治療することができる。また、本発明の脂肪分解促進剤は、脂肪分解促進作用を通じて、肥満を抑制・防止することができるとともに、肥満体質を改善することができる。
【００２８】
エンドウの若芽からの抽出物は、抗酸化作用、抗炎症作用又は脂肪分解促進作用を有しており、皮膚の老化防止・改善、炎症性疾患の予防・治療、肥満の抑制・防止、肥満体質の改善等に有用であると共に、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れているため、皮膚化粧料に配合するのに好適である。皮膚化粧料には、本発明の抗酸化剤、抗炎症剤又は脂肪分解促進剤のいずれか１種を配合してもよいし、２種以上を組み合わせて配合してもよい。
【００２９】
エンドウの若芽からの抽出物を配合し得る皮膚化粧料は特に限定されないが、その具体例としては、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、入浴剤等が挙げられる。
皮膚化粧料におけるエンドウの若芽からの抽出物の配合量は、皮膚化粧料の種類や抽出物の生理活性等によって適宜調整することができるが、好適な配合率は標準的な抽出物に換算して約０．００５〜１０重量％である。
【００３０】
皮膚化粧料には、エンドウの若芽からの抽出物の抗酸化剤、抗炎症剤又は脂肪分解促進剤の妨げにならない限り、その皮膚化粧料の製造に通常使用される各種主剤及び助剤、その他任意の助剤を使用することができる。皮膚の老化防止・改善、炎症性疾患の予防・治療、肥満の抑制・防止、肥満体質の改善等に関する皮膚化粧料の主剤は、エンドウの若芽からの抽出物のみに限られるわけではない。
【００３１】
エンドウの若芽からの抽出物と共に皮膚化粧料構成成分として利用可能なものとしては、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素消去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料等が挙げられる。なお、エンドウの若芽からの抽出物とともに上記成分を併用した場合、エンドウの若芽からの抽出物と併用された上記成分との間の相乗作用が、通常期待される以上の優れた使用効果をもたらすことがある。
【００３２】
エンドウの若芽からの抽出物は任意の飲食品や栄養補助食品に配合するのに好適である。その場合の配合量は、添加対象飲食品の一般的な摂取量を考慮して成人１日当たりの抽出物摂取量が約１〜１０００ｍｇになるようにするのが適当である。
【００３３】
エンドウの若芽からの抽出物を配合し得る飲食品は特に限定されないが、その具体例としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物などが挙げられる。
【００３４】
以上説明した本発明の抗酸化剤、抗炎症剤、脂肪分解促進剤、皮膚化粧料並びに飲食品は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【００３５】
【実施例】
以下、製造例、試験例及び配合例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらに何ら限定されるものではない。
【００３６】
〔製造例１〕
エンドウ（Pisum sativum L.）の若芽の乾燥物を細切りしたもの５０ｇに水、５０％エタノール（水とエタノールとの重量比１：１）、又はエタノール５００ｍＬを加え、還流抽出器で８０℃、２時間加熱抽出し、熱時濾過した。残渣についてさらに同様の抽出処理を行った。得られた抽出液を合わせて減圧下に濃縮し、さらに乾燥して抽出物を得た。抽出物の収率は表１のとおりであった。
【００３７】
【００３８】
〔試験例１〕カタラーゼ産生促進作用の試験
製造例１による植物抽出物について、下記の試験法によりカタラーゼ産生促進作用を試験した。
ヒト正常新生児線維芽細胞（NB1RGB）１×１０６個を８０ｃｍ2フラスコを用いて１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培地（ｐＨ７.２）で３７℃、５％ＣＯ２ −９５％airの下にて５日間培養した。トリプシン処理により細胞を集め、５％ＦＢＳを含むα−MEM培地を用いて１ウェル当たり８×１０4個となるように４８穴マイクロプレートに２００μLづつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％airの下で一晩培養した。翌日、試料（試料濃度：１００ｐｐｍ（μｇ／ｍＬ））を溶解した１％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培地を各ウェルに２００μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％airの下で１日間培養した。
【００３９】
細胞内のカタラーゼ量をEnzyme-linked immunosorbent assay（ＥＬＩＳＡ）により測定した。同時に線維芽細胞内の総タンパク量を定量し、総タンパク量当たりのカタラーゼ量を算出して、試料無添加（コントロール）の総タンパク質当たりのカタラーゼ量を１００としたカタラーゼ産生インデックス（％）を求めた。
結果を表２に示す。
【００４０】
【００４１】
〔試験例２〕腫瘍壊死因子産生抑制作用の試験
製造例１による植物抽出物について、下記の試験法により腫瘍壊死因子産生抑制作用を試験した。
マウスマクロファージ細胞（RAW264.7細胞；大日本製薬製）を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したDulbecco's ＭＥＭ（日水製薬製）培地にて前培養後、セルスクレーパーより細胞を集め、１ウェル当たり３×１０５cells／１００μＬの密度で９６穴マイクプレートに細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間前培養した。その後、９６穴プレート中の培地を捨て、予め２％ ＤＭＳＯを含む培養液で溶解した試験試料を１００μＬ添加した後、リポポリサッカライド(ＬＰＳ、最終濃度１μｇ／ｍＬ、E.coli 0111;B4、DIFCO 社)を１００μＬ添加し、細胞を刺激した。その後、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間の培養により産生した腫瘍壊死因子の産生量を下記サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
