DK1259628T5 - Fremgangsmåde til dannelse af hypermutabel gær - Google Patents

Description

OPFINDELSENS OMRÅDE

Opfindelsen angår området fejlparringsreparationsgener. Den angår især området in situ-muta g enese af encellede organismer.

OPFINDELSENS BAGGRUND

Inden for de seneste fire år er den genetiske årsag til syndromet hereditær nonpolypøs kolorektal cancer (HNPCC), også kendt som Lynch syndrom II, blevet fastslået for størstedelen af de slægtninge, som lider af sygdommen (Liu, B., Parsons, R., Papadopoulos, N., Nicolaides, N.C., Lynch, H.T., Watson, P., Jass, J.R., Dunlop, M., Wyllie, A., Peltomaki, P., de la Chapelle, A., Hamilton, S.R., Vogelstein, B., og Kinzler, K.W. 1996. Analysis of mismatch repair genes in hereditary non-polyposis colorectal cancer patients. Nat. Med. 2:169-174). Den molekylære basis for HNPCC involverer genetisk ustabilitet, der er et resultat af defekt fejlparringsreparation (MMR). Patentansøgning CA-A-2240609 (The John Hopkins University) beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af hypermutable celler eller dyr ved at indføre dominante negative alleler af et fejlparringsreparationsgen. Indtil nu er der blevet identificeret seks gener i mennesker, hvilke gener koder for proteiner og synes at deltage i MMR-processen, herunder mufS-homologerne GTBP, hMSH2 og hMSH3 og ' mutL-homologerne hMLHl, hPMSl og hPMS2 (Bronner, C.E., Baker, S.M., Morrison, P.T., Warren, G., Smith, L.G., Lescoe, M.K., Kane, M., Earabino, C., Lipford, J., Lindblom, A., Tannergard, P., Bollag, RJ., Godwin, A., R., Ward, D.C., Nordenskjold, M., Fishel, R., Kolodner, R. og Liskay, R.M. 1994. Mutation in the DNA mismatch repair gene homologue hMLHl is associated with hereditary non-polyposis coion cancer. Nature 368:258-261; Fishel, R., Lescoe, M., Rao, M.R.S., Copeland, N.J., Jenkins, N.A., Garber, J., Kane, M. og Kolodner, R. 1993. The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colon cancer. Cell 7:1027-1038; Leach, F.S., Nicolaides, N.C., Papadopoulos, N., Liu, B., Jen, J., Parsons, R., Peltomaki, P., Sistonen, P., Aaltonen, L.A., Nystrom-Lahti, M., Guan, X.Y., Zhang, J., Meltzer, P.S., Yu, J.W., Kao, F.T., Chen, D.J., Cerosaletti, K.M., Fournier, R.E.K., Todd, S., Lewis, T., Leach R.J., Naylor, S.L., Weissenbach, J., Mecklin, J.P., Jarvinen, J.A., Petersen, G.M., Hamilton, S.R., Green, J,, Jass, J., Watson, P., Lynch, H.T., Trent, J.M., de la Chapelle, A., Kinzler, K.W. og Vogelstein, B. 1993. Mutations of a mutS homolog in hereditary non-polyposis colorectal cancer. Cell 75:1215-1225; Nicolaides, N.C., Papadopoulos, N. Liu, B.,

Wei, Y.F., Carter, K.C., Ruben, S.M., Rosen, C.A., Haseltine, W.A., Fleisch-mann, R.D., Fraser, C.M., Adams, M.D., Venter, C.J., Dunlop, M.G., Hamilton, S.R., Petersen, G.M., de la Chapelle, A., Vogelstein, B. og Kinzler, K.W. 1994. Mutations of two PMS homologs in hereditary nonpolyposis colon cancer. Nature 371:75-80; Nicolaides, N.C., Palombo, F., Kinzler, K.W., Vogelstein, B. og Jiricny, J. 1996. Molecular cloning of the N-terminus of GTBP. Genomics 31:395-397; Palombo, F., Hughes, M., Jiricny, J., Truong, O. og Hsuan, J. 1994. Mismatch repair and cancer. Nature 36:417; Palombo, F., Gallinari, P,, Iaccarino, I,, Lettieri, T., Hughes, M.A., Truong, 0., Hsuan, J.J. og Jiricny, J. 1995. GTBP, a 160-kilodalton protein essential for mismatch-binding activity in human cells. Science 268:1912-1914; Papadopoulos, N., Nicolaides, N.C., Wei, Y.F., Carter, K.C., Ruben, S.M., Rosen, C.A., Haseltine, W.A., Fleisch-mann, R.D., Fraser, C.M., Adams, M.D., Venter, C.J., Dunlop, M.G., Hamilton, S.R., Petersen, G.M., de la Chapelle, A., Vogelstein, B. og Kinzler, K.W. 1994. Mutation of a mutL homolog is associated with hereditary colon cancer. Science 263:1625-1629). Kimlinjemutationer i fire af disse gener (hMSH2, hMLHl, hPMSl og hPMS2) er blevet identificeret hos HNPCC-slægtninge (Bronner, C.E., Baker, S.M., Morrison, P.T., Warren, G., Smith, L.G., Lescoe, M.K., Kane, M., Earabino, C., Lipford, J., Lindblom, A., Tannergard, P., Bollag, R. J., Godwin, A., R., Ward, D.C., Nordenskjold, M., Fishel, R., Kolodner, R. og Liskay, R.M. 1994. Mutation in the DNA mismatch repair gene homologue hMLHl is associated with hereditary non-polyposis colon cancer. Nature 368:258-261; Leach, F.S., Nicolaides, N.C., Papadopoulos, N., Liu, B., Jen, J., Parsons, R., Peltomaki, P., Sistonen, P., Aaltonen, L.A., Nystrom-Lahti, M., Guan, X.Y., Zhang, J., Meltzer, P.S., Yu, J.W., Kao, F.T., Chen, D.J., Cerosaletti, K.M., Fournier, R.E.K., Todd, S., Lewis, T., Leach R.J., Naylor, S. L., Weissenbach, J., Mecklin, J.P., Jarvinen, J.A., Petersen, G.M., Hamilton, S.R., Green, J., Jass, J., Watson, P., Lynch, H.T., Trent, J.M., de la Chapelle, A., Kinzler, K.W, og Vogelstein, B. 1993. Mutations of a mutS homolog in hereditary non-polyposis colorectal cancer. Cell 75:1215-1225; Liu, B., Parsons, R., Papadopoulos, N., Nicolaides, N.C., Lynch, H.T., Watson, P., Jass, J.R., Dunlop, M,, Wyllie, A,, Peltomaki, P., de la Chapelle, A., Hamilton, S.R., Vogelstein, B. og Kinzler, K.W. 1996. Analysis of mismatch repair genes in hereditary non-polyposis colorectal cancer patients. Nat. Med. 2:169-174; Nicolaides, N.C., Papadopoulos, N., Liu, B., Wei, Y.F., Carter, K.C., Ruben, S.M.,

Rosen, C.A., Haseltine, W.A., Fleischmann, R.D., Fraser, C.M., Adams, M.D., Venter, C.J., Dunlop, M.G., Hamilton, S.R., Petersen, G.M., de la Chapelle, A., Vogelstein, B. og Kinzler, K.W. 1994. Mutations of two PMS homologs in hereditary nonpolyposis colon cancer. Nature 371:75-80; Papadopoulos, N., Nicolaides, N.C., Wei, Y.F., Carter, K.C., Ruben, S.M., Rosen, C.A., Haseltine, W.A., Fleischmann, R.D., Fraser, C.M., Adams, M.D., Venter, C.J., Dunlop, M.G., Hamilton, S.R., Petersen, G.M., de la Chapelle, A., Vogelstein, B. og Kinzler, K.W. 1994. Mutation of a mutL homolog is associated with hereditary colon cancer. Science 263:1625-1629). Selvom mutatordefekten, som stammer fra MMR-defekten, kan påvirke en hvilken som helst DNA-sekvens, er mikrosatellitsekvenser særligt følsomme over for MMR-abnormiteter (Modrich, P. 1994. Mismatch repair, genetic stability, and cancer, Science 266:1959-1960). Mikrosatellitustabilitet (MI) er derfor en nyttig indikator for defekt MMR. Ud over dens forekomst i praktisk talt alle tumorer, der forekommer hos HNPCC-patienter, findes MI i en lille fraktion af sporadiske tumorer med karakteristiske molekylære og fænotypiske egenskaber (Perucho, M. 1996. Cancer of the microsattelite mutator phenotype. Biol Chem. 377:675-684). HIMPCC nedarves på en autosomal dominant måde, således at normale celler af familiemedlemmer, der lider af sygdommen, indeholder én mutantal-lel af det relevante MMR-gen (arvet fra en forælder, der lider af sygdommen) og én vildtype-allel (arvet fra forælderen, som ikke lider af sygdommen). Under de tidlige stadier af tumorudviklingen inaktiveres vildtype-allelen imidlertid gennem en somatisk mutation, hvilket efterlader cellen uden et funktionelt MMR-gen og resulterer i en udtalt defekt i MMR-aktivitet. Fordi en somatisk mutation, ud over en kimlinjemutation, er nødvendig for dannelse af defekt MMR i tumorcellerne, omtales denne mekanisme sædvanligvis som en mekanisme, der involverer to hits, som er analoge med den biallele inaktivering af tumorsuppressorgener, som initierer andre arvelige cancerformer (Leach, F.S., Nicolaides, N.C., Papadopoulos, N., Liu, B., Jen, J., Parsons, R., Peltoma-ki, P., Sistonen, P., Aaltonen, L.A., Nystrom-Lahti, M., Guan, X.Y., Zhang, J., Meltzer, P.S., Yu, J.W., Kao, F.T., Chen, DJ., Cerosaletti, K.M., Fournier, R.E.K., Todd, S., Lewis, T., Leach, R.J., Naylor, S.L., Weissenbach, J., Mecklin, J.P., Jarvinen, J.A., Petersen, G.M., Hamilton, S.R., Green, J., Jass, J., Watson, P., Lynch, H.T., Trent, J.M., de la Chapelle, A., Kinzler, K.W. og Vogelstein, B. 1993. Mutations of a mutS homolog in hereditary non-polyposis colo- rectal cancer. Cell 75:1215-1225; Liu, B., Parsons, R., Papadopoulos, N., Nicolaides, N.C., Lynch, H.T., Watson, P., Jass, J.R., Dunlop, M., Wyllie, A., Peltomaki, P., de la Chapelle, A,, Hamilton, S.R., Vogelstein, B. og Kinzler, K.W. 1996. Analysis of mismatch repair genes in hereditary non-polyposis colorectal cancer patients. Nat. Med. 2:169-174; Parsons, R., Li, G.M., Longley, M.J., Fang, W.H., Papadopolous, N., Jen, J., de la Chapelle, A., Kinzler, K.W., Vogelstein, B. og Modrich, P. 1993. Hypermutability and mismatch repair deficiency in RER+ tumor cells. Cell 75:1227-1236). På linje med denne to-hits-mekanisme opretholder de ikke-neoplastiske celler af HNPCC-patienter sædvanligvis næsten normale niveauer af MMR-aktivitet på grund af tilstedeværelsen af vildtype-allelen.

Evnen til at ændre signaltransduktionsvejene ved hjælp af manipulation af et genprodukts funktion, enten ved overekspression af vildtype-proteinet eller et fragment deraf eller ved indføring af mutationer i specifikke proteindomæner af proteinet, den såkaldte dominante negative inhiberende mutant, blev over et årti beskrevet i gærsystemet Saccharomyces cerevisiae af Herskowitz (Nature 329(6136):219-222, 1987). Det er blevet påvist, at overekspression af vildtype-genprodukter kan resultere i en lignende dominant negativ inhiberende fænotype, mest sandsynligt på grund af "udmætnin-gen" af en faktor, såsom et protein, som er til stede ved lave niveauer og nødvendigt for aktivitet; fjernelse af proteinet ved binding til et højt niveau af dets beslægtede partner resulterer i den samme nettovirkning, hvilket fører til inaktivering af proteinet og den dermed forbundne signaltransduktionsvej. For nylig har arbejde udført af Nicolaides et al. (Nicolaides NC, Littman SJ, Modrich P, Kinzler KW og Vogelstein B. 1998. A naturally occurring hPMS2 mutation can confer a dominant negative mutator phenotype. Mol Cell Biol. 18:1635-1641) vist anvendeligheden af indførelse af dominante negative inhiberende fejlparringsreparationsmutanter i pattedyrceller for at bibringe overordnet DNA-hypermutabilitet. Evnen til at manipulere MMR-processen og derfor forøge mutabiliteten af målværtsgenomet efter ønske, i dette eksempel en pattedyrcelle, muliggør frembringelsen af innovative undertyper af celler eller varianter af de originale vildtype-celler. Disse varianter kan placeres under en specificeret, ønsket selektiv fremgangsmåde, hvilket resulterer i en hidtil ukendt organisme, som udtrykker ét eller flere ændrede biologiske molekyler og har et nyt træk. Begrebet dannelse og indføring af dominante nega tive alleler af et gen, herunder MMR-allelerne, i bakterieceller er blevet beskrevet som resulterende i genetisk ændrede prokaryote fejlparringsrepara-tionsgener (Aronshtam A, Marinus MG. 1996. Dominant negative mutator mutations in the mutL gene of Escherichia coli. Nucleic Acids Res 24:2498-2504; Wu TH, Marinus MG. 1994. Dominant negative mutator mutations in the mutS gene of Escherichia coli. J Bacteriol 176:5393-400; Brosh RM Jr, Matson SW. 1995. Mutations in motif II of Escherichia coli DNA helicase II render the enzyme nonfunctional in both mismatch repair and excision repair with differential effects on the unwinding reaction. J Bacteriol 177:5612-5621). Endvidere er ændret MMR-aktivitet blevet påvist, når MMR-gener fra forskellige arter, herunder gær, pattedyrceller og planter, overudtrykkes (Fishel, R., Lescoe, M., Rao, M.R.S., Copeland, N.J., Jenkins, N.A., Garber, J,, Kane, M. og Kolod-ner, R. 1993. The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colon cancer. Cell 7:1027-1038; Studamire B, Quach T og Alani E. 1998. Saccharomyces cerevisiae Msh2p and Msh6p AT-Pase activities are both required during mismatch repair. Mol Cell Biol 18:7590-7601; Alani E, Sokolsky T, Studamire B, Miret JJ og Lahue RS. 1997. Genetic and biochemical analysis of Msh2p-Msh6p: role of ATP hydrolysis and Msh2p-Msh6p subunit interactions in mismatch base pair recognition. Mol Cell Biol 17:2436-2447; Lipkin SM, Wang V, Jacoby R, Banerjee-Basu S, Baxevanis AD, Lynch HT, Elliott RM og Collins FS. 2000. MLH3: a DNA mismatch repair gene associated with mammalian microsatellite instability. Nat. Genet. 24:27-35).

Der er et fortsat behov inden for teknikken for fremgangsmåder til genmanipulation af nyttige gærstammer for at øge deres adfærdskarakteristika og -evner.

KORT BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

Det er et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en fremgangsmåde til at gøre gærceller hypermutable.

Det er et andet formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe hypermutable gærceller.

Det er et yderligere formål med opfindelsen at tilvejebringe en fremgangsmåde til mutation af et gen af interesse i en gær.

Det er endnu et yderligere formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en fremgangsmåde ti! frembringelse af gærtyper, som er hyper- mutable.

Det er et formål med opfindelsen at tilvejebringe en fremgangsmåde til genoprettelse af normal fejlparringsreparationsaktivitet i hypermutabie celler efter selektion af stamme.

Disse og andre formål med opfindelsen tilvejebringes ved hjælp af én eller flere af de følgende udførelsesformer. I én udførelsesform tilvejebringes en fremgangsmåde til dannelse af en hypermutabel gær. Et polynukleotid, der omfatter en dominant negativ allel af et fejlparringsreparationsgen, hvilken al-lel reguleres inducerbart, således at ekspression af den dominante negative allel kan svækkes eller elimineres, indføres i en gærcelle. Cellen bliver således hypermutabel. I overensstemmelse med en anden udførelsesform tilvejbringes en homogen sammensætning af dyrkede, hypermutabie gærceller. Gærcellerne omfatter en dominant negativ allel af et fejlparringsreparationsgen, hvilken allel reguleres inducerbart, således at ekspression af den dominante negative allel kan svækkes eller elimineres. I overensstemmelse med endnu en anden udførelsesform ifølge opfindelsen tilvejebringes en fremgangsmåde til dannelse af en mutation i et gen af interesse. Der dyrkes en gærcellekultur, der omfatter genet af interesse og en dominant negativ allel af et fejlparringsreparationsgen, hvilken allel reguleres inducerbart, således at ekspression af den dominante negative allel kan svækkes eller elimineres. Gærcellen er hypermutabel. Celler af kulturen undersøges for at bestemme, hvorvidt genet af interesse indeholder en mutation. I endnu en anden udførelsesform ifølge opfindelsen tilvejebringes en fremgangsmåde til dannelse af en mutation i et gen af interesse. En gærcelle, der omfatter genet af interesse og et polynukleotid, der koder for en dominant negativ allel af et fejlparringsreparationsgen, hvilken allel reguleres inducerbart, således at ekspressionen af den dominante negative allel kan svækkes eller elimineres, dyrkes for at danne en population af muterede, hypermutabie gærceller. Populationen af muterede, hypermutabie gærceller dyrkes under betingelser, hvor træk selekteres. Gærceller, som vokser under betingelser, hvor træk selekteres, undersøges for at bestemme, hvorvidt genet af interesse indeholder en mutation.

Ved hjælp af den foreliggende opfindelse tilvejebringes der også en fremgangsmåde til dannelse af forøget hypermutabel gær. En gærcelle eksponeres for et mutagen. Gærcellen er defekt i fejlparringsreparation (MMR) på grund af tilstedeværelsen af en dominant negativ allel af mindst ét MMR-gen, hvilken allel reguleres Inducerbart, således at ekspression af den dominante negative allel kan svækkes eller elimineres. Der opnås en forøget mutationsrate af gærcellen på grund af eksponering for mutagenet.

Ifølge endnu et andet aspekt af opfindelsen tilvejebringes en fremgangsmåde til dannelse af fejlparringsreparations (MMR)-kompetent gær med nye træk. En gærcelle, der omfatter et gen af interesse og et polynukleotid, som koder for en dominant negativ allel af et fejlparringsreparationsgen, hvilken allel reguleres inducerbart, således at ekspression af den dominante negative allel kan svækkes eller elimineres, dyrkes for at danne en population af muterede, hypermutable gærceller. Populationen af muterede, hypermutable gærceller dyrkes under betingelser, hvor træk selekteres. Gærcellerne, som vokser under betingelser, hvor træk selekteres, undersøges for at bestemme, hvorvidt genet af interesse indeholder en mutation. Normal fejlparringsreparationsaktivitet genoprettes i gærcellerne.

Disse og andre udførelsesformer ifølge opfindelsen giver teknikken fremgangsmåder, som kan danne forøget mutabilitet i gær samt tilvejebringe encellede, eukaryote organismer, der indeholder potentielt nyttige mutationer, til dannelse af hidtil ukendte træk til kommerciel anvendelse.

DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

Det er en opdagelse ifølge den foreliggende opfindelse, at hypermutabel gær kan fremstilles ved at ændre aktiviteten af endogen fejlparringsreparationsaktivitet af værtsceller. Når dominante negative alleler af fejlparringsreparationsgener indføres og udtrykkes i gær, forøger de raten af spontane mutationer ved at reducere effektiviteten af endogen fejlparringsreparationsmedieret DNA-reparationsaktivitet, og gør derved gæren særdeles modtagelig over for genetiske ændringer, dvs. hypermutabel. Hypermutabel gær kan derefter anvendes til at screene for mutationer i et gen eller et sæt gener i varierende datterceller, som udviser ét eller flere træk, der ikke findes i vildtype-cellerne.

Fremgangsmåden til fejlparringsreparation, også kaldet fejlparringskorrektur, er en udviklingsmæssigt højt konserveret fremgangsmåde, som udføres af proteinkomplekser beskrevet i celler så forskelligartede som prokaryote celler, såsom bakterier, til mere komplekse pattedyrceller (Modrich, P. 1994.

Mismatch repair, genetic stability, and cancer. Science 266:1959-1960; Parsons, R., Li, G.M., Longley, M., Modrich, P., Liu, B., Berk, T., Hamilton, S.R., Kinzler, K,W. og Vogelstein, B. 1995. Mismatch repair deficiency in phenotypi-cally normal human cells. Science 268:738-740; Perucho, M. 1996. Cancer of the microsatellite mutator phenotype. Biol Chem. 377:675-684). Et fejlpar-ringsreparationsgen er et gen, som koder for ét af proteinerne af et sådant fejlparringsreparationskompleks. Selvom det ikke ønskes at være bundet af nogen bestemt teori om virkningsmekanisme, menes et fejlparringsreparationskompleks at påvise forvridninger af DNA-helixen, hvilke forvridninger stammer fra ikke-komplementær parring af nukleotidbaser. Den ikke-komplementære base på den nyere DNA-streng skæres ud, og den udskårne base erstattes med den hensigtsmæssige base, der er komplementær med den ældre DNA-streng. På denne måde eliminerer celler mange mutationer, som forekommer som et resultat af fejl i DNA-replikation, hvilket resulterer i genetisk stabilitet af dattercellerne afledt af modercellen.

