JP4674329B2 - 繰返し配列組換えによる細胞全体および生物の進化 - Google Patents

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Description

【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、０９／１１６，１８８の一部継続出願である。本出願は、この先願に対して優先権を主張し、これはまた、すべての目的のためにその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、新規でかつ改善された特性を獲得するために細胞および生物のゲノムを進化させるための分子遺伝学の技術分野に適合する。
【０００３】
（背景）
ＷＯ９８／３１８３７（ＰＣＴ／ＵＳ９８／００８５２）は、細胞全体または生物全体のゲノムを進化させるための先駆的な技術を提供する。当業者は、ＷＯ９８／３１８３７に提供される技術が、細胞および生物全体を迅速に進化させるための当業者の能力に基本的であることを理解する。例えば、文献は、インビボで核酸を人工的に組換える種々の反復的方法を教示する（ゲノム全体、および得られる組換え生物を選択する方法を含む）。
【０００４】
人工的に遺伝子を進化させるこの能力は、根本的に重要である。例えば、細胞は、分子生物学、医学、ならびに工業的プロセスにおいて多数の十分に確立された用途を有する。例えば、細胞は、形質転換および組換えのようなプロセスにおいて、ＤＮＡを操作するための宿主として一般的に使用される。細胞は、形質転換されるか、トランスフェクトされるか、またはさもなくば細胞に導入されるＤＮＡによってコードされた組換えタンパク質の発現のために使用される。いくつかの細胞の型は、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物の生成のための先祖として使用される。これらのプロセスのすべてが現在慣用的であるが、ＷＯ９８／３１８３７によって提供される技術に先立って、これらのプロセスにおいて使用される細胞のゲノムは、天然の細胞のゲノムからほとんど進化せず、そして特に上記のプロセスにおける使用のための新規なまたは改善された特性の獲得に向けてはほとんど進化していなかった。
【０００５】
インビボで繰り返して組換わる核酸のさらなる方法および得られる組換え体を選択することは、有用である。本発明は、全体的および部分的ゲノムの進化のための新規かつ価値のある多数の方法および組成物を提供する。
【０００６】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、所望の機能を獲得するために細胞を進化させる方法を提供する。このような方法は、例えば、複数の細胞にＤＮＡフラグメントのライブラリーを導入することを伴い、それによって少なくとも１つのフラグメントが、細胞のゲノムまたはエピソーム中のセグメントとの組換えを受け、改変された細胞を産生する。必要に応じて、これらの改変された細胞は、育種されて多様な得られる組換え細胞集団を増加させる。次いで、この改変された細胞または組換え細胞集団は、所望の機能の獲得に向けて進化した改変された細胞または組換え細胞についてスクリーニングされる。次いで、所望の機能の獲得に向けて進化した改変された細胞からのＤＮＡは、必要に応じてＤＮＡフラグメントのさらなるライブラリーで組換えられ、その少なくとも１つが改変された細胞のゲノムまたはエピソーム中のセグメントで組換えを受け、さらなる改変細胞を産生する。次いで、さらなる改変細胞は、所望の機能の獲得に向けてさらに進化したさらなる改変された細胞についてスクリーニングされる。組換えおよびスクリーニング／選択の工程は、さらに改変された細胞が所望の機能を獲得するまで、必要とされるように反復される。１つの好ましい実施態様において、改変された細胞は、繰り返し組換えられて、任意の得られる細胞上での任意の選択工程を実行する前に、細胞の多様性を増大する。
【０００７】
いくつかの方法において、ＤＮＡフラグメントのライブラリーまたはそのさらなるライブラリーは、ｒｅｃＡタンパク質でコーティングされて、ゲノムのセグメントとの組換えを刺激する。フラグメントのライブラリーは、必要に応じて、一本鎖ＤＮＡを産生するために変性され、この一本鎖ＤＮＡは、アニールされて二重鎖を産生し、そのいくつかはフラグメントの変異の点においてミスマッチを含む。ミスマッチを含む二重鎖は、必要に応じて、固定化されたＭｕｔＳへのアフィニティークロマトグラフィーによって選択される。
【０００８】
必要に応じて、所望の機能は、タンパク質の分泌であり、そして複数の細胞はさらに、タンパク質をコードする構築物を含む。このタンパク質は、必要に応じて、分泌されない限りは不活性であり、そしてさらに改変された細胞は、必要に応じてタンパク質機能について選択される。必要に応じて、このタンパク質は、分泌されない限りは、複数の細胞に対して毒性である。この場合、所望の機能の獲得に向けて進化する改変された細胞またはさらに改変された細胞は、細胞を増殖させ、そして生存している細胞を回収することによってスクリーニングされる。
【０００９】
いくつかの方法において、所望の機能は、組換えの増強である。このような方法において、フラグメントのライブラリーは、ときどき、組換え能力を集合的に与える遺伝子のクラスターを含む。スクリーニングは、その発現が組換えによって除去可能な変異によって妨害されるマーカーをコードしている遺伝子を有する細胞を使用して達成され得る。この細胞は、組換えによる変異の除去から生じるマーカーの発現によってスクリーニングされる。
【００１０】
いくつかの方法において、複数の細胞は植物細胞であり、そして所望の特性は化学物質または微生物に対する改善された耐性である。改変された細胞またはさらに改変された細胞（または植物全体）は、化学物質または微生物に曝露され、そして所望の機能の獲得に向けて進化した改変された細胞またはさらに改変された細胞は、その曝露を生き延びるそれらの能力によって選択される。
【００１１】
いくつかの方法において、複数の細胞は、動物の胚性細胞であり、そしてその方法はさらに、形質転換された細胞をトランスジェニック動物へと増殖させる工程を包含する。
【００１２】
複数の細胞は、所望のプロセス条件（熱、光、放射、選択されたｐＨ、界面活性剤または他の変性剤の存在、アルコールまたは他の有機物質の存在など）に許容性である微生物について富化された複数の工業用微生物であり得る。
【００１３】
本発明はさらに、インビボでの組換えを実行するための方法を提供する。少なくとも１つの遺伝子からの少なくとも第１および第２のセグメントが細胞に導入され、そのセグメントは少なくとも２つのヌクレオチドにおいて互いに異なり、それによってそのセグメントは、組換えを起こしキメラ遺伝子のライブラリーを産生する。キメラ遺伝子は、所望の機能を獲得したライブラリーから選択される。
【００１４】
本発明はさらに、ウイルス感染を処置する際の薬物の効力を予想する方法を提供する。このような方法は、ウイルス由来の核酸セグメントを少なくともそのウイルス由来の第２の核酸セグメントで組換えて、組換え核酸セグメントのライブラリーを産生する工程を包含し、ここでそのウイルスの感染は薬物によって阻害され、その第２の核酸セグメントは、少なくとも２つのヌクレオチドにおいてその第１の核酸セグメントと異なる。次いで、宿主細胞は、薬物を含有する培地中で、組換え核酸セグメントを含むゲノムを有するウイルスの収集物と接触され、そしてその宿主細胞の感染から生じる子孫のウイルスが収集される。
【００１５】
第１の子孫のウイルス由来の組換えＤＮＡセグメントは、第２の子孫ウイルス由来の少なくとも組換えＤＮＡセグメントで組換えて、組換え核酸セグメントのさらなるライブラリーを産生する。宿主細胞は、薬物を含有する培地中で、さらなるライブラリーまたは組換え核酸セグメントを含むゲノムを有するウイルスの収集物と接触され、そしてさらなる子孫のウイルスがその宿主細胞によって産生される。所望の場合、さらなる子孫ウイルスがその薬物に対する所望の程度の耐性を獲得するまで、これらの組換えおよび選択工程は反復され、それによって獲得される耐性の程度およびそれを獲得するために必要とされる反復の回数は、ウイルスの処置における薬物の効力の尺度を提供する。ウイルスは、必要に応じて、特定の細胞株上で増殖するように適合される。
【００１６】
本発明はさらに、病原性微生物による感染を処置する際の薬物の効力を予想する方法を提供する。これらの方法は、複数の微生物細胞中へのＤＮＡフラグメントのライブラリーの送達を包含し、少なくともそれらのいくつかは、その細胞のゲノム中のセグメントとの組換えを行って、改変された微生物細胞を産生する。改変された微生物は、薬物を含有する培地中で増殖され、そして生存している微生物が回収される。生存している微生物からのＤＮＡは、さらなるＤＮＡフラグメントのライブラリーで組換えられ、少なくともそれらのいくつかは、生存している微生物からのＤＮＡ中のコグネイトセグメントで組換えを受けて、さらなる改変された微生物細胞を産生する。さらなる改変された微生物は、薬物を含有する培地中で増殖され、そして、さらなる生存している微生物が収集される。組換えおよび選択工程は、さらなる生存している微生物が、所望の程度の薬物に対する耐性を獲得するまで、必要に応じて反復される。獲得された耐性の程度およびそれを獲得するために必要とされる反復の回数は、病原性微生物を殺傷する際の薬物の効力の尺度を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、所望の機能を獲得するために細胞を進化させる方法を提供する。これらの方法は、異なる細胞の集団を提供することを包含する。それらの細胞は、ＤＮＡが細胞間で交換される条件下で培養され、ハイブリッドゲノムを有する細胞を形成する。次いで、その細胞は所望の特性の獲得に向けて進化した細胞についてスクリーニングまたは選択される。ＤＮＡ交換工程およびスクリーニング／選択工程は、必要に応じて、細胞が所望の特性を獲得するまで反復され、ここで、１つのサイクルからのスクリーニングされた細胞／選択された細胞は、次のサイクルにおいて異なる細胞の集団を形成する。
【００１８】
ＤＮＡ交換のメカニズムには、接合、ファージ媒介形質導入、リポソーム送達、プロトプラスト融合、および細胞の有性組換えが含まれる。必要に応じて、ＤＮＡフラグメントのライブラリーは、細胞に形質転換され得るか、またはエレクトロポレーションされ得る。
【００１９】
述べたように、所望の特性を獲得するために細胞を進化させるいくつかの方法は、細胞間のＤＮＡのプロトプラスト媒介交換によってもたらされる。このような方法は、異なる細胞の集団のプロトプラストを形成することを包含する。次いで、そのプロトプラストは融合されてハイブリッドプロトプラストを形成し、ここでそのプロトプラストからのゲノムが組換えを起こし、ハイブリッドゲノムを形成する。そのハイブリッドプロトプラストは、細胞の再生を促進する条件下でインキュベートされる。再生された細胞は、１回以上組換えされ得（すなわち、プロトプラスト法または細胞のゲノムを組合わせる以外の任意の他の方法によって）、任意の得られる細胞の多様性を増大する。好ましくは、再生された細胞は、例えば、細胞の多様な集団を生成するためのプロトプラスト融合によって、数回組換えられる。
【００２０】
次の段階は、選択またはスクリーニングして、所望の特性の獲得に向けて進化した再生された細胞を単離することである。ＤＮＡ交換および選択／スクリーニング工程は、必要に応じて、再生された細胞が所望の特性を獲得するまで反復され、ここで１つのサイクルにおいて再生された細胞は、次のサイクルにおいてプロトプラストを形成するために使用される。工業用微生物は、上記の方法を行うための好ましい微生物のクラスである。いくつかの方法は、親の細胞の融合していないプロトプラストを含まない融合したプロトプラストについて選択またはスクリーニングする工程をさらに包含する。いくつかの方法は、親のゲノムを有する細胞を含まないハイブリッドゲノムを有する融合したプロトプラストについて選択またはスクリーニングする工程をさらに包含する。いくつかの方法において、プロトプラストは、個々の細胞、菌糸または胞子を、細胞壁を分解する酵素で処理することによって提供される。いくつかの方法において、その株は、インタクトな細胞壁合成の能力を欠く変異体であり、そしてプロトプラストは、自発的に形成される。いくつかの方法において、プロトプラストは、プロトプラストを生成するために、細胞壁形成のインヒビターで増殖している細胞を処理することによって形成される。
【００２１】
いくつかの方法において、所望の特性は、タンパク質または二次代謝産物（例えば、工業用酵素、治療用タンパク質、一次代謝産物（例えば、乳酸もしくはエタノール）、または二次代謝産物（例えば、エリスロマイシン、サイクロスポリンＡ、またはタキソール）の発現および／または分泌である。他の方法において、細胞に提供された化合物を他の化合物に転換することは、細胞の能力である。なお他の方法において、所望の特性は、減数分裂の能力である。いくつかの方法において、所望の特性は、別の株と異核接合体を形成する適合性である。
【００２２】
本発明はさらに、所望の特性の獲得に向けて細胞を進化させる方法を提供する。これらの方法は、異なる細胞の集団を提供する工程を包含する。ＤＮＡは、異なる細胞の第１の亜集団から単離され、そしてリポソーム中にカプセル化される。プロトプラストは、異なる細胞の第２の亜集団から形成される。リポソームは、そのプロトプラストと融合され、それによってそのリポソームからのＤＮＡはそのプロトプラストによって取り込まれ、そしてそのプロトプラストのゲノムと組換えられる。そのプロトプラストは、再生する条件下でインキュベートされる。次いで、再生している細胞または再生した細胞は、所望の特性に向けての進化について選択またはスクリーニングされる。
【００２３】
本発明はさらに、人工の染色体を使用して所望の特性の獲得に向けて細胞を進化させる方法を提供する。このような方法は、人工染色体にクローニングされたＤＮＡフラグメントライブラリーを細胞の集団に導入する工程を包含する。次いで、その細胞は、それによって細胞間で有性組換えが起こるような条件下で培養され、そして人工染色体にクローニングされたＤＮＡフラグメントは、細胞の集団の内在性染色体の対応するセグメントとの相同組換えによって組換えを受け、そして内在性染色体は、互いに組換えを受ける。細胞はまた、接合を介して組換えされ得る。いかなる得られる細胞も本明細書中に述べられた任意の方法を介して、所望である回数、組換えされ得、得られる組換え細胞における所望の多様性のレベルを生成する。いずれにせよ、多様な細胞のライブラリーを生成した後、所望の特性の獲得に向けて進化した細胞は、所望の特性についてスクリーニングおよび／または選択される。次いで、その方法は、１つのサイクルにおいて所望の特性に向けて進化した細胞を用いて反復され、次のサイクルにおける異なる細胞の集団を形成する。ここで再び、インビボ組換えの複数のサイクルは、必要に応じて、さらなる選択またはスクリーニングの段階の前に行われる。
【００２４】
本発明はさらに、所望の特性の獲得のために人工染色体にクローニングされたＤＮＡセグメントを進化させる方法を提供する。これらの方法は、そのセグメントの改変体のライブラリーを提供する工程を包含し、各々の改変体は、人工染色体の別々のコピーへとクローニングされる。人工染色体のコピーは、細胞の集団に導入される。その細胞は、それによって細胞間で有性組換えが起こるような条件下で培養され、そして相同組換えが、改変体を有する人工染色体のコピー間で起こる。次いで、改変体は、所望の特性の獲得に向けての進化についてスクリーニングまたは選択される。
【００２５】
本発明はさらに、超組換え形成性ｒｅｃＡタンパク質を提供する。このようなタンパク質の例は、図１３に示されるクローン２、４、５、６、および１３からのタンパク質である。
【００２６】
本発明はまた、高等生物を繰り返しプールし、そして育種する方法を提供する。それらの方法において、多様な多細胞生物（例えば、植物、動物など）のライブラリーが産生される。雄性配偶子のプールは、雌性配偶子のプールとともに提供される。少なくとも１つの雄性プールまたは雌性プールは、１つの種または異なる種の異なる株由来の複数の異なる配偶子を含む。雄性配偶子は、雌性配偶子と授精するために使用される。得られる授精した配偶子の少なくとも一部が、生殖可能に生存できる生物へと生長する。これらの生殖可能に生存できる生物は交雑され（例えば、以前のように、雄性配偶体および雌性配偶体の対毎のプールおよび結合により）、多様な生物のライブラリーを産生する。次いで、このライブラリーは、所望の形質または特性について選択される。
【００２７】
多様な生物のライブラリーは、複数の植物（例えば、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ、Ｆｅｔｕｃｏｉｄｅａｅ、Ｐｏａｃｏｉｄｅａｅ、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｓｏｒｇｕｍ、Ｓｅｔａｒｉａ、Ｚｅａ、Ｏｒｙｚａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ａｖｅｎａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｐｏａ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｃｏｉｘ、Ｏｌｙｒｅａｅ、Ｐｈａｒｅａｅ、Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ、またはＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）のライブラリーを含み得る。例えば、その植物は、例えば、トウモロコシ、イネ、コムギ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、エンドウ、マメ、ヒラマメ、ラッカセイ、クズイモ、ササゲ、ダーリングカズラ、ダイズ、クローバー、アルファルファ、ルピナス、ソラマメ、スイレン、シナガワハギ、フジ、スイートピー、モロコシ、アワ、ヒマワリ、カノラなどであり得る。
【００２８】
同様に、多様な生物のライブラリーは、複数の動物（例えば、非ヒト哺乳動物、魚、昆虫など）を含み得る。
【００２９】
必要に応じて、選択されたライブラリーメンバーは、選択されたメンバーから配偶体をプールし、そして任意の得られるさらなる生殖可能に生存できる生物を反復して交雑することによって交雑され得、多様な生物の第２のライブラリーを産生する（例えば、雄性配偶体および雌性配偶体を分割して対毎にプールし、そして再結合することによって）。ここで再び、第２のライブラリーは、所望の形質または特性について選択され得、得られる選択されたメンバーがさらなるプール毎の育種および選択の基礎を形成する。
【００３０】
本発明の特徴は、これらの（または任意の先行する）方法によって作製されるライブラリーである。
【００３１】
（詳細な説明）
（Ｉ．一般論）
（Ａ．基本的アプローチ）
本発明は、繰り返して用いる配列組換えによって、新規なまたは改善された特性を獲得するために細胞を人工的に進化させるための方法を提供する。簡単に言えば、繰り返して用いる配列組換えは、分子の多様性を生成するための継続的な組換えのサイクルおよびその分子多様性を利用するスクリーニング／選択を包含する。すなわち、実質的な配列および／または構造同一性を示すが変異の存在に関しては異なる、核酸分子のファミリーが作製される。次いで、これらの配列は、得られる組換えライブラリーにおいて表される変異の組み合わせの多様性を最適化するために記載された様式のいずれかで組換えられる。代表的には、任意の得られる組換え核酸またはゲノムは、１つ以上の組換えサイクルについて繰り返して使用されて組換えられて、得られる産物の多様性を増大させる。この繰り返して使用される組換え手順の後、最終的な得られる産物は、所望の形質または特性についてスクリーニングおよび／または選択される。
【００３２】
あるいは、各々の組換えサイクルには、所望の特徴を有する分子についてスクリーニングまたは選択の少なくとも１サイクルが続き得る。この実施態様において、１ラウンドにおいて選択された分子は、次のラウンドにおける多様性の生成のための出発物質を形成する。
【００３３】
進化させられる細胞は、細菌、古細菌、または真核生物細胞であり得、そして均質な細胞株または混合培養物を構成し得る。進化のために適切な細胞には、遺伝子操作、タンパク質発現、あるいはタンパク質、酵素、一次代謝産物、二次代謝産物、ファインケミカルス、特製品化学、または日用品化学の工業的生産または転換において一般に使用される細菌および真核細胞株が含まれる。適切な哺乳動物細胞には、例えば、マウス、ラット、ハムスター、霊長類、およびヒト由来のもの（細胞株および初代培養物の両方）が含まれる。このような細胞には、幹細胞（胚性幹細胞および造血幹細胞を含む）、接合体細胞、線維芽細胞、リンパ球、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、腎臓細胞、肝細胞、筋肉細胞、および皮膚細胞が含まれる。目的の他の真核生物細胞には、植物細胞（例えば、トウモロコシ、イネ、コムギ、ワタ、ダイズ、サトウキビ、タバコ、およびシロイヌナズナ）；魚、藻類、真菌（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、昆虫（例えば、ｂａｃｕｌｏ ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、酵母（ｐｉｃｃｈｉａおよびｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）が含まれる。グラム陰性およびグラム陽性の両方の多くの細菌細胞型（例えば，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｅｈｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉｕｓ、Ａｃｅｔｏｎｉｔｃｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、およびＥｒｗｉｎｉａ）もまた、目的のものである。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの完全ゲノム配列は、Ｂｌａｔｔｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７、１４５４−１４６２（１９９７）；Ｋｕｎｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３９０、２４９−２５６（１９９７）に記載されている。
【００３４】
改変体細胞の集団を生成することによって進化は開始する。代表的には、集団中の細胞は、同じ型の細胞であるが前駆細胞の改変体を示す細胞である。いくつかの場合には、変異は、異なる細胞が、種内の異なる個体から、異なる種から、または異なる属から得られる場合のように、天然である。他の場合には、変異は、前駆細胞の変異誘発によって誘導される。変異誘発は、細胞を変異誘発剤にさらすことによってもたらされ得るか、または、細胞が変異誘発細胞（例えば、変異の導入に有利である、ＤＮＡ複製、組換え、および／または修復に関与する遺伝子における変異を有する）である場合は、単にその変異誘発細胞を増殖させることによってもたらされ得る。変異誘発細胞は、単純な表現型の変化（例えば、リファンピシン耐性の獲得、次いでナリジクス酸耐性次いでｌａｃ−からｌａｃ＋（Ｍａｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９、４１７−４２２（１９９７）を参照のこと））についての連続的な選択から生成され得るか、または変異誘発細胞は、変異誘発遺伝子表現型を生じる細胞因子の特異的インヒビターにさらすことによって生成され得る。これらは、ｍｕｔＳ、ｍｕｔＬ、ｍｕｔＤ、ｒｅｃＤ、ｍｕｔＹ、ｍｕｔＭ、ｄａｍ、ｕｖｒＤなどのインヒビターであり得る。
【００３５】
より一般的には、変異は、任意の利用可能な変異技術を使用して細胞集団中に導入される。一般的な変異を導入するためのメカニズムには、ミスマッチ修復に関与する変異のような変異（例えば、ｍｕｔＳ、ｍｕｔＴ、ｍｕｔＬ、およびｍｕｔＨにおける変異）を含む株の使用；ＵＶ光への曝露；化学的変異誘発（例えば、ＭＭＲのインヒビター、ＤＮＡ損傷誘導遺伝子、またはＳＯＳインデューサーの使用）；相同組換え複合体／経路の任意の構成成分（例えば、ＲｅＡ、ｓｓｂなど）の過剰産生／過小産生／変異；ＤＮＡ合成／ホメオタシスに関与する遺伝子の過剰産生／過小産生／変異；細菌、ファージ（例えば、Ｌａｍｂｄａ Ｒｅｄ機能）、または他の生物由来の組換え刺激遺伝子の過剰産生／過小産生／変異；ドナーＤＮＡフラグメントへのχ部位の付加／ドナーＤＮＡフラグメントに隣接するχ部位の付加；ＲｅｃＡ／ｓｓｂでのＤＮＡフラグメントのコーティングなどが含まれるがこれらに限定されない。
【００３６】
他の場合には、変異は、ＤＮＡフラグメントのライブラリーを（例えば、接合、プロトプラスト融合、リポソーム融合、形質転換、形質導入、または天然の受容能によって）細胞に移入することの結果である。ライブラリーにおける少なくとも１つの、そして通常多くのフラグメントが、相同組換えを起こさせるに十分な細胞内のコグネイト遺伝子または対立遺伝子と、いくらかの、しかし完全ではない配列または構造同一性を示す。例えば、１つの実施態様において、シャッフルされた遺伝子を有するプラスミドの相同組み込みまたは代謝経路は、ゲノムコピーの隣に、そのプラスミドに含まれる配列の挿入をもたらす。必要に応じて、対抗選択マーカー（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ）ストラテジーを使用して、組換え体を選択する。ここでは、組換えが相同配列間で起こり、対抗選択マーカーの除去をもたらす。このストラテジーは、図２０Ａに図示される。種々の選択マーカーおよび対抗選択マーカーは、当該分野において詳細に例証されている。有用なマーカーのリストとしては、ＢｅｒｇおよびＢｅｒｇ（１９９６）Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、２：２５８８−２６１２；Ｌａ Ｒｏｓｓａ、同書、２５２７−２５８７を参照のこと。このストラテジーは、所望の形質または特性についてスクリーニング／選択する前に、標的化された遺伝子の配列多様性を最大化するために、繰り返して用いて反復される。
【００３７】
フラグメントのライブラリーは、１つ以上の供給源に由来し得る。フラグメントの１つの供給源は、トランスフェクトされる細胞からの、異なる種、細胞型、生物、または個体由来のフラグメントのゲノムライブラリーである。この状況において、ライブラリーにおけるフラグメントの多くは、形質転換される細胞においてコグネイト遺伝子または対立遺伝子を有するが、天然に存在する種変異、多型、変異、およびゲノムにおけるいくつかの相同遺伝子の複数コピーの存在のために、その遺伝子とは異なっている。あるいは、そのライブラリーは、形質転換されるものと、同じ細胞型由来のＤＮＡから誘導され得、その後、ＤＮＡは、放射、エラー傾向性（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、変異誘発生物における増殖、トランスポゾン変異誘発、またはカセット変異誘発のような従来的な方法によって、変異の誘導に供されている。あるいは、そのライブラリーは、所望の特性を有する細胞の集団のプールされたゲノムＤＮＡから生成されたフラグメントのゲノムライブラリーから誘導され得る。あるいは、そのライブラリーは、所望の特性を有する細胞の集団のプールされたゲノムＤＮＡから生成されたフラグメントのゲノムライブラリーから誘導され得る。
【００３８】
これらの状況のいずれかにおいて、ゲノムライブラリーは、例えば、選択された染色体、または染色体の一部、または細胞内のエピソームエレメントに由来する完全ゲノムライブラリーまたはサブゲノムライブラリーであり得る。ＤＮＡフラグメントのこれらの供給源に加えて、またはこれらの代わりに、そのライブラリーは、公知の機能を有する選択された遺伝子の天然のまたは選択された改変体を表すフラグメントを含み得る（すなわち、焦点を合わせたライブラリー）。
【００３９】
ライブラリーにおけるフラグメントの数は、単一のフラグメント〜約１０10まで変化し得、１０3〜１０8フラグメントを有するライブラリーが一般的である。そのフラグメントは、それらが相同組換えを受けられ得るように十分に長く、かつそれらが細胞に導入され得るように十分に短いべきであり、そして必要な場合、導入の前に操作されるべきである。フラグメントサイズは、約１０ｂ〜約２０ｍｂの範囲であり得る。フラグメントは、二本鎖または一本鎖であり得る。
【００４０】
そのフラグメントは、ゲノム全体として、またはウイルス、プラスミド、ＹＡＣＳ、ＨＡＣ、もしくはＢＡＣの構成成分として細胞に導入され得るか、あるいは、それらのそのままの状態で導入され得、その場合、すべてのまたは大部分のフラグメントが複製の起点を欠く。一本鎖ゲノムを有するウイルスフラグメントの使用は、組換えを促進する、一本鎖形態におけるフラグメントを送達する利点を提供する。このフラグメントはまた、導入前に選択マーカーと結合され得る。複製起点を有するベクター中にフラグメントを含ませることにより、細胞への導入後の長い時間を提供し、その細胞中でフラグメントはコグネイト遺伝子で組換えを受け得、その後分解されるかまたは細胞に対して選択され、そして細胞から失われ、それによって組換えゲノムを有する細胞の割合を増加させる。必要に応じて、そのベクターは、単離されたＤＮＡフラグメントよりも長期間存在し得るが、細胞株中で永続的には維持され得ない、自殺ベクターである。このようなベクターは、十分な時間、ベクターを有する細胞をスクリーニングまたは選択するために、一過性にマーカーを発現する（例えば、ベクターによって形質導入された細胞は、引き続く選択アッセイにおいてスクリーニングされる標的細胞型であるため）が、次いで、分解されるか、またはさもなくばマーカーを発現できなくなる。このようなベクターの使用は、以下で議論される組換えの任意の引き続くラウンドを行う際に有利であり得る。例えば、いくつかの自殺ベクターは、寿命の長い毒素を発現し、この毒素は、同じベクターによって発現される寿命の短い分子によって中和される。この毒素単独の発現により、ベクターが確立されない。ＪｅｎｓｅおよびＧｅｒｄｅｓ、Ｍｏｌ．Ｍｉｄｒｏｂｉｏｌ．１７、２０５−２１０（１９９５）；Ｂｅｒｎａｒｄら、Ｇｅｎｅ １６２、１５９−１６０。あるいは、ベクターは、欠損した複製起点（例えば、温度感受性複製起点）の組み込みによって、または複製起点を削除することによって自殺性にされ得る。ベクターはまた、ネガティブ選択マーカー（例えば、酵母におけるｕｒａ３または多くの細菌におけるｓａｃＢ）の含有により、自殺性にされ得る。これらの遺伝子は、特定の化合物の存在下においてのみ、毒性になる。このようなベクターは、広範な安定性を有するように選択され得る。例えば、ベクターを複製欠損にするために使用され得るベクターの条件的な複製欠損の一覧は、例えば、ＢｅｒｇおよびＢｅｒｇ（１９９６）、「Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ＣｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、２：２５８８−２６１２に見出される。同様に、ベクター選択に一般的に適用可能な対抗選択マーカーのリストは、ＢｅｒｇおよびＢｅｒｇ、同書、においてまた見出される。ＬａＲｏｓｓａ（１９９６）「Ｍｕｔａｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ ｌｉｎｋｉｎｇ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ」Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ．２：２５２７−２５８７もまた参照のこと。
【００４１】
細胞への導入の後、このフラグメントは、相同組換え、非相同組換えもしくは部位特異的組換えにより、ゲノム中または細胞のエピソーム中に存在するＤＮＡと、組み換わり得る。この目的のために、相同組換えは、細胞の進化に最も重大に寄与する。なぜならこの組換えの形態は、トランスフェクトされる細胞のＤＮＡとＤＮＡフラグメントとの間の既存の多様性を増幅させるからである。例えば、トランスフェクトされるＤＮＡフラグメントがコグネイトまたは対立遺伝子と２つの位置で異なる場合、４つの組換え産物が可能であり、そしてこれらの組換え産物の各々は、形質転換された集団中の異なる細胞において形成される得る。従って、このフラグメントの相同組換えは、この遺伝子における最初の多様性を二倍にする。多くのフラグメントが対応するコグネイトまたは対立遺伝子と組み換わるとき、開始産物に対する組換え産物の多様性は、変異の数とともに指数関数的に増加する。組換えは、改変されたゲノムおよび／またはエピソームを有する改変細胞を生じる。選択の前の反復的な組換えは、得られる改変細胞の多様性をさらに増加させる。
【００４２】
改変体細胞（天然の改変体、変異誘発、または組換えの結果のいずれにしても）は、スクリーニングまたは選択されて、新たなもしくは改善された特性の獲得に向かって進歩した細胞のサブセットが同定される。もちろん、スクリーニングの性質は、特性に依存し、そしていくつかの例は以下に議論される。代表的には、組換えは、最初のスクリーニングの前に反復される。しかし、必要に応じて、スクリーニングはまた、引き続く組換えのサイクルを行う前に反復され得る。ストリンジェンシーは、スクリーニングのサイクルの反復において増加され得る。
【００４３】
細胞生存スクリーニングの亜集団は、必要に応じてさらなる回の組換えに供され得る。いくつかの場合において、さらなる回の組換えは、細胞間のＤＮＡの交換を可能にする条件下で、細胞を増殖させることによりもたらされる。例えば、プロトプラストが細胞から形成され得、このことにより、融合が可能となり、そして再生され得る。組換えゲノムを有する細胞は、融合プロトプラストから増殖される。あるいは、ＤＮＡの交換は、電場で細胞またはプロトプラストを増殖させることにより促進され得る。接合輸送装置（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｐｐａｒａｔｕｓ）を有する細胞については、ＤＮＡの交換は、単に細胞を増殖させることにより促進され得る。
【００４４】
他の方法において、さらなる回の組換えは、分割およびプール（ｓｐｌｉｔ ａｎｄ ｐｏｏｌ）アプローチにより行われる。すなわち、生存細胞は、２つのプールに分割される。ＤＮＡが、１つのプールから単離され、そして増幅する必要があれば、他のプールへ形質転換される。従って、第１のプール由来のＤＮＡフラグメントは、フラグメントのさらなるライブラリーを構成し、そして第２のプールにおけるコグネイトフラグメントと組み換わり、さらなる多様性を生じる。このストラテジーの例は、図１９に例示される。示されるように、所望の表現型における改善を有する変異細菌のプールが得られ、そして分割される。遺伝子は一方の半分から、例えば、ＰＣＲにより、ランダムゲノムフラグメントのクローニングより、形質導入ファージで感染させて、そして形質導入する粒子を採取することにより、または移入起点（ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＯｒｉＴ）の関連する染色体へのランダムな導入より得られて、アクセプター集団に対する接合体によりランダムなフラグメントを移入し得る細胞のドナー集団を作製する。次いで、これらの遺伝子は、シャッフルされるか（公知の方法によりインビトロで、または本明細書中に教示されるようにインビボで）、または単に対立遺伝子置換ベクター（例えば、選択マーカーおよび対向選択マーカー（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ）を有するベクター）へクローニングされる。次いで、この遺伝子プールは、本来の変異体プールの他方の半分に形質転換され、そして組換え体が選択され、そして表現型のさらなる改善のためにスクリーニングされ得る。これらの最良の改変体は、次のサイクルの開始点として使用される、あるいは、記載される任意の方法による反復組換えがスクリーニングの前に行われ得、それによってスクリーニングされる細胞の集団の多様性を増加させる。
【００４５】
他の方法において、スクリーニングを生存する細胞のいくつかまたは全ては、ＤＮＡフラグメントの新鮮なライブラリーでトランスフェクトされ、これは、第１回の組換えにおいて使用されたライブラリーと同じでもよいし、異なっていてもよい。この状況において、新鮮なライブラリー中の遺伝子は、生存細胞中のコグネイト遺伝子との組換えを受ける。遺伝子がベクターの成分として導入される場合、このベクターと先の回のトランスフェクションにおいて使用された任意のベクターとの適合性が考慮されるべきである。先の回で使用されたベクターが、自殺ベクターである場合、不適合性の問題はない。しかし、先の回で使用されたベクターが自殺ベクターでない場合、異なる不適合性起源を有するベクターが次の回で使用されるべきである。これらの形式の全てにおいて、さらなる組換えは、細胞のＤＮＡ成分におけるさらなる多様性を生成する。その結果、さらなる改変細胞が生じる。
【００４６】
このさらなる改変細胞は、第１回と同じ原理に従う、別の回のスクリーニング／選択に供される。スクリーニング／選択により、特性の獲得に向かってさらに進化したさらなる改変細胞の亜集団が同定される。細胞の亜集団は、（必要に応じて、各回で増加されるスクリーニングのストリンジェンシーで）同じ原理に従う、さらなる回の組換えおよびスクリーニングに供される。最終的に、所望の特性を獲得した細胞が同定される。
【００４７】
（ＩＩ．定義）
用語、コグネイトは、種間で進化的にそして機能的に関連する遺伝子配列をいう。例えば、ヒトゲノムにおいて、ヒトＣＤ４遺伝子は、マウスＣＤ４遺伝子に対するコグネイト遺伝子である。なぜなら、これらの２つの遺伝子の配列および構造は、それらが相同であり、そして両方の遺伝子がＭＨＣクラスＩＩ拘束抗原認識によってＴ細胞活性化をシグナル伝達することにおいて機能するタンパク質をコードすることを示すからである。
【００４８】
一般に、スクリーニングは、２工程プロセスである。ここで、最初にどの細胞がスクリーニングマーカーまたは表現型（または選択されたレベルのマーカーもしくは表現型）を発現しているか否かを決定し、次いで、所望の特性を有する細胞を物理的に分離する。選択は、スクリーニングの一形態であり、ここで同定および物理的分離は、選択マーカー（これは、いくつかの遺伝子環境においてはマーカーを発現する細胞の生存を可能にするが、他の細胞は死ぬ（逆の場合もまた同じである））の発現により同時に達成される。スクリーニングマーカーとしては、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、および緑色蛍光タンパク質が挙げられる。選択マーカーとしては、薬物および毒素耐性遺伝子が挙げられる。
【００４９】
外因性ＤＮＡセグメントは、細胞に対して外来性（すなわち異種）であるか、または細胞に対して同種であるが、エレメントが通常には見出されない宿主細胞核酸内の位置にあるＤＮＡセグメントをいう。外因性ＤＮＡセグメントは発現されて、外因性ポリペプチドを生成し得る。
【００５０】
用語「遺伝子」は、生物学的機能と関連するＤＮＡの任意のセグメントをいうために広く使用される。従って、遺伝子は、コード配列、および／またはコード配列の発現のために必要とされる調節配列を含む。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質についての認識配列を形成する発現されないＤＮＡセグメントを含む。
【００５１】
用語「同一」または「％同一性」は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて、または視覚検査によって測定される際に、最大一致について比較および整列した場合、同じであるか、または同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの具体的な割合を有する２つ以上の配列または部分配列をいう。
【００５２】
語句「実質的に同一」は、２つの核酸またはポリペプチドの文脈において、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて、または視覚検査によって測定される際に、最大一致について比較および整列した場合、少なくとも６０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列または部分配列をいう。好ましくは、実質的同一性は、少なくとも約５０残基長である配列の領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは配列は、少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。最も好ましい実施態様において、配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。
【００５３】
配列比較について、代表的には１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、部分配列座標を指定し、そして必要な場合は、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した試験配列についての％配列同一性を計算する。
【００５４】
比較のための配列の至適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のコンピュータ処理の実施によって行われ得る。
【００５５】
有用な整列アルゴリズムの別の例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、漸進性の対をなす整列を使用して関連配列の群から複数の配列整列を作製して、関連性および％配列同一性を示す。これはまた、整列を作製するために使用されるクラスタ形成の関係性を示す樹枝状分岐または樹形図をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６（１９８７）の漸進性整列方法の単純化を使用する。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）により記載される方法に類似している。このプログラムは、３００までの配列を整列し得、各々の最大の長さは、５，０００ヌクレオチドまたは５，０００アミノ酸である。複数整列手順は、２つの最も類似の配列の対になった整列で始まり、２つの整列された配列のクラスタを生成する。次いで、このクラスタは、次の最も関連した配列または整列された配列のクラスタに対して整列される。配列の２つのクラスタは、２つの個々の配列の対になった整列の単純な伸長により整列される。この最終的な整列は、一連の漸進性の対になった整列により達成される。このプログラムは、特定の配列および配列比較の領域についてのそれらのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することによって、ならびにプログラムパラメーターを指定することによって実行される。例えば、参照配列を他の試験配列と比較して、以下のパラメーターを使用して％配列同一性の関係性を決定し得る：デフォルトギャップ重み（３．００）、デフォルトギャップ長重み（０．１０）、および重み付け末端ギャップ。
【００５６】
％配列同一性および配列類似性を決定するために適切であるアルゴリズムの別つの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）において記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公に利用可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベースの配列中の同じ長さのワードと整列される場合に、いくつかの正価の閾値スコアＴにマッチするかまたはそれを満たすかのいずれかである、問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出す検索を開始するための元として作用する。次いで、ワードヒットは、累積整列スコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、変数Ｍ（マッチ塩基の対についての報酬スコア；常に＞０）、およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に、＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列について、スコアリングマトリクスを使用して、累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積整列スコアが、その最大達成値から量Ｘだけ落ちる場合；１つ以上の負のスコアリング残基整列の蓄積に起因して、累積スコアがゼロ以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズム変数Ｗ、Ｔ、およびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）。
【００５７】
％配列同一性を算定することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小総確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に生じる確率の指数を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小総確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に対して類似であると考えられる。
【００５８】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるというさらなる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交叉反応性であることである。従って、ポリペプチドは、代表的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる第２のポリペプチドに実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【００５９】
用語「天然に存在する」は、天然において見出され得る物体を記載するために使用される。例えば、天然に供給源から単離され得る生物（ウイルスを含む）中に存在し、そして研究室において人によって意図的に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在している。一般に、用語、天然に存在する、は、非病原性（罹患していない）個体に存在するような物体（例えば、種の標準である）をいう。
【００６０】
無性組換えは、接合子を形成するために配偶子の融合なくして組換えが生じる。
【００６１】
「ミスマッチ修復欠損株」は、ミスマッチ修復の機能を減損した任意の生物における任意の変異体を含み得る。これらは、ｍｕｔＳ、ｍｕｔＴ、ｍｕｔＨ、ｍｕｔＬ、ｏｖｒＤ、ｄｃｍ、ｖｓｒ、ｕｍｕＣ、ｕｍｕＤ、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＪなどの変異遺伝子産物を含む。この減損は、遺伝的変異、対立遺伝子置換、添加された試薬（例えば、低分子化合物または発現されるアンチセンスＲＮＡ）による選択性阻害、または他の技術によって達成される。減損は、記載される遺伝子の減損、または任意の生物における相同性遺伝子の減損であり得る。
【００６２】
（ＩＩＩ．バリエーション）
（Ａ．ｒｅｃＡタンパク質でのフラグメントのコーティング）
ライブラリーフラグメントとコグネイト内因性遺伝子との間の相同組換えの頻度は、細胞への導入の前に、組換え形成性の（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）タンパク質でフラグメントをコーティングすることにより増加される。Ｐａｔｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ １、１（１９９６）；ＳｅｎａおよびＺａｒｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３、３６５（１９９６）；Ｒｅｖｅｔら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３２、７７９−７９１（１９９３）；ＫｏｗａｌｃｚｋｏｗｓｋｉおよびＺａｒｌｉｎｇ、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＣＲＣ １９９５）、Ｃｈ．７を参照のこと。組換え遺伝子タンパク質はｌ、相同対形成および／または鎖交換を促進する。最もよく特徴づけられたｒｅｃＡタンパク質はＥ．ｃｏｌｉ由来であり、そしてＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能である（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。野生型タンパク質に加えて、多くの変異型ｒｅｃＡ様タンパク質が同定された（例えば、ｒｅｃＡ８０３）。さらに、多くの生物が、鎖転移活性を有するｒｅｃＡ様リコンビナーゼを有する：
【００６３】
【表１】
Figure 0004674329
このようなリコンビナーゼタンパク質の例としては、以下が挙げられる：
【００６４】
【表２】
Figure 0004674329
ｒｅｃＡタンパク質は、１本鎖ＤＮＡをコーティングする場合に、核タンパク質フィラメントを形成する。この核タンパク質フィラメントにおいて、ｒｅｃＡタンパク質の１モノマーは、約３ヌクレオチドに結合される。ｒｅｃＡが１本鎖ＤＮＡをコーティングするというこの特性は、本質的には、配列とは独立しているが、特定の配列は、ポリヌクレオチド（例えば、核形成配列）へのｒｅｃＡの最初の負荷に有利である。この核タンパク質フィラメントは、基本的にシャッフルされるいずれのＤＮＡに対しても形成され得、そして原核生物細胞および真核生物細胞における１本鎖ＤＮＡおよび２本鎖ＤＮＡの両方と複合体を形成し得る。
【００６５】
ＲｅｃＡまたは他のリコンビナーゼと接触させる前に、フラグメントは、しばしば、例えば、熱処理により変性される。次いで、ｒｅｃＡタンパク質は、約１〜１０μＭの濃度で添加される。インキュベーションの後、ｒｅｃＡコーティングされる１本鎖ＤＮＡは、従来の方法（例えば、化学的形質転換またはエレクトロポレーション）によりレシピエント細胞へ導入される。一般に、コーティングされたＤＮＡが送達される生物から単離されたＲｅｃＡホモログでＤＮＡをコーティングすることが望ましくあり得る。組換えは、いくつかの細胞因子が関与し、そして宿主のＲｅｃＡ等価物は、一般に、あまり密接に関連しないＲｅｃＡ分子より他の宿主因子と、より良好に相互作用する。このフラグメントは、内因性コグネイト遺伝子との相同組換えを受ける。リコンビナーゼでのコーティングに起因して組換えの頻度が増加するために、このフラグメントは、ベクターの成分として導入される必要はない。
【００６６】
フラグメントは、ときおり、組換えを促進するか、核酸が分解するのを妨げるか、または核酸を核に標的化する他の核酸結合タンパク質でコーティングされる。このようなタンパク質の例としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｒＥ２（Ｄｕｒｒｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６、９１５４−９１５８（１９８９））。あるいは、レシピエント株は、ＲｅｃＤ活性が欠損している。１本鎖になった末端はまた、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性または５’突出を生成する制限酵素により生成され得る。
【００６７】
（１．ＭｕｔＳ選択）
Ｅ．ｃｏｌｉのミスマッチ修復タンパク質ＭｕｔＳは、少なくとも１つの塩基のミスマッチを含む２本鎖ＤＮＡのフラグメントを富化するためのアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用され得る。ＭｕｔＳタンパク質は、ミスマッチの点の周囲に個々の鎖により形成されたバブル構造（ｂｕｂｂｌｅ）を認識する。例えば、ＨｓｕおよびＣｈａｎｇ，ＷＯ９３２０２３３号を参照のこと。部分的にミスマッチである二重鎖をアフィニティー富化するストラテジーを本発明の方法に組み込んで、フラグメントの後継のライブラリーと、レシピエント細胞における対応するコグネイトまたは対立遺伝子との間の多様性を増加させる。
【００６８】
図２は、ＭｕｔＳを使用して多様性を増加させる、１つのスキームを示す。富化のためのＤＮＡ基質は、互いに実質的に類似しているが、いくつかの部位で異なっている。例えば、ＤＮＡ基質は、異なる個体由来の完全ゲノムまたは部分的ゲノム（例えば、染色体ライブラリー）を表し得、差異は、多型性に起因する。この基質はまた、野生型配列の誘導された変異体を表し得る。このＤＮＡ基質はプールされ、制限消化され、そして変性されて１本鎖ＤＮＡのフラグメントが生成される。次いで、この１本鎖ＤＮＡを再アニールさせる。いくつかの１本鎖フラグメントは、完全にマッチした相補鎖と再アニールされて、完全にマッチした二重鎖を形成する。他の１本鎖フラグメントは、ミスマッチ二重鎖を生成するためにアニールする。ミスマッチの二重鎖は、（例えば、ＭｕｔＳをビーズに固定化した）ＭｕｔＳクロマトグラフィーにより完全にマッチした二重鎖から富化される。このクロマトグラフィーにより回収されたミスマッチの二重鎖は、上記の内因性コグネイト遺伝子との組換えのためにレシピエント細胞に導入される。ＭｕｔＳアフィニティークロマトグラフィーは、互いに異なるフラグメントの割合と内因性コグネイト遺伝子を増加させる。従って、後継のフラグメントと内因性遺伝子との間の組換えは、より大きな多様性を生じる。
【００６９】
図３は、ＭｕｔＳ富化の第２のストラテジーを示す。このストラテジーにおいて、ＭｕｔＳ富化についての基質は、比較的短いセグメント（例えば、遺伝子もしくは遺伝子のクラスタ）の改変体を表し、ここで大部分の異なる改変体は、単一のヌクレオチドが異なるに過ぎない。ＭｕｔＳ富化の目的は、天然に存在する配列より多くのバリエーションを含む、組換えのための基質を生成することである。これは、基質をランダムにフラグメント化して、重複するフラグメントを生成することにより達成される。このフラグメントは、第１のストラテジーにおけるように変性され、そして再アニールされる。再アニーリングにより、いくつかのミスマッチの二重鎖が形成され、これは、ＭｕｔＳアフィニティークロマトグラフィーにより完全にマッチした二重鎖から分離され得る。先のように、ＭｕｔＳクロマトグラフィーは、少なくとも単一のミスマッチを有する二重鎖を富化する。次いで、このミスマッチの二重鎖は、より長いフラグメントへ再アセンブルされる。これは、変性、再アニーリング、および部分的にアニールした二重鎖の鎖伸長のサイクルにより達成される（第Ｖ節を参照のこと）。何回かのこのようなサイクル後に、これらのフラグメントが互いに複数の部位で異なることを除いて、本来の基質と同じ長さのフラグメントが達成される。次いで、これらのフラグメントは、内因性コグネイト遺伝子で組換えを受ける細胞へ導入される。
【００７０】
（２．対立遺伝子交換についてのポジティブ選択）
本発明は、開始細胞と比較して改変遺伝子を有する細胞について富化する方法をさらに提供する。これは、ＤＮＡフラグメントライブラリー（例えば、単一の特定のセグメントまたは全ゲノムライブラリーまたは部分的ゲノムライブラリー）を、ポジティブ選択マーカーもしくはネガティブ選択マーカーの両方を含む自殺ベクター（すなわち、レシピエント細胞型における機能的な複製起点を欠如する）中に導入することによって達成され得る。必要に応じて、異なる供給源（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよびＢ．ｃｅｒｅｕｓ）に由来する複数フラグメントのライブラリーを、異なる選択マーカーを有する異なるベクターにクローニングし得る。適切なポジティブ選択マーカーとしては、ｎｅｏR、ｋａｎａｍｙｃｉｎR、ｈｉｇ、ｈｉｓＤ、ｇｐｔ、ｂｌｅ、ｔｅｔRが挙げられる。適切なネガティブ選択マーカーとしては、ｈｓｖ−ｔｋ、ｈｐｒｔ、ｇｐｔ、ＳａｃＢ、ｕｒａ３およびシトシンデアミナーゼが挙げられる。条件付き複製ベクター、ベクター複製に影響が及ぶ変異、制限された宿主範囲のベクター、ならびに対向選択マーカーの種々の例は、ＢｅｒｇおよびＢｅｒｇ（前出）、ならびにＬａＲｏｓｓａ（同書）およびその中での引用文献に見出される。
【００７１】
１つの例において、Ｒ６Ｋおよびｆｌ複製起点、ポジティブ選択マーカー（ベータラクタマーゼ）、および対向選択マーカー（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓａｃＢ）を有するプラスミドを使用した。クローニングされた遺伝子を含むプラスミドのＭ１３形質導入により、ｒｅｐ変異Ｅ．ｃｏｌｉ株におけるその遺伝子の染色体コピーへ効率的に組み込まれた。
【００７２】
ネガティブ選択を適用する別のストラテジーは、ストレプトマイシン耐性を付与する変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する細胞において使用するためのベクター中に、野生型ｒｐｓＬ遺伝子（リボソームタンパク質Ｓ１２をコードする）を含めることである。ｒｐｓＬの変異体形態は、野生型ｒｐｓＬを有する細胞において劣性である。従って、Ｓｍ耐性についての選択は、ｒｐｓＬの野生型コピーを有する細胞に対して選択する。ＳｋｏｒｕｐｓｋｉおよびＴａｙｌｏｒ、Ｇｅｎｅ １６９、４７−５２（１９９６）を参照のこと。あるいは、ポジティブ選択マーカーのみを有するベクターを、マーカーを発現する細胞についての１回の選択、およびこのマーカーを失った細胞についての引き続く回のスクリーニング（例えば、薬物感受性についてのスクリーニング）で使用し得る。ポジティブ選択マーカーを失った細胞についてのスクリーニングは、ネガティブ選択マーカーの発現に対するスクリーニングに等しい。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓは、ＣＡＴ遺伝子および組み込まれる配列を有するベクターで形質転換され得る。ＨａｒｗｏｏｄおよびＣｕｔｔｉｎｇ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ、第３１〜３３頁を参照のこと。クロラムフェニコール耐性についての選択は、ベクターを取り込んだ細胞を単離する。組換えを可能にする適切な時間の後、ＣＡＴ感受性についての選択は、ＣＡＴ遺伝子を失った細胞を単離する。このような細胞の約５０％は、組み込まれる配列との組換えを受けている。