【００４２】
一次抗体であるラット抗マウス腫瘍壊死因子モノクローナル抗体（Endogen社）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（pＨ９.６）で２．５μｇ／ｍＬとなるように溶解し、９６ウェルマイクロプレートに１００μＬ加え、一夜、４℃でコーティングした。次いで、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液）で各ウェルを洗浄後、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液でブロッキングを行った。洗浄液で各ウェルを洗浄後、試験培地で培養上清を希釈し、その１００μＬを各ウェルに加え、３７℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、二次抗体として０．３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液で２．５μｇ／ｍＬとなるように溶解したウサギ抗マウス腫瘍壊死因子ポリクローナル抗体（Endogen社）を１００μＬ加え、３７℃で６０分間インキュベートしてから洗浄した。次いで、５００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（CHEMICON社）を１００μＬ加え、３７℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、発色用緩衝液（２０ｍＭ硫酸マグネシウム含有トリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０）１００ｍＬにｐ-ニトロフェニルリン酸５０ｍｇを溶解してなる基質溶液１５０μＬをウェルに添加し、３７℃で２０〜３０分間酵素反応を行って発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定し、リコビナントマウス腫瘍壊死因子（Endogen社）標準液より作成した標準曲線から、培養上清中の腫瘍壊死因子量（ｐｇ／ｍＬ）を求めた。試験試料の腫瘍壊死因子産生抑制率は以下の式に基づいて算出した。
【００４３】
腫瘍壊死因子産生抑制率（％）＝{(Ｂ−Ａ)／Ｂ}×１００
上記式中、「Ａ」は試料添加時の腫瘍壊死因子量、「Ｂ」は試料無添加時の腫瘍壊死因子量を表す。
腫瘍壊死因子産生抑制率は、試料２００ｐｐｍ(μｇ／ｍＬ)添加時の値を算出した。その結果を表３に示す。
【００４４】
【００４５】
〔試験例３〕血小板凝集抑制試験
日本種白色家兎の血液に７７ｍＭ ＥＤＴＡを血液量の１／１０容量添加し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿物を除いた。上清を２１００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿した血小板を採取した。得られた血小板を血小板洗浄液に浮遊させ、２１００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿した血小板を採取し、血小板数が３０万個／μＬになるように血小板浮遊液に浮遊させた。上述のようにして調製した洗浄血小板浮遊液２２３μＬに塩化カルシウム溶液１μＬを加え、３７℃に１分間インキュベーションした。そこに試料溶液１μＬを加えてさらに２分間インキュベーションした後、１分間攪拌した。次いで凝集惹起剤として１０ｐｐｍコラーゲン溶液２５μＬを添加し、３７℃で１０分間インキュベーションした後、血小板凝集測定装置 ＰＡＭ１２ＣＬ（メバニクス株式会社製）を用いて、凝集率Ａを測定した。別に、試料溶液の代わりに試料溶液の溶媒を添加し、上記と同様に操作し、凝集率Ｂを測定し、次式により血小板擬集抑制率を求めた。
【００４６】
血小板凝集抑制率（％）＝｛（Ｂ−Ａ）／Ｂ｝×１００
上記式中、「Ａ」は凝集惹起剤添加・試料溶液添加時の凝集率、「Ｂ」は凝集惹起剤添加・試料溶液無添加時の凝集率を表す。
試料溶液の濃度を段階的に減少させて上記血小板凝集率を測定し、抑制率が５０％になる試料濃度ＩＣ５０（ｐｐｍ；μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。その結果を表４に示す。
【００４７】
【００４８】
〔試験例４〕脂肪分解促進作用試験
製造例１による植物抽出物について、下記の試験法により脂肪分解促進作用を試験した。
ロッドベルの方法［Rodbell M., J.Biol.Chem., 239, 375(1964)］により、ウィスター系雄性ラット（体重１５０〜２００ｇ）の副睾丸脂肪組織からコラゲナーゼ溶液を用いて遊離脂肪細胞を調製した。遊離脂肪細胞懸濁液９０μＬに、最終試料濃度が４００ｐｐｍとなるよう調製した牛血清アルブミンを含むハンクス緩衝液１０μＬを加え、３７℃にて９０分間反応した。反応後、遊離した脂肪酸をＮＥＦＡ Ｃ−テストワコーで測定した。
脂肪分解促進率は、試料無添加時の値を１００％として算出した。
結果を表５に示す。
【００４９】
【００５０】
〔試験例５〕
製造例１で得られた５０％エタノール抽出物を配合した乳液（以下「実施例乳液」という。）を常法に従って調整した。実施例乳液の組成を以下に示す。
エンドウの若芽５０％エタノール抽出物（製造例１） １．０ｇ
セチルアルコール ０．５ｇ
ミツロウ ２．０ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（10E.0） １．０ｇ
モノステアリン酸グリセリル １．０ｇ
ヒアルロン酸 ０．１ｇ
プロピレングリコール ５．０ｇ
エタノール ３．０ｇ
パラオキシ安息香酸メチル ０．３ｇ
香料 ０．０３ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００５１】
実施例乳液と、エンドウの若芽の抽出物を含まない他は実施例乳液と同じ組成の比較例乳液について、下記の評価試験を行った。
被験者：２２〜４３歳の女性多数の中から、皮溝・皮丘が消え、広範囲の角質がめくれている（表６に示す評点が１）、又は皮溝・皮丘が不鮮明で角質が部分的にめくれている（表６に示す評点が２）、肌荒れと判定されたもの２０名を選抜して被験者とした。
塗布試験：各被験者に、顔の右半分には実施例乳液を、左半分には比較例乳液を、朝夕各１回、３０日間塗布させた。
【００５２】
[判定１：肌荒れ改善効果]