Nogle vildtype-alleler samt dominante negative alleler forårsager en fænotype med defekt fejlparringsreparation, selv i nærvær af en vildtype-allel i den samme celle. Et eksempel på en dominant negativ allel af et fejlparringsreparationsgen er det humane gen hPMS2-134, som bærer en trunkeringsmutation på kodon 134 (Parsons, R., Li, G.M., Longley, M., Modrich, P., Liu, B., Berk, T., Hamilton, S.R., Kinzler, K.W. og Vogelstein, B. 1995. Mismatch repair deficiency in phenotypically normal human cells. Science 268:738-740; Nicolaides NC, Littman SJ, Modrich P, Kinzler KW og Vogelstein B. 1998. A naturally occurring hPMS2 mutation can confer a dominant negative mutator phenotype. Mol Cell Biol 18:1635-1641). Mutationen får dette gens produkt til helt abnormt at terminere på stillingen for den 134. aminosyre, hvilket resulterer i et forkortet polypeptid, der indeholder de N-terminale 133 aminosyrer. En sådan mutation forårsager en forøgelse i raten af mutationer, hvilke mutationer akkumulerer i celler efter DNA-replikation. Ekspression af en dominant negativ allel af et fejlparringsreparationsgen resulterer i svækkelse af fejlparringsreparationsaktivitet, selv i nærvær af vildtype-allelen. En hvilken som helst fej I parringsreparationsa Ilel, som frembringer en sådan virkning, kan anvendes i denne opfindelse, uanset om det er vildtype-allel eller en ændret allel, og uanset om den stammer fra pattedyr, gær, svampe, amfibier, insekter, planter eller bakterier. Anvendelsen af overudtrykte vildtype-MMR-genalleler fra mennesker, mus, planter og gær i bakterier har derudover vist sig at forårsage en dominant negativ virkning på MMR-aktiviteten i bakterieværterne (Aronshtam A, Marinus MG. 1996. Dominant negative mutator mutations in the mutL gene of Escherichia coli. Nucleic Acids Res 24:2498-2504; Wu TH og Marinus MG. 1994. Dominant negative mutator mutations in the mutS gene of Escherichia coli. J Bacteriol 176:5393-400; Brosh RM Jr og Matson SW. 1995. Mutations in motif II of Escherichia coli DNA helicase II render the enzyme nonfunctional in both mismatch repair and excision repair with differential effects on the unwinding reaction. J Bacteriol 177:5612-5621; Lipkin SM, Wang V, Jacoby R, Banerjee-Basu S, Baxevanis AD, Lynch HT, Elliott RM og Collins FS. 2000. MLH3: a DNA mismatch repair gene associated with mammalian microsatellite instability. Nat Genet 24:27-35). Dette antyder, at perturbering af MMR-proteinkomplekset med flere komponenter kan opnås ved indføring af MMR-komponenter fra andre arter i gær.

Dominante negative alleler af et fejlparringsreparationsgen kan opnås fra cellerne af mennesker, dyr, gær, bakterier, planter eller andre organismer. Screeningsceller til defekt fejlparringsreparationsaktivitet kan identificere sådanne alleler. Fejlparringsreparationsgener kan være mutante eller vildtype. MMR-gærværter kan eventuelt muteres. Udtrykket gær anvendt i denne ansøgning omfatter en hvilken som helst organisme fra eukaryot-riget, herunder, men ikke begrænset til, Saccharomyces sp., Pichia sp., Schizosaccharo-myces sp., Kluyveromyces sp. og andre svampe (Gellissen, G. og Hollenberg, CP. Gen 190(1):87-97, 1997). Disse organismer kan eksponeres for f.eks. kemiske mutagener eller stråling og kan screenes for defekt fejlparringsreparation. Genomisk DNA, cDNA, mRNA eller protein fra en hvilken som helst celle, der koder for et fejlparringsreparationsprotein, kan analyseres for variationer af vildtype-sekvensen. Dominante negative aiieler af et fejiparringsrepara-tionsgen kan også dannes kunstigt, for eksempel ved at fremstille varianter af hPMS2-134-allelen eller andre fejlparringsreparationsgener (Nicolaides NC, Littman SJ, Modrich P, Kinzler KW og Vogelstein B. 1998. A naturally occurring hPMS2 mutation can confer a dominant negative mutator phenotype. Mol Cell Biol 18:1635-1641). Forskellige teknikker til stedorienteret mutagenese kan anvendes. Egnetheden af sådanne alleler, uanset om de er naturlige eller kunstige, til anvendelse i dannelsen af hypermutabel gær kan vurderes ved at undersøge fejlparringsreparationsaktiviteten (under anvendelse af frem gangsmåder beskrevet i Nicolaides NC, Littman SJ, Modrich P, Kinzler KW og Vogeistein B. 1998. A naturally occurring hPMS2 mutation can confer a dominant negative mutator phenotype. Mol Cell Biol 18:1635-1641), som forårsages af allelen i nærvær af én eller flere vildtype-alleler, for at bestemme, hvorvidt det er en dominant negativ allel.

En gær, som overudtrykker en vildtype-fejlparringsreparationsallel eller en dominant negativ allel af et fejlparringsreparationsgen, vil blive hypermu-tabel. Dette betyder, at den spontane mutationsrate af en sådan gær forøges sammenlignet med gær uden sådanne alleler. Graden af forøgelse af den spontane mutationsrate kan være mindst 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 eller 1000 gange højere end den for den normale gær, som målt som en funktion af gærfordobling/time.

Ifølge ét aspekt af opfindelsen indføres et polynukleotid, der koder for enten en vildtype-form eller en dominant negativ form af et fejlparringsreparationsprotein, i gær, hvor den dominante negative allel reguleres inducer-bart, således at ekspression af den dominante negative allel kan svækkes eller elimineres. Genet kan være en hvilken som helst dominant negativ allel, der koder for et protein, som er del af et Fejlparringsreparationskompleks, f.eks. mutS-, mutL-, mutH- eller mutY-homologer af bakterie-, gær-, plante-eller pattedyrgener (Modrich, P. 1994. Mismatch repair, genetic stability, and cancer. Science 266:1959-1960; Prolla, T.A, Pang, Q., Alani, E., Kolodner, R.A og Liskay, R.M. 1994. MLH1, PMS1, and MSH2 Interaction during the initiation of DNA mismatch repair in yeast. Science 264:1091-1093). Den dominante negative allel kan være naturligt forekommende eller fremstillet i laboratoriet. Polynukleotidet kan være i form af genomisk DNA, cDNA, RNA eller et kemisk syntetiseret polynukleotid eller polypeptid. Molekylet kan indføres i cellen ved transformation, elektroporering, parring, partikelbombardement eller andre fremgangsmåder beskrevet i litteraturen.

Transformation anvendes heri som en hvilken som helst fremgangsmåde, hvorved et polynukleotid eller polypeptid indføres i en celle. Fremgangsmåden til transformation kan udføres i en gærkultur under anvendelse af en suspension af celler. Gæren kan være en hvilken som helst type, der er klassificeret under eukayot-riget, i overensstemmelse med international konvention. I almindelighed vil transformation udføres under anvendelse af en su- spension af celler, men andre fremgangsmåder kan også anvendes, når blot en tilstrækkelig fraktion af de behandlede celler inkorporerer polynukleotidet eller polypeptidet for at muliggøre vækst og anvendelse af transficerede celler, Protein produktet af polynukleotidet kan udtrykkes transient eller stabilt i cellen. Teknikker til transformation er velkendte for fagmanden. Tilgængelige teknikker til indføring af et polynukleotid eller polypeptid i en gærcelle indbefatter, men er ikke begrænset til, elektroporering, virustransduktion, cellefusion, anvendelse af sfaeroplaster eller kemisk kompetente celler (f.eks. cal-ciumchlorid) og pakning af polynukleotidet sammen med lipid til fusion med cellerne af interesse. Når en celle først er blevet omdannet med fejlparringsreparationsgenet eller -proteinet, kan cellen opformeres og manipuleres enten i flydende kultur eller på en fast agarmatrix, såsom en petriskål. Hvis den transficerede celle er stabil, vil genet blive udtrykt på et ensartet niveau i mange cellegenerationer, og en stabil, hypermutabel gærstamme følger.

En isoleret gærcelle kan opnås ud fra en gærkultur ved kemisk selektion af stammer under anvendelse af antibiotisk selektion af en ekspressionsvektor. Hvis gærcellen er afledt af en enkeltcelle, defineres den som en klon. Teknikker til enkeltcellekloning af mikroorganismer, såsom gær, er velkendte inden for teknikken.

Et polynukleotid, der koder for en dominant negativ form af et fejlparringsreparationsprotein, kan indføres i genomet af gær eller opformeres på et ekstra-kromosomalt plasmid, såsom 2-mikrometerplasmidet. Selektion af kloner, der indeholder en ekspressionsvektor for fejlparringsreparationsgen, kan opnås ved at udplade celler på syntetisk, komplet medium uden den hensigtsmæssige aminosyre eller andre væsentlige næringsstoffer, som beskrevet (J. C. Schneider og L. Guarente, Methods in Enzymology 194:373, 1991). Gæren kan være en hvilken som helst art, for hvilken egnede teknikker er tilgængelige, til fremstilling af transgene mikroorganismer, såsom, men ikke begrænset til, slægter, herunder Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pi-chia, Hansenuia, Kluyveromyces og andre.

En hvilken som helst fremgangsmåde til fremstilling af transgen gær, hvilken fremgangsmåde er kendt inden for inden for teknikken, kan anvendes. Ifølge én fremgangsmåde til fremstilling af en transgen mikroorganisme indføres polynukleotidet i gæren ved hjælp af én af fremgangsmåderne, der er velkendte for fagmanden. Derefter dyrkes gærkulturen under betingelser, som selekterer for celler, hvor polynukleotidet, der koder for fejlparringsrepara-tionsgenet, enten inkorporeres i værtsgenomet som en stabil enhed eller op-formeres på et selvreplikerende ekstra-kromosomalt plasmid, og proteinet, der kodes af polynukleotidfragmentet, transkriberes og efterfølgende transla-teres til et funktionelt protein i cellen. Nar transgen gær først er manipuleret til at indeholde ekspressionskonstruktionen, opformeres den derefter for at danne og bibeholde en kultur af transgen gær på ubestemt tid. Når en stabil, transgen gærcelle først er blevet tilvejebragt til at udtrykke et defekt fejlparrings (MMR)-protein, kan gæren dyrkes for at danne hidtil ukendte mutationer i ét eller flere målgener af interesse, hvilke målgener er indeholdt i samme gærcelle. Et gen af interesse kan være et hvilket som helst gen, der naturligt er indeholdt i gæren, eller ét gen, der er indført i gærværten ved hjælp af rekombinant DNA-standardteknikker. Målgenerne kan eventuelt være kendte inden selektionen. Én fordel ved at anvende sådanne transgene gærceller til frembringelse af mutationer i iboende eller ekstra-kromosomale gener i gæren er, at det er unødvendigt at eksponere cellerne for mutagen skade, uanset om det er kemisk stof eller stråling, for at frembringe en række vilkårlige genændringer i målgenerne. Dette skyldes den særdeles effektive beskaffenhed og spektret af naturligt forekommende mutationer, som opstår som følge af den ændrede fremgangsmåde for fejlparrings-reparation. Det er imidlertid muligt at forøge spektret og frekvensen af mutationer ved hjælp af samtidig anvendelse af enten kemisk stof og/eller stråling sammen med MMR-defekte celler. Nettovirkningen af kombinationsbehandlingen er en forøgelse i mutationsraten i de genetisk ændrede gærtyper, der er nyttige til at frembringe nye træk. Raten af kombinationsbehandlingen er højere end raten, hvor der kun anvendes MMR-defekte celler eller kun mutagenet med vildtype-MMR-celler. MMR-defekt gær ifølge opfindelsen kan anvendes i genetiske screeninger til den direkte selektion af subklonvarianter, der udviser nye træk med kommercielt ønskelige anvendelser. Dette muliggør, at de langsommelige og tidskrævende trin i genidentifikation, -isolering og -karakterisering undgås.

Mutationer kan påvises ved at undersøge den internt og/eller eksternt mutageniserede gær for ændringer i dens genotype og/eller fænotype. Gener, der frembringer ændrede fænotyper i MMR-defekte mikrobielle celler, kan ses ved hjælp af en hvilken som helst af en række molekylære teknikker, der er velkendte for fagmanden. Gærgenomet kan f.eks. isoleres, og et bibliotek af restriktionsfragmenter af gærgenomet kan klones i en plasmidvektor. Biblioteket kan indføres i en "normal" celle, og cellerne, som udviser den hidtil ukendte fænotype, kan screenes. Et plasmid kan Isoleres fra de normale celler, der udviser den hidtil ukendte fænotype, og genet/generne kan karakteriseres ved DNA-sekvensanalyse. Der kan alternativt anvendes differentiel messenger-RNA-screening, hvori der anvendes driver- og tester-RNA (afledt af henholdsvis vildtype-mutant og hidtil ukendt mutant), efterfulgt af kloning af de differentielle transkripter og karakterisering deraf ved standardfremgangsmåder for molekylærbiologi, hvilke fremgangsmåder er velkendte for fagmanden. Hvis den søgte mutant endvidere kodes af et ekstra-kromosomalt plasmid, kan plasmidet, efter samtidig ekspression af det dominante negative MMR-gen og genet af interesse, og efter fænotypisk selektion, isoleres fra mutante kloner og analyseres ved hjælp af DNA-sekvensanalyse under anvendelse af fremgangsmåder, der er velkendte for fagmanden. Fænotypisk screening for træk i MMR-defekte mutanter kan ske ved hjælp af biokemisk aktivitet og/eller en let observerbar fænotype af det ændrede genprodukt. En mutant fænotype kan også detekteres ved at identificere ændringer i eiektro-foretisk mobilitet, DNA-binding i tilfælde af transkriptionsfaktorer, spektrosko-piske egenskaber, såsom IR, CD, røntgenkrystallografi eller højfelts-NMR-analyse eller andre fysiske eller strukturelle karakteristika af et protein, der er kodet af et mutant gen. Det er også muligt at screene for ændret, hidtil ukendt funktion af et protein in situ i isoleret form eller i modelsystemer. Der kan screenes for ændring af en hvilken som helst egenskab af gæren, hvilken egenskab er forbundet med funktionen af genet af interesse, uanset om genet er kendt inden selektion eller ukendt.

Det er meningen, at de beskrevne fremgangsmåder for screening og selektion skal illustrere potentielle fremgangsmåder til tilvejebringelse af hidtil ukendte mutanter med kommercielt værdifulde træk, men det er ikke meningen, at de skal begrænse de mange mulige måder, hvorpå screening og selektion kan udføres af fagmanden.

Plasmidekspressionsvektorer, som indeholder et fej I parringsreparations (MMR)-geninsert, kan anvendes i kombination med et antal kommercielt tilgængelige, regulatoriske sekvenser til regulering af både det temporale og kvantitative biokemiske ekspressionsniveau af det dominante negative MMR-protein. De regulatoriske sekvenser kan bestå af en promotor, en enhancer eller en promotor/enhancer-kombination og kan indsættes enten opstrøms eller nedstrøms for MMR-genet for at regulere ekspressionsniveauet. De regulatoriske sekvenser kan være en hvilken som helst regulatorisk sekvens, som er velkendt for fagmanden, herunder, men ikke begrænset til, AOX1-, GAP-, GAL1-, GAL10-, PH05- og PGK-promotorer, der er indeholdt i ekstra-kromosomale ekspressionsvektorer med højt eller lavt kopital eller på konstruktioner, som er integreret i genomet via homolog rekombination. Disse typer af regulatoriske systemer er blevet beskrevet i videnskabelige publikationer og er kendte for fagmanden. IMår en mikroorganisme med et hidtil ukendt, ønsket træk af interesse først er dannet, svækkes eller elimineres aktiviteten af den afvigende MMR-aktivitet ønskeligt ved hjælp af en hvilken som helst fremgangsmåde, der er kendt inden for teknikken. Disse fremgangsmåder indbefatter, men er ikke begrænset til, fjernelse af en inducer fra dyrkningsmediet, hvilken inducer er ansvarlig for promotoraktivering, fjernelse af et plasmid fra en transformeret gærcelle og tilsætning af kemikalier, såsom 5-fluororotsyre, med henblik på et "loop-out" af genet af interesse. I tilfælde af en inducerbart reguleret, dominant negativ MMR-allel vil ekspressionen af det dominante negative MMR-gen blive tændt (induceret) for at danne en population af hypermutable gærceller med nye træk. Ekspression af den dominante negative MMR-allel kan hurtigt slukkes for at rekonstituere en genetisk stabil stamme, som udviser et nyt træk af kommerciel interesse. Den resulterende gærstamme er nu nyttig som en stabil stamme, der kan anvendes til forskellige kommercielle anvendelser, afhængig af den selektionsfremgangsmåde, som den udsættes for.

I tilfælde hvor genetisk defekte fejlparringsreparationsgærtyper [stammer, såsom, men ikke begrænset til: Ml (mutS) og i EC2416 (mutS delta umuDC) og mutL- eller mutY-stammer] anvendes til at aflede nye træk, kan der anvendes transgene konstruktioner, som udtrykker vildtype-fejlparringsreparationsgener, der er tilstrækkelige til at komplementere den genetiske defekt og derfor genoprette fejlparringsreparationsaktivitet af værten efter selektion af træk [Grzesiuk, E. et al. (Mutagenesis 13; 127-132, 1998); Bridges, B.A., et al. (EMBO J. 16:3349-3356, 1997); LeClerc, J.E., Science 15:1208-1211, 1996); Jaworski, A. et at. (Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:11019-11023, 1995)]. Den resulterende gær er genetisk stabil og kan anvendes til forskellige kommercielle anvendelser.

Det er tidligere blevet påvist, at anvendelsen af overekspression af fremmede (eksogene, transgene) fejlparringsreparationsgener fra mennesker og gær, såsom MSH2, MLH1, MLH3, etc., frembringer en dominant negativ mutatorfænotype i gærværter (Shcherbakova, P.V., Hall, M.C., Lewis, M.S., Bennett, S.E., Martin, K.J., Bushel, P.R., Afshari, C.A. og Kunkel, T.A. Mol. Cell Biol. 21(3):940-951; Studamire B, Quach T og Alani E. 1998. Saccharomyces cerevisiae Msh2p and Msh6p ATPase activities are both required during mismatch repair. Mol Cell Biol 18:7590-7601; Alani E, Sokolsky T, Studamire B, Miret JJ og Lahue RS. 1997. Genetic and biochemical analysis of Msh2p-Msh6p: role of ATP hydrolysis and Msh2p-Msh6p subunit interactions in mismatch base pair recognition. Mol Cell Biol 17:2436-2447; Lipkin SM, Wang V, Jacoby R, Banerjee-Basu S, Baxevanis AD, Lynch HT, Elliott RM og Collins FS. 2000. MLH3: a DNA mismatch repair gene associated with mammalian microsatellite instability. Nat Genet 24:27-35). Endvidere har anvendelsen af gærstammer, der udtrykker prokaryote, dominante negative MMR-gener, samt værter, som har genomiske defekter i endogene MMR-proteiner, også tidligere vist sig at resultere i en dominant negativ mutatorfænotype (Evans, E., Sugawara, N., Haber, J.E. og Alani, E. Mol. Cell. 5(5):789-799, 2000; Aronshtam A og Marinus MG. 1996. Dominant negative mutator mutations in the mutL gene of Escherichia coli. Nucleic Adds Res 24:2498-2504; Wu TH og Marinus MG. 1994. Dominant negative mutator mutations in the mutS gene of Escherichia coli. J Bacteriol 176:5393-400; Brosh RM Jr og Matson SW. 1995. Mutations in motif II of Escherichia coli DNA helicase II render the enzyme nonfunctional in both mismatch repair and excision repair with differential effects on the unwinding reaction. J Bacteriol 177:5612-5621). Resultaterne beskrevet heri beskriver imidlertid anvendelsen af MMR-gener, herunder det humane PMSR2-gen (Nicolaides, N.C., Carter, K.C., Shell, B.K., Pa-padopoulos, N., Vogelstein, B. og Kinzler, K.W, 1995. Genomic organization of the human PMS2 gene family. Genomics 30:195-206), det beslægtede PMS134-trunkerede MMR-gen (Nicolaides N.C., Kinzler, K.W. og Vogelstein, B. 1995. Analysis of the 5' region of PMS2 reveals heterogenous transcripts and a novel overlapping gene. Genomics 29:329-334), de vegetabilske fejlpar-ringsreparationsgener (US-patentansøgning S.N. 09/749,601) og de gener, som er homologe med de 134 N-terminale aminosyrer af PMS2-genet, til dannelse af hypermutabel gær. DNA-mutagener kan anvendes sammen med MMR-defekte gærværter til forøgelse af den hypermutable produktion af genetiske ændringer. Dette reducerer endvidere MMR-aktivitet og er nyttigt til dannelse af mikroorganismer med kommercielt relevante træk.