【００７３】
ポジティブ選択マーカー、および必要に応じてネガティブ選択マーカー、ならびにＤＮＡフラグメントを有する自殺ベクターは、このフラグメントに相同な染色体ＤＮＡにおける部位で単一の交叉により宿主染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。組換えにより、相同配列の直接反復に隣接する組み込みベクターが生成される。いくつかの細胞において、反復の間の引き続く組換えは、ベクターの切り出し、およびゲノムによるベクターに由来する所望される変異の獲得または野生型へのゲノムの回復のいずれかを生じる。
【００７４】
本発明の方法において、適切なベクターにクローニングされた遺伝子ライブラリーの移入の後、ポジティブ選択を、ポジティブ選択マーカーの発現について適用する。自殺ベクターの組み込まれていないコピーが細胞から迅速に排除されるために、この選択は、宿主染色体にベクターを組み込んだ細胞を富化する。次いで、ポジティブ選択に生き残った細胞を増殖し得、そしてネガティブ選択に供し得るか、またはポジティブ選択マーカーの喪失についてスクリーニングされ得る。ネガティブ選択は、ネガティブ選択マーカーを発現する細胞に対して選択する。従って、組み込まれたベクターを保持したままの細胞は、ネガティブマーカーを発現し、そして選択的に排除される。両方の回の選択に生き残った細胞は、最初にベクターを組み込み、そしてベクターを選択的に排除した細胞である。これらの細胞は、ベクターとの相同組換えにより改変された遺伝子を有する細胞について富化される。このプロセスは、遺伝情報の単一の交換により多様化させる。しかし、このプロセスが、同じベクターまたは富化された組換え集団由来のプールされたＤＮＡのＰＣＲにより生成されたフラグメントのライブラリーのいずれかで反復され、このことにより、組換えの各回で指数関数的に増強される標的にされた遺伝子の多様性を生じる場合、このプロセスは、反復的に繰り返され、選択が、所望されるように行われる。
【００７５】
（３．遺伝子の個別化した（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ）最適化）
一般に、上記の方法は、最適化される遺伝子の数、それらのマッピング位置、またはそれらの機能を認識する必要はない。しかし、いくつかの場合において、この情報が１つ以上の遺伝子について利用可能である場合は、これが利用され得る。例えば、進化により獲得される特性が、増強された細胞の組換えの場合、（多くの他の遺伝子（未知および既知）がさらに寄与し得るとしても）重要である可能性が高い遺伝子はｒｅｃＡである。この状況において、ｒｅｃＡ遺伝子は、他の候補遺伝子とは別に、少なくとも一部進化され得る。このｒｅｃＡ遺伝子は、第Ｖ節に記載の反復的組換えの任意の方法により進化され得る。簡潔には、このアプローチは、ｒｅｃＡ遺伝子の多様な形態を得ること、形態を組み換えさせること、改善された特性を有する組換え体を選択すること、ならびにこの組換え体をさらなる回の組換えおよび選択に供することを含む。ｒｅｃＡの個別化された改善における任意の時点で、このｒｅｃＡの多様性形態は、本明細書中に記載の一般的方法において使用されるライブラリー中の他の遺伝子をコードするフラグメントとともにプールされ得る。このようにして、このライブラリーは、獲得しようとされる特性に対して重要であることが公知の遺伝子において、他の場合におけるよりも高い割合の改変体を含むように播種される。
【００７６】
１つの例（図２０Ｂに例示される）において、染色体遺伝子（例えば、ＵＲＡ３）の非機能的（変異された）バージョンを有するプラスミドが構築される。ここで野生型遺伝子は、薬物（この場合は、５−フルオロオロチン酸）に対する感受性を付与する。このプラスミドはまた、選択マーカー（カナマイシンのような別の薬物に対する耐性）およびｒｅｃＡ改変体のライブラリーを有する。プラスミドの細胞への形質転換は、ｒｅｃＡ改変体の発現を生じ、これらの改変体のいくつかは、増加した割合で相同組換えを触媒する。相同組換えが生じた細胞は、プラスミド上の選択薬物に対して、そしてこの遺伝子の染色体コピーの破壊のために５−フルオロオロチン酸に対して耐性である。最も高い割合の相同組換えを与えるｒｅｃＡ改変体は相同組換え体のプールに最も高度に示される。変異体ｒｅｃＡ遺伝子は、ＰＣＲされ、再シャッフルされ、このプラスミドにクローニングしなおされたことによってこのプールから単離され得、そしてこのプロセスが繰り返され得る。他の配列をｒｅｃＡの代わりに挿入して、相同組換えシステムの他の成分を進化させ得る。
【００７７】
（４．シャッフリングのためのＤＮＡ基質の採取）
いくつかのシャッフリング方法において、ＤＮＡ基質は、天然の供給源から単離され、そして扱いにくい（ｒｅｃａｌｓｉｔｒａｎｔ）不純物（酵素反応を汚染する）に起因して、ＤＮＡ改変酵素もしくはＤＮＡ重合酵素により容易に操作されない。このような困難性は、採取株によりＤＮＡ基質をプロセシングすることにより回避され得る。採取株は、代表的には、天然の形質転換能（ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ）および実質的多様性を有する配列（例えば、わずか７５％配列同一性を示す配列）間の相同組換えについての受容力（ｃａｐａｃｉｔｙ）を有する細胞型である。採取株は、標的生物由来のＤＮＡにおける目的の遺伝子または他の領域に隣接する２つのセグメントにそれぞれ相補的な、２つのセグメントが隣接するネガティブ選択マーカーをコードするベクターを有する。採取株は、標的生物由来のＤＮＡのフラグメントと接触される。フラグメントは、元来の能力または本明細書中に記載の他の方法により取り込まれ、そして標的生物由来の目的のフラグメントは採取株のベクターと組み換わり、ネガティブ選択マーカーの喪失を引き起こす。ネガティブ選択マーカーに対する選択は、目的のフラグメントを取り込んだ細胞の単離を可能にする。シャッフリングは、採取株（例えば、ＲｅｃＥ／Ｔ株）において行われ得るか、またはベクターは、インビトロでのシャッフリングのために採取株から単離され得るか、もしくはインビボでのシャッフリングのために異なる細胞型に移入され得る。あるいは、このベクターは、接合、プロトプラスト融合、または電気融合（ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ）により異なる細胞型に移入され得る。適切な採取株の例は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ｍｕｔＳである（ＭｅｌｎｉｋｏｖおよびＹｏｕｎｇｍａｎ、（１９９９）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７（４）：１０５６−１０６２）。この株は、元来形質転換能があり、そして非配列特異的様式で取り込む。また、ｍｕｔＳ変異のために、この株は、わずか７５％配列同一性を示す配列の相同組換えが可能である。
【００７８】
（ＩＶ．適用）
（Ａ．組換え形成性（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ））
細胞進化全体の１つの目標は、組換えについて改善された能力を有する細胞を生成することである。このような細胞は分子遺伝学の種々の目的に有用であり、これには、第５節に記載される反復的な配列組換えのインビボ形式を含む。遺伝子組換えに関与する約３０遺伝子（例えば、ｒｅｃＡ，ｒｅｃＢ，ｒｅｃＣ，ｒｅｃＤ，ｒｅｃＥ，ｒｅｃＦ，ｒｅｃＧ，ｒｅｃＯ，ｒｅｃＱ，ｒｅｃＲ，ｒｅｃＴ，ｒｕｖＡ，ｒｕｖＢ，ｒｕｖＣ，ｓｂｃＢ，ｓｓｂ，ｔｏｐＡ，ｇｙｒＡおよびＢ，ｌｉｇ，ｐｏｌＡ，ｕｖｒＤ，Ｅ，ｒｅｃＬ，ｍｕｔＤ，ｍｕｔＨ，ｍｕｔＬ，ｍｕｔＴ，ｍｕｔＵ，ｈｅｌＤ）およびＤＮＡ部位（例えば、ｃｈｉ，ｒｅｃＮ、ｓｂｃＣ）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて同定されており、そしてこれらの遺伝子のいくつかのコグネイト形態が、他の生物体で見出されている（例えば、酵母におけるｒａｄ５１、ｒａｄ５５〜ｒａｄ５７、Ｄｍｃ１（Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８，４０１−４６５（１９９４）；ＫｏｗａｌｃｚｋｏｗｓｋｉおよびＺａｒｌｉｎｇ、前出を参照のこと）、ならびにＲａｄ５１およびＤｍｃ１のヒトホモログが同定されている（Ｓａｎｄｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４，２１２５−２１３２（１９９６）を参照のこと））少なくともいくつかのＥ．ｃｏｌｉ遺伝子（ｒｅｃＡを含む）は、哺乳動物細胞において機能的であり、そしてＳＶ４０ラージＴ抗原核標的化配列との融合体として核に標的され得る（Ｒｅｉｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，３０９４−３０９８（１９９６））。さらに、ミスマッチ修復遺伝子（例えば、ｍｕｔＬ，ｍｕｔＳ，ｍｕｔＨ，ｍｕｔＴ）の変異は、相同性の必要性を緩和し、そしてより異なる配列間の組換えを可能にする（Ｒａｙｓｓｉｇｕｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２，３９６−４０１（１９８９））。異なる株間の組換えの程度は、ミスマッチ修復遺伝子の損傷およびＳＯＳ遺伝子の刺激によって増強され得る。これらは、適切な変異株の使用および／またはＳＯＳを刺激して、かつミスマッチ修復遺伝子を阻害することが見出されている代謝ストレス条件下での培養によって達成され得る。Ｖｕｌｉｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（１９９７）。さらに、これは、選択的なインヒビターに対する曝露によってミスマッチ修復遺伝子の産物を損傷することにより達成され得る。
【００７９】
組換えのための出発基質は、上記の一般的原則に従って選択される。つまり、この基質は、組換え遺伝子または組換え部位を含む、ゲノム全体あるいはその画分であり得る。本質的にランダムなフラグメントの大きいライブラリーは、１以上の公知の組換え遺伝子（例えば、ｒｅｃＡ）の改変体を構成するフラグメントのコレクションを播種され得る。あるいは、ライブラリーは種々の公知の組換え遺伝子および組換え部位の改変形態を混合することによって形成され得る。
【００８０】
フラグメントのライブラリーは、改善されるべきレシピエント細胞に導入され、そして組換えが生じ、改変された細胞を生成する。このレシピエント細胞は、好ましくはマーカー遺伝子を含み、このマーカー遺伝子の発現は、組換えによって補正され得る様式で無能化されている。例えば、この細胞は、異なる部位で変異を有する２コピーのマーカー遺伝子を含み得、これらのコピーは野生型遺伝子を生成するために組み換わり得る。適切なマーカー遺伝子は緑色蛍光タンパク質である。ベクターは、タンパク質のＮ末端付近に終止コドンを有する１コピーのＧＦＰ、およびタンパク質のＣ末端付近に終止コドンを有する別のＧＦＰのコピーをコードするよう構築され得る。分子のそれぞれの末端の終止コドンの間の距離は、５００ｂｐであり、そして組換え事象の２５％が活性なＧＦＰを生じる。細胞中のＧＦＰの発現は、細胞が相同組換え可能であり、終止コドン間で組み換わり、連続するコード配列を生成することを合図する。ＧＦＰを発現する細胞についてのスクリーニングによって、組換え能力が最も高い細胞を富化する。同じ型のスクリーニングは、引き続く回の組換え後に使用され得る。しかし、前回に使用した選択マーカーが自殺ベクター上に存在しない限り、引き続く回は、異なる複製起点を保持する第二のベクター内の第二の無能化スクリーニングマーカーまたは前回に使用したベクターに対する異なるポジティブ選択マーカーを使用するべきである。
【００８１】
（Ｂ．複数のゲノムコピー数−−遺伝子反復）
富化培地中で増殖された定常期培養物中の大半の細菌細胞は、２、４または８個のゲノムを有する。最小培地において、細胞は１または２個のゲノムを有する。従って、細菌細胞あたりのゲノム数は、細胞が定常期に入るときのその細胞の増殖速度に依存する。このことは、迅速に増殖する細胞が、複数の複製フォークを有し、停止後の細胞中にいくつかのゲノムが生じるためである。ゲノム数は株依存的であるが、試験した全ての株が定常期に１より多い染色体を有する。定常期細胞でのゲノム数は、時間と共に減少する。これは、染色体全体のフラグメント化および分解に起因するようであり、これは哺乳動物におけるアポトーシスに類似する。複数のゲノムコピーを有する細胞中のゲノムのこのフラグメント化は、多数の組換えおよび変異を生じる。有用な変異体は、それらが増殖しつづけるのを可能にするエネルギー供給源の使用方法を見出し得る。複数のゲノムまたは遺伝子反復性の細胞は、変異誘発にさらにより耐性であり、選択された形質により速く改善され得る。
【００８２】
いくつかの細胞型（例えば、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉａｎｓ（ＤａｌｙおよびＭｉｎｔｏｎ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７，５４９５−５５０５（１９９５）））は、細胞周期を通して倍数性を示す。この細胞型は、多コピーのゲノムの存在に起因して、高度に放射耐性である。ゲノム間の高頻度の組換えは、種々のＤＮＡ損傷薬剤によって誘導される変異の迅速な除去を可能にする。
【００８３】
本発明の方法の目的は、Ｄｅｉｎｏｃｃｏｃｕｓ ｒａｄｉａｎｓのゲノムコピー数に近似する増加したゲノムコピー数を有するよう、他の細胞型を進化することである。好ましくは、増加したコピー数は、全てまたはほとんどの増殖条件における、その細胞周期の全てまたはほとんどを通して維持される。そのような細胞の複数のゲノムコピーの存在は、これらの細胞において、細胞内の異なるゲノム中の遺伝子のコピー間、および細胞内ゲノムとトランスフェクトされたフラグメントとの間の両方で、より高頻度の相同組換えを生じる。増加した組換え頻度は、その細胞を、他の有用な特性を獲得するためにより迅速に進化されることを可能にする。
【００８４】
組換えのための出発基質は、そのわずか数個がゲノムコピー数に関連する遺伝子の多様なライブラリー、ゲノムコピー数における役割を有すること公知であるか、またはそれが疑われる遺伝子の改変体から形成される焦点を合わせたライブラリーであるか、あるいはその２つの組み合わせであり得る。一般的な役割として、コピー数の増加が、複製に関与する遺伝子および細胞中隔形成の進化によって達成され、その結果、細胞中隔形成が複製を障害することなく抑制されることを予測する。複製に関連する遺伝子としては、ｔｕｓ，ｘｅｒＣ，ｘｅｒＤ，ｄｉｆ，ｇｙｒＡ，ｇｙｒＢ，ｐａｒＥ，ｐａｒＣ，ｄｉｆ，ＴｅｒＡ，ＴｅｒＢ，ＴｅｒＣ，ＴｅｒＤ，ＴｅｒＥ，ＴｅｒＦが挙げられ、そして染色体の分割および遺伝子コピー数に影響する遺伝子としては、ｍｉｎＤ，ｍｕｋＡ（ｔｏｌＣ），ｍｕｋＢ，ｍｕｋＣ，ｍｕｋＤ，ｓｐｏＯＪ，ｓｐｏＩＩＩＥが挙げられる（ＷａｋｅおよびＥｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２９，４１−６７，１９９５））。基質の有用な供給源は、複数の遺伝子コピー数の所望の表現型を有することが公知のＤｅｉｎｏｃｃｏｃｕｓ ｒａｄｉａｎｓのような細胞型のゲノムである。上記基質と同様、または上記基質に代わって、細胞中隔形成に関与することが公知の遺伝子に対するタンパク質をコードするフラグメントまたはアンチセンスＲＮＡインヒビターもまた、使用され得る。
【００８５】
天然において、細胞型における複数のゲノムコピーの存在は、このコピー数を維持するのに必要とされるより多くの栄養要求性に起因して、通常有利ではない。しかし、人為的条件は、高コピー数について選択するために考案され得る。組換えゲノムを有する改変された細胞は、富化培地（この条件において、複数のコピー数が不利であるべきではない）中で増殖され、そして変異原（例えば、紫外線照射またはγ照射あるいは化学変異原（例えば、マイトマイシン、亜硝酸、光活性化ソラレン））の単独または組み合わせに曝露され、組換えによって修復を受け入れ可能なＤＮＡ切断を誘導する。これらの条件は、変異のより大きな効率の減少に起因して、複数のコピー数を有する細胞について選択する。変異原への曝露を生き残る改変された細胞は、複数のゲノムのコピーを有する細胞を富化する。所望の場合、選択された細胞を、ゲノムのコピー数について個々に分析し得る（例えば、適切なコントロールを用いる定量的ハイブリダイゼーションにより）。細胞生存選択のいくつかまたは全てのコレクションは、次回の組換えのための基質を提供する。さらに、個々の細胞は、ＤＮＡをより多く含むこれらの細胞について、例えば、ＤＮＡ特異的蛍光化合物を使用するか、光分散を使用して増加サイズを選別するセルソーターを使用して選別され得る。最終的に、細胞周期を通して少なくとも２、４、６、８または１０コピーのゲノムを有する細胞に進化される。同様の形式で、プロトプラストもまた、組換えられ得る。
【００８６】
（Ｃ．分泌）
細菌細胞および真核生物細胞のタンパク質（または代謝物）の分泌経路は、例えば、タンパク質医薬、低分子の薬物または専門薬品の製造のために、所望の分子をより効率的に輸送するよう進化され得る。効率の改善は、複数のサブユニットのアセンブリを必要とするタンパク質（例えば、抗体）または分泌前の広範な翻訳後修飾を必要とするタンパク質について、特に所望される。
【００８７】
分泌効率は、シグナルペプチドコード配列、そのコード配列を切断するか、さもなければ認識するタンパク質をコードする配列、および分泌されるタンパク質のコード配列を含む多くの遺伝子配列に依存し得る。後者は、タンパク質の折り畳み、およびそのタンパク質は膜内に組み込まれ得るか、または膜を横断する容易さに影響し得る。Ｅ．ｃｏｌｉの細菌分泌経路としては、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＤおよびＳｅｃＦ遺伝子が挙げられる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて、主要な遺伝子は、ｓｅｃＡ、ｓｅｃＤ、ｓｅｃＥ、ｓｅｃＦ、ｓｅｃＹ、ｆｆｈ、ｆｔｓＹ、およびこれらと共に５つのシグナルペプチダーゼ遺伝子（ｓｉｐＳ、ｓｉｐＴ、ｓｉｐＵ、ｓｉｐＶおよびｓｉｐＷ）である（Ｋｕｎｓｔら、前出）。翻訳後修飾を必要とするタンパク質について、このような修飾をもたらす遺伝子の進化は、分泌の改善に寄与し得る。同様に、複数のサブユニットのタンパク質のアセンブリにおいて役割を有する発現産物（例えば、シャペロニン）を伴う遺伝子もまた、分泌の改善に寄与する。
【００８８】
組換えのための基質の選択は、上記に議論した一般的原則に従う。この場合、上記に言及された焦点を合わせたライブラリーは、公知の分泌遺伝子の改変体を含む。真核生物タンパク質を発現するように原核生物細胞を進化させるために、組換えのための出発基質は、しばしば、少なくとも一部が真核生物供給源から得られる。この後継（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）フラグメントは、レシピエント細胞中の染色体ＤＮＡおよびこのような細胞中に存在するスクリーニングマーカー構築物の両方での組換えを受け得る（以下を参照のこと）。後者の形態の組換えは、このスクリーニングマーカー構築物中に組み込まれるシグナルコード配列の進化に重要である。改善された分泌は、進化される細胞中のマーカー構築物の封入によってスクリーニングされ得る。このマーカー構築物は、マーカー遺伝子をコードし、このマーカー遺伝子は、発現配列に作動可能に連結され、そして通常シグナルペプチドコード配列に作動可能に連結される。マーカー遺伝子は、時折、目的の組換えタンパク質との融合タンパク質として発現される。このアプローチは、分泌遺伝子と共に組換えタンパク質コード配列を進化させることを所望する場合に有用である。
【００８９】
１つの変形として、このマーカー遺伝子は、細胞に対して毒性の産物をコードし、この細胞は、この産物が分泌されない限りこの構築物を含む。適切な毒素タンパク質としては、ジフテリア毒素およびリシン毒素が挙げられる。このような構築物を保持する改変された細胞の増殖は、この毒素の分泌を改善するよう進化された細胞を選択する。あるいは、このマーカー遺伝子は、公知のレセプターに対するリガンドをコードし得、そしてこのリガンドを保持する細胞は、標識レセプターを使用してＦＡＣＳによって検出され得る。必要に応じて、このようなリガンドは、リン脂質アンカー配列に作動可能に連結され得、この配列は、分泌後に細胞膜表面にこのリガンドを結合する（共有に係る、同時係属中の０８／３０９，３４５を参照のこと）。さらなる変形において、分泌されたマーカータンパク質は、個々の細胞を寒天小滴内に分散させることによって、このマーカータンパク質を分泌する細胞に近接して維持され得る。これは、例えば、細胞懸濁液の液滴形成によって行われる。分泌されたタンパク質は、寒天マトリクス内に拘束され、そして例えば、ＦＡＣＳによって検出され得る。別の変形において、目的のタンパク質は、ｂ−ラクタマーゼまたはアルカリホスファターゼと共に融合タンパク質として発現される。これらの酵素は、市販されている色素原基質（例えば、Ｘ−ｇａｌ）を代謝するが、ペリプラズム内への分泌後のみにこの代謝を行う。従って、細胞コロニー中の有色基質の出現は、融合タンパク質を分泌する能力を示し、そして色の強度は、分泌効率に関連する。
【００９０】
これらのスクリーニングおよび分泌方法によって同定される細胞は、増加した量のタンパク質を分泌する能力を有する。この能力は、分泌の増加および発現の増加に起因し得るか、増加した分泌単独に由来し得る。
【００９１】
（１．発現）
細胞はまた、増加した組換えタンパク質の発現を獲得するよう進化され得る。発現のレベルは、もちろん、組換えタンパク質が発現される構築物および調節配列（例えば、構築物中に含まれる、プロモーター、エンハンサーおよび転写終結部位）に高度に依存する。発現はまた、転写、翻訳後修飾および翻訳における役割を有する多くの宿主遺伝子によって影響され得る。さらに、転写および翻訳のための、リボヌクレチドおよびアミノ酸モノマーの合成に関与する宿主遺伝子は、発現の効率に対する間接的な影響を有し得る。組換えのための基質の選択は、上記に議論された一般的原則に従う。この場合、焦点を合わせたライブラリーは、発現における役割を有する公知の遺伝子の改変体を含む。真核生物タンパク質を発現するように原核生物細胞を進化させるために、組換えのための出発基質は、しばしば、少なくとも一部が真核生物供給源から得られる；この供給源は、タンパク質の分泌および／またはアセンブリに関連するシャペロニンのようなタンパク質をコードする真核生物細胞遺伝子である。この後継フラグメントは、レシピエント細胞中の染色体ＤＮＡおよびこのような細胞中に存在するスクリーニングマーカー構築物の両方での組換えを受け得る（以下を参照のこと）。
【００９２】
改善された発現についてのスクリーニングは、進化される細胞中にレポーター構築物を含むことによってもたらされ得る。このレポーター構築物は、レポータータンパク質（例えば、ＧＦＰ）を発現（および通常は分泌）し、このタンパク質は容易に検出され、そして非毒性である。レポータータンパク質は、単独で発現され得るか、または融合タンパク質として目的のタンパク質と共に発現され得る。レポーター遺伝子が分泌される場合、スクリーニングは、改善された分泌または改善された発現のいずれか、あるいは両方を有する細胞について効率的に選択する。
【００９３】
（２．植物細胞）
反復配列組換えのさらなる適用は、植物細胞およびそれに由来するトランスジェニック植物を、病原性疾患（真菌、ウイルスおよび細菌）、昆虫、化学物質（例えば、塩、セレン、汚染物質、殺虫剤、除草剤など）（例えば、アトラジンまたはグリフォセートを含む）に対する耐性を獲得するように、または化学組成または収量などを改変するよう進化させることである。組換えのための基質は、同様に、ゲノムライブラリー全体、その画分または上記の薬剤の１つに耐性を与えることが公知または推測される遺伝子の改変体を有する焦点を合わせたライブラリーであり得る。しばしば、ライブラリーのフラグメントは、進化される植物とは異なる種から得られる。
【００９４】
ＤＮＡフラグメントは、エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，５８２４（１９８５））を含む標準的な方法、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）のようなウイルスベクターによる感染（Ｈｏｈｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｔｕｍｏｒｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２）５４９−５６０頁；Ｈｏｗｅｌｌ，ＵＳ４，４０７，９５６）、小さいビーズまたは粒子のマトリックス内、あるいはその表面上のいずれかに核酸を有する、小粒子による高速弾道貫入（Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２７，７０−７３（１９８７））、ベクターとしての花粉の使用（ＷＯ８５／０１８５６）、またはＤＮＡフラグメントがクローン化されているＴ−ＤＮＡプラスミドを保持するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの使用によって、植物組織、培養植物細胞、植物小胞子、または植物プロトプラスト内に導入される。このＴ−ＤＮＡプラスミドは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる感染の際に植物細胞に移入され、そして一部は植物ゲノム内に安定に組み込まれる（Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３，４９６−４９８（１９８４）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０，４８０３（１９８３））。
【００９５】
多様性はまた、真菌類プロトプラストについて以下に記載される同様の原理に従って、植物プロトプラスト間での遺伝的交換により生成され得る。植物プロトプラストの形成および融合の手順は、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、米国特許第４，６７７，０６６号；Ａｋａｇｉら、米国特許第５，３６０，７２５号；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、米国特許第５，２５０，４３３号；Ｃｈｅｎｅｙら、米国特許第５，４２６，０４０号に記載される。
【００９６】
組換えが生じそして組換え遺伝子の発現が可能となるに適切な期間のインキュベーションの後、この植物細胞を、獲得されるべき抵抗性に対する薬剤と接触させ、そして生存している細胞を回収する。これらの植物細胞のいくつかもしくは全てを、組換えおよびスクリーニングのさらなるラウンドに供し得る。最終的に、要求される程度の抵抗性を有する植物細胞を獲得する。
【００９７】
次いで、これらの細胞は、トランスジェニック植物へと培養される。培養プロトプラストからの植物の再生は、Ｅｖａｎｓら「Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ １，１２４〜１７６（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３）；Ｄａｖｅｙ，「Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ」Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，（１９８３）１２〜２９頁，（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂａｓａｌ １９８３）；Ｄａｌｅ，「Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ Ｃｒｏｐｓ」Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ（１９８３）３１〜４１頁，（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂａｓｅｌ １９８３）；Ｂｉｎｄｉｎｇ，「Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ」Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，２１〜７３頁，（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９８５）。
【００９８】
上記の方法の変形においては、組換えおよびスクリーニングの１回以上の予備的なラウンドが、植物細胞について記載される一般的な同様のストラテジーに従って、細菌細胞において行われ得る。細菌細胞のより速い増殖速度およびより優れた有効性（ＤＮＡがそのような細胞に導入され得ることに付随する）に起因して、より迅速な進化が、細菌細胞において達成され得る。組換え／スクリーニングの１回以上のラウンドの後、ＤＮＡフラグメントライブラリーを細菌から回収し、そして植物細胞に形質転換する。このライブラリーは、完全ライブラリーまたは焦点を合わせたライブラリーのいずれかであり得る。焦点を合わせたライブラリーは、植物配列、特に、抵抗性を付与することに役割を有することが既知のまたは推測される植物配列に特異的なプライマーからの増幅により作製され得る。
【００９９】
（３．例：アトラジン異化作用プラスミドのコンカテマーアセンブリ）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓアトラジン異化作用遺伝子であるＡｔｚＡおよびＡｔｚＢを、ｐＭＤ１から（ｄｅＳｏｕｚａら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１，３３７３〜３３７８（１９９５）；ｄｅ Ｓｏｕｚａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，４８９４〜４９００（１９９６））ｐＵＣ１８にサブクローニングした。ＡｔｚＡを含有する１．９ｋｂのＡｖａＩフラグメントを末端に充填（ｅｎｄ−ｆｉｌｌ）し、そしてｐＵＣ１８のＡｖａＩ部位に挿入した。ＡｔｚＢを含有する３．９ｋｂのＣｌａＩフラグメントを末端に充填し、そしてｐＵＣ１８のＨｉｎｃＩＩ部位にクローニングした。次いで、ＡｔｚＡをｐＵＣ１８からＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで、ならびにＡｔｚＢをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、そしてこの２つのインサートを、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８に共に連結した。ｐＵＣ１８（全プラスミドサイズ：８．４ｋｂ）中にＡｔｚＡおよびＡｔｚＢを含有する５．８ｋｂのインサートが得られた。
【０１００】
反復的配列組換えを以下のように行った。８．４ｋｂプラスミド全体を、ＤＮａｓｅＩ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｎＣｌ2中で処理し、そして５００ｋｂと２０００ｋｂとの間のフラグメントをゲル精製した）で処理した。このフラグメントを、Ｔｔｈ−ＸＬ酵素およびＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒからの緩衝液（２．５ｍＭ ＭｇＯＡｃ、４００μＭ ｄＮＴＰおよびＤＮＡフラグメントの系列希釈）を使用するＰＣＲ反応にてアセンブリさせた。このアセンブリ反応を、以下のサイクルにプログラムされたＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ「ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ」にて行った：１）９４℃、２０秒；２）９４℃、１５秒；３）４０℃、３０秒；４）７２℃、３０秒＋１サイクルあたり２秒；５）工程２に行く、３９回以上；６）４℃。
【０１０１】
ＡｔｚＡ遺伝子およびＡｔｚＢ遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用するアセンブリ反応から増幅されなかったので、代わりに、フェノール抽出およびエタノール沈殿、次いで、このアセンブリしたＤＮＡをこのプラスミドを直鎖化する制限酵素（ＫｐｎＩ：ｐＵＣ１８のＫｐｎＩ部位はサブクローニングの間に失われ、ＡｔｚＡのＫｐｎＩ部位のみが残っている）で消化することにより、ＤＮＡをこの反応から精製した。直鎖化プラスミドをゲル精製し、一晩自己連結させそしてＥ．ｃｏｌｉ株ＮＭ５２２に形質転換した。（宿主株の選択は適切であった：ごくわずかな粗悪なプラスミドが、他の多くの市販される株（ＴＧ１、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ１２Ｓを含む）から得られた。）
形質転換反応の系列希釈物を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートにプレートした。残りの形質転換体を２５％グリセロール中に作製し、そして−８０℃で凍結させた。一旦、形質転換細胞が力価測定（ｔｉｔｅｒ）されると、凍結細胞を、５００μｇ／ｍｌアトラジンを含有する１５０ｍｍ直径プレートに、２００と５００との間の密度でプレートし、そして３７℃にて増殖させた。
【０１０２】
アトラジンは、５００μｇ／ｍｌで不溶性の沈殿物を形成する。ＡｔｚＡ遺伝子およびＡｔｚＢ遺伝子の産物は、アトラジンを可溶性産物に変化させる。従って、ｐＵＣ１８中に野生型ＡｔｚＡ遺伝子およびＡｔｚＢ遺伝子を含有する細胞は、アトラジンが分解されているハロ（ｈａｌｏ）に取り囲まれる。ＡｔｚＡ酵素およびＡｔｚＢ酵素がより活性になればなるほど、アトラジン含有プレート上に、ハロがより迅速に形成されそして増大していく。最も迅速に最も大きな清澄な領域を形成したポジティブコロニーを取り上げた。（おおよそ）約４０個の最良のコロニーを取り上げ、プールし、５０μｇ／ｍｌアンピシリンの存在下で増殖させ、そしてそれらからプラスミドを調製した。全過程（ＤＮａｓｅ処理からアトラジンプレート上へのプレートまで）を４回反復した（２０００〜４０００コロニー／サイクル）。
【０１０３】
４回目のラウンドで改変を加えた。細胞を、５００μｇ／ｍｌアトラジン、および５００μｇ／ｍｌテルブチルアジン（ｔｅｒｂｕｔｙｌａｚｉｎｅ）（アトラジンアナログ）（これは野生型ＡｔｚＡ遺伝子およびＡｔｚＢ遺伝子に非分解性である）の両方にプレートした。両方の化合物を分解するポジティブ物が得られた。アトラジンクロロヒドロラーゼ（ＡｔｚＡ遺伝子産物）は、野生型遺伝子により生成させたものよりも１０〜１００倍高かった。
【０１０４】
（Ｄ．植物ゲノムシャッフリング）
植物ゲノムシャッフリングは、改良された特性を所望の植物種に与える遺伝子または経路の導入および組換えのために使用される反復的サイクルを可能にする。所望の形質（例えば、除草剤抵抗性、塩抵抗性、害虫抵抗性、または温度抵抗性）を示す任意の植物種（雑草および野生品種を含む）がＤＮＡ供給源として使用され、このＤＮＡは、作物宿主植物種もしくは園芸宿主植物種に導入される。
【０１０５】
供給源植物から調製されたゲノムＤＮＡはフラグメント化され（例えば、ＤＮａｓｅＩ、制限酵素によって、または機械的に）、そして植物ゲノムライブラリーの作製に適したベクター（例えば、ｐＧＡ４８２（Ａｎ．Ｇ．，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４４：４７〜５８））にクローニングされる。このベクターは、植物細胞への遺伝子導入に必要とされるＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの左縁および右縁、ならびにＥ．ｃｏｌｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、および植物での選択のための抗生物質マーカーを含む。マルチクローニング部位が、ゲノムフラグメントの挿入のために提供される。ｃｏｓ配列は、初代ライブラリーのＥ．ｃｏｌｉへのトランスフェクションのためのバクテリオファージλヘッドへの、ＤＮＡの効率的なパッケージングのために存在する。このベクターは、２５〜４０ｋｂのＤＮＡフラグメントを受容する。
【０１０６】
初代ライブラリーはまた、宿主植物細胞を感染および形質転換するために使用されるＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株またはＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株に、直接的にエレクトロポレートされ得る（Ｍａｉｎ，ＧＤら，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４４：４０５−４１２）。あるいは、ＤＮＡは、エレクトロポレーションまたはＰＥＧ媒介性取り込み（Ｂｉｌａｎｇら（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ Ｍａｎｕａｌ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａ１：１〜１６）によってレシピエント植物種のプロトプラストにか、あるいは細胞または組織の粒子ボンバードメント（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，同書，Ａ２：１〜１５）によって導入され得る。必要であれば、Ｔ−ＤＮＡ領域内の抗生物質マーカーは、形質の選択が可能でありさえすれば、最終植物産物が抗生物質遺伝子を含まないように除去され得る。
【０１０７】
安定に形質転換された、形質を獲得している全細胞は、導入されるＤＮＡが付与する抵抗性もしくは耐性に対する因子を含有する固相培地または液体培地で選択される。問題の形質が直接的に選択され得ない場合、形質転換細胞は、抗生物質を用いて選択され得、そしてカルスを形成させ得るかまたは全植物を再生させ得、次いで、その所望の特性についてスクリーニングし得る。
【０１０８】
２回目のサイクルおよびさらなるサイクルは、ゲノムＤＮＡを各々のトランスジェニック株から単離する工程、ならびにそれを１つ以上の他のトランスジェニック株に導入する工程からなる。各ラウンドにおいて、形質転換細胞は、増進した改良について、選択またはスクリーニングされる。複数の形質転換サイクルを使用するプロセスの速度を増すために、植物の再生を最終ラウンドまで延期し得る。プロトプラストまたは形質転換組織から生成されるカルス組織は、ゲノムＤＮＡの供給源および新しい宿主細胞として利用され得る。最終ラウンドの後、稔性植物を再生させ、そしてその子孫を挿入されたＤＮＡのホモ接合性について選択する。最終的に、高レベルの所望の形質を付与するために、相加的もしくは相乗的に組み合わされた複数のインサートを保有する新しい植物が作製される。あるいは、小胞子が、自然発生的な二倍体から生成されたホモ接合体として単離され得る。
【０１０９】
さらに、所望の形質を付与する導入されたＤＮＡは、ベクター内の既知の配列に隣接されるので、これを追跡することが可能となる。ＰＣＲもしくはプラスミド救出（ｒｅｓｃｕｅ）のいずれかがその配列を単離するために使用され、そしてそれらをより詳細に特徴付ける。全長２５〜４０ｋｂインサートの長（ｌｏｎｇ）ＰＣＲ（Ｆｏｏｒｄ，ＯＳおよびＲｏｓｅ，ＥＡ，１９９５，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，６３〜７７頁）は、適切な試薬および技術を用いて、プライマーとしてＴ−ＤＮＡの縁（ｂｏｒｄｅｒ）配列を使用して達成される。ベクターが、Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点、およびＴ−ＤＮＡの縁の間に抗生物質マーカーを含むように改変される場合、挿入されるＤＮＡの末端でのみ切断するまれな切断制限酵素（例えば、ＮｏｔＩまたはＳｆｉＩ）を使用して、供給源植物ＤＮＡを含有するフラグメントが作製される。このフラグメントは、次いで自己連結し、そしてＥ．ｃｏｌｉに形質転換され、そこでプラスミドとして複製される。移入される形質の能力を有する全ＤＮＡまたはそのサブフラグメントは、ＤＮＡシャッフリングによるインビトロでの進化に供され得る。シャッフルされたライブラリーは、本明細書中の任意の方法によって反復して組み換えられ得、次いで宿主植物細胞に導入され得、そしてその改良特性についてスクリーニングされ得る。このようにして、単一および複数遺伝子形質が、ある種から別の種に移入され得、そして植物全体の改良を導くより高い発現または活性のために最適化され得る。この全過程はまた、反復して繰り返され得る。
【０１１０】
あるいは、その細胞は、以下に示されるように、改良された形質について直接的にスクリーニングされた、再生した一倍体植物で形質転換された小胞子であり得る。
【０１１１】
（Ｅ．小胞子の操作）
小胞子は、花粉粒子を生じる一倍体（１ｎ）の雄性胞子である。葯は、初期単一核形成（ｅａｒｌｙ−ｕｎｉｎｕｃｌｅａｔｅ）期から第一有糸分裂期に多数の小胞子を含有する。小胞子は、ほとんどの種について（例えば、イネ（Ｃｈｅｎ，ＣＣ １９９７ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ．１３：４８４〜４８９）、タバコ（Ａｔａｎａｓｓｏｖ，Ｉら １９９８ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３８：１１６９〜１１７８）、Ｔｒａｄｅｓｃａｎｔｉａ（Ｓａｖａｇｅ ＪＲＫおよびＰａｐｗｏｒｔｈ ＤＧ．１９９８ Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ．４２２：３１３〜３２２）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ｐａｒｋ ＳＫら、１９９８ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２５：３７８９〜３７９９）、砂糖大根（Ｍａｊｅｗｓｋａ−Ｓａｗｋａ ＡおよびＲｏｄｒｉｇｕｅｓ−Ｇａｒｃｉａ ＭＩ １９９６ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０９：８５９〜８６６）、Ｂａｒｌｅｙ（Ｏｌｓｅｎ ＦＬ １９９１ Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ １１５：２５５〜２６６）およびアブラナ（Ｂｏｕｔｉｌｌｉｅｒ ＫＡら １９９４ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２６：１７１１〜１７２３）のように）、植物への発生を首尾良く誘導されている。
【０１１２】
小胞子から誘導された植物は、優性に一倍体かまたは二倍体である（まれに、倍数体および異数体）。二倍体植物はホモ接合でかつ稔性であり、そして比較的短い時間で生成され得る。Ｆ１ハイブリッド植物から得られた小胞子は優れた多様性を示し、それゆえ、組換えを研究するための優れたモデルである。さらに、小胞子は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたは他の利用可能な手段によって導入されたＴ−ＤＮＡで形質転換され得、次いで、個々の植物に再生され得る。さらに、プロトプラストは小胞子から作製され得、そしてこれらは、真菌および細菌において生じるものと同様に融合され得る。
【０１１３】
小胞子は、その複雑な倍数性および再生能力に起因して、植物全ゲノムシャッフリングのためのツールを提供する。例えば、４個の親からの花粉が回収されそしてプールされ、次いでその親を受粉するために無作為に使用される場合、その子孫は、２4＝１６の起こり得る組み合わせを有するはずである。この植物が７つの染色体を有すると仮定すると、１６個の子孫から回収される小胞子は、２7×１６＝２０４８の起こり得る染色体の組み合わせを示す。この数は、減数分裂過程が生じる場合にはさらにより大きくなる。二倍体の場合、ホモ接合胚は、多くの場合これらの小胞子から生成され、これらは、除草剤抵抗性または病害抵抗性のような所望の表現形についてスクリーニングされる。さらに、植物油組成に関しては、これらの胚は二等分され得る：一方は分析のため、他方は生存可能な植物への再生のため。
【０１１４】
小胞子（特に、一倍体の小胞子）から生成されたプロトプラストが、プールされそして融合される。プロトプラスト融合により生成された植物から得られた小胞子が再度プールされそして融合され、これにより、得られる小胞子の遺伝的多様性が増大される。
【０１１５】
小胞子は、融合または再生の前に、化学的変異誘発、照射誘導変異誘発、例えばｔ−ＤＮＡ形質転換のような種々の様式の変異誘発に供され得る。生成された新しい変異体は、上記および本明細書に記載される反復的過程により組換えられ得る。
【０１１６】
（Ｆ．例：塩耐性の獲得）
図２１に示されるように、塩耐性植物由来のＤＮＡを単離し、そしてゲノムライブラリーを作製するために使用する。レシピエント種から作製したプロトプラストは、そのゲノムライブラリーを用いて（例えば、エレクトロポレーション、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍなどによって）形質転換／トランスフェクトされる。細胞を、通常の阻害レベルのＮａＣｌを含有する培地上で選択する。新たに獲得した塩耐性を有する細胞のみが、カルス組織に生長する。最良株を選択し、そしてそれらのプールされたＤＮＡからゲノムライブラリーを作製する。これらのライブラリーを、初回ラウンドで形質転換したカルスから作製されたプロトプラストに形質転換する。再度、細胞を、増大させた塩濃度上で選択する。所望レベルの塩耐性が達成された後に、そのカルス組織を誘導して全植物を再生させ得る。これらの植物の子孫を、代表的には、獲得した形質の安定性を確保するために、そのインサートのホモ接合性について分析する。示された工程において、植物の再生または単離、および導入された遺伝子のシャッフリングが、プロトコル全体に加えられ得る。
【０１１７】
（Ｇ．トランスジェニック動物）
（１．導入遺伝子の最適化）
トランスジェネシスの１つの目的は、乳汁中に組換えタンパク質を分泌するトランスジェニック動物（例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウシ）を産生することである。この目的のための導入遺伝子は、代表的に、乳汁タンパク質遺伝子（例えば、αカゼイン、βカゼイン、またはγカゼイン、β−ラクトグロブリン、酸性乳清タンパク質またはα−ラクトアルブミン）由来のプロモーターおよびエンハンサー、シグナル配列、組換えタンパク質コード配列および転写終結部位の作動可能な連結を包含する。必要に応じて、導入遺伝子は、免疫グロブリンのような多重鎖（ｍｕｌｔｉｃｈａｉｎ）タンパク質の複数の鎖をコードし得る。そのような場合、２つの鎖は、通常、調節配列のセットに個々に作動可能に連結される。導入遺伝子は、発現および分泌について、反復的な配列組換えによって最適化され得る。組換えのための適切な基質としては、異なる種または個々の動物からの乳汁タンパク質遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサーのような調節配列が挙げられる。組換えサイクルは、Ｖ節で考察される形式のいずれかによってインビトロまたはインビボで行われ得る。スクリーニングは、上記で考察したような導入遺伝子およびレポーター構築物でトランスフェクトされた乳腺由来細胞（例えば、ＨＣ１１またはＭａｃＴ）の培養物について、インビボで行われる。組換えおよびスクリーニングの数回のサイクルの後、最高レベルの発現および分泌を生じる導入遺伝子が乳腺組織培養細胞から抽出され、そしてトランスジェニック動物へと成熟する胚細胞（例えば、接合体および胚性幹細胞）をトランスフェクトするために使用される。
【０１１８】
（動物全体の最適化）
このアプローチにおいて、後継（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）フラグメントのライブラリーは、胚性細胞（例えば、ＥＳ細胞または接合体）中に形質転換される。このフラグメントは、所望の特性（例えば、成長ホルモン）を与えることが公知の遺伝子の改変体であり得る。あるいは、このフラグメントは、多くの遺伝子を含む部分的または完全なゲノムライブラリーであり得る。
【０１１９】
フラグメントは、通常、Ｇｏｒｄｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１，４１４（１９８４）；Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ（Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｎ．Ｙ．，１９８６）（マウスの胚）；およびＨａｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５，６８０（１９８５）（ウサギおよびブタの胚）；Ｇａｎｄｏｌｆｉら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８１，２３−２８（１９８７）；Ｒｅｘｒｏａｄら、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．６６，９４７−９５３（１９８８）（ヒツジの胚）、ならびにＥｙｅｓｔｏｎｅら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８５，７１５−７２０（１９８９）；Ｃａｍｏｕｓら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．７２，７７９−７８５（１９８４）；およびＨｅｙｍａｎら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２７，５９６８（１９８７）（ウシの胚）に記載されるようなマイクロインジェクションによって接合体中に導入される。次いで、接合体は、成熟されそして胚を妊娠し、そしてトランスジェニック子孫を出産するレシピエントの雌の動物中に導入される。
【０１２０】
あるいは、導入遺伝子は胚性幹細胞（ＥＳ）中に導入され得る。これらの細胞は、インビトロで培養された着床前の胚から得られる（Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３０９，２２５−２５８（１９８４））。導入遺伝子は、電気泳動またはマイクロインジェクションによってこのような細胞中に導入され得る。形質転換されたＥＳ細胞は、非ヒト動物由来の胚盤胞と組み合わされる。このＥＳ細胞は、得られるキメラ動物の生殖系列由来の胚および何らかの胚をコロニー化する。Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１４６８−１４７４（１９８８）を参照のこと。
【０１２１】
接合体が用いられるかまたはＥＳが用いられるかにかかわらず、スクリーニングは、所望の特性（例えば、サイズの増加および／または成長速度）について全ての動物に対して行われる。ＤＮＡは、所望の特性の獲得に向けて進化させた動物から抽出される。次いでこのＤＮＡは、さらなる胚性細胞をトランスフェクトするために使用される。これらの細胞はまた、分割アプローチまたはプールアプローチにおける所望の特性に対して獲得された動物から得られ得る。すなわち、このような動物の１つのサブセット由来のＤＮＡは、別の動物のサブセットから調製される胚性細胞中に形質転換される。あるいは、所望の特性の獲得のために進化させた動物由来のＤＮＡは、新鮮な胚性細胞中にトランスフェクトされ得る。いずれにせよ、トランスフェクトされた細胞は、トランスジェニック動物へと成熟させ、そしてこの動物は、所望の特性のためにさらなる回のスクリーニングに供される。
【０１２２】
図４は、より大きなサイズへ魚を進化させるためのこのアプローチの適用を示す。初めに、成長ホルモン遺伝子の改変体のライブラリーが調製される。この改変体は、天然であり得るかまたは誘導され得る。このライブラリーは、ｒｅｃＡタンパク質でコーティングされ、そして授精した魚卵中にトランスフェクトされる。次いで、魚卵は異なるサイズの魚へと成熟する。次いで、成長ホルモン遺伝子は、大きな魚由来のゲノムＤＮＡのフラグメントが、ＰＣＲによって増幅され、そして次回の組換えに用いられる。あるいは、魚α−ＩＦＮを進化させて、以下に記載されるようなウイルス感染に対する耐性を増強する。
【０１２３】
（３．改良された形質を有する動物を作製するためのトランスジェニック動物（例えば、魚）における発現のための改変型ホルモンの進化）
ホルモンおよびサイトカインは、サイズ、体重、ウイルス耐性、および他の多くの商業的に重要な形質の重要な調節因子である。ＤＮＡシャッフリングは、インビトロアッセイにおいて用いられるこれらのタンパク質について遺伝子を急速に進化させるために用いられる。これは、ヒトαインターフェロン遺伝子の進化によって、マウス細胞上の強力な抗ウイルス活性を有することが実証される。活性における大きな改良は、２サイクルのヒトＩＦＮ遺伝子のファミリーシャッフリングにおいて達成された。
【０１２４】
一般に、細胞におけるウイルス感染に対する耐性を増加させる方法は、動物細胞へ少なくとも１つのシャッフルされたインターフェロン遺伝子を含むシャッフルされたライブラリーを初めに導入して、動物細胞または動物の初期ライブラリーを作製することによって行われ得る。次いで、初期のライブラリーは、ウイルスを用いてチャレンジされる。ウイルスに対して耐性である動物細胞または動物が、初期のライブラリーから選択され、そしてウイルスに対して耐性である複数の動物細胞または動物由来の複数の導入遺伝子が、回収される。この複数の導入遺伝子は、ウイルスを用いて再びチャレンジされる動物細胞または動物の進化させたライブラリーを作製するために回収される。細胞または動物は、ウイルスに対して耐性である進化させたライブラリーから選択される。
【０１２５】
例えば、インビトロでのアッセイを用いて進化させた遺伝子は、改良された株を作製するために動物または植物の生殖質中に導入される。この手順の１つの制限は、しばしばインビトロでのアッセイが、インビボでのアッセイの粗い予測にすぎないことである。しかし、トランスジェニック植物または動物の産生のための改良法を用いて、現在、分子育種を用いて育種させる全ての生物を結婚させ得る。このアプローチは、目的の種の中へとホルモン遺伝子のシャッフルされたライブラリーを導入することである。これは、トランスジェニックあたり１つの単一の遺伝子を用いてか、またはトランスジェニックあたり遺伝子のプールを用いて行われ得る。次いで、子孫は、目的の表現型についてスクリーニングされる。この場合において、インターフェロン遺伝子（例えば、αＩＦＮ）のシャッフルされたライブラリーは、トランスジェニック魚中に導入される。トランスジェニック魚のライブラリーは、ウイルスを用いてチャレンジされる。最も耐性の魚（すなわち、致死チャレンジの生存者か；またはチャレンジの後、最も健康だと考えられるもののいずれか）が、同定される。ＩＦＮ導入遺伝子は、ＰＣＲによって回収され、そしてプール様式（ｐｏｏｌｗｉｓｅ）かまたはペア様式（ｐａｉｒｗｉｓｅ）のいずれかでシャッフルされる。これは、ＩＦＮ遺伝子の進化させたライブラリーを作製する。トランスジェニック魚の第２のライブラリーが作製され、そしてこのプロセスが繰り返される。この方法において、ＩＦＮは、生物全体のアッセイにおいて改良された抗ウイルス活性のために進化させる。
【０１２６】
この手順は、一般的であり、そして目的の遺伝子または遺伝子ファミリーによって影響され、そして定量的に測定され得る任意の形質に対して適用され得る。
【０１２７】
魚のインターフェロン配列データは、日本のカレイ目の魚（ｆｌａｔｆｉｓｈ）（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）について、ｍＲＮＡ配列（Ｔａｍａｉら、（１９９３）「Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｔｆｉｓｈ（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ） ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｃＤＮＡ」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１７４，１８２−１８６；Ｔａｍｉら、（１９９３）「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｌｉｋｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｒｉｖｅｒｅｄ ｆｒｏｍ ｆｌａｔｆｉｓｈ（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ） ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｂｙ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ」Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９３；１１（２）：１２１−１３１もまた参照のこと）として利用可能である。この配列は、この種からＩＦＮ遺伝子をクローン化するために用いられ得る。この配列はまた、魚のさらなる種から同種のインターフェロンをクローン化するためのプローブとして用いられ得る。同様に、さらなる配列情報は、より多くの種の魚のインターフェロンをクローン化するために利用され得る。一旦、インターフェロンのライブラリーがクローン化されると、これらは、改変体のライブラリーを作製するためにファミリーシャッフリングされ得る。