塗布試験終了後、シルフロ（FLEXICL DEVELOPMENTS LTD製）によるレプリカ法を用いて顔のレプリカをとり、５０倍の顕微鏡で皮紋の状態及び角質剥離状態を観察し、表６に示す評価基準で肌の状態を判定した。判定結果を表７に示す。
【００５３】
【００５４】
【００５５】
表７に示されるように、実施例乳液を塗布した領域は、比較例乳液を塗布した領域に比べて顕著に肌荒れ（皮膚の老化）が改善された。
【００５６】
[判定２・官能評価]
使用感と肌への効果について、実施例乳液と比較例乳液とを比較した場合の優劣を被験者全員に質問した。回答の集計結果を表８に示す。
【００５７】
【００５８】
表８に示される結果より、官能評価によっても上記判定１と同様の効果と優れた使用感が確認された。
判定１及び２の結果より、エンドウの若芽の抽出物を配合した皮膚化粧料が皮膚の老化防止・改善作用（肌荒れ改善作用）を有するとともに、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れていることが確認された。
【００５９】
〔試験例６〕
製造例１で得られた５０％エタノール抽出物を配合した化粧水（以下「実施例化粧水」という。）を常法に従って調整した。実施例化粧水の組成を以下に示す。
エンドウの若芽５０％エタノール抽出物（製造例１） １．０ｇ
エタノール ５．０ｇ
プロピレングリコール ５．０ｇ
親水性界面活性剤（ポリオキシエチレンセチルエーテル） ０．５ｇ
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０５ｇ
香料 適量
防腐剤（ヒノキチオール、パラオキシ安息香酸エチル） ０．１ｇ
精製水 残部(全量を１００ｇとする)
【００６０】
実施例化粧水と、エンドウの若芽の抽出物を含まないほかは実施例化粧水と同じ組成の比較例化粧水について、下記の評価試験を行った。
肥満度を示すＢＭＩ［Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ＝体重（ｋｇ）／｛身長（ｍ）×身長（ｍ）｝］が２８±２の１０名（男女各５名）に対し、３週間毎日入浴後に腹部（前、横）、大腿部内側に塗布しマッサージを行った後、表６に示す評価項目で効果があると感じた人数で官能評価した。評価結果を表９に示す。
【００６１】
【００６２】
表９に示されるように、実施例化粧料を塗布した領域は、比較例化粧料を塗布した領域に比べて優れた効果及び使用感が確認された。
【００６３】
〔配合例１〕
下記の組成の乳液を常法により製造した。
エンドウの若芽の抽出物（製造例１） １ｇ
ホホバオイル ４ｇ
オリーブオイル ２ｇ
スクワラン ２ｇ
セタノール ２ｇ
モノステアリン酸グリセリル ２ｇ
ポリオキシエチレンセチルエーテル（20E.0） ２．５ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.0） ２ｇ
黄杞エキス ０．１ｇ
イチョウ葉エキス ０．１ｇ
コンキオリン ０．１ｇ
オウバクエキス ０．１ｇ
カミツレエキス ０．１ｇ
1,3-ブチレングリコール ３ｇ
パラオキシ安息香酸メチル ０．１５ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００６４】
〔配合例２〕
下記組成の化粧水を常法により製造した。
エンドウの若芽の抽出物（製造例１） ２ｇ
グリセリン ３ｇ
1,3-ブチレングリコール ３ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.0） ０．５ｇ
パラオキシ安息香酸メチル ０．１５ｇ
クエン酸 ０．１ｇ
クエン酸ソーダ ０．１ｇ
油溶性甘草エキス ０．１ｇ
海藻エキス ０．１ｇ
キシロビオースミクスチャー ０．５ｇ
クジンエキス ０．１ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００６５】
〔配合例３〕
下記組成のクリームを常法により製造した。
エンドウの若芽の抽出物（製造例１） １ｇ
流動パラフィン ５ｇ
サラシミツロウ ４ｇ
セタノール ３ｇ
スクワラン １０ｇ
ラノリン ２ｇ
ステアリン酸 １ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.0） １．５ｇ
モノステアリン酸グリセリル ３ｇ
1,3-ブチレングリコール ６ｇ
酵母抽出液 ０．１ｇ
シソ抽出液 ０．１ｇ
シナノキ抽出液 ０．１ｇ
ジユ抽出液 ０．１ｇ
パラオキシ安息香酸メチル １．５ｇ
香料 ０．１ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００６６】
〔配合例４〕
下記組成のパックを常法により製造した。
エンドウの若芽抽出物（製造例１） ５ｇ
ポリビニルアルコール １５ｇ
ポリエチレングリコール ３ｇ
プロピレングリコール ７ｇ
エタノール １０ｇ
セージ抽出液 ０．１ｇ
トウキ抽出液 ０．１ｇ
ニンジン抽出液 ０．１ｇ
パラオキシ安息香酸エチル ０．０５ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００６７】
〔配合例５〕
下記の混合物を打錠して,錠剤状栄養補助食品を製造した。
エンドウの若芽の抽出物（製造例１） ５０重量部
粉糖（ショ糖） １７８重量部
ソルビット １０重量部
グリセリン脂肪酸エステル １２重量部
【００６８】
〔配合例６〕
下記の混合物を顆粒状に形成して栄養補助食品を製造した。
エンドウの若芽の抽出物（製造例１） ３４重量部
ビートオリゴ糖 １０００重量部
ビタミンＣ １６７重量部
ステビア抽出物 １０重量部
【００６９】
【発明の効果】
本発明によれば、抗酸化剤、抗炎症剤及び脂肪分解促進剤が提供される。また、本発明によれば、抗酸化作用、抗炎症作用又は脂肪分解促進作用を有する皮膚化粧料及び飲食品が提供される。
【００７０】