Evnen til at danne hypermutable organismer under anvendelse af dominante negative alleler kan anvendes til at danne innovative gærstammer, som udviser nye træk, der er nyttige til en række anvendelser, herunder, men ikke begrænset til, industrien, til dannelse af nye biokemikalier, til afgiftning af skadelige kemikalier, enten biprodukter af fremstillingsprocesser eller dem, som anvendes som katalysatorer, samt til hjælp i remediering af toksiner, der er til stede i miljøet, herunder, men ikke begrænset til, polychlorbenzener (PCB’er), tungmetaller og andre miljømæssige farer. Hidtil ukendte gærstammer kan selekteres for forøget aktivitet for at frembringe enten øget mængde eller kvalitet af et terapeutisk molekyle med eller uden protein ved hjælp af biotransformation. Biotransformation er den enzymatiske omdannelse af ét kemisk mellemprodukt til det næste mellemprodukt eller produkt i en vej eller et skema ved hjælp af en mikrobe eller et ekstrakt, der er afledt af mikroben, Der er mange eksempler på biotransformation, der anvendes til kommerciel fremstilling af vigtige biologiske og kemiske produkter, herunder penicillin G, erythromycin og clavulansyre, Organismer, som er effektive ved omdannelse af "rå" materialer til advancerede mellemprodukter og/e))er slutprodukter, kan også udføre biotransformation (Berry, A. Trends Biotechnol. 14(7):250-256). Evnen til at regulere DNA-hypermutabilitet i værtsgærstammer under anvendelse af en dominant negativ MMR (som beskrevet ovenfor) muliggør dannelsen af varierende undertyper, som kan selekteres for nye fænotyper af kommerciel interesse, herunder, men ikke begrænset til, organismer som er toksinresistente, som har evnen til nedbryde et toksin in situ, eller som har evnen til at omdanne et molekyle fra et mellemprodukt til enten et bearbejdet mellemprodukt eller et slutprodukt. Andre anvendelser, hvori der anvendes dominante negative MMR-gener til frembringelse af genetisk ændring af gærværter med henblik på opnåelse af nye træk, indbefatter, men er ikke begrænset til, rekombinante produktionsstammer, som frembringer større mængder af et rekombinant polypeptid, samt anvendelsen af ændrede endogene gener, som kemisk kan omdanne eller katalysere nedstrøms-fremstillingsprocesser. En dominant negativ MMR-faenotype, som er regulerbar, kan anvendes til at fremstille en gærstamme med et kommercielt fordelagtigt træk. Under anvendelse af denne fremgangsmåde kan encellede gærceller, der udtrykker en dominant negativ MMR, selekteres direkte for fænotypen af interesse. Når en valgt gær med et specificeret træk først er isoleret, kan den hypermutable aktivitet af den dominante negative MMR-allel slukkes ved hjælp af adskillige fremgangsmåder, der er velkendte for fagmanden. Hvis for eksempel den dominante negative allel udtrykkes af et inducerbart promotorsystem, kan induceren fjernes eller udtømmes. Sådanne systemer indbefatter, men er ikke begrænset til, promotorer, såsom: lactoseinducerbar GALi-GALlO-promotor (M. Johnston og R.W. Davis, Mol. Cell Biol. 4:1440, 1984); den phosphatinducerbare PH05-promotor (A. Miyanohara, A. Toh-e, C. Nosaki, F. Nosaki, F. Hamada, N. Ohtomo og K. Matsubara. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:1, 1983); alkoholdehydrogenase I (ADH)- og 3- phosphoglyceratkinase (PGKJ-promotorer, som anses for at være konstitutive, men som kan undertrykkes/fremmes, når gærceller dyrkes i ikke-fermenteringsbare carbonkilder, såsom, men ikke begrænset til, lactat (G. Ammerer, Methods in Enzymology 194:192, 1991; J. Mellor, M.J. Dobson, N.A. Roberts, M.F. Tuite, J.S. Emtage, S. White, D.A. Lowe, T. Patel, A.J. Kingsman og S.M. Kingsman, Gene 24:563, 1982); S. Hahn og L. Guarente, Science 240:317, 1988); Alkoholoxidase (AOX), i Pichia pastoris (Tschopp, JF, Brust, Pf, Cregg, JM, Stillman, CA og Gingeras, TR. Nucleic Acids Res. 15(9):3859-76, 1987; og den thiaminrepresserbare ekspressionspromotor nmtl i Schizosaccharomyces pombe (Moreno, MB, Duran, A. og Ribas, JC. Yeast 16(9):861-72, 2000). Gærceller kan omdannes ved hjælp af en hvilken som helst fremgangsmåde, der er kendt for fagmanden, herunder kemisk transformation med LiCI (Mount, R.C., Jordan, B.E. og Hadfield, C. Methods Mol. Biol. 53:139-145,1996) og elektroporering (Thompson, JR, Register, E., Curotto, J., Kurtz, M. og Kelly, R. Yeast 14(6):565-71, 1998). Gærceller, der er blevet omdannet med DNA, kan selekteres for vækst ved hjælp af en række fremgangsmåder, herunder, men ikke begrænset til, selekterbare markører (URA3; Rose, M., Grisafi, P. og Botstein, D. Gene 29:113,1984; LEU2; A. An-dreadis, Y., Hsu, M., Hermodson, G., Kohlhaw og P. Schimmel. J. Biol. Chem. 259:8059, 1984; ARG4; G. Tschumper og J. Carbon. Gene 10:157, 1980; og HIS3; K. Struhl, D.T. Stinchcomb, S., Scherer og R.W. Davis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:1035, 1979), og lægemidler, som inhiberer vækst af gærceller (tunicamycin, TUN; S. Hahn, J., Pinkham, R. Wei, R., Miller og L. Guarente. Mol. Cell Biol. 8:655, 1988). Rekombinant DNA kan indføres i gær, som beskrevet ovenfor, og gærvektorerne kan være indeholdt i gærcellen, enten ekstra-kromosomalt eller integreret i et specifikt locus. Ekstra-kromosomalt baserede gærekspressionsvektorer kan enten være centrome-riske vektorer med højt kopital (såsom 2-pm-vektoren Yepl3; A.B. Rose og J.R. Broach, Methods in Enzymology 185:234, 1991), centromeriske vektorer med lavt kopital, hvilke vektorer indeholder autonomt replikerende sekvenser (ARS), såsom YRp7 (M. Fitzgerald-Hayes, L. Clarke og J. Carbon, Cell 29:235, 1982), samt integrationsvektorer, der muliggør, at genet af interesse indføres i et specificeret locus i værtsgenomet og opformeres på en stabil måde (R.J. Rothstein, Methods in Enzymology 101:202, 1991). Ektopisk ekspression af MMR-gener i gær kan svækkes eller elimineres fuldstændigt, efter ønske, ved hjælp af en række fremgangsmåder, herunder, men ikke begrænset til, fjernelse af den specifikke kemiske inducer fra mediet (f.eks. udtømt galactose, som driver ekspression af GALlO-promotoren i Saccharomyces cerevisiae, eller methanol, som driver ekspression af AOX1-promotoren i Pichia pastoris), ekstra-kromosomalt replikerende plasmider kan "få fjernet" ekspres-sionsplasmid ved hjælp af cellevækst under ikke-selektive betingelser (f.eks. kan YEpl3-holdige celler opformeres i nærvær af leucin), og celler, som har gener indsat i genomet, kan dyrkes med kemikalier, der tvinger det indsatte locus til et "loop-out" (f.eks. kan integranter med URA3 selekteres for tab af det indsatte gen ved vækst af integranter på 5-fluororotsyre) (J.D. Boeke, F. LaCroute og G.R. Fink. Mol. Gen. Genet. 197:345-346, 1984). Fjernelse af MMR-ekspression resulterer i retablering af en genetisk stabil gærcellelinje, uanset om det sker ved fjernelse af inducer eller behandling af gærceller med kemikalier. Derefter muliggør manglen på mutant MMR, at den endogene, vildtype-MMR-aktivitet i værtscellen fungerer normalt og reparerer DNA. De nyligt dannede, mutante gærstammer, som udviser hidtil ukendte, valgte træk, er egnede til en lang række kommercielle fremgangsmåder eller til gen/protein-opdagelse til at identificere nye biomolekyler, som er involveret i dannelsen af et særligt træk, Selvom det er blevet beskrevet, at MMR-defekt kan føre til så meget som en 1000-gange stigning i en værts endogene DNA-mutationsrate, er det ikke sikkert, at MMR-defekten alene vil være tilstrækkelig til at ændre hvert gen i værtsbakteriens DNA til at danne ændrede biokemikalier med nye aktiviteter. Anvendelsen af kemiske mutagener og deres respektive analoger, såsom ethidiumbromid, EMS, MNNG, MNU, tamoxifen, 8-hydroxyguanin samt andre, såsom dem beskrevet i: Khromov-Borisov, N.N., et al. (Mutat. Res. 430:55-74, 1999); Ohe, T., et al. (Mutat. Res. 429:189-199, 1999); Hour, T.C., et al. (Food Chem. Toxicol. 37:569-579, 1999); Hrelia, P., et al. (Chem. Biol. Interact. 118:99-111, 1999); Garganta, F., et al. (Environ. Mol. Mutagen. 33:75-85, 1999); Ukawa-Ishikawa S., et al. (Mutat. Res. 412:99-107, 1998); www.ehs.utah.edu/ohh/mutaaens. etc., kan derfor anvendes til at forøge spektret af mutationer yderligere og øge sandsynligheden for at opnå ændringer i ét eller flere gener, som igen kan danne værtsgær med ét eller flere ønskede nye træk. Fejlparringsreparationsdefek-ter fører til værter med en forøget resistens over for toksicitet af kemikalier med DNA-skadelig aktivitet. Dette træk muliggør dannelsen af yderligere genetisk forskelligartede værter, når fejlparringsdefekte gærtyper eksponeres for sådanne midler, hvilket ellers ville være umuligt på grund af de toksiske virkninger af sådanne kemiske mutagener [Colella, G., et al. (Br. J. Cancer 80:338-343, 1999); Moreland, N.J., et al. (Cancer Res. 59:2102-2106, 1999); Humbert, O., et al. (Carcinogenesis 20:205-214, 1999); Glaab, W.E., et al. (Mutat. Res. 398:197-207, 1998)]. Desuden er fejlparringsreparation ansvarlig for reparation af kemisk inducerede DNA-addukter, og derfor kunne blokering af denne fremgangsmåde teoretisk øge antallet, typerne, mutationsraten og de genomiske ændringer af en gær [Rasmussen, L.J. et al. (Carcinogenesis 17:2085-2088, 1996); Sledziewska-Gojska, E., et al. (Mutat. Res. 383:31-37, 1997) og Janion, C. et al. (Mutat. Res. 210:15-22, 1989)]. Ud over kemikalierne anført ovenfor kan andre typer af DNA-mutagener, herunder ioniserende stråling og UV-bestråling, hvilke DNA-mutagener er kendt for at forårsage DNA-mutagenese i gær, også anvendes til potentielt at forbedre denne fremgangsmåde (Lee CC, Lin HK, Lin JK. 1994. A reverse mutagenicity assay for alkylating agents based on a point mutation in the beta-lactamase gene at the active site serine codon. Mutagenesis 9:401-405; Vidal A, Abril N, Pueyo C. 1995. DNA repair by Ogt alkyltransferase influences EMS mutational specificity. Carcinogenesis 16:817-821). Disse midler, som er ekstremt toksiske over for værtsceller og derfor resulterer i en reduktion i den faktiske pool-størrelse af ændrede gærceller, er mere tolererede i MMR-defekte værter og tillader igen et beriget spektrum og en beriget grad af genomisk mutagenese. Beskrivelsen ovenfor beskriver i almindelighed den foreliggende opfindelse. En mere fuld forståelse kan opnås ved henvisning til følgende specifikke eksempler, som udelukkende er til illustration og ikke har til hensigt at begrænse opfindelsens omfang.

EKSEMPLER

Eksempel 1: Dannelse af inducerbare MMR-dominante negative allelvektorer og gærceller, der indeholder ekspressionsvektorerne

Gærekspressionskonstrukter blev fremstillet for at bestemme, hvorvidt det humane PMS2-beslægtede gen (hPMSR2) (Nicolaides et al. Genomics 30(2):195-206) og det humane PMS134-gen (Nicolaides NC, Littman SJ, Modrich P, Kinzler KW og Vogelstein B. 1998. A naturally occurring hPMS2 mutation can confer a dominant negative mutator phenotype. Mol Cell Biol 18:1635-1641) kan inaktivere gær-MMR-aktiviteten og derved forøge den samlede frekvens af genomisk hypermutation, hvilket resulterer i dannelsen af varierende datterceller med hidtil ukendte træk efter værtsselektion. Til disse undersøgelser blev et plasmid, der koder for hPMS134-cDNA'et, ændret ved polymerasekædereaktion (PCR). 5'-oligonukleotidet har følgende struktur: 5'-ACG CAT ATG GAG CGA GCT GAG AGC TCG AGT-3', som indbefatter Ndel-restriktionsstedet CAT ATG. 3'-oligonukleotidet har følgende struktur: 5'-GAA TTC TTA TCA CGT AGA ATC GAG ACC GAG GAG AGG GTT AGG GAT AGG CTT ACC AGT TCC AAC CTT CGC CGA TGC-3', som indbefatter et EcoRI-sted GAA TTC og epitopen med 14 aminosyrer for V5-antistoffet. Oligonukleotiderne biev anvendt tit PCR under standardbetingelser, der indbefattede 25 cyklusser af PCR (95 °C i 1 minut, 55 °C i 1 minut, 72 °C i 1,5 minutter til 25 cyklusser, efterfulgt af 3 minutter ved 72 °C). PCR-fragmentet blev oprenset ved gete-lektroforese og klonet i pTA2.1 (Invitrogen) ved standardfremgangsmåder for kloning (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tredje udgave, 2001), hvilket dannede plasmidet pTA2.1-hPMS134. pTA2.1-hPMSl34 blev spaltet med restriktionsenzymet EcoRI for at frigive insertet, som blev klonet i EcoRI-restriktionsstedet af pPIC3.5K (Invitrogen). Den følgende strategi, som ligner den, der er beskrevet ovenfor for kloning af humant PMS134, blev anvendt til fremstilling af en ekspressionsvektor for det humant beslægtede gen PMSR2. Først blev hPMSR2-fragmentet amplificeret ved hjælp af PCR for at indføre to restriktionssteder, et Ndel-restriktionssted på 5'-enden og et EcoRI-sted på 3'-enden af fragmentet. 5’-oligonukleotidet, der blev anvendt til PCR, har følgende struktur: 5‘-ACG CAT ATG TGT CCT TGG CGG CCT AGA-3', der indbefatter Ndel-restriktlonsstedet CAT ATG. 3'-oligonukleotidet, der blev anvendt til PCR, har følgende struktur: 5'-GAA TTC TTA TTA CGT AGA ATC GAG ACC GAG GAG AGG GTT AGG GAT AGG CTT ACC CAT GTG TGA TGT TTC AGA GCT-3’, der indbefatter et EcoRI-sted GAA TTC og V5-epitopen for at muliggøre detektion af antistof, Plasmidet, der indeholdt humant PMSR3 i pBluescript SK (Nicolaides et al. Genomics 30 (2):195-206, 1995), blev anvendt som PCR-målet med de hPMS2-specifikke oligonukleotider ovenfor. Efter 25 cyklusser af PCR (95 °C i 1 minut, 55 °C i 1 minut og 72 °C i 1,5 minutter til 25 cyclusser, efterfulgt af 3 minutter ved 72 °C) blev PCR-fragmentet oprenset ved hjælp af gelelektroforese og klonet i pTA2.1 (In-vitrogen) ved standardfremgangsmåder for kloning (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tredje udgave, 2001), hvilket dannede plasmidet pTA2.1-hR2. pTA2.1-hR2 blev derefter spaltet med restriktionsenzymet EcoRI for at frigive insertet (der er to EcoRI-restriktionssteder i det multiple kloningssted af pTA2.1, der flankerer insertet) og indført i gærekspressionsvektoren pPIC3,5K (Invitrogen).

Pichia pastoris-gærceller blev omdannet med pPIC3.5K-vektor, pPIC3.5K-pmsl34 og pPIC3.5K-hR2 som følger. Først blev 5 ml YPD-medium (1 % gærekstrakt, 2 % bactopepton og 1 % dextrose) inokuleret med en enkelt koloni fra en YPD-plade (samme som ved YPD-væsken, men der var tilsat 2 % difco-agar til pladen) og inkuberet under omrystning natten over ved 30 °C. Overnatskulturen blev derefter anvendt til at inokulere 500 ml YPD-medium (200 ul overnatskultur), og kulturen blev inkuberet ved 30 °C, indtil den optiske densitet på 600 nm nåede 1,3 til 1,5. Cellerne blev derefter bundfældet ved centrifugering (4000 x g i 10 minutter) og derefter vasket 2 gange i sterilt vand (én volumen hver gang), hvorefter cellerne blev suspenderet i 20 ml 1M sorbitol. Sorbitol/cellesuspensionen blev bundfældet ved centrifugering (4.000 x g i 10 minutter) og suspenderet i 1 ml 1M sorbitol. 80 ul af cellesuspensionen blev blandet med 5 til 10 ug lineariseret plasmid-DNA og anbragt i en kuvette på 0,2 cm, pulslængde 5 til 10 millisekunder ved feltstyrke på 7.500 V/cm. Derefter blev cellerne fortyndet i 1 ml af 1M sorbitol og overført til et rør på 15 ml og inkuberet ved 30 °C i 1 til 2 timer uden omrysning.

Derefter blev cellerne bundfældet ved centrifugering (4.000 x g i 10 minutter) og suspenderet i 100 ul sterilt vand, og 50 ul/plade blev spredt ud på den hensigtsmæssige, selektive dyrkningsplade. Pladerne blev inkuberet i 2 til 3 dage ved 30 °C, og kolonier blev lagt ud på YPD-plader til yderligere undersøgelse.

Eksempel 2: Dannelse af hypermutabel gær med inducerbare dominante negative alleler af fejlparringsreparationsgener Gærkloner, der udtrykker human PMS2-homolog PMS-R2 eller tom vektor, blev dyrket i flydende BMG (lOOmM kaliumphosphat, pH 6,0, 1,34 % YNB (gærnitrogenbase), 4 x 10'5 % biotin og 1 % glycerol)-kultur i 24 timer ved 30 °C. Den næste dag blev kulturerne fortyndet 1:100 i MM-medium (1,34 % YNB, 4 x 10'5% biotin og 0,5 % methanol) og inkuberet ved 30 °C under omrystning. Celler blev fjernet til mutantselektion 24 og 48 timer efter induktion af methanol, som beskrevet nedenfor (se eksempel 3). EKSEMPEL 3: Dominante negative MMR-gener kan frembringe nye genetiske varianter og kommercielt levedygtige træk i gær.

Evnen til at udtrykke MMR-gener i gær, som beskrevet i eksempie 2, viser evnen til at danne genetiske ændringer og nye fænotyper i gær, der udtrykker dominante negative MMR-gener. I dette eksempel beskrives anvendeligheden af denne fremgangsmåde til dannelse af eukaryote stammer med kommercielt relevante træk.

DANNELSE AF URACIL-AFHÆNGIG GÆRSTAMME Ét eksempel på anvendelighed er dannelsen af en gærstamme, som er mutant for et specifikt metabolisk produkt, såsom en aminosyre eller et nu-kleotid. Fremstilling af en sådan gærstamme vil muliggøre rekombinant manipulation af gærstammen til indføringen af gener til skalérbare fremgangsmåde til rekombinant fremstilling. For at påvise, at MMR kan manipuleres i gær for at danne mutanter uden evnen til at frembringe specifikke molekylære byggeklodser, blev det følgende forsøg udført. Gærceller, som udtrykker en methanolinducerbar human PMS2-homolog, hPMS2-R2 (som beskrevet i eksempel 1 ovenfor), blev dyrket i BMY-medium natten over, derefter fortyndet 1:100 og overført til MM-medium, hvilket resulterede i aktivering af AOX-promotoren og frembringelse af hPMS2-R2-MMR-genet, der er iboende i gærcellen. Kontrolceller blev behandlet på samme måde; disse celler indeholder pPJC3.5-vektoren i gær og mangler et insert. Celler blev induceret i 24 og 48 timer og derefter selekteret for uracilkrævende mutationer som følger. Cellerne blev udpladet på 5-FOA-medium (Boeke, J.D., LaCroute, F. og Fink, G.R. Mol. Gen. Genet. 197:345-345, 1984). Pladerne fremstilles på følgende måde: (2 x koncentrat (filtersteriliseres): gærnitrogenbase 7 gram; 5-fluororotsyre 1 gram; uracil 50 milligram; glucose 20 gram og vand til 500 ml tilsættes til 500 ml 4 % agar (autoklaveret) og hældes på pladerne. Celler udplades på 5-FOA-plader (efter 0, 24 og 48 timer) og inkuberes ved 30 °C i mellem 3 og 5 dage. Data fra et typisk forsøg er vist i tabel 1. Der blev ikke observeret nogle uracilkrævende kloner i den ikke-inducerede eller inducerede kultur i gærceller, der indeholder den "tomme" vektor, hvorimod de celler, der indeholder MMR-genet, hPMS2-R2, har kloner, som kan vokse på selektionsmediet. Bemærk at den ikke-inducerede kultur af hPMS2-R2 ikke har nogle kolonier, som er resistente over for 5-FOA, hvilket viser, at genet skal induceres, for at den hidtil ukendte fænotype kan dannes. Det er blevet påvist, at mutagenerne (såsom ethylmethylsulfonat) resulterer i et lavt antal af ura'-mutanter, og at den spontane mutationsrate til dannelse af denne klasse af mutanter er lav (Boeke, J.D., LaCroute, F. og Fink, G.R. Mol. Gen, Genet. 197:345-346, 1984).