【０１２８】
カレイ目の魚のインターフェロンのタンパク質配列（配列番号１）は以下である：
【０１２９】
【化１】
Figure 0004674329
１つの実施態様において、ＢＨＫ−２１（ハムスター由来の繊維芽細胞株）は、シャッフルされたＩＦＮ発現プラスミドを用いてトランスフェクトされ得る。活性な組換えＩＦＮが生成され、次いでＷＧＡアガロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製される（Ｔａｍａｉら、１９９３ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｃｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．前出）。ＩＦＮの抗ウイルス活性は、ラブドウイルスによってチャレンジされた魚細胞において測定され得る。Ｔａｍｉら、（１９９３）「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｌｉｋｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｆｌａｔｆｉｓｈ（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ） ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｂｙ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ」Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９３；１１（２）：１２１−１３１）。
【０１３０】
（Ｈ．高等生物における総ゲノムシャッフリング−−プール様式循環交配）
本発明は、より高等な真核生物、植物、魚、家畜動物などの大きなコンビナトリアルライブラリーを生成するための手順を提供する。上記に概略化された手順に加えて、雄または雌の配偶子のプール様式組み合わせはまた、大きな多様な分子ライブラリーを作製するために用いられ得る。
【０１３１】
１つの局面において、この手順は、いかなる意図的なスクリーニングなしでもいくつかの世代についての反復的プール交配を含む。これは、生物の対よりは生物のプールが交配され、それによって遺伝的多様性の生成を加速することを除いて、古典的な交配に類似している。
【０１３２】
この方法は、バクテリアの全ての開始集団由来の遺伝情報を有する複数の子孫の生成を生じる細菌のプロトプラストの多様な集団の循環様式に類似している。本明細書中に記載されるプロセスは、分割プール交配ストラテジーを伝える天然の単離物の大きな集団の類似の人工的または天然の交配を行うことである。交配の前に、全ての雄の配偶子（すなわち、花粉、精子など）は、開始集団から単離され、そしてプールされる。次いで、これらは同じ集団由来の雌の配偶子の混合されたプールを「自家」授精させるために用いられる。
【０１３３】
このプロセスは、次の子孫を用いて、いくつかの世代について繰り返される。この世代は、たとえ全ての開始時の「親」ではなくても、多くの親に由来する遺伝情報を有する各々のメンバーを有するコンビナトリアル生物ライブラリーである最後の子孫を有する。このプロセスは、多くの選択物および／またはスクリーニング物が伝えられ得る大きな多様な生物ライブラリーを作製し、そしてそれは洗練された遺伝子のインビトロでの操作を必要としない。しかし、それは、このような生物ずっと短い時間枠において、有用な新規の株（おそらく集団の中で十分に希釈された）の生成を生じる。
【０１３４】
これらのライブラリーは、比較的迅速に（例えば、代表的には、商業的に重要なほとんどの植物について３年未満で、これは、所望の多様性を生じるのに十分である６サイクル以下の循環交配を用いる）作製される。
【０１３５】
これらの方法のさらなる利点は、遺伝的に得られたライブラリーが、農業、水産養殖、および畜産のような領域において生物の多様性（これらは、現在遺伝的に同種である）を提供することである。
【０１３６】
いくつかの生物についてのこれらの方法の例を以下に記載する。
【０１３７】
（１．植物）
植物の集団（例えば、市販の種子／生殖質収集物における全ての異なるトウモロコシ株）を成長し、そして全集団からの花粉が収集およびプールされる。次いで、この混合された花粉集団は、同じ集団を「自家」授精させるために用いられる。授精がコンビナトリアルであるように、自家受粉は妨げられる。交雑は、集団内で可能な全てのペア法の交雑を生じ、そして得られた種子は、各々のこれらのペア法の交雑の多くの可能な結果を生じる。次いで、授精された植物由来の種子は、収集され、プールされ、成長され、そして花粉が再び、収集され、プールされ、そして集団を「自家」授精させるために用いられる。いくつかの世代のみの後、得られる集団は、トウモロコシの非常に多様なコンビナトリアルライブラリーである。このライブラリー由来の種子は収集され、そして所望の形質（例えば、耐塩性、成長速度、生産性、収量、病害耐性など、についてスクリーニングされる。本質的に、任意の植物収集物は、このアプローチによって改変され得る。重要な商業用穀物は、単子葉植物および双子葉植物の両方を含む。単子葉植物は、イネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）（例えば、ＦｅｔｕｃｏｉｄｅａｅおよびＰｏａｃｏｉｄｅａｅ亜科の植物）を含み、これはＡｇｒｏｓｔｉｓ属、Ｐｈｌｅｕｍ属、Ｄａｃｔｙｌｉｓ属、Ｓｏｒｇｕｍ属、Ｓｅｔａｒｉａ属、Ｚｅａ属（例えば、トウモロコシ）、Ｏｒｙｚａ属（例えば、イネ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属（例えば、コムギ）、Ｓｅｃａｌｅ属（例えば、ライムギ）、Ａｖｅｎａ属（例えば、カラスムギ）、Ｈｏｒｄｅｕｍ属（例えば、オオムギ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属、Ｐｏａ属、Ｆｅｓｔｕｃａ属、Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ属、Ｃｙｎｏｄｏｎ属、Ｃｏｉｘ属、Ｏｌｙｒｅａｅ属、Ｐｈａｒｅａｅ属および他の多くの属の植物を含む数百の属を共に含む。Ｇｒａｍｉｎｅａｅ科の植物は、本発明の方法について特に好ましい標的植物である。さらに好ましい標的は、他の商業的に重要な穀物（例えば、Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ科（少なくとも１，０００の属を含み、ヒマワリのような重要な商業用穀物を含む維管束植物の最も大きな科）、およびＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ、すなわちマメ科（これは、エンドウマメ、インゲンマメ、レンズマメ、ラッカセイ、クズイモ、ササゲ、ハッショウマメ、ダイズ、クローバー、アルファルファ、ルピナス、カラスノエンドウ（Ｖｅｔｃｈ）、ミヤコグサ、スイートクローバー、フジ、およびスイートピーのような多くの商業上価値のある穀物を含む数百の属を含む）由来）を含む。本発明の方法に適用可能な一般の穀物は、Ｚｅａ ｍａｙｓ、イネ、ダイズ、モロコシ、コムギ、カラスムギ、オオムギ、キビ、ヒマワリ、およびカノーラを含む。
【０１３８】
このプロセスはまた、異なる種またはより分岐した系統（例えば、トウモロコシと古くからのイネ科との交雑）由来の花粉を用いて行われ得る。異なる植物種は、交雑することを強制され得る。初めの交雑由来の数個の植物のみが、このプロセスを生育可能するために生じなければならない。これらの少数の子孫（例えば、ダイズとトウモロコシとの間の交雑に由来する）は、花粉および卵を生成する。これらの各々は、２つのゲノムの組換えから異なる減数分裂の結果を示す。花粉は収集され、そして本来の子孫を「自家」受粉するために用いられる。次いで、このプロセスは、反復的に行われる。これは、２つ以上の大きなファミリーのシャッフルされたライブラリーを作製する。これは、次いでスクリーニングされ得る。
【０１３９】
上記のストラテジーを、図３０に概略的に例示する。
【０１４０】
（２．魚）
魚の卵を身体の外に産み、雄にこれらの卵に精子をかけさせる魚の天然の性向は、分割してプールされた交配ストラテジーに対する別の機会を提供する。多くの異なる魚（例えば、世界の異なる漁場由来のサケ）由来の卵は、収集され、プールされ、次いで同様に収集されそしてプールされたサケの精子で授精され得る。この授精は、開始集団の全ての可能なペア法の交配を生じる。次いで、得られる子孫は成長され、そして再び精子および卵が収集され、そしてプールされる。これらは、異なる交雑の異なる減数分裂の結果を表す各々の卵および精子を有する。次いで、プールされた精子は、プールされた卵と授精するために用いられ、そしてこのプロセスは反復的に実行される。いくつかの世代の後、次いで得られる子孫は、所望の特性（例えば、サイズ、病害耐性など）について選択およびスクリーニングに供され得る。
【０１４１】
上記のストラテジーを、図３０に概略的に例示する。
【０１４２】
（３．動物）
インビトロでの授精の出現および代理母は、哺乳動物のような動物における総ゲノムシャッフリングの手段を提供する。魚を用いるように、集団（例えば、全て屠殺ウシ由来）からの卵および精子は、収集されそしてプールされる。次いでこのプールされた卵は、プールされた精子を用いてインビトロで授精される。次いで、得られる胚は、発生のために代理母に戻される。上述のように、このプロセスは、所望の特性についてスクリーニングされ得る大きな多様な集団が生じるまで反復的に繰り返される。
【０１４３】
技術的に可能なアプローチは、植物に用いたアプローチに類似する。この場合において、開始集団の雄に由来する精子は、収集およびプールされ、次いでおのプールされたサンプルは、各々の開始集団由来の複数の雌を人工的に授精させるために用いられる。１つ（または数個）のみの精子は、各々の動物において成功するが、これらは、各々の授精について異なるべきである。このプロセスは、全ての雄の子孫由来の精子を収集し、それをプールし、そして全ての雌の子孫を授精させるためにそれを用いることによって繰り返される。このプロセスは、生物ライブラリーを作製するためにいくつかの世代について反復的に実行され、ついでこれらはスクリーニングされ得る。
【０１４４】
（Ｉ．予測ツールとしての急速進化）
循環配列組換えは、試験の下で、薬物に曝露されることに応じた病原性微生物の天然の進化をシミュレートするために用いられ得る。循環配列組換えを用いて、進化は、天然の進化においてよりもより速い速度で進行する。進化の速度の１つの尺度は、微生物が薬物に対する定義されたレベルの耐性を獲得するまで、必要とされる組換えおよびスクリーニングのサイクルの数である。この分析からの情報は、異なる薬物の相対的な価値を比較することにおいて価値があり、そして特に、それらの繰り返された投与の長期の効力を予測することにおいて価値がある。
【０１４５】
この分析において用いられる病原性微生物は、以下のような一般的ヒト感染原である細菌を含む：
【０１４６】
【表３】
Figure 0004674329
およびライム病細菌。進化は、ＤＮＡフラグメントのライブラリーを用いる試験の下で薬物に感受性である細菌の単離物を形質転換することによってもたらされる。このフラグメントは、進化させる細菌の遺伝子の変異型であり得る。標的の薬物が、公知のタンパク質または核酸である場合、対応するゲノムの改変体を含む焦点を合わせたライブラリーが用いられ得る。あるいは、このライブラリーは、他の種類の細菌（特に、代表的に、ヒト組織に宿ることが見出される細菌）に由来し得、それによってインビボでの組換えに利用可能な原材料をシミュレートする。このライブラリーはまた、薬物に対して耐性であることが公知の細菌に由来し得る。組換えを生じさせるためならびに組換え遺伝子を発現させるために適切な期間の形質転換および細菌の増殖の後、この細菌は、試験の下で薬物にこれらを曝露し、次いで生存物を収集することによってスクリーニングされる。生存する細菌は、さらなる回の組換えに供される。次の回は、生存する細菌の１つのサブセット由来のＤＮＡが細菌の第２のサブセットに導入させる分割アプローチおよびプールアプローチによってもたらされ得る。あるいは、ＤＮＡフラグメントの新鮮なライブラリーは、生存する細菌中に導入され得る。選択の次の回は、漸増濃度の薬物で行われ得、それによって選択のストリンジェンシーを増大させる。
【０１４７】
類似のストラテジーは、薬物耐性のウイルス獲得をシミュレートするために用いられ得る。目的は、耐性があったとしても、ゆっくりでのみ獲得され得る薬物を同定することである。進化させるべきウイルスは、少なくとも適度の効果の薬物が利用可能であるヒトにおいて感染を引き起こすウイルスである。組換えのための基質は、誘導された変異体、同じウイルス系統または異なるウイルス属の天然の改変体に由来し得る。薬物の標的が、公知（例えば、ＨＩＶの逆転写酵素遺伝子を阻害するヌクレオチドアナログ）である場合、標的遺伝子の改変体を含む、焦点を合わせたライブラリーが、作製され得る。フラグメントのライブラリーを有するウイルスゲノムの組換えは、通常インビトロで行われる。しかし、フラグメントのライブラリーが、このようなゲノムにおいて含まれ得るウイルスゲノムまたはフラグメントの改変体を構成する状況において、組換えはまた、インビトロで（例えば、複数の基質コピーを用いて細胞をトランスフェクトすることによって）行われ得る（Ｖ節を参照のこと）。組換えウイルスゲノムは、ウイルスによって感染を受けやすい宿主細胞中に導入され、そしてこの細胞は、ウイルスに対して効果的な薬物に（初めは低濃度で）曝露される。この細胞は、任意の非感染させたウイルスを取り除くためにスピンされ得る。感染の一定期間後、子孫のウイルス（少なくとも部分的に薬物に対する耐性を獲得したウイルスについて富化させた子孫のウイルス）は、培養培地から回収され得る。あるいは、ウイルス感染細胞は、ソフトアガーローン（ｌａｗｎ）にプレートされ得、そして耐性ウイルスがプラークから単離され得る。プラークのサイズは、ウイルス耐性の程度のいくつかの指標を提供する。
【０１４８】
スクリーニングを生き残る子孫ウイルスは、予定されたレベルの薬物耐性が獲得されているまで漸増したストリンジェンシーで、さらなる回の組換えおよびスクリーニングに供される。この予定されたレベルの薬物耐性は、過度の副作用を伴わずに患者に対して投与するための最大用量の薬物粒子を反映し得る。この分析は、薬物の種々の組み合わせ（例えば、認可された抗ＨＩＶ薬物の増大するリスト（例えば、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄ４Ｔ、ＴＩＢＯ ８２１５０、ネバリピン（ｎｅｖａｒｉｐｉｎｅ）、３ＴＣ、ｃｒｉｘｉｖａｎおよびｒｉｔｏｎａｖｉｒ））に対する耐性の獲得の調査のために特に価値がある。
【０１４９】
（Ｊ．組換えの進化的重要性）
株の改良は、生物の進化が所望の仕事についてより「適合する」ように指向される。天然において、適合は有性組換えによって容易にされる。有性組換えは、集団に、その中での遺伝的多様性を、例えば、有用な変異を整理統合しそして有害なものを捨てることによって活用させる。この方法において、適合および進化は一飛びで進行し得る。有性生活環の欠如において、集団のメンバーは、無作為変異を連続的に蓄積することによって独立して進化しなければならない。多くの有用な変異は失われるが、有害な変異は蓄積され得る。この手順における適合および進化は、有性進化に比べてゆっくりと進行する。
【０１５０】
図１７に示すように、無性生殖進化は、遅くそして能率の上がらないプロセスである。集団は、群としてよりむしろ個体として移動する。多様な集団は、適合する個体および適合しない個体の分布を生じる単一の親の変異によって生成させる。有性生活環の非存在下において、生存する集団の遺伝情報の各断片は、個体の変異において残存する。「最も適合するもの」の選択は、個体が保有する有用な遺伝情報と共に放棄された多くの「適合する」個体を生じる。無性生殖進化は、一度に１つの遺伝的事象を進め、次いで単一の遺伝的事象の固有の価値によって制限される。有性進化は、より速くそして効果的に移動する。集団内の交配は、集団内の遺伝的情報を整理統合し、そして共に組み合わされた有用な変異を生じる。有用な遺伝情報の組み合わせの結果、これらの親よりもずっとより適合する子孫を生じる。従って、有性進化は、複数の遺伝的事象によってより速く進む。
【０１５１】
数年にわたる植物および動物の交配は、有性組換えを用いることの能力を実証して、特定の仕事に対する複雑なゲノムの進化の急速な進化をもたらした。この一般的原理は、指向された分子進化の速度を加速するためにインビトロでＤＮＡ分子を再結合するためにＤＮＡシャッフリングを用いることによって、さらに実証される。株の改良は、連続無作為変異によって微生物の指向された進化に依存する発酵産業の努力である。この反復プロセスへの組換えの組込みは、株を改良するプロセスを大きく加速する。次いで、これは、現在の発酵プロセスの収益性を増大させ、そして新製品の開発を容易にする。
【０１５２】
（Ｋ．ＤＮＡシャッフリング対天然の組換え−プール様式組換えの有用性）
ＤＮＡシャッフリングは、ＤＮＡ配列の循環組換えを含む。ＤＮＡシャッフリングと天然の有性組換えとの間の有意な差異は、ＤＮＡシャッフリングが複数の親配列に由来するＤＮＡ配列を生成し得るが、有性組換えは、２つの親配列のみに由来するＤＮＡ配列を生成することである（図２５）。
【０１５３】
図２５に示すように、進化の速度は、集団のメンバーが選択事象間で蓄積され得る有用な変異の数によって部分的に制限される。連続無作為変異において、有用な変異は、選択事象あたり１つを蓄積させる。多くの有用な変異は、最良のパフォーマーのために各サイクルを破棄され、そして生存する天然または有害な変異は、これらが獲得され、従って蓄積することが困難なのと同じくらい失うことが困難である。有性進化において、ペア法組換えは、２つの異なる親に由来する変異を、異なる組み合わせにおいて分離させそして組換えさせる。有用な変異は、蓄積され得、そして有害な変異は失われ得る。プール様式組換え（例えば、ＤＮＡシャッフリングによってもたらされる）は、ペア法組換えと同じ利点を有するが、多くの親由来の変異を単一の子孫に整理統合させる。従ってプール様式組換えは、各々の選択事象を蓄積し得る有用な変異の数を増加させるための手段を提供する。図２５におけるグラフは、個体が各々のこれらのプロセスによって蓄積され得る潜在的な変異の数のプロットを示す。組換えは、連続無作為変異に対して指数関数的に優勢であり、そしてこの利点は、組換えし得る親の数と共に指数関数的に増加する。従って、有性組換えは、より保存的である。天然では、有性組換えのペア法の特性は、プール様式組換えから生じ得るＤＮＡ配列において大きな変化を妨げることによって集団内で重要な安定性を提供し得る。しかし、指向された進化の目的のために、プール様式組換えは、より有効である。
【０１５４】
プール様式組換えの結果として集団から生成され得る潜在的多様性は、ペア法組換えから生じる多様性と比較してより広い。さらに、プール様式組換えは、複数の親配列に由来する複数の有益な変異の組み合わせを可能にする。
【０１５５】
分子の多様性の生成におけるプール様式組換え対、ペア法組換えの重要性を実証するため、各々１つの固有の変異のみを含む１０の独立したＤＮＡ配列の交配を考える。変異を有さない（コンセンサス）単一の配列から１０全ての変異を有する配列の範囲のこれらの１０の変異の２10＝１０２４の異なる組み合わせが存在する。このプールが、ペア法組換えによって共に組換えられる場合、コンセンサス、親、および任意の２つの変異の４５の異なる組換えを含む集団は、可能な１０２４の変異組換えの５６、すなわち５％を生じる。あるいは、プールが、プール様式でともに組換えられた場合、１０２４全てが理論上生成して、ライブラリーの多様性において約２０倍の増加を生じる。分子進化における問題に対する固有の回答をさがす場合、より複雑なライブラリーは、より複雑な可能な回答となる。実際、シャッフルされたライブラリーの最も適合するメンバーは、しばしばいくつかの独立した開始配列に由来するいくつかの変異を含む。
【０１５６】
（１．ＤＮＡシャッフリングは、循環ペア法組換えを提供する）
インビトロでのＤＮＡシャッフリングは、複数のＤＮＡ配列の組換えを触媒することによってコンビナトリアル遺伝子ライブラリーの効率的作製を生じる。ＤＮＡシャッフリングの結果は、複数の配列のプール様式組換えを表す集団である一方、このプロセスは、複数のＤＮＡ配列の組換えに同時に依存しないが、それらの循環ペア法組換えにむしろ依存する。小さな遺伝子フラグメントの混合されたプール由来の完全遺伝子のアセンブリは、複数のアニーリングおよび伸張サイクル（プライマーなしのＰＣＲ反応の熱サイクル）を必要とする。各熱サイクルの間に、多くのフラグメントのペアがアニールし、そして大きなキメラＤＮＡフラグメントのコンビナトリアル集団を形成するために伸張される。再アセンブリの初めのサイクルの後、キメラフラグメントは、優勢な２つの異なる親遺伝子由来の配列を含み、理論的に表される「親」配列の全ての可能なペアを有する。これは、集団内の単一の有性生活環の結果に類似している。第２のサイクルの間、これらのキメラフラグメントはお互いを用いてまたは他の小さなフラグメントを用いてアニールし、異なる開始配列の４つまでに由来するキメラを生じ、再び理論的に表される４つの親配列の全ての可能な組み合わせを有する。この第２のサイクルは、単一の有性交雑（親および子孫の両方、近親交配）から生じた全集団に類似している。
【０１５７】
さらなるサイクルは、８、１６、３２などの親配列に由来するキメラを生じ、そして前の集団のさらなる近親交配に類似する。これは、ある島に隔離されるトリの小さな集団（これは、多くの世代について、互いに交配する）から生じる多様性に類似すると考えられ得る。結果は、「プール様式」組換えの結果を模倣するが、経路は、循環ペア法組換えを介する。この理由により、インビトロでのＤＮＡシャッフリングから生じたＤＮＡ分子は、開始「親」配列の「子孫」ではなく、むしろ開始「先祖」分子の初代、２代、３代、ｎ代．．（ｎ＝熱サイクルの数）隔てた子孫である。
【０１５８】
（Ｌ．発酵）
天然産物の産生のための微生物の発酵は、最も古く最も洗練された生体触媒の適用である。工業的微生物は、単一の反応器の中で高価な化学製品への再製可能な供給原料の多工程の転換もたらして、そしてそうすることで数十億ドル産業を触媒する。発酵製品は、ファインケミカルおよび日用の化学製品（例えば、エタノール、乳酸、アミノ酸およびビタミン）から高価な低分子医薬品、タンパク質医薬品、および産業用酵素まで及ぶ。生体触媒の導入については、例えば、ＭｃＣｏｙ（１９９８）Ｃ＆ＥＮ １３−１９を参照のこと。
【０１５９】
これらの製品を市場へ導くことでの成功、および市場の中の競争での成功は、全体の細胞生体触媒の連続した改良に依存する。改良としては以下が挙げられる：所望の産物の収量増加、望まれない共代謝産物の除去、安価な炭素源および窒素源の改良された利用、ならびに発酵槽状態への適応、主な一次代謝産物の産生増大、二次代謝産物の産生増大、酸性条件に対する耐性増大、塩基性条件に対する耐性増大、有機溶媒への耐性増大、高塩状態に対する耐性増大、および高温または低温への耐性増大。任意のこれらの領域における欠点は、高い製造費用、市場のシェアを捕らえることまたは維持することの不可能性、そして市場への有望な製品の導入の失敗を生じ得る。この理由のために、発酵産業は、生産株の改良において重要な財源および人的資源を投資する。
【０１６０】
株の改良のための現在のストラテジーは、発酵状態および産生する生物体の遺伝的操作の経験的および反復の改変に依存する。確立された産業用の生物の分子生物学における進歩がなされている一方、合理的な代謝操作とは、集約的な情報でありそして特徴付けの乏しい産業用の株に対して広範に適用できない。株の改良のために最も広範に実行されるストラテジーは、産生する株の無作為変異および改良された特性を有する変異体のスクリーニングを用いる。成熟株（これらは多くの回の改良に供される）について、これらの努力は、１年あたり産物の力価（ｐｒｏｄｕｃｔ ｔｉｔｒｅ）において１０％の増加を通常提供する。効果的であるが、この古典的ストラテジーは、遅く、困難で、そして高価である。この領域における技術的進歩は、オートメーションおよび株の改良の費用を減少させるつもりでサンプルスクリーニングの処理能力を増大させることに向けられている。しかし、現実の技術的障害が、有意な株の改良をもたらす単一の変異の内在的制限に存在する。本明細書中の方法はこの制限を克服し、そして自動化技術を補足にするため、および株改良プロセスを触媒するために用いられ得るサイクルあたり複数の有用な変異の利用を提供する。
【０１６１】
本明細書中の方法は、生体触媒を従来の方法よりもより速いペースで改良させる。総ゲノムシャッフリングは、伝統的な方法と比較して発酵において用いられる微生物について株の改良の速度を少なくとも２倍にし得る。これは、発酵プロセスの費用の相対的な減少を提供する。新規の製品は市場にすぐに投入され得、生産者は利益ならびに市場のシェアを増大させ得、そして消費者は、高い品質および低い価格のより多くの製品を利用できる。さらに、生産プロセスの増大した効率は、より少ない廃棄物および資源のより節約した使用へと変わっていく。総ゲノムシャッフリングは、サイクルあたりの複数の有用な変異を蓄積する手段を提供し、従って現在の株改良プログラム（ＳＩＰ）の物理的な制限を排除する。
【０１６２】
ＤＮＡシャッフリングは、循環突然変異、組換え、およびＤＮＡ配列の選択を提供する。ＤＮＡシャッフリング媒介組換えと天然の有性組換えとの間の重要な差異は、ＤＮＡシャッフリングが、上述のように、親分子のペア法（２つの親）組換えおよびプール様式（複数の親）組換えの両方に効果を与えることである。天然の組換えは、より保存的であり、そしてペア法組換えに限定される。天然において、ペア法組換えは、プール様式組換えから生じ得る配列またはゲノム構造において大きな飛躍を防ぐことによって集団内で安定性を提供する。しかし、指向された進化の目的のためには、プール様式組換えは魅力的である。なぜならば、複数の親の有益な変異は、優位な子孫を産生するために単一交雑間で組み合わされ得るからである。プール様式組換えは、交雑が多くの株の間で一度に生じることを除いて、古典的株の改良における近交系の交雑に類似する。本質において、プール様式組換えは、２つよりも多い本来の核酸からの遺伝情報を含む新規の核酸の生成を生じる核酸配列の集団の組換えをもたらす事象の配列である。インビトロでのＤＮＡシャッフリングの能力は、大きなコンビナトリアルライブラリーが、循環ペア法のアニーリング反応そして伸張反応（「交配」）によって再アセンブリされるＤＮＡフラグメントの小さなプールから作製され得ることである。記載される多くのインビボ組換え形式（例えば、プラスミド−プラスミド、プラスミド−染色体、ファージ−ファージ、ファージ−染色体、ファージ−プラスミド、夫婦のＤＮＡ−染色体、外来ＤＮＡ−染色体、染色体−染色体、これらは、天然−非天然の形質転換能、形質導入、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合などによって細胞中に導入されるＤＮＡを有する）が、２つのＤＮＡ分子のペア法組換えを主に生じる。従って、組換えの単一サイクルのみについて実行される場合に、これらの形式は、分子の多様性を生じるそれらの能力を固有に制限される。インビトロシャッフリング法によって得られたこのレベルの多様性を生じるために、ペア法交配形式は、反復的（すなわち、多くの世代について）改良された配列についてスクリーニングする前に実行されなければならない。従って、ＤＮＡ配列のプール（例えば、４つの独立した染色体）は、例えば、プロトプラスト融合によって組換えられなければならず、次いでこの組換えの子孫（各々は、ペア法交配の固有の結果を表す）は、選択を伴わずにプールされなければならず、次いで組換えは繰り返され、そして繰り返され、そして繰り返される。このプロセスは、所望の複雑さを有する子孫を生じるのに十分な数のサイクルについて繰り返されるべきである。一度でも十分な多様性が生成されていると、得られた集団は、新規の配列および改良された配列についてスクリーニングされるべきである。
【０１６３】
原核生物において効率的な組換えをもたらすための、いくつかの一般的な方法が存在する。細菌は、既知の性周期自体は有していないが、それらの生物体のゲノムが組換えを受ける天然の機構は存在する。これらのメカニズムとしては、天然の受容能、ファージ媒介性形質導入、および細胞−細胞接合が挙げられる。天然でコンピテントである細菌は、その環境から裸のＤＮＡを効率的に取りむことができる。相同である場合、このＤＮＡは、この細胞のゲノムとの組換えを受け、遺伝的交換を生じる。酵素産業の主要な生産生物体であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓは、このプロセスの実施に伴う有効性について公知である。
【０１６４】
一般化された形質導入において、バクテリオファージは遺伝的交換を媒介する。形質導入するファージは、しばしば、多頭（ｈｅａｄｆｕｌｌ）宿主ゲノムをパッケージングする。これらのファージは新たな宿主に感染し得、そして相同組換えを介して頻繁に組込まれる前者の宿主ゲノムのフラグメントを送達し得る。細胞はまた、接合によって、それ自体の間でＤＮＡを移入し得る。適切な接合因子を含む細胞は、エピソームならびに完全な染色体を、アクセプターゲノムで組換えられ得る適切なアクセプター細胞に移入する。結合体は、微生物についての有性組換えに類似し、そして種内、種間、および属間であり得る。例えば、多くの商業的な抗生物質の生成を担う属である、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種を形質転換する効率的な手段は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のプラスミドの接合伝達による手段である。
【０１６５】
多くの産業的な微生物について、受容能、形質導入するファージ、または稔性因子の知識が欠如している。プロトプラスト融合は、これらの天然の組換え方法に対する汎用的かつ一般的な代替手段として開発されてきた。プロトプラストは、浸透圧安定剤の存在下で溶解性酵素を用いて細胞を処理することにより、細胞壁を除去することによって調製される。融合性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）薬剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））の存在下において、プロトプラストは融合し、そして一過性のハイブリッド（すなわち、融合体（ｆｕｓａｎｔ））を形成するように誘導される。このハイブリッド状態の間に、遺伝的組換えが高頻度で生じ、これは、ゲノムの再分類（ｒｅａｓｓｏｒｔ）を可能にする。最後の重要な工程は、融合プロトプラストからの生細胞の首尾よい分離および再生である。プロトプラスト融合は、種内、種間、および属間であり得、そして原核生物および真核生物の両方に適用されている。さらに、２つを超える細胞を融合することも可能であり、従って、プール様式（ｐｏｏｌｗｉｓｅ）の組換えをもたらすための機構を提供する。稔性因子、形質導入するファージまたは受容能の発達はプロトプラスト融合のために必要とされないが、プロトプラストの形成、融合、および再生のための方法は、代表的に、各生物体について最適化される。プール様式の組換えに適用されるようなプロトプラスト融合は、前出においてより詳細に記載される。
【０１６６】
ＳＩＰの１つの鍵は、産物収量においてわずかな増加を有するいくつかの変異体を数千の変異体から同定するために、独立して使用され得るアッセイを有することである。多くのアッセイ形式における限定因子は、細胞増殖の均一性である。これらの変動は、引き続くアッセイにおける基線可変性の原因である。接種材料の大きさ、および培養環境（温度／湿度）は、細胞増殖変動の原因である。初代培養物を確立するすべての局面の自動化、ならびに最新技術で温度および湿度を制御するインキュベーターは、可変性を減少させる際に有用である。
【０１６７】
変異細胞または胞子は、固体培地上で分離されて、個々の胞子形成コロニーを産生する。自動化コロニー採取機（Ｑ−ｂｏｔ、Ｇｅｎｅｔｉｘ、Ｕ．Ｋ．）を用いて、コロニーを同定し、採取し、そして１０，０００個の異なる変異体を、２つの３ｍｍガラスボール／ウェルを含む９６ウェルマイクロタイターディッシュに接種した。Ｑ−ｂｏｔは、コロニー全体を採取するのではなく、そのコロニーの中心を通るピンを挿入し、そして細胞（または菌糸）および胞子の少量のサンプリングとともに抜け出る。このピンがそのコロニー内に存在する時間、その培養培地を接種する浸漬物の数、およびそのピンがその培地中に存在する時間は各々、接種の大きさに作用し、そして各々は、制御され得そして最適化され得る。Ｑ−ｂｏｔの均一なプロセスは、人間の取り扱いによる誤差を減じ、そして培養物を確立する速度を上昇させる（およそ、１０，０００／４時間）。次いで、これらの培養物を、温度および湿度が制御されたインキュベータ内で振盪する。ガラスボールは、細胞の均一な通気、および発酵槽の羽根と同様に菌糸のフラグメントの分散を促進するにように作用する。この手順の実施態様は、図２８にさらに説明され、これはアッセイのための統合型システムを含む。
【０１６８】
（１．予備スクリーニング）
親株の能力を超える、変異体の能力のわずかな増加を検出する能力は、アッセイの感受性に依存する。改善を有する生物体を見出す機会は、アッセイによってスクリーニングされ得る個々の変異体の数によって増加する。十分な大きさのプールを同定する機会を増加させるために、処理された変異体の数を１０倍まで増加させる予備スクリーニングが使用され得る。一次スクリーニングの目的は、親株と同等かまたはそれより優れた産物力価を有する変異体を迅速に同定すること、およびこれらの変異体のみを液体培養培地に移すことである。
【０１６９】
一次スクリーニングは寒天プレートスクリーニングであり、スクリーニングはＱ−ｂｏｔコロニー採取機によって分析される。アッセイは基本的に異なり得るが、多くは、例えば、コロニーハロ（ｈａｌｏ）の産生を生じる。例えば、抗生物質の生成は、プレート上で、感受性の指示株（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の重層を使用してアッセイされる。抗生物質の生成は、代表的には、生成生物体周辺の除去（ｃｌｅａｒｉｎｇ）帯（指示生物体の成長の阻害）としてアッセイされる。同様に、酵素生成は、酵素基質を含有するプレート上で、生成コロニー周辺の基質改変の帯として検出される活性によってアッセイされ得る。産物力価は、コロニー面積に対するハロ面積の比率と相関する。
【０１７０】
Ｑ−ｂｏｔまたは他の自動化システムは、集団の上位１０％のハロ比率を有するコロニーのみを採取するように命令される（すなわち、１００，０００から１０，０００変異体がプレートでの予備スクリーニングに入れられる）。これは、二次アッセイにおける改善されたクローンの数を増加させ、そしてノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）生産者および低生産者をスクリーニングするための無駄な努力を排除する。これは、二次アッセイの「ヒット率」を改善する。
【０１７１】
（Ｍ．遺伝的交換の促進）
（１．概説）
本発明のいくつかの方法は、細胞間でのｃＤＮＡ交換を誘導する条件下で、細胞を増殖することによって、細胞性ＤＮＡの組換えをもたらす。ＤＮＡ交換は、エレクトロポレーション、微粒子銃、細胞融合のような一般的に適用可能な方法によって、またはいくつかの場合においては、接合、形質導入、またはアグロバクテリウム媒介性移入、および減数分裂によって、促進され得る。例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、Ｔ−ＤＮＡによってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換し得、これは相同組換えおよびギャップ修復機構の両方によって、酵母ゲノムに取りこまれる（Ｐｉｅｒｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（４）、１６１３−８（１９９６））。
【０１７２】
いくつかの方法において、細胞間の初期の多様性（すなわち、ゲノム交換前）は、祖先細胞型の化学的または照射誘導変異誘発によって、必要に応じて、次ぐ所望の表現型についてスクリーニングすることによって誘導される。他の方法において、細胞が異なる個体、株、または種から得られるので、多様性は当然である。
【０１７３】
いくつかのシャッフリング方法において、誘導されたＤＮＡの交換は、組換えの各周期において組換えをもたらす唯一の手段として使用される。他の方法において、誘導された変換は、生物体の天然の有性組換えでの組換えにおいて使用される。他の方法において、誘導された交換および／または天然の有性組換えは、フラグメントライブラリーの導入を用いる組換えにおいて使用される。そのようなフラグメントライブラリーは、総ゲノム、総染色体、機能的または遺伝的に連鎖した遺伝子群、プラスミド、コスミド、ミトコンドリアゲノム、ウイルスゲノム（複製可能および複製不可能）、またはこれらの任意のうちの特定のフラグメントもしくは無作為なフラグメントであり得る。ＤＮＡはベクターに連結され得るか、または遊離形態にあり得る。いくつかのベクターは、宿主ゲノムとの相同組換えまたは非相同組換えを促進する配列を含む。そのようなフラグメントは、組換えを刺激するために、ガラスビーズ、超音波処理、または化学的もしくは酵素的フラグメント化で剪断することによって生じるような、二本鎖切断の断片を含み得る。
【０１７４】
各々の場合において、ＤＮＡは細胞間で交換され得、この後に、これはハイブリッドゲノムを形成するように組換えを受け得る。一般的に、細胞は、スクリーニング前の集団の多様性を増加させるように、反復的に組換えに供される。ハイブリッドゲノムを保有する細胞（例えば、少なくとも１回そして通常は数回の、組換えの後に生成される）を、所望の表現型についてスクリーニングし、そしてこの表現型を有する細胞を単離する。これらの細胞は、反復的な組換え／選択スキームにおいて、さらなる組換え回のための出発物質をさらに形成し得る。
【０１７５】
細胞間のＤＮＡの交換を促進する１つの手段は、細胞の融合による手段（例えば、プロトプラスト融合による手段）である。プロトプラストは、その完全性を維持するための等張性培地または高張性培地に依存する膜結合細胞を残しつつ、細胞からその細胞壁を除去することから生じる。細胞壁が部分的に除去される場合に、得られる細胞は、厳密には、スフェロプラストいわれ、そして完全に除去される場合には、プロトプラストといわれる。しかし、本明細書中で用語プロトプラストは、他に示されない限り、スフェロプラスを含む。
【０１７６】
プロトプラスト融合は、Ｓｈａｆｆｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１６３（１９８０）によって記載され、そして他の例示的な手順は、Ｙｏａｋｕｍら、米国特許第４，６０８，３３９号、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、米国特許第４，６７７，０６６号、およびＳａｍｂｒｏｏｋｅら、第１６節によって記載される。プロトプラスト融合は株間、種間、および属間で報告されている（例えば、酵母とニワトリ赤血球）。
【０１７７】
プロトプラストは、細菌細胞および真核生物細胞（哺乳動物細胞および植物細胞を含む）の両方について、細胞壁を剥離するための化学的処理を含むいくつかの方法によって調製され得る。例えば、細胞壁は、１０〜２０％スクロース、５０ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液中のリゾチームのような、細胞壁分解酵素を用いる消化によって剥離され得る。球状プロトプラストへの細胞の交換は、位相差顕微鏡によってモニターされ得る。プロトプラストはまた、細胞壁合成のインヒビターを補充した培地中での細胞の増殖によって、または細胞壁形成のための能力を欠損した変異株の使用によって調製され得る。好ましくは、真核生物細胞は、α−因子、Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー毒素、レフロナミド（ｒｅｆｌｏｎａｍｉｄｅ）およびアデニレートシクラーゼインヒビターのようなインヒビターを用いる阻止によって、Ｇ１期に同調される。必要に応じて、全てではないがいくつかの融合されるべきプロトプラストは、紫外線照射、ヒドロキシルアミンまたはクペロン（ｃｕｐｆｅｒｏｎ）（Ｒｅｅｖｅｓら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９９、１９３−１９８（１９９２））を用いる処理によって、殺傷され得るか、および／またはそれらの処理によってフラグメント化されたそれらのＤＮＡを有し得る。この状況において、殺傷されたプロトプラストはドナーといわれ、そして生存プロトプラストはアクセプターといわれる。死滅したドナー細胞を使用することは、以下に記載されるように、引き続いてハイブリッドゲノムと融合された細胞を認識する際に有利であり得る。さらに、ドナー細胞においてＤＮＡを粉砕することは、アクセプターＤＮＡとの組換えを刺激するために有利である。必要に応じて、アクセプターおよび／または融合された細胞はまた、さらに組換えを刺激するために、一時的であるが非致死的にＵＶ照射に曝露され得る。
【０１７８】
一旦形成されると、プロトプラストは、種々のオスモライト（ｏｓｍｏｌｙｔｅ）および化合物（例えば、ＤＴＴの存在下の塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、スクロース、ソルビトール）中で安定化され得る。緩衝液、ｐＨ、還元剤、および浸透圧安定剤の組み合わせは、種々の細胞型について最適化され得る。プロトプラストは、化学薬品（例えば、ＰＥＧ、塩化カルシウム、またはプロピオン酸カルシウム）での処理によって、または電気的融合（Ｔｓｏｎｅｖａ、Ａｃｔａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ Ｂｕｌｇａｒｉａ ２４：５３−５９（１９８９）での処理によって融合するように誘導され得る。電場を使用する細胞融合の方法もまた、記載されている。Ｃｈａｎｇ、米国特許第４，９７０，１５４号を参照のこと。条件は、種々の株について最適化され得る。
【０１７９】
融合された細胞は、２つ以上の構成成分プロトプラスト由来のゲノムを含むヘテロカリオンである。融合された細胞は、スクロース勾配沈降または細胞選択によって、融合されていない親細胞から、富化され得る。ヘテロカリオンにおける２つの核は融合され得（核融合）、そしてゲノム間で相同組換えが起こり得る。染色体はまた非対称的に分離し得、総染色体を欠損または獲得した、再生プロトプラストを生じる。組換えの頻度は、紫外線照射での処理によって、あるいはｒｅｃＡもしくは他の組換え遺伝子、または酵母のｒａｄ遺伝子を過剰発現する株、および他の種におけるそれらのコグネイト改変体の使用によって、あるいはＭｕｔＳ、ＭｕｔＬ、またはＭｔＤの遺伝子産物の阻害によって増加され得る。過剰発現は、外因性の組換え遺伝子の導入の結果、または天然の変動または誘導された変異の結果として、外因性の組換え遺伝子を過剰発現する株を選択したことの結果のいずれかであり得る。融合されたプロトプラストは、細胞壁の再生、組換え、およびこのヘテロカリオン由来の子孫細胞への組換えゲノムの分離、ならびに組換え遺伝子の発現を可能にする条件下で増殖される。このプロセスは、繰返し反復されて、任意のセットのプロトプラストまたは細胞の多様性を増加させ得る。融合細胞の回収の後、または必要に応じてその前もしくはその間に、所望の特性への進化について、細胞をスクリーニングまたは選択する。
【０１８０】
その後に、前回における選択／スクリーニングで残存している細胞由来のプロトプラストを調製することによって、引き続く組換え回が実施され得る。プロトプラストは融合され、融合されたプロトプラスト内で組換えが起こり、そして融合されたプロトプラストから細胞を再生する。このプロセスは、再度繰り返し反復されて、出発集団の多様性を増加し得る。プロトプラスト、再生された細胞または再生しつつある細胞を、さらなる選択またはスクリーニングに供する。
【０１８１】
引き続く組換え回は、上記のように分割したプール（ｓｐｌｉｔ ｐｏｏｌ）に基づいて実施され得る。すなわち、前回からの選択／スクリーニングで残存する細胞の第１の亜集団を、プロトプラスト形成のために使用する。前回からの選択／スクリーニングで残存する細胞の第２の亜集団を、ＤＮＡライブラリー調製物のための供給源として使用する。次いで、細胞の第２の亜集団由来のＤＮＡライブラリーを、第１の亜集団由来のプロトプラスト中に形質転換する。ライブラリーは、プロトプラストのゲノムでの組換えを受けて、組換えゲノムを形成する。このプロセスは、選択事象の非存在下で数回繰り返されて、細胞集団の多様性を増加し得る。細胞をプロトプラストから再生し、そして選択／スクリーニングを再生する細胞または再生した細胞に適用する。さらなる変形において、核酸フラグメントの新鮮なライブラリーが、前回からの選択／スクリーニングで残存するプロトプラスト内に導入される。
【０１８２】
プロトプラスト融合を使用するシャッフリングについての例示的様式を、図５に示す。図は、以下の工程を示す：ドナー株およびレシピエント株のプロトプラスト形成、ヘテロカリオン形成、核融合、組換え、個々の細胞への組換えゲノムの分離。必要に応じて、性周期を有する場合に組換えゲノムは、減数分裂および接合の結果として、互いとのさらなる組換えを受け得る。プロトプラスト融合の反復的な回、または反復的な接合／減数分裂がしばしば使用されて、細胞集団の多様性を増加する。組換えのこれらの様式のうちの１つを介して、十分な多様性の集団を達成した後、細胞を所望の特性についてスクリーニングまたは選択する。次いで、選択／スクリーニングで残存する細胞を、本明細書中で述べるような、プロトプラスト化（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｉｎｇ）または他の組換え方法のさらなる回における出発物質として使用し得る。
【０１８３】
（２．ハイブリッド株についての選択）
本発明は、２つ以上の異なる亜集団由来の、親細胞由来の構成成分の融合によって形成される細胞を同定するための選択ストラテジーを提供する。ハイブリッド細胞のための選択は、通常、所望の特性の獲得に対して（遺伝的交換の結果として）進化した細胞について選択またはスクリーニングする前に実施される。大半のそのような選択スキームの基本的前提条件は、２つの開始の亜集団が２つの異なるマーカーを有することである。従って、ハイブリッドゲノムを有する細胞は、両方のマーカーについて選択することによって同定され得る。
【０１８４】
１つのそのようなスキームにおいて、少なくとも１つの細胞の亜集団は、その細胞膜に付着された選択マーカーを保有する。適切な膜マーカーの例としては、ビオチン、フルオレセイン、およびローダミンが挙げられる。マーカーは、アミド基もしくはチオール基に連結され得るか、またはより特異的な誘導体化学（例えば、ヨード−アセテート、ヨードアセトアミド、マレイミド）を通して、連結され得る。例えば、マーカーは以下のように付着され得る。細胞またはプロトプラストは、リジンのアミノ基、または膜タンパク質のＮ末端アミノ基と反応する化学的に活性なリガンドの化学的カップリングを阻害しない緩衝液（例えば、ＰＢＳ）を用いて洗浄される。リガンドは、それ自体アミノ反応性であるか（例えば、イソチオシアネート、スクシンイミジルエステル、スルホニルクロライド）、またはアミン反応性になるために、ヘテロ二官能性リンカー（例えば、ＥＭＣＳ、ＳＩＡＢ、ＳＰＤＰ、ＳＭＢ）によって活性化されるかのいずれかである。リガンドは、タンパク質で誘導体化された磁気ビーズ、または他の捕捉固体支持体によって容易に結合される分子である。例えば、リガンドは、スクシンイミジル活性化されたビオチンであり得る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．：Ｂ−１６０６、Ｂ−２６０３、Ｓ−１５１５、Ｓ−１５８２）。このリンカーは、細胞表面内または細胞表面上にあるタンパク質のアミノ基と反応される。次いで、細胞を洗浄して、第２の選択マーカーを保有する第２の亜集団由来の細胞と接触させる前に過剰な標識剤を除去する。
【０１８５】
細胞の第２の亜集団はまた、第１の亜集団とは異なる膜マーカーであるが、膜マーカーを保有し得る。あるいは、第２の亜集団は、遺伝的マーカーを保有し得る。遺伝的マーカーは、薬剤耐性またはスクリーニング可能な特性（例えば、緑色蛍光タンパク質の発現）のような選択的特性を付与し得る。
【０１８６】
第１および第２の細胞亜集団の融合ならびに回収後、両方の親の亜集団にあるマーカーの存在について、細胞をスクリーニングまたは選択する。例えば、融合体は、特定のビーズへの吸着によって１つの集団について富化され、次いで、これらは、マーカーを発現する集団に対するＦＡＣＳによって選択される。両方のマーカーについての両方のスクリーニングで残存する細胞は、プロトプラスト融合を受けた細胞であり、従って組換えゲノムを有する可能性がより高い。通常、マーカーは個々にスクリーニングされるか、または選択される。膜結合マーカー（例えば、ビオチン）は、細胞膜マーカーについての親和性の富化によって（例えば、アフィニティーマトリクス上での融合細胞のパニングによって）、スクリーニングされ得る。例えば、ビオチン膜標識について、細胞を、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を用いてアフィニティー精製し得る。これらのビーズは、融合されていない宿主細胞を除去するために、数回洗浄される。あるいは、細胞は、膜マーカーに対する抗体に対してパニング（ｐａｎ）され得る。さらなる変形において、膜マーカーが蛍光である場合、マーカーを保有する細胞は、ＦＡＣＳによって同定され得る。遺伝的マーカーに対するスクリーニングはマーカーの性質に依存し、そして薬剤処理培地での増殖能、または緑色蛍光タンパク質についてのＦＡＣＳ選択を含む。第１および第２の細胞集団が異なる波長の蛍光マーカーを有する場合、両方のマーカーがＦＡＣＳ選択によって同時にスクリーニングされ得る。
【０１８７】
ハイブリッド細胞についてのさらなる選択スキームにおいて、融合されるべき第１および第２の細胞集団は、ヘテロ多量体の酵素の異なるサブユニットを発現する。通常は、ヘテロ多量体酵素は２個の異なるサブユニットを有するが、３個、４個、またはそれ以上の異なるサブユニットを有するヘテロ多量体酵素が使用され得る。酵素が２個を超える異なるサブユニットを有する場合、各サブユニットは、異なる細胞の亜集団において発現され得るか（例えば、３つの亜集団における３個のサブユニット）、または１個を超えるサブユニットが同一の細胞の亜集団において発現され得る（例えば、１つの亜集団における１個のサブユニット、第２の亜集団における２個のサブユニット）。２個を超えるサブユニットが使用される場合、２個を超えるプロトプラストのプール様式での組換えについての選択が達成され得る。
【０１８８】
次いで、第１、第２、またはそれ以上の亜集団のコンピテント細胞のゲノムの組み合わせを表すハイブリッド細胞は、インタクトな酵素についてのアッセイによって認識され得る。そのようなアッセイは結合アッセイであり得るが、より代表的には、機能的アッセイ（例えば、酵素の基質を代謝する能力）である。酵素の活性は、例えば、蛍光またはさもなくば容易に検出され得る吸光度もしくは発光スペクトルを伴う、産物への基質のプロセシングによって、容易に検出され得る。このようなアッセイにおいて使用されるヘテロ多量体の酵素の個々のサブユニットは、好ましくは、解離形態では全く酵素活性を有さないか、または少なくとも、解離形態では会合形態よりも有意により低い活性を有する。好ましくは、融合に使用される細胞は、ヘテロ多量体酵素の内因性形態を欠くか、または少なくとも、細胞の融合によって形成されるヘテロ多量体酵素から生じる活性よりも有意により低い内因性活性を有する。
【０１８９】
ペニシリンアシラーゼ酵素である、セファロスポリンアシラーゼ、およびペニシリンアシルトランスフェラーゼは、適切なヘテロ多量体酵素の例である。これらの酵素は単一の遺伝子によってコードされる。この単一の遺伝子は、前酵素として翻訳され、そして翻訳後の自己触媒的なタンパク質分解によって切断されて、スペーサーエンドペプチドを取り除き、そして活性なへテロニ量体酵素を形成するように会合する２個のサブユニットを生成する。いずれのサブユニットも、他方のサブユニットの非存在下では活性ではない。しかし、これらの個々の遺伝子部分を、同時形質転換によって同一の細胞中で発現させる場合、活性が再構築され得る。使用され得る他の酵素は、異なる遺伝子によってコードされるサブユニットを有する（例えば、ｆａｏＡ遺伝子およびｆａｏＢ遺伝子は、Ｐｓｅｕｄｏｎｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉの３−オキソアシル−ＣｏＡチオラーゼをコードする（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ ３２８、８１５−８２０（１９９７））。
【０１９０】
例示的な酵素は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のペニシリンＧアシラーゼであり、これは単一の遺伝子によってコードされる２個のサブユニットを有する。適切な発現調節配列に作動可能に連結される、この２個のサブユニットをコードする遺伝子のフラグメントは、内因性ペニシリンアシラーゼ活性を欠損する第１および第２の細胞の亜集団内にトランスフェクトされる。第１および第２の亜集団由来のコンピテント細胞の融合によって形成される細胞は、アセンブルして機能的な酵素（例えば、ペニシリンアシラーゼ）を形成する、２個のサブユニットを発現する。次いで、融合された細胞は、ペニシリンアシラーゼによって分解されるペニシリンＧを含有する寒天プレート上で選択され得る。
【０１９１】
別の変形において、融合された細胞は、栄養素要求性変異体の補完性によって同定される。細胞の親の亜集団は、既知の栄養素要求性変異体について選択され得る。あるいは、細胞の出発集団における栄養素要求性変異体は、変異促進性薬剤への曝露によって同時に生成され得る。栄養素要求性変異体を有する細胞は、最小培地および完全培地上にレプリカをプレーティングすることによって、選択される。栄養素要求性を生じる損傷は、ゲノム、アミノ酸についての遺伝子内、ヌクレオチド、およびビタミン生合成経路を通して散在されていることが予期される。親の細胞の融合後、融合から生じる細胞は、最小培地で増殖するそれらの能力によって同定され得る。次いで、これらの細胞は、所望の特性への進化についてスクリーニングまたは選択され得る。新鮮な栄養素要求性変異体を生成する変異誘発のさらなる工程は、組換えおよびスクリーニング／選択の引き続く回において組込まれ得る。
【０１９２】
上記の方法の変形において、シャッフリングの各回における栄養素要求性変異体のデノボ産生は、同じ栄養素要求株を再利用することによって回避され得る。例えば、栄養素要求株は、選択マーカーを保有するトランスポゾンを用いるトランスポゾン変異誘発によって生成され得る。栄養素要求株は、レプリカ平板法のようなスクリーニングによって同定される。栄養素要求株をプールし、そして普遍化された形質導入ファージ溶解物を、栄養素要求株細胞の集団上でのファージの増殖によって調製する。栄養素要求株細胞の個々の集団を遺伝的交換に供し、そして遺伝的交換および組換えを受けた細胞を選択するために補完性を使用する。次いで、これらの細胞を所望の特性の獲得についてスクリーニングまたは選択する。次いで、スクリーニングまたは選択で残存する細胞は、形質導入するトランスポゾンライブラリーの導入によって再生される栄養素要求株マーカーを有する。次いで、新たに生成された栄養素要求株細胞は、さらなる遺伝的交換およびスクリーニング／選択に供され得る。
【０１９３】
さらなる変形において、栄養素要求株変異体は、進化されるべき細胞のゲノムの生合成領域と相同な領域によって隣接される選択マーカーを含む、標的ベクターを用いた相同組換えによって生成される。ベクターとゲノムとの間の組換えは、ポジティブ選択マーカーを、栄養素要求株変異体を生じるゲノム中に挿入する。ベクターは、細胞の導入前は線状形態である。必要に応じて、ベクターの導入頻度は、ヘアピン形成においてアニールされる自己相補的オリゴヌクレオチドで、その末端をキャッピングすることによって増加され得る。遺伝的交換およびスクリーニング／選択は、上記のように進行される。各回において、標的化ベクターが再導入され、栄養素要求株マーカーの同一の集団を再生する。
【０１９４】
別の変形において、融合された細胞は、親の細胞の１つの亜集団に存在するゲノムマーカー、および細胞の第２の亜集団に存在するエピソームマーカーをについてスクリーニングすることによって、同定される。例えば、ミトコンドリアを含有する第１の酵母の亜集団は、矮小化（ｐｅｔｉｔｅ）表現型を有する（すなわち、ミトコンドリアを欠損する）第２の酵母の亜集団を補完するために使用され得る。
【０１９５】
さらなる変形において、遺伝的交換は、一方が死滅している２つの細胞の亜集団の間で実施される。細胞は、好ましくは、ＤＮＡフラグメント化因子（例えば、ヒドロキシルアミン、カプフェロン、または照射）に一時的に曝露することによって、殺傷される。次いで、死滅した親の亜集団に存在するマーカーについて、生細胞をスクリーニングする。
【０１９６】
（３．リポソーム媒介性移入）