本発明の抗酸化剤は、カタラーゼ合成促進作用等を通じて生体成分の酸化を防止し、皮膚のシワ形成や弾力性低下等の老化現象を効果的に予防・改善することができる。また、本発明の抗炎症剤は、腫瘍壊死因子産生抑制作用、血小板凝集抑制作用等を通じて、種々の炎症性疾患、肌荒れ等を効果的に予防・治療することができる。また、本発明の脂肪分解促進剤は、脂肪分解促進作用を通じて全身又は局所の脂肪組織を減少させ、肥満を効果的に抑制することができるとともに、肥満体質を効果的に改善することができる。本発明の抗酸化剤、抗炎症剤及び脂肪分解促進剤は、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れているので皮膚化粧料に配合するのに好適なものである。また、本発明の皮膚化粧料及び飲食品は、皮膚老化の予防・改善、炎症性疾患の予防・治療、肥満の予防・改善、肥満体質の予防・改善に有用である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物抽出物を有効成分とする抗酸化剤、抗炎症剤及び脂肪分解促進剤、並びに植物抽出物を配合した皮膚化粧料及び飲食品に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、特に生体成分を酸化させる要因として、活性酸素が注目されており、その生体への悪影響が問題となっている。
活性酸素の過剰な生成は、生体内の膜や組織を構成する生体内分子を攻撃し、各種疾患を誘発する。例えば、活性酸素は、コラーゲン等の生体組織を分解、変性又は架橋したり、油脂類を酸化して細胞に障害を与える過酸化脂質を生成したりすると考えられており、活性酸素によって引き起こされるこれらの障害が、シワ形成や弾力性低下といった皮膚の老化の原因になるものと考えられている。
【０００３】
活性酸素種の中でもヒドロキシルラジカルは最も反応性が高く、タンパク質やＤＮＡを切断し、脂質の過酸化を惹起することが知られ、生体内ではフェントン反応により、過酸化水素と金属イオンとの反応により生成する。したがって、活性酸素種の生成を抑制し、皮膚の老化症状を防止又は改善するには、皮膚における過酸化水素を消去することが有効であると考えられる。生体内で過酸化水素を優先的に消去することが知られているカタラーゼは、ヒト線維芽細胞内では加齢や紫外線曝露により、あるいは、ある種の先天性疾患により減少又は失活することが報告されていることから、このカタラーゼの産生を促進することにより皮膚の老化や皮膚疾患の予防・治療に有効であると考えられる。カタラーゼ産生促進作用又はカタラーゼ活性化作用を有する生薬としては、例えば、アマニン抽出物（特許文献１参照）、ナス抽出物、セイヨウニワトコ抽出物、ショウガ抽出物、オクラ抽出物（以上、特許文献２参照）が報告されている。
【０００４】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）は、腫瘍を壊死させる因子として見いだされたが、最近では腫瘍に対してだけでなく、正常細胞の機能を調節するメディエーター的な役割を担うサイトカインであると言われている。腫瘍壊死因子は炎症の初発から終息までの過程において重要な役割を担っているが、その持続的かつ過剰な産生は、組織障害を引き起こしたり、全身的には発熱やカケクシアの原因となり、炎症の悪化を引き起こしたりする。関節リューマチ、変形性関節症といった慢性炎症性疾患が代表的な例である。したがって、炎症性疾患においては腫瘍壊死因子の過剰な産生を抑制することが重要となる。過剰に産生された腫瘍壊死因子の産生抑制作用を有する生薬としては、例えば、シソ抽出液（非特許文献１参照）、ヒガンバナ科アルカロイドのリコリンとリコリシジノール（非特許文献２参照）が報告されている。
【０００５】
炎症性疾患の原因の一つとして血小板凝集によるものが知られている。血小板が凝集して活性化することにより、生理的には止血、病理的には血栓形成を生じる他、血小板の凝集は、動脈硬化の進展、ガン転移、炎症等に関与していると考えられている。このため、血小板の凝集を阻害・抑制する物質により炎症性疾患に対処する試みがなされている。血小板凝集抑制作用を有する生薬としては、例えば、カナリウム属植物の抽出物（特許文献３参照）、コウサンフウ抽出物（特許文献４参照）、藤茶抽出物（特許文献５参照）が報告されている。
【０００６】
体内の脂肪は、消費エネルギーに対して摂取エネルギーが過剰である場合、その過剰分が白色脂肪細胞の中性脂肪として蓄積されるものである。体脂肪の蓄積によって生じる肥満は美容上好ましくないばかりでなく、動脈硬化、糖尿病等の様々な疾病を引き起こす。昨今は飽食の時代であり、過食、運動不足、ストレス等による肥満が増加し、特に女性は外見上からもスリムな引き締まった体を切望する傾向にある。したがって、皮下脂肪等の蓄積は、健康上も好ましくなく、皮下脂肪等の減少又は蓄積の防止が重要な問題となっている。脂肪分解促進作用を有する生薬としては、例えば、ハトムギ抽出物、大麦抽出物、決明子抽出物、蕃石榴抽出物、プアール茶抽出物（以上、特許文献６参照）、ケイヒ抽出物、ジュ抽出物、茶抽出物、サルビア抽出物、ビワ抽出物（以上、特許文献７参照）が報告されている。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００１−１２２７３３号公報
【特許文献２】
特開２００１−１３９４２０号公報
【特許文献３】
特開２００２−５３４７８号公報
【特許文献４】
特開２００２−５３４７７号公報
【特許文献５】
特開２００１−９７８７３号公報
【特許文献６】
特開２００２−２７５０７８号公報
【特許文献７】
特開平１０−１５８１８１号公報
【非特許文献１】
「炎症」, Vol.13, No.4, p.337-340, 1993年発行
【非特許文献２】
「薬学雑誌」, Vol.121, No.2, p.167-171, 2001年発行
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、天然物の中から、腫瘍壊死因子産生抑制作用を通じて抗炎症作用を発揮する物質を見いだし、その物質を有効成分とした腫瘍壊死因子の過剰産生に起因する炎症性疾患の予防・治療剤（関節リウマチの予防・治療用途を除く）を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明の腫瘍壊死因子の過剰産生に起因する炎症性疾患の予防・治療剤（関節リウマチの予防・治療用途を除く）は、エンドウの若芽からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。本発明の炎症性疾患の予防・治療剤において、前記抽出物が腫瘍壊死因子産生抑制作用を有することが好ましい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において、「抽出物」には、抽出処理によって抽出原料から得られる抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１５】