Tabel 1: Dannelse af uracilkrævende mutante Pichia pastoris-gærceller. # betegner 24-timers methanolinduktion og @ 48-timers induktion. Til sammenligning er vist en behandlet/ubehandlet vildtype-gærcelle, (Galli, A. og Schiestl, R.H. Mutat. Res. 429(1):13-26, 1999).

DANNELSE AF VARMERESISTENTE PRODUCENTSTAMMER Ét eksempel pi kommerciel anvendelighed er dannelsen af varmeresi-stente, rekombinante proteinproducentstammer. I den skalérbare fremgangsmåde til rekombinant fremstilling resulterer fermentering i stor skala af både prokaryoter og eukaryoter i dannelsen af meget kraftig varme i kulturen. Denne varme skal spredes ved hjælp af fysiske midler, såsom under anvendelse af kølekapper, der omgiver kulturen, mens den aktivt vokser og frembringer produkt. Frembringelse af en gærcelle, der effektivt kan modstå høj temperaturstigning, ville være fordelagtig til fremgangsmåder til rekombinant fremstilling i stor skala. Til dette formål kan gærstammen, som beskrevet i eksempel 2, dyrkes i nærvær af methanol for at inducere det dominante negative MMR-gen, og cellerne, som dyrkes i forskellige tidsperioder (f.eks. 12, 24, 36 og 48 timer), anbringes derefter i plader og inkuberes ved forhøjede temperaturer for at selektere for mutanter, der modstår høj temperaturstigning (f.eks. 37 °C eller 42 °C). Disse stammer ville være nyttige til fermenteringsudvikling og "opskalering" af fremgangsmåder og skulle resulterer i et fald i fremstillingsomkostninger, da der mindre ofte vil være behov for at køle fermenteringen.

DANNELSE AF HØJE. REKOMBINANTE PROTEINPROPUCENT-STAMMER OG STAMMER MED MINDRE ENDOGEN PROTEASEAKTIVITET Gær er en værdifuld organisme til rekombinant fremstilling, da den er en encellet organisme, der er billig at dyrke og let egner sig til fermentering i skala. Mange eukaryote proteiner, som ikke kan folde effektivt, når de udtrykkes i Escherichia coil· syste mer, folder desuden med den rette konforma-tion i gær og er strukturelt identiske med deres modstykker fra pattedyr. Der er adskillige iboende begrænsninger ved mange proteiner, der udtrykkes i gær, herunder over- og/eller uhensigtsmæssig glycosylation af det rekombinante protein, proteolyse af endogene gærenzymer og utilstrækkelig sekretion af rekombinant protein fra det indre af gærcellen til mediet (som letter oprensning). Til dannelse af gærceller med evnen til at oversecernere proteiner eller med mindre endogen proteaseaktivitet og/eller mindre hyperglycosyla-tionsaktivitet kan gærceller, som beskrevet i eksempel 1, dyrkes med methanol i 12, 24, 36 og 48 timer, og gærceller kan selekteres for evnen til at oversecernere proteinet af interesse, underglycosylere det eller en celle med svækket eller ingen proteaseaktivitet. En sådan stamme vil være nyttig til rekombinant fremstilling eller andre kommercielle formål og kan kombineres med den varmeresistente stamme anført ovenfor.

For eksempel ville resultatet være en mutant gærcelle, der er resistent over for høj temperaturstigning og som kan udskille store mængder af protein i mediet.

Lignende resultater blev observeret med andre dominante negative mutanter, såsom PMSR2, PMSR3 og de humane MLHl-proteiner. EKSEMPEL 4: Mutationer dannet i værtsgenomet af gær ved defekt MMR er genetisk stabile

Som beskrevet i eksempel 3 resulterer manipulation af MMR-vejen i gær i ændringer i værtsgenomet og evnen til at selektere for et hidtil ukendt træk, f.eks. en gærcelles evne til at kræve et specifikt næringsstof. Det er vigtigt, at mutationerne indført af MMR-vejen er genetisk stabile og overføres til datterceller på en reproducerbar måde, når først vildtype-MMR-vejen er retableret. For at bestemme den genetiske stabilitet af mutationer indført i gærgenomet blev følgende forsøg udført. Fem uafhængige kolonier fra pPIC3.5K-hPMS2-R2, som er ura', fem vildtype-kontrolceller (URA+) og fem pPIC3.5K-omdannede celler ("tom vektor") blev dyrket natten over fra en isoleret koloni i 5 ml YPD (1 % gærekstrakt, 2 % bactopepton og 1 % dextrose) ved 30 °C under omrystning. YPD-mediet indeholder alle de næringsstoffer, der er nødvendige for at få gær til vokse, herunder uracil. 1 μΙ af overnatskulturen, som var ved en optisk densitet (OD), som målt ved 600nM til >3,0, blev derefter fortyndet til en OD6oo på 0,01 i YPD, og kulturen blev inkuberet under omrystning ved 30 °C i yderligere 24 timer. Denne fremgangsmåde blev gentaget endnu 3 gange i 5 overnatsinkubationer i alt. Dette er det ækvivalente af mere end 100 fordoblingsgenerationer (fra den første koloni på pladen til slutningen af den sidste overnatsinkubation). Celler (fem uafhængige kolonier, som var ura', og fem, som var vildtype) blev derefter udpladet på YPD-plader ved en celledensitet på 300 til 1.000 celler/plade og inkuberet i to dage ved 30 °C. Cellerne fra disse plader blev udpladet flere gange på de følgende plader og bedømt for vækst efter tre dages inkubation ved 30 °C; Synthetic Complete (SC) (Syntetisk Komplet) SC-ura (1,34 % gærnitrogenbase og ammoniumsulfat; 4 x 10'5 % biotin; suppleret med alle aminosyrer, ingen supplerende uracil; 2 % dextrose og 2 % agar); SC+URA (samme som SC-ura, men med supplerende plade med 50 mg uracil/liter medium) og YPD-plader. De blev udpla- det flere gange i følgende rækkefølge - SC-ura, SC-komplet og YPD. Hvis det hidtil ukendte træk, som er iboende i gærgenomet, som blev dannet ved ekspression af den mutante MMR (i dette eksempel den humane homolog af PMS2, hPMS2-R2), er ustabilt, bør de uracil-afhængige celler "falde tilbage til" en uracil-uafhængig fænotype. Hvis fænotypen er stabil, bør vækst af de mutante celler under ikke-selektive betingelser resultere i gærceller, som bibeholder deres levedygtighedsafhængighed af eksogen supplering med uracil, Som det kan ses i dataene angivet i tabel 2, er den uracil-afhængige fænotype stabil, når gærcellerne dyrkes under ikke-selektive betingelser, hvilket viser, at den MMR-dannede fænotype afledt af mutation i én af de biosyntetiske uracilreaktionsvejgener er genetisk stabil.

Disse data viser anvendeligheden af at anvende et inducerbart ekspressionssystem og et dominant negativt MMR-gen i et eukaryot system for at danne genetisk ændrede stammer. Stammen udviklet i dette eksempel, en gærstamme, der nu kræver tilsætning af uracil for vækst, er potentielt nyttig som en stamme til rekombinant fremstilling; ved at konstruere en ekspressionsvektor, som indeholder vildtype-URA3-genet, på enten et integra-tionsplasmid eller en ekstra-kromosoma I vektor, er det nu muligt at omdanne og danne hidtil ukendte celler, der udtrykker proteinet af interesse. Det er også muligt at modificere andre iboende gener i gærceller og selektere for mutationer i gener, hvilke mutationer tilvejebringer andre nyttige fænotyper, såsom evnen til at udføre en hidtil ukendt biotransformation. Det er endvidere muligt at udtrykke et gen ekstra-kromosomalt i en gærcelle, der har ændret MMR-aktivitet, som beskrevet ovenfor, og selektere for mutationer i det ekstra-kromosomale gen. På en måde, som ligner den beskrevet ovenfor, kan den mutante gærcelle derfor anbringes under specifikt selektivt tryk, og et hidtil ukendt protein med kommercielt vigtige biokemiske træk kan selekteres. Disse eksempler er kun ment som illustrationer og ikke som begrænsnin ger af omfanget af den foreliggende opfindelse. Endelig, som beskrevet ovenfor, svækkes eller elimineres MMR-aktiviteten fuldstændigt, når en mutation først er blevet indført i genet af interesse. Resultatet er en gærcelle, der indeholder en stabil mutation i målgenerne af interesse. EKSEMPEL 5: Forøget dannelse af MMR-defekt gær og kemiske mutagener til dannelsen af nye træk

Det er tidligere blevet dokumenteret, at MMR-defekt giver forøget mutationsfrekvens og forøget resistens over for toksiske virkninger af kemiske mutagener (CM) og deres respektive analoger, såsom, men ikke begrænset til: ethidiumbromid, EMS, MNNG, MNU, tamoxifen, 8-hydroxyguanin og andre angivet i, men ikke begrænset til, publikationer af: Khromov-Borisov, N.N., et al. Mutat. Res. 430:55-74, 1999; Ohe, T., et al. (Mutat. Res. 429:189-199, 1999; Hour, T.C. et al. Food Chem. Toxicol. 37:569-579, 1999; Hrelia, P., et al. Chem. Biol. Interact. 118:99-111, 1999; Garganta, F., et al. Environ. Mol. Mutagen. 33:75-85, 1999; Ukawa-Ishikawa S., et al. Mutat. Res. 412:99-107, 1998; www.ehs.utah.edu/ohh/mutaqens: Marcelino LA, Andre PC, Khrapko K, Colier HA, Griffith J og Thilly WG. Chemically induced mutations in mitochondrial DNA of human cells: mutational spectrum of N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine. Cancer Res. 1998 Jul l;58(13):2857-62; Koi M, Umar A, Chauhan DP, Cherian SP, Carethers JM, Kunkel TA og Boland CR. Human chromosome 3 corrects mismatch repair deficiency and microsatellite instability and reduces N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine tolerance in colon tumor cells with homozygous hMLHl mutation. Can res 1994 54:4308-4312, 1994. Fejlparringsreparation fremkalder kromosomafvigelser i hamsterceller behandlet med methyleringsmidler eller 6-thioguanin, men ikke med ethyle-ringsmidler. For at vise CM'ers evne til at forøge mutationsfrekvensen i MMR-defekte gærceller blev det forudsagt, at eksponering af gærceller for CM'er i nærvær eller fravær af methanol (som inducerer ekspressionen af den iboende humane homolog til PMS2, hPMS2-R2) ville resultere i en forøgelse af mutationer i gærcellen. Gærceller, som udtrykker hPMS2-R2 (induceret eller ikke-induceret), og tomme vektorkontrolceller dyrkes (som beskrevet i eksempel 2 og 3) i 24 timer og fortyndes i MM-medium, som beskrevet ovenfor. Cellerne i MM inkuberes derefter enten med eller uden stigende mængder af ethylmethan-sulfonat (EMS) fra 0, 1, 10, 50, 100 og 200μΜ. Aliquoter af 10 μΙ af kultur (fortyndet i 300 μΙ MM) inkuberes i 30 minutter, 60 minutter og 120 minutter, efterfulgt af udpladning af celler på 5-FOA-plader, som beskrevet i eksempel 3 ovenfor. Mutanter selekteres og bedømmes som ovenfor. Det forudsiges, at der vil være en stigning i frekvensen af ura'-mutanter i PMS2-R2~kulturerne, som induceres med methanol, i sammenligning med den ikke-inducerede udgangs- eller vildtype-stamme. I en yderligere udvidelse af dette eksempel vil humane PMS2-R2-holdige celler blive induceret i 24 og 48 timer og derefter mutageniseret med EMS, Dette vil muliggøre, at MMR-genet bliver fuldstændigt aktivt og udtrykt ved høje niveauer, hvilket resulterer i en stigning i antallet af opnåede ura'-mutanter. Det forudsiges, at der ikke vil være nogen ændring i antallet af ura'-mutanter opnået i den ikke-inducerede udgangskontrol eller i vildtype-"tom vektor"-cellerne.

Dette eksempel viser anvendeligheden af at anvende et reguleret dominant negativt MMR-system plus kemiske mutagener til frembringelse af forøgede antal af genetisk ændrede gærstammer, som kan selekteres for nye træk. Denne fremgangsmåde er nyttig til at danne sådanne organismer til kommercielle anvendelser, såsom, men ikke begrænset til, rekombinant fremstilling, biotransformation og ændrede biokemikalier med forøgede aktiviteter. Den er også nyttig til at opnå ændringer af proteinaktivitet fra ektopisk udtrykte proteiner indeholdt på ekstra-kromosomale ekspressionsvektorer, der ligner dem beskrevet i eksempel 4 ovenfor. EKSEMPEL 6: Alternative fremgangsmåder til inhibering af gær-MMR-aktivitet

Inhiberingen af MMR-aktivitet i en værtsorganisme kan opnås ved indføring af en dominant negativ allel, som vist i eksemplerne ovenfor. Denne ansøgning beskriver også anvendeligheden af at anvende regulerede systemer til at regulere MMR i gær for at frembringe genetisk diversitet og træk til kommercielle anvendelser. Yderligere fremgangsmåder til at regulere suppressionen af en værts MMR-aktivitet er ved anvendelse af genetisk rekombination for at slå alleler af et MMR-gen i cellen af interesse ud. Dette kan opnås under anvendelse af homolog rekombination, som afbryder det endogene MMR-gen; 2) blokering af MMR-proteindimerisering med andre underenheder (hvilken proteindimerisering er nødvendig for aktivitet) ved at indføre polypeptider eller antistoffer i værten via fremgangsmåder til transfektion, hvilke fremgangsmåder anvendes rutinemæssigt af fagmanden (f.eks. elektroporering), eller 3) forøgelse af ekspressionen af et MMR-gen under anvendelse af anti-sense-oligonukleotider. MMR-qen-knockouts. Det er hensigten at frembringe afbrudte målret-tende vektorer af et særligt MMR-gen og indføre det i gærgenomet under anvendelse af standardfremgangsmåder inden for teknikken. Gær, der udviser hypermutabilitet, vil være nyttig til at frembringe genetisk forskelligartet afkom til kommercielle anvendelser. Det vil blive bekræftet, at gær har mistet ekspressionen af MMR-genet under anvendelse af northern-standandteknikker og biokemiske standardteknikker (som beskrevet i reference 31). MMR-genloci kan slås ud, stammer kan selekteres for nye træk, og MMR kan gendannes ved at indføre et vildtype-MMR-gen til at supplere KO-locuset. Andre strategier indbefatter anvendelse af KO-vektorer, som kan målrette et MMR-genlocuset, selekterere for værtstræk og derefter få KO-vektoren "splejset" fra genomet efter stammedannelse.

Blokerende peptider. MMR-underenheder (MutS- og MutL-proteiner) in-teragerer for at danne aktive MMR-komplekser. Peptider er i stand til specifikt at inhibere bindingen af to proteiner ved hjælp af kompetitiv inhibering. Indføring af peptider eller antistoffer i celler til konserverede domæner af et særligt MMR-gen for at afbryde aktivitet er simpelt for fagmanden. Gær vil blive kontrolleret for tab af ekspression af MMR-aktiviteten ved northern-standardteknikker og/eller biokemiske standardteknikker (som beskrevet i Ni-colaides NC, Littman SJ, Modrich P, Ktnzler KW og Vogelstein B. 1998. A naturally occurring hPMS2 mutation can confer a dominant negative mutator phenotype. Mol Cell Biol 18:1635-1641). Gær, der udviser hypermutabilitet, vil være nyttig til frembringelse af genetisk forskelligartet afkom til kommercielle anvendelser.

Diskussion

Resultaterne beskrevet ovenfor vil føre til flere konklusioner. For det første vil ekspression af dominante negative MMR-proteiner resultere i en stigning i mi-krosatellit-ustabilitet og hypermutabilitet i gær. Gærcellens hypermutabilitet skyldes inhiberingen af den iboende, endogene MMR-biokemiske aktivitet i disse værter. Denne fremgangsmåde tilvejebringer et krav om anvendelse af MMR-gener og de produkter, der kodes deraf, til dannelse af hypermutabel gær til frembringelse af nye træk til kommercielle anvendelser.

EKSEMPLER PÅ MMR-GENER OG KODEDE POLYPEPTIDER Gær MLHl-cDNA (deponeringsnummer U07187) 1 aaataggaat gtgataeett ctattgcatg caaagatagt gtaggaggcg ctgctattgc 61 caaagacttt tgagaccgct tgctgtttca ttatagttga ggagttctcg aagacgagaa 121 attagcagtt tccggtgttt agtaatcgeg ctagcatgct aggacaattt aactgcaaaa 181 tCttgatacg atagtgatag taaatggaag gtaaaaataa catagaccta tcaataagca 241 atgtctctca gaataaaagc acttgatgca tcagtggtta acaaaatcgc tgcaggtgag 301 ateataatat cccccgtaaa tgctctcaaa gaaatgatgg agaattccat cgatgcgaat 361 gctacaatga ttgatattct agtcaaggaa ggaggaatta aggtacttca aataacagat 421 aacggatctg gaattaataa agcagaectg ccaatcttat gtgagcgatt cacgacgtec 481 aaattacaaa aatlcgaaga tttgagteag attcaaacgt atggattccg aggagaagct 541 ttagceagta tctcacatgt ggcaagagtc acagtaacga caaaagttaa agaagacaga 601 tgtgcatgga gagtttcata tgcagaaggt aagatgttgg aaagccccaa acctgttgct 661 ggaaaagacg gtaccacgat cctagttgaa gacctttttt tcaatattcc ttctagatta 721 agggccttga ggtcccataa tgatgaatac tctaaaatat tagatgttgt cgggcgatac 7B1 gccattcatt ccaaggacat tggcttttct tgtaaaaagt tcggagactc taattattct B41 ttatcagtta aaccttcata tacagtccag gataggatta ggaqtgtgtt caataaatct 901 gtggcttcga atctaattac ttttcatatc agcaaagtag aagatttaaa cctggaaagc 961 gttgatggaa aggtgtgtaa tttgaatttc atatccaaaa agtccatttc attaattttt 1021 ttcattaata atagactagt gacatgtgat cttctaagaa gagctttgaa cagcgtttac 10B1 tccaattatc tgccaaaggg cttcagacct tttatttatt tgggaattgt tatagatccg 1141 gcggctgttg atgttaacgt tcacccgaca aagagagagg ttcgtttcct gagccaagat 1201 gagatcatag agaaaaccgc caatcaattg cacgccgaat tatctgccat Cgatactcca 1261 cgtactttca aggcttcttc aatttcaaca aacaagccag agtcattgat accatttaat 1321 gacaccatag aaagtgatag gaataggaag agtctccgac aagcccaagC ggtagagaat 13B1 tcatatacga cagccaatag tcaactaagg aaagcgaaaa gacaagagaa taaactagtc 1441 agaatagatg cttcacaagc taaaattacg tcatttttat cctcaagtca acagttcaac 1501 tttgaaggat cgtctacaaa gcgacaactg agtgaaccca aggtaacaaa tgtaagccac 1561 tcccaagagg cagaaaagct gacactaaat gaaagcgaac aaccgcgtga tgccaataca 1621 atcaatgata atgacttgaa ggatcaacct aagaagaaac aaaagttggg ggattataaa 1681 gttccaagca ttgccgatga cgaaaagaat gcactcccga tttcaaaaga cgggtatatt 1741 agagtaccta aggagcgagt taatgttaat cttacgagta tcaagaaatt gcgtgaaaaa 1801 gtagatgatt cgatacatcg agaactaaca gacattCttg caaatCtgaa ttacgttggg 1861 gttgtagatg aggaaagaag attagccgct attcagcatg acttaaagct ttttttaata 1921 gattacggat ctgtgtgcta tgagctattc tatcagattg gtttgacaga cttcgcaaac 19B1 tttggtaaga taaacctaca gagtacaaat gtgtcagatg atatagtttt gtataatctc 2041 ctatcagaat ttgaegagtt aaatgacgat gcttccaaag aaaaaataat tagtaaaata 2101 tgggacatga gcagtatgct aaatgagtac tattccatag aattggtgaa tgatggtcta 2161 gataatgact taaagtctgt gaagctaaaa tctctaccac tocttttaaa aggctacatt 2221 ccatctctgg tcaagttacc attttttata tatcgcctgg gtaaagaagt tgattgggag 2281 gatgaacaag agtgtctaga tggtatttta agagagattg cattactcta tatacctgat 2341 atggttccga aagtcgatac actcgatgca tcgttgtcag aagacgaaaa agcccagttt 2401 ataaatagaa aggaacacat atcctcatta ctagaacacg ttctcttccc ttgtatcaaa 2461 cgaaggttcc tggcccctag acacattctc aaggatgtcg tggaaatagc caaccttcca 2521 gatctataca aagtttttga gaggtgttaa ctttaaaacg ttttggctgt aataccaaag 2581 tctttgttca cttcctgagt gtgattgtgt ttcatttgaa agtgzatgcc cttzcctcta 2641 acgatteatc cgcgagattt caaaggatat gaaatatggt tgcagttagg aaagtatgtc 2701 agaaatgtat attcggattg aaactcttct aatagttctg aagtcacttg gttccgtatt 2761 gttttcgtcc tcttcctcaa gcaacgattc ttgtctaagc ttattcaacg gtaccaaaga 2821 cccgagtccc tttatgagag aaaacatttc atcatttttc aactcaatta tcttaatatc 2881 attttgtagt attttgaaaa caggatggta aaacgaatca cctgaatcta gaagctgtac 2941 cttgtcccat aaaagtttta atttactgag cctttcggtc aagtaaacta gtttatctag 3001 ttttgaaccg aatattgtgg gcagatttgc agtaagttca gttagatcta ctaaaagttg 3061 tttgacagca gccgattcca caaaaatttg gtaaaaggag atgaaagaga cctcgcgcgt 3121 aatggtttgc atcaccatcg gatgtctgtt gaaaaactca ctttttgcat ggaagttatt 3181 aacaataaga ctaatgatta ccttagaata atgtataa Gær-MLH 1-protein (deporteringsnummer U07187)