核酸フラグメントライブラリーがプロトプラスト内に導入される、上記に述べた方法において、核酸は時折、プロトプラストによる取込みを容易にするために、リポソーム中にカプセル化される。プロトプラストによるリポソーム媒介性のＤＮＡの取込みは、Ｒｅｄｆｏｒｄら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８４：５６７−５６９（１９８１）において記載される。リポソームは、大量のＤＮＡをプロトプラストに効率的に送達し得る（Ｄｅｓｈａｙｅｓら、ＥＭＢＯ．Ｊ．４、２７３１−２７３７（１９８５）を参照のこと）。ＰｈｉｌｉｐｐｏｔおよびＳｃｈｕｂｅｒ（編）（１９９５）Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ Ｔｏｏｌｓ ｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎの、例えば、第９節、Ｒｅｍｙら、「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｗｉｔｈ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ」もまた参照のこと。さらに、ＤＮＡは線状フラグメントとして送達され得、これはしばしば総ゲノムよりも組換え形成性（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）である。いくつかの方法において、フラグメントは、リポソーム内にカプセル化される前に変異される。いくつかの方法において、組換えを促進するために、リポソーム内へのカプセル化の前に、フラグメントをＲｅｃＡおよびホモログ、またはヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）と組み合わせる。あるいは、プロトプラストを、致死的用量のニック化試薬で処理し得、次いで融合し得る。残存する細胞は、他のゲノムフラグメントを用いて組み換えることによって修復され、それによって、組換え（従って、所望される多様性の）プロトプラストについて選択するための選択機構を提供する細胞である。
【０１９７】
（４．糸状菌のシャッフリング）
糸状菌は、上記のシャッフリング方法を実施するのに特に適している。糸状菌は、有性生殖に対するそれらの構造に基づいて、４つの主要な分類に分けられる：Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ、ＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓおよびＦｕｎｇｉ Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ（例えば、Ｒｈｉｓｏｐｕｓ、Ｍｕｃｏｒ）は、胞子嚢中に有性胞子を形成する。この胞子は単核または多核であり得、しばしば中隔のある菌糸（多核体）を欠く。Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｓｉｌｌｕｍ）は、減数分裂の結果として子嚢中に有性胞子を産生する。子嚢は、代表的に４つの減数分裂産物を含むが、いくつかは、さらなる減数分裂の結果として８つの減数分裂産物を含む。Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓはキノコ、および黒穂病菌を含み、そして担子器の表面上に有性胞子を形成する。ｈｏｌｏｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ（例えば、キノコ）において、担子器は分裂されない。ｈｅｍｉｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ、（例えば、サビ菌（ｒｕｔ）（Ｕｒｅｄｉｎａｌｅｓ）および黒穂病菌類（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎａｌｅｓ））において、担子器は分裂される。大半のヒト病原体を含むＦｕｎｇｉ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉは、既知の有性世代を有さない。
【０１９８】
真菌は、無性的、有性的、または擬似有性的手段によって生殖され得る。無性生殖は、配偶子の関与を伴わず、そして核融合を伴わない、菌糸の栄養成長、核分裂および細胞分裂に関与する。細胞分裂は、胞子形成、出芽、または菌糸のフラグメント化によって生じ得る。
【０１９９】
有性生殖は、細胞間の遺伝物質をシャッフリングするための機構を提供する。有性生殖周期は、一倍体相と二倍体相の交替によって特徴付けられる。二倍性は、２つの一倍体配偶子の核が融合する場合（核融合）に生じる。配偶子核は、同一の親株に由来し得る（自家授精）（例えば、同株性真菌において）。異株性真菌において、親株は異なる接合型の株に由来する。
【０２００】
二倍体細胞は、減数分裂を通して一倍性に交換される。減数分裂は、染色体の１回の分裂によって達成される核の２回の分裂から本質的になる。１回の減数分裂の産物は、４分子（４つの一倍体核）である。いくつかの場合において、有糸分裂が減数分裂の後に生じ、８つの産物細胞を生じる。結果の細胞の配置（通常は、胞子内に囲まれる）は、親株の配置に類似する。一倍体世代および二倍体世代の長さは、種々の真菌において異なる：例えば、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓおよび多くのＡｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓは、主として一倍体の生活環を有する（すなわち、核融合の直後に減数分裂が生じる）。一方、他のもの（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、その生活環の大半が二倍体である（減数分裂の直ぐ後に核融合が生じる）。有性生殖は、同じ株の細胞間（自家授精）、または異なる株由来の細胞間（他家交配）で生じ得る。
【０２０１】
有性二形性（雌雄異体現象）は、異なる菌糸上での雄性器官と雌性器官の個々の生成である。これは真菌の間では稀な現象であるが、いくつかの例が公知である。ヘテロタリズム（１遺伝子座に２つの対立遺伝子）は、自家不和合性である交配適合性株の間の他家交配を可能にする。最も単純な形態は、２つの対立遺伝子−１遺伝子座の系の接合型／因子であり、これは以下の生物体によって説明される：ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａにおけるＡおよびα；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおけるａおよびα；ＳｃｈｉｚｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＺｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓにおける＋および−；Ｕｓｔｉｌａｇｏにおけるα１およびα２。
【０２０２】
複数対立遺伝子のヘテロタリズムは、いくつかのより高等なＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ（例えば、ＧａｓｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓおよびＨｙｍｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）（これらは、異株性であり、複数の対立遺伝子によって決定されるいくつかの接合型を有する）によって示される。これらの生物体におけるヘテロタリズムは、１つの接合型因子による双極性、または２つの関連のない因子ＡおよびＢによる四極性のいずれかである。安定で稔性のヘテロカリオンの形成は、異なるＡ因子の存在に依存し、そして四極性生物体の場合、同様に異なるＢ因子の存在に依存する。この系は、異系交配を促進し、そして自家交配を回避する際に有効である。異なる交配因子の数は、非常に多く（すなわち、数千）（Ｋｏｔｈｅ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１８、６５−８７（１９９６））、そして親のではない交配因子が組換えによって生じ得る。
【０２０３】
擬似有性生殖は、細胞間の遺伝物質をシャッフリングするためのさらなる手段を提供する。このプロセスは、接合型または配偶子の改善を伴わずに、親のＤＮＡの組換えを可能にする。擬似有性生殖は、異なる核を含む共通の細胞質を生じる菌糸融合によって生じる。２つの核は、ヘテロカリオンを生じる際に独立して分裂され得るが、必要に応じて融合され得る。融合は、染色体の欠失、および相同染色体間にわたる有糸分裂接合を含み得る一倍体化に先行する。プロトプラスト融合は、擬似有性生殖の一形態である。
【０２０４】
上記の４つのクラスの中で、真菌はまた、栄養適合性群（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ）によって分類分けされる。栄養適合性群内の真菌は、互いにヘテロカリオンを形成し得る。従って、真菌の異なる株間での遺伝物質の交換について、真菌は通常、同一の栄養適合性群から調製される。しかし、いくつかの遺伝的交換は、擬似有性生殖の結果として、異なる適合性群由来の真菌の間で生じ得る（Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅら、米国特許第５，６０５，８２０号を参照のこと）。さらに、他の箇所で議論したように、真菌の天然の栄養適合性群は、シャッフリングの結果として拡大され得る。
【０２０５】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐ．ｎｏｔａｔｕｍ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓのいくつかの単離株を核型分析した。一般に、ゲノムサイズは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの間では、２０〜５０Ｍｂの間の範囲である。核型における差異が、しばしば類似の株間で存在し、そしてまた外因性ＤＮＡでの形質転換により引き起こされる。糸状菌遺伝子は、類似のコンセンサス５’および３’スプライス配列を持つ通常サイズが約５０〜１００ｂｐのイントロンを含む。プロモーションおよび停止シグナルは、しばしば、交叉して認識可能であり、１つの真菌（例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）からの遺伝子／経路の、別の真菌（例えば、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）における発現を可能にする。
【０２０６】
真菌細胞壁の主要成分は、キチン（またはキトサン）、β−グルカン、およびマンノタンパク質である。キチンおよびβグルカンは足場を形成し、マンノタンパク質は、壁の間隙率、抗原性および接着性を決める間質性成分である。キチンシンテターゼは、β−（１，４）結合型Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の重合を触媒し、逆平行に走る直鎖を形成する；β−（１，３）−グルカンシンテターゼは、グルコースのホモ重合を触媒する。
【０２０７】
シャッフリングの１つの一般的な目的は、遺伝子工学のため、特に非関連遺伝子のシャッフリングのための有用な宿主になるために真菌を進化させることである。Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびｎｅｕｒｏｓｐｏｒａは、一般に、古典的および分子遺伝学におけるそれらの有性生活環および良く確立された使用のため、そのような操作のための宿主として供するために選択される真菌生物である。別の一般的な目的は、特定化合物（例えば、抗菌剤（ペニシリン類、セファロスポリン類）、抗真菌剤（例えば、エキノカンジン類（ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎｓ）、オーレオバシジン類（ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎｓ））、および木材分解酵素）を作る真菌の能力を改良することである。これらの一般的な目的の間にはいくらかの重複があり、そしてそれ故、いくつかの所望の性質が、両方の目的を達成するために有用である。
【０２０８】
１つの所望の性質は、現在、有性生活環を欠く真菌中への減数分裂器官の導入である（Ｓｈａｒｏｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５１、６０〜６８（１９９６）を参照のこと）。真菌Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（不完全菌）中に有性生活環を導入するためのスキームを図６に示す。プロトプラストの亜集団を、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（これは有性生活環を持つ）およびＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（これは有性生活環を持たない）から形成する。好ましくは、この２つの株は、異なるマーカーを保持する。このＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓプロトプラストは、ＵＶまたはヒドロキシルアミンでの処理により殺傷される。この２つの亜集団を融合して、ヘテロカリオンを形成する。いくつかのヘテロカリオンでは、核が融合し、そしていくつかの組換えが生じる。融合細胞を、新たな細胞壁を生成する条件下で培養し、次いで性的組換えをさせる。次いで組換えゲノムを持つ細胞を選択する（例えば、個々の親株上に存在する原栄養回復マーカーの相補性について選択することにより）。ハイブリッドゲノムを持つ細胞は、有性生活環に必要な遺伝子を獲得したようである可能性が高い。次いで、細胞のプロトプラストを、有性生活環を有することが知られるさらなる細胞の集団（先のラウンドと同じかまたは異なる）の殺傷プロトプラストと同様に交配し得、次いでハイブリッドゲノムを持つ細胞について選択する。
【０２０９】
別の所望の性質は、真菌の変異誘発株の産生である。このような真菌は、マーカー遺伝子を含む真菌株を、機能的産物の発現を損傷したか、または防ぐ１つ以上の変異でシャフルすることにより産生され得る。シャフラントを、ポジィブマーカーの発現について選択する条件下で（発現なしに小量の残存増殖を可能にしながら）増殖させる。最も早く増殖するシャフラントを選択し、次のラウンドのシャッフリングのための出発材料を形成する。
【０２１０】
別の所望の性質は、真菌の宿主範囲を拡大することであり、その結果、その他の栄養適合性群からの真菌とヘテロカリオンを形成し得る。種間の非適合性は、異なる非適合性遺伝子座（「ｈｅｔ」遺伝子座のような）における特異的対立遺伝子の相互作用から生じる。２つの株が、菌糸吻合を受ける場合、致死的な細胞質非適合性反応が、これら遺伝子が異なる場合に生じ得る。株は、完全に適合性であるために同一の遺伝子座を保有しなければならない。これらの遺伝子座のいくつかが、種々の種において同定されており、そしてこの非適合性影響は、幾分付加的である（それ故「部分的非適合性」が生じ得る）。いくつかの耐性およびｈｅｔネガティブ変異体が、これらの生物について記載されている（例えば、Ｄａｌｅｓ＆Ｃｒｏｆｔ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６、１７１７〜１７２４（１９９０））。さらに、耐性遺伝子（ｔｏｌ）が報告され、これは、接合型ヘテロカリオン非適合性を抑制する。シャッフリングは、異なる非適合性群からの株のプロトプラスト間で実施される。好適な形式では、生存アクセプター株およびＵＶ照射死滅アクセプター株を用いる。このＵＶ照射は、ＤＮＡ不活性化ｈｅｔ遺伝子中に変異を導入するために供される。この２つの株は、異なる遺伝マーカーを担う。この株のプロトプラストを融合し、細胞を再生し、そしてマーカーの相補性についてスクリーニングする。シャッフリングおよび選択の次のラウンドを、スクリーニングされて生存する細胞を、ドナー細胞の新たな集団のプロトプラストと融合することにより同様に実施し得る。本明細書に注記されるその他の手順と同様に、プロトプラストの再生から得られる細胞は、必要に応じて、プロトプラストにすることにより拒絶され、そして任意の選択工程の前に１回以上細胞に再生され、スクリーニングされるべき細胞の得られる集団の多様性を増大する。
【０２１１】
別の所望される性質は、通常は、この性質を示さない、ＡｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓおよびＦｕｎｇｉ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ中への複数対立形質ヘテロタリズムの導入である。この接合系は、自己育種なしに異系交配を可能にする。このような接合系は、ＡｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓおよびＦｕｎｇｉ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉを、このような系を有する、ＧａｓｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓまたはＨｙｍｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓからのＤＮＡとシャッフリングすることにより導入され得る。
【０２１２】
別の所望の性質は、シャッフリング宿主として真菌株の使用を促進するためのプロトプラストの自然形成である。ここでは、代表的には、進化されるべき真菌は変異誘発される。進化されるべき真菌の胞子は、完全なプロトプラスト形成には不十分な時間、細胞壁分解剤で簡単に処理され、そして他の真菌の株からのプロトプラストと混合される。２つの異なる亜集団の融合により形成されるプロトプラストは、上記のように、遺伝的またはその他の選択／またはスクリーニングにより同定される。これらのプロトプラストを用いて、菌糸次いで胞子を再生し、これは、次のラウンドのシャッフリングのための出発材料を形成する。次のラウンドでは、少なくともいくつかの生存胞子を、細胞壁除去酵素で、しかし、先のラウンドより短い時間の間処理する。処理後、部分的に裸にされた細胞を、第１の標識で標識する。次いで、これらの細胞を、プロトプラストと混合し、これらは、先のラウンドにおける選択で生存するその他の細胞由来であるか、または新たな真菌の株由来であり得る。これらのプロトプラストは、第２の標識で物理的に標識される。細胞を、プロトプラスト融合のための条件下でインキュベートした後、両方の標識を持つ融合体を選択する。これらの融合体を用いて、シャッフリングの次のラウンドのための菌糸および胞子の生成などをする。結果として、自発的にプロトプラストを形成する子孫（すなわち、細胞壁分解剤の添加なしに）が同定される。本明細書で注記されるその他の手順のように、細胞まはプロトプラストは、繰り返し融合されて、そして任意の選択工程を実施する前に再生され、得られる細胞またはスクリーニングされるべきプロトプラストの多様性を増大し得る。同様に、選択された細胞またはプロトプラストは、繰り返し融合され、そして得られる細胞またはプロトプラスト集団に対して選択を課することなく１サイクルまたは数サイクル繰り返し、それによって最終的にスクリーニングされる細胞またはプロトプラストの多様性を増大し得る。選択工程とともに分散された組換えの複数サイクルを実施するこのプロセスは、所望に応じて反復して繰り返され得る。
【０２１３】
別の所望の性質は、生合成経路における酵素をコードする遺伝子、トランスポータータンパク質をコードする遺伝子、および代謝フラックス制御に関与するタンパク質をコードする遺伝子の獲得および／または改良である。この状況では、この経路の遺伝子は、進化されるべき真菌中に、この経路を所有する真菌の別の株との遺伝的交換によるか、またはこの経路を所有する生物からのフラグメントライブラリーの導入によるかのいずれかにより導入され得る。次いで、これらの真菌の遺伝的材料は、本明細書で論議される種々の手順により、さらなるシャッフリングおよびスクリーニング／選択を受け得る。真菌のシャフラント株は、代謝経路により産生される化合物またはその前駆体の産生について選択／スクリーニングされる。
【０２１４】
別の所望の性質は、熱のような極限条件に対する真菌の安定性を増大することである。この状況では、安定性を与える遺伝子は、このような性質を既に有する株からのＤＮＡで交換するか、またはそのようなＤＮＡを形質転換することにより得られ得る。あるいは、進化されるべき株は、ランダム変異誘発に供され得る。進化されるべき真菌の遺伝的材料は、本出願に記載される任意の手順によりシャフルされ得、シャフラントは、極限条件に対する生存曝露により選択される。
【０２１５】
別の所望の性質は、改変された栄養要求下で増殖する真菌の能力である（例えば、特定の炭素または窒素供給源上の生育）。栄養要求性を改変することは、例えば、価値ある商業的製品を産生するが、難解そしてそれ故高価な栄養要求性を有する天然の単離株に特に価値がある。進化されるべき株は、所望の栄養要求性を有する株からのＤＮＡと遺伝的交換および／または形質転換を受ける。進化されるべき真菌は、次いで、必要に応じて、本出願に記載されるように、さらなるシャッフリングを受け得、そして組換え株が、所望の栄養的状況中で増殖する能力について選択される。必要に応じて、この栄養的状況は、進化されるべき真菌の天然の要求に近接して開始するシャッフリングの連続的なラウンドで変動し、そして引き続くラウンドで所望の栄養要求性に接近する。
【０２１６】
別の所望の性質は、真菌における天然の形質転換能の獲得である。シャッフリングにより天然の形質転換能を獲得する手順は、一般に、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０４４９４に記載されている。代表的には、進化されるべき真菌は、この性質を既に有する細菌株または真菌株からのＤＮＡで遺伝的交換または形質転換を受ける。次いで、組換えゲノムを有する細胞を、選択マーカーを担うプラスミドを取り込む能力により選択する。組換えおよび選択のさらなるラウンドを、上記に記載の任意の手順を用いて実施し得る。
【０２１７】
別の所望の性質は、プロテアーゼおよびＤＮａｓｅの減少または増加する分泌である。この状況では、進化されるべき真菌は、この所望の性質を有することが知られる別の株から交換または形質転換によりＤＮＡを獲得し得る。あるいは、進化されるべき真菌は、ランダム変異誘発を受け得る。進化されるべき真菌は上記のようにシャフルされる。このような酵素の存在、またはその欠如は、個々の単離株からの培養培地を、ペプチドまたはＤＮＡ連結を経由して支持体につないだ蛍光分子と接触させることによりアッセイされ得る。この連結の切断は、検出可能な蛍光を培地中に放出する。
【０２１８】
別の所望の性質は、改変されたトランスポーター（例えばＭＤＲ）を産生する真菌である。このような改変されたトランスポーターは、例えば、新たな二次代謝産物を産生するように進化した真菌で有用であり、細胞中に新たな二次代謝産物の合成に必要な前駆体の侵入を可能にするか、または細胞からの二次代謝産物の流出を可能にする。トランスポーターは、真菌細胞中にトランスポーター改変体のライブラリーの導入、およびこの細胞を有性的または擬似有性的な組換えにより組換えさせることにより進化され得る。前駆体を細胞中にトランスポートする能力でトランスポーターを進化させるために、細胞を、前駆体の存在下で増殖させ、次いで細胞を代謝産物の産生についてスクリーニングする。代謝産物を搬出する能力でトランスポーターを進化させるために、細胞を、代謝産物の産生を支持する条件下で増殖させ、そして培養培地への代謝産物の搬出についてスクリーニングする。
【０２１９】
真菌シャッフリングの一般的方法を図７に示す。凍結ストック、凍結乾燥ストック、または寒天プレートからの新鮮な胞子を用いて、適切な液体培地に接種する（１）。胞子を発芽させ菌糸増殖を得る（２）。菌糸を回収し、そして濾過および／または遠心分離により洗浄する。必要に応じて、試料を、ＤＴＴで前処理し、プロトプラスト形成を促進する（３）。プロトプラスト化は、細胞壁分解酵素（例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ ２３４）の添加により、浸透圧的に安定化する培地中で実施される（例えば、１ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ ＭｇＳＯ4、ｐＨ５．８）（４）。細胞壁分解酵素を、浸透圧的に安定化した溶液を用いて反復洗浄により除去する（５）。プロトプラストは、菌糸、残渣および胞子から、ミラクロス（ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）による濾過、および密度遠心分離により分離され得る（６）。プロトプラストを遠心分離により回収し、そして適切な濃度に再懸濁する。この工程は、ある程度のプロトプラスト融合に至り得る（７）。融合は、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ３３５０）の添加、および／またはＰＥＧ有りまたは無しの反復遠心分離および再懸濁により刺激され得る。電気融合もまた実施され得る（８）。必要に応じて、融合したプロトプラストは、非融合プロトプラストから、スクロース勾配沈降（または上記のその他のスクリーニング方法）により濃縮され得る。融合したプロトプラストは、必要に応じて、紫外線照射で処理され、組換えを促進し得る（９）。プロトプラストを、浸透圧的に安定化した寒天プレート上で培養し、細胞壁を再生させ、そして菌糸を形成する（１０）。この菌糸を用いて胞子を生成し（１１）、これを、次のラウンドのシャッフリングにおける出発材料として用いる（１２）。
【０２２０】
所望の性質に対する選択は、再生菌糸またはそれに由来する胞子のいずれかに対して実施され得る。
【０２２１】
代替的方法では、プロトプラストは、細胞壁合成に必要な１つ以上の酵素の阻害により形成され得る（図８を参照のこと）。このインヒビターは、使用の条件下で、殺真菌性であるよりもむしろ静真菌性であるべきである。インヒビターの例は、（例えば、Ｇｅｏｒｇｏｐａｐａｄａｋｏｕ ＆ Ｗａｌｓｈ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４０、２７９〜２９１（１９９６）；Ｌｙｍａｎ ＆ Ｗａｌｓｈ、Ｄｒｕｇｓ ４４、９〜３５（１９９２））により記載される抗真菌性化合物を含む。その他の例は、キチンシンターゼインヒビター（ポリオキシンまたはニッコマイシン化合物）および／またはグルカンシンターゼインヒビター（例えばエキノカンジン類、パプロカンジン類（ｐａｐｕｌｏｃａｎｄｉｎｓ）、ニューモカンジン類（ｐｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎｓ））を含む。インヒビター類は、浸透圧的に安定化された培地中で適用されるべきである。それらの細胞壁を剥がされた細胞は、遺伝的形質転換／株開発プログラムにおいて、融合されるか、またはそうでなければドナーもしくは宿主として採用され得る。この方法を利用する可能なスキームは、図８に反復して概説される。
【０２２２】
さらなる改変では、プロトプラストは、インタクトな細胞壁を合成するそれらの能力が遺伝的に欠損しているか、または損なわれている真菌の株を用いて調製される（図９を参照のこと）。このような変異体は、一般に、虚弱、浸透圧救済（ｏｓｍｏｔｉｃ−ｒｅｍｅｄｉａｌ）、または細胞壁レスと称され、そして寄託株から得られ得る。このような株の例は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ｏｓ変異株（Ｓｅｌｉｔｒｅｎｎｉｋｏｆｆ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２３、７５７〜７６５（１９８３））を含む。いくつかのこのような変異は温度感受性である。温度感受性株は、選択および増幅の目的の許容温度、およびプロトプラスト形成および融合の目的の非許容温度で増殖させ得る。温度感受性株Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ｏｓ株は、非許容温度でソルボースおよびポリオキシンを含む浸透圧的安定化培地における増殖のとき、プロトプラストとして増殖するが、許容温度でソルビトールを含む培地に移す際に完全細胞を生成すると記載されている。ＵＳ ４，８７３，１９６を参照のこと。
【０２２３】
その他の適切な株は、キチン合成、グルカン合成およびその他の細胞壁関連プロセスに関与する遺伝子の標的化変異誘発により生成され得る。このような遺伝子の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．のＣＨＴ１、ＣＨＴ２およびＣＡＬＩ（またはＣＳＤ２）（Ｇｅｏｒｇｏｐａｐａｄａｋｏｕ ＆ Ｗａｌｓｈ １９９６）；ＥＴＧＩ／ＦＫＳＩ／ＣＮＤＩ／ＣＷＨ５３／ＰＢ ＲＩおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、ＣｈｖＡＩＮｄｖＡ ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＲｈｉｚｏｂｉｕｍにおける相同体を含む。その他の例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのＭＡ、ｏｒｌＢ、ｏｒＩＣ、ＭＤ、ｔｓＥ、およびｂｉｍＧである（Ｂｏｒｇｉａ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４、３７７〜３８９（１９９２））。ＯｒｌＡ１またはｔｓｅ１変異を含むＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓの株は、制限温度で溶解する。これらの株の溶解は、浸透圧安定化により防がれ得、そしてこの変異は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）の添加により補足され得る。ＢｉｍＧ１１変異は、タイプ１プロテインホスファターゼに対するｔｓである（この変異を担う株の生殖系列はキチンを欠き、そして分生子は膨潤しそして溶解する）。その他の適切な遺伝子は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｆｕｍｉｇａｔｕｓのｃｈｓＡ、ｃｈｓＢ、ｃｈｓＣ、ｃｈｓＤおよびｃｈｓＥ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａのｃｈｓ１およびｃｈｓ２；Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓ ＭＭおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｃｈｓ１、２および３である。Ｃｈｓ１は、非必須修復酵素：ｃｈｓ２は隔壁形成に関与し、そしてｃｈｓ３は細胞壁成熟および芽リング形成に関与する。
【０２２４】
その他の有用な株は、ｔｓ株のような、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＬＹ（細胞溶解）変異体（Ｐａｒａｖｉｃｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２、４８９６〜４９０５（１９９２））、およびＰＫＣ１遺伝子欠失を担うＣＬＹ１５株を含む。その他の有用な株は、（アクチンをコードする）ｓｒｂ中のｔｓ変異を含む株ＶＹ１１６０（Ｓｃｈａｄｅら、Ａｃｔａ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．補遺、４１、１９３〜２００（１９９１））、およびカタツムリ腸から単離された細胞壁消化酵素に対して増加した感受性を生じるｓｅｓ変異を持つ株（Ｍｅｔｈａ ＆ Ｇｒｅｇｏｒｙ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１、９９２〜９９９（１９８１））を含む。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの有用な株は、Ｐａｙｔｏｎ ＆ ｄｅ Ｔｉａｎｉ、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１７、２９３〜２９６（１９９０）によって記載されるような浸透圧救済条件致死変異体のような、ｃｈｓ１、ｃｈｓ２、またはｃｈｓ３（キチンシンテターゼをコードする）に変異を有する株；カタツムリ腸から単離された細胞壁消化酵素に対して増加した感受性を持つＣ．ｕｔｉｌｉｓ変異株（Ｍｅｔｈａ ＆ Ｇｒｅｇｏｒｙ、１９８１、前述）；およびＮ．ｃｒａｓｓａ変異株ｏｓ−１、ｏｓ−２、ｏｓ−３、ｏｓ−４、ｏｓ−５、およびｏｓ−６。Ｓｅｌｉｔｒｅｎｎｉｋｏｆｆ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２３、７５７〜７６５（１９８３）を参照のこと。このような変異株は、３７℃で細胞壁なしに増殖および分裂するが、２２℃では細胞壁を生成する。
【０２２５】
標的化変異誘発は、標的化され得るセグメントに隣接する相同領域、これら相同領域間のポジティブ選択マーカーおよびこれら相同領域の外側のネガティブ選択マーカーを含むポジティブ−ネガティブ選択ベクターで細胞を形質転換することにより達成され得る（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、ＵＳ ５，６２７，０５９を参照のこと）。改変例では、このネガティブ選択マーカーは、ポジティブ選択マーカーのアンチセンス転写物であり得る（ＵＳ ５，５２７、６７４を参照のこと）。
【０２２６】
その他の適切な細胞は、選択と組み合わせたランダム変異誘発またはシャッフリング手順により選択され得る。例えば、細胞の最初の亜集団を変異誘発し、変異誘発から回収させ、細胞壁の不完全分解を受けさせ、次いで細胞の第２の亜集団のプロトプラストと接触させる。両方の亜集団からのマーカーを保持するハイブリッド細胞を（上記のように）同定し、そして次のラウンドのシャッフリングにおける出発材料として用いる。この選択スキームは、自発的プロトプラスト形成のための能力を持つ細胞、および増大した組換え形成性を持つ細胞の両方を選択する。
【０２２７】
さらなる改変では、自発的プロトプラスト形成の能力を有する細胞を、本発明の他の方法を用いて進化した増大した組換え形成性を有する細胞と交配し得る。ハイブリッド細胞は、特に、全ゲノムシャッフリングのために適切な宿主である。
【０２２８】
細胞壁合成または維持に関与する酵素における変異を持つ細胞は、自発的プロトプラスト形成に起因して浸透圧保護培養で細胞を増殖させる単なる結果として融合を受け得る。この変異が条件的であれば、細胞を非許容条件にシフトする。プロトプラスト形成および融合は、ＰＥＧまたは電場のような促進因子の添加により加速され得る（Ｐｈｉｌｉｐｏｖａ ＆ Ｖｅｎｋｏｖ、Ｙｅａｓｔ ６、２０５〜２１２（１９９０）；Ｔｓｏｎｅｖａら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５１、６１〜６５（１９８９）を参照のこと）。
【０２２９】
（５．標的化シャッフリング−ホットスポット）
１つの局面では、標的化相同遺伝子は、組換え「ホットスポット」（すなわち、全ゲノムに亘って観察される組換えの平均レベルに比較して組換えの増加したレベルを示す領域）であることが知られるか、またはこのようなホットスポットの近傍にあることが知られるゲノムの特定領域中に（例えば、相同組換えまたは他の標的手順により）クローン化される。得られる組換え株は、反復的に接合される。減数分裂の組換えの間に、相同的組換え遺伝子が組換わり、それによって遺伝子の多様性を増大する。反復接合による組換えのいくつかのサイクルの後、得られる細胞をスクリーニングする。
【０２３０】
（６．酵母におけるシャッフリング法）
酵母は単一細胞として増殖する真菌の亜種である。酵母は、発酵飲料および食品の生産に、燃料としてのエタノール、低分子量化合物の生産に、そしてタンパク質および酵素の異種生産のために用いられている（添付の酵母株のリストおよびそれらの使用を参照のこと）。一般に用いられる酵母の株は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｃａｎｉｄｉａ ｓｐ．およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅを含む。
【０２３１】
酵母におけるクローニングに利用可能であるいくつかのタイプのベクターは、組込みプラスミド（ＹＩｐ）、酵母複製プラスミド（２μ環を基礎にしたベクターのようなＹＲｐ）、酵母エピソームプラスミド（ＹＥｐ）、酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐ）、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。各ベクターは、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、およびＨＩＳ３のようなプラスミドの存在について、またはＵＲＡ３のようなプラスミドの不在（５−フルオロオロチン酸の存在下で増殖される細胞に対して毒性である遺伝子）について選択するために有用なマーカーを保持し得る。
【０２３２】
多くの酵母は有性生活環および無性（栄養）生活環を有する。有性生活環は、細胞が減数分裂を通過するたびごとに、この生物の全ゲノムの組換えを含む。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの二倍体細胞が、窒素および炭素制限条件に曝されるとき、二倍体細胞は減数分裂を行い子嚢を形成する。各子嚢は、４つの一倍体胞子を保有し、これらは、２つの接合型「ａ」および２つの接合型「α」である。豊富な培地に戻した際、反対の接合型の一倍体胞子が接合して再び二倍体細胞を形成する。反対の接合型の子嚢胞子（ａｓｉｏｓｐｏｒｅ）は、子嚢内で接合し得るか、または、例えば、ザイモラーゼで子嚢が分解した場合、一倍体細胞が遊離し、そして他の子嚢からの胞子と接合し得る。この有性生活環は、酵母の内因性ゲノムおよび／または酵母ベクター中に挿入される外因性フラグメントライブラリーをシャフルするためのフォーマットを提供する。このプロセスは、ハイブリッド遺伝子の交換または蓄積、および接合細胞により共有される相同配列のシャッフリングを生じる。
【０２３３】
いくつかの既知の遺伝子における変異を有する酵母株は、シャッフリングに有用な性質を有する。これらの性質は、細胞内の組換えの頻度を増大することおよび自然変異の頻度を増大することを含む。これらの性質は、コード配列の変異の結果であるか、または野生型コード配列の改変された発現（通常過剰発現）の結果であり得る。ＨＯヌクレアーゼは、ＨＭＬａ／αおよびＨＭＲａ／αのＭＡＴ遺伝子座への転移に作用し接合型転換を生じる。この酵素をコードする遺伝子における変異は、それらの接合型を転換せず、そしてライブラリーをかくまうか、まは所望の表現型を有する規定された遺伝子型のような遺伝子型の株間の交配を強制するため、およびスターター株の交雑を防ぐために採用され得る。ＰＭＳ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６は、ミスマッチ修復に関与する。これらの遺伝子における変異はすべて変異誘発遺伝子表現型を有する（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６、６１１０〜６１２０（１９９６））。ＴＯＰ３ ＤＮＡトポイソメラーゼにおける変異は、染色体間相同組換えの６倍増大を持つ（Ｂａｉｌｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２、４９８８〜４９９３（１９９２））。ＲＡＤ５０−５７遺伝子は、照射に対する耐性を与える。Ｒａｄ３は、ピリミジンダイマーの切除において機能する。ＲＡＤ５２は遺伝子変換において機能する。ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＸＲＳ２は、相同的組換えおよび非正統的組換えの両方において機能する。ＨＯＰ１、ＲＥＤ１は、初期減数分裂組換えにおいて機能する（Ｍａｏ−Ｄｒａａｙｅｒ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４４、７１〜８６）。ＨＯＰ１またはＲＥＤ１のいずれかにおける変異は、ＨＩＳ２組変えホットスポットにおいて二本鎖切断を低減する。これら遺伝子が欠損した株は、ＹＡＣ上に保持されたタンデム発現ライブラリーのような超組換え誘発構築物における安定性を維持するために有用である。ＨＰＲ１における変異は、超組換え形成性である。ＨＤＦ１は、ＤＮＡ末端結合活性を有し、そして二本鎖切断修復およびＶ（Ｄ）Ｊ組換えに関与する。この変異を担う株は、プロトプラスト融合またはエレクトロポーレーションのいずれかによるランダムゲノムフラグメントを用いた形質転換に有用である。Ｋａｒ−１は、核合体を防ぐ優性変異である。Ｋａｒ−１は、ドナーから受容株に単一の染色体の直接移入に有用である。この技法は、株間のＹＡＣの移入に広く用いられており、そしてまた進化遺伝子／染色体の他の生物への移入に有用である（Ｍａｒｋｉｅ、ＹＡＣ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１９９６））。ＨＯＴ１は、ｒＤＮＡ反復配列のプロモーターおよびエンハンサー領域内のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ組換えホットスポットである。この遺伝子座は、恐らくその高レベル転写に起因して、隣接配列における有糸分裂組換えを誘導する。この領域の転写制御下に挿入された遺伝子および／または経路は、増大した有糸分裂組換えを受ける。ａｒｇ４およびｈｉｓ４遺伝子を取り囲む領域もまた、組換えホットスポットであり、そしてこれらの領域中にクローン化された遺伝子は、減数分裂の間に組換えを受ける増加した可能性を有する。相同遺伝子が、これらの領域中にクローン化され、そして反復してこれら組換え株を接合することによりインビボでシャフルされ得る。ＣＤＣ２はポリメラーゼδをコードし、そして有糸分裂遺伝子変換に必要である。この遺伝子の過剰発現を、シャフラー株または変異誘発遺伝子株で用い得る。ＣＤＣ４中の温度感受性変異は、制限温度で細胞周期をＧ１で止め、そして最適化された融合および次の組換えのためのプロトプラストを同調するために用い得る。
【０２３４】
糸状菌の場合のように、酵母をシャッフリングする一般的目的は、遺伝的操作の宿主生物として、および種々の化合物の生産装置としての酵母における改良を含む。いずれの場合においても１つの所望の性質は、酵母の異種タンパク質を発現および分泌する能力を改善することである。以下の実施例は、増加する量のＲＮａｓｅＡを発現および分泌するために酵母を進化させるためのシャッフリングの使用を記載する。
【０２３５】
ＲＮａｓｅＡは、特にピリミジンヌクレオチド後のＲＮＡのＰ−Ｏ5'結合の切断を触媒する。この酵素は、各々が触媒に必要な８つのハーフ（ｈａｌｆ）シスチン残基を有する塩基性の１２４アミノ酸のポリペプチドである。ＹＥｐＷＬ−ＲＮａｓｅＡは、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからＲＮａｓｅＡの発現および分泌をもたらすベクターであり、そしてこのベクターを保持する酵母は、培養培地１リットルあたり１〜２ｍｇの組換えＲＮａｓｅＡを分泌する（ｄｅｌ Ｃａｒｄａｙｒｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８（３）：２６、１〜２７３（１９９５））。この全体収率は、酵母中で異種的に発現されるタンパク質のためには乏しく、そしてシャッフリングにより少なくとも１０〜１００倍で改良され得る。ＲＮａｓｅＡの発現は、いくつかのプレートおよびマイクロタイタープレートアッセイにより容易に検出される（ｄｅｌ Ｃａｒｄａｙｒｅ ＆ Ｒａｉｎｅｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３、６０３１〜６０３７ １９９４）。全ゲノムシャッフリングのための記載の形式の各々を用いて、ＹＥｐＷＬ．ＲＮａｓｅＡを保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株をシャフルし得、そして得られる細胞を、培地中へのＲＮａｓｅＡの増加した分泌についてスクリーニングし得る。新たな株を、シャッフリング形式を通じて、十分に高いレベルのＲＮａｓｅＡ分泌が観察されるまで繰り返し循環させる。ＲＮａｓｅＡの使用は特に有用である。なぜなら、それは、適正な折り畳みおよびジスルフィド結合形成を要求するだけでなく、適正なグリコシル化を要求するからである。従って、発現、折り畳み、および分泌系の多くの成分が最適化され得る。得られる株もまた、その他の異種タンパク質の改良された分泌について進化される。
【０２３６】
酵母をシャッフリングする別の目的は、エタノールに対する酵母の耐性を増大することである。これは、エタノールの商業的生産のため、およびよりアルコールが多いビールおよびワインの産生のための両方に有用である。シャフルされる酵母株は、酵母の他の株（これは、エタノールに対する優れた耐性を有することが公知であってもよくまたは公知でなくてもよい）との交換または形質転換により遺伝的材料を獲得する。進化されるべき株はシャフルされ、そしてシャフラントは、エタノールへの曝露にかかわらず生存する能力について選択される。増加する濃度のエタノールをシャッフリングの連続的ラウンドにおいて用い得る。同じ原理を用いてベーキング酵母を、改良された耐浸透圧性についてシャフルし得る。
【０２３７】
シャッフリング酵母の別の所望の性質は、所望の栄養条件下で増殖する能力である。例えば、酵母が、利用可能性に依存して、メタノール、デンプン、モラセス、セルロース、セロビオース、またはキシロースのような安価な炭素源上で増殖することは有用である。シャッフリングおよび選択の原理は、糸状菌について論議された原理と同様である。
【０２３８】
別の所望の性質は、糸状菌または細菌により天然に産生される二次代謝産物を産生する能力である。このような二次代謝産物の例は、シクロスポリンＡ、タキソール、およびセファロスポリン類である。進化されるべき酵母は、この二次代謝産物を産生する生物からのＤＮＡで遺伝子交換を受けるか、または形質転換される。例えば、タキソールを産生する真菌は、Ｔａｘｏｍｙｃｅｓ ａｎｄｒｅａｎａｅおよびＰｅｓｔａｌｏｔｏｐｉｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａを含む（Ｓｔｉｅｒｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０、２１４〜２１６（１９９３）；Ｓｔｒｏｂｅｌら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４２、４３５〜４４０（１９９６））。ＤＮＡはまた、Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａのようなタキソールを天然に産生する樹木から得られ得る。タキソール経路中の１つの酵素をコードするＤＮＡであるタキサジエンシンターゼは、タキソール生合成における決定的工程を触媒すると考えられており、そしてタキソール産生の全体において速度律速であり得るが、クローン化されている（Ｗｉｌｄｕｎｇ ＆ Ｃｒｏｔｅａｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、９２０１〜４（１９９６））。次いでＤＮＡはシャフルされ、そしてシャフラントが二次代謝産物の生産についてスクリーニング／選択される。例えば、タキソール産生は、タキソールに対する抗体を用いて、質量分析法によるか、またはＵＶ分光光度法によりモニターされ得る。あるいは、タキソール合成における中間体またはタキソール合成経路中の酵素の産生がモニターされ得る。Ｃｏｎｃｅｔｔｉ ＆ Ｒｉｐａｎｉ、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ ３７５、４１９〜２３（１９９４）。二次代謝産物のその他の例は、ポリオール類、アミノ酸、ポリケチド類、非リボソームポリペプチド類、エルゴステロール、カロチノイド類、テルピノイド類、ステロール類、ビタミンＥなどである。
【０２３９】
別の所望の性質は、酵母の凝集性を増大し、エタノールの調製における分離を容易にすることである。酵母は、大きなクランプを形成するシャフルされた酵母に対する選択とともに、上記の任意の手順によりシャフルされ得る。
【０２４０】
（７．酵母プロトプラスト化のための例示の手順）
酵母におけるプロトプラスト調製は、Ｍｏｒｇａｎによる、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂａｓｅｌ、１９８３）により総説されている。新鮮細胞（約１０8）を、緩衝液、例えば、０．１Ｍリン酸カリウムで洗浄し、次いで５０ｍＭ ＤＴＴのような還元剤を含む同緩衝液に再懸濁し、ゆっくり攪拌しながら３０℃で１時間インキュベートし、次いで緩衝液で再び洗浄して還元剤を除去する。次いでこれらの細胞を、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ２３４（１ｍｇ／ｍＬ）のような細胞壁分解酵素、および、種々の任意の濃度の浸透圧安定剤（例えば、スクロース、ソルビトール、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ4、ＭｇＣｌ2、またはＮＨ4Ｃｌ）を含む緩衝液中に再懸濁する。次いでこれらの懸濁液を、プロトプラストが遊離されるまで、ゆっくり振盪して（約６０ｒｐｍ）３０℃でインキュベートする。生産性の融合体をより産生し易いプロトプラストを生成するために、いくつかの戦略が可能である。
【０２４１】
プロトプラスト形成は、プロトプラストの細胞サイクルが、Ｇ１で止まるように同調された場合、増大し得る。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合には、これは、ａまたはαいずれかの接合因子の添加により達成され得る（Ｃｕｒｒａｎ ＆ Ｃａｒｔｅｒ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２９、１５８９〜１５９１（１９８３））。これらのペプチドは、ｃＡＭＰの細胞レベルを低減することによりアデニルシクラーゼインヒビターとして作用し、細胞周期をＧ１で阻止する。さらに、性因子は、ａおよびα細胞の性的融合のために調製物中の細胞壁の弱体化を誘導することが示されている（Ｃｒａｎｄａｌｌ ＆ Ｂｒｏｃｋ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．３２、１３９〜１６３（１９６８）；Ｏｓｕｍｉら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９７、２７〜３８（１９７４））。したがって、プロトプラストの調製において、細胞は、接合因子、またはレフルノミドまたはＫ．ｌａｃｔｉｓからのキラートキシンのような、アデニレートシクラーゼのその他の公知のインヒビターで処理され得、Ｇ１で阻止される（Ｓｕｇｉｓａｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３０４、４６４〜４６６（１９８３））。次いで、プロトプラストの融合の後（工程２）、ｃＡＭＰを再生培地に添加し得、Ｓ相およびＤＮＡ合成を誘導し得る。あるいは、ＣＤＣ４遺伝子における温度感受性変異を有する酵母株を、細胞が同調されかつＧ１で阻止されるように用い得る。融合細胞が許容温度に戻った後、ＤＮＡ合成および増殖が再開する。
【０２４２】
一旦適切なプロトプラストが調製されると、物理的または化学的手段により融合を誘導することが必要である。各細胞型の等しい数のプロトプラストを、例えば、０．８Ｍ ＮａＣｌ、およびＰＥＧ６０００（３３％ｗ／ｖ）の浸透圧安定剤を含む、リン酸緩衝液中（０．２Ｍ、ｐＨ５．８、２×１０8細胞／ｍＬ）で混合し、次いで３０℃で５分間融合を生じながらインキュベートする。ポリオール類、またはその他の水を結合する化合物を採用し得る。次いで融合体を、ＰＥＧを欠く浸透圧的に安定化された緩衝液中で洗浄および再懸濁し、そして浸透圧が安定化された再生培地に移し、その上／中で細胞が所望の特性について選択またはスクリーニングされ得る。
【０２４３】
（８．人工染色体を使用するシャッフリング方法）
酵母人工染色体（Ｙａｃ）は、非常に大きなＤＮＡフラグメント（例えば、５０〜２０００ｋｂ）がクローニングされ得る酵母ベクターである（例えば、Ｍｏｎａｃｏ＆Ｌａｒｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２（７）、２８０〜２８６（１９９４）；Ｒａｍｓａｙ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１（２），１８１〜２０１ １９９４；Ｈｕｘｌｅｙ，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．１６，６５〜９１（１９９４）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．４（８），７６１〜３（１９９４）；Ｌａｍｂ＆Ｇｅａｒｈａｒｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５（３），３４２〜８（１９９５）；Ｍｏｎｔｏｌｉｕら、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６，５７７〜８４（１９９４）を参照のこと）。これらのベクターは、末端小粒（Ｔｅｌ）、動原体（Ｃｅｎ）、自律複製配列（ＡＲＳ）を有し、そしてポジティブ（例えば、ＴＲＰ１）およびネガティブ（例えば、ＵＲＡ３）選択のための遺伝子を有し得る。ＹＡＣは、減数分裂および有糸分裂の両方を介して、他の酵母染色体と同様に維持され、複製され、そして分離し、それによって、クローニングされたＤＮＡを真の減数分裂の組換えに曝露する手段を提供する。
【０２４４】
ＹＡＣは、インビボにおいて、大きなＤＮＡフラグメントのライブラリーをシャッフリングするためのビヒクルを提供する。シャッフリングのための基質は、代表的に、２０ｋｂ〜２Ｍｂの大きなフラグメントである。このフラグメントは、ランダムフラグメントであり得るか、または望ましい特性をコードすることが公知のフラグメントであり得る。例えば、フラグメントは、抗生物質の生成に関与する遺伝子のオペロンを含み得る。ライブラリーはまた、全ゲノムまたは染色体を含み得る。ウイルスのゲノムおよびいくつかの細菌のゲノムは、単一のＹＡＣへインタクトにクローニングされ得る。いくつかのライブラリーにおいて、フラグメントは、単一の生物から得られる。他のライブラリーは、フラグメント改変体を含み、ここでいくつかのライブラリーは異なる個体または種から得られる。フラグメント改変体はまた、誘導された変異によって生成され得る。代表的に、フラグメント内の遺伝子は，酵母内で、天然に関連する調節配列から発現される。しかし、あるいは、個々の遺伝子は，発現カセットを形成するために酵母の調節エレメントに連結され得、そしてこのようなカセットのコンカテマー（異なる遺伝子を各々含む）が、ＹＡＣへ挿入され得る。
【０２４５】
いくつかの例において，フラグメントが酵母ゲノムへ組み込まれ、そしてシャッフリングは改善された酵母株を進化させるために使用される。他の例において、フラグメントはシャッフリングプロセス全体を通じてＹＡＣの成分とし残存し、そして所望の特性の獲得後、ＹＡＣは所望のレシピエント細胞へ移入される。
【０２４６】
（９．酵母株を進化させる方法）
フラグメントがＹＡＣベクターへクローニングされ、そして得られたＹＡＣライブラリーはコンピテント酵母細胞へ形質転換される。ＹＡＣを含む形質転換体は、ＹＡＣ上に存在するポジティブ選択マーカーについて選択することによって同定される。細胞は回収することが可能であり、次いでプールされる。その後、この細胞は、この細胞を富化培地から窒素および炭素の制限培地へ移すことによって胞子形成するように誘導される。胞子形成の過程において、細胞は減数分裂を受ける。次いで、胞子は、富化培地へ戻されることによって接合するように誘導される。必要に応じて、子嚢は、胞子を遊離するために溶解され、その結果、胞子は、他の子嚢から生じる他の胞子と接合し得る。接合は、異なるインサートを保有するＹＡＣ間、およびＹＡＣと天然酵母染色体との間の組換えを生じる。後者は、紫外光で胞子を照射することによって促進され得る。組換えは、ＹＡＣ上のフラグメントによって発現される遺伝子の結果としてか、または宿主遺伝子との組換えの結果としてのいずれか、あるいはその両方で、新たな表現型を生じ得る。
【０２４７】
ＹＡＣと天然酵母染色体との間の組換えの誘導後、ＹＡＣは、しばしば、そのＹＡＣ上のネガティブ選択マーカーに対する選択によって除去される。例えば、マーカーＵＲＡ３を含むＹＡＣは、５−フルオロ−オロチン酸を含む培地上での増殖によって選択され得る。残存する任意の外因性遺伝物質または改変された遺伝物質が、天然酵母染色体に含まれる。必要に応じて、さらなる回の天然酵母染色体間の組換えが、ＹＡＣの除去後に実施され得る。必要に応じて、同じＹＡＣのライブラリーまたは異なるＹＡＣのライブラリーが細胞へ形質転換され得、そして上記の工程が繰り返され得る。このプロセスを反復的に繰り返すことによって、この集団の多様性が、スクリーニングの前に増大される。
【０２４８】
ＹＡＣの除去後、次いで、酵母は、所望の特性についてスクリーニングまたは選択される。この特性は、移入されたフラグメントによって付与される新たな特性（例えば、抗生物質の生成）であり得る。この特性はまた、酵母の改善された特性（例えば、外因性タンパク質を発現または分泌する改善された能力、改善された組換え形成性、温度または溶媒に対する改善された安定性、または酵母の市販株もしくは研究用株に必要な他の特性であり得る。
【０２４９】
次いで、選択／スクリーニングを生存する酵母株は、さらなる回の組換えに供される。組換えは、もっぱら、選択／スクリーニングを生存する酵母の染色体間であり得る。あるいは、フラグメントのライブラリーは酵母細胞へ導入され得、そして以前のように内因性酵母染色体と組換えられ得る。このフラグメントのライブラリーは、その前の回の形質転換において使用されるライブラリーと同じでもよいし、または異なっていてもよい。例えば、ＹＡＣは、その前の工程において得られた改善された株のプールから単離されるゲノムＤＮＡのライブラリーを含み得る。ＹＡＣは、以前のように除去され、続いて、さらなるＹＡＣライブラリーを用いてさらなる回の組換えおよび／または形質転換を行う。組換えは、上記のように、別の回の選択／スクリーニングに先行する。さらなる回の組換え／スクリーニングは、酵母株が所望の特性を獲得するように進化するまで、必要に応じて実施され得る。
【０２５０】