抽出原料としては、エンドウ（Pisum sativum L.）の若芽を使用する。エンドウの若芽としては、エンドウの草丈が３０ｃｍ位になったときに先端１０ｃｍ位を摘み取ったものを使用することが好ましい。エンドウの蔓先１０ｃｍ位の若芽を摘み取ったものを特にトウミョウ（豆苗）といい、中国では古くから高級野菜として食されている。エンドウの若芽（トウミョウ）は、中国ではガン予防、貧血予防等を有する野菜として食されているが、抗酸化作用、抗炎症作用及び脂肪分解促進作用を有することはこれまで知られていなかった。
【００１６】
エンドウの若芽からの抽出物の組成は不明であるが、植物の抽出に一般に使用される抽出方法によって、エンドウの若芽から、抗酸化作用、抗炎症作用又は脂肪分解促進作用を有する抽出物を得ることができる。抽出原料は、例えば、乾燥後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供される。この際、抽出原料の乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、エンドウの若芽は、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１７】
抽出溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することができる。
抽出溶媒として使用できる水には、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用できる水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１８】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００１９】
水と親水性有機溶媒との混合液を抽出溶媒として使用する場合、低級アルコールの場合には水１０質量部に対して１〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合には水１０質量部に対して１〜４０質量部、多価アルコールの場合には水１０質量部に対して１０〜９０質量部添加することが好ましい。
【００２０】
抽出にあたり特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温又は還流加熱下で、任意の装置を使用することができる。具体的には、抽出溶媒を満たした処理槽に抽出原料を投入し、必要に応じて時々攪拌しながら、３０分から２時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物を得ることができる。抽出溶媒量は通常、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）であり、抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９５℃で１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０〜８０℃で３０分〜４時間程度である。
【００２１】
得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００２２】
得られた抽出液は、そのままでも抗酸化剤、抗炎症剤又は脂肪分解促進剤として使用することができるが、濃縮、乾燥又は製剤化したものの方が利用しやすい。抽出物の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合、保存や取扱いを容易にするために、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容され得るキャリアーその他任意の助剤を添加することができ、抽出物を粉末状、果粒状、錠剤状等、任意の剤形に製剤化することができる。
【００２３】
エンドウの若芽からの抽出物は特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱臭、脱色を目的とする精製を行うことも可能であるが、化粧料や飲食品等に添加する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。脱臭、脱色等を目的とする精製は、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができる。
【００２４】
以上のようにして得られるエンドウの若芽からの抽出物は、抗酸化作用、抗炎症作用又は脂肪分解促進作用を有しており、それぞれの作用を利用し、抗酸化剤、抗炎症剤又は脂肪分解促進剤の有効成分として使用することができる。
【００２５】
エンドウの若芽からの抽出物の抗酸化作用は、カタラーゼ合成促進作用に基づいて発揮される。但し、エンドウの若芽からの抽出物の抗酸化作用は、カタラーゼ合成促進作用に基づいて発揮される抗酸化作用に限定されるわけではない。エンドウの若芽からの抽出物は、カタラーゼ合成促進作用を有しているので、カタラーゼ合成促進剤の有効成分として利用することもできる。
【００２６】
エンドウの若芽からの抽出物の抗炎症作用は、腫瘍壊死因子産生抑制作用及び／又は血小板凝集抑制作用に基づいて発揮される。但し、エンドウの若芽からの抽出物の抗炎症作用は、上記作用に基づいて発揮される抗炎症作用に限定されるわけではない。エンドウの若芽からの抽出物は、腫瘍壊死因子産生抑制作用又は血小板凝集抑制作用を有しているので、腫瘍壊死因子産生抑制剤及び血小板凝集抑制剤の有効成分として利用することもできる。
【００２７】
本発明の抗酸化剤は、カタラーゼ合成促進作用を通じて活性酸素や生体内ラジカルを消去し、肌荒れ、皮膚の老化及びこれらに伴って生じる各種皮膚疾患を予防及び／又は改善することができる。また、本発明の抗炎症剤は、腫瘍壊死因子産生抑制作用及び／又は血小板凝集抑制作用を通じて、炎症性疾患を予防及び／又は治療することができる。また、本発明の脂肪分解促進剤は、脂肪分解促進作用を通じて、肥満を抑制・防止することができるとともに、肥満体質を改善することができる。
【００２８】
エンドウの若芽からの抽出物は、抗酸化作用、抗炎症作用又は脂肪分解促進作用を有しており、皮膚の老化防止・改善、炎症性疾患の予防・治療、肥満の抑制・防止、肥満体質の改善等に有用であると共に、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れているため、皮膚化粧料に配合するのに好適である。皮膚化粧料には、本発明の抗酸化剤、抗炎症剤又は脂肪分解促進剤のいずれか１種を配合してもよいし、２種以上を組み合わせて配合してもよい。