MSLRIKALDASVVNKIAAGEIII5PVNALKEMMENSIDANATMI DU.VK£GGIKVLQITDNGSGINKADLPILCERfTTSKLQKFEDLSQIQTYGFRGEAlA SISHVARVTVTTKVKEDRCAWRVSYAEGKM1XSPKPVAGKDGTTILVEDLFFNIPSRL RALRSHNDEYSKILDWGRYAIHSKDIGFSCKKFGDSNYSL5VKPSYTVQDRIRTVFN KSVASNLITFHI5KVEDLNLE SVDGKVCNLNFISKKS1S LIFFINNRLVTCDLLRRAL NSvySN YLPKG FRPFIYLGIVIDPAAVDVNVH PTKREVR FLSODEIIEKIANOLHAEL S AI DTS RTFKASS ISTNK PESl·IPFN DTIE S DRN RKSLRQAQVVE NS YTTANSQLRKA KRQENKLVRIDASQAKITSFLSS SQOFNFEGSST KRQLSEPKVTNVSHSQEAEKLTLN ESEQPRPANTINDNDLKDQFKKKQKLGDYKVPSIADDEKNALPISKDGYIRVPKERVN VNLTSIKKLREKVDDSIHRELTDI FANENYVGVVDEERRLAAIQHDLKLFLIDYGSVC yelfyqigltdfanfgkinlqstnvsddivlynllsefdelnodaskeki jtskiwdms

SMLNE Y YSIELVNDGLDN DLKSVKLKSLP LLLKGYIP SLVK LFFFIYRLGKEV DWE DE QECLDGILREIALLYIPDMVPKVDTLDASLSEDEKAQFINRKEHISSLLEHVLFPCIK RRFLAPRHILKDWEIANLPDLYKVFERC

Muse- PMS2 protein MEQTEGVSTE CAKAIKPIDG KSVHQICSGQ VILSLSTAVK ELIENSVDAG RTTIDLRLKD 60 YGVDEIEVSD NGCGVEEENF EGLALKHHTS KIQEFADLTQ VETFGFRGEA LSSLCALSDV 120 TISTCHGSAS VGTRLVFDHN GKITQKTPYP RPKGTTVSVQ HLFYTLPVRY KEFQRNIKKE 180 YSKMVQVLQA YCUSAGVRV SCTNQLGQGK RHAVVCTSGT SGMKENIGSV FGQKQLQSLI 240 FFVQLPPSDA VCEEYGLSTS GRHKTFSTFR ASFHSARTAP GGVQQTGSFS SS1RGPVTQQ 300 RSLSLSMRFY HMYNRHQYPF WLNVSVDSE CVDINVTPDK RQILLQEEKL LLAVLKTSLI 360 GMFDSDANKL NVNQQPLLDV EGNLVKLHTA ELEKPVPGKQ DNSPSLKSTA DEKRVASISR 420 LREAFSLHPT KEIKSRGPET AELTRSFPSE KRGVL3SYPS DVISYRGLRG SQDKLVSPTD 480 SPGDCMDREK IEKDSGLSST SAGSEEEFST PEVASSFSSD YNVSSLEDRP SQETINCGDL 540 DCRFPGTGQS LKPEDHGYQC KALPLARLSP TNAKRFKTEE RPSNVNISQR LPGPQSTSAA 600 EVDVAIKMNK RIVLLEFSLS SLAXRMKQLQ HLKAQNKHEL SYRKFRAKIC PGENQAAEDE 660 LRKEISKSMF AEMEILGQFN LGFIVTKLKE DLFLVDQHAA DEKYNFEMLQ QHTVLQAQRL 720 ITPQTLNLTA VNEAVLIENL EIFRKNGFDF VIDEDAPVTE RAKL1SLPTS KNWTFGPQDI 780 DELIFMLSDS PGVMCRPSRV RQMFASRACR KSVMIGTALN ASEMKKLITH MGEMOHPWNC 840 PHGRPTMRHV ANLOVISQN 859

Muse- PMS2 cDNA gaattccggt gaaggtcctg aagaatttcc agattcctga gtatcattgg aggagacaga 60 taacctgtcg tcaggtaacg atggtgtata tgeaacagaa atgggtgttc ctggagacgc 120 gtcttttccc gagagcggca ccgcaactct cccgcggtga ctgtgactgg aggagtcctg 180 catccatgga gcaaaccgaa ggcgtgagta cagaatgtgc taaggccatc aagcctattg 240 atgggaagtc agtccatcaa atttgttctg ggcaggtgat actcagttta agcaccgctg 300 tgaaggagtt gatagaaaat agtgtagatg ctggtgctac tactattgat ctaaggctta 360 aagactacgg ggtggacctc attgaagttt cagacaatgg atgtggggta gaagaagaaa 420 actttgaagg tctagctctg aaacatcaca catctaagat tcaagagttt gecgacctca 480 cgcaggttga aactttcggc tttcgggggg aagctctgag ctctctgtgt gcactaagtg 540 atgtcactat atctacctgc cacgggtctg caagcgttgg gactcgactg gtgtttgacc 600 ataaCgggaa aatcacccag aaaacteeet acceccgacc taaaggaacc acagtcagtg 660 tgcagcactt attttataca ctacccgtgc gttacaaaga gtttcagagg aacattaaaa 320 aggagtattc caaaatggtg caggtcttac aggcgtactg tatcatctca gcaggcgtcc 380 gtgtaagctg cactaatcag ctcggacagg ggaagcggca cgctgtggtg tgcacaagcg 840 gcacgtctgg catgaaggaa aatatcgggt ctgtgtttgg ccagaagcag ttgcaaagcc 900 tcattccttt tgttcagctg ccccctagtg aegctgtgtg tgaagagtac ggcctgagca 960 cttcaggacg ccacaaaacc ttttctacgt ttcgggcttc atttcacagt gcacgcacgg 1020 cgccgggagg agtgcaacag acaggcagtt tttcttcatc aatcagaggc cctgtgaccc 1080 agcaaaggtc tctaagcttg tcaatgaggt tttatcacat gtataaccgg catcagtacc 1140 catttgtcgt ccttaacgtt tccgttgact cagaatgtgt ggatattaat gtaactccag 1200 ataaaaggca aattctacta caagaagaga agctattgct ggccgtttta aagacctcct 1260 tgataggaat gtttgacagt gatgcaaaca agcttaatgt caaccagcag ccactgctag 1320 atgttgaagg taacttagta aagctgcata ctgcagaact agaaaagcct gtgccaggaa 1380 agcaagataa ctctccttca ctgaagagca cagcagacga gaaaagggta gcatccatct 1440 ccaggctgag agaggccttt tctcttcatc ctactaaaga gatcaagtct aggggtccag 1500 agactgctga actgacacgg agttttccaa gtgagaaaag gggcgtgtta tcctettatc 1560 cttcagacgt catctcttac agaggcctcc gtggctcgca ggacaaattg gtgagtccca 1620 cggacagccc tggtgactgt atggacagag agaaaataga aaaagactca gggctcagca 1680 gcacctcagc tggctctgag gaagagttca gcaccccaga agtggccagt agctttagca Π40 gtgactstaa cgtgagctcc ctagaagaca gaccttetca ggaaaccata aactgtggtg 1800 acctggactg ccgtcctcca ggtacaggac agtccttgaa gccagaagac catggatatc 1860 aatgcaaagc tctacctcta gctcgtctgt cacccacaaa tgccaagcgc ttcaagacag 1920 aggaaagacc ctcaaatgtc aacatttctc aaagattgcc tggtcctcag agcacctcag 1980 cagctgaggt cgatgtagcc ataaaaatga ataagagaat cgtgctcctc gagttctctc 2040 tgagttctct agctaagcga atgaagcagt tacagcacct aaaggcgcag aacaaacatg 2100 aactgagtta cagaaaattt agggccaaga tttgccctgg agaaaaccaa gcagcagaag 2160 atgaactcag aaaagagatt agtaaatcga tgtttgcaga gatggagatc ttgggtcagt 2220 ttaacctggg atttatagta aceaaactga aagaggacct cttcctggtg gaccagcatg 2280 ctgcggatga gaagtacaac tttgagatgc tgcagcagca cacggtgctc caggcgcaga 2340 ggctcatcac accecagact ctgaacttaa ctgctgtcaa tgaagctgta ctgatagaaa 2400 atctggaaat attcagaaag aatggctttg actttgtcat tgatgaggat gctccagtca 2460 ctgaaagggc taaattgatt tccttaccaa ctagtaaaaa ctggaccttt ggaccccaag 2520 atatagatga actgatcttt atgttaagtg acagccctgg ggtcatgtgc cggccctcac 2580 gagtcagaca gatgtttgct tccagagcct gtcggaagtc agtgatgatt ggaacggcgc 2640 tcaatgcgag cgagatgaag aagcteatca cccaeatggg tgagatggac cacccc.tgga 2700 actgccccca cggcaggcca accatgaggc acgttgccaa tctggatgtc atctctcaga 2360 actgacacac cccttgtagc atagagttta ttacagattg ttcggtttgc aaagagaagg 2820 ttttaagtaa tctgattatc gttgtacaaa aattagcaCg ctgctttaat gtactggatc 2880 catttaaaag cagtgttaag gcaggcatga tggagtgttc ctctagctca gctacttggg 2940 tgatccggtg ggagctcatg tgagcccagg actttgagac cactccgagc cacatteatg 3000 agactcaatt caaggacaaa aaaaaaaaga tatttttgaa gccttttaaa aaaaaa 3056 human PMS2 protein MKQLPAATVR LLSSSQIITS VVSWKELIE NSLDAGATSV DVKLENYGFD KlEVRDNGEG 60 IKAVDAPVMA MKYYTSKINS HEDLENLTTY GFRGEALGSI CCIAEVLITT RTAADNFSTQ 120 YVLDGSGHIL sqkpshlgqg ttvtalrlfk nlpvrkqfys TAKKCKDEIK KIQDLLMSFG 180 ILKPDLRIVF VHNKAVIWQK SRVSDHKMAL MSVLGTAVMN NMESFQYRSE ESQIYtSGFL 2-10 PKCDADHSFT SLSTPERSFI FINSRPVHQK DILKLIRHHY NLKCLKESTR LYPVFFLKID 300 VPTADVDVNL tpdksqvllq HKESVLIALE nlmttcygpl pstnsyenhk TDVSAADIVL 360

Sktaetdvlf nkvessgkny snvdtsvipf QNDHHNDESG KNTDDCLNHQ ISIGDFGYGH 420 CSSEISN1DK NTKNAFQDIS MSNVSWENSQ TEYSKTCFIS SVKHTQSENG NKDHIDESGE 480 NEEEAGLENS SEISADEMSR GNILKNSVGE NIEPVKILVP EKSLPCKVSN NNYPIFEQMN 640 LNEDSCNKKS NVIDNKSGKV TAYDLLSNRV IKKPMSASAL FVQDHRPQFL IENPKTSLED 600 ATLQIEELWK TLSEEEKLKY EEKATKDLER YHSQMKRAIE QESQMSLKDG RKKIKPTSAW 660 HLAQKHKLKT SLSNQPKLDE LLQSQIEKRR SQNIKMVQIP FSMKNLKINF KKQNKVDLEE 720 KDEPCLIHNL RFPDAWLHT5 KTEVMLLNPY RVEEALLFKR LLENHKLPAE PLEKP1MLTE 780 5LFNGSHYLD VLYKMTADDQ RYSGSTYLSD PRLTANGFKI KLIPGVSITE NYLEIEGMAN 840 CLPFYGVADL KEILNAIENR NAKEVYECRP RKVISYLEGE AVRLSRQLPM YLSKEDIQDI 900 IYRMKHQFGN E1KECVHGRP FFHHLTYLPE TT 932

Human PMS2 cDNA cgaggcggat cgggtgttgc atccatggag cgagctgaga gctcgagtac agaacctgct 60 aaggccatca aacctattga tcggaagtca gtccatcaga tttgctctgg gcaggtggta 120 ctgagtctaa gcactgcggt aaaggagtta gtagaaaaca gtctggatgc tggtgccact 180 aatattgatc taaagcttaa ggactatgga gtggatctta ttgaagtttc agacaatgga 240 tgtggggtag aagaagaaaa cttcgaaggc ttaactctga aacatcacac atctaagatt 300 caagagtttg ccgacetaac tcaggttgaa acttttggct ttcgggggga agctctgagc 360 tcactttgtg cactgagega tgtcaccatt tctacctgcc acgcatcggc gaaggttgga 420 actcgactga tgtttgatca caatgggaaa attatccaga aaacccccta cccccgcccc 480 agagggacca cagtcagcgt gcagcagtta ttttecacac tacctgtgcg ccataaggaa 540 tttcaaagga atattaagaa ggagtatgcc aaaatggtcc aggtcttaca tgcatactgt 600 atcatttcag caggcatccg tgtaagttgc accaatcagc ttggacaagg aaaacgacag 660 cctgtggtat gcacaggtgg aagccccagc ataaaggaaa atatcggctc tgtgtttggg 720 cagaagcagt tgcaaagcct cattcctttt gttcagctgc cccctagtga ctccgtgtgt 780 gaagagtacg gtttgagctg ttcggatgct ctgcataatc ttttttacat ctcaggtttc 840 atttcacaat gcacgcatgg agtcggaagg agttcaacag acagacagtt tttctttatc 900 aaccggcggc cttgtgaccc agcaaaggtc tgcagactcg tgaatgaggt etaccacatg 960 tataatcgac accagtatcc atttgttgtt cttaacattt ctgttgattc agaatgcgtt 1020 gatatcaatg ttactccaga taaaaggcaa attttgctac aagaggaaaa gcttttgttg 1080 gcagttttaa agacctcttt gataggaatg tttgatagtg atgtcaacaa gctaaatgtc 1140 agtcagcagc cactgctgga tgttgaaggt aacttaataa aaatgcatgc agcggatttg 1200 gaaaagccca tggtagaaaa gcaggatcaa tccccttcat taaggactgg agaagaaaaa 1260 aaagacgtgt ccatttccag actgcgagag gccttttctc ttcgtcacac aacagagaac 1320 aagcctcaca gcccaaagac tccagaacca agaaggagcc ctctaggaca gaaaaggggt 1380 atgctgtctt ctagcacttc aggtgccatc tcCgacaaag gcgtcctgag acctcagaaa 1440 gaggcagtga gttccagtca cggacccagt gaccctacgg acagagcgga ggtggagaag 1500 gactcggggc acggcagcac ttccgtggat tctgaggggt tcagcatccc agacacgggc 1560 agtcaetgca gcagcgagta tgcggccagc tccccagggg acaggggctc gcaggaacat 1620 gtggactctc aggagaaagc gcctgaaact gacgactctt tttcagatgt ggactgccat 1680 tcaaaccagg aagataccgg atgtaaattt cgagttttgc ctcagccaac taatctcgca 1740 accccaaaca caaagcgttt taaaaaagaa gaaattcttt ccagttctga catttgtcaa 1800 aagttagtaa atactcagga catgtcagcc tctcaggttg atgtagctgt gaaaattaat 1860 aagaaagttg tgcccctgga cttttctatg agttctttag ctaaacgaat aaagcagtta 1920 catcatgaag cacagcaaag tgaaggggaa cagaattaca ggaagtttag ggcaaagatt 1980 tgtcctggag aaaatcaagc agccgaagat gaactaagaa aagagataag taaaacgatg 2040 tttgcagaaa tggaaatcat tggtcagttt aacctgggat ttataataac caaactgaat 2100 gaggatatct tcatagtgga ccagcatgcc acggacgaga agtacaactt cgagatgctg 2160 cagcagcaca ccgtgctcca ggggcagagg ctcatagcac ctcagactct caacttaact 2220 gctgttaatg aagctgttet gatagaaaat ctggaaatat ttagaaagaa tggctttgat 2280 tttgttatcg atgaaaatgc tccagtcact gaaagggcta aactgatttc cttgccaact 2340 agtaaaaact ggaccttcgg accccaggac gtcgatgaac tgatcttcat gctgagcgac 2400 agccctgggg tcatgtgccg gccttcccga gtcaagcaga tgtttgcctc cagagcctgc 2460 cggaagtcgg tgatgattgg gactgctctt aacacaagcg agatgaagaa actgatcacc 2520 cacatggggg agatggacca cccctggaac tgtccccatg gaaggccaac catgagacac 2580 atcgccaacc tgggtgtcat ttctcagaac tgaccgtagt cactgtatgg aataattggt 2640 tttatcgcag atttttatgt tttgaaagac agagtcttca ctaacctttt Ctgttttaaa 2700 atgaaacctg ctacttaaaa aaaatacaca tcacacccat ttaaaagtga tcttgagaac 2760

cttttcaaac c 277J human PMS1 protein MKQLPAATVR LLSS5QIITS VVSVVKELIE N5LDAGATSV DVKLENYGFD KlEVRDNGEG 60 IKAVDAPVMA MKYYTSKINS HEDLENLTTY GFRGEALGSI CCIAEVLITT RTAADNFSTQ 120 YVLDGSGHIL SQKPSHLGQG TTVTALRLFK NLPVRKQFYS TAKKCKDEIK KIQDLLMSFG 180 ILKPDLR1VF VHNKAVIWQK SRVSDHKMA1 MSVLGTAVMN NMESFQYHSE ESDIYLSGFL 240 PKCDADHSFT SLSTPERSFI FIN5RPVHQK DILKLIRHHY NLKCLKESTR LYPVFFLKID 300 VPTADVDVNL TPDKSQVLLQ NKE5VLIALE NLMTTCYGPL PSTNSYENNK TDVSAADIVL 360 SKTAETDVLF »KVESSGKNY SNVDTSVIPF QNDMHNDESG KNTDDCLNHQ ISIGDFGYGH 420 CSSEISNIDK NTKNAFQDIS MSNVSWENSQ TEYSKTCFIS SVKHTQSENG NKDHIDESGE 480 NEEEAGLENS SEISADEWSR GNILKNSVGE NIEPVKILVP EKSLPCKVSN NNYPIPEQMN 540 LNEDSCNKKS NV]DNKSGKV TAYDLL5NRV IKKPMSASAL FVQDHRpQFL IENPKTSLED 600 ATLQIEELWK tlseeeklky eekatkdler YNSQMKRAIE QES0M3LKDG RKKIKPTSAW 660 NLAQKHKLKT SLSNQPKLDE LLQSQIEKRR SQNIKMVQIP FSMKNLKINF XKQNKVDLEE 720 KDEPCLIHNL RFPDAWLHTS KTEVMLLNPY RVEEALLFKR LLENHKLPAE PEEKPIMLTE 780 SLFNGSHYLD VLYKMTADDQ RYSGSTYLSD PRLTANGFKI KLIPGVSITE NYLEIEGMAN 840 CLPFYGVADX. KEILNAILNR NAKEVYECRP RKVISYLEGE AVRLSRQLFM YESKEDIQDI 900 IYRMKHQFGN EIKECVHGRP FFHHLTYLPE TT 932