ＹＡＣライブラリーの導入によって酵母を進化させるための例示的なスキームは、図１０において示される。この図の第１部分は、内因性二倍体ゲノムおよび配列の改変体を提示するフラグメントのＹＡＣライブラリーを含む酵母を示す。このライブラリーは、ＤＮＡ １μｇあたり１００〜１０００コロニーを生じるように、細胞へ形質転換される。ここで、大半の形質転換された酵母細胞は、単一のＹＡＣならびに内因性染色体を保有する。減数分裂は、窒素および炭素の制限培地上での増殖によって誘導される。減数分裂の過程において、ＹＡＣは、同じ細胞中の他の染色体と組換えられる。減数分裂、接合および再生された二倍体から生じる一倍体胞子が形成される。ここで、二倍体形態は組換え染色体を保有し、その部分は、内因性染色体およびＹＡＣの部分から生じる。必要に応じて、ここでＹＡＣは、そのＹＡＣ上に存在するネガティブ選択マーカーに対する選択によって細胞から救済（ｃｕｒｅ）され得る。ＹＡＣが選択されるか否かにかかわらず、次いで、細胞が、所望の特性についてスクリーニングまたは選択される。選択／スクリーニングを生存する細胞は、別のシャッフリングの回を開始するために、別のＹＡＣライブラリーを用いて形質転換される。
【０２５１】
（１０．レシピエント株に移入するためにＹＡＣを進化させる方法）
これらの方法は、複数のＹＡＣが同じ酵母細胞に保有され得、そしてＹＡＣ−ＹＡＣ組換えが生じることが公知である（Ｇｒｅｅｎ＆Ｏｌｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０、９４〜９８（１９９０））という事実に一部基づく。ＹＡＣ間（ｉｎｔｅｒ−ＹＡＣ）組換えは、２０ｋｂより大きいフラグメント上に保有される相同性遺伝子のファミリーが、インビボにおいてシャッフリングされ得る形式を提供する。ＤＮＡフラグメントの開始集団は、互いに類似であるが、例えば、誘導された多様性、対立遺伝子多様性、または種の多様性の結果として、異なる配列を示す。しばしば、ＤＮＡフラグメントは、共通の経路において機能する複数の遺伝子をコードすることが既知であるかまたは疑われる。
【０２５２】
フラグメントは、代表的に、形質転換体についてのポジティブ選択を伴って、Ｙａｃへクローニングされ、そして酵母に形質転換される。この形質転換体は、胞子形成されるように誘導されて、その結果として染色体は減数分裂を受ける。次いで、細胞は接合される。ここで、得られた二倍体細胞のほとんどは、各々異なるインサートを有する２つのＹＡＣを保有する。これらは、再び胞子形成するように誘導され、そして接合される。得られた細胞は、組換え配列のＹＡＣを保有する。次いで、この細胞は、所望の特性についてスクリーニングされ得るかまたは選択され得る。代表的に、このような選択は、シャッフリングのために使用される酵母株において生じる。しかし、シャッフリングされるフラグメントが酵母において発現されない場合、ＹＡＣは単離され得、そしてスクリーニングのために発現される適切な細胞型に移入される。このような特性の例としては、所望の化合物の合成または分解、所望の遺伝子産物の分泌の増加、または他の望ましい表現型が挙げられる。
【０２５３】
好ましくは、ＹＡＣライブラリーは、一倍体ａ細胞および一倍体α細胞へ形質転換される。次いで、これらの細胞は、互いに接合するように誘導される。すなわち、これらは富化培地上での増殖によってプールされそして接合されるように誘導される。次いで、二倍体細胞（各々２つのＹＡＣを保有する）は、胞子形成培地へ移される。胞子形成の間、この細胞は減数分裂および相同染色体組換えを受ける。この場合において、ＹＡＣに保有される遺伝子は組換えられ、そしてこれらの配列を多様化する。次いで、得られた一倍体子嚢胞子（ａｃｏｓｐｏｒｅ）は、子嚢壁の酵素的分解または他の利用可能な手段によって子嚢から遊離され、そしてプールされ遊離された一倍体子嚢胞子（ａｃｏｓｐｏｒｅ）は、富化培地へ移されることによって接合するように誘導される。このプロセスは、ＹＡＣへクローニングされるＤＮＡの多様性を増大させるために数回繰り返される。得られた酵母細胞の（好ましくは一倍体状態における）集団は、改善された特性についてスクリーニングされるか、または多様化したＤＮＡが別のスクリーニングのための宿主細胞もしくは生物に送達されるかのいずれかである。
【０２５４】
選択／スクリーニングを生存する細胞は、所望の表現型が観察されるまで、連続回のプール化、胞子形成、接合、および選択／スクリーニングに供される。組換えは、細胞を、胞子形成を誘導するために富化培地から炭素および窒素の制限培地へ移し、次いで、接合を誘導するために富化培地へ胞子を戻すことによって単純に達成され得る。子嚢は、異なる子嚢から生じる胞子の接合を刺激するために溶解され得る。
【０２５５】
ＹＡＣが所望の特性をコードするように進化された後、これらは、他の細胞型へ移入され得る。移入は、プロトプラスト融合、または単離されたＤＮＡを用いる再形質転換によってであり得る。例えば、酵母から哺乳動物細胞へのＹＡＣの移入は、Ｍｏｎａｃｏ＆Ｌａｒｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２、２８０〜２８６（１９９４）；Ｍｏｎｔｏｌｉｕら、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６，５７７〜８４（１９９４）；Ｌａｍｂら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５，３４２〜８（１９９５）によって議論されている。
【０２５６】
酵母においてＹＡＣフラグメントライブラリーをシャッフリングするための例示的なスキームが、図１１に示される。遺伝的改変体を示すＹＡＣフラグメントのライブラリーは、二倍体内因性染色体を有する酵母へ形質転換される。形質転換された酵母は、二倍体内因性染色体、および単一のＹＡＣを有し続ける。この酵母は、減数分裂を受けそして胞子形成されるように誘導される。この胞子は、一倍体ゲノムを含み、そしてＹＡＣ選択マーカーを用いて、ＹＡＣを含む胞子について選択される。この胞子は、接合するように誘導されて、二倍体細胞を生成する。ここで、二倍体細胞は、２つの異なるインサートを保有するＹＡＣならびに二倍体内因性染色体を含む。この細胞は減数分裂を受け、そして胞子形成するように再び誘導される。減数分裂の間、組換えがＹＡＣインサートの間で生じ、そして組換えＹＡＣは、アスコイト（ａｓｃｏｙｔｅ）に分離される。従って、いくつかのアスコイトは、一倍体内因性染色体および組換えインサートを有するＹＡＣ染色体を含む。このアスコイトは胞子に成熟し、胞子は、再び接合し得、二倍体細胞を生成する。ここで、いくつかの二倍体細胞は、内因性染色体および２つの組換えＹＡＣの二倍体相補物を有する。次いで、これらの細胞は、さらなる回の減数分裂、胞子形成、および接合を通じて得られ得る。各回において、さらなる組換えがＹＡＣインサート間で生じ、そしてインサートのさらなる組換え形態が生成される。１回または数回の組換えが生じた後、細胞は、所望の特性の獲得について試験され得る。次いで、さらなる回の組換え、続く選択は、類似の様式で実施され得る。
【０２５７】
（１１．同一の遺伝子座において相同遺伝子を保有する酵母細胞の反復的接合による遺伝子のインビボシャッフリング）
ＤＮＡシャッフリングの目標は、有性組換えの組み合わせ能力を模倣および拡張することである。インビトロＤＮＡシャッフリングは、このプロセスにおいて成功する。しかし、組換えの機構を変化させることおよび組換えが生じる条件を変更することによって、生来、インビトロ組換え方法は、ＤＮＡ配列を「進化可能（ｅｖｏｌｖａｂｌｅ）」にさせる、そのＤＮＡ配列における固有の情報を危うくし得る。
【０２５８】
減数分裂の間に生じる機構にわたる天然の交叉を利用することによるインビボのシャッフリングは、固有の天然の配列情報を利用し得、そしてより高品質のシャッフリングされたライブラリーを作製する手段を提供し得る。天然の減数分裂組換えの機構を利用するＤＮＡのインビボシャッフリングの方法が、本明細書中に記載され、そしてＤＮＡシャッフリングの代替の方法が提供される。
【０２５９】
基本的なストラテジーは、シャッフリングされるべき遺伝子を、酵母の一倍体ゲノム内の同一の遺伝子座へクローニングすることである。次いで、一倍体細胞は、接合および胞子形成するように反復的に誘導される。このプロセスは、反復的な回の減数分裂の間、クローニングされた遺伝子を反復的な組換えに供する。次いで、得られたシャッフリングされた遺伝子は、インサイチュにおいてスクリーニングされるか、または単離され、そして種々の条件下でスクリーニングされる。
【０２６０】
例えば、５つのリパーゼ遺伝子のファミリーをシャッフリングすることを望む場合、インビボで行われる手段が以下に提供される。
【０２６１】
各リパーゼのオープンリーディングフレームがＰＣＲによって増幅され、その結果各ＯＲＦが、同一の３’配列および５’配列によって隣接される。この５’隣接配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｕｒａ３遺伝子の５’コード配列内の領域と同一であり、そしてこの３’隣接配列は、ｕｒａ ３遺伝子の３’内の領域と同一である。この隣接領域が選択され、その結果、ｕｒａ ３遺伝子とのＰＣＲ産物の相同組換えは、リパーゼ遺伝子の組込みおよびｕｒａ ３ ＯＲＦの破壊を生じる。次いで、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのａ一倍体細胞およびα一倍体細胞の両方は、ＰＣＲ増幅されたリパーゼＯＲＦの各々を用いて形質転換され、そしてリパーゼ遺伝子をｕｒａ ３遺伝子座へ組み込まれた細胞は、５フルオロオロチン酸（５ＦＯＡは、機能的ＵＲＡ３を発現する細胞に対して致死的である）上での増殖によって選択される。結果は、１０の細胞型（破壊されたｕｒａ ３遺伝子座において５つのリパーゼ遺伝子のうちの１つを各々保有する２つの異なる接合型）である。次いで、これらの細胞は、ａ細胞とα細胞との間の接合が許容される条件下（例えば、富化培地中）でプールされ、そして増殖される。
【０２６２】
接合は、２つのｕｒａ ３遺伝子座においてリパーゼ遺伝子の３２の可能な組み合わせを全て有する二倍体細胞の組み合わせ混合物を生じる。次いで、この細胞は、炭素および窒素の制限条件下での増殖によって胞子形成を誘導される。胞子形成の間、二倍体細胞は、子嚢に入れられる４つの（２つのａおよび２つのα）一倍体子嚢胞子を形成するように減数分裂を受ける。胞子形成のプロセスの第ＩＩ減数分裂の間、姉妹染色分体は整列され、そして交差する。ｕｒａ ３遺伝子座へクローニングされるリパーゼ遺伝子はまた、整列および組換えられる。従って、得られた一倍体子嚢胞子は、種々の可能なキメラリパーゼ遺伝子（元々の二倍体細胞における２つのリパーゼ遺伝子の減数分裂組換えの各々固有の結果）を各々保有する細胞のライブラリーを示す。子嚢の壁は、遊離し、そして個々の子嚢胞子の混合を可能にするために、ザイモリアーゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ）を用いる処理によって分解される。次いで、この混合物は、ａ一倍体細胞およびα一倍体細胞の接合を促進する条件下で増殖される。さもなければ、接合は子嚢内の子嚢胞子間で生じるので、個々の子嚢胞子を遊離することは重要である。一倍体細胞の混合により、２つより多くのリパーゼ遺伝子間での組換えを可能にし、「プール組換え（ｐｏｏｌｗｉｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」を可能にする。接合は、キメラ遺伝子の新たな組換えも共にもたらし、次いでこれは、胞子形成の際の組換えを受け得る。細胞は、十分な多様性が５つのリパーゼ遺伝子の反復的ペア組換えの（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって生成されるまで、胞子形成、子嚢胞子混合および接合を通じて反復的に循環される。個々のキメラリパーゼ遺伝子は、一倍体酵母細胞中で直接的にスクリーニングされ得るか、または適切な発現宿主に移入され得るかのいずれかである。
【０２６３】
このプロセスは、リパーゼおよび酵母について上記される；しかし、遺伝子が指向され得る任意の有性生物が使用され得、そして当然のことながら、任意の遺伝子がリパーゼと置換され得る。このプロセスは、反復的ペア様式の接合によってゲノム全体をシャッフリングする方法に類似する。しかし、この多様性は、ゲノム全体の場合において、特定の遺伝子座に局在されるのではなく、宿主ゲノム全体に分布される。
【０２６４】
（１２．連結していない遺伝子をクローニングするためのＹＡＣの使用）
ＹＡＣのシャッフリングは、特に、連鎖していないが機能的に関連する遺伝子を、ある種から別の種（特にここでは、そのような遺伝子が同定されていない）へ移入することに従う。いくつかの商業的に重要な天然産物（例えば、タキソール）についての場合も同様である。代謝経路における遺伝子の異なる生物への移入は、しばしば望ましい。なぜなら、このような化合物を天然に生成する生物は、大量培養に十分に適合されないからである。
【０２６５】
このような遺伝子のクラスターは、有用な化合物を生成する生物からＹＡＣライブラリーへＤＮＡの総ゲノムライブラリーをクローニングすることによって単離され得る。次いで、このＹＡＣライブラリーは、酵母に形質転換される。この酵母は、胞子形成および接合され、その結果、ＹＡＣ間および／またはＹＡＣと天然酵母染色体との間で組換えが生じる。次いで、選択／スクリーニングは、遺伝子の所望の収集物を発現するために実施される。この遺伝子が生合成経路をコードする場合、発現は、この経路の生成物の出現から検出され得る。この経路における個々の酵素、または最終発現産物の中間体もしくは細胞がこのような中間体を代謝する能力の提示は、この合成経路の部分的な獲得を示す。元々のライブラリーまたは異なるライブラリーは、選択／スクリーニングを生存する細胞へ導入され得、そしてさらなる回の組換えおよび選択／スクリーニングが、所望の代謝経路の最終生成物が生成されるまで実施され得る。
【０２６６】
（１３．ＹＡＣ−ＹＡＣシャッフリング）
目的の表現型が２メガベース長よりも小さいゲノムＤＮＡの一本鎖ストレッチに単離され得る場合、これは、ＹＡＣへクローニングされ得、そしてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で複製され得る。関連する宿主由来のＤＮＡの類似のストレッチの同一のＹＡＣへのクローニングは、所望の表現型をもたらす相同インサートを有するＹＡＣを各々保有する酵母細胞の集団を生じる。これらの酵母細胞の反復的増殖は、これらのＹＡＣの相同領域が、減数分裂の間に組換えられることを可能にし、遺伝子、経路、およびクラスターが、減数分裂の各回の間、組換えられることを可能にする。数回の接合および分離の後、ＹＡＣインサートは、十分にシャッフリングされる。次いで、ここで非常に多様な酵母ライブラリーは、ＹＡＣインサートのシャッフリングから得られる表現型の改善についてスクリーニングされ得る。
【０２６７】
（１４．ＹＡＣ−染色体シャッフリング）
「有糸分裂」組換えは細胞分裂の間に生じ、そして複製の間の遺伝子の組換えから生じる。この型の組換えは、姉妹染色分体間に限定されず、そして組換え機構を誘導する因子（例えば、ニック化（ｎｉｃｋｉｎｇ）化学物質および紫外線照射）によって増強され得る。空間障壁を横切る直接的な接合はしばしば困難であるので、ＹＡＣライブラリーとして所望の宿主生物に対して標的遺伝子を提供することによって、異なる種から生じる相同遺伝子の組換えを誘導することが可能である。次いで，このライブラリーに保有される遺伝子は、増強された有糸分裂組換えによる宿主染色体上の相同遺伝子を用いて組換えるように誘導される。このプロセスは、多様な生物のライブラリーを生成するように反復的に実施され、次いで、所望の表現型の改善を有する表現型についてスクリーニングされる。次いで、改善された部分集団は、蓄積された複数の有用な遺伝的変更を有する新たな株を同定するために、上記のように反復的に接合される。
【０２６８】
（１５．有用な遺伝子を保有する複数のＹＡＣの蓄積）
所定の表現型の獲得または改善に必要な複数の連鎖していない遺伝子の蓄積は、ＹＡＣライブラリーのシャッフリングによって達成され得る。所望の表現型（例えば、エタノール耐性、熱耐性、およびペントース糖を発酵する能力）を有する生物由来のゲノムＤＮＡは、プールされ、フラグメント化され、そしていくつかの異なるＹＡＣベクター（各々、異なる選択マーカー（ｈｉｓ、ｕｒａ、ａｄｅなど）を有する）へクローニングされる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、これらのライブラリーを用いて形質転換され、そしてこれらの存在について（選択培地（すなわち、Ｕｒａ３選択マーカーを含むＹＡＣについてのウラシルドロップアウト（ｄｒｏｐｏｕｔ）培地）を用いて）選択され，次いで、獲得または改善された所望の表現型を有することについてスクリーニングされる。生存する細胞は、プールされ、反復的に接合され、そして複数のＹＡＣの蓄積について（複数の栄養性ドロップアウトを伴う培地中での増殖によって）選択される。有用なゲノムインサートを保有する複数のＹＡＣを獲得する細胞は、さらなるスクリーニングによって同定される。最適化された株は、直接使用され得るが、ＹＡＣが細胞に示し得る負荷に起因して、関連するＹＡＣインサートは、最小化され得、サブクローニングされ得、そして宿主染色体へ組換えられて、より安定な産生株を生成し得る。
【０２６９】
（１６．宿主ＳＳＦ生物の選択）
本発明のための１つの例示的使用は，リグノセルロースバイオマス（ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｂｉｏｍａｓｓ）からのエタノールの生成について改善された酵母を作製することである。特に、改善されたエタノール耐性および熱安定性／熱耐性を有する酵母株が、望ましい。同時的糖化および発酵（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（ＳＳＦ）プロセスにおける良好な挙動について公知の親酵母株が、同定される。これらの株は，エタノール耐性および／または熱安定性を有することか既知である他の株と組合わせられる。
【０２７０】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、最適化されたＳＳＦプロセスのための開発に対して非常に影響を受ける。これは、この使用のためにいくつかの特性（スクロース、グルコース、ガラクトース、マルトースおよびマルトリオース（ｍａｌｔｒｉｏｓｅ）のような種々の糖をインポート（ｉｍｐｏｒｔ）および発酵する能力を含む）を固有に有する。また、酵母は、フロック化（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｅ）能力を有し、これは、発酵周期の最後で酵母バイオマスの回収を可能にし、および引き続くバイオプロセス（ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ）においてその再使用を可能にする。これは、増殖培地において栄養素の使用を最適化する点で、重要な特性である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはまた、実験操作に対して非常に影響を受け、非常に特徴付けられた遺伝学を有し、そして有性生殖周期を有する。厳密な嫌気性生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）（それらの生物が研究室において操作されることを非常に困難にする）であるいくつかの他の潜在的なＳＳＦ生物とは対照的に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、好気性条件下または嫌気性条件下のいずれでも増殖され得る。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはまた、「一般に安全であるとみなされ」（「ＧＲＡＳ」）、そして一般大衆向けの重要な食料品（例えば、ビール、ワイン、パンなど）の生産のための広範な使用に起因して、一般に精通されかつ十分に知られている。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、一般に発酵プロセスにおいて使用され、そして発酵の専門家によるその操作の精通は、新たに改善された酵母株の産業的設定への導入を容易にする。
【０２７１】
特に良好なＳＳＦ生物として以前に同定されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（例えば、Ｓ，ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｄ5Ａ（ＡＴＣＣ２０００６２）（Ｓｏｕｔｈ ＣＲおよびＬｙｎｄ ＬＲ．（１９９４）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５／４６：４６７〜４８１；Ｒａｎａｔｕｎｇａ ＴＤら（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：１１２５〜１１２７））は、開始物質のために使用され得る。さらに、産業的に使用される他のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株、特に、望ましい発酵の特徴を示す株（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ５６７（ＡＴＣＣ２４８５８）（Ｓｉｔｔｏｎ ＯＣら（１９７９）Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４（９）：７〜１０；Ｓｉｔｔｏｎ ＯＣら（１９８１）Ａｄｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：２３１〜２３７；ＭｃＭｕｒｒｏｕｇｈ Ｉら（１９７１）Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：３４６〜３４９）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＣＡ１７４（ＡＴＣＣ６０８６８（Ｂｅｎｉｔｅｚ Ｔら（１９８３）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：１４２９〜１４３６；Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．５０：Ｂ１７〜Ｂ２２，１９９２））は、必要に応じて、宿主株として使用される。これらは、大規模な（ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ）発酵について望ましい特性を有することが示されている。
【０２７２】
（１７．エタノール耐性株の選択）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの多くの株は、高エタノール環境から単離され、そして適応進化によってエタノール富化環境において生存されてきた。例えば、Ｓｈｅｒｒｙワイン熟成由来の株（「Ｆｌｏｒ」株）は、高エタノール環境におけるそれらの生存を可能にする、非常に機能的な進化されたミトコンドリアを有する。これらのワイン酵母ミトコンドリアの他の株への移入は、高エタノール濃度に対するレシピエントの耐性、ならびに熱耐性を増大させることが示されている（Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｊ．およびＢｅｎｉｔｅｚ，Ｔ（１９８８）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１３：４６１〜４６９）。ＡＴＣＣに寄託されたいくつかのｆｌｏｒ株が存在する。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＹ９１（ＡＴＣＣ２０１３０１）、ＭＹ１３８（ＡＴＣＣ２０１３０２）、Ｃ５（ＡＴＣＣ２０１２９８）、ＥＴ７（ＡＴＣＣ２０１２９９）、ＬＡ６（ＡＴＣＣ２０１３００）、ＯＳＢ２１（ＡＴＣＣ２０１３０３）、Ｆ２３（Ｓ．ｇｌｏｂｏｓｕｓ ＡＴＣＣ９０９２０）。また、Ｓ．ｕｖａｒｕｍおよびＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａ Ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓのいくつかのｆｌｏｒ株も寄託されている。他のエタノール耐性ワイン株としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＣＡ１７４（ＡＴＣＣ６０８６８）（１５％エタノール）、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａ５４（ＡＴＣＣ９０９２１）（１８％（ｖ／ｖ）エタノールを含むワインから単離された）、およびＮＲＣＣ２０２０３６（ＡＴＣＣ４６５３４）（これもまたワイン酵母である）が挙げられる。増強されたエタノール耐性をさらに示す他のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエタノール原（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎ）としては、ＡＴＣＣ２４８５８、ＡＴＣＣ２４８５８、Ｇ３７０６（ＡＴＣＣ４２５９４）、ＮＲＲＬ Ｙ−２６５（ＡＴＣＣ６０５９３）、およびＡＴＣＣ２４８４５〜ＡＴＣＣ２４８６０が挙げられる。Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓの株（Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＡＴＣＣ２３４５）は、高エタノール耐性（１３％ ｖ／ｖ）を有する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓａ２８（ＡＴＣＣ２６６０３）（ジャマイカモロコシ（Ｊａｍａｉｃａｎ ｃａｎｅ）ジュースサンプル由来）は、高レベルのアルコールを糖蜜から生成し、糖耐性であり、そして木酢の加水分解（ｗｏｏｄ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｅ）からエタノールを生成する。
【０２７３】
いくつかの列挙した株、ならびにさらなる株は、エタノール耐性を改良するための開始物質として使用され得る。
【０２７４】
（１８．温度耐性株の選択）
高度にフロック状（ｆｌｏｃｃｕｌｅｎｔ）の株Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ ＳＡ２３（Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＡＴＣＣ２６６０２）（これは、温度の上昇でエタノールを生成する）、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｋｙｏｋａｉ７（Ｓ．ｓａｋｅ、ＡＴＣＣ２６４２２）（短期間の熱および酸化的ストレスに耐性である日本酒酵母）を含む、いくつかの温度耐性株が報告されている。Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓら（（１９９１）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８／２９：３０７〜３１５）は、２７の酵母株（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓおよびＣａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．を含む）が３２〜４５℃の温度範囲においてグルコースを増殖および発酵させる能力について試験した。これらのうち、最良の熱耐性クローンは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ ＬＧおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ２６７１であった（Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９／４０：２０１〜２１１）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ−ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ ＦＤＨＩは、幾分熱耐性であったが、エタノール耐性は乏しかった。この株のエタノール耐性を示す他の株との反復的組換えを使用して、子孫においてエタノール耐性もまた示す熱耐性特徴の株を獲得し得る。
【０２７５】
Ｃａｎｄｉｄａ ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、ＡＴＣＣ２０３８１）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｄ5Ａよりも高いＳＳＦ温度で、リグノセルロースバイオマスからのエタノール生成において改善された性能もまた示す良好なＳＳＦ株である（Ｋａｄａｍ，ＫＬ，Ｓｃｈｍｉｄｔ，ＳＬ（１９９７）Ａｐｐｌ．Ｍｏｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：７０９〜７１３）。この株はまた、改善されたＳＳＦ株への遺伝的な寄与株（ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ）であり得る。
【０２７６】
（１９．株のシャッフリング）
株が非常に関連される例において、反復的接合のストラテジーが、探求され得る。例えば、一倍体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ａおよびα）の集団は、変異され、そして改善されたＥｔＯＨ耐性または熱耐性についてスクリーニングされる。改善された一倍体部分集団は一緒に混合され、そしてプールとして接合され、そして胞子形成するように誘導される。得られた一倍体胞子は、胞子壁を分解することによって遊離され、そして混合される。次いで、遊離された胞子は、反復的に接合および胞子形成するように誘導される。このプロセスは、全ての可能な変異の組み合わせを生成するために十分な回数繰り返される。次いで、全ゲノムがシャッフリングされた集団（一倍体）は、さらなるＥｔＯＨ耐性または熱耐性についてスクリーニングされる。
【０２７７】
株が反復的な接合について十分に関連されない場合、プロトプラスト融合に基づく形式が利用され得る。反復的であり、そしてプール様式プロトプラスト融合は、多様な親株のキメラ集団を生成するために実施され得る。得られた子孫のプールは、改善されたエタノール耐性株および熱耐性株を同定するように選択され、そしてスクリーニングされる。
【０２７８】
あるいは、ＹＡＣベースの全ゲノムシャッフリング形式が、使用され得る。この形式において、ＹＡＣを使用して株間で大きな染色体フラグメントを移動（ｓｈｕｔｔｌｅ）させる。先に詳述されるように、組換えは、ＹＡＣ間で、またはＹＡＣと宿主染色体との間で生じる。所望の表現型を有する生物由来のゲノムＤＮＡは、プールされ、フラグメント化され、そしていくつかの異なるＹＡＣベクター（各々、異なる選択マーカー（ｈｉｓ、ｕｒａ、ａｄｅなど）を有する）へクローニングされる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、これらのライブラリーを用いて形質転換され、そしてそれらの存在について（選択培地（すなわち、Ｕｒａ３選択マーカーを含むＹＡＣについてはウラシルドロップアウト培地）を使用して）選択され、次いで、獲得または改善された所望の表現型を有することについてスクリーニングされる。生存する細胞は、プールされ、反復的に接合され（上記のように）、そして複数のＹＡＣの蓄積について（複数の栄養素のドロップアウトを伴う培地における増殖によって）選択される。有用なゲノムインサートを保有する複数のＹＡＣを獲得する細胞は、さらなるスクリーニングによって同定される（以下を参照のこと）。
【０２７９】
（２０．改善された株についての選択）
変異誘発および組換えによる新規な株の大きなライブラリーを生成されて、第１の課題は、所望の表現型において改善を有する株を単離することである。生物ライブラリーの同定は、所望の重要な特性が選択可能な表現型である場合に容易にされる。例えば、エタノールは、酵母集団の増殖速度、生存率、および発酵速度に対して異なる効果を有する。細胞増殖および生存率の抑制は、エタノール濃度とともに増大するが、高い発酵能は、より高いエタノール濃度でのみ阻害される。従って、エタノール中で増殖する細胞の選択は、エタノール耐性株を単離するための実用的なアプローチである。続いて、選択された株は、エタノールを生成するこれらの発酵能力について分析され得る。増殖および培地の条件が全ての株（親および子孫）について同じであるという条件下で、エタノール耐性のヒエラルキーが、構築され得る。
【０２８０】
熱耐性株およびエタノール耐性株の同定についての単純な選択スキームが利用可能であり、そしてこの場合において、これは、潜在的に有用なＳＳＦ株を同定するために以前に設計されたスキームに基づく。エタノール耐性の選択は、この集団をエタノールに曝露することによって実施され、次いで、この集団をプレートし、そして増殖について調査する。エタノールへの曝露後に増殖し得るコロニーは、より高濃度のエタノールに再び曝露され得、そして最も耐性な株が選択されるまでこのサイクルを繰り返し得る。一時的に獲得された順応性を有する遺伝可能なエタノール耐性を有する株を識別するために、これらのサイクルは、選択をしない（例えば、エタノールを有さない）増殖のサイクルで中断され得る。
【０２８１】
あるいは、混合された集団は、エタノールの濃度の増加で直接増殖され得、そして最も耐性な株が富化された（ＡｇｕｉｌｅｒａおよびＢｅｎｉｔｅｚ，１９８６，Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４：３３７〜４４）。例えば、この富化は、ケモスタットまたはタービドスタットにおいて実施され得る。同様の選択が，熱耐性について開発され得、ここでこの株は、この株が熱処理後に増殖する能力によって、または上昇する温度での増殖について直接的に同定される（Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓら、１９９１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２８：３０７〜３１５）。これらの選択によって同定された最良の株は、エタノール耐性、熱耐性または目的の他の特性についての引き続くスクリーニングにおいて、より徹底的にアッセイされる。
【０２８２】
１つの局面において、増大するエタノール耐性を有する生物について選択される。天然のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ単離菌の集団が、変異誘発される。次いで，この集団は、最初の低エタノール濃度下での発酵条件下で増殖される。一旦、培養物が飽和に達すると、この培養物は、わずかに高いエタノール含量を有する新鮮な培地へ希釈される。このプロセスの、逐次的に増加するエタノール濃度の培地への連続希釈は、エタノール耐性の閾値に到達するまで続けられる。次いで、最も高いエタノール耐性を有する生存する変異集団がプールされ、そしてそれらのゲノムが、本明細書中で述べられる任意の方法によって組換えられる。富化はまた、温度またはエタノール濃度が進行的に上昇されるケモスタットまたはタービドスタットにおける連続培養によって達成され得る。次いで、得られるシャッフリングされた集団は、再度、富化のストラテジー（しかし、開始培地のエタノール濃度ではより高い）に、曝露される。このストラテジーは、必要に応じて、熱耐性細胞の富化のために、および熱耐性およびエタノール耐性をあわせて有する細胞の富化のために適用される。
【０２８３】
（２１．改良された株についてのスクリーニング）
最初の選択において生存能力を示す株は、他の株と再シャッフリングする前に、所望の特性における改良についてより定量的にアッセイされる。
【０２８４】
株の変異誘発から生じる子孫、またはそれらのエタノール耐性および／または熱安定性について予備選択された子孫は、非選択的寒天上にプレート化され得る。コロニーは、マイクロタイターディッシュ中へ機械的に拾われ得、そして増殖され得る。培養物は、新鮮なマイクロタイタープレートに複製され、そしてその複製物は、適切なストレス条件下でインキュベートされる。個々のクローンの増殖または代謝活性は、モニターされ得、そして順位付けられ得る。生存能力の指標は、固体培地上の増殖コロニーの大きさ、増殖培養物の密度、または液体培地に添加された代謝活性指標の色の変化に及ぶ。次いで、最も優れた生存能力を示す株は混合されてシャッフリングされ、そして得られた子孫は、よりストリンジェントな条件下で再スクリーニングされる。
【０２８５】
（２２．セルロースをエタノールへ転換し得るエタノールゲン（ｅｔｈａｎｏｌｇｅｎ）の開発）
一旦熱耐性およびエタノール耐性を示す酵母の株が生じると、セルロースの単糖への分解が、宿主株への効率良いセルロース分解経路の包含によって提供される。
【０２８６】
さらなる望ましい特徴は、宿主によるエタノールの生成の増強に有用であり得る。例えば、基質糖の範囲が広がった異種酵素および経路の包含が行われ得る。株の「チューニング」は、種々の他の形質の付加、または望ましいが組換え手順の間に失われる特定の内因性形質の修復により達成され得る。
【０２８７】
（２３．セルロース活性の付与）
多数のセルラーゼおよびセルラーゼ分解系は、真菌、細菌および酵母から特徴付けられている（Ｂｅｇｕｉｎ，ＰおよびＡｕｂｅｒｔ，Ｊ−Ｐ（１９９４）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１３：２５〜５８；Ｏｈｉｍａ，Ｋら、（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．１４：３６５〜４１４による総説を参照のこと）。効率良いセルロースの糖化に必要な酵素経路は、エンドグルカナーゼ（エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ３．２．１．４）、エキソセロビオヒドロラーゼ（ｅｘｏｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）（エキソ−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ３．２．１．９１）、およびβ−グルコシダーゼ（セロビアーゼ、１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ３．２．１．２１）（実施例９）の相乗作用を含む。エタノールゲン中のセルラーゼ酵素の異種産生は、セルロースの糖化を可能にし、エタノール生成のために生物体により使用され得る単糖を生成する。エタノールゲンにおける機能的セルラーゼ経路の異種発現に対するいくつかの利点が存在する。例えば、ＳＳＦプロセスは、糖化のための別々のバイオプロセス工程の必要性を除去し、そして蓄積された中間体および生成糖によるセルラーゼ酵素の最終産物阻害を改善する。
【０２８８】
天然に存在するセルラーゼ経路は、エタノールゲン中に挿入されるか、または特別に改善された「ハイブリッド」セルラーゼ経路（これは、異なる天然の供給源に（高温生物を含む）由来するセルラーゼの協調作用を用いる）の使用を選択し得る。
【０２８９】
非Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ由来のいくつかのセルラーゼは、この生物体から首尾良く産生されそして分泌されており、これには、細菌、真菌および酵母の酵素（例えば、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ ＣＢＨ Ｉ（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ（１９９４）「Ｔｈｅ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｔｒａｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｉｎ Ｙｅａｓｔ」、Ｏｎｌｉｎｅ、Ｐｉｎｎｅｒ、ＵＫ、５９３〜６００））を含む。簡単な代謝操作技術を使用して、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおいてセルラーゼ活性を生じさせることが可能である。また、酵母は、プロトプラスト融合によりセルロース分解経路のエレメントを強制的に獲得させた（例えば、セロビアーゼ産生酵母であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉの遺伝子間ハイブリッドが作製されている（Ｐｉｎａ Ａら（１９８６）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：９９５〜１００３）。概して、密接に関連する酵母生物体に由来するいずれかのセルラーゼ成分酵素は、プロトプラスト融合により輸送され得る。いくらか広い範囲の酵母により産生されるセロビアーゼは、その多くの様式（例えば、全体、フラグメント化、ＹＡＣ−ベース）のうちの１つにおいてゲノム全体をシャッフリングすることにより利用され得る。
【０２９０】
最適に、使用されるセルラーゼ酵素は、良好な相乗効果、適切な発現レベルおよび宿主からの分泌レベル、良好な比活性（すなわち、宿主の分解因子および酵素改変に対する耐性）ならびに所望のＳＳＦ環境における安定性を提示するべきである。非常に良好な相乗効果を有するハイブリッドセルロース分解経路の例としては、以下の酵素が挙げられる：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｓｅｉのＣＢＨ Ｉエキソセロビオヒドロラーゼ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓＥ１エンドグルカナーゼ、およびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｅｒａ ｆｕｓｃａＥ３エキソセルラーゼ（Ｂａｋｅｒら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７０〜７２：３９５〜４０３）。
【０２９１】
これらの酵素（またはそれらの改良された変異体）は、Ｃａｎａｄｉｄａ ｐｅｌｔａｔａ由来のようなセロビアーゼ（β−グルコシダーゼ）とともに、ＳＳＦ生物体における使用のために考慮されることが、ここで示唆される。考えられる他の可能なセルラーゼ系は、結晶セルロースに対して特に良好な活性を有する（例えば、Ｔ．ｒｅｓｓｅｉセルラーゼ系（Ｔｅｅｒｉ，ＴＴら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２６：１７３〜１７８））か、または特に良好な熱安定性の特徴を有する（例えば、Ｔｈｅｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｆｕｓｃａ（Ｚｈａｎｇ，Ｓ．ら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：３３８６〜３３５）のような好熱生物由来セルラーゼ系）べきである。
【０２９２】
エタノール生成性（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ）酵母宿主におけるセルラーゼのクローニングに対する合理的なアプローチが使用され得た。例えば、公知のセルラーゼ遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプロモーター配列を利用する発現カセット中にクローン化され、そして得られたＤＮＡの直鎖状フラグメントは、ゲノムへの部位特異的組込みを促進するために、末端で短い酵母配列を配置することによって、レシピエントの宿主中に形質転換され得る。これは、遺伝的安定性の理由によりプラスミドの形質転換および形質転換ＤＮＡの維持に好ましい。
【０２９３】
セルロース分解経路全体が導入された場合、選択は、寒天プレートに基づく様式において実行され得、そして多くの数のクローンが短時間でセルラーゼ活性についてアッセイされ得た。例えば、エキソセルラーゼについての選択は、宿主に対して唯一の炭素供給源として可溶性オリゴセルロース基質またはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を提供することによって、利用可能であり得る。そうでなければ、この唯一の炭素供源を含む寒天上では増殖し得ない。活性セルラーゼ経路を産生するクローンは、グルコースを生成するそれらの能力により増殖する。
【０２９４】
あるいは、異なるセルラーゼを連続して導入するならば、唯一の炭素供給源として市販のセロビオースを用いた選択を可能にするセロビアーゼを最初に導入するのに有用であり得る。セロビオース上で増殖し得るＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのいくつかの株は、セロビアーゼ遺伝子の導入により作製された（例えば、Ｒａｊｏｋａ ＭＩら（１９９８）Ｆｌｏｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４３、１２９〜１３５；Ｓｋｏｒｙ，ＣＤら（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．３０、４１７〜４２２；Ｄ’Ａｕｒｉａ，Ｓら（１９９６）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６１、１５７〜１６６；Ａｄａｍ，ＡＣら（１９９５）Ｙｅａｓｔ １１、３９５〜４０６；Ａｄａｍ，ＡＣ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２０、５〜８）。
【０２９５】
この生物体のＣＢＨＩエキソセルラーゼでの続く形質転換は、カルボキシメチルセルロール（ＣＭＣ）ようなセルロース基質上での増殖により選択され得る。最終的には、エンドグルカナーゼの添加が、改善された結晶分解能力を有する酵母株を作製する。
【０２９６】
（２４．五炭糖利用性の付与）
五炭糖利用経路の包括は、潜在的に有用なＳＳＦ生物体に対する重要な面である。エタノール生成のための、キシロース糖利用経路の首尾良い発現は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおいて報告されている（例えば、Ｃｈｅｎ，ＺＤおよびＨｏ，ＮＷＹ（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９／４０ １３５〜１４７）。
【０２９７】
これはまた、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ宿主におけるエタノール生成についてのＬ−アラビノース基質の利用性を達成するのに有用である。Ｌ−アラビノースを利用する酵母株は、いくつかのＣａｎｄｉｄａおよびＰｉｃｈｉａ ｓｐｐ．（ＭｃＭｉｌａｎ ＪＤおよびＢｏｙｎｔｏｎ ＢＬ（１９９４）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５〜４６：５６９〜５８４；Ｄｉｅｎ
ＢＳら（１９９６）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５７〜５８：２３３〜２４２）。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるアラビノース発酵に必要な遺伝子はまた、合理的な手段（例えば、以前にＺ．ｍｏｂｉｌｉｓにおいて行われたように（Ｄｅａｎｄａ，Ｋら（１９９６）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：４４６５〜４４７９））により導入され得る。
【０２９８】
（２５．他の有用な活性の付与）
ＳＳＦ株の最適化に重要ないくつかのほかの形質は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉｚｅへ転移可能であることを示している。熱耐性、セルラーゼ活性および五炭糖利用性のような、これらの形質は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（または、宿主として使用されているＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの特定の株）により通常提示されなくてもよく、そして遺伝的手順により付加されてもよい。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるヒト筋肉アシルホスファターゼの発現は、エタノール生成の増大を示唆した（Ｒｏｕｇｅｉ，Ｇ．ら、（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３：２７３〜２７８）。
【０２９９】
進化したストレス耐性ＳＳＦ株が進化の戦略の過程においていくつかの望ましくない変異を獲得することが起こり得る。実際、これは、変異誘発技術に依存する株の改良戦略に拡がる問題であり、そして非常に不安定なまたは脆弱な株の産生をもたらし得る。これらの所望の形質のいくつかを、合理的な方法（例えば、ノックアウトされたかまたは前回の株の改良においてネガティブに影響した特定の遺伝子のクローニング）により、回復させることが可能である。このアプローチに対する利点は、特異性である−オフェンディング遺伝子が直接標的とされ得ることである。欠点としては、いくつかの遺伝子が弱体化される場合、それが時間の浪費でありかつ繰り返しが多いことであり得、そして特徴付けられた問題を処理するのみであることである。望ましくない／有害な変異の除去に対する好ましい（そしてより伝統的な）アプローチは、進化した株を所望の親株（例えば、元の「宿主」ＳＳＦ株）と戻し交配する。この戦略は、実行可能（すなわち、有性生活環の生殖を有する生物について）である株の改良を通じて首尾良く用いられ得る。有性プロセスの利点を欠く場合、他の方法（例えば、擬似有性組換えまたはプロトプラスト融合）の使用により、達成された。例えば、凝集する能力を、凝集コンピテントのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いたプロトプラスト融合により、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの非凝集株に付与した（Ｗａｔａｒｉ，Ｊ．ら（１９９０）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４：１６７７〜１６８１）。
【０３００】
（Ｎ．インビトロでの全ゲノムシャッフリング）
大きなＤＮＡ配列（例えば、真核生物の染色体）のシャッフリングは、先行技術のインビトロシャッフリング方法より困難である。この制限を克服するための方法を本明細書中に記載する。
【０３０１】
関連する真核生物種の細胞を、穏やかに溶解し、そしてインタクトな染色体を遊離する。次いで、遊離された染色体を、ともに配列決定される類似のサイズの染色体を用いたＦＡＣＳまたは同様の方法（例えば、パルスフィールド電気泳動）により分類する。分類された染色体の各サイズ画分は、一般に、類似染色体（関連する哺乳動物のＹ染色体）のプールを示す。最初の目標は、不可逆的に損傷していないインタクトな染色体を単離することである。
【０３０２】
ＤＮＡポリメラーゼを使用する、そのような大きなＤＮＡの複合体片のフラグメント化および再アセンブリは、困難であり、そして受容不可能な高いレベルのランダム変異を誘導するようである。制限酵素およびＤＮＡリガーゼを使用する代替的アプローチは、可能な少ない崩壊溶液を提供する。染色体画分は、長いＤＮＡ配列（約１５〜２０ｂｐ）を認識する１つ以上の制限酵素（例えば、イントロンおよびインテイン（ｉｎｔｅｉｎ）コードエンドヌクレアーゼ（Ｉ−Ｐｐｏ Ｉ、Ｉ−Ｃｅｕ Ｉ、ＰＩ−Ｐｓｐ Ｉ、ＰＩ−Ｔｌｉ Ｉ、ＰＩ−Ｓｃｅ Ｉ（ＶＤＥ））を用いて消化される。これらの各酵素はそれぞれ、せいぜい各染色体内で数回切断する。そして、大きなフラグメントのコンビナトリアル混合物を生じ、これらはそれぞれ、同じ酵素で切断された他の部位に相補的な突出単一鎖末端を有する。
【０３０３】
消化物はさらに、単鎖エキソヌクレアーゼとの非常に短いインキュベーションにより改変される。選択されたヌクレアーゼの極性は、選択された制限酵素から生じる単鎖突出である、３’突出については５’−３’エキソヌクレアーゼおよび５’突出については３’−５’エキソヌクレアーゼに依存する。この消化は、有意に長い、各ｄｓＤＮＡ末端上のｓｓＤＮＡ突出領域を生じる。このインキュベーションの目的は、組換えが生じ得るＤＮＡの特定領域を規定するＤＮＡの領域を生成することである。次いで、フラグメントは、フラグメントの末端が相同なｓｓＤＮＡ末端を有する他のフラグメントとアニールする条件下で、インキュベートされる。しばしば、この２つのフラグメントのアニーリングは、異なる染色体から生じ、そしてＤＮＡリガーゼの存在下で共有結合し、キメラ染色体を形成する。これは、相同な染色体交叉を模倣する遺伝的多様性を生じる。完全なライゲーション反応は、相同な突出末端を有するフラグメントの全ての可能なライゲーションのコンビナトリアル混合物を含む。この集団のサブセットは、完全なキメラ染色体である。
【０３０４】
シャッフルされたライブラリーをスクリーニングするために、染色体は、染色体全体の取り込みおよび発現が可能な様式で、適切な宿主に送達される。例えば、ＹＡＣ（酵母人工染色体）は、プロトプラスト融合により真核生物細胞に送達され得る。従って、シャッフルライブラリーは、リポソーム中にカプセル化され得、そして適切な宿主細胞のプロトプラストと融合され得る。得られた形質転換体は、増殖され、そして所望の細胞の改善のためにスクリーニングされる。一旦、改善された集団を同定すると、染色体は、単離、シャッフル、そしてスクリーニングが繰り返される。
【０３０５】
（Ｏ．天然のコンピテント微生物の全ゲノムシャッフリング）
天然の形質転換能は、微生物種の個々の細胞が、環境中からＤＮＡを取り込み、そしてそれをその微生物のゲノムに、相同組換えにより組み入れる、いくつかの微生物種で観察される現象である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＡｅｔｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ亜種は、この過程で特に有効であることが公知である。これらおよび類似生物体の全ゲノムシャッフリング（ＷＧＳ）方法は、この過程を用いて記載される。
【０３０６】
全ゲノムシャッフリングの１つの目標は、個々の株の集団からある優位な株への有用な変異の迅速な蓄積である。進化される生物体が天然にコンピテントである場合、天然のコンピテント細胞の、プール由来のＤＮＡとの反復的な形質転換のための分割プール戦略は、この過程をもたらす。例示的な手順は、以下のとおりである。
【０３０７】
種々の有用な形質（例えば、タンパク質の分泌の増強）を実証する天然にコンピテントな生物体の集団を同定する。この株をプールし、そしてそのプールを分割する。そのプールの一方の半分をｇＤＮＡの供給源とし使用し、一方他方を、天然にコンピテントな細胞のプールを生成するために使用する。
【０３０８】
このコンピテントな細胞を、プールしたｇＤＮＡの存在下で増殖し、ＤＮＡの取り込みおよび組換えを可能にする。ある遺伝子型の細胞は、キメラゲノムを有する細胞を発生する異なる型の細胞からｇＤＮＡを取り込み、そして組込む。この結果、元のプールで生じる遺伝子バリエーションのコンビナトリアル混合物を示す細胞集団を得る。これらの細胞を再びプールし、そして同じＤＮＡの供給源を用いて再び形質転換する。この過程を反復的に実行し、形質転換から得られる細胞のゲノムの多様性を増大させる。一旦十分な多様性が生じると、細胞集団は、所望の改善を示す新規のキメラ生物体についてスクリーニングされる。
【０３０９】
この過程は、宿主生物体の天然の形質転換能を増大させることにより増強させる。ＣＯＭＳは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中で発現される場合、一定の規模よりも多く天然の形質転換能に媒介される形質転換の効率を増大させるタンパク質である。
【０３１０】
プラスミドｐＣＯＭＳを保有する細胞の約１００％が、ゲノムＤＮＡフラグメントを取り込み、そしてそれらのゲノム中に組込むことが実証された。一般に、ゲノムの約１０％が、任意の所定の形質転換された細胞中に組み込まれる。この観察は、以下により実証された。
【０３１１】
２つの栄養マーカーについて、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＣＯＭＳの栄養素要求株を、同じ生物体の原栄養株から単離されたゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）で形質転換した。このＤＮＡに曝露された細胞の１０％は、２つの栄養マーカーのうち１つについて原栄養性であった。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにより取り込まれたＤＮＡ鎖の平均サイズは、約５０ｋｂであるか、またはゲノムの約２％である。従って、１０細胞毎に１細胞は、取り込まれたｇＤＮＡの５０分子毎に１分子を示すマーカーを組換えた。従って、細胞の大部分は、約５つの５０ｋｂ分子、またはゲノムの１０％を取り込み、組換わる。この方法は、微生物ゲノムの全体を迅速かつ効率良く組換えるための強力なツールを示す。
【０３１２】
ｐＣＯＭＳの非存在下で、天然のコンピテンシーについて調製された細胞の０．３％のみが特異的マーカーを取り込み、そして組込む。このことは、細胞の約１５％が実際に単一ゲノムフラグメントとの組換えを受けたことを示唆した。従って、上記のような反復的な形質転換戦略は、ｐＣＯＭＳの非存在下でさえ、ゲノム全体をシャッフルしたライブラリーを作製する。しかし、ｐＣＯＭＳの非存在下で、複合ゲノムは、より小さいが、なおスクリーニング可能な形質転換されたか、またはシャッフルされた集団の割合を示す。
【０３１３】
（Ｐ．コングレッション）