【００２９】
エンドウの若芽からの抽出物を配合し得る皮膚化粧料は特に限定されないが、その具体例としては、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、入浴剤等が挙げられる。
皮膚化粧料におけるエンドウの若芽からの抽出物の配合量は、皮膚化粧料の種類や抽出物の生理活性等によって適宜調整することができるが、好適な配合率は標準的な抽出物に換算して約０．００５〜１０重量％である。
【００３０】
皮膚化粧料には、エンドウの若芽からの抽出物の抗酸化剤、抗炎症剤又は脂肪分解促進剤の妨げにならない限り、その皮膚化粧料の製造に通常使用される各種主剤及び助剤、その他任意の助剤を使用することができる。皮膚の老化防止・改善、炎症性疾患の予防・治療、肥満の抑制・防止、肥満体質の改善等に関する皮膚化粧料の主剤は、エンドウの若芽からの抽出物のみに限られるわけではない。
【００３１】
エンドウの若芽からの抽出物と共に皮膚化粧料構成成分として利用可能なものとしては、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素消去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料等が挙げられる。なお、エンドウの若芽からの抽出物とともに上記成分を併用した場合、エンドウの若芽からの抽出物と併用された上記成分との間の相乗作用が、通常期待される以上の優れた使用効果をもたらすことがある。
【００３２】
エンドウの若芽からの抽出物は任意の飲食品や栄養補助食品に配合するのに好適である。その場合の配合量は、添加対象飲食品の一般的な摂取量を考慮して成人１日当たりの抽出物摂取量が約１〜１０００ｍｇになるようにするのが適当である。
【００３３】
エンドウの若芽からの抽出物を配合し得る飲食品は特に限定されないが、その具体例としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物などが挙げられる。
【００３４】
以上説明した本発明の抗酸化剤、抗炎症剤、脂肪分解促進剤、皮膚化粧料並びに飲食品は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【００３５】
【実施例】
以下、製造例、試験例及び配合例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらに何ら限定されるものではない。
【００３６】
〔製造例１〕
エンドウ（Pisum sativum L.）の若芽の乾燥物を細切りしたもの５０ｇに水、５０％エタノール（水とエタノールとの重量比１：１）、又はエタノール５００ｍＬを加え、還流抽出器で８０℃、２時間加熱抽出し、熱時濾過した。残渣についてさらに同様の抽出処理を行った。得られた抽出液を合わせて減圧下に濃縮し、さらに乾燥して抽出物を得た。抽出物の収率は表１のとおりであった。
【００３７】
〔試験例１〕カタラーゼ産生促進作用の試験
製造例１による植物抽出物について、下記の試験法によりカタラーゼ産生促進作用を試験した。
ヒト正常新生児線維芽細胞（NB1RGB）１×１０６個を８０ｃｍ2フラスコを用いて１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培地（ｐＨ７.２）で３７℃、５％ＣＯ２ −９５％airの下にて５日間培養した。トリプシン処理により細胞を集め、５％ＦＢＳを含むα−MEM培地を用いて１ウェル当たり８×１０4個となるように４８穴マイクロプレートに２００μLづつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％airの下で一晩培養した。翌日、試料（試料濃度：１００ｐｐｍ（μｇ／ｍＬ））を溶解した１％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培地を各ウェルに２００μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％airの下で１日間培養した。
【００３９】
細胞内のカタラーゼ量をEnzyme-linked immunosorbent assay（ＥＬＩＳＡ）により測定した。同時に線維芽細胞内の総タンパク量を定量し、総タンパク量当たりのカタラーゼ量を算出して、試料無添加（コントロール）の総タンパク質当たりのカタラーゼ量を１００としたカタラーゼ産生インデックス（％）を求めた。
結果を表２に示す。
【００４０】
〔試験例２〕腫瘍壊死因子産生抑制作用の試験
製造例１による植物抽出物について、下記の試験法により腫瘍壊死因子産生抑制作用を試験した。
マウスマクロファージ細胞（RAW264.7細胞；大日本製薬製）を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したDulbecco's ＭＥＭ（日水製薬製）培地にて前培養後、セルスクレーパーより細胞を集め、１ウェル当たり３×１０５cells／１００μＬの密度で９６穴マイクプレートに細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間前培養した。その後、９６穴プレート中の培地を捨て、予め２％ ＤＭＳＯを含む培養液で溶解した試験試料を１００μＬ添加した後、リポポリサッカライド(ＬＰＳ、最終濃度１μｇ／ｍＬ、E.coli 0111;B4、DIFCO 社)を１００μＬ添加し、細胞を刺激した。その後、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間の培養により産生した腫瘍壊死因子の産生量を下記サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
【００４２】