Human PMS1 cDNA ggcacgagtg gctgcttgcg gctagtggat ggtaattgcc tgcctcgcgc tagcagcaag 60 ctgctctgtt aaaagcgaaa atgaaacaat tgcctgcggc aacagttcga ctcctttcaa 120 gttcccagac catcacttcg gtggtcagtg ttgtaaaaga gcttattgaa aactccttgg 180 atgctggtgc cacaagcgta gatgttaaac tggagaacta tggatttgat aaaattgagg 240 tgcgagataa cggggagggt atcaaggctg ttgatgcacc tgtaatggca atgaagtact 300 acacctcaaa aataaatagt catgaagatc ttgaaaattt gacaacttac ggttttcgtg 360 gagaagcctt ggggtcaatt tgttgtatag ctgaggtttt aattacaaca agaacggctg 420 ctgataattt tagcacccag tatgttttag atggcagtgg ccacatactt tctcagaaac 480 cttcaeatct tggtcaaggt acaactgtaa ctgctttaag .attatttaag aatctacctg 540 taagaaagca gttttactca actgcaaaaa aatgtaaaga tgaaataaaa aagatccaag 600 atctcctcat gagctttggt atccttaaac ctgacttaag gattgtcttt gtacataaca 660 aggcagttat ttggcagaaa agcagagtat cagatcacaa gatggctctc atgtcagttc 720 tggggactgc tgttatgaac aatatggaat cctttcagta ccactctgaa gaatctcaga 780 tttatctcag tggatttctt ccaaagtgtg atgcagacca ctctttcact agtctttcaa 640 caccagaaag aagtttcatc ttcataaaca gtcgaccagt acatcaaaaa gatatcttaa 900 agttaatccg acatcattac aatctgaaat gcctaaagga atctactcgt ttgtatcctg 960 ttttctttct gaaaatcgat gttcctacag etgatgttga tgtaaattta acaccagata 1020 aaagccaagt attattacaa aataaggaat ctgttttaat tgctcttgaa aatctgatga 1080 cgacttgtta tggaccatta cctagtacaa attcttatga aaataataaa acagatgttt 1140 ccgcagctga catcgttctt agtaaaacag cagaaacaga'tgtgcttttt aataaagtgg 1200 aatcatctgg aaagaattat tcaaatgttg atacttcagt cattccattc caaaatgata 1260 tgcataatga tgaatctgga aaaaacactg atgattgttt aaatcaccag ataagtattg 1320 gtgactttgg ttatggtcat tgtagtagtg aaatttctaa cattgataaa aacactaaga 1380 atgcatttca ggacatttca atgagtaatg tatcatggga gaactctcag acggaatata 1440 gtaaaacttg ttttataagt tccgttaagc acacccagtc agaaaatggc aataaagacc 1500 atatagatga gagtggggaa aatgaggaag aagcaggtct tgaaaactct tcggaaattt 1560 ctgcagatga gtggagcagg ggaaatatac ttaaaaattc agtgggagag aatattgaac 1620 ctgtgaaaat tttagtgccc gaaaaaagtt taccatgtaa agtaagtaat aataattatc 1680 caatccctga acaaatgaat cttaatgaag attcatgtaa caaaaaatca aatgtaatag 1740 ataataaatc tggaaaagtt acagcttatg atttaettag caatcgagta atcaagaaac 1800 ccatgtcagc aagtgctctt tttgttcaag atcatcgtcc tcagtttctc atagaaaatc 1860 ctaagactag tttagaggat gcaacactac aaattgaaga actgtggaag acattgagtg 1920 aagaggaaaa actgaaatat gaagagaagg ctactaaaga cttggaacga tacaatagtc 1980 aaaCgaagag agccattgaa caggagtcac aaatgtcact aaaagatggc agaaaaaaga 2040 taaaacccac cagcgcatgg aatttggccc agaagcacaa gttaaaaace tcattatcta 2100 atcaaccaaa acttgatgaa ctccttcagt cccaaattga aaaaagaagg agtcaaaata 2160 ttaaaatggt acagatcccc ttttctatga aaaacttaaa aataaatttt aagaaacaaa 2220 acaaagttga cttagaagag aaggatgaac cttgcttgat ccacaatctc aggtttcctg 2280 atgcatggct aatgacatcc aaaacagagg taatgttatt aaatccatat agagtagaag 2340 aagccctgct atttaaaaga cttcttgaga atcataaact tcctgcagag ccactggaaa 2400 agccaattat gttaacagag agtcttttta atggatctca ttatttagac gttttatata 2460 aaatgacagc agatgaccaa agatacagtg gatcaactta cctgtctgat cctcgtctta 2520 cagcgaatgg tttcaagata aaattgatac caggagtttc aattactgaa aattacttgg 25B0 aaatagaagg aatggctaat tgtctcccat tctatggagt agcagattta aaagaaattc 2640 ttaatgctat attaaacaga aatgcaaagg aagtttatga atgtagacct cgcaaagtga 2700 taagttattt agagggagaa gcagtgcgtc tatccagaca attacccatg tacttatcaa 2760 aagaggacat ccaagacatt atctacagaa tgaagcacca gtttggaaat gaaattaaag 2820 agtgtgttca tggtcgccca ttttttcatc atttaaccta tcttccagaa actacatgat 2880 taaatatgtt taagaagatt agttaccatt gaaattggtt ctgtcataaa acagcatgag 2940 tctggtttta aattatcttt gtattatgtg tcacatggtt attttttaaa tgaggattca 3000 ctgaettgtt tttatattga aaaaagttcc acgtattgta gaaaacgtaa acaaactaat 3060 aac 3063 human MSH2 protein MAVQPKETLQ LESAAEVGFV RFFQGMPEKP TTTVRLFDRG DFYTAHGEDA LLAAREVFKT 60 QGVIKYMGPA GAKNLQSWL SKMNFESFVK DLLLVRQYRV EVYKNRAGNK ASKENDWYLA 120 YKASPGNLSQ FEDILFGNND MSASIGVVGV KMSAVDGQRQ VGVGYVDSIQ RKLGLCEFPD 180 NDQFSNLEAL LIQIGPKECV LPGGETAGDM GKLRQIIQRG GILITERKKA DFSTKD1YQD 240 LNRLLKGKKG EQMNSAVLPE MENQVAVSSL SAV1KFLELL SDDSNFGQFE LTTFDFSQYM 300 KEDIAAVRAL NLFQGSVEDT TGSQSLAALL NKCKTPQGQR LVNQWIKQPL MDKNR1EERL 360 NLVEA FVEDA ELRQTLQEDL LRRFPDLNRL AKKFQRQAAN LQDCYRLYQG INQLPNVIQA 420 LEKHEGKHQK LLLAVFVTPL TDLRSDFSKF QEMIETTLDM DQVENHEFLV KPSFDPNLSE 480 LREIMNDLEK KMQSTLISAA RDLGLDPGKQ IKLDSSAQFG YYFRVTCKEE KVLRNNKNFS 540 TVDIQKNGVK FTNSKLTSLN EEYTKNKTEY EEAQDAIVKE IVMSSGYVE PMQTLNDVLA 600 QLDAVVSFAH VSNGAPVPYV RPAILEKGQG RIILKASRHA CVEVQDEIAF IPNDVYFEKD 660 KQMFHIITGP NMGGKSTYIR OTGVIVLMAQ IGCFVPCESA EVSIVDCILA RVGAGDSQLK 720 GVSTFMAEML ETASILRSAT KDSLIIIDEI, GRGTSTYDGF GLAWAISEYI ATKIGAFCMF 7Θ0 ATHFHELTAL ANQIPTVNNL HVTALTTEET LTHLYQVKKG VCDQSFGIHV AEIANFPKHV 840 IECAXQKALE LEEFQYIGES QGYDIMEPAA XKCYLEREQG EKlIQBFiSK VKQMPFTEMS 900 eenitiklkq lkaeviaknn SFVNEIISRI KVTT 934

Human MSH2 cDNft ggcgggaaac agcttagtgg gtgtggggtc gcgcattttc ttcaaccagg aggtgaggag 60 gtttcgacat ggcggtgcag ccgaaggaga cgetgcagtt ggagagcgcg gccgaggtcg 120 gcttcgtgcg cttctttcag ggcatgccgg agaagccgac caccacagtg cgccttttcg 180 accggggcga cttctatacg gcgcacggcg aggacgcgct gctggccgcc cgggaggtgt 240 tcaagaccca gggggtgatc aagtacatgg ggccggcagg agcaaagaat ctgcagagtg 300 ttgtgcttag taaaatgaat tttgaatctt ttgtaaaaga tcttcttetg gttcgtcagt 360 atagagttga agtttataag aatagagctg gaaataaggc atccaaggag aatgattggt 420 atttggcata taaggcttct cctggcaatc tctctcagtt tgaagacatt ctctttggta 480 acaatgatat gtcagcttcc attggtgttg tgggtgttaa aatgtccgca gttgatggcc 540 agagacaggt tggagttggg tatgtggatt ccatacagag gaaactagga ctgtgtgaat 600 tccctgataa tgatcagttc tccaatcttg aggctctcct catccagatt ggaccaaagg 660 aatgtgtttt acccggagga gagactgctg gagacatggg gaaactgaga cagataattc 720 aaagaggagg aattctgatc acagaaagaa aaaaagctga cttttccaca aaagacattt 780 atcaggacct caaccggttg ttgaaaggca aaaagggaga gcagatgaat agtgctgtat 840 tgccagaaat ggagaatcag gttgcagttt catcactgtc tgcggtaatc aagtttttag 900 aactcttatc agatgattcc aactttggac agtttgaact gactactttt gacttcagcc 960 agtatatgaa attggatatt gcagcagtca gagcccttaa cctttttcag ggttctgttg 1020 aagataccac tggctctcag tetctggctg ccctgctgaa taagtgtaaa acccctcaag 1080 gacaaagact tgttaaccag tggatcaage agcctctcat ggataagaac agaatagagg 1140 agagattgaa tttagtggaa gcttttgtag aagacgcaga attgaggcag actttacaag 1200 aagatttact tcgtcgattc ccagatctta accgacttgc caagaagttt caaagacaag 1260 cagcaaactt acaagattgt taccgactct atcagggtat aaatcaacta cctaatgtta 1320 taeaggctct ggaaaaacat gaaggaaaac accagaaatt attgttggca gtttttgtga 1380 ctcctcttac tgatcttcgt tctgacttct ccaagtttca ggaaatgata gaaacaactt 1440 tagatatgga tcaggtggaa aaccatgaat tccttgtaaa acettcattt gatcctaatc 1500 tcagtgaatt aagagaaata atgaatgact tggaaaagaa gatgcagtca acattaataa 1560 gtgcagccag agatcttggc ttggaccctg gcaaacagat taaactggat tccagtgcac 1620 agtttggata ttactttcgt gtaacctgta aggaagaaaa agtccttcgt aacaataaaa 1680 actttagtae tgtagatatc cagaagaatg gtgttaaatt taccaacagc aaattgactt 1740 ctttaaatga agagtatacc aaaaataaaa cagaatatga agaagcccag gatgccattg 1800 ttaaagaaat tgtcaatatt tcttcaggct atgtagaacc aatgcagaca ctcaatgatg 1860 tgttagctca gctagatget gttgtcagct ttgctcacgt gtcaaatgga gcacctgttc 1920 catatgtacg accagccatt ttggagaaag gacaaggaag aattatatta aaagcatcca 1980 ggcatgcttg tgttgaagtt caagatgaaa ttgcatttat tcctaatgac gtatactttg 2040 aaaaagataa acagatgttc cacatcatta ctggccccaa tatgggaggt aaatcaacat 2100 atattcgaca aactggggtg atagtactca tggcccaaat tgggtgtttt gtgccatgtg 2160 agtcagcaga agtgtccatt gtggactgca tcttagcccg agtaggggct ggtgacagtc 2220 aattgaaagg agtctccacg ttcatggctg aaatgttgga aactgcttct atcctcaggt 2280 ctgcaaccaa agattcatta ataatcatag atgaattggg aagaggaact tctacctacg 2340 atggatttgg gttagcatgg gctatatcag aatacattgc aacaaagatt ggtgettttt 2400 gcatgtttgc aacccatttt catgaactta ctgccttggc caatcagata ccaactgtta 2460 ataatctaca tgtcacagca ctcaccactg aagagacctt aactatgctt tatcaggtga 2520 agaaaggtgt ctgtgatcaa agttttggga ttcatgttgc agagcttgct aatttcccta 2580 agcatgtaat agagtgtgct aaacagaaag ccctggaact tgaggagttt cagtatattg 2640 gagaatcgca aggatatgat atcatggaac cagcagcaaa gaagtgctat ctggaaagag 2700 agcaaggtga aaaaattatt caggagttcc tgtccaaggt gaaacaaatg ccctttactg 2760 aaatgtcaga agaaaacatc acaataaagt taaaacagct aaaagctgaa gtaatagcaa 2820 agaataatag ctttgtaaat gaaatcattt cacgaataaa agttactacg tgaaaaatcc 2880 cagtaatgga atgaaggtaa tattgataag ctattgtctg taatagtttt atattgtttt 2940 atattaaccc tttttccata gtgttaactg tcagtgqcca tgggctatca acttaataag 3000 atstttagta atattttact ttgaggacat tttcaaagat ttttattttg aaaaatgaga 3060 gctgtaactg aggactgttt gcaattgaca taggcaataa taagtgatgt gctgaatttt 3120 ataaataaaa Ccatgtagtt tgtgg 3145 human MLH1 protein MSFVAGVIRR LDETWNRIA AGEVIQRPAN AIKEMIENCL DAKSTSIQVI VKEGGLKLIQ 60 IQDNGTGIRK EDLDIVCERF TTSKLQSFED LASISTYGFR GEALASISHV AHVTITTKTA 120 DGKCAYRASY SDGKLKAPPK PCAGNQGTQI TVEDLFYNIA TRRKALKNPS EEYGKILEVV 180 GRYSVHNAGI SFSVKKQGET VADVRTLPNA STVDNIR5IF GNAVSRELIE IGCEDKTLAF 240 KMKGYISNAH YSVKKCIFLL FINHRLVEST SLRKAIETVY AAYLPKNTHP FLYLSLEISP 300 QNVDVNVHPT KHEVHFLHEE SILERVQQHI ESKLLGSNSS RMYFTQTLLP GLAGPSGEMV 360 KSTTSLTSSS TSGSSDKVYA HQMVRTDSRE QKLDAFLQFL SKPLSSQPOA IVTEDKTDIS 420 SGRARQQDEE MLELPAPAEV AAKNQSLEGD TTKGTSEHSE KRGPTSSNPR KRHREDSDVE 480 MVEDDSRKEM TAACTPRRRI INLTSVLSLQ EEINEQGHEV LREMLHNHSF VGCVNPQWAL 540 AQHQTKLYLL NTTKLSEELF YQILIYDFAN FGVLRLSEPA PLFDLAHLAL DSPESGWTEE 600 DGPKEGLAEY IVEFLKKKAE MLADYFSLEI DEEGNLIGLP LLIDNYVPPL EGLPIFILRL 660' ATEVNWDEEK ECFESLSKEC AMFYS1RKQY 1SEESTL5GQ QSEVPGSIPN SWKWTVEH1V 720 YKALRSHILP PKHFTEDGNI EQLANLPDLY KVFERC 756

Human MLH1 cDNA cttggctctt ctggegccaa aatgtcgttc gtggcagggg ttattcggcg gctggacgag 60 acagtggtga accgcatcgc ggcgggggaa gttatccagc ggccagctaa tgctatcaaa 120 gagatgattg agaactgttt agatgcaaaa tccacaagta ttcaagtgat tgttaaagag 1Θ0 ggaggcctga agttgattca gatccaagac aatggcaccg ggatcaggaa agaagatctg 240 gatattgtat gtgaaaggtt cactactagt aaactgcagt cctttgagga tttagccagt 300 atttctacct atggctttcg aggtgaggct ttggccagca taagccatgt ggctcatgtt 360 actattacaa cgaaaacagc Lgatggaaag tgtgcataca gagcaagtta ctcagatgga 420 aaactgaaag cccctcctaa accatgtgct ggeaatcaag ggacccagat cacggtggag 480 gacctttttt acaacatagc cacgaggaga aaagctttaa aaaatccaag tgaagaatat 540 gggaaaattt tggaagttgt tggcaggtat tcagtacaca atgcaggcat tagtttctca 600 gttaaaaaac aaggagagac agtagctgat gttaggacac tacccaatgc ctcaaccgtg 660 gacaatattc gctccatctt tggaaatgct gttagtcgag aactgataga aattggatgt 720 gaggataaaa ccctagcctt caaaacgaat ggttacatat ccaatgcaaa ctactcagtg 760 aagaagtgca tcttcttact cttcatcaac catcgtctgg tagaatcaac ttccttgaga 840 aaagccatag aaacagtgta tgcagcctat ttgcccaaaa acacacaccc attcctgtac 900 ctcagtttag aaatcagtcc ccagaatgtg gatgttaatg tgcaccccac aaagcatgaa 960 gttcacttcc tgcacgagga gagcatcctg gagcgggtgc agcagcacat cgagagcaag 1020 ctcctgggct ccaattcctc caggatgtac ttcacccaga ctttgctacc aggacttgct 1080 ggcccctctg gggagatggt taaatccaca acaagtctga cctcgtcttc tacttctgga 1140 agtagtgata aggtctatgc ccaccagatg gttcgtacag attcccggga acagaagett 1200 gatgcatttc tgcagcccct gagcaaaccc ctgtccagtc agccccaggc cattgtcaca 1260 gaggataaga cagatatttc tagtggcagg gctaggcage aagatgagga gatgcttgaa 1320 ctcccagccc ctgctgaagt ggctgccaaa aatcagagct tggaggggga tacaacaaag 1380 gggacttcag aaatgtcaga gaagagagga cctacttcca gcaaccccag aaagagacat 1440 cgggaagatt ctgatgtgga aatggtggaa gatgattccc gaaaggaaat gactgcagct 1500 tgtacccccc ggagaaggat cattaacctc actagtgttt tgagtctcca ggaagaaatt 1560 aatgagcagg gacatgaggt tctccgggag atgttgcata accactcctt cgtgggctgt 1620 gtgaatcctc agtgggcctt ggcacagcat caaaccaagt tataccttct caacaccacc 1660 aagcttagtg aagaactgtt ctaccagata ctcatttatg attttgccaa ttttggtgtt 1740 ctcaggttat cggagccagc accgctcttt gaccttgcca tgcttgcctt agatagtcca 1800 gagagtggcc ggacagagga agatggtccc aaagaaggac ttgctgaata cattgttgag 1860 tttctgaaga agaaggctga gatgcctgca gactatttct ctttggaaat tgatgaggaa 1920 gggaacctga ttggattacc ccttctgatt gacaactatg tgcccccttt ggagggactg 1980 cctatcttca ttcttcgact agccactgag gtgaattggg acgaagaaaa ggaatgtttt 2040 gaaagcctca gtaaagaatg cgctatgttc tattccatcc ggaagcagta catatctgag 2100 gagtcgaccc tctcaggcca gcagagtgaa gtgcctggct ccattccaaa ctcctggaag 2160 tggactgtgg aacacattgt ctataaagcc ttgcgctcac acattctgcc tcctaaacat 2220 ttcacagaag atggaaatat cctgcagctt gctaacctgc etgatctata caaagtcttt 2280 gagaggtgtt aaatatggtt atttatgcac tgtgggatgt gttcttcttt ctctgtattc 2340 cgatacaaag tgttgtatca aagtgtgata tacaaagtgt accaacataa gtgttggtag 2400 cacttaagac ttatacttgc cttctgatag tattccttta tacacagtgg attgattata 2460 aataaataga tgtgtcttaa cata 2484 hPMS2-134 protein mkqlpaatvr llsssqiits wsvvkelie nsldagatsv DVKLENYGFD KIEVRDNGEG 60 IKAVDAPVKA MKYYTSKINS HEDLENLTTY GFRGEALGSI CCIAEVLITT RTAADNFSTQ 120 YVLDGSGHIL SQK 133

hPMS2-l34 cDNA cgaggcggat cgggtgttgc atocatggag cgagctgaga gctcgagtac agaacctgct 60 aaggccatca aacctattga tcggaagtca gtccatcaga tttgctctgg gcaggtggta 120 Ctgagtctaa gcactgcggt aaaggagtca gtagaaaaca gtctggatgc tggtgccact 180 aatattgatc taaagcttaa ggactatgga gtggatctta ttgaagtttc agacaatgga 240 tgtggggtag aagaagaaaa cttcgaaggc ttaactctga aacatcacac atctaagatt 300 caagagtttg ccgacctaac tcaggttgaa acttttggct ttcgggggga agctctgagc 360 tcactttgtg cactgagcga tgtcaccatt tctacctgcc acgcatcggc gaaggttgga 420 acttga 426 hMSH6 (human CDNA) DEPONERING U28946

MSRQSTLYS FFPKS PALS DANKASARASREGGRAAAAPGASPSP

GGDAAWSEAGPGPRPLARSASPPKAKNLNGGLRRSVAPAAPTSCDFSPGDLVWAKMEG

YPWWPCLVYNHPFDGTFIREKGKSVSVHVQFFDDSPTRGWVSKRLLKPYTGSKSKEAQ kgghfysakpeilramqraoealnkdkikrlelavcdepsepeeeeemevgttyvtdk

SEEDNEIESEEEVQPKTQGSRRSSRQIKKRRVISDSESDIGGSDVEFKPDTKEEGSSD

eissgvgdseseglnspvkvarkrkrmvtgngslkrkssrketpsatkqatsissetk NTLRAFSAPQNSESQAHVSGGGDDSSRPTVWYHETLEWLKEEKRRDEHRRRPDHPDFD ASTLYVPEDFLNSCTPGMRKWWQIKSQNFDLVICYKVGKFYELYHMDALIGVSELGlV FMKGNWAHSGFPEIAFGRY S DSLVQKGYKVARVEQTETPEMMEARCRKMAHI SK Y DRV VRREICRIITKGTQrYSVLEGDPSENYSKYLLSLKEKEEDSSGHTRAYGVCFVDTSLG XFFIGQFSDDRHCSRFRTLVAHYPPVQVLFEXGNLSKETKTI LKSSLSCSLQECLI PC SGFWDASKTLRTLLEEEY FREKLS DGl G VM LPQ VLKGMTSE S DS IGLT PGEKSELALS ALGGCVFYLKKCLIDQELLSMANFEEYIPLDSDTVSTTRSGAIFTKAYQRMVLDAVTL NNLEIFLNGTNGSTEGTLLERVDTCHTPFGKRLLKQWLCAPLCNHYAINDRLDAIEDL mwpdki sewellkklpdlerllskihnvgsplksqnhpdsraimyeettyskkkii dflsalegfkvmckiigimeevadgfkski lkqvislqtknpegrfpdltvelnrwdt