コングレッション（ｃｏｎｇｒｅｓｓｉｏｎ）とは、２つの独立した結合していないマーカーの細胞への組込みである。天然のコンピテントなＢ．ｓｕｂｔｉｌｓ細胞の０．３％は、単一のマーカー（上記）を組み込み得る。これらのうち、約１０％がさらなるマーカーを取り込む。従って、ある特定のマーカーの組み込みについて選択するかまたはスクリーニングする場合、得られた集団の１０％は、別の特定のマーカーを組み込んでいる。これは、特定の組み込み事象について富化させる方法を提供する。
【０３１４】
例えば、スクリーニングまたは選択が容易でない遺伝子の組み込みを探索する場合、それは、細胞集団の０．３％として存在する。その集団が第一に特定の組換え事象について選択され、次いで所望の組込みがその集団の１０％に見出される。これは、所望の事象について有意な富化（約３０倍）を示す。この富化は、「コングレッション効果」として定義される。このコングレッション効果は、ｐＣＯＭＳの存在に影響されず、従って、「ｐＣＯＭＳ効果」とは、その非存在下で約１５％からその存在下で１００%である真に天然のコンピテントな、天然のコンピテント細胞の割合を単に増大させることである。全てのコンピテント細胞はなお、ほぼ同じ量のＤＮＡまたはＢａｃｉｌｌｕｓゲノムの約１０％を取り込む。
【０３１５】
このコグレッション効果は、以下の実施例に使用され得、全ゲノムシャッフリングならびにシャッフルされたゲノムの染色体への標的化された組込みを増強する。
【０３１６】
（Ｑ．Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのシャッフリング）
１つの例外はあるが、上記のように、所望の特性を有するＳ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞の集団を同定し、プールし、そしてシャッフルする：一旦、プールした集団を分割し、その集団の半分を、特定の栄養性遺伝子（例えば、アミノ生合成に関与する遺伝子）の組込みおよび崩壊を標的とする配列に隣接する抗生物質選択マーカーで形質転換する。薬物に対する形質転換体の耐性は、その栄養に対して栄養要求性株である。耐性集団を、それらに天然のコンピテントにする条件下でプールし、そして増殖させる（または必要に応じてｐＣＯＭＳでまず形質転換する）。
【０３１７】
次いで、コンピテントな細胞を元のプールから単離したｇＤＮＡで形質転換し、そして原栄養性株を選択する。この原栄養性株集団は、栄養性マーカーの機能的コピーをコードするゲノムフラグメントで組換えを受け、従って、他の遺伝子座でコングレッション効果により組換えを受けた細胞が富化される。
【０３１８】
（Ｒ．遺伝子および遺伝子ライブラリーの染色体への標的化）
遺伝子または遺伝子ライブラリーを細胞染色体中の特定の位置へ直接効率良く送達し得ることが有用である。上記のように、標的細胞は、染色体への相同組換えを標的する配列に隣接するポジティブ選択マーカーで形質転換される。マーカーを保有する選択された細胞は、天然にコンピテント（ｐＣＯＭＳを有してもまたは有さなくてもよいが、好ましくは有する）であるように産生され、そしてＤＮＡフラグメントの２つのセットの混合物で形質転換される。第一のセットは、特定の染色体座へのその組込みを標的化する配列にそれぞれ隣接する遺伝子または遺伝子のシャッフルされたライブラリーを含む。第二のセットは、その組込みおよび第一のポジティブ選択マーカーの置換を標的とする配列に隣接するポジティブ選択マーカー（細胞に最初に組込まれることが異なる）を含む。最適な条件下で、混合物は、遺伝子または遺伝子ライブラリーがポジティブ選択マーカーに対してモル過剰で存在するようである。次いで、形質転換体は、新規のポジティブマーカーを含む細胞について選択される。これらの細胞は、所望の遺伝子または遺伝子ライブラリーのコピーをコングレッション効果により組込んだ細胞について富化し、そして目的の遺伝子または遺伝子改変体を保有する細胞について直接スクリーニングされ得る。このプロセスは、ＰＣＲフラグメント（＜１０ｋｂ）を使用して実行し、そしてコングレッション効果を用いて、集団が富化され得、その結果細胞の５０％が集合体の要素（ｃｏｎｇｒｅｇａｎｔ）であることが見出された。従って、２つの細胞のうち１つは、遺伝子または遺伝子改変体を含む。
【０３１９】
あるいは、発現宿主は、第一のポジティブ選択マーカーが存在しない可能性があり、そしてコンピテントな細胞は、標的遺伝子および制限量の第一のポジティブ選択マーカーフラグメントの混合物で形質転換される。ポジティブマーカーについて選択された細胞は、標的化された遺伝子の所望の特性についてスクリーニングされる。改善された遺伝子は、ＰＣＲにより増幅され、再びシャッフルされ、次いで第一のポジティブ選択マーカーとともに再び元の宿主へ戻される。このプロセスは、所望の遺伝子の機能が入手されるまで、反復的に実行される。このプロセスは、一次宿主株を構築する必要性および２つのポジティブマーカーの必要性を除く。
【０３２０】
（Ｓ．接合媒介遺伝子変換）
接合は、いくつかの方法において細胞のゲノムの進化において用いられ得る。ＤＮＡの接合輸送は、細胞間での接触の間生じる。Ｇｕｉｎｅｙ（１９９３）、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ（Ｃｌｅｗｅｌｌ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、７５〜１０４頁；ＲｅｉｍｍａｎｎおよびＨａａｓ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ（Ｃｌｅｗｅｌｌ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９３）、１３７〜１８８頁（全ての目的でそれらの全体において参考として援用される）を参照のこと。接合は、多くの型のグラム陰性菌間およびいくつかの型のグラム陽性菌間で生じる。接合輸送はまた、細菌細胞と、植物細胞（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）または酵母との間が公知である。特許第５，８３７，４５８号中で議論されるように、接合輸送を担う遺伝子は、それら自体を進化させ細胞型の範囲を（例えば、細菌から哺乳動物へ）そのような輸送が行われ得るその細胞型の間で、拡大し得る。
【０３２１】
接合輸送は、輸送の起点（ｏｒｉＴ）および隣接する遺伝子（ＭＯＢ Ａ、ＢおよびＣ）、およびｔｒａと呼ばれる、接合を生じるために必要な構造および酵素をコードする１５〜２５の遺伝子によりもたらされる。この輸送起源は、ＤＮＡ輸送のためにシスで必要とされる部位として定義される。ｔｒａ遺伝子は、ｔｒａＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｖｉｒＡＢ（対立遺伝子１〜１１）、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、ＩＨＦ、およびＦｉｎＯＰを含む。ｔｒａ遺伝子は、ｏｒｉＴに対してシスまたはトランスで発現され得る。他の細胞酵素（ＲｅｃＢＣＤ経路、ＲｅｃＡ、ＳＳＢタンパク質、ＤＮＡジャイレース、ＤＮＡｐｏｌＩ、およびＤＮＡリガーゼを含む酵素）はまた、接合輸送に関与する。ＲｅｃＥまたはｒｅｃＦ経路は、ＲｅｃＢＣＤの代わりとされ得る。
【０３２２】
ｔｒａ遺伝子によりコードされる１つ構造タンパク質は、性ピリ線毛であり、細胞表面から突き出た単一ポリペプチドの凝集体から構成されたフィラメントである。性ピリ線毛は、レシピテント細胞上の多糖に結合し、そしてＤＮＡが輸送され得る接合性細胞間架橋を形成する。このプロセスは、ＭＯＢ遺伝子（これは、輸送されるべきＤＮＡをｏｒｉＴで特異的に切断する）よりコードされる部位特異的ヌクレアーゼを活性化する。次いで、切断されたＤＮＡは、他のｔｒａ酵素の作用により接合性細胞間架橋を通過される。
【０３２３】
移動性ベクターは、エピソーム形態で存在し得るか、または染色体中に組込まれ得る。エピソーム移動性ベクターを使用して、細胞間で、ベクターへ挿入されたフラグメントを交換し得る。組込まれた移動性ベクターを使用してその染色体から隣接する遺伝子を移動し得る。
【０３２４】
（Ｔ．ゲノムＤＮＡの交換を促進するための組込まれた移動性ベクターの使用）
Ｅ．ｃｏｌｉのＦプラスミドは、高頻度で染色体中へ組込まれ、そして組込み部位から一方向性に遺伝子を移動させる（Ｃｌｅｗｅｌｌ、１９９３、前出；Ｆｉｒｔｈら、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２、２３７７〜２４０１（１９９６）；Ｆｒｏｓｔら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８、１６２〜２１０（１９９４））。他の移動性ベクターは、高頻度で宿主の染色体中に自発的に組み込まれないが、特定の条件下での増殖により誘導されて組込まれ得る（例えば変異誘発剤での処理、プラスミド複製について非許容温度での増殖）。ＲｅｉｍａｎｎおよびＨａｓｓ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ（Ｃｌｅｗｅｌｌ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ １９９３）、Ｃｈ．６を参照のこと。格別の目的は、広範な宿主の範囲により類別化される接合プラスミドのＩｎｃＰ群である（Ｃｌｅｗｅｌｌ、１９９３、前出）。
【０３２５】
接合プラスミド（例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｆ因子）の染色体挿入物を保有するドナー「雄性」細菌は、染色体ＤＮＡを、Ｆ（Ｆ’）を欠くレシピエントの「雌性」腸内細菌に効率良く与え得る。ドナーからレシピエントの接合輸送は、ｏｒｉＴで開始される。ニックを入れた単一鎖のレシピエントへの輸送は、５’から３’への方向で、タンデムな染色体のコピーを移動し得るローリングサイクル機構により生じる。レシピエントに侵入する際、ドナーの鎖は、不連続的に複製される。直鎖状の単鎖ドナーＤＮＡ鎖は、レシピエント内でのｒｅｃＡ媒介性組換えの開始のための潜在的な基質である。ドナー株とレシピエント染色体との間の組換えは、ドナーの形質の遺伝性を生じ得る。従って、Ｆの染色体コピーを有する株は、Ｈｆｒ（高頻度の組換えについて）を設計する（Ｌｏｗ、１９９６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、２４０２〜２４０５頁；Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２、２４０６〜２４１２（１９９６））。
【０３２６】
組込まれた移動性ベクターを有する株が染色体ＤＮＡを輸送する能力は、細菌集団の間の遺伝子物質の迅速かつ効率良い交換手段を提供し、それによりポジティブな変異の組み合わせ、およびネガティブな変異の希釈を可能にする。そのようなシャッフリング方法は、代表的には、少なくともいくつかの遺伝子多様性を有する組込まれた移動性ベクターを有する株の集団で開始する。この遺伝子多様性は、天然のバリエーション、変異誘発剤への曝露、またはフラグメントライブラリーの導入の結果であり得る。この細胞集団は、遺伝子交換、組換え、および組換え遺伝子の発現を可能にするように選択することなく培養される。次いで、細胞はスクリーニングされるか、または所望の特性への進化について選択される。次いで、生存集団の選択／スクリーニングは、ＨＦＲ媒介性遺伝子交換によるシャッフリングのさらなる回に供され得るが、そうでない。
【０３２７】
接合輸送のレシピエントとして組込まれた移動性ベクターを有するＨｆｒおよび他の株の天然の効率は、いくつかの手段により改善され得る。天然のＨＦＲ株の比較的低いレシピエントの効率は、ＦのｔｒａＳ遺伝子およびｔｒａＴ遺伝子の産物に起因する（Ｃｌｅｗｅｌｌ、１９９３、前出；Ｆｉｒｔｈら、１９９６、前出；Ｆｒｏｓｔら、１９９４、前出；Ａｃｈｔｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３８、７７９〜７９５（１９８０））。これらの産物は、Ｆ＋株の内膜および外膜にそれぞれ局在され、それらが、両方がＤＮＡを与え得る２つの株間での重複接合を阻害するように働く。ｔｒａＳおよびｔｒａＴ、ならびに他の接合プラスミド中のコグネイト遺伝子の効果は、これらの酵素を発現し得ないノックアウト細胞の使用により除去され得るか、または炭素を制限した供給源（ｃａｒｂｏｎ−ｌｉｍｉｔｅｄ ｓｏｕｒｃｅ）での細胞の増殖により低減され得る（Ｐｅｔｅｒｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８、３０３７〜３０４３（１９９６））。
【０３２８】
いくつかの方法では、細胞の出発集団は、異なるゲノム部位で組込まれた移動性ベクターを有する。ｏｒｉＴからの方向性輸送は、代表的には、ｏｒｉＴに近い形質が、より頻度の高い遺伝性で生じ得る。これは、交配対が、脆弱であり、そして解離する傾向にあり（特に液体培地の場合には）、その結果輸送の妨害を生じるからである。異なる部位で組込まれた移動性ベクターを有する細胞の集団において、染色体の交換がよりランダムな様式で生じる。Ｈｆｒ株のキットはＥ．ｃｏｌｉ、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ ＣｅｎｔｅｒおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｆｒｏｓｔら、１９９４、前出）から入手可能である。あるいは、ランダムな部位および配位でｏｒｉＴを有する株のライブラリーが、ｏｒｉＴを保有するトランスポゾンを用いた挿入変異誘発により産生され得る。ｏｒｉＴを保有するトランスポゾンの使用（例えば、Ｙａｋｏｂｓｏｎ ＥＡら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４ １０月；１６０（１）：４５１〜４５３に記載されるようなＴｎ５−ｏｒｉＴ）は、そのようなライブラリーを作製する迅速な方法を提供する。トランスポゾンにより運ばれるｏｒｉＴ部位からの移動性についての輸送機能は、ヘルパーベクターによりトランスで提供される。当業者に公知の他の配列を用いて同様の遺伝子構築物を作製することもまた可能である。
【０３２９】
１つの局面において、Ｔｎ−ｏｒｉＴエレメントを用いたゲノムシャッフリングに関する反復的スキームが提供される。原栄養性細菌株または接合プラスミドを保有する関連株のセット（例えば、Ｆ稔性因子または広範な宿主範囲のプラスミドのＩｎｃＰ群のメンバー）は、変異誘発され、そして所望の特性についてスクリーニングされる。所望の特性を有する個体は、Ｔｎ−ｏｒｉＴエレメントで変異誘発され、そしてゲノムを超えて散在した多くの生合成遺伝子のいずれか１つにおけるＴｎ−ｏｒｉＴエレメントの挿入より生じた栄養素要求性の獲得についてスクリーニングされる（例えば、最小培地および完全培地へのレプリカ平板法により）。得られた栄養素要求性株は、プールされ、そして雄性間での接合を（例えば、フィルター膜状の近傍で増殖している間）促進する条件下で接合し得る。輸送機能が元の株セットに存在するヘルパー接合プラスミドにより提供されることに注意のこと。組換えトランス接合体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）は、最小培地上で選択され、そしてさらなる改善のために選択される。
【０３３０】
必要に応じて、組込まれた移動性ベクターを保有する株は、ミスマッチ修復遺伝子において欠損される。配列異常発生から生じるドナー形質の遺伝性は、メチル指向性ミスマッチ修復系を欠く株中で増大される。必要に応じて、組換え効率を減少させる遺伝子産物は、小分子により阻害され得る。
【０３３１】
種間（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、これはＤＮＡレベルで２０％分岐する）での遺伝子間接合輸送はまた、レシピエントの株がｍｕｔＨ、ｍｕｔＬまたｍｕｔＳである場合、可能である（Ｒａｙｓｓｉｇｕｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２、３９６〜４０１（１９８９）を参照のこと）。そのような輸送を使用して、以下の例に示されるように、いくつかの点で組換えを得る。
【０３３２】
１つの例は、地図の位置０でマーカーｔｈｒ５５７、３３分にマーカーｐｙｒＦ２６９０、６２分にマーカーｓｅｒＡ１３および４３分にマーカーｈｆｒＫ３を有するＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｈｆｒドナー株を使用する。ＭｕｔＳ＋／−、Ｆ−Ｅ．ｃｏｌｉレシピエント株は、２１分にマーカーｐｙｒＤ６８、５１分にマーカーａｒｏＣ３５５、８５分にマーカーｉｌｖ３ １６４および５９分にマーカーｍｕｔＳ２１５を有した。三栄養素要求性Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｈｆｒドナーおよび同系遺伝子型ｍｕｔＳ＋／−三栄養素要求性Ｅ．ｃｏｌｉレシピエントを、３ｍｌのＬｂブロス中でインキュベートし、そして十分に増殖するまで３７℃で振盪した。１００μｌのドナーおよび各レシピエントを１０ｍｌの新鮮なＬＢブロス中で混合し、次いで、Ｎａｌｇｅｎｅ ２５０ｍｌの再利用可能な濾過装置を使用して、滅菌したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ０．４５μＭ ＨＡフィルターに沈着させた。復帰変異について調べるために、ドナーおよびレシピエント単独を同様に希釈し、そして沈着させた。細胞を有するフィルターを、３７℃で一晩インキュベートしたＬＢ寒天プレートの表面に対して細胞を有する側を上にして（ｃｅｌｌ−ｓｉｄｅ−ｕｐ）配置した。このフィルターを滅菌した鉗子で補助して除去し、そして滅菌した５ｍｌの最小塩ブロスを含む５０ｍｌチューブ中に配置した。強力なボルテックスを使用してフィルターから細胞を洗浄した。１００μｌの接合混合物、ならびにドナーおよびレシピエントコントロールを、生存細胞の計数のためにＬＢに広げ、そして最小のグルコースを、単一組換え数についての３つのレシピエント要件のうち２つ、二重組換え数についての３つの要件のうち１つ、または三重組換え数についての３つの要件のうちなしのいずれかで補充した。このプレートを３７℃で４８時間インキュベートし、その後コロニーを計数した。
【０３３３】
【表４】
Figure 0004674329
このデータは、組換え体が、Ｈｆｒの接合を使用する合理的な頻度で生成され得ることを示す。属間組換えは、欠損したメチル指向化ミスマッチ修復であるレシピエントにおいて１００〜２００倍増強される。
【０３３４】
頻度は、レシピエント細胞に対するドナーの比率を増加することにより、または以前に生成された組換え子孫を有する元々のドナー株を繰り返し接合することによりさらに増強される。
【０３３５】
（Ｕ．接合によるフラグメントの導入）
可溶性（ｓｏｂｉｌｉｚａｂｌｅ）ベクターはまた、進化されるように細胞中にフラグメントライブラリーを移すために使用され得る。このアプローチは、進化されるような細胞が、フラグメントライブラリーでは直接的に効率良く形質転換され得ないが、フラグメントライブラリーで形質転換され得る初代細胞と接合され得る状況において、特に有用である。
【０３３６】
宿主細胞中に導入されるべきＤＮＡフラグメントは、宿主細胞ゲノムに対する多様性を包含する。この多様性は、天然の多様性または変異誘発の結果であり得る。ＤＮＡフラグメントライブラリーは、移入起点を有する移動性ベクター中にクローニングされる。いくつかのそのようなベクターはまた、ｍｏｂ遺伝子を含むが、代替のこれらの機能はまた、トランスに提供され得る。ベクターは、初代細胞と意図される宿主細胞との間の効率的な接合輸送（ｃｏｎｊｕｇａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を可能にするべきである。ベクターはまた、選択可能な表現型を付与するべきである。この表現型は、進化される表現型と同じであり得るか、またはマーカー（例えば、薬物耐性マーカー）により付与され得る。このベクターは、好ましくは、意図された宿主細胞における自己排除を可能にするべきであり、それによりクローニングされたフラグメントが複製よりもむしろ相同な宿主セグメントとの遺伝的交換を受ける細胞についての選択を可能にする。意図される宿主型における元々の複製機能を欠いたベクターの使用またはそのベクター中のネガティブな選択マーカーの包含により、そのようなことが達成され得る。
【０３３７】
１つの適切なベクターは、Ｓｉｍｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １、７８４−７９１（１９８３）；ＴｒｉｅｕＣｕｏｔら、Ｇｅｎｅ １０２、９９−１０４（１９９１）；Ｂｉｅｒｍａｎら、Ｇｅｎｅ １１６：４３−４９（１９９２）により記載される広範な宿主範囲の接合プラスミドである。これらのプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換され得、次いで、受動能の化学的または電気的誘導により形質転換することが困難であるかまたは不可能である細菌中に強制的に接合される（ｆｏｒｃｅ−ｍａｔｅｄ）。これらのプラスミドは、元々のＩｎｃＰプラスミドであるｏｒｉＴを含む。動員機能は、必要な遺伝子の染色体が組み込まれたコピーによりトランスに供給される。ＤＮＡの接合輸送は、いくつかの場合において、ペニシリンの半阻害性（ｓｕｂ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）濃度でのレシピエント（グラム陽性の場合）の処理により補助され得る（Ｔｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔら、１９９３ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０９、１９−２３）。集団において多様性を増加させるために、スクリーニングの前に接合（ｃｏｎｊｕｇａｌ ｍａｔｉｎｇ）が、くり返し実施される。
【０３３８】
ライブラリーのフラグメントとの対立遺伝子対交換を受けた細胞は、所望の表現型に対する進化についてスクリーニングまたは選択され得る。次の回の組換えは、接合輸送工程の繰り返しにより実施され得る。このフラグメントのライブラリーは、新鮮であり得るか、または以前の回の選択／スクリーニングの生存細胞のいくつか（全てではない）から得られ得る。接合媒介シャッフリングは、他のシャッフリング方法と組み合わせられ得る。
【０３３９】
（Ｖ．形質導入ファージにより促進される遺伝子交換）
ファージの形質導入は、ある細胞から別の細胞への、ウイルス外被中の非ウイルス性遺伝物質の転移を含み得る（Ｍａｓｔｅｒｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２、２４２１−２４４２（１９９６）。おそらく、広汎性の形質導入ファージの２つの最良の例は、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのバクテリオファージＰ１およびＰ２２である。広汎性の形質導入バクテリオファージ粒子は、ウイルスゲノムサイズの、二本鎖のフラグメントの宿主の（これは、ドナーとして役立つ）染色体ＤＮＡが、ファージヘッド（ｐｈａｇｅ ｈｅａｄ）中にパッケージングされる場合、溶菌性感染の間低頻度で形成される。ほとんど配列特異性を有さないＤＮＡを効率的にパッケージするバクテリオファージＰ２２の乱交雑な高形質導入（ＨＴ）変異体が単離された。感受性宿主の感染は、ファージの５０％までが形質導入粒子である溶菌産物を生じる。感受性レシピエント細胞への広汎性の形質導入粒子の吸着は、ドナー染色体フラグメント注入を生じる。ドナーフラグメントの注入後の、ＲｅｃＡ媒介相同組換えは、ドナー形質の遺伝を生じ得る。宿主染色体中へのＤＮＡの準無作為挿入を達成するファージの別の型はＭｕである。Ｍｕ生物学の概説についてはＧｒｏｉｓｍａｎ（１９９１）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖ．２０４を参照のこと。Ｍｕは、種々の染色体再配列（欠失、反転、重複および転移を含む）を生成し得る。さらに、Ｐ２２およびＭｕの特徴を組み合わせるエレメント（Ｐ２２ ａｔｔ部位およびｉｎｔ遺伝子に代わってＭｕゲノムの末端を含むＭｕｄ−Ｐ２２を含む）が、利用可能である。Ｂｅｒｇ（前出）を参照のこと。
【０３４０】
広汎性の形質導入ファージを使用して、遺伝的多様性を包含する細胞集団とファージによる感染に対して感受性の細胞集団との間の遺伝物質を交換し得る。遺伝的多様性は、細胞の変異が誘導された細胞間の天然のバリエーションの結果であり得るか、または細胞中へのフラグメントライブラリーの導入の結果であり得る。次いで、ＤＮＡは、広汎性の形質導入により細胞間で交換される。ファージが細胞の溶菌を引き起こさない場合、完全な細胞の集団が、ファージの存在下で増殖され得る。ファージが溶菌性感染を生じる場合、形質導入が、分割プールベースで行なわれる。すなわち、細胞の開始集団は、２つに分割される。１つの亜集団を使用して、形質導入ファージを調製する。次いで、形質導入ファージを他の亜集団中に感染させる。好ましくは、感染は、細胞あたり非常に多数のファージで実施され、その結果、感染せずに残る細胞はほとんどない。感染を生き延びる細胞は、増殖され、そして所望の特性に対する進化についてスクリーニングされるかまたは選択される。次いで、スクリーニング／選択を生き延びる細胞のプールは、広汎性の形質導入のさらなる回によるか、または他のシャッフリング方法によりシャッフリングされ得る。反復的な分割プールの形質導入は、必要に応じて、スクリーニングされる任意の集団の多様性の増加について選択する前に実施される。
【０３４１】
上記の方法の効率は、感染性（非形質導入ファージ）による細胞の感染の減少および溶原形成の減少により増加され得る。前者は、二価のカチオンのキレート剤（例えば、培養培地中のクエン酸塩およびＥＧＴＡ）の封入により達成され得る。テール欠損形質導入ファージを使用して、単回の感染のみを可能にし得る。二価のカチオンは、ファージの吸収およびキレート剤の封入に必要とされ、それゆえ、望ましくない感染を予防する手段を提供する。広汎性の形質導入ファージの組み込み欠損（ｉｎｆ）誘導体を使用して、溶原形成を防止し得る。さらなるバリエーションにおいて、ミスマッチ修復遺伝子における欠損を有する宿主細胞を使用して、形質導入されたＤＮＡとゲノムＤＮＡとの間の組換えを増加し得る。
【０３４２】
（１．ＤＮＡシャッフリングを促進するための固定化（ｌｏｃｋｅｄ ｉｎ）プロファージの使用）
ドナーからレシピエントへのＤＮＡを移入する手段としてファージの形質導入を使用する生物の全ゲノムシャッフリングを促進する手段としての（固定化プロファージ）ハイブリッドな可動性遺伝的エレメントの使用は、好ましい実施態様である。鋳型ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＰ２２に基づく１つのそのようなエレメント（Ｍｕｄ−Ｐ２２）は、変異の遺伝的および物理的マッピングにおける使用について記載されている。Ｙｏｕｄｅｒｉａｎら（１９８８）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１８：５８１−５９２、ならびにＢｅｎｓｏｎおよびＧｏｌｄｍａｎ（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４（５）：１６７３−１６８１を参照のこと。個々のＭｕｄ−Ｐ２２挿入物は、ファージＰ２２粒子中へのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ染色体の特定の領域をパッケージングする。無作為なＭｕｄ−Ｐ２２挿入物のライブラリーは、容易に単離および誘導され得て、無作為染色体ＤＮＡフラグメントをパッケージングするファージ粒子のプールを作製し得る。これらのファージ粒子を使用して、新しい細胞に感染し得、そして形質導入の過程において宿主からレシピエントへＤＮＡを移入し得る。あるいは、パッケージングされた染色体ＤＮＡは、単離され得、そして染色体中にそれらが組みこまれた場合、形質転換またはエレクトロポレーションにより細胞中（特に直鎖状ＤＮＡについてはｒｅｃＤ細胞）に再導入される前に、ＤＮＡシャッフリングまたは任意の他の変異誘発技術のような技術によりさらに操作され得る。
【０３４３】
インタクトな形質導入ファージ粒子または単離されたＤＮＡのいずれかは、細胞中に再導入される前に、種々の変異誘発に供され、変異率を増強し得る。ミューテーター細胞株（例えば、ｍｕｔＤ）はまたファージの増殖のために使用され得る。いずれかの方法を所望の特性を有する遺伝子または株を作製する過程において反復的に使用し得る。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＬＰＳ遺伝子のコスミドクローンを保有するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｐ２２ファージにより感染可能である。輸送可能なエレメントの他の組み合わせおよびバクテリオファージもしくはウイルスなどを使用して類似の遺伝エレメント発現させることが可能である。
【０３４４】
Ｐ２２は、「多頭」機構により予めアセンブルされた（ｐｒｅａｓｓｅｍｂｌｅ）ファージ粒子（ヘッド）中にそのＤＮＡをパッケージングするラムダファージである。ファージＤＮＡのパッケージングは、特定の部位（ｐａｅ）で開始され、そして通常、直線状の二本鎖のコンカテマー性分子を伴って一方向性に進行される。ファージヘッドが、完全（約４３ｋｂ）である場合、ＤＮＡ鎖は、切断され、そして次のファージヘッドのパッケージングが開始される。しかし、固定化または切除欠損Ｐ２２プロファージは、ｐａｃ部位にてパッケージングが開始され、次いで、染色体に沿って一方向性に進行し、多頭性の染色体ＤＮＡ（ファージＤＮＡよりむしろ）を首尾良くパッケージングする。これらの形質導入ファージが、新しいＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞に感染する場合、それらは、元々の宿主からレシピエント細胞へ染色体ＤＮＡを注入し、レシピエント細胞は、キメラ染色体を作製する相同組み換えにより染色体中に組み込まれ得る。高い感染多重度でのレシピエント細胞の感染の際に、組み換えがまた、染色体中の組換え前に次ぎの形質導入フラグメント間に生じ得る。
【０３４５】
染色体の種々の部位でのそのような固定化Ｐ２２プロファージの組み込みは、隣接する領域が増幅およびファージ粒子中にパッケージングされることを可能にする。Ｍｕｄ−Ｐ２２の可動性遺伝エレメントは、ファージ／トランスポゾンＭｕの末端により隣接される切除−欠損Ｐ２２プロファージを含む。完全なＭｕｄ−Ｐ２２エレメントは、Ｍｕ ＡおよびＢタンパク質が、トランスに提供される場合、染色体または他のエピソーム（例えば、Ｆ’、ＢＡＣクローン）中の実質的にどの位置へも置きかえられ得る。
【０３４６】
この型の遺伝エレメントについての多くの実施態様が利用可能である。１つの例において、固定化プロファージは、広汎性の形質導入ファージとして使用されて、ドナー染色体の無作為フラグメントをレシピエント中に転移する。Ｍｕｄ−Ｐ２２エレメントは、Ｍｕ ＡおよびＢトランスポザーゼタンパク質がトランスに提供され、そして染色体中の無作為な位置でそれ自身のコピーを組みこむ場合、トランスポゾンとして作用する。この様式において、無作為染色体Ｍｕｄ−Ｐ２２挿入物のライブラリーは、適切な宿主中で生成され得る。このライブラリー中のＭｕｄ−Ｐ２２プロファージが誘導される場合、染色体ＤＮＡの無作為フラグメントが、ファージ粒子中にパッケージングされる。これらのファージがレシピエント細胞に感染する場合、この染色体ＤＮＡが注入され、そしてレシピエントの染色体中へ組換え得る。これらのレシピエント細胞は、所望の特性についてスクリーニングされ、次いで、改善を示す細胞が増殖される。このプロセスは、繰り返され得る。なぜなら、Ｍｕｄ−Ｐ２２遺伝エレメントは、このプロセスにおいてレシピエントに伝達されないからである。高い多様性での感染は、複数の染色体フラグメントについて、レシピエント染色体への挿入および組換えを可能にする。
【０３４７】
固定化プロファージはまた、特定化形質導入ファージとして使用され得る。目的の遺伝子付近への個々の挿入は、種々の方法により無作為挿入ライブラリーから単離され得る。これらの特定のプロファージの導入は、ファージ粒子中の目的の遺伝子を含む隣接する染色体ＤＮＡのパッケージングを生じる。これらのファージでのレシピエント細胞の感染および染色体中にパッケージングされたＤＮＡの組換えは、所望の特性についてスクリーニングされ得るキメラ遺伝子を作成する。感染細胞の高い多様性での感染は、染色体中への組換えの前に、次の形質導入フラグメント間の組換えを可能にし得る。
【０３４８】
これらの特定化された形質導入ファージをまた使用して、いかなる既知のＤＮＡ配列も有さない目的の特定の遺伝子を含む大量の高品質ＤＮＡを単離し得る。特定の遺伝子のクローニングは、必要とはされない。例えば、生合成オペロンに隣接するそのようなエレメントの挿入は、オペロンからの大量のＤＮＡについて、ＤＮＡシャッフリング（インビトロおよび／またはインビボ）、クローニング、配列決定または本明細書中に示される他の使用における使用のために単離されることを可能にする。相同なオペロンを含む他の生物における同様の挿入物から単離されたＤＮＡは、必要に応じて、本明細書中に記載されるように、異なる生物からの相同な遺伝子において（または単一の種内の異なる染色体位置、あるいはその両方）ファミリーシャッフリング形式において使用するために混合される。あるいは、形質導入された集団は、プールされた形質導入ファージまたは以前の形質導入細胞から生成された新規の形質導入ファージで反復的に形質導入される。これは、シャッフリング前に遺伝子の多様性が最適化されるまで反復的に実行され得る。
【０３４９】
種々の株または相同なオペロンを含有する生物における挿入物から単離されたファージは、必要に応じて混合され、そして使用されて、染色体中への組換え前に次の形質導入フラグメント間の組換えを可能にする高いＭＯＩで細胞に同時感染する。
【０３５０】
固定化プロファージは、遺伝子、オペロンおよび／または所望の表現型または所望されない表現型のいずれかでの特定の変異のマッピングに有用である。固定化プロファージはまた、所定の宿主における複製の変異を分離およびマッピングするための手段を提供し得る。目的の遺伝子またはオペロンの外側の有益な変異について探索されるならば、改変されていない遺伝子またはオペロンが、変異誘発された宿主もしくはシャッフリングされた宿主中に形質導入され得、次いで所望の二次的な変異の存在についてスクリーニングされ得る。あるいは、目的の遺伝子／オペロンは、変異誘発／シャッフリングされた宿主から、遺伝子／オペロン自体の改変についてスクリーニング／選択するための異なるバックグラウンドへ容易に移動され得る。
【０３５１】
他の転移性の（ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ）エレメントおよびバクテリオファージまたはウイルスなどの組み合わせを用いる同様の遺伝エレメントを開発することもまた可能である。同様の系が、他の生物（例えば、Ｐ２２またはＰ１の複製を可能にしない生物）において示される。広範な宿主範囲のファージおよび転移性エレメントが、特に有用である。同様の遺伝エレメントは、多頭機構によりまたパッケージングする他の鋳型ファージ由来である。一般的に、広汎性の形質導入が可能であるファージが存在する。ウイルスに感染する真核生物細胞は、同様の目的に適用され得る。有用な広汎性の形質導入ファージの例が以下に記載される：
【０３５２】
【表５】
Figure 0004674329
Ｍｕｄ−Ｐ２２と比較され得るＭｕｄ−Ｐ１／Ｔｎ−Ｐ１の系は、ファージＰ１を用いて開発される。ファージＰ１は、多頭あたりより大きな（約１１０ｋｂ）フラグメントをパッケージングする利点を有する。ファージＰ１は、容易に使用され、細菌性人工染色体すなわちＢＡＣを作製する。Ｐ１ベースのＢＡＣベクターは、これらの原則に沿って設計され、その結果、クローニングされたＤＮＡは、単一コピーのエピソームからのＤＮＡ調製物を必要とする現在の系よりもファージ粒子中にパッケージングされる。これは、安定な単一コピー形式においてクローニングされた遺伝子を有する両方の系の利点を合わせるが、一方プロファージの誘導の際にクローニングされたＤＮＡの増幅および特定のパッケージングを可能にする。
【０３５３】
（Ｗ．遺伝子の文脈の最適化のためのゲノム全体にわたる遺伝子または改良された遺伝子の無作為配置）
宿主の染色体またはエピソームにおける遺伝子の配置および配向（染色体における遺伝子の「文脈」）は、遺伝子の発現および活性に大きな効果を有する。非相同組換えにより宿主染色体内へのプラスミドまたは他のエピソーム配列の無作為組み込み、次いで、所望の表現型についての選択またはスクリーニングは、標的の発現についての最適な染色体の位置を同定する好ましい方法である。この戦略は、図１８に例示される。
【０３５４】
種々のトランスポゾンが媒介する伝達系を使用して、目的の遺伝子（個々の遺伝子、ゲノムライブラリーまたは宿主のゲノム全体にわたって無作為にシャッフリングされた遺伝子のライブラリーのいずれか）を送達し得る。従って、１つの好ましい実施態様において、細胞の機能の改良は、トランスポゾン送達ビヒクル中に、目的の遺伝子（例えば、所望の代謝経路をコードする遺伝子）のクローニングにより達成され得る。
【０３５５】
このようなトランスポゾンビヒクルは、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の両方について利用可能である。Ｄｅ Ｌｏｒｅｎｚｏ ａｎｄ Ｔｉｍｉｓ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２３５：３８５−４０４は、Ｔｎ５およびＴｎ１０に由来するミニトランスポゾンを有するグラム陰性細菌における安定な表現型の分析および構築を記載する。Ｋｌｅｃｋｎｅｒら（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０４、第７章は、グラム陽性細菌において使用することを含むＴｎ１０のようなトランスポゾンの使用を記載する。Ｐｅｔｉｔら（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７２（１２）：６７３６−６７４０は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて活性なＴｎ１０由来のトランスポゾンを記載する。トランスポゾン送達ビヒクルは、細胞集団中に導入され、これは、次いで、ゲノム中に組み込まれたトランスポゾンを有する組換え細胞について選択される。
【０３５６】
選択は、代表的に、トランスポゾン内にもまた保有される任意の種々の薬物耐性マーカーによる。選択された亜集団は、目的の遺伝子の改良された発現を有する細胞についてスクリーニングされ得る。一旦、最適な位置に目的の遺伝子を保有する細胞が単離されると、遺伝子は、ＰＣＲを用いてゲノム中から増幅され、シャッフリングされ、そしてトランスポゾン内に異なる選択マーカーを有し、そしてトランスポゾン組み込み遺伝子を欠失する同様のトランスポゾン送達ビヒクル中にクローニングして戻される。
【０３５７】
次いで、シャッフリングされたライブラリーは、形質転換されて、元々のトランスポゾンを保有する株中に戻され、そして細胞が、新規な耐性マーカーの存在、および以前の選択マーカーの欠失について選択される。選択された細胞は、元々のトランスポゾンのシャッフリングされたライブラリーのメンバーを保有する新規なトランスポゾンについての相同組換えにより交換された細胞について富化される。次いで、生存細胞は、所望の表現型の発現におけるさらなる改良についてスクリーニングされる。次いで、改良された細胞から遺伝子がＰＣＲにより増幅され、そして再度シャッフリングされる。このプロセスは、反復的に実行され、異なる選択マーカー間の各サイクルを往復する。一旦、目的の遺伝子が、所望のレベルまで最適化され、そのフラグメントが、増幅され、そして改良された遺伝子の最適の位置を同定するために上記のようにゲノム全体にわたり再び無作為に分配され得る。
【０３５８】
あるいは、所望の特性を付与するこの遺伝子は、公知であり得る。この場合、トランスポゾン送達ビヒクル内にクローニングされたＤＮＡフラグメントは、所望の特性を有する一つ以上の株に由来する細胞の集団から生じるゲノムフラグメントのライブラリーであり得る。このライブラリーは、所望の特性を有するかまたは欠失する一つ以上の株に由来する細胞の集団に送達され、そしてトランスポゾンを取り込む細胞が、選択される。次いで、生存細胞が、所望の特性の獲得または改良についてスクリーニングされる。生存細胞中に含まれるこのフラグメントはＰＣＲにより増幅され、次いで、第１の送達ベクター由来の異なる選択マーカーを保有する同様のトランスポゾン送達ベクター内にプールとしてクローニングされる。次いで、このライブラリーは、生存細胞のプールに送達され、そして新規な選択マーカーを獲得した集団が選択される。次いで、選択された細胞が、所望の特性のさらなる獲得または改良についてスクリーニングされる。この方法において、所望の表現型を付与または改良する異なる可能な遺伝子の組み合わせが、コンビナトリアル様式において探索される。このプロセスは、さらなる選択マーカーを使用する新規な各サイクルで反復的に実行される。あるいは、ＰＣＲフラグメントは、異なる選択マーカーを有するトランスポゾンベクターのプール中にクローニングされる。これらは、細胞に送達され、そして１、２、３またはそれより多いマーカーについて選択される。
【０３５９】
あるいは、各改良された細胞から増幅されたフラグメントは、別々にシャッフリングされる。次いで、このシャッフリングされたライブラリーが、元々のベクターに類似するが異なる選択マーカーを含有し、かつトランスポザーゼ遺伝子をを欠くトランスポゾン送達ビヒクル中にクローニングして戻される。次いで、選択は、新規のマーカーの獲得および以前のマーカーの欠失について行なわれる。選択された細胞は、相同組換えにより、増幅された遺伝子のシャッフリングされた改変体を取り込む細胞について富化される。このプロセスは、反復的に実行され、２つの選択マーカー間の各サイクルを往復する。
【０３６０】
（Ｘ．所望の表現型についての過剰発現遺伝子の改良）
細胞の特性または表現型の改良は、しばしば、その特性の発現を予期する遺伝子のコピー数または発現の増加により増強される。所望の特性に対するそのような効果を有する遺伝子はまた、同様の効果を有するＤＮＡシャッフリングにより改良され得る。ゲノムＤＮＡライブラリーは、過剰発現ベクター中にクローニングされ、そして標的細胞集団中に形質転換され、その結果、ゲノムフラグメントが、過剰発現ベクターの存在について選択される細胞において高度に発現される。次いで、選択された細胞は、所望の特性の改良についてスクリーニングされる。改良された細胞由来の過剰発現ベクターが単離され、そしてクローニングされたゲノムフラグメントがシャッフリングされる。各改良された単離物由来のベクターに保有されるゲノムフラグメントは、別々にシャッフリングされるか、または同定された相同な遺伝子とともにシャッフリングされる（ファミリーシャッフリング）。次いで、シャッフリングされたライブラリーは、細胞の集団に送達し戻され、そして選択された形質転換体は、所望の特性におけるさらなる改良について再スクリーニングされる。このシャッフリング／スクリーニングプロセスは、所望の特性が、所望のレベルにまで最適化されるまで反復的に繰り返される。
【０３６１】
上記のように、遺伝子投与量は、所望の細胞特性を非常に増強し得る。未知の遺伝子の遺伝子コピー数を増加する１つの方法は、無作為増幅を用いる方法である（Ｍａｖｉｎｇｕｉら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１５、５６４もまた参照のこと）。この方法において、ゲノムライブラリーは、高用量にてまた増強された表現型を提供する選択マーカーを含有する自殺ベクター中にクローニングされる。そのようなマーカーの例は、カナマイシン耐性遺伝子である。連続的な高いコピー数にて、連続的な高レベルのカナマイシンに対する耐性が達成される。このゲノムライブラリーは、任意の種々の方法（形質転換、形質導入、接合などを含む）により標的細胞に送達される。ベクターとクローニングされた遺伝子の染色体コピーとの間の相同組換えにより染色体中に取りこまれたベクターを有する細胞は、ベクターが複製されない条件下で選択マーカーの発現が要求されることにより選択され得る。この組換え事象は、ベクターのコピーおよび２つのコピーを分離する選択マーカーを有する宿主染色体中のクローニングされたＤＮＡフラグメントの重複を生じる。この生存細胞の集団は、遺伝子重複事象の結果である所望の細胞特性の改良についてスクリーニングされる。元々のクローニングされたＤＮＡフラグメントのさらなるコピーを生じる、さらなる遺伝子重複事象は、連続したよりストリンジェントな選択条件（すなわち、カナマイシンの増加した濃度）下での細胞のさらなる増殖により生成され得る。これらの場合において、選択は、選択マーカーのコピーの増加を必要とするが、所望の遺伝子フラグメントのコピーの増加もまたともなう。生存細胞は、所望の表現型における改良についてさらにスクリーニングされる。生じる細胞の集団は、異なる遺伝子の増幅を生じるようである。なぜなら、しばしば、多くの遺伝子が所定の表現型に影響するからである。これらの遺伝子の可能な組み合わせのライブラリーを生成するために、表現型の改良を示す元々の選択されたライブラリーは、本明細書中で記載される方法（例えば、プロトプラスト融合、分割プールの形質導入（ｓｐｌｉｔ ｐｏｏｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）形質転換、接合など）を用いて組換えられる。
【０３６２】
組換え細胞は、選択マーカーの発現の増加について選択される。生存者は、相同組換えによりベクター配列のさらなるコピーの取りこみを有する細胞について富化され、そしてこれらの細胞は、異なる遺伝子の組み合わされた重複を有する細胞について富化される。言いかえると、増強された表現型の１つの細胞由来の重複は、増強された表現型の別の細胞の重複と組み合わされる。これらの生存者は、所望の表現型におけるさらなる改良についてスクリーニングされる。この手順は、所望のレベルの表現型の発現が達成されるまで、反復的に繰り返される。
【０３６３】
あるいは、同定されたか、または増加されたコピー数における利点を有することが疑われる遺伝子が、適切なプラスミドベクター中にタンデムでクローニングされる。次いで、これらのベクターは、形質転換され、そして適切な宿主生物中で増殖される。クローニングされた遺伝子間フラグメントのプラスミド−プラスミド組換えは、さらなる遺伝子の重複を生じる。プラスミド二重鎖（ｄｏｕｂｌｅｔ）の分解は、さらなる遺伝子のコピーを有するいくつかのプラスミドおよびより少ない遺伝子コピーを有する他のプラスミドを含む遺伝子のコピーの一様でない分配を生じる。次いで、このプラスミドの分配を保有する細胞は、遺伝子の重複により影響される表現型における改良についてスクリーニングされる。
【０３６４】
まとめると、上記の手順による核酸配列の増加したコピー数について選択する方法が提供される。この方法において、用量感受性選択マーカーを含む自殺ベクターのゲノムライブラリーが、上記に記載されるように提供される。このゲノムライブラリーは、標的細胞の集団中に形質導入される。標的細胞は、自殺ベクターがエピソーム的に（ｅｐｉｓｏｍａｌｌｙ）複製されない条件下の選択マーカーの用量の増加について標的細胞の集団中でスクリーニングされる。複数の標的細胞が、所望の表現型について選択され、組換えられ、そして再選択される。このプロセスは、所望であれば、所望の表現型が得られるまで反復的に繰り返される。
【０３６５】
（Ｙ．直鎖状ＤＮＡフラグメントの形質転換を介したゲノムのシャッフリングを改良するための戦略）
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の野生型メンバーは、代表的に、直鎖状ＤＮＡ分子の形質転換後の遺伝子交換に対して耐性である。これは、形質転換後の直鎖状ＤＮＡ分子を急速に分解するＲｅｃＢＣＤホロ酵素のＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖ（Ｅｘｏ Ｖ）の活性に少なくとも一部は起因する。Ｅｘｏ Ｖの産物は、ホロ酵素のＤサブユニットをコードするｒｅｃＤ遺伝子に切り詰められる。Ｒｕｓｓｅｌら（１９８９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ２６０９−２６１３により実証されるように、形質転換された直鎖状ドナーＤＮＡ分子とレシピエントの染色体との間の相同組換えは、ｒｅｃＤ変異体における機能変異の欠失を保有する株において容易に検出される。ｒｅｃＤ株の使用は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅのゲノムシャッフリングのための簡単な手段を提供する。例えば、ｒｅｃＤヌル変異（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＤ １９０３：：ミニ−Ｔｅｔ対立遺伝子）を保有する、細菌株または関連株は、変異誘発され、そして所望の特性についてスクリーニングされる。分割プール様式において、１アリコート上で調製された染色体ＤＮＡは、第２のアリコートを（例えば、エレクトロポレーションまたは化学的に誘導された形質転換能を介して）形質転換するために使用され得る。次いで、得られた形質転換体は、改良についてスクリーニングされるか、またはスクリーニングの前に反復的に形質転換される。
【０３６６】
上述のようなＲｅｃＥ／ｒｅｃＴの使用は、直鎖状ＤＮＡフラグメントの相同組換えを改良し得る。
【０３６７】
ＲｅｃＢＣＤホロ酵素は、ＲｅｃＡ依存性相同組換えの開始に重要な役割を果たす。ｄｓＤＮＡ末端の認識の際に、ＲｅｃＢＣＤ酵素は、ヌクレアーゼ活性を減衰する、χ（すなわち「ｘ」）部位（コンセンサス５’−ＧＣＴＧＧＴＧＧ−３’）に遭遇するまで、５’から３’方向に非対称的にＤＮＡをほぐしそして分解する。これは、ＲｅｃＡローディングに好ましい３’−ｓｓＤＮＡテールを有するｃ部位付近で終結するｓｓＤＮＡの生成を生じ、次いで、相同組換えに対してｄｓＤＮＡを侵害する。従って、形質転換の前に、ラムダ（λ）エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能）のような５’から３’への特異的ｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼを有する形質転換フラグメントのプレプロセシング（ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を供し、ＲｅｃＡローディングについてのｓｓＤＮＡ侵襲性末端を提供することによりｒｅｃＤ-における相同組換えを刺激し得、次いで鎖を侵襲し得る。
【０３６８】
χ部位（コンセンサス５’−ＧＣＴＧＧＴＧＧ−３’）をコードするＤＮＡ配列のＤＮＡフラグメントへの添加は、エキソヌクレアーゼＶ活性の減衰および相同組換えの刺激の両方に供し得、それにより、ｒｅｃＤ変異の必要を取り除く（Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉら（１９９４）「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４０１−４６５およびＪｅｓｓｅｎら（１９９８）「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｈｉ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：５１２１−５１２６もまた参照のこと）。
【０３６９】
χ部位は、必要に応じて、リンカー中に含まれ、形質転換フラグメントの末端に連結されるか、または形質転換されるＤＮＡフラグメントを生成するために使用される外部プライマー中に取りこまれる。χのような組換え刺激配列の使用は、一般的に、フラグメントの形質転換による広範な範囲の細胞型の進化のためのアプローチに有用である。
【０３７０】
Ｅｘｏ Ｖまたは他のヌクレアーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（ｅｎｄＡＩ）、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ（ｎｔｈ）、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＶ（ｎｆｏ）、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＶＩＩおよびＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＶＩＩＩ）のアナログの阻害もしくは変異のための方法は、同様に有用である。ヌクレアーゼの阻害もしくは排除、またはエキソヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与する形質転換ＤＮＡフラグメントの末端の変異は、広範な範囲の細胞型の進化において適用を有する。
【０３７１】
（Ｚ．未知相互作用を最適化するためのシャッフリング）
多くの観察された形質は、複数の遺伝子または遺伝子産物の複雑な相互作用の結果である。多くのこのような相互作用はなお特徴付けられていない。従って、この形質に寄与するいくつかの遺伝子がたとえ知られていたとしても、どの遺伝子が、所望の形質を達成するために最適化される必要があるかはしばしば不明確である。
【０３７２】
この特徴付けの欠如は、ＤＮＡシャッフリングの間には問題ではなく、これは、何が選択されるのであっても最適化する解決を生成する。この課題のみならず、予測される将来の律速因子もまた解決する可能性を有する代替のアプローチは、未知ゲノム配列の過剰発現による相補性である。
【０３７３】
ゲノムＤＮＡのライブラリーが、最初、記載のように（前述）作製される。これは、最適化されるべき細胞中に形質転換され、そして形質転換体が、所望の性質における増加についてスクリーニングされる。改良された性質を生じるゲノムフラグメントは、ＤＮＡシャッフリングにより進化され、それらの有益な影響をさらに増大する。このアプローチは、配列情報を必要とせず、タンパク質の性質または経路相互作用、さらにはどの工程が律速であるかについてなんらの知識または仮定をも必要とせず；それは、所望の表現型の検出のみに依存する。この種類のランダムクローニング、およびポジティブに相互作用するゲノム配列のＤＮＡシャッフリングによる引き続く進化は、極度に強力かつ一般的である。ゲノムＤＮＡの、同系遺伝子型株から、潜在的に所望の性質を有するより遠く関連する種まで、種々の供給源を用いる。さらに、この技法は、形質転換およびクローニングベクターの分子生物学の基礎が利用可能である任意の細胞に、そしてアッセイされ得る（好ましくは高処理能力フォーマットで）任意の性質について適用可能である。あるいは、一旦最適化されたなら、進化ＤＮＡは、相同的組換えによるか、またはファージ媒介部位特異的組換えによりランダムに染色体中に戻され得る。
【０３７４】
（ＡＡ．染色体内の相同的組換え）
染色体内の相同的組換えを用いて、進化およびサイズ制限に基づくプラスミドの制限を回避する。この戦略は、インビトロシャッフリングが生じないことを除いて、それらの染色体の状況内でシャッフリング遺伝子について上記に述べたそれと同様である。その代わりに、親株を、紫外線光またはニトロソグアニジンのような変異誘発剤で処理し、そして改良された変異体が選択される。改良された変異体をプールし、そして分割する。プールの半分を用いて、相同的組換えベクター中へのクローニングのためのランダムゲノムフラグメントを生成する。必要に得応じて、さらなるゲノムフラグメントが、所望の性質を持つ関連種に由来する。クローン化されたゲノムフラグメントは、変異体プールの残りの半分のゲノム中に相同的に組換えられ、そして改良された性質を持つ改変体が選択される。これらは、さらなるラウンドの変異誘発、選択および組換えに供される。再び、このプロセスは、組換えベクターおよびアッセイが開発され得る任意の全細胞生物触媒の改良に完全に普遍的である。ここで再び、組換えがスクリーニングの前に反復して実施され得ることに注目すべきである。
【０３７５】
（ＢＢ．反復配列組換えのための方法）
反復配列組換えのためのいくつかのフォーマットおよび実施例は、しばしばＤＮＡシャッフリングまたは分子育種と呼ばれ、同時係属中の出願、１９９６年３月２５日に出願された代理人種類番号第１６５２８Ａ−０１４６１２、１９９５年２月１７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１２６（ＷＯ ９５／２２６２５として公開された）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０、１５１０（１９９５）；Ｓｔｅｍｍｅｒら、Ｇｅｎｅ、１６４、４９〜５３（１９９５）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３、５４９〜５５３（１９９５）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１、１０７４７〜１０７５１（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３７０、３８９〜３９１（１９９４）；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２（１）：１〜３、（１９９６）、およびＣｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４、３１５〜３１９（１９９６）（それらの各々は、すべての目的にその全体が参考として援用される）において、本発明者および共同研究者により記載されている。
【０３７６】
図１６および１７に示されるように、ＤＮＡシャッフリングは、複雑な新たな機能の進化のために最も迅速な技術を提供する。図１６に示されるように、バネル（Ａ）、ＤＮＡシャッフリングにおける組換えは、２〜３のサイクルで複数の有益な変異の蓄積を達成する。対照的に、有益な変異に対して高頻度の有害な変異のため、反復性の点変異が、一度に有益な変異を構築しなければならず、そしてその結果として、同じ点に到達するために多くのサイクルが必要である。図１６のパネルＢに示されるように、変異蓄積の単純な直線状配列よりむしろ、ＤＮＡシャッフリングは、複数の問題が独立に解決され得、次いで組み合わされる平行プロセスである。