一次抗体であるラット抗マウス腫瘍壊死因子モノクローナル抗体（Endogen社）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（pＨ９.６）で２．５μｇ／ｍＬとなるように溶解し、９６ウェルマイクロプレートに１００μＬ加え、一夜、４℃でコーティングした。次いで、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液）で各ウェルを洗浄後、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液でブロッキングを行った。洗浄液で各ウェルを洗浄後、試験培地で培養上清を希釈し、その１００μＬを各ウェルに加え、３７℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、二次抗体として０．３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液で２．５μｇ／ｍＬとなるように溶解したウサギ抗マウス腫瘍壊死因子ポリクローナル抗体（Endogen社）を１００μＬ加え、３７℃で６０分間インキュベートしてから洗浄した。次いで、５００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（CHEMICON社）を１００μＬ加え、３７℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、発色用緩衝液（２０ｍＭ硫酸マグネシウム含有トリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０）１００ｍＬにｐ-ニトロフェニルリン酸５０ｍｇを溶解してなる基質溶液１５０μＬをウェルに添加し、３７℃で２０〜３０分間酵素反応を行って発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定し、リコビナントマウス腫瘍壊死因子（Endogen社）標準液より作成した標準曲線から、培養上清中の腫瘍壊死因子量（ｐｇ／ｍＬ）を求めた。試験試料の腫瘍壊死因子産生抑制率は以下の式に基づいて算出した。
【００４３】
腫瘍壊死因子産生抑制率（％）＝{(Ｂ−Ａ)／Ｂ}×１００
上記式中、「Ａ」は試料添加時の腫瘍壊死因子量、「Ｂ」は試料無添加時の腫瘍壊死因子量を表す。
腫瘍壊死因子産生抑制率は、試料２００ｐｐｍ(μｇ／ｍＬ)添加時の値を算出した。その結果を表３に示す。
【００４４】
〔試験例３〕血小板凝集抑制試験
日本種白色家兎の血液に７７ｍＭ ＥＤＴＡを血液量の１／１０容量添加し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿物を除いた。上清を２１００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿した血小板を採取した。得られた血小板を血小板洗浄液に浮遊させ、２１００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿した血小板を採取し、血小板数が３０万個／μＬになるように血小板浮遊液に浮遊させた。上述のようにして調製した洗浄血小板浮遊液２２３μＬに塩化カルシウム溶液１μＬを加え、３７℃に１分間インキュベーションした。そこに試料溶液１μＬを加えてさらに２分間インキュベーションした後、１分間攪拌した。次いで凝集惹起剤として１０ｐｐｍコラーゲン溶液２５μＬを添加し、３７℃で１０分間インキュベーションした後、血小板凝集測定装置 ＰＡＭ１２ＣＬ（メバニクス株式会社製）を用いて、凝集率Ａを測定した。別に、試料溶液の代わりに試料溶液の溶媒を添加し、上記と同様に操作し、凝集率Ｂを測定し、次式により血小板擬集抑制率を求めた。
【００４６】
血小板凝集抑制率（％）＝｛（Ｂ−Ａ）／Ｂ｝×１００
上記式中、「Ａ」は凝集惹起剤添加・試料溶液添加時の凝集率、「Ｂ」は凝集惹起剤添加・試料溶液無添加時の凝集率を表す。
試料溶液の濃度を段階的に減少させて上記血小板凝集率を測定し、抑制率が５０％になる試料濃度ＩＣ５０（ｐｐｍ；μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。その結果を表４に示す。
【００４７】
〔試験例４〕脂肪分解促進作用試験
製造例１による植物抽出物について、下記の試験法により脂肪分解促進作用を試験した。
ロッドベルの方法［Rodbell M., J.Biol.Chem., 239, 375(1964)］により、ウィスター系雄性ラット（体重１５０〜２００ｇ）の副睾丸脂肪組織からコラゲナーゼ溶液を用いて遊離脂肪細胞を調製した。遊離脂肪細胞懸濁液９０μＬに、最終試料濃度が４００ｐｐｍとなるよう調製した牛血清アルブミンを含むハンクス緩衝液１０μＬを加え、３７℃にて９０分間反応した。反応後、遊離した脂肪酸をＮＥＦＡ Ｃ−テストワコーで測定した。
脂肪分解促進率は、試料無添加時の値を１００％として算出した。
結果を表５に示す。
【００４９】
〔試験例５〕
製造例１で得られた５０％エタノール抽出物を配合した乳液（以下「実施例乳液」という。）を常法に従って調整した。実施例乳液の組成を以下に示す。
エンドウの若芽５０％エタノール抽出物（製造例１） １．０ｇ
セチルアルコール ０．５ｇ
ミツロウ ２．０ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（10E.0） １．０ｇ
モノステアリン酸グリセリル １．０ｇ
ヒアルロン酸 ０．１ｇ
プロピレングリコール ５．０ｇ
エタノール ３．０ｇ
パラオキシ安息香酸メチル ０．３ｇ
香料 ０．０３ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００５１】
実施例乳液と、エンドウの若芽の抽出物を含まない他は実施例乳液と同じ組成の比較例乳液について、下記の評価試験を行った。
被験者：２２〜４３歳の女性多数の中から、皮溝・皮丘が消え、広範囲の角質がめくれている（表６に示す評点が１）、又は皮溝・皮丘が不鮮明で角質が部分的にめくれている（表６に示す評点が２）、肌荒れと判定されたもの２０名を選抜して被験者とした。
塗布試験：各被験者に、顔の右半分には実施例乳液を、左半分には比較例乳液を、朝夕各１回、３０日間塗布させた。
【００５２】
[判定１：肌荒れ改善効果]
塗布試験終了後、シルフロ（FLEXICL DEVELOPMENTS LTD製）によるレプリカ法を用いて顔のレプリカをとり、５０倍の顕微鏡で皮紋の状態及び角質剥離状態を観察し、表６に示す評価基準で肌の状態を判定した。判定結果を表７に示す。
【００５３】
表７に示されるように、実施例乳液を塗布した領域は、比較例乳液を塗布した領域に比べて顕著に肌荒れ（皮膚の老化）が改善された。
【００５６】
[判定２・官能評価]
使用感と肌への効果について、実施例乳液と比較例乳液とを比較した場合の優劣を被験者全員に質問した。回答の集計結果を表８に示す。
【００５７】
表８に示される結果より、官能評価によっても上記判定１と同様の効果と優れた使用感が確認された。