AFDHEKARKTGLITPKAGFDSDYDQALADIRENEQSLLEYLEKQRNRIGCRTIVYWGI

GRNRYQLEIPENFTTRNLPEEYELKSTKKGCKRYWTKTIEKKLANLINAEERRDVSLK

DCMRRLFYNFDKNYKDWQSAVECIAVLDVLLCLANYSRGGDGPMCRPVILLPEDTPPF

LEtKGSR«PCITXTFFGDDFIPNDILIGCEEEEQENGKAYCVLVTGPNMGGKSTI.MRQ AGLLAVMAQMGC Y V PAEVCRLTPIDRV FTRLGASDRIMSGE STFFVELSETASILMHA tahslvlvdelgrgtatfdgtaianavvkeiaetikcrtlfsthyhslvedysqnvav rlghmacmvenecedpsqetitflykfikgacpksygfhaarlanlpeeviqkghrka REFEKMNQSLRLFREVCLASERSTVDAEAVHKLLTLIKEL" hPMSR2 (human cDNA) DEPONERING U38964 1 ggcgctccta cctgcaagtg gctagtgcca agtgctgggc cgccgctcct gccgtgcatg 61 ttggggagcc agtacatgca ggtgggctcc acacggagag gggcgcagac ccggtgacag 121 ggctttacct ggtacatcgg catggcgcaa ccaaagcaag agagggtggc gcgtgccaga 161 caccaacggt cggaaaccgc cagacaccaa cggtcggaaa ecgccaagac accaacgctc 241 ggaaaccgcc agacaccaac gctcggaaac cgccagacac caaggctcgg aatccacgcc 301 aggccacgac ggagggcgac tacctccctt ctgaccctgc tgctggcgtt cggaaaaaac 361 gcagtccggt gtgctctgat tggtccaggc tctttgacgt cacggactcg acctttgaca 421 gagccactag gcgaaaagga gagacgggaa gtattttttc egccccgccc ggaaagggtg 461 gagcacaacg tcgaaagcag ccgttgggag cccaggaggc ggggcgcctg tgggagccgt 541 ggagggaact ttcccagtcc ccgaggcgga tccggtgttg catccttgga gcgagctgag 601 aactegagta cagaacctgc taaggccatc aaacctattg atcggaagtc agtccatcag 661 atttgctctg ggccggtggt accgagtcta aggccgaatg cggtgaagga gttagtagaa 721 aacagtctgg atgctggtgc cactaatgtt gatctaaagc ttaaggacta tggagtggat 761 ctcattgaag tttcaggcaa tggatgtggg gtagaagaag aaaacttcga aggctttact 841 ctgaaacatc acacatgtaa gattcaagag tttgccgacc taactcaggt ggaaactttt 901 ggctttcggg gggaagctct gagctcactt tgtgcactga gtgatgtcac catttctacc 961 tgccgtgtat cagcgaaggt tgggactcga ctggtgtttg atcactatgg gaaaatcatc 1021 cagaaaaccc cctacccccg ccccagaggg atgacagtca gcgtgaagca gttattttct 1061 acgctacctg tgcaccataa agaatttcaa aggaatatta agaagaaacg tgcctgcttc 1141 cccctcgcct tctgccgcga ttgtcagttt cctgaggect ccccagccat gcttcctgta 1201 cagcctgtag aactgactcc tagaagtacc ccaecccacc cctgctcctt ggaggacaac 1261 gtgatcactg tattcagctc tgtcaagaat ggtccaggtt cttctagatg atctgcacaa 1321 atggttcctc tcctccttcc tgatgtctgc cattagcatt ggaataaagt tcctgccgaa 1361 aatccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa

hPMSR2 (human protein) DEPONERING U38964 MAQPKQERVARARHQRSETARHQRSETAKTPTLGNROTPTLGNR

QTPRLGIHARPRRRATTSLLTLLLAFGKNAVRCALIGPGSLTSRTRFLTEPU3EKERR EVFFPPRPERVEHNVE SSRWE PRRRGACGS RGGN F PS PRGGSGVASLERÅEN SSTE PA KAIKPIDRKSVHQICSGPVVPSLRPNAVKELVENSLDAGATNVDLKLKDYGVDLIEVS GHGCGVEEENFEGFTLXHHTCKI0EFADLT0VETFGFRGEALSSLCALSDVTI5TCRV SAKVGTRLVFDHVGKI1QKTPY PRPRGHTVSVKQLFSTLPVH RKEFQRNIKKKRAC FP FAFCRDCQFPEASPAMLFVQPVELTPRSTPFKFCSLEDNVITVFSSVKNGPGSSR HPMSR3 (human cDNA) deponering U3897 9 1 tttttagaaa ctgatgttta ttttccatca accatttttc catgctgctt aagagaatat 61 gcaagaacag cttaagacca gtcagtggtt gctcctaccc attcagtggc ctgagcagtg 121 gggagctgca gaccagtctt ccgtggcagg ctgagcgctc cagtcttcag tagggaattg 181 ctgaataggc acagagggca cctgtacacc ttcagaccag tctgcaacct caggctgagt 241 agcagtgaac tcaggagcgg gagcagtcca' ttcaccctga aattcctcct tggtcactgc 301 ettctcagea gcagcctgct cttctttttc aatetcttca ggatctctgt agaagtacag 361 atcaggcatg acctcccatg ggtgttcacg ggaaatggtg ccacgcatgc gcagaacttc 421 ccgagccagc atccaccaca ttaaacccac tgagtgagct cccttgttgt tgcatgggat 4Θ1 ggcaatgtcc acatagcgca gaggagaatc tgtgttacac agcgcaatgg taggtaggtt 541 aacataagat gcctccgtga gaggcgaagg ggcggcggga cccgggcctg gcccgtatgt 601 gtccttggcg gcctagacta ggccgtcgct gtatggtgag ccccagggag gcggatctgg 661 gcccccagaa ggacacccgc ctggatttgc cccgtagecc ggcccgggcc cctcgggagc 721 agaacagcct tggtgaggtg gacaggaggg gacctcgcga gcagacgcgc gcgccagcga 781 cagcagcccc gccccggcct ctcgggagcc ggggggcaga ggctgcggag ccccaggagg 841 gtctatcagc cacagtctct gcatgtttcc aagagcaaca ggaaatgaac acattgcagg 901 ggccagtgtc attcaaagat gtggctgtgg atttcaccca ggaggagtgg cggcaactgg 961 accctgatga gaagatagcs tacggggatg tgatgttgga gaaccacagc catctagttt 1021 ctgtggggca tgattatcac caagccaaac atcatcacgg agtggaggtg aaggaagtgg 1081 agcagggaga ggagccgtgg ataatggaag gtgaattccc atgtcaacat agtccagaac 1141 ctgctaaggc catcaaacct attgatcgga agtcagtcca tcagatttgc tctgggccag 1201 tggtactgag tctaagcact gcagtgaagg agttagtaga aaacagtctg gatgctggtg 1261 ccactaatat tgatctaaag cttaaggact atggagtgga tctcattgaa gtttcagaca 1321 atggatgtgg ggtagaagaa gaaaactttg aaggcttaat ctctttcagc tctgaaacat 1381 cacacatgta agattcaaga gtttgccgac ctaactgaag ttgaaacttt cggttttcag 1441 ggggaagctc tgagctcact gtgtgcactg agcgatgtca ecatttctac ctgccacgcg 1501 ttggtgaagg ttgggactcg actggtgttt gatcacgatg ggaaaatcat ccaggaaacc 1561 ccctaccccc accccagagg gaccacagtc agcgtgaagc agttattttc tacgctacct 1621 gtgcgccata aggaattcca aaggaatatt aagaagacgt gcctgcttcc ccttcgcctt 1681 ctgccgtgat tgtcagtttc ctgaggcctc cccagccatg cttcctgtac agcctgcaga 1741 actgtgagtc aattaaaect cttttcttca taaattaaaa aaaaa hPMSR3 (human protein) deponering U38979 MCPWRPRLGRRCMVSPREADLGPQKDTRLDLPRSPARAPREQNS LGEVDRRGPREQTRAPATAAPPRPLGSRGAEAAEPQEGLSATVSACFQEQQEMNTLQG PVSFKDVAVDFTQEEWRQUDPDEKIAYGDVMLENYSHLVSVGYDYHQAKHHHGVEVKE VEQGEE PWX HEGE FPCOH SPE PAKAIKPIDRKSVHQICSGPVVLSLSTAVKELVENSL ΟΑΟΑΤΝΙΟΕΚΕΚΟΥΟνΟΕΙΕνεΟΝσοανΕΕΕΝΓΕαΕΙΒΓεδΕΤεΗΜ" hPMSLS (human cDNA) deponering NM_005395 1 atgtgtcctt ggcggcctag actaggccgt cgctgtatgg tgagccccag ggaggcggat 61 ctgggccccc agaaggacac ccgcctggat ttgccccgta gcccggcccg ggcccctcgg 121 gagcagaaca gccttggtga ggtggacagg aggggacctc gcgagcagac gcgcgcgcca 181 gcgacagcag ccccgccccg gcctctcggg agccgggggg cagaggctgc ggagccccag 241 gagggtctat cagccacagt ctctgcatgt ttccaagagc aacaggaaat gaacacattg 301 caggggccag tgtcattcaa agatgtggct gtggatttca cccaggagga gtggcggcaa 361 ctggaccctg atgagaagat agcatacggg gatgtgatgt tggagaacta cagccatcta 421 gtttctgtgg ggtatgatta tcaccaagcc aaacatcatc atggagtgga ggtgaaggaa 481 gtggagcagg gagaggagcc gtggataatg gaaggtgaat ttccatgtca acatagtcca 541 gaacctgcta aggccatcaa acctattgat cggaagtcag tccatcagat ttgctctggg 601 ccagtggtac tgagtctaag cactgcagtg aaggagttag tagaaaacag tctggatgct 661 ggtgccacta atattgatct aaagcttaag gactatggag tggatctcat tgaagtttca 721 gacaatggat gtggggtaga agaagaaaac tttgaaggct taatctcttt cagctctgaa 701 acatcacaca tgtaa hPHSL9 (human protein) DEPONERING NM_005395

MCPWRPRLGRRCMVSPREADLGPQKDTRLDLPRSPARAPREQNS lgevdrrgpreqtrapataapffplgsrgaeaaepqeglsatvsacfqeqqemntlqg

PVSFKDVAVDFTQEEWRQEDPDEKIAYGDVMLENYSHLVSVGYDYHQAKHHHGVEVKE veqgeepwimegefpcqhspepakaikpidrksvhqicsgpwlslstavkelvensl DAGATNIDLKLKDYGVDLIEVSDNGCGVEEENFEGLISFSSETSHM”

SEKVENSLISTE <110> Nicolaides, Nicholas Sass, Philip Kinzler, Kenneth Grasso, Luigi Vogelstein, Bert <120> Methods for generating hypermutable yeast < 130> 01107.00099 <140> PCT/US01/05447 <141> 2001-02-21 < 150> 60/184,336 <151> 2000-02-23 <160> 26 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0

<210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 acgcatatgg agcgagctga gagctcgagt 30 <210>2 <211> 75

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 gaattcttat cacgtagaat cgagaccgag gagagggtta gggataggct taccagttcc 60 aaccttcgcc gatgc 75

<210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 acgcatatgt gtccttggcg gcctaga 27

<210> 4 < 211 > 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 gaattcttat tacgtagaat cgagaccgag gagagggtta gggataggct tacccatgtg 60 tgatgtttca gaget 75

<210> 5 <211> 3218 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 5 aaataggaat gtgatacctt ctattgcatg caaagatagt gtaggaggeg ctgctattgc 60 caaagacttt tgagaccgct tgctgtttca ttatagttga ggagtteteg aagaegagaa 120 attageagtt ttcggtgttt agtaategeg etageatget aggacaattt aactgcaaaa 180 ttetgataeg atagtgatag taaatggaag gtaaaaataa catagaccta tcaataagca 240 atgtctctca gaataaaagc acttgatgca teagtggtta acaaaattgc tgeaggtgag 300 atcataatat cccccgtaaa tgctctcaaa gaaatgatgg agaattccat egatgegaat 360 gctacaatga ttgatattet agtcaaggaa ggaggaatta aggtacttea aataaeagat 420 aaeggatetg gaattaataa agcagacctg ccaatcttat gtgagegatt cacgacgtcc 480 aaattacaaa aattegaaga tttgagtcag attcaaacgt atggattccg aggagaaget 640 ttagccagta tctcacatgt ggcaagagtc aeagtaaega caaaagttaa agaagaeaga 600 tgtgcatgga gagttteata tgeagaaggt aagatgttgg aaagccccaa acctgttgct 660 ggaaaagacg gtaccacgat cctagttgaa gaeetttttt tcaatattcc ttetagatta 720 agggccttga ggtcccataa tgatgaatac tctaaaatat tagatgttgt egggegatae 780 gccattcatt ccaaggacat tggettttet tgtaaaaagt tcggagactc taattattct 840 ttateagtta aaccttcata tacagtccag gataggatta ggactgtgtt caataaatct S00 gtggcttcga atttaattac tttteatate agcaaagtag aagatttaaa cctggaaagc 960 gttgatggaa aggtgtgtaa tttgaatttc atatccaaaa agtccattte attaattttt 1020 ttcattaata atagactagt gacatgtgat ettetaagaa gagetetgaa eagegtttae 1080 tccaattatc tgccaaaggg cttcagacct tttatttatt tgggaattgc tatagatccg 1140 gcggctgttg atgttaacgt tcacccgaca aagagagagg ttcgtttcct gagccaagat 1200 gagatcatag agaaaatcgc caaccaattg cacgccgaat tatctgccat tgatacttca 12$0 cgtactttca aggcttcttc aattccaaca aacaagccag agtcattgat aceatttaat 1320 gacaccatag aaagtgatag ga&amp;taggaag agtctccgac aagcccaagt ggtagagaat 1380 tcatatacga cagccaatag tcaactaagg aaagcgaaaa gacaagagaa taaactagtc 1440 agaatagatg cttcacaagc taaaattacg tcatttttat cctcaagtca acagttcaac 1500 tttgaaggat cgtctacaaa gcgacaactg agt'gaaccca aggtaacaaa cgcaagccac 1560 tcccaagagg cagaaaagct gacactaaat gaaagcgaac aaccgcgtga tgccaataca 1620 atcaatgata atgacttgaa ggatcaacct aagaagaaac aaaagttggg ggattataaa 1680 gttccaagca ttgccgatga cgaaaagaat gcactcccga tttcaaaaga cgggtatatt 1740 agagtaccta aggagcgagt taatgttaat cttacgagta tcaagaaatt gcgtgaaaaa 1800 gtagatgatt cgatacatcg agaactaaca gacatttttg caaatttgaa ttacgttggg 1860 gttgtagatg aggaaagaag attagccgct attcagcatg acttaaagct ttttttaata 1920 gattacggat ctgtgtgcta tgagctattc tatcagattg gtttgacaga cttcgcaaac 1980 tttggtaaga taaacctaca gagtacaaat gtgtcagatg atatagtttt gtataatctc 2040 ctatcagaat ttgacgagtt aaatgacgat gcttccaaag aaaaaataat tagtaaaata 2100 tgggacatga gcagcatgct aaacgagtac tattccatag aattggtgaa tgatggtcta 2160 gataatgact caaagtctgt gaagctaaaa tctctaccac tacttttaaa aggctacatt 2220 ccatctctgg tcaagttacc attttttata tatcgcctgg gtaaagaagt tgactgggag 2280 gatgaacaag agtgtctaga tggtatttta agagagattg cattactcta catacctgat 2340 atggttccga aagtcgatac actcgatgca tcgttgtcag aagacgaaaa agcccagctt 2400 ataaatagaa aggaacacat atcctcatta ctagaacacg ttctcttccc ttgtatcaaa 2460 cgaaggctcc tggcccctag acacattctc aaggatgtcg tggaaatagc caaccttcca 2520 gatctataca aagtttttga gaggtgttaa ctttaaaacg ttttggctgt aataccaaag 2580 tttttgttta tttccegagt gtgattgtgt Ctcatttgaa agtgtatgcc ctttccttta 2640 acgattcatc cgcgagattt caaaggatat gaaatatggt tgcagttagg aaagtatgtc 2700 agaaatgtat attcggattg aaactcttct aatagttctg aagtcacttg gttccgtatt 2760 gttttcgtcc tcttcctcaa gcaacgattc ttgtctaagc ttattcaacg gtaccaaaga 2820 cccgagtcct tttatgagag aaaacatttc atcatttttc aactcaatta tcttaatatc 2880 attttgtagt attttgaaaa caggatggta aaacgaatca cctgaatcta gaagctgtac 2940 cttgtcccat aaaagtttta atctactgag cctttcggtc aagtaaacta gtttatctag 3000 ttttgaaccg aatattgtgg gcagatttgc agtaagttca gttagatcta ctaaaagttg 3060 tttgaoagca gccgaCCcca caaaaattcg gtaaaaggag atgaaagaga cctcgcgcgt 3120 aatggtttgc atcaccatcg gatgtctgtt gaaaaactca ctttttgcat ggaagttatt 3180 aacaataaga ctaatgatta ccttagaata atgtataa 3218 <210>6 <211> 3056 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 gaattccggt gaaggtcctg aagaatttcc agattcctga gtatcattgg aggagacaga 60 taacctgtcg tcaggtaacg atggtgtata tgcaacagaa atgggtgttc ctggagacgc 120 gtcttttccc gagagcggca ccgcaactct cccgcggtga ctgtgactgg aggagtectg 180 catccatgga gcaaaccgaa ggcgtgagta cagaatgtgc taaggccatc aagcctattg 240 atgggaagtc agtccatcaa atttgttctg ggcaggtgat actcagttta agcaccgctg 300 tgaaggagtt gatagaaaat agtgtagatg ctggtgctac tactattgat ctaaggctta 360 aagactatgg ggtggacctc attgaagttt cagacaatgg atgtggggta gaagaagaaa 42 0 actttgaagg Cctagctctg aaacatcaca catctaagat tcaagagttt gacgacctca 480 cgcaggttga aactttcggc tttcgggggg aagctctgag ctctctgtgt geactaagtg 540 atgtcactat atctacctgc cacgggtctg caagcgttgg gactcgactg gtgtttgacc 600 ataatgggaa aatcacccag aaaactccct acccccgacc taaaggaacc acagtcagtg 660 tgcagcactt attttataca ctacccgtgc gttacaaaga gtttcagagg aacattaaaa 720 aggagtattc caaaatggtg caggtcttac aggcgtactg tatcatctca gcaggcgtcc 780 gtgtaagctg cactaatcag ctcggacagg ggaagcggca cgctgtggtg tgcacaagcg 840 gcacgtctgg catgaaggaa aatatcgggt ctgtgtttgg ccagaagcag ttgcaaagcc 900 tcattccttt tgttcagctg ccccctagtg acgctgtgtg tgaagagtac ggcctgagca 960 cttcaggacg ccacaaaacc ttttctacgt ttcgggcttc atttcacagt gcacgcacgg 1020 cgccgggagg agtgcaacag acaggcagtt tttcttcatc aatcagaggc cctgtgaccc 1080 agcaaaggtc tctaagcttg tcaatgaggt tttatcacat gtataaecgg catcagtacc 1140 catttgtcgt ccttaacgtt tccgttgact cagaatgtgt ggatattaat gtaactccag 1200 ataaaaggca aattctacta caagaagaga agctattgct ggccgtttta aagacctcct 1260 tgataggaat gtttgacagt gatgcaaaca agcttaatgt caaccagcag ecactgctag 1320 atgttgaagg taacttagta aagctgcata ctgcagaact agaaaagcct gtgccaggaa 1380 agcaagataa ctctccttca ctgaagagca cagcagacga gaaaagggta gcatccatCt 1440 ccaggctgag agaggccttt tctcttcatc ctactaaaga gatcaagtct aggggtccag 1500 agactgctga actgacacgg agttttccaa gtgagaaaag gggcgtgtta tcctcttatc 1560 cttcagacgt catctcttac agaggcctcc gtggctcgca ggacaaattg gtgagtccca 1620 cggacagccc tggtgactgt atggacagag agaaaataga aaaagactca gggctcagca 1680 gcacctcagc tggctctgag gaagagtCca gcaccceaga agtggccagt agctttagca 1740 gtgactataa cgtgagctcc ctagaagaca gaccttctca ggaaaccata aactgtggtg 1800 acctggactg ccgtcctcca ggtacaggac agtccttgaa gccagaagac catggatatc 1860 aatgcaaagc tctacctcta gctcgtctgt cacccacaaa tgccaagcgc ttcaagacag 1920 aggaaagacc ctcaaatgtc aacatttctc aaagattgcc tggtcetcag agcacctcag 1980 cagctgaggt cgatgtagcc ataaaaatga ataagagaat cgtgctcctc gagttctctc 2040 tgagttctct agctaagcga atgaagcagt tacagcacct aaaggcgcag aacaaacarg 2100 aactgagtta cagaaaettt agggccaaga cttgccctgg agaaaaccaa gcagcagaag 2160 atgaactcag aaaagagatt agtaaatcga tgtttgeaga gatggagatc ttgggtcagt 2220 ttaacctggg atttatagta accaaactga aagaggacct cttcctggtg gaccagcatg 2280 ctgcggatga gaagtacaac tttgagatgc tgcagcagca cacggtgctc caggcgcaga 2340 ggctcatcac accccagact ctgaacttaa ctgctgtcaa tgaagctgta ctgatagaaa 2400 atctggaaat attcagaaag aatggctttg actttgtcat tgatgaggat gctccagtca 2460 ctgaaagggc taaattgatt tccttaccaa ctagtaaaaa ctggaccttt ggaccccaag 2520 atatagatga actgatctct atgttaagtg aoagccctgg ggtcatgtgc cggccctcac 2580 gagtcagaca gatgtttgct tccagagect gtcggaagtc agtgatgatt ggaacggcgc 2640 tcaatgcgag cgagatgaag aagctcatca cccacatggg tgagatggac cacccctgga 2700 actgccccca cggcaggcca accatgaggc acgttgccaa tctggatgtc atctctcaga 2760 actgacacac cccttgtagc atagagttta ttacagactg ttcggtttgc aaagagaagg 2820 ttttaagtaa tctgattatc gttgtacaaa aattagcatg ctgctttaat gtactggatc 2880 catttaaaag cagtgttaag gcaggcatga tggagtgttc ctctagctca gctacttggg 2940 tgatccggtg ggagctcatg tgagcccagg actttgagac cactccgagc cacattcatg 3000 agactcaatt caaggacaaa aaaaaaaaga tatttttgaa gccttttaaa aaaaaa 3056 <210> 7 <211> 2771 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cgaggcggat cgggtgttgc atccatggag cgagctgaga gctcgagtac agaacctgct 60 aaggccatca aacctattga tcggaagtca gtccatcaga tttgctctgg gcaggCggCa 120 ctgagtctaa gcactgcggt aaaggagtta gtagaaaaca gtctggatgc tggtgccact 180 aatattgatc taaagcttaa ggactatgga gtggatctta ttgaagtttc agacaatgga 240 tgtggggtag aagaagaaaa cttcgaaggc ttaactctga aacaccacac atctaagatt 300 caagagtttg ccgacctaac tcaggttgaa acttttggct ttcgggggga agctctgagc 360 tcactttgtg cactgagcga tgtcaccatt tctacctgec acgcatcggc gaaggttgga 420 actcgactga tgtttgatca caatgggaaa attatccaga aaacccccta cccccgcccc 480 agagggacca cagtcagcgt gcagcagtta ttttccacac tacctgtgcg ccataaggaa 540 tttcaaagga atattaagaa ggagtatgcc aaaatggtcc aggtcttaca tgcatactgt 600 atcatttcag eaggcatccg tgtaagttgc accaatcagc ttggacaagg aaaacgacag 660 cctgtggtat gcacaggtgg aagecccagc ataaaggaaa atatcggctc tgtgtttggg 720 cagaagcagt tgcaaagcct cattcctttt gttcagctgc cccctagtga ctccgtgtgt 780 gaagagtacg gtttgagctg ttcggatgct etgcataatc tttttCacat ctcaggtttc 840 atttcacaat gcacgcatgg agttggaagg agtteaacag acagacagtt tttctttatc 900 aaccggcggc cttgtgaccc agcaaaggtc tgcagactcg tgaatgaggt ctaccacatg 960 tataatcgac acoagtatcc atttgttgtt cttaacattt ctgttgattc agaatgcgtt 1020 gatatcaatg ttactccaga taaaaggcaa attttgctac aagaggaaaa gcttttgttg 1080 gcagttttaa agacctcttt gataggaatg tttgatagtg atgtcaacaa gctaaatgtc 1140 agtcagcagc cactgctgga tgttgaaggc aacttaataa aaatgeatgc agcggatttg 1200 gaaaagccca tggtagaaaa gcaggatcaa tccccttcat taaggactgg agaagaaaaa 1260 aaagacgtgt ccatttccag actgcgagag gccttttctc ttcgtcacac aacagagaac 1320 aagcctcaca gcccaaagac tccagaacca agaaggagcc ctctaggaca gaaaaggggt 1380 atgctgtctt ctagcacttc aggtgccatc tctgacaaag gcgtcctgag acctcagaaa 1440 gaggcagtga gttccagtea cggacccagt gaccctacgg acagagcgga ggtggagaag 1500 gactcggggc acggcagcac ttccgtggat tctgaggggt tcagcatccc agacacgggc 1560 agtcactgca gcagcgagta tgcggccagc tccccagggg acaggggctc gcaggaacat 1620 gtggactctc aggagaaagc gcctgaaact gacgactctt tttcagatgt ggactgccat 1680 tcaaaccagg aagataccgg atgtaaattt cgagttttgc ctcagccaac taatctcgca 1740 accccaaaca caaagcgttt taaaaaagaa gaaattcttt ccagttotga catttgtcaa 1800 aagttagtaa atactcagga catgtcagcc tctcaggttg atgtagctgt gaaaattaat 1860 aagaaagttg tgcccctgga cttttctatg agttctttag ctaaacgaat aaagcagtta 1920 catcatgaag cacagcaaag tgaaggggaa cagaattaca1ggaagtttag ggcaaagatt 1980 tgtcctggag aaaatcaagc agccgaagat gaactaagaa aagagataag taaaacgatg 2040 tttgcagaaa tggaaatcat tggtcagttt aacctgggat ttataataac caaactgaat 2100 gaggatatct tcatagtgga ccagcatgcc acggacgaga agtataactt cgagatgctg 2160 cagcagcaca cegtgctcca ggggcagagg ctcatagcac ctcagactct caacttaact 2220 gctgttaatg aagctgttct gatagaaaat ctggaaatat ttagaaagaa t ggctttgat 2280 tttgttatcg atgaaaatgc tccagtcact gaaagggcta aactgatttc cttgccaact 2340 agtaaaaact ggaccttcgg accccaggac gtcgatgaac tgatcttcat gctgagcgac 2400 agccctgggg tcatgtgccg gccttcccga gtcaagcaga tgtttgcctc cagagcctgc 2460 cggaagtcgg tgatgattgg gactgctctt aacacaagcg agatgaagaa actgatcacc 2520 cacatggggg agatggacca cccctggaac tgtccccatg gaaggccaac catgagacac 2580 atcgccaacc tgggtgtcat ttctcagaac tgaccgtagt cactgtatgg aataattggt 2640 tttatcgcag atttttatgt tttgaaagac agagtcttca ctaacctttt ttgttttaaa 2700 atgaaacctg ctacttaaaa aaaatacaca tcacacccat ttaaaagtga tcttgagaac 2760 cttttcaaac c 2771 <210> 8 <211> 3063 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ggcacgagtg gctgcttgcg gctagtggat ggtaattgcc tgcctcgcgc tagcagcaag 60 ctgctetgtt aaaagcgaaa atgaaacaat tgcctgcggc aacagttcga ctcctttcaa 120 gttctcagat catcacttcg gtggtcagtg ttgtaaaaga gcttattgaa aactccttgg 180 atgctggtgc cacaagcgta gatgttaaac tggagaacta tggatttgat aaaattgagg 240 tgcgagataa cggggagggt atcaaggctg ttgacgcacc tgtaatggca atgaagtact 300 acacctcaaa aataaatagt catgaagatc ttgaaaattt gacaacttac ggttttcgtg 360 gagaagcctt ggggtcaatt tgttgtatag ctgaggtttt aattacaaca agaacggctg - 4 2 0 ctgataattt tagcacccag tatgttttag atggcagtgg ccacatactt tctcagaaac 480 cttcacatct tggtcaaggt acaactgtaa ctgctttaag attatttaag aatctacctg 540 taagaaagca gttttactca actgcaaaaa aatgtaaaga tgaaataaaa aagatccaag 600 atctcctcat gagctttggt atccttaaac ctgacttaag gattgtcttt gtacataaca 660 aggcagttat ttggcagaaa agcagagtat cagatcacaa gatggctctc atgtcagttc 720 tggggactgc tgttatgaac aatatggaat cctttcagta ccactctgaa gaatcccaga 780 tttatctcag tggatttctt ccaaagtgtg atgcagacca ctctttcact agtctttcaa 840 caccagaaag aagtttcatc ttcataaaca gtcgaccagt acatcaaaaa gatatcttaa 900 agttaatccg acatcattac aatctgaaat gcctaaagga atctactcgt ttgtatcctg 960 ttttctttct gaaaatcgat gttcctacag ctgatgttga tgtaaattta acaccagata 1020 aaagccaagt attattacaa aataaggaat ctgttttaat tgctcttgaa aatctgatga 1080 cgacttgtta tggaccatta cctagtacaa attcttatga aaataataaa acagatgttt 1140 ccgcagctga catcgttctt agtaaaacag cagaaacaga tgtgcttttt aataaagtgg 1200 aatcatctgg aaagaattat tcaaatgttg atacttcagt cattccattc caaaatgata 1260 tgcataatga tgaatctgga aaaaacactg atgattgttt aaatcaccag ataagtattg 1320 gtgactttgg ttatggtcat tgtagtagtg aaatttctaa cattgataaa aacactaaga 1380 atgcatttca ggacatttca atgagtaatg tatcatggga gaactctcag acggaatata 1440 gtaaaactcg tcttataagt tccgttaagc acacccagtc agaaaatggc aataaagacc 1500 atatagatga gagtggggaa aatgaggaag aagcaggtct tgaaaactct tcggaaattt 1560 ctgcagatga gtggagcagg ggaaatatac ttaaaaattc agtgggagag aatattgaac 1620 ctgtgaaaat tttagtgoct gaaaaaagtt taccatgtaa agtaagtaat aataattatc 1680 caatccctga acaaatgaat cttaatgaag aetcatgtaa caaaaaatca aatgtaatag 1740 ataataaatc tggaaaagtt acagcttatg atteacttag caatcgagta atcaagaaac 1800 ccatgtcagc aagtgctctt tttgttcaag atcatcgtcc tcagtttctc atagaaaatc 1860 ctaagactag tttagaggat gcaacactac aaattgaaga actgtggaag acattgagtg 1920 aagaggaaaa actgaaatat gaagagaagg ctactaaaga cttggaacga tacaatagtc 1980 aaatgaagag agccattgaa caggagtcac aaacgtcact aaaagatggc agaaaaaaga 2040 taaaacccac cagcgcatgg aatttggccc agaagcacaa gttaaaaacc tcattatcta 2100 atcaaccaaa acttgatgaa ctccttcagt cccaaattga aaaaagaagg agtcaaaata 2160 ttaaaatggt acagatcccc ttttctatga aaaacttaaa aataaatttt aagaaacaaa 2220 acaaagttga cttagaagag aaggatgaac cttgcttgat ccacaatctc aggtttcctg 2280 atgcatggct aatgacatcc aaaacagagg taatgttatt aaatccatat agagtagaag 2340 aagccctgct atttaaaaga cttcttgaga atcataaact tcctgcagag ccactggaaa 2400 agccaattat gttaacagag agtcttttta atggatctea ttatttagac gttttatata 2460 aaatgacagc agatgaccaa agatacagtg gatcaactta cctgtctgat cctcgtctta 2520 cagcgaatgg tttcaagata aaattgatac caggagtttc aattactgaa aattacttgg 2580 aaatagaagg aatggctaat tgtctcccat tctatggagc agcagatcta aaagaaattc 2640 ttaatgccat attaaacaga aatgcaaagg aagtttatga atgtagacct cgcaaagtga 2700 taagttattt agagggagaa gcagtgcgtc tatccagaca attacccatg tacttatcaa 2760 aagaggacat ccaagacatt atctacagaa tgaagcacca gtttggaaat gaaattaaag 2820 agtgtgttca tggtcgccca ttttttcatc atttaaccta tcttccagaa actacatgat 2880 taaatatgtt taagaagatt agttaccatt gaaattggtt ctgtcataaa acagcatgag 2940 tctggtttta aattatctct gtattatgtg tcacatggtt attttttaaa tgaggattca 3000 ctgacttgtt tttatattga aaaaagttcc acgtattgta gaaaacgtaa ataaactaat 3060 aac 3063 <210>9 <211> 3145 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ggcgggaaac agcttagtgg gtgtggggtc gcgcattttc ttcaaccagg aggtgaggag 60 gtttcgacat ggcggtgcag ccgaaggaga cgctgcagtt ggagagcgcg gocgaggtcg 120 gcttcgtgcg cttctttcag ggcatgccgg agaagccgac caccacagtg cgccttttcg 180 accggggcga cttctatacg gcgcacggcg aggacgcgct gctggccgcc cgggaggtgt 240 tcaagaccca gggggtgatc aagtacatgg ggccggcagg agcaaagaat ctgcagagtg 300 ttgtgcttag taaaatgaat tttgaatctt ttgtaaaaga tcttcttctg gttcgtcagt 360 atagagttga agtttataag aatagagctg gaaataaggc atccaaggag aatgattggt 420 atttggcata taaggcCtct cctggcaatc tctctcagtt tgaagacatt ctctttggta 480 acaatgatat gtcagcttcc attggtgttg tgggtgttaa aatgtccgca gttgatggcc 540 agagacaggt tggagtCggg tatgtggatt ccatacagag gaaactagga ctgtgtgaat 600 tccctgataa tgatcagttc tceaatcttg aggctctcct catccagatt ggaccaaagg 660 aatgtgttct acccggagga gagactgctg gagacatggg gaaactgaga cagataattc 720 aaagaggagg aattctgatc acagaaagaa aaaaagctga cttttccaca aaagacattt 780 atcaggacct caaccggttg ttgaaaggca aaaagggaga gcagatgaat agtgctgtat 840 tgccagaaat ggagaatcag gttgcagttc catcactgtc tgcggtaatc aagtttttag 900 aactcttatc agatgattcc aactttggac agtttgaact gactactttt gacttcagcc 960 agtatatgaa attggatatt gcagcagtca gagcccttaa cctCtttcag ggttctgttg 1020 aagataccac tggctctcag tctctggctg ccttgctgaa taagtgtaaa acccctcaag 1080 gacaaagact tgttaaccag tggattaagc agcctctcat ggataagaac agaatagagg 1140 agagattgaa tttagtggaa gcttttgtag aagatgcaga attgaggcag actttacaag 1200 aagatttact tcgtcgattc ccagatctta accgacttgc caagaagttt caaagacaag 1260 cagcaaactc acaagattgt taccgactct atcagggtat aaatcaacta cctaatgtta 1320 tacaggctct ggaaaaacat gaaggaaaac accagaaatt attgttggca gtttttgtga 1380 ctcctcttac tgatcttcgt tctgacttct ccaagtttca ggaaatgata gaaacaactt 1440 tagatatgga tcaggtggaa aaccatgaat tccttgtaaa accttcattt gatcctaatc 1500 tcagtgaatt aagagaaata atgaatgact tggaaaagaa gatgcagtca acattaataa 1560 gtgcagccag agatcttggc ttggaccctg gcaaacagat taaactggat tccagtgcac 1620 agtttggata ttactttcgt gtaacctgta aggaagaaaa agtccttegt aacaataaaa 1680 actttagtac tgtagatatc cagaagaatg gtgttaaatt taccaacagc aaattgactt 1740 ctttaaatga agagtatacc aaaaataaaa cagaatatga agaagcccag gatgccattg 1800 ttaaagaaat tgtcaatatt tcttcaggct atgtagaacc aatgcagaca ctcaatgatg 1860 tgttagctca gctagatgct gttgtcagct ttgctcacgt gtcaaatgga goacctgttc 1920 catatgtacg accagccatt ttggagaaag gacaaggaag aattatatta aaagcatcca 1980 ggcatgcttg tgttgaagtt caagatgaaa ttgcatttat tcctaatgac gtatactttg 2040 aaaaagataa acagatgttc cacatcatta ctggccccaa tatgggaggt aaatcaacat 2100 atattogaca aactggggtg atagtactca tggcccaaat tgggtgtttt gtgccatgtg 2160 agtcagcaga agtgtccatt gtggactgca tettagcccg agtaggggct ggtgacagtc 2220 aattgaaagg agtctccacg ttcatggctg aaatgttgga aactgcttct atcctcaggt 2280 ctgcaaccaa agattcatta ataatcatag atgaattggg aagaggaact tctacctacg 2340 atggatttgg gttagcatgg gctatatcag aatacattgc aacaaagatt ggtgcttttt 2400 gcatgtttgc aacccatttt catgaactta ctgccttgge caatcagata ccaactgtta 2460 ataatctaca tgtcacagca ctcaccactg aagagacctt aactatgctt tatcaggtga 2520 agaaaggtgt ctgtgatcaa agttttggga ttcatgttgc agagcttgct aatttcccta 2580 agcatgtaat agagtgtgct aaacagaaag ccctggaact tgaggagttt cagtatattg 2640 gagaatcgca aggatatgat atcatggaac cagcagcaaa gaagtgctat ctggaaagag 2700 agcaaggtga aaaaattatt caggagttcc tgtccaaggt gaaacaaatg ccctttactg 2760 aaatgtcaga agaaaacatc acaataaagt caaaacagct aaaagctgaa gtaatagcaa 2820 ag&amp;ataatag ctttgtaaat gaaatcattt cacgaataaa agttactacg tgaaaaatcc 2880 cagtaatgga atgaaggtaa tattgataag ctattgtctg taatagtttt atattgtttt 2940 atattaaccc tttttccata gtgttaactg tcagtgccca tgggctatca acttaataag 3000 atatttagta atattttact ttgaggacat tttcaaagat ttttattttg aaaaatgaga 3060 gcfcgtaactg aggaetgttt gcaattgaca taggcaataa taagtgatgt gctgaatttt 3120 ataaataaaa tcatgtagtt tgtgg 3145 <210> 10 <211> 2484 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 cttggctctt ctggcgccaa aatgtcgtcc gtggcagggg ttattcggcg gctggacgag 60 acagtggtga accgcatcgc ggcgggggaa gttatccagc ggccagctaa tgctatcaaa 120 gagatgattg agaactgttt agatgcaaaa tccacaagta ttcaagtgat tgttaaagag 180 ggaggcctga agttgattca gatccaagac aatggcaccg ggatcaggaa agaagatctg 240 gatattgtat gtgaaaggtt cactactagt aaactgcagt cctttgagga tttagccagt 300 atttctacct atggctttcg aggtgaggct ttggecagca taagccatgt ggctcatgtt 360 actattacaa cgaaaacagc tgatggaaag tgtgcataca gagcaagtta ctcagatgga 420 aaactgaaag cccctoctaa accatgtgct ggcaatcaag ggacccagat cacggtggag 480 gacctttCtt acaacatagc cacgaggaga aaagctttaa aaaatccaag tgaagaatat 540 gggaaaattt tggaagttgt tggcaggtat tcagtacaca atgcaggcat tagtttctca 600 gttaaaaaac aaggagagac agtagctgat gttaggacac tacccaatgc ctcaaccgtg 660 gacaatattc gctccatctt tggaaatgct gttagtcgag aactgataga aattggatgt 720 gaggataaaa coctagcctt caaaatgaat ggttacatat ccaatgcaaa ctactcagtg 780 aagaagtgca tcttcttact: cttcatcaac catcgtctgg tagaatcaac ttccttgaga 840 aaagccatag aaacagtgta tgcagcctat ttgcccaaaa acacacaccc attcctgtac 900 ctcagtttag aaateagtcc ccagaatgtg gatgttaatg tgcaccccac aaagcatgaa 960 gttcacttcc tgcacgagga gagcatcctg gagcgggtgc agcagcacat cgagagcaag 1020 ctcctgggct ccaattcctc caggatgtac ttcacccaga ctctgctacc aggacttgct 1080 ggcccctctg gggagatggt taaatccaca acaagtctga cctcgtcttc tacttctgga 1140 agtagtgata aggtctatgc ccaccagatg gttcgtacag attcccggga acagaagctt 1200 gatgcatttc tgcagcctct gagcaaaccc ctgtccagtc agccccaggc cattgtcaca 1260 gaggataaga cagatatttc tagtggcagg gctaggcagc aagatgagga gatgcttgaa 1320 ctcccagccc ctgctgaagt ggctgccaaa aatcagagct tggaggggga tacaacaaag 1380 gggacttcag aaatgtcaga gaagagagga cctacttcca gcaaccccag aaagagacat. 1440 cgggaagatt ctgatgtgga aatggtggaa gatgattccc gaaaggaaat gactgcagct 1500

Cgcacccccc ggagaaggat cattaacctc actagtgttt tgagtctcca ggaagaaatt 1560 aatgagcagg gacatgaggt tctccgggag atgttgcata accactcctt cgcgggctgt 1620 gtgaatcctc agtgggcctt ggcacagcac caaaccaagt tataccttct caacaccacc 1680 aagcttagtg aagaactgtt ctaccagata ctcatttatg attttgccaa ttttggtgtt 1740 ctcaggttat cggagccagc accgctcttt gaccttgcca tgcttgcctt agatagtcca 1800 gagagtggct ggacagagga agatggtccc aaagaaggac ttgctgaata cattgttgag 1860 tttctgaaga agaaggctga gatgcttgca gactatttct ctttggaaat tgatgaggaa 1920 'gggaacctga ttggattacc ccttctgatt gacaactatg tgcccccttC ggagggactg 1980 cctatcttca ttcttcgact agccactgag gtgaattggg acgaagaaaa ggaatgtctt 2040 gaaagcctca gtaaagaatg cgctatgttc tattccatcc ggaagcagta catatctgag 2100 gagtcgaccc tctcaggcca gcagagtgaa