【０３７７】
（１．インビトロフォーマット）
インビトロのシャッフリングの１つのフォーマットを図１に示す。組換えのための開始の基質は、関連配列のプールである。図１のパネルＡ中のＸは、配列多様性の場所を示す。配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、そして組換えまたは再アセンブルされる遺伝子またはＤＮＡフラグメントのサイズに依存して種々の長さであり得る。好ましくは、これらの配列は、５０ｂｐ〜５０ｋｂである。
【０３７８】
関連基質のプールは、図１のパネルＢに示されるように、例えば、約５ｂｐ〜５ｋｂ以上の重複フラグメントに転換される。しばしば、これらフラグメントのサイズは、約１０ｂｐから１０００ｂｐまでであり、そしてしばしば、これらのＤＮＡフラグメントのサイズは、約１００ｂｐ〜５００ｂｐである。この転換は、ＤＮａｓｅＩまたはＲＮａｓｅ消化、ランダム剪断または制限酵素部分消化のような、多くの異なる方法により実施され得る。あるいは、基質のフラグメントへの転換は、基質の不完全ＰＣＲ増幅または単一プライマーからプライムされたＰＣＲにより行われ得る。あるいは、適切な一本鎖フラグメントが、核酸合成機上で生成され得る。特定の長さおよび配列の核酸フラグメントの濃度は、しばしば、総核酸の重量の０．１％または１％より少ない。混合物中の異なる特定種核酸フラグメントの数は、通常、少なくとも約１００、５００または１０００である。
【０３７９】
核酸フラグメントの混合集団は、少なくとも部分的に一本鎖形態に転換される。転換は、約８０℃〜１００℃、より好ましくは９０℃〜９６℃に加熱することにより行われ、一本鎖核酸フラグメントを形成し、次いで再アニーリングされる。転換はまた、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質またはｒｅｃＡタンパク質での処理により実施され得る。次いで、他の一本鎖核酸フラグメントと配列同一性の領域を有する一本鎖核酸フラグメントは、４℃〜７５℃、そして好ましくは４０℃〜６５℃まで冷却することにより再アニールされ得る。再生は、ポリエチレングルコール（ＰＥＧ）、その他の容量−排除試薬または塩の添加により加速され得る。塩濃度は、好ましくは、０ｍＭ〜２００ｍＭであり、より好ましくは、塩濃度は、１０ｍＭ〜１００ｍＭである。この塩はＫＣｌまたはＮａＣｌであり得る。ＰＥＧの濃度は、好ましくは０％〜２０％、より好ましくは５％〜１０％である。再アニールするフラグメントは、図１のパネルＣに示されるように、異なる基質由来であり得る。アニールされた核酸フラグメントは、ＴａｑまたはＫｌｅｎｏｗのような核酸ポリメラーゼ、またはｐｆｕまたはｐｗｏのようなプルーフ読み取りポリメラーゼ、およびｄＮＴＰ類（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下でインキュベートされる。配列同一性の領域が大きい場合、Ｔａｑポリメラーゼは、４５〜６５℃の間のアニーリング温度で用いられ得る。同一性のこの領域が小さい場合、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼは、２０〜３０℃の間のアニーリング温度で用いられ得る（Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）、前述）。ポリメラーゼは、アニーリングの前、アニーリングと同時またはアニーリング後にランダム核酸フラグメントに添加され得る。
【０３８０】
フラグメントの異なる順列を含むポリヌクレオチドのコレクションを生成するための、重複フラグメントのポリメラーゼの存在下の変性、再生およびインキュベーションは、しばしば、インビトロの核酸のシャッフリングと呼ばれる。このサイクルは、所望の数の回数繰り返される。好ましくは、このサイクルは、２〜１００回繰り返され、より好ましくは、シークエンスは１０〜４０回繰り返される。得られる核酸は、図１のパネルＤに示されるように、約５０ｂｐ〜約１００ｋｂ、好ましくは５００ｂｐ〜５０ｋｂの二本鎖ポリヌクレオチドのファミリーである。この集団は、それに対して実質的な配列同一性を示すが、またいくつかの位置で分岐する開始基質の改変体を表す。この集団は、開始基質よりもかなり多くのメンバーを有する。シャッフリングから得られるフラグメントの集団は、必要に応じてベクター中にクローニングした後、宿主細胞を形質転換するために用いられる。
【０３８１】
インビトロシャッフリングの改変例では、組換え基質のサブ配列が、実質的なフラクション、代表的には少なくとも２０％またはそれ以上の、不完全伸長増幅産物を生成する条件下で、完全長配列を増幅することにより生成され得る。不完全に伸長した増幅産物を含む増幅産物を変性し、そして少なくとも１つの再アニーリングおよび増幅のさらなるサイクルに供する。この改変例は、ここでは、再アニーリングおよび増幅の少なくとも１つのサイクルが、不完全に伸長した産物の実質的なフラクションを提供し、「シャタリング」と呼ばれる。引き続く増幅ラウンドでは、この不完全に伸長した産物が、異なる配列関連テンプレート種に再アニールし、そしてプライム伸長する。
【０３８２】
さらなる改変例では、フラグメントの混合物が、１つ以上のオリゴヌクレオチドでスパイクされる。これらのオリゴヌクレオチドは、野生型配列の予備特徴付けされた変異、または個々の間または種間の天然の変動の部位を含めるために設計され得る。これらのオリゴヌクレオチドはまた、野生型フラグメントとのアニーリングを可能にするに十分な、このような変異または変動に隣接する配列相同性あるいは構造的相同性を含む。いくつかのオリゴヌクレオチドは、ランダム配列であり得る。アニーリング温度は、相同性の長さに依存して調節され得る。
【０３８３】
さらなる改変例では、組換えは、ＤＮＡフラグメントが、関連するが異なるテンプレートの相同位置上で１つのテンプレートプライマーに由来するときのような、テンプレートスイッチングによる少なくとも１つのサイクルで生じる。テンプレートスイッチングは、増幅混合物への、ｒｅｃＡ，ｒａｄ５１、ｒａｄ５５、ｒａｄ５７またはその他のポリメラーゼ（例えば、ウイルスポリメラーゼ、逆転写酵素）の添加により誘導され得る。テンプレートスイッチングはまた、ＤＮＡテンプレート濃度を増加することにより増加され得る。
【０３８４】
さらなる改変例では、増幅の少なくとも１つのサイクルが、関連する配列であって、かつ異なる長さの重複する一本鎖ＤＮＡフラグメントのコレクションを用いて実施され得る。フラグメントは、Ｍ１３のような一本鎖ＤＮＡファージを用いて調製され得る。各フラグメントは、コレクションからの第２のフラグメントにハイブリダイズし得、そしてそのポリヌクレオチド鎖伸長をプライムし得、それ故、配列組換えポリヌクレオチドを形成する。さらなる改変例では、可変長のｓｓＤＮＡフラグメントが、第１のＤＮＡテンプレート上で、Ｖｅｎｔまたはその他のＤＮＡポリメラーゼによる単一のプライマーから生成され得る。この一本鎖ＤＮＡフラグメントを、第２の、ウラシル含有環状ｓｓＤＮＡからなる、Ｋｕｎｋｅｌ型テンプレートのためのプライマーとして用いる。これは、第１のテンプレートの第２中への複数の置換を生じる。Ｌｅｖｉｃｈｋｉｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ２９、５７２〜５７７（１９９５）を参照のこと。
【０３８５】
（２．インビボフォーマット）
（（ａ）．プラスミド−プラスミド組換え）
組換えのための開始基質は、遺伝子の改変体形態を含むポリヌクレオチドのコレクションである。この改変体形態は、しばしば、基質間の相同的組換えを可能にするに十分な互いに対する実質的配列同一性を示す。ポリヌクレオチド間の多様性は、天然（例えば、対立遺伝子改変体または種改変体）、誘導性（例えば、エラープローンＰＣＲ）、またはインビトロ組換えの結果であり得る。多様性はまた、天然タンパク質をコードする遺伝子を，代替および／または混合コドンユーセージで再合成することの結果であり得る。組換えが開始材料に存在するより多くの多様性産物を生成し得るということに少なくとも十分な基質間の多様性が存在すべきである。少なくとも２つの位置で異なる少なくとも２つの基質が存在すべきである。しかし、一般に、１０3〜１０8メンバーの基質のライブラリーが採用される。多様性の程度は、組換えられている基質の長さ、および進化されるべき機能的変化の程度に依存する。０．１〜５０％の間の位置における多様性が代表的である。この多様な基質がプラスミド中に取り込まれる。このプラスミドは、しばしば、標準的なクローニングベクター、例えば、細菌マルチコピープラスミドである。しかし、以下に記載するいくつかの方法では、プラスミドは、移動機能を含む。基質は、同じかまたは異なるプラスミド中に取り込まれ得る。しばしば、異なるタイプの選択マーカーを有する少なくとも２つの異なるタイプのプラスミドを用いて、少なくとも２つのタイプのベクターを含む細胞の選択を可能にする。また、異なるタイプのプラスミドが採用される場合、この異なるプラスミドは、２つの別の不適合群に由来し得、細胞内に２つの異なるプラスミドの安定な同時存在を可能にする。それにもかかわらず、同じ非適合性群からのプラスミドが、相同的組換えを生じさせるに十分な時間、同じ細胞内になお同時存在し得る。
【０３８６】
多様な基質を含むプラスミドは、最初に、原核生物細胞または真核生物細胞中に、任意のトランスフェクション方法により（例えば、化学的形質転換、天然の形質転換能、エレクトロポーレーション、ウイルス形質導入または微粒子銃）導入される。しばしば、プラスミドは、飽和濃度またはその近傍であり（最大トランスフェクション能力に関して）同じ細胞に侵入する１つ以上のプラスミドの確率を増加する。種々の基質を含むプラスミドは、同時または複数のラウンドでトランスフェクトされ得る。例えば、後者のアプローチでは、細胞は、プラスミドの第１のアリコートでトランスフェクトされ、トランスフェクタントが選択および増殖され、次いでプラスミドの第２のアリコートで感染され得る。
【０３８７】
細胞中にプラスミドを導入し、組換え遺伝子を生成するための基質間の組換えが、単に細胞中で増殖することにより複数の異なるプラスミドを含む細胞内で生じる。しかし、１つのプラスミドのみを受け入れた細胞は、組換えに参加し得ず、そしてこのようなプラスミドが進化することに対して基質の潜在的な寄与が十分に開発されない（これらのプラスミドは、それらが変異誘発遺伝子細胞で増殖するか、またはそうでなければ点変異を蓄積する（すなわちＵＶ照射処理による）場合、ある程度まで寄与し得るが）。進化の速度は、すべての基質を組換えに参加させることにより増大し得る。これは、トランスフェクト細胞をエレクトロポーレーションに供することにより達成され得る。エレクトロポーレーションの条件は、外来性ＤＮＡを細胞中に導入するために通常用いられる条件と同じである（例えば、１，０００〜２，５０００ボルト、４００μＦおよび１〜２ｍＭギャップ）。これらの条件下、プラスミドは、すべての基質を組換えに参加させる細胞間で交換される。さらに、組換えの産物は、互いとのまたは当初の基質との組換えのさらなるラウンドを受け得る。進化の速度もまた、接合輸送の使用により増大され得る。接合輸送系は多くの細菌で公知であり（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、そしてまた細菌と酵母との間、または細菌と哺乳動物細胞との間でＤＮＡを移入するために用いられ得る。
【０３８８】
接合輸送を開発するために、基質をＭＯＢ遺伝子を有するプラスミド中にクローン化し、そしてｔｒａ遺伝子もまたｃｉｓもしくはｔｒａｎｓでこのＭＯＢ遺伝子に提供される。接合輸送の効果は、プラスミドを細胞間で移動させ、そして任意の基質間の組換えを可能にし、そして先の組換えの産物を、培養物を単に増殖させることにより生じさせるという点でエレクトロポーレーションと非常に類似している。これらのベクター中でどのように接合輸送が開発されるかの詳細は、以下により詳細に論議される。進化の速度はまた、プラスミドまたは染色体の交換を誘導するために細胞のプロトプラストを融合することにより増大され得る。融合は、ＰＥＧのような化学的薬剤、またはウイルスもしくはインフルエンザウイルス血球凝集素、ＨＳＶ−１ ｇＢおよびｇＤのようなウイルスタンパク質により誘導され得る。進化の速度はまた、変異誘発遺伝子宿主細胞（例えば、Ｍｕｔ Ｌ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、ＨおよびＡｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａヒト細胞株）の使用により増大され得る。
【０３８９】
あるいは、複数のプラスミドを一緒に増殖させて組換えを促進し、次いで単離し、プールし、そして細胞中に再導入し得る。プラスミドの組み合わせは、各細胞において異なり、そして組換えはこの集団内で配列多様性をさらに増大する。これは、必要に応じて、所望のレベルの多様性が達成されるまで繰り返し実施される。次いでこの集団を、スクリーニングおよび選択し、そして必要に応じてこのプロセスは、任意の選択された細胞／プラスミドで繰り返される。
【０３９０】
勿論、細胞が増殖し、そして組換えを起こさせる時間は、細胞型で異なるが、一般には重要ではない。なぜなら、小程度の組換えでさえ、開始物質に対して実質的に多様性を増大し得るからである。組換えられた遺伝子を含むプラスミドを保持する細胞は、所望の機能についてスクリーニングまたは選択される。例えば、進化される基質が薬物耐性遺伝子を含む場合、薬物耐性を選択する。スクリーニングまたは選択を生存する細胞は、１つ以上のラウンドのスクリーニング／選択、次いで組換えに供し得るか、またはさらなるラウンドの組換えに直接供し得る。
【０３９１】
次のラウンドの組換えは、先のラウンドとは独立にいくつかの異なるフォーマットにより達成され得る。例えば、さらなるラウンドの組換えは、上記のように、プラスミドのエレクトロポーレーションまたは接合媒介細胞間移入を単に再開することにより行われ得る。あるいは、先の基質と同じかまたは異なる、新鮮基質または基質類を、選択／スクリーニングを生存する細胞中に移入し得る。必要に応じて、新たな基質を、異なる選択マーカーを保持するか、および／または当初のプラスミドとは異なる非適合性群からの、プラスミドベクター中に含める。さらなる代替として、選択／スクリーニングを生存する細胞は、２つの亜集団に分割され得，そして１つの亜集団からのプラスミドＤＮＡを、もう一方にトランスフェクトし、そこで、２つの亜集団からのプラスミドからの基質が、さらなるラウンドの組換えを受ける。後者の２つのオプションのいずれにおいても、上記のように、進化の速度は、ＤＮＡ抽出、エレクトロポーレーション、接合または変異誘発遺伝子細胞を採用することにより増大され得る。なおさらなる改変例では、スクリーニング／選択を生存する細胞からのＤＮＡが抽出され、そしてインビトロＤＮＡシャッフリングを受け得る。
【０３９２】
第２のラウンドの組換えの後、好ましくは、増加したストリンジェンシー条件下で、第２のラウンドのスクリーニング／選択が実施される。所望であれば、さらなるラウンドの組換えおよび選択／スクリーニングが、第２のラウンドと同じ戦略を用いて実施され得る。組換えおよび選択／スクリーニングの連続的なラウンドで、生存組換え基質は、所望の表現型の獲得に向けて進化する。代表的には、反復組換えのこのおよびその他の方法で、組換えの最終産物は、０．１％〜２５％の位置で開始基質とは異なる所望の表現型を獲得し、そして一世代あたり１０-9位置あたり約１の自然に獲得した変異の率（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＆ Ｈｕｇｈｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３、９０６〜９０７（１９９６）を参照のこと）を越える大きさの率のオーダーで進化した（例えば、少なくとも１０倍、１００倍、１０００倍、または１０，０００倍）。本明細書のその他の技法と同様に、組換え工程は、スクリーニングの前に多様性を増大するために繰り返して実施され得る。さらに、全体のプロセスを反復様式で実施し得、所望の生物、クローンまたは核酸を生成し得る。
【０３９３】
（３．ウイルス−プラスミド組換え）
プラスミド−プラスミド組換えのために用いた戦略はまた、ウイルス−プラスミド組換え；通常、ファージ−プラスミド組換えのために用いられ得る。しかし、ウイルスの使用に特別ないくつかのさらなるコメントが適切である。組換えの開始基質は、プラスミドとウイルスベクターの両方中にクローン化される。どの基質がウイルスベクターに挿入され、そしてどれがプラスミド中にであるかは通常重要ではないが、通常、ウイルスベクターは、プラスミドとは異なる基質を含むべきである。以前のように、プラスミド（およびウイルス）は、代表的には、選択マーカーを含む。プラスミドおよびウイルスベクターは両方、上記のように、トランスフェクションにより細胞中に導入され得る。しかし、より効率的な手順は、細胞を、プラスミドで形質転換し、形質転換体を選択し、そして形質転換体をウイルスで感染することである。多くのウイルスの感染の効率は、１００％の細胞に達するので、このルートにより形質転換および感染された大部分の細胞は、異なる基質を保持するプラスミドおよびウイルスの両方を含む。
【０３９４】
プラスミドとウイルスとの間の相同的組換えが生じ、組換えられたプラスミドと組換えられたウイルスの両方が生じる。二本鎖形態および一本鎖形態の両方で細胞内ＤＮＡが存在する糸状ファージのような、いくつかのウイルスについては、両方が組換えに関与し得る。ウイルスが細胞を急速に殺傷しないと仮定して、組換えは、細胞間にプラスミドを移入するためのエレクトロポーレションまたは接合の使用により増強され得る。組換えはまた、１つの細胞からの子孫ウイルスを他の細胞に再感染させることにより、いくつかのタイプのウイルスについて増強され得る。いくつかのタイプのウイルスについては、ウイルスに感染した細胞は、重感染に対して耐性を示す。しかし、このような耐性は、高い多重度で感染することにより、および／または重感染に対する耐性が減少したウイルスの変異体株を用いることにより克服され得る。スクリーニング前の反復の感染および形質転換を実施して多様性を増大し得る。
【０３９５】
プラスミドを含有する細胞をウイルスで感染させる結果は、ウイルスの性質に依存する。糸状ファージのようないくつかのウイルスは、細胞中でプラスミドとともに安定に存在し、そしてまた細胞から子孫ファージを押し出す。コスミドゲノムを有するλのようなその他のウイルスは、子孫ビリオンを産生することなくプラスミドのように細胞中に安定に存在する。Ｔファージおよび溶解λのようなその他のウイルスは、プラスミドとの組換えを行うが、最終的に宿主細胞を殺傷し、そしてプラスミドＤＮＡを破壊する。宿主を殺傷することなく細胞を感染するウイルスについては、組換えプラスミドおよびウイルスを含む細胞は、プラスミド−プラスミド組換えに対するのと同じアプローチを用いてスクリーニング／選択され得る。選択／スクリーニングを生存する細胞により押し出される子孫ウイルスはまた集められ、そして引き続くラウンドの組換えにおける基質として用いられる。それらの宿主細胞を殺傷するウイルスについては、組換えから得られる組換え遺伝子は、子孫ウイルスにのみ存在する。スクリーニングまたは選択アッセイが、細胞における組換え遺伝子の発現を必要とする場合、組換え遺伝子を子孫ウイルスから別のベクター、例えば、プラスミドベクターに移入されるべきであり、そして選択／スクリーニングが実施される前に細胞中にトランスフェクトされる。
【０３９６】
糸状ファージについては、組換えの産物は、組換えを生存する細胞およびこれらの細胞から押し出されるファージ中の両方に存在する。組換え産物の二重の供給源は、プラスミド−プラスミド組換えに対していくつかのさらなるオプションを提供する。例えば、ＤＮＡは、インビトロ組換えのラウンドにおける使用のためにファージ粒子から単離され得る。あるいは、子孫ファージを用いて、スクリーニング／選択の先のラウンドを生存する細胞、または組換えの新鮮基質でトランスフェクトされた新鮮細胞を、トランスフェクトまたは感染し得る。
【０３９７】
（４．ウイルス−ウイルス組換え）
プラスミド−プラスミドおよびプラスミド−ウイルス組換えについて記載された原理は、２〜３の改変を用いてウイルス−ウイルス組換えに適用され得る。組換えのための開始基質は、ウイルスベクター中にクローン化される。通常、すべての基質について同じベクターが用いられる。好ましくは、ウイルスは、天然に、または変異の結果として、細胞を殺傷しないものである。感染後、いくつかのウイルスは、インビトロでパッケージングされ得る。パッケージされたウイルスを用いて、細胞が異なる基質を保持する複数のウイルスを受け入れるという高い確率が存在するように、高多重度で細胞を感染する。
【０３９８】
開始ラウンドの感染の後、次の工程は、先のセクションで論議したように、感染の性質に依存する。例えば、ウイルスがλコスミドまたはＭ１３、Ｆ１またはＦｄファージミドのようなファージミドゲノムを有する場合、このファージミドは、細胞内でプラスミドのように挙動し、そして細胞中で単に増殖することにより組換えを受ける。組換えおよび配列多様性は、細胞のエレクトロポーレーションにより増大され得る。選択／スクリーニングの後、組換え遺伝子を含むコスミドを、生存細胞から回収し得（例えば、ｃｏｓ溶原性宿主細胞の熱誘導により）、インビトロで再パッケージ化し、そしてさらなるラウンドの組換えのために高多重度で新鮮細胞を感染するために用いる。
【０３９９】
ウイルスが糸状ファージである場合、複製形態ＤＮＡの組換えは、感染細胞の培養物を増殖させることにより生じる。選択／スクリーニングは、改善された性質を持つ組換え遺伝子を有するウイルスベクターを含む細胞のコロニーを、このような細胞から押し出されたファージとともに同定する。引き続くオプションは、プラスミド−ウイルス組換えについてのと本質的に同じである。
【０４００】
（５．染色体−プラスミド組換え）
このフォーマットは、染色体およびプラスミドが担う基質の両方を進化させるために用い得る。このフォーマットは、特に、多くの染色体遺伝子が表現型に寄与しているか、または進化させるべき染色体遺伝子の正確な位置が知られていない状況で有用である。組換えのための開始基質は、プラスミトベクター中にクローン化される。進化されるべき染色体遺伝子が既知の場合、基質は、高い程度の配列同一性であるが、染色体遺伝子からいくらかの多様性を示す配列のファミリーを構成する。進化されるべき染色体遺伝子が、位置付けられていない場合、開始基質は、通常、ほんの小数が、進化されるべき遺伝子に対して配列同一性を示すＤＮＡセグメントのライブラリーを構成する。プラスミドが担う基質と染色体遺伝子との間の多様性は、変異誘発によるか、または染色体を保持する細胞の種とは異なる種からプラスミドが担う基質を得ることにより誘導され得る。
【０４０１】
この組換えのためのプラスミドが担う基質は、進化されるべき染色体遺伝子を有する細胞中にトランスフェクトされる。進化は、培養物を単に増殖させることにより生じ得、そして接合、エレクトロポーレーションまたはプロトプラスト融合により細胞間でプラスミドを移入することにより加速され得る。進化は、変異誘発遺伝子宿主細胞の使用によるか、または進化されるべき非変異誘発遺伝子宿主細胞の培養物を、変異誘発遺伝子宿主細胞で接種し、そしてエレクトロポーレーション、接合またはプロトプラスト融合によりプラスミドの細胞間移入を誘導することによりさらに加速され得る。あるいは、反復の単離および形質転換を用い得る。好ましくは、接種のために用いられる変異誘発遺伝子宿主細胞は、ネガティブ選択マーカーを含み、進化される非変異誘発遺伝子宿主細胞の純粋培養物の単離を容易にする。選択／スクリーニングは、所望の機能の獲得に向けて進化した染色体および／またはプラスミドを保持する細胞を同定する。
【０４０２】
組換えおよび選択／スクリーニングの引き続くラウンドを、プラスミド−プラスミド組換えについて記載したのと同様の様式で進行する。例えば、さらなる組換えは、エレクトロポーレーション、プラスミドの接合輸送、またはプロトプラスト融合と組み合わせて、組換えを生存する細胞を増殖することにより行い得る。あるいは、組換えのためにさらなる基質を保持するプラスミドを、生存細胞中に導入し得る。好ましくは、このようなプラスミドは、異なる非適合性群由来であり、そして当初のプラスミドと異なる選択マーカーを保持し、少なくとも２つの異なるプラスミドを含む細胞の選択を可能にする。さらなる代替として、プラスミドおよび／または染色体ＤＮＡを、生存細胞の亜集団から単離し得、そして第２の亜集団中にトランスフェクトする。染色体ＤＮＡは、トランスフェクション前にプラスミドベクター中にクローン化され得る。
【０４０３】
（６．ウイルス−染色体組換え）
上記に記載のその他の方法におけるように、ウイルスは、通常、細胞を殺傷しないものであり、そしてしばしばファージまたはファージミドてある。この手順は、プラスミド−染色体組換えに対するのと実質的に同じである。組換えのための基質は、ベクター中にクローン化される。基質を含むベクターは、次いで、細胞中にトランスフェクトされ得るか、インビトロでパッケージされ、そして注入により細胞中に導入される。ウイルスゲノムは、培養物を単に増殖することにより宿主染色体と組換わる。進化は、エレクトロポーレーション、または子孫ビリオンによる細胞の再感染によりウイルスゲノムの細胞間移入を可能にすることにより加速され得る。スクリーニング／選択は、所望の機能の獲得に向けて進化した染色体および／またはウイルスゲノムを有する細胞を同定する。
【０４０４】
引き続くラウンドの組換えにはいくつかのオプションがある。例えば、ウイルスゲノムは、反復の単離およびトランスフェクションおよびエレクトロポーレーションにより、選択／組換えを生存する細胞間で移入され得る。あるいは、選択／スクリーニングを生存する細胞から押し出されたウイルスは、プールされ、そして高い多重度で細胞を重感染するために用い得る。あるいは、組換えのための新鮮基質を、プラスミドまたはウイルスベクター上のいずれかで、細胞中に導入し得る。
【０４０５】
（ＣＣ．プール様式全ゲノム組換え）
無性進化はゆっくりとして非効率的なプロセスである。集団は、群としてよりもむしろ個体として移動する。多様な集団が、単一の親の変異誘発により生成され、適合および非適合個体の分布が得られる。有性生活環の非存在下で、生存集団の遺伝的情報の各片は、個々の変異体中に残存する。最も適合したものの選択は、それらが保持する遺伝的に有用な情報とともに、廃棄される多くの適合個体を生じる。無性進化は、１つの遺伝的事象を一度に進行し、そしてそれ故単一の遺伝的事象の内因的な価値により制限される。有性進化は、より迅速かつ効率的に動く。集団内の接合は、この集団内の遺伝的情報を統合し、そして一緒に組み合わせられる有用な情報を生じる。有用な遺伝的情報の結合は、それらの親よるかなりより適合している子孫を生じる。従って、有性進化は、複数の遺伝的事象によりかなり速く進行する。これらの差異を図１７にさらに図示する。有性進化とは対照的に、ＤＮＡシャッフリングは、ＤＮＡ配列の反復の変異誘発、組換え、および選択である（また図２５を参照のこと）。
【０４０６】
天然における有性組換えは、対による組換えを行い、そして２つの親の遺伝的ハイブリッドである子孫を生じる。対照的に、インビトロのＤＮＡシャッフリングは、プールの中で組換えを行い、そこでは子孫は複数の親分子のハイブリッドである。これは、ＤＮＡシャッフリングが、各熱サイクルとともに、多くの個々の対による組換え事象を行うからである。多くのサイクルの後、結果は、繰り返して近親交配された集団であり、「子孫」は、当初の親分子のＦｘ（再アセンブリのＸサイクルについて）である。これらの子孫は、当初の親の多くまたはすべての潜在的な末裔である。図２５に示されるグラフは、逐次的な、対による組換えおよびプールによる組換えにより個体が蓄積し得る、変異の可能な数のプロットを示す。
【０４０７】
プール様式組換えは、それが単一の「育種」実験から、変異の可能な組み合わせのより大きい比率を生成する手段を提供するという点で、ＤＮＡシャッフリングにとって重要な特徴である。このようにして、集団の「遺伝的ポテンシャル」は、１回のＤＮＡシャッフリング実験の子孫をスクリーニングすることにより容易に評価され得る。
【０４０８】
例えば、ある集団が、１０の単一の変異体親からなる場合、０〜１０個の変異を有する子孫から多様なこれらの変異の２10＝１０２４の可能な組み合わせがある。これらの１０２４のうち、わずか５６が１つの対による交配から生じる（図１４）（すなわち、０、１、および２個の変異を有するもの）。天然では、複数親の組み合わせは、この集団からいくつかの変異を除去する選択が与えられないと仮定して、最終的には、複数のランダム有性接合の後に生じる。このように、性は、集団内の可能なすべての有用な変異体組み合わせの統合およびサンプリングを行う。指向された進化の目的には、スクリーニングまたは選択に入る変異体組み合わせの最大の数を有することが望ましく、その結果、最良の子孫（すなわち、選択スクリーニングにおいて用いられる選択基準により）が最短の可能な時間で同定される。
【０４０９】
インビボおよび全ゲノムシャッフリングへの１つの挑戦は、プールによる組換えまたは複数反復の対による組換え事象を行うための方法を考案することである。スクリーニング前の１サイクルあたり単一の対による交配での交配では、開始集団の「遺伝的ポテンシャル」をスクリーニングする能力は、限られている。この理由により、インビボおよび全ゲノムシャッフリング媒介細胞進化の速度は、プールによる組換えを行うことにより促進され得る。プールによる組換えのための２つの戦略を以下に記載する（プロトプラスト融合および形質導入）。
【０４１０】
（１．プロトプラスト融合）
プロトプラスト融合（前出）媒介全ゲノムシャッフリング（ＷＧＳ）は、プール毎の組換えに直接影響を及ぼし得る１つの形式である。全遺伝子シャッフリングは、生物体の集団からの、１つ以上の核酸分子（フラグメント、染色体、エピソームなど）の形態における、全ゲノムの反復的組換えであり、生物の出発集団の少なくとも２つからの、分配された遺伝子情報を有する新たな生物が産生される。プロトプラスト融合のこのプロセスは、図２６にさらに例示される。
【０４１１】
複数親プロトプラストの融合から生じる子孫が観察されている（ＨｏｐｗｏｏｄおよびＷｒｉｇｈｔ、１９７８）が、しかし、これらの子孫は、稀である（１０-4〜１０-6）。この低い頻度は、２つ、３つ、４つ等の親から生じる融合体の分布、および複数親を有する子孫が生じるために起こらなければならない複数の組換え事象（４つの親交雑種についての６交雑）の見込みに起因する。従って、これは複数親の子孫を富化するために有用である。これは、例えば、反復的融合もしくは複数回融合されたプロトプラストの富化によって達成され得る。プール毎の融合および組換えのこのプロセスは、図２７にさらに例示される。
【０４１２】
（２．反復的融合）
同定された親細胞のプロトプラストは、調製され、融合され、そして再生される。次いで、再生された子孫のプロトプラストは、スクリーニングまたは富化なしに、形成、融合、および再生される。これは、複数の子孫の表示（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を増大するために、スクリーニングの前に、２つ、３つ、またはそれ以上のサイクル行われ得る。可能な変異／子孫の数が、各サイクル毎に二倍になる。例えば、１回の交雑が、主に、０個、１個、および２個の変異を有する子孫を生成する場合、この集団のそれ自身を用いての増殖は、０、１、２，３、および４個の変異を有する子孫を産生し（図１５）、第３回目の交雑は、８個まで産生する。これらの引き続いての交雑に由来する複数親の子孫の表示は、一重の親の子孫および二重の親の子孫と同じくらい高くはないが、それは、検出可能であり、そして一重の交雑由来よりも高い。スクリーニング前の反復的融合は、集団内の多くの性的な交雑および前出のインビトロＤＮＡシャッフリングの個々の熱サイクルと類似である。このアプローチの価値をもたらす要因は、親集団の出発サイズである。集団が成長するにつれ、それは、複数親の融合物が、反復融合から生じることがより確からしくなる。例えば、４つの親が二回融合された場合、その４親の子孫は、総子孫の約０．２％をなす。これは、３０００（９５％の信頼度）の集団を見出すのに十分であるが、より良い表示が好ましい。１０の親が２回融合される場合、その子孫の２０％より多くが４つ親の子孫である。
【０４１３】
（３．複数融合されたプロトプラストの富化）
プロトプラストの集団の融合後、その融合体は、代表的には、融合剤（例えば、５０％ＰＥＧ）を希釈するために低張性の培地へと希釈される。その融合された細胞は、細胞壁を再生するために、短い期間増殖され得るか、または直接分離され得、次いで、サイズに基づいて分離される。これは、例えば、サイズの見積もりとして光分散を使用する細胞選別により、大きな融合体を単離するために行われる。あるいは、その融合体は、ＤＮＡ含有量に基づいてＦＡＣＳによって選別され得る。その大きな融合体、またはより多くのＤＮＡを含有する融合体は、複数親の融合から生じ、そして複数の子孫へと分離するようである。その富化された融合体は、再生され、そして直接スクリーニングされるか、またはその子孫は、上記のように反復的に融合され、多様な変異体の組み合わせについてその集団をさらに富化する。
【０４１４】
（４．形質導入）
形質導入は、その形質導入するファージ粒子が、ファージＤＮＡというよりむしろ主に宿主ゲノムＤＮＡを含有する場合、プール毎の組換えを理論的にもたらし得る。ファージＤＮＡが、過度に表示される場合、ほとんどの細胞は、少なくとも１つの所望でないファージゲノムを受ける。固定化プロファージ（前出）から生成されるファージ粒子は、この目的のために有用である。細胞の集団が、適切な形質導入ファージで感染され、そしてその溶解物が回収され、そして同一の出発集団を感染させるために使用される。高い感染多重度が、各感染された細胞に複数のゲノムフラグメントを送達し、それにより２つより多い親ゲノムからの変異を含有する組み換え体を産生する機会を増大させるために利用される。その得られる形質導入体は、ファージが、増殖し得ない条件下で（例えば、クエン酸の存在下で）回収される。次いで、この集団は、直接的にスクリーニングされるか、またはファージで再び感染され、その得られる形質導入粒子は、第１の子孫を形質導入するために使用される。これは、反復的プロトプラスト融合、複数性的組換え、およびインビトロＤＮＡシャッフリングを模倣する。
【０４１５】
（ＤＤ．分解されたゲノムの盲検ファミリーシャッフリングならびに相同組換えによる強制的組み込みおよび切り出しの反復的サイクルによる全ゲノムシャッフリングのための方法、ならびに改善された表現型についてのスクリーニング） インビトロ法は、例えば、本明細書に記載されるような、単一の遺伝子およびオペロンをシャッフリングするために開発されている。種内の、および異なる種からの相同遺伝子の「ファミリー」シャッフリングはまた、分子進化を促進するための有効な方法である。この節は、これらの方法が全ゲノムに適用され得るように、これらの方法を拡張するためのさらなる方法を記載する。
【０４１６】
いくつかの場合には、生化学的プロセスにおける律速段階をコードする遺伝子または目的の表現型に寄与する遺伝子が公知である。この方法は、ファミリーシャッフリングされたライブラリーをこのような部位に標的化するために使用され得、目的の座に対立遺伝子の高品質なファミリーシャッフリングされたライブラリーを有する生物体のライブラリーを生成する。このような遺伝子の例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて過剰発現されたタンパク質の折り畳みをより効率的にシャペロンするための、宿主シャペロニンの進化である。
【０４１７】
このプロセスの目的は、２つ以上の種由来の相同な遺伝子をシャッフリングし、次いで、そのシャッフルされた遺伝子を標的生物の染色体に組み込むことである。複数部位での複数シャッフリングされた遺伝子の組み込みは、同じ手順を連続的に適用することによる、組み込み（複製を生成すること）、切り出し（染色体中における改善された対立遺伝子を残すこと）、およびさらなる進化した遺伝子のトランスファーの反復的サイクルを使用して、達成され得る。
【０４１８】
第１の工程において、適切な細菌ベクターにシャッフリングされるべき遺伝子が、サブクローニングされる。これらのベクターは、プラスミド、コスミド、ＢＡＣＳなどであり得る。従って、１００ｂｐ〜１００ｋｂのフラグメントが取り扱われ得る。次いで、相同フラグメントが、一緒に「ファミリーシャッフリングされ」る（すなわち、異なる種または染色体位置由来の相同フラグメントが相同組換えされる）。簡単な例として、２つの種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ）由来のホモログがクローン化され、インビトロでファミリーシャッフリングされ、そして対立遺伝子置換ベクター（例えば、ポジティブに選択可能なマーカーを有するベクター、ネガティブに選択可能なマーカーを有するベクター、および条件的に活性な複製起点を有するベクター）中にクローン化される。分解された（サブクローン化された）ゲノムの全ゲノムファミリーシャッフリングについての基本的なストラテジーは、さらに図２２に記載される。
【０４１９】
ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ中にトランスフェクトされ、そして例えば、薬物耐性について選択される。ほとんどの薬物耐性細胞は、ファミリーシャッフリングされた挿入とクローン化された挿入の染色体コピーとの間の相同組換えによって生成される。改善された表現型を有するコロニーがスクリーニングされる（例えば、アッセイされるべき表現型に依存して、酵素活性もしくは低分子産生についての質量分析、または色素産生性のスクリーニングなどにより）。ネガティブ選択（すなわち、ｓｕｃ選択）は、タンデム複製の強制的切除にかけられる。コロニーのおおよそ半分は、改善された表現型を維持すべきである。重要なことに、このプロセスは、野生型遺伝子座が、有益な対立遺伝子をコードするファミリーシャッフリングされたフラグメントと置換される「清潔な」染色体を再生する。染色体が「清潔」（すなわち、ベクター配列を有さない）であるので、他の改善された対立遺伝子もまた、相同組換えによって染色体上のこの点に移動され得る。
【０４２０】
改善された表現型についての選択もしくはスクリーニングは、図２２における工程３または工程４のいずれかの後に生じ得る。選択もしくはスクリーニングが、工程３の後に行われる場合、その改善された対立遺伝子は、例えば、Ｐ１形質導入によって、その他の系統に都合良く移動し得る。次いで、ｓｕｃマーカーに対する「ネガティブ選択」によって、改善された対立遺伝子を含有するが、ベクター配列を欠失する系統を再生し得る。引き続く回において、遺伝子の独立して同定された改善された改変体は、改善された系統へ引き続いて移動され得る（例えば、上記の、薬物で標識されたタンデム複製のＰ１形質導入によって）。それ自体がそのファミリーシャッフリングされた遺伝子材料を含有する形質導入体は、形質導入されたタンデム複製を受けるために、表現型におけるさらなる改善についてスクリーニングされる。再び、ネガティブ選択がかけられ、そして改善された系統のシャッフリングのプロセスは、所望のように反復的に反復される。
【０４２１】
このプロセスが、目的の遺伝子の標的化を参照して記載されたが、どの遺伝子座が標的化されるべきかについて何も仮定することなく、「盲目的に」使用され得る。この手順は、図２３に示される。例えば、目的の生物の全ゲノムは、扱いやすいフラグメント（例えば、プラスミドに基づく方法については、１０ｋｂ）にクローニングされる。次いで、相同フラグメントは、図２３に示す方法によって関連する種から単離される。染色体相同体での強制された組換えは、キメラを作製する（図２２）。
【０４２２】
（ＥＥ．遺伝子の高処理能力ファミリーシャッフリングのための方法）
Ｅ．ｃｏｌｉについて、１０ｋｂフラグメントにおけるゲノムのクローニングは、約３００クローンを必要とする。相同なフラグメントが、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａから単離される。これにより、大体３百対の相同フラグメントを得る。各対は、ファミリーシャッフリングされ、そしてそのシャッフリングされたフラグメントが、対立遺伝子置換ベクター中にクローン化される。その挿入物は、上記のようにＥ．ｃｏｌｉゲノム中に組み込まれる。全体的なスクリーニングが、改善された表現型を有する改変体を同定するためになされる。これは、シャッフリングされて所望の系統を産生する改善の基本的集団として作用する。これらの独立して同定された改変体の１つのスーパー系統へのシャッフリングは、上記のようにして行われる。
【０４２３】
ファミリーシャッフリングは、遺伝子改変体の高品質のライブラリーを作製するための効率的な方法であることが示されている。１つの種からのクローン化遺伝子を仮定して、他の種から相同体を早急（ｑｕｉｃｋｌｙ）かつ迅速に（ｒａｐｉｄｌｙ）単離することが目的であり、そしてこのプロセスは、律速段階であり得る。例えば、全ゲノムに対してファミリーシャッフリングを行うことを望む場合、数百〜数千の個々のファミリーシャッフリングライブラリーを構築することが必要であり得る。
【０４２４】
この実施態様において、目的の遺伝子は、ｓｓＤＮＡが作製され得るベクター中に必要に応じてクローニングされる。このようなベクターの例は、Ｍ１３複製起点を有するファージミドベクターである。目的の種由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡが単離され、変性され、ファージミドにアニーリングされ、次いでそれをクローニングするために酵素により操作される。次いで、そのクローニングされたＤＮＡは、元々の目的の遺伝子を用いてファミリーシャッフリングするために使用される。ＰＣＲに基づく形式もまた、図２４に概説するように利用可能である。これらの形式は、中間のクローニング工程を必要とせず、それゆえ、高処理能力適用のために特に興味深い。
【０４２５】
あるいは、目的の遺伝子は、精製されたＲｅｃＡタンパク質を使用して探し出され得る。目的の遺伝子は、ビオチンのようなアフィニティータグでタグ化されたプライマーを使用してＰＣＲ増幅され、変性され、次いでＲｅｃＡタンパク質（または改善されたその変異体）でコーティングされる。次いで、そのコーティングされたｓｓＤＮＡは、ｇＤＮＡプラスミドライブラリーと混合される。適切な条件下（例えば、加水分解不可能ｒＡＴＰアナログの存在下）で、ＲｅｃＡは、プラスミドライブラリーにおけるＲｅｃＡコーティング遺伝子（ｓｓＤＮＡ）のハイブリダイゼーションを触媒する。次いで、ヘテロ二重鎖は、その標識されたＰＣＲ産物およびその関連する相同なＤＮＡの、適切なアフィニティーマトリックスへの吸着により、遺伝子ライブラリーのハイブリダイズしないプラスミドからアフィニティー精製される。その相同なＤＮＡは、所望の機能の改善のためにファミリーシャッフリング反応において使用される。
【０４２６】
Ｅ．ｃｏｌｉシャペロニン遺伝子ＤｎａＪの他のホモログとのシャッフリングは、１つの例として以下に記載される。その例は、任意の他の遺伝子（植物遺伝子または動物遺伝子（哺乳動物遺伝子を含む）のような真核生物遺伝子を含む）に対して、記載される形式に従うことによって、一般化され得る。図２４は、高処理能力ファミリーシャッフリングに対する工程の模式的概略を提供する。
【０４２７】
第１の工程として、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤｎａＪ遺伝子は、Ｍ１３ファージミドベクターにクローニングされる。次いで、ｓｓＤＮＡが、好ましくは、ｄｕｔ（−）ｕｎｇ（−）系統において、産生され、その結果、Ｋｕｎｋｅｌ部位指向変異誘発プロトコルが適用され得る。次いで、ゲノムＤＮＡは、非Ｅ．ｃｏｌｉ供給源（例えば、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＹｅｒｓｉｎｉａ Ｐｅｓｔｉｓ）から単離される。その細菌ゲノムＤＮＡは、変性され、そしてファージミドｓｓＤＮＡ（例えば、約１マイクログラムのｓｓＤＮＡ）に再アニーリングされる。その再アニーリングされた産物は、ｓｓＤＮＡをエンドヌクレアーゼとしてではなくエキソヌクレアーゼとして分解する（そのヌクレアーゼは、より大きいアニーリングされたフラグメント中に包埋されたミスマッチＤＮＡを分解しない）Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ（リョクトウ）ヌクレアーゼのような酵素によって処理される。標準的なＫｕｎｋｅｌ部位指向変異誘発プロトコルが、そのフラグメントを延長するために使用され、そしてその標的細胞は、その得られる変異誘発されたＤＮＡで形質転換される。
【０４２８】
上記の第１の変異において、その手順は、目的の標的遺伝子が未知である状況に適合される。この変異において、目的の生物の全ゲノムは、フラグメント（例えば、各々約１０ｋｂ）においてファージミドにクローン化される。次いで、一本鎖ファージミドＤＮＡが産生される。関連する種由来のゲノムＤＮＡは、変性され、そしてファージミドにアニーリングされる。リョクトウヌクレアーゼは、ハイブリダイズしていないＤＮＡ末端を切り取るために使用される。ポリメラーゼおよびリガーゼは、得られるギャップを有する環を満たすために使用される。これらのクローンは、ミスマッチ修復欠損系統に形質転換される。そのミスマッチ分子が細菌中で複製される場合、ほとんどのコロニーは、Ｅ．ｃｏｌｉフラグメントおよび相同なフラグメントの両方を含有する。次いで、その２つの相同な遺伝子は、そのコロニーから（例えば、標準的なプラスミド精製またはコロニーＰＣＲのいずれかによって）単離され、そしてシャッフリングされる。
【０４２９】
インビトロシャッフリングを必要としないキメラを生成するための別のアプローチは、単に、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａゲノムを、対立遺伝子置換ベクターにクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し、そして染色体組み込み体を選択することである。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ遺伝子とＥ．ｃｏｌｉホモログとの間の相同組換えにより、シャッフリングされたキメラを生成する。全体的なスクリーニングは、改善された表現型をスクリーニングするために行われる。あるいは、反復的形質転換および組換えが行われて、スクリーニングの前に多様性を増大させる。改善された表現型を有するコロニーが得られる場合、それは、その改善が、新鮮な系統へのＰ１形質導入および改善された表現型についてのカウンタースクリーニングによる対立遺伝子置換に起因するものであることが評価される。次いで、このような改善された対立遺伝子の収集物は、本明細書に示された分解されたゲノムのブラインドファミリーシャッフリングによる全体的なゲノムシャッフリングのための方法を使用して、１つの系統に組み合わされ得る。さらに、一旦、これらの遺伝子座が同定されると、さらなる回のシャッフリングおよびスクリーニングが、さらなる改善を生じるようである。これは、キメラ遺伝子をクローニングし、次いで、本開示において記載される方法を使用することによって行われ得、細菌の多くの異なる系統由来のホモログを有する遺伝子を増殖する。
【０４３０】
一般に、その形質転換体は、標的遺伝子（例えば、上記の例におけるＥ．ｃｏｌｉ ＤｎａＪ）のホモログのクローンを含有する。インビボにおけるミスマッチ修復は、遺伝子の多様性の減少をもたらす。これに対して少なくとも２つの解答が存在する。第１に、形質導入がミスマッチ修復欠損系統中へと行われ得る。あるいは、またはさらに、Ｍ１３鋳型ＤＮＡは、選択的に分解され得、そのクローン化されたホモログを残す。これは、標準的なＥｃｋｓｔｅｉｎ部位指向変異誘発技術（本明細書中で有用な一般的な分子生物学的技術（変異誘発を含む）を記載する一般的なテキストには、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との共同事業（１９９８に補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が含まれる）に類似する方法を使用して行われ得る。
【０４３１】
この方法は、新たな鎖の合成の間の、αチオール改変ｄＮＴＰの組み込み、続いて鋳型の選択的分解、および鋳型鎖の再合成に依存する。１つの実施態様において、その鋳型鎖は、ｄｕｔ（−）ｕｎｇ（−）系統において増殖され、その結果、ウラシルがファージミドＤＮＡ中に取り込まれる。上記のように延長した後（そして、形質転換の前）に、そのＤＮＡを、ウラシルグリコシレートおよびＡＰ部位（ａｐｕｒｉｎｉｃ ｓｉｔｅ）エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥｎｄｏＩＩＩまたはＥｎｄｏＩＶ）で処理する。次いで、その処理されたＤＮＡを、進行的エキソヌクレアーゼ（これは、得られるギャップから切断する一方、他の鎖をインタクトのままに残す（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ変異誘発におけるように））で処理する。そのＤＮＡを、ポリメラーゼ処理し、そして連結する。次いで、標的細胞を、形質転換する。このプロセスは、標的に由来するものではないホモログ（すなわち、上記の例では、非Ｅ．ｃｏｌｉホモログ）をコードするクローンを富化する。
【０４３２】
類似の手順は、必要に応じて、ＰＣＲ形式で行われる。上記のＤｎａＪに適用されるように、ＤｎａＪ ＤＮＡは、各末端に３０マープライミング部位を構築するプライマーを用いてＰＣＲによって増幅される。ＰＣＲは、変性され、そして過剰のＳａｌｍｏｎｅｌｌａゲノムＤＮＡでアニーリングされる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＤｎａＪ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉホモログとハイブリダイズする。Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼでの処理の後、その得られるミスマッチハイブリッドを、隣接する３０マープライマーでＰＣＲ増幅する。このＰＣＲ産物は、ファミリーシャッフリングに直接使用し得る。例えば、図２４を参照のこと。
【０４３３】
ゲノムが増大する量の配列情報を提供するので、設計されたプライマーでホモログを直接ＰＣＲ増幅することがますます可能である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムの配列および関連するゲノム（すなわち、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の配列が与えられれば、各ゲノムは、設計されたプライマーで、例えば、５ｋｂのフラグメントに、ＰＣＲ増幅され得る。その相同なフラグメントは、一緒に、対で、シャッフリングに使用され得る。ゲノムシャッフリングについて、そのシャッフリングされた産物は、対立遺伝子置換ベクターにクローニングされ、そして上記のようにゲノム中にて増殖される。
【０４３４】
（ＦＦ．超組換え形成性ＲｅｃＡクローン）
本発明は、さらに、超組換え形成性（ｈｙｐｅｒ−ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）ＲｅｃＡタンパク質を提供する（以下の実施例を参照のこと）。このようなタンパク質の例は、図１３に示すクローン２、４、５、６、および１３に由来する。当業者は、開示された配列が与えられれば、種々の関連する組換え性タンパク質を作製し得ることが十分に予測される。
【０４３５】
図１２および１３の配列を含むクローンは、必要に応じて、本明細書中の任意のシャッフリング法のために出発点として使用され、示されるクローンを改良するための変異および組換えのための出発点を提供する。
【０４３６】
標準的な分子生物学技術は、所定の核酸を含む核酸を、例えば、その核酸を任意の公知のベクターにクローニングすることによって作製するために使用され得る。適切なクローニングおよび配列決定技術の例、および当業者を多くのクローニングの実施に導くのに十分な教示は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２巻 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の共同事業，（１９９４補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）に見出される。生物学試薬および実験装置の製造業者からの製品情報はまた、公知の生物学的方法において有用な情報を提供する。このような製造業者には、ＳＩＧＭＡ化学会社（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡおよびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ならびに当業者に公知の多くの他の商業的供給源が含まれる。
【０４３７】
所定の配列の保存的置換は、超組換え形成性クローンをコードする核酸を産生するために使用され得ることが理解される。特定の核酸配列の「保存的に改変された変異」とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいうか、または、その核酸が、本質的に同一の配列に対するアミノ酸配列をコードしない場合をいう。遺伝子コードの縮重のために、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所定のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧは全て、アミノ酸アルギニンをコードする。従って、コドンによってアルギニンが特定される全ての位置において、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく、記載された任意の対応するコドンに変更され得る。このような核酸の変異は、「保存的に改変された変異」の一種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書中の全ての核酸配列はまた、全ての可能なサイレント変異を記載する。当業者は、核酸中の各コドン（通常メチオニンについての唯一のコドンであるＡＵＧを除く）が、標準的な技術によって、機能的に同一の分子を生じるように改変され得ることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各「サイレント変異」は、任意の記載される配列について暗黙（ｉｍｐｌｉｃｉｔ）である。さらに、当業者は、コードされる配列において、単一のアミノ酸または小割合のアミノ酸（代表的には、５％未満、より代表的には、１％未満）を変更、付加、または欠失する、個々の置換、欠失、または付加が、「保存的に改変された変異」（その変更が、アミノ酸の化学的に類似のアミノ酸との置換を生じる）であることを認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該分野で周知である。以下の６つの群は、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；ならびに６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙもまた参照のこと。最後に、コードされる核酸分子の活性を変更しない配列（例えば、非機能的配列）の付加は、基本的核酸の保存的改変である。
【０４３８】
当業者は、開示される核酸構築物の多くの保存的変異が、機能的に同一な構築物を生じることを理解する。例えば、遺伝子コードの縮重により、「サイレント置換」（すなわち、コードされるポリペプチドにおける変更を生じない核酸配列の置換）は、アミノ酸をコードする全ての核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、パッケージング構築物もしくはパッケージング可能な構築物のアミノ酸配列における１または数個のアミノ酸の「保存的アミノ酸置換」は、高度に類似する特性を有する異なるアミノ酸で置換され、そしてまた、開示された構築物に高度に類似するとして容易に同定される。各々の明白に開示された配列のこのような保存的に置換された改変体は、本発明の特徴である。
【０４３９】
ストリンジェントな条件下で、図中の核酸にハイブリダイズする核酸は、本発明の特徴である。核酸ハイブリダイゼーション実験（例えば、サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーション）の状況における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列に依存し、そして異なる環境パラメータの下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ ２「核酸プローブアッセイのハイブリダイゼーションの原理およびストラテジーの概説（ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ）」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解点（Ｔm）よりも約５℃低く選択される。Ｔmは、５０％の標的配列が、完全にマッチするプローブに（規定されたイオン強度およびｐＨ下で）ハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴmに等しいように選択される。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて関連していないプローブについて観察されるものの、２倍の（またはそれより高い）シグナル対ノイズ比は、特定のハイブリダイゼーションの検出を示す。
【０４４０】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、なお、実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝子コードによって許容される最大コドン縮重を使用して作製される場合、生じる。
【０４４１】
最後に、好ましい核酸は、ＲｅｃＡ活性についての標準的なアッセイにおける野生型ＲｅｃＡタンパク質の少なくとも一桁の大きさ（１０倍）より活性である、超組換え形成性ＲｅｃＡタンパク質をコードする。