判定１及び２の結果より、エンドウの若芽の抽出物を配合した皮膚化粧料が皮膚の老化防止・改善作用（肌荒れ改善作用）を有するとともに、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れていることが確認された。
【００５９】
〔試験例６〕
製造例１で得られた５０％エタノール抽出物を配合した化粧水（以下「実施例化粧水」という。）を常法に従って調整した。実施例化粧水の組成を以下に示す。
エンドウの若芽５０％エタノール抽出物（製造例１） １．０ｇ
エタノール ５．０ｇ
プロピレングリコール ５．０ｇ
親水性界面活性剤（ポリオキシエチレンセチルエーテル） ０．５ｇ
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０５ｇ
香料 適量
防腐剤（ヒノキチオール、パラオキシ安息香酸エチル） ０．１ｇ
精製水 残部(全量を１００ｇとする)
【００６０】
実施例化粧水と、エンドウの若芽の抽出物を含まないほかは実施例化粧水と同じ組成の比較例化粧水について、下記の評価試験を行った。
肥満度を示すＢＭＩ［Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ＝体重（ｋｇ）／｛身長（ｍ）×身長（ｍ）｝］が２８±２の１０名（男女各５名）に対し、３週間毎日入浴後に腹部（前、横）、大腿部内側に塗布しマッサージを行った後、表６に示す評価項目で効果があると感じた人数で官能評価した。評価結果を表９に示す。
【００６１】
表９に示されるように、実施例化粧料を塗布した領域は、比較例化粧料を塗布した領域に比べて優れた効果及び使用感が確認された。
【００６３】
〔配合例１〕
下記の組成の乳液を常法により製造した。
エンドウの若芽の抽出物（製造例１） １ｇ
ホホバオイル ４ｇ
オリーブオイル ２ｇ
スクワラン ２ｇ
セタノール ２ｇ
モノステアリン酸グリセリル ２ｇ
ポリオキシエチレンセチルエーテル（20E.0） ２．５ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.0） ２ｇ
黄杞エキス ０．１ｇ
イチョウ葉エキス ０．１ｇ
コンキオリン ０．１ｇ
オウバクエキス ０．１ｇ
カミツレエキス ０．１ｇ
1,3-ブチレングリコール ３ｇ
パラオキシ安息香酸メチル ０．１５ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００６４】
〔配合例２〕
下記組成の化粧水を常法により製造した。
エンドウの若芽の抽出物（製造例１） ２ｇ
グリセリン ３ｇ
1,3-ブチレングリコール ３ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.0） ０．５ｇ
パラオキシ安息香酸メチル ０．１５ｇ
クエン酸 ０．１ｇ
クエン酸ソーダ ０．１ｇ
油溶性甘草エキス ０．１ｇ
海藻エキス ０．１ｇ
キシロビオースミクスチャー ０．５ｇ
クジンエキス ０．１ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００６５】
〔配合例３〕
下記組成のクリームを常法により製造した。
エンドウの若芽の抽出物（製造例１） １ｇ
流動パラフィン ５ｇ
サラシミツロウ ４ｇ
セタノール ３ｇ
スクワラン １０ｇ
ラノリン ２ｇ
ステアリン酸 １ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.0） １．５ｇ
モノステアリン酸グリセリル ３ｇ
1,3-ブチレングリコール ６ｇ
酵母抽出液 ０．１ｇ
シソ抽出液 ０．１ｇ
シナノキ抽出液 ０．１ｇ
ジユ抽出液 ０．１ｇ
パラオキシ安息香酸メチル １．５ｇ
香料 ０．１ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００６６】
〔配合例４〕
下記組成のパックを常法により製造した。
エンドウの若芽抽出物（製造例１） ５ｇ
ポリビニルアルコール １５ｇ
ポリエチレングリコール ３ｇ
プロピレングリコール ７ｇ
エタノール １０ｇ
セージ抽出液 ０．１ｇ
トウキ抽出液 ０．１ｇ
ニンジン抽出液 ０．１ｇ
パラオキシ安息香酸エチル ０．０５ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００６７】
〔配合例５〕
下記の混合物を打錠して,錠剤状栄養補助食品を製造した。
エンドウの若芽の抽出物（製造例１） ５０重量部
粉糖（ショ糖） １７８重量部
ソルビット １０重量部
グリセリン脂肪酸エステル １２重量部
【００６８】
〔配合例６〕
下記の混合物を顆粒状に形成して栄養補助食品を製造した。
エンドウの若芽の抽出物（製造例１） ３４重量部
ビートオリゴ糖 １０００重量部
ビタミンＣ １６７重量部
ステビア抽出物 １０重量部
【００６９】
【発明の効果】
本発明によれば、抗酸化剤、抗炎症剤及び脂肪分解促進剤が提供される。また、本発明によれば、抗酸化作用、抗炎症作用又は脂肪分解促進作用を有する皮膚化粧料及び飲食品が提供される。
【００７０】
本発明の抗酸化剤は、カタラーゼ合成促進作用等を通じて生体成分の酸化を防止し、皮膚のシワ形成や弾力性低下等の老化現象を効果的に予防・改善することができる。また、本発明の抗炎症剤は、腫瘍壊死因子産生抑制作用、血小板凝集抑制作用等を通じて、種々の炎症性疾患、肌荒れ等を効果的に予防・治療することができる。また、本発明の脂肪分解促進剤は、脂肪分解促進作用を通じて全身又は局所の脂肪組織を減少させ、肥満を効果的に抑制することができるとともに、肥満体質を効果的に改善することができる。本発明の抗酸化剤、抗炎症剤及び脂肪分解促進剤は、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れているので皮膚化粧料に配合するのに好適なものである。また、本発明の皮膚化粧料及び飲食品は、皮膚老化の予防・改善、炎症性疾患の予防・治療、肥満の予防・改善、肥満体質の予防・改善に有用である。
Claims (2)
- エンドウの若芽からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする腫瘍壊死因子の過剰産生に起因する炎症性疾患の予防・治療剤（関節リウマチの予防・治療用途を除く）。
- 前記抽出物が腫瘍壊死因子産生抑制作用を有することを特徴とする請求項１記載の炎症性疾患の予防・治療剤。
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