【０４４２】
（ＧＧ．インビボでのｒｅｃＥ／ｒｅｃＴ媒介シャッフリング）
ｒｅｃＡのように、ｒｅｃＥ、およびｒｅｃＴ（またはこれらのホモログ（例えば、λ組換えタンパク質ｒｅｄαおよびｒｅｄβ））は、相同組換えをインビボで刺激し得る。Ｍｕｙｒｅｒｓら（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７（６）：１５５５−７およびＺｈａｎｇら（１９９８）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２０（２）：１２３−８を参照のこと。
【０４４３】
超組換え形成性ｒｅｃＥおよびｒｅｃＴは、ｒｅｃＡについて記載したのと同じ方法によって進化される。あるいは、増大した組換え性を有する改変体は、選択マーカーを保有する自殺ベクター（複製起点を欠失する）と、それらの染色体または安定に維持されるエピソームのいずれかにおける相同領域との間で組換えを引き起こすそれらの能力によって選択される。
【０４４４】
ｒｅｃＡおよびｒｅｃＥ遺伝子を含有するプラスミドは、シャッフリングされる（単一の出発点としてこれらの遺伝子を使用して、またはファミリーシャッフリング（例えば、ｒｅｄαおよびｒｅｄβとの、もしくは利用可能な配列データベースから同定された他の相同遺伝子との）によって、のいずれかで）。次いで、このシャッフリングされたライブラリーは、選択マーカーを有するベクターにクローニングされ、そして適切な組換え欠損系統へと形質転換される。次いで、その細胞のライブラリーは、自殺ベクターに運ばれて、または標的配列（プラスミドまたは宿主染色体中のいずれかの）に対して相同な各末端に領域を有する線状ＤＮＡフラグメントとしてのいずれかで、第２の選択マーカーで形質転換される。相同組換えによるこのマーカーの組み込みは、ｒｅｃＥおよびｒｅｃＴ遺伝子産物の活性に依存する選択的事象である。ｒｅｃＥ／ｒｅｃＴ遺伝子は、相同組換えが生じている細胞から単離される。そのプロセスは、次の回のシャッフリングが行われる前に、最も効率的な変異体について富化するために、数回反復される。さらに、選択を伴わない組換えのサイクルが、選択前に細胞集団の多様性を増大させるために行われ得る。
【０４４５】
一旦、超組換え形成性ｒｅｃＥ／ｒｅｃＴ遺伝子が単離されると、それらは、超組換え形成性ｒｅｃＡについて記載されたように使用される。例えば、それらは、宿主細胞において（構成的または条件的に）発現され、宿主細胞内での改変体遺伝子フラグメントと相同体との間の相同組換えを容易にする。それらは、代替的に、マイクロインジェクション、バイオリスティクス、リポフェクション、または他の手段によって、改変体遺伝子が導入されるのと同時に、宿主細胞中に、導入される。
【０４４６】
超組換え形成性ｒｅｃＥ／ｒｅｃＴ（細菌／ファージ起源または植物相同体由来のいずれか）は、植物における相同組換えを容易にするために有用である。これらは、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍクローニングベクター中にクローン化され、そこで、それらは、植物への進入の際に発現され、それにより、レシピエント細胞において相同組換えを刺激する。
【０４４７】
好ましい実施態様において、ｒｅｃＥ／ｒｅｃＴが使用され、そして／またはｍｕｔＳ系統において作製される。
【０４４８】
（ＨＨ．多サイクル組換え）
上記のように、プロトプラスト融合は、２つの微生物ゲノムの組換えの効率的な手段である。そのプロセスは、再現的に、約１０％の非選択集団が組換えキメラ生物を生じるようにする。
【０４４９】
プロトプラストは、低張性の培地における細胞壁分解酵素での処理によって、その細胞壁がストリップされている細胞である。プロトプラスト融合は、ポリエチレングリコールのような融合誘発性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）剤による、２つ以上のこれらのプロトプラストの膜の誘導された融合物である。融合により、細胞質が混合され、そして融合細胞のゲノムが同じ膜内に配置される。これらの条件下で、ゲノム間の組換えは、頻繁である。
【０４５０】
その融合されたプロトプラストは、再生され、そして細胞分裂の間に、単一のゲノムが、各々の娘細胞に分裂する。代表的には、これらの娘細胞の１０％は、元々の親のプロトプラストゲノムの一つ以上に部分的に由来するゲノムを有する。
【０４５１】
この結果は、減数分裂ＩＩの分裂前期の間の真核生物細胞における娘染色分体の交雑の結果に類似している。組換え体である娘細胞のパーセンテージは、プロトプラスト融合後よりもほんの少し低い。プロトプラスト融合が効率的な組換えをもたらすのに対して、その組換えは、主に、性的組換えにおけるように２つの細胞の間で生じる。
【０４５２】
全ゲノムシャッフリングされたライブラリーのライブラリーを効率的に生成するために、複数親に由来する遺伝子情報を有する娘細胞が作製される。
【０４５３】
インビトロＤＮＡシャッフリングは、複数の相同なＤＮＡ配列の効率的なプール毎の組換えを生じる。小遺伝子フラグメントの混合されたプールからの全長遺伝子の再構築は、複数のアニーリング、および伸長サイクルであるプライマーを用いないＰＣＲ反応のその熱サイクルを必要とする。各熱サイクルの間、フラグメントの多くの対がアニーリングし、そしてより大きなキメラＤＮＡフラグメントの組み合わせ集団を形成するように伸長される。再構築の第１のサイクルの後、キメラフラグメントは、２つの異なる親遺伝子に由来する配列を含有する。これは、集団内での単一の性的サイクル、対毎の交雑、またはプロトプラスト融合の結果に類似している。第２のサイクルの間に、これらのキメラフラグメントは、互いに、またはその他の小フラグメントとアニーリングし得、４つまでの異なる親配列に由来するキメラを生じる。
【０４５４】
この第２のサイクルは、それ自体と近親交配する単一の性的交雑に由来する全子孫に類似している。さらなるサイクルが、８、１６、３２、等の親配列に由来するキメラを生じ、そして子孫集団のさらなる近親交配と類似している。インビトロＤＮＡシャッフリングの力は、大きな組み合わせライブラリーが、これらの反復的な対毎の「接合」によって再構築されたＤＮＡフラグメントの１つのプールから生成され得ることである。上記のように、インビボシャッフリングストラテジー（例えば、プロトプラスト融合）は、単一の対毎の接合反応を生じる。従って、インビトロ法によって得られる多様性のレベルを生成するために、インビボ法が、反復的に行われる。つまり、生物のプールは、組み換えられ、そしてその子孫が選択されずにプールされ、次いで、再び組み合わされる。このプロセスは、十分なサイクルの間反復され、複数親配列を有する子孫を生じる。
【０４５５】
以下に記載されるのは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの４つの系統をシャッフリングするために使用される方法である。単独の栄養マーカーを各々含有する始めの４つの系統から、３〜４回の反復的にプールされたプロトプラスト融合物は、４つのマーカーの１６全ての可能な組み合わせを含有するシャッフリングされた生物の集団を生成するために十分であった。これは、４つの系統の単一のプールされた融合物に比較しての、４つの親子孫の生成における１０6倍の改善を表す。
【０４５６】
図３１に示すように、プロトプラストを、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのいくつかの系統から生成し、プールし、そして融合した。菌糸体を生成し、そして胞子形成させた。その胞子を収集し、菌糸体へと成長させ、プロトプラストを形成させ、プールし、そして融合させ、そしてそのプロセスを、３〜４回反復した。次いで、得られる胞子をスクリーニングに供した。
【０４５７】
４つのＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ系統（その各々は、４つの異なるマーカーの１つを有する）から全ゲノムシャッフリングしたライブラリーを生成するための基本的なプロトコルは、以下の通りであった。４つの菌糸体培養物（各々の系統は、４つの異なるマーカーの１つを有する）を、初期の定常期まで成長させた。各々由来の菌糸体を、遠心分離によって回収し、そして洗浄した。各培養物由来のプロトプラストを、以下のように調製した。
【０４５８】
約１０9のＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ胞子を、２５０ｍｌのバッフルフラスコ中の．０．５％グリシンを含有する５０ｍｌのＹＥＭＥへと接種した。その胞子を、回転式シェーカーにおいて３０℃で３６〜４０時間インキュベートした。菌糸体を、顕微鏡を使用して評価した。いくつかの系統は、さらに一日の培養を必要とした。その培養物を５０ｍｌのチューブに移し、そして４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その菌糸体を、１０．３％スクロースで二回洗浄し、そして４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した（菌糸体は、洗浄後、−８０℃で保存し得る）。５ｍｌのリゾチームを、約０．５ｇの菌糸体ペレットに添加した。そのペレットを、懸濁し、そして３０℃で２０〜６０分間、１０分ごとに穏やかに攪拌しながら、インキュベートした。その顕微鏡観察は、２０分間毎にプロトプラスト形成についてチェックした。一旦、その大部分がプロトプラストとなったら、プロトプラスト形成を、１０ｍｌのＰ緩衝液を添加することによって止めた。そのプロトプラストを、綿を通して濾過し、そしてそのプロトプラストを、３，０００ｒｐｍで７分間室温で遠心分離した。その上清を廃棄し、そしてそのプロトプラストを穏やかに再懸濁し、ペレット化したサイズ（通常、約５００μｌ）に従って適切な量のＰ緩衝液を添加した。１０倍の連続希釈を、Ｐ緩衝液において作製し、そしてそのプロトプラストを、１０-2希釈で計数した。プロトプラストを、１ｍｌ当たり１０10プロトプラストに調整した。
【０４５９】
各培養物由来のそのプロトプラストを、顕微鏡観察によって定量した。各培養物からの１０8のプロトプラストは、同じチューブ中で混合され、洗浄され、次いで、５０％ＰＥＧの添加によって融合された。融合されたプロトプラストを、希釈し、そして再生培地にプレートし、そしてそのコロニーが胞子形成するまで（４日間）インキュベートした。胞子を、回収し、そして洗浄した。これらの胞子は、全ての組み換え体のプールを表し、そして親はその融合物を形成する。次いで、プールされた胞子のサンプルを使用して、単一の液体培養物を接種した。その培養物を初期定常期まで成長させ、その菌糸体を回収し、そしてプロトプラストを調製した。次いで、この「菌糸体ライブラリー」由来の１０8のプロトプラストを、５０％ＰＥＧを添加することによってそれら自体と融合させた。そのプロトプラスト融合／再生／回収／プロトプラスト調製の工程を、二回繰り返した。四回目の融合から生じる胞子を、「全ゲノムシャッフリングライブラリー」として考え、そしてそれらを、４つのマーカーの１６の可能な組み合わせの頻度についてスクリーニングした。各回の融合からのその結果を図３３および以下の表に示す。
【０４６０】
シャッフリング手順の結果を、図３３に示す。特に、選択の前に、組換えの回を加えることにより、４つ全ての関連する選択マーカーを取り込んだクローンの数の有意な増大を生成し、このことは、その集団が反復的プーリングおよび胞子形成によって漸増的に多様になったことを示している。さらなる結果を、以下の表に示す。
【０４６１】
【表６】
Figure 0004674329
４つの親シャッフリングの４つの株は、以下の４つの可能な栄養マーカーのうちの３つについて各々栄養素要求株であり、そして１つについて原栄養菌株であった：アルギニン（Ａ）、シスチン（Ｃ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｇ）（Ｐ）、および／またはウラシル（Ｕ）。各融合物からの胞子を、これらの４つの栄養素の１６の可能な組合せの各々にプレーティングし、そして粒子状培地上で増殖する集団のパーセントを、選択的プレート上でコロニーを形成する、４つ全ての栄養素を有するプレート上で増殖するコロニーに対する比として算出した（全ての改変体は、４つ全ての栄養素を有する培地上で増殖し、従って、このプレートからのコロニーは、生存可能な全集団を表す）。マーカー表現型なし、１つ、２つ、および３つのマーカー表現型の各々についての補正したパーセンテージを、「不必要な」栄養素を有する培地上で増殖し得るさらなるマーカーを有する細胞のパーセンテージを差し引くことにより決定した。例えば、さらなる栄養素なしで増殖するコロニー（原栄養菌株）の数を、栄養素を要求する任意のプレート上で増殖するコロニー数から差し引いた。
【０４６２】
（ＩＩ．組織化されたヘテロ二重鎖シャッフリングを通しての全ゲノムシャッフリング）
選り抜きの生物のコスミドライブラリーのヘテロ二重鎖シャッフリングによって目的の表現型を最適化するための新たな手順が提供される。コスミドクローニング、形質転換、インビトロパッケージング／トランスフェクション、およびプラスミド移入／可動化を含む、この手順は、プロトプラスト融合を必要とせず、そして充分に確立された遺伝系が利用可能である細菌へ適用可能である。これらの方法によって改善され得る微生物としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、および他のグラム陰性生物が挙げられる。この方法はまた、グラム陽性微生物にも適用可能である。
【０４６３】
組織化されたヘテロ二重鎖シャッフリングを通しての全ゲノムシャッフリングの基本的手順を、図３４に示す。
【０４６４】
工程Ａでは、改善されるべき生物の染色体ＤＮＡは、適切な制限酵素で消化され、そしてコスミド中に連結される。コスミドに基づくヘテロ二重鎖ガイドＷＧＳのために用いられるコスミドは、その後の工程において直鎖化のために用いられるべき少なくとも２つの稀な制限酵素認識部位（例えば、ＳｆｒおよびＮｏｔＩ）を有する。完全な染色体を表すために十分なコスミドは精製され、そして９６ウェルマイクロタイターディッシュ中に保存される。工程Ｂでは、ライブラリーの小さなサンプルが、ヒドロキシルアミンまたは他の変異誘発性化学物質を用いてインビトロで変異誘発される。工程Ｃでは、変異誘発コレクションの各ウェルからのサンプルが、標的細胞をトランスフェクトするために用いられる。工程Ｄでは、トランスフェクタントが、表現型の改善について（各変異誘発サンプルウェルからのプールとして）アッセイされる。このアッセイからのポジティブ物は、特定のウェルからのコスミドが、表現型の改善を付与し得、従って、ヘテロ二重鎖媒介シャッフリングについての適切な標的である大きなゲノムフラグメントを含むことを示す。工程Ｅでは、同定されたコスミドの変異体ライブラリーを保有するトランスフェクトした細胞が、固形培地上にプレーティングすることによって分離され、そして改善された表現型を付与する独立変異体についてスクリーニングされる。工程Ｆでは、ポジティブ細胞からのＤＮＡは、起源により単離およびプールされる。工程Ｇでは、選択されたコスミドプールは、一方のサンプルがＳｆｒによって消化され得、そして他方のサンプルがＮｏｔＩで消化され得るように分けられる。これらのサンプルはプールされ、変性され、再アニーリングされ、そして再連結される。
【０４６５】
工程Ｈでは、標的細胞が、得られるヘテロ二重鎖でトランスフェクトされ、そしてインビボでヘテロ二重鎖の間で「組換え」が生じるのを可能にするように増殖される。トランスフェクタントは、スクリーニングされ得る（この集団は、ペア様式組換えを表す）か、または通常は、工程Ｉによって表されるように、この組換えられたコスミドは、スクリーニングの前に、繰返しインビトロヘテロ二重体形成およびインビボ組換え（可能性のある変異の完全なコンビナトリアルライブラリーを生成するため）によってさらにシャッフリングされる。さらなる変異誘発工程もまた、シャッフリングプロセスの間に多様性を増すために付け加えられ得る。
【０４６６】
工程Ｊでは、一旦、様々に分布した遺伝子座を保有するいくつかのコスミドが改善されると、これらは、染色体組み込みによって同じ宿主中へ合わされる。この生物は、直接的に用いられ得るか、またはヘテロ二重鎖によってガイドされる全ゲノムシャッフリングの新たな回に供され得る。
【０４６７】
（実施例）
以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるが、本発明を限定しない。示した正確な手順に対する本質的に等価な改変が、本開示を検討した当業者には明らかである。
【０４６８】
（Ａ．実施例１：超組換え生成性（ｈｙｐｅｒ−ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）ＲｅｃＡを進化させること）
ＲｅｃＡタンパク質は、大部分のＥ．ｃｏｌｉ相同組換え経路に関与する。ｒｅｃＡにおける大部分の変異は、組換えを阻害するが、いくつかは、組換えを増加させることが報告されている（Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５８，４０１−４６５（１９９４））。以下の実施例は、インビボのシャッフリング形式において有用な超組換え生成活性を獲得するためのＲｅｃＡの進化を記載する。
【０４６９】
超組換え生成性ＲｅｃＡを、Ｓｈｅｎら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１２、４４１−４５７（１９８６）；Ｓｈｅｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８，３５８−３６０（１９８９）によって開発された系の改変型を、組換え頻度に対する基質の長さおよび相同性の効果を測定するために用いて選択した。ＳｈｅｎおよびＨｕａｎｇらの系は、小さな（３１〜４３０ｂｐ）相同性領域を有するプラスミドおよびバクテリオファージを使用し、この領域でこれら２つは組換え得た。制限性宿主では、このプラスミド配列を取り込んだファージのみがプラークを形成し得た。
【０４７０】
ｒｅｓＡのシャッフリングのために、内因性ｒｅｃＡおよびｍｕｔＳを、宿主株ＭＣ１０６１から欠失させた。この株では、プラスミドとファージとの間に組換えは見られなかった。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＡを、組換えベクターのうちの２つ（Ｂｐ２２１およびπＭＴ６３１ｃ１８）にクローニングした。クローニングされたＲｅｃＡを含むプラスミドは、以下の相同性ファージと組換えし得た：λＶ３（Ｂｐ２２１と４３０ｂｐ同一）、λＶ１３（Ｂｐ２２１と８９％同一の４３０ｂｐストレッチ）、およびλｌｉｎｋ Ｈ（１８位での１つのミスマッチ以外はπＭｔ６３１ｃ１８と３１ｂｐ同一）。
【０４７１】
次いで、クローニングされたＲｅｃＡを、標準的なＤＮａｓｅ処理、続いてＰＣＲベースの再アセンブリを用いてインビトロでシャッフリングした。シャッフリングされたプラスミドを、非組換え性宿主株に形質転換した。これらの細胞を、一晩増殖させ、ファージλＶｃ、λＶ１３、またはλｌｉｎｋ Ｈに感染させ、そして１０倍過剰のＭＣ１０６１欠損プラスミドの存在下でＮＺＣＹＭプレートにプレーティングした。ｒｅｃＡ対立遺伝子がプラスミドとファージとの組換えを促進する効率が高ければ高いほど、バクテリオファージＤＮＡ中に提示される対立遺伝子がより多い。その結果、プレートから全てのファージを収集すること、およびｒｅｃＡ遺伝子を回収することによって、最も組換え生成性が高いｒｅｃＡ対立遺伝子が選択される。
【０４７２】
野生型および３回のシャッフリング後の超組換え生成性ＲｅｃＡのプールについての組換え頻度は、以下の通りであった：、
【０４７３】
【表７】
Figure 0004674329
これらの結果は、４３０ｂｐの基質についての組換えの５０倍の増加、および３１ｂｐの基質についての５倍の増加を示す。
【０４７４】
５つの個々のクローン性単離物についてのＢＰ２２１とＶ３との間の組換え頻度を以下に示し、そしてそれらのＤＮＡおよびタンパク質の配列および整列を図１２および１３に含める。
【０４７５】
【表８】
Figure 0004674329
クローン２、４、５、６および１３は、ｒｅｃＡにおけるさらなる改善が所望される場合、その後の回のシャッフリングにおいて基質として用いられ得る。野生型ｒｅｃＡ配列からの変化の全てが、超組換え生成性表現型に必ずしも寄与するわけではない。サイレントな変化は、戻し交配によって除去され得る。あるいは、野生型からの変化の個々の点を、コドン５、１８、１５６、１９０、２３６、２６８、２７１、２８３、３０４、３１２、３１７、３４５、および３５３に取り込んでいるｒｅｃＡの改変体は、活性について試験され得る。
【０４７６】
（Ｂ．実施例２：超組換えについてのの生物全体の進化）
増加したレベルの組換えを有するＥ．ｃｏｌｉ株についての選択可能性は、ＤＮＡの鎖間架橋剤であるマイトマイシンＣへの曝露後の野生型、ΔｒｅｃＡ、ｍｕｔＳ、およびΔｒｅｃＡ ｍｕｔＳ株の表現型から示された。
【０４７７】
マイトマイシンＣへのＥ．ｃｏｌｉの曝露は、ＤＮＡの鎖間架橋を生じ、それにより、ＤＮＡ複製をブロックする。Ｅ．ｃｏｌｉにおける鎖間ＤＮＡ架橋の修復は、ＲｅｃＡ依存性組換え修復経路を介して起きる（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇら，ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（１９９５）１９１−２３２頁）。修復の間の架橋の処理は、偶然の二重鎖ＤＮＡ切断をもたらし、これはまた、ＲｅｃＡ依存性組換え経路によって修復される。従って、ｒｅｃＡ-株は、マイトマイシンＣ曝露に対して野生型株よりも有意に感受性である。実際、マイトマイシンＣは、単純なディスク感受性アッセイにおいて用いられて、ＲｅｃＡ+株とＲｅｃＡ-株との間を区別する。
【０４７８】
組換え生成性特性に加えて、マイトマイシンＣは、変異原である。ＤＮＡ損傷剤（例えば、マイトマイシンＣ）への曝露により、代表的には、ＤＮＡ損傷の誤りがちの修復に関与する産物を含むＥ．ｃｏｌｉ ＳＯＳ調節の誘導がもたらされる（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇら，１９９５，前出，４６５−５２２頁）。
【０４７９】
野生型Ｅ．ｃｏｌｉおよびｍｕｔＳ Ｅ．ｃｏｌｉへのファージＰ１によって媒介される、Δ（ｒｅｃＡ−ｓｒｌ）：：Ｔｎ１０対立遺伝子（非機能的対立遺伝子）の普遍形質導入の後、テトラサイクリン耐性形質導入体を、ｒｅｃＡ-表現型について、マイトマイシン感受性アッセイを用いてスクリーニングした。野生型株およびｍｕｔＳ株の増殖は、ディスクの中心から約１０ｍｍの半径を有する領域内で阻害されたことが、１０μｇのマイトマイシンＣで飽和した１／４インチのフィルターディスクを有するＬＢ重層物において、３７℃にて４８時間後に観察された。高レベルのマイトマイシンでのＤＮＡ架橋は、組換え修復を飽和させて、ＤＮＡ複製の致死的な遮断をもたらす。両方の株は、阻害域内に偶然のコロニー形成単位を生じたが、コロニーの頻度は、ｍｕｔＳ株において約１０〜２０倍高かった。これは、おそらく、ｍｕｔＳバックグラウンドの増加した自然変異率に起因する。並べた比較は、ΔｒｅＡ株およびΔｒｅｃＡ ｍｕｔＳ株が、マイトマイシンＣに対して有意により感受性であり、増殖が、ディスクの中心から約１５ｍｍ広がった領域において阻害されたことを実証した。しかし、ｒｅｃＡ+株とは対照的に、Ｍｉｔr個体は、（ｍｕｔＳバックグラウンドにおいてさえも）増殖阻害領域において見られなかった。Ｍｉｔr個体は、ｒｅｃＡ+バックグラウンドにおいて出現したが、ΔｒｅｃＡバックグラウンドにおいては出現しなかったことは、Ｍｉｔrが、機能的なＲｅｃＡタンパク質に依存することを示し、そしてＭｉｔrが、マイトマイシンＣ融合性損傷の組換え修復能力の増加からもたらされ得ることを示唆する。
【０４８０】
ＲｅｃＡ媒介組換え修復能力の増加を導く変異は、多様で、予期されず、関連がなく、そして潜在的に相乗作用的であり得る。Ｍｉｔrについての選択と染色体シャッフリングとを交互に行う繰返しプロトコルは、劇的に増加した組換え能力を有する個々の細胞を進化させる。
【０４８１】
繰返しプロトコルは以下の通りである。マイトマイシンＣへのｍｕｔＳ株の曝露後、Ｍｉｔr個体はプールされ、そして（例えば、Ｈｆｒ媒介染色体シャッフリング、もしくは分割−プール普遍形質導入、またはプロトプラスト融合を介して）交雑育種される。Ｍｉｔrをもたらし、そしておそらく組換え修復能力の増加をもたらす対立遺伝子は、ミスマッチ修復の非存在下で集団間でシャッフリングされる。さらに、マイトマイシンＣへの曝露後の誤りがちの修復は、次の回のシャッフリングのための新たな変異遺伝子を導入し得る。このプロセスは、マイトマイシンＣへの徐々により厳しい曝露を用いて繰り返される。種々の対立遺伝子を生成する手段としての最初の回における多数の並行選択。必要に応じて、単離物の組換え生成性は、超組換えについて、プラスミド×プラスミドアッセイまたは染色体×染色体アッセイ（例えば、Ｋｏｎｒａｄ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３０，１６７−１７２（１９９７）のもの）を用いてモニタリングされ得る。
【０４８２】
（Ｃ．実施例３：γ−アクチノロジン（γ−ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ）の生成を改善させるためのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの全ゲノムシャッフリング）
Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒからの二次代謝産物であるγ−アクチノロジンの生成を改善するために、この生物のゲノム全体を、単独で、またはその近縁のＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓを伴ってかのいずれかでシャッフリングする。以下に記載される最初の手順では、遺伝的多様性は、化学的手段または物理的手段によって生成されるランダム変異から生じる。第２の手順では、遺伝的多様性は、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのゲノムとＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓのゲノムとの間に存在する天然の多様性から生じる。
【０４８３】
Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの胞子懸濁物を、滅菌水中に再懸濁し、そして１％の胞子が生存するようなＵＶ変異誘発（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅを用いて約６００「エネルギー」単位）に供し、そして得られる変異体を、胞子形成寒天上で「芽生え」させる。個々の胞子は、それらのゲノム内に様々な変異を保有する単核細胞を表す。胞子を収集し、洗浄し、そして胞子形成コロニーをもたらす固形培地（好ましくは、大豆寒天培地、Ｒ５培地、または他の栄養分に富む培地）上にプレーティングする。次いで、コロニーを形成させ、そして自動コロニーピッカー（例えば、Ｑ−ｂｏｔ（Ｇｅｎｅｔｉｘ））を用いてランダムに拾う。あるいは、青色色素のより大きいかまたはより濃いハロを生成するコロニーを、さらにまたは優先的に拾う。
【０４８４】
これらのコロニーを、１／３×ＹＥＭＥ培地（１７０μｌ／ウェル）を含む９６ウェルマイクロタイタープレート中に接種する。２つの無菌３ｍｍガラスビーズを各ウェルに添加し、そしてこれらのプレートを、加湿インキュベータ中で１５０〜２５０ｒｐｍで３０℃にて振盪する。これらのプレートを、７日間までインキュベートし、そして細胞上清を、γ−アクチノロジン生成についてアッセイする。
【０４８５】
アッセイするために、５０μＬの上清を、９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレート中の１００μＬの蒸留水に添加し、そしてこれらのプレートを、４０００ｒｐｍで遠心分離して菌糸をペレット化させる。次いで、５０μＬの澄明化した上清を取り出し、そして各ウェル中に１５０μＬの１Ｍ ＫＯＨを含む平底ポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレートに添加する。次いで、得られるプレートを、個々のサンプルの６５４ｎｍでの吸光度をγ−アクチノロジン含量の尺度として測定するマイクロタイタープレートリーダー中で読み取る。
【０４８６】
次いで、野生型Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのレベルよりも有意に高いレベルでγ−アクチノロジンを生成する培養物由来の菌糸を単離する。これらを、固形胞子形成培地上で増殖させ、そして改善された変異体各々の胞子調製物を作製する。これらの調製物から、改善された変異体の各々のプロトプラストを生成し、一緒にプールし、そして融合させる（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ−Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．らに記載される通り）。融合されたプロトプラストを再生させ、そして胞子形成させる。胞子を収集し、そしてさらに拾い、そしてスクリーニングするために固形培地上にプレーティングするか、または複数親（ｍｕｌｔｉｐａｒｅｎｔ）子孫の提示を増加させるためにプロトプラストを生成させ、そして再度（またはプール様式組換えを達成するための方法について以前に記載された通りに数回）融合させるために用いた後に拾い、そしてスクリーニングするかのいずれかとする。
【０４８７】
さらなる改善された変異体は、ｇ−アクチノロジン生成に対して相加的効果または相乗的効果を有する２以上の変異の組合せからもたらされる。さらなる改善変異体を、プロトプラストのプール様式融合によって再度接合させ得るか、またはこれらをランダム変異誘発に曝露させて、さらなる改善のためにスクリーニングおよび接合されるべき新規な細胞集団を作製し得る。
【０４８８】
ランダム変異誘発の代替物として、遺伝的多様性の供給源である天然の多様性が用いられ得る。この場合、野生型Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒおよびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓから作製されるプロトプラストを一緒に融合する。次いで、この接合の再生された子孫からの胞子を繰返し融合および再生して相加的多様性を作製するか、またはこれらを固形培地上で分離し、拾い、そしてｇ−アクチノロジンの増強された生成についてスクリーニングするかのいずれかとする。以前のように、改善された亜集団を一緒に接合させてさらに改善されたファミリーシャッフリングされた生物を同定する。
【０４８９】
（Ｄ．実施例４：高処理能力アクチノロジンアッセイ）
菌糸を選択するために用いられる高処理能力シャッフリングアクチノロジンアッセイについてのさらなる詳細を、図３２に示す。手短には、シャッフラント（ｓｈｕｆｆｌａｎｔ）を、Ｑ−ｂｏｔ自動システムを用いる標準的な自動手順によって拾い、そして標準的な９６ウェルプレートに移した。３０℃にて７日間のインキュベーション後、得られた菌糸を遠心分離し、そして細胞上清のサンプルを取り出し、そして９６ウェル中で０．１Ｍ ＫＯＨと混合し、そして吸光度を６５４ｎｍで読み取った。最良のポジティブクローンを選択し、そして振盪フラスコ中で増殖させた。
【０４９０】
約１０9個のプロトプラストを、３，０００ｒｐｍにて７分間遠心分離した。１より多くの株を用いた場合、等しい数のプロトプラストを各株から得た。大部分の緩衝液を除去し、そして穏やかに弾くことによりペレットを残りの緩衝液（総容量約２５μｌ）中に懸濁した。０．５ｍｌの５０％ ＰＥＧ１０００を添加し、そして２回の穏やかなピペッティングによってプロトプラストと混合した。次いで、この混合物を２分間インキュベートした。０．５ｍｌのＰ緩衝液を添加し、そして穏やかに混合した。（これは、１０-1の希釈での融合物である）。１０倍連続希釈を、Ｐ緩衝液において行った。２分後、希釈物を、Ｒ５プレートに各々５０μｌで各希釈について２3プレートで１０-1、１０-2、および１０-3でプレーティングした（プレーティングのために、約２０個の３ｍｍガラスビーズを用い、穏やかに振盪した）。第１のコントロールとして、プロトプラストの再生のために、上記と同数のプロトプラストを用い、Ｐ緩衝液を全体が１ｍｌになるように添加した（これは、希釈１０-1での再生である）。混合物を、Ｐ緩衝液中にさらに希釈した（１０×）。この希釈物を、各々５０μｌでＲ５プレートに１０-1、１０-2、および１０-3でプレーティングした。第２のコントロールとして（非プロトプラスト化菌糸バックグラウンドのチェックとして）、上記と同数のプロトプラストを用い、０．１％ ＳＤＳを合計１ｍｌとなるように添加した（これは、希釈１０-1でのバックグラウンドである）。０．１％ ＳＤＳ中でのさらなる１０×希釈後、この希釈物を、各々５０μｌでＲ５プレートに１０-3、１０-4、および１０-5でプレーティングした。これらのプレートを風乾し、そして３０℃にて３日間インキュベートした。
【０４９１】
コロニー数（計数可能であったもの）を各プレートから計数し、再生したプロトプラストの数を１００％として用い、そしてバックグラウンドのパーセンテージ（通常１より小さい）および融合生存物のパーセンテージ（通常１０より大きい）を算出した。これらの融合プレートを、全てのコロニーが充分に胞子形成するまで、３０℃にてさらに２日間インキュベートした。胞子を、５，０００未満のコロニーを有するプレートから収集した。胞子を綿を通して濾過し、そして水で１回洗浄し、２０％グリセロール中に懸濁し、そして計数した。これらの胞子を、さらなる研究、培養物接種のために用いるか、または単に−２０℃にて保存する。
【０４９２】
（Ｅ．実施例４：２相反応触媒作用のためのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓの全ゲノムシャッフリング）
本実施例は、本明細書中に記載される技術をどのようにして、細胞全体によって触媒される生体内変化の一般的な改善を可能にする技術に適用するかの一例を提供する。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓを、最初の標的として選択した。なぜなら、これは、（環境単離物をスクリーニングすることによって一般に選択される全細胞触媒において通常であるように）分子生物学が未発達である代表的な系であるとともに、２相反応を触媒し得る生物であるからである。
【０４９３】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓの全ゲノムシャッフリングの目的は、任意の選択した経路を通る流量の増加を得ることである。経路の基質特異性は、現在は基質ではない分子を受け入れるように変更され得る。これらの特徴の各々は、全ゲノムシャッフリングの間に選択され得る。
【０４９４】
全ゲノムシャッフリングの間に、シャッフリングされた酵素および経路のライブラリーが作製され、そしてＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ中に形質転換され、そして（好ましくは、標的表現型における改善についての高処理能力アッセイによって、例えば、生成物を測定するための質量分析法によって）スクリーニングされる。
【０４９５】
上記のように、遺伝子の染色体での状況は、遺伝子の活性に対して劇的な効果を有し得る。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ中の小さなプラスミドへの標的遺伝子のクローニングは、全体的な経路活性を劇的に（５〜１０倍以上の倍数で）低減し得る。従って、（プラスミド上の）経路のＤＮＡシャッフリングに関するこの出発点は、野生型株の活性よりも１０倍低くあり得る。対照的に、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ染色体のランダムな部位への遺伝子の組み込みは、活性の有意な（５〜１０倍）増加をもたらし得る。類似の現象が、ＤＮＡシャッフリングによるアルセネート耐性オペロン（もとは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに由来する）のＥ．ｃｏｌｉにおける近年の特異的進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）において観察された。このプラスミドのシャッフリングは、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体へのこのオペロンの効率的な組み込みを導く配列の変化を生じた。３つの遺伝子経路の特異的進化により得られたアルセネート耐性の計５０倍の増加のうち、約１０倍は、その染色体へのこの組み込みによってもたらされた。染色体内での位置もまた、重要なようである：例えば、複製起点付近の配列は、効果的により高い遺伝子量を有し、それゆえ、より高い発現レベルを有する。
【０４９６】
予測不能な染色体位置効果を充分に利用するため、ならびにそれらを複数サイクルの変異、組換え、および選択を利用する特異的進化ストラテジーに組み込むために、遺伝子をインビトロで操作し、次いで最適な染色体位置に移入する。プラスミドと染色体との間の組換えは、２つの異なる方法で生じる。組み込みは、プラスミドと染色体との有意な配列相同性が存在する位置で、すなわち、相同組換えによって起こる。組み込みはまた、明らかな配列同一性の存在しないところで、すなわち、非相同組換えによって起こる。これらの２つの組換え機構は、異なる細胞装置によって達成され、そして特異的進化において異なる潜在的適用を有する。
【０４９７】
遺伝子の重複および標的経路の染色体組み込みによってもたらされる活性の増加を、ＤＮＡシャッフリングの強力な技術と合わせるために、シャッフリングされた遺伝子のライブラリーをインビトロで作製し、そして相同組換えによって野生型遺伝子の代わりに染色体に組み込む。次いで、組換え体を、増加した活性についてスクリーニングする。このプロセスは、必要に応じて、本明細書中で考察したように反復性とされる。最良のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ改変体をプールし、そしてこのプールを２つに分ける。遺伝子をこのプールからＰＣＲによってクローニングし、一緒にシャッフリングし、そして相同組換えによって、残りの半分のプールの染色体中に再度組み込む。組換え体をもう一度スクリーニングし、最良のものを採取およびプールし、そしてこのプロセスを必要に応じて繰り返す。
【０４９８】
時々、経路における連続反応を触媒する酵素間には複雑な相互作用が存在する。時々、１つの酵素の存在は、この経路の他の酵素の活性に有害に作用し得る。このことは、タンパク質−タンパク質相互作用の結果、または別の酵素の産物による１つの酵素の阻害、または一次代謝産物または二次代謝産物の不均等であり得る。
【０４９９】
この問題は、ＤＮＡシャッフリングにより克服される。ＤＮＡシャッフリングは、スクリーニングされるどのような形質においても改善を生じるという、標的遺伝子クラスターにおける解決を生じる。代替的アプローチ（これは、この問題を解決し得るだけでなく、予期される将来の律速段階（例えば、還元力の供給および基質輸送）も解決し得る）は、まだ未知のゲノム配列のような他のものの過剰発現による相補である。
【０５００】
多コピーＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓベクター（例えば、ｐＲＣ１）におけるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓゲノムＤＮＡのライブラリーを、まず作製する。これをＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ中に形質転換し、そして形質転換体を所望の表現型の増加についてスクリーニングする。経路活性の増加を生じるゲノムフラグメントをＤＮＡシャッフリングにより進化させて、選択する特性に対するその有益な効果をさらに増大させる。このアプローチは、なんの配列情報も必要とせず、タンパク質の性質についてかまたは経路の相互作用についての、いかなる知識または仮定も、あるいは律速段階についてのものでさえ、必要とせず、所望の表現型の検出にのみ依存する。正に相互作用するゲノム配列のＤＮＡシャッフリングによるこの種のランダムクローニングおよび部分配列進化は、非常に強力でかつ一般的である。種々の供給源のゲノムＤＮＡが使用され、この供給源は、同系遺伝子型株から潜在的に所望の特性を有する、より遠縁の種までである。さらに、原則として、この技術は、分子生物学の基礎である形質転換およびクローニングベクターが利用可能である任意の微生物に、そしてアッセイされ得る任意の特性について、好ましくは高処理能力様式で、適用され得る。
【０５０１】
染色体内での相同組換えを使用して、プラスミド進化の限界およびサイズ制限を回避し、そしてこの相同組換えを必要に応じて使用して、中心代謝を変化させる。このストラテジーは、その染色体の文脈でのシャッフリング遺伝子について上記されたものと、インビトロシャッフリングが生じないことを除いて、同様である。代わりに、その親株を変異原（例えば、紫外光またはニトロソグアニジン）で処理し、そして改良された変異体を選択する。この改善された変異体をプールし、そして分割する。このプールの半分を使用して、ランダムなゲノムフラグメントを生成し、相同組換えベクター中へとクローニングする。されなるゲノムフラグメントを、所望の特性（この場合は、より速い代謝速度およびより安価な炭素源上で増殖する能力）を有する関連する種から誘導する。クローニングしたゲノムフラグメントを、変異体プールの残り半分のゲノム中に相同組換えさせ、そして改善された表現型を有する改変体を選択する。これらを、さらなる回の変異誘発、選択、および組換えに供する。また、このプロセスは、組換えベクターおよびアッセイが開発され得る任意の細胞生体触媒全体の改善について完全に一般的である。反復組換えを実行して、このプロセス中の任意の工程でプールの多様性を増大させ得る。
【０５０２】
効率的な相同組換えが、上記で概説された染色体進化ストラテジーの反復性に重要である。非相同組換えは、無駄な組み込み（選択に際して）、続いてプラスミド全体の切り出し（対抗選択後）を生じる。あるいは、対抗選択を使用しない場合、ますます多コピーのプラスミド／ゲノム配列の組み込みが存在し、これはともに不安定であり、そしてまたさらなる選択マーカーを各サイクルのために必要とする。さらに、さらなる非相同組換えがランダムな位置で生じる。そしてこれは、組み込まれた配列の良好な発現を導いても導かなくてもよい。
【０５０３】
（Ｆ．実施例５：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓにおける相同組換えの割合の増加）
遺伝学的アプローチを使用して、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓにおける相同組換えの割合を増加させる。相同組換えにおける増加を進化させるための標的化ストラテジーおよび非標的化ストラテジーの両方を使用する。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｅｃＡを、ＤＮＡシャッフリングによって進化させ、これが染色体内で相同組換えを促進させる能力を増大させる。ｒｅｃＡ遺伝子を選択したのは、上記のようなＥ．ｃｏｌｉ．における相同組換えの割合の増大を生じることが知られているｒｅｃＡの改変体が存在するからである。
【０５０４】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ由来のｒｅｃＡ遺伝子を、ＤＮＡシャッフリングし、そして選択マーカー、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＵＲＡ３遺伝子（ウラシル前駆体アナログである５−フルオロオロチン酸に対する感受性も付与する遺伝子）のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ相同体の破壊されたコピーを保有するプラスミド中にクローニングする。この染色体中へのこのプラスミドの相同組み込みにより宿主のウラシル合成経路が破壊され、選択マーカーを保有する株を生じ、そしてこの株はまた、５−フルオロオロチン酸に耐性である。シャッフリングされたｒｅｃＡ遺伝子が組み込まれており、そしてこれを染色体から増幅し得、再びシャッフリングし得、そして組み込み選択ベクター中へとクローニングし戻し得る。各サイクルで、最大程度の相同組換えを促進するｒｅｃＡ遺伝子は、ゲノム中で組み込み体として最も良好に示されているものである。従って、相同組換え促進活性が増大しているＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｅｃＡは、進化されている。
【０５０５】
多くの他の遺伝子が、いくつかの異なる相同組換え経路に関与しており、そしてこれらのタンパク質のうちのいくつかにおける変異もまた、相同組換えのレベルが増大した細胞を導き得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩにおける変異は、ＲｅｃＡ独立性相同組換えを増大させることが、最近示された。ＤＮＡ架橋薬剤（例えば、亜硝酸、マイトマイシン、および紫外線）に対する耐性は、相同組換えに依存する。従って、この経路の活性における増大は、これらの薬剤に対する耐性の増大を生じる。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ細胞を変異誘発し、そしてＤＮＡ架橋薬剤に対する耐性の増大について選択する。これらの変異体を、プラスミドが染色体中に相同的に組み込まれる割合について試験する。ゲノムライブラリーをこれらの変異体から調製し、上記のように組合せ、そして使用して、なおより高いレベルの相同組換えを有する株を進化させる。
【０５０６】
本発明の好ましい実施態様の上記の説明は、例示および説明の目的のために示された。これらは、網羅的であることも、または本発明を開示された正確な形態に限定することも意図されない。そして多くの改変型および変化型が上記の教示に照らして可能である。当業者に明らかであり得るこのような改変型および変化型は、本発明の範囲内であることが意図される。上記で引用されたすべての特許文書および刊行物は、各項目がすべての目的のためにその全体が参考として援用されると個々に示されたのと同じ程度に、すべての目的のためにその全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１（パネルＡ−Ｄ）は、遺伝子のインビトロシャッフリングについてのスキームを示す。
【図２】 図２は、ＭｕｔＳを使用するミスマッチ配列を富化させるためのスキームを示す。
【図３】 図３は、ＭｕｔＳを使用するミスマッチ配列を富化させるための代替的なスキームを示す。
【図４】 図４は、より大きな魚を産生するための成長ホルモン遺伝子を進化させるためのスキームを示す。
【図５】 図５は、プロトプラスト融合による原核生物をシャッフリングするためのスキームを示す。
【図６】 図６は、有性生殖が以前に不可能であった真菌への生殖周期の導入のためのスキームを示す。
【図７】 図７は、プロトプラスト融合による真菌のシャッフリングのための一般的スキームを示す。
【図８】 図８は、細胞壁形成の原因である酵素のインヒビターの使用によって生成されるプロトプラストを用いるプロトプラスト融合による真菌のシャッフリングを示す。
【図９】 図９は、自発的にプロトプラストを形成する細胞壁合成における真菌株欠損を使用するプロトプラスト融合による真菌のシャッフリングを示す。
【図１０】 図１０は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび関連する生物の、ＹＡＣ媒介全ゲノムシャッフリングを示す。
【図１１】 図１１は、より大きいＤＮＡフラグメントのＹＡＣ媒介シャッフリングを示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、野生型ｒｅｃＡタンパク質のＤＮＡ配列（配列番号２）およびその５つの過剰組換え改変体のＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号３〜７）、ならびにコンセンサスヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、野生型ｒｅｃＡタンパク質のＤＮＡ配列（配列番号２）およびその５つの過剰組換え改変体のＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号３〜７）、ならびにコンセンサスヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、野生型ｒｅｃＡタンパク質のＤＮＡ配列（配列番号２）およびその５つの過剰組換え改変体のＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号３〜７）、ならびにコンセンサスヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、野生型ｒｅｃＡタンパク質のＤＮＡ配列（配列番号２）およびその５つの過剰組換え改変体のＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号３〜７）、ならびにコンセンサスヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す。
【図１３】図１３は、野生型ｒｅｃＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８）およびその５つの過剰組換え改変体のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号９〜１３）、ならびにコンセンサスタンパク質配列（配列番号１５）を示す。
【図１４】 図１４は、コンビナトリアル性を図示する。
【図１５】 図１５は、複数変異体子孫を入手するための反復する対の組換えを示す。
【図１６Ａ】 図１６Ａは、３つの異なる変異ストラテジーについての適応度対配列間隔（ｆｉｔｎｅｓｓ ｖｅｒｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐａｃｅ）のグラフである。
【図１６Ｂ】 図１６Ｂは、３つの異なる変異ストラテジーについての適応度対配列間隔（ｆｉｔｎｅｓｓ ｖｅｒｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐａｃｅ）のグラフである。
【図１７】 図１７は、無性生殖的な逐次的変異誘発および有性生殖的な繰り返し行われる組換えのグラフである。
【図１８】 図１８は、非相同組換えについての模式図である。
【図１９】 図１９は、分割およびプールストラテジーについての模式図である。
【図２０Ａ】 図２０パネルＡは、選択マーカー／対抗選択マーカーストラテジーのための模式図である。
【図２０Ｂ】 図２０パネルＢは、ＲｅｃＡについての選択マーカー／対抗選択マーカーストラテジーのための模式図である。
【図２１】 図２１は、塩許容性植物を再生させるための植物再生ストラテジーを示す。
【図２２】 図２２は、分解された（サブクローニングされた）ゲノムの全ゲノムシャッフリングを示す。
【図２３】 図２３は、遺伝子ホモログのブラインドクローニングについての模式図である。
【図２４】 図２４は、高処理能力ファミリーシャッフリングを示す。
【図２５Ａ】 図２５は、プール毎の組換えの模式図およびグラフである。
【図２５Ｂ】 図２５は、プール毎の組換えの模式図およびグラフである。
【図２６】 図２６は、プロトプラスト融合の模式図である。
【図２７Ａ】 図２７Ａは、プール毎の組換えのためのアッセイの模式図である。
【図２７Ｂ】 図２７Ｂは、プール毎の組換えのためのアッセイの模式図である。
【図２８】 図２８は、ハロアッセイおよび組み込み系の模式図である。
【図２９】 図２９は、繰り返して行われるプールされた魚の育種を例証する模式図である。
【図３０】 図３０は、繰り返して行われるプールされた植物の育種を例証する模式図である。
【図３１】 図３１は、Ｓ．Ｃｏｌｉｃｏｌｏｒのシャッフリングについての模式図である。
【図３２】 図３２は、ＨＴＰアクチノロホジンアッセイを例証する模式図である。
【図３３】 図３３は、４つの親の株の全ゲノムシャッフリングを例証する模式図および表である。
【図３４】 図３４は、組織化されたヘテロ二重鎖シャッフリングを通してのＷＧＳの模式図である。

Claims (21)

  1. 細胞を進化させて所望の特性を獲得する方法であって、以下：
    （ｉ．）異なる細胞の集団のプロトプラストを形成する工程；
    （ｉｉ．）該プロトプラストを融合してハイブリッドプロトプラストを形成する工程であって、ここで該プロトプラスト由来のゲノムが組み換わってハイブリッドゲノムを形成する、工程；
    （ｉｉｉ．）該ハイブリッドプロトプラストを、細胞の再生を促進する条件下でインキュベートし、それにより再生細胞を生成する、工程；
    （ｉｖ．）該再生細胞からプロトプラストを形成し、該プロトプラストを融合してハイブリッドプロトプラストを形成する工程であって、ここで該プロトプラストからのゲノムが組み換わってさらなるハイブリッドゲノムを形成する工程；該さらなるハイブリッドプロトプラストを、細胞の再生を促進する条件下でインキュベートし、それによってさらなる再生細胞を生成する工程を繰返す工程；ならびに
    （ｖ．）選択またはスクリーニングして、該所望の特性の獲得に向けて進化したさらなる再生細胞を単離する、工程、
    を包含する、方法。
  2. 前記所望の特性は、熱耐性、エタノール生成、エタノール耐性、酸、酵素補因子の改善された生成および維持、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの改善された生成および維持、ならびに改善されたグルコース輸送から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. さらに、前記再生細胞が、前記所望の特性を獲得するまで、工程（ｉ．）〜（ｖ．）を、工程（ｉｉｉ．）における再生細胞または工程（ｉ．）における前記プロトプラストを形成するために用いられる工程（ｉｖ．）におけるさらなる再生細胞について繰り返す工程を包含する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ハイブリッドプロトプラストは、２より多くの親ゲノムを有する細胞を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記異なる細胞は真菌細胞であり、そして前記再生細胞は、真菌菌糸である、請求項１に記載の方法。
  6. プロトプラストが、菌糸または胞子を酵素で処理することによって提供される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記真菌細胞は、完全な細胞壁の合成能を欠く脆弱株由来であり、それによってプロトプラストが自然に形成される、請求項５に記載の方法。
  8. 前記菌糸を、細胞壁形成のインヒビターで処理してプロトプラストを生成する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
  9. 選択またはスクリーニングして、親ゲノムを有する細胞を含まない、ハイブリッドゲノムを有する再生細胞を単離する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  10. 第１の亜集団の細胞が第１のマーカーを含み、そして第２の亜集団の細胞が第２のマーカーを含み、そして前記方法はさらに、選択またはスクリーニングして、該第１のマーカーおよび第２のマーカーの両方を発現する再生細胞を同定する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
  11. 前記第１のマーカーは膜マーカーであり、そして前記第２のマーカーは遺伝マーカーであり、該膜マーカーは、ビオチン、フルオレセイン、およびローダミンからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記第１のマーカーは、ヘテロ多量体酵素の第１のサブユニットであり、そして前記第２のマーカーは、該ヘテロ多量体酵素の第２のサブユニットである、請求項１０に記載の方法。
  13. 少なくとも１サイクルにおいてＤＮＡフラグメントのライブラリーでプロトプラストを形質転換する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  14. 前記ＤＮＡフラグメントは、制限酵素由来である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記プロトプラストを、少なくとも１サイクルにおいて紫外照射に曝露する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  16. 前記所望の特性は、タンパク質、一次代謝産物、または二次代謝産物の発現である、請求項１に記載の方法。
  17. 前記所望の特性は、タンパク質または二次代謝産物の分泌である、請求項１に記載の方法。
  18. 前記二次代謝産物が、タキソール、シクロスポリンＡ、およびエリスロマイシンから選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記所望の特性は、減数分裂能である、請求項１に記載の方法。
  20. 前記所望の特性は、真菌の宿主範囲を拡大することであり、その結果、その他の栄養適合性群からの真菌とヘテロカリオンを形成し得る、請求項１に記載の方法。
  21. 前記プロトプラストまたは菌糸を、少なくとも１サイクルにおいて変異促進性薬剤に曝露する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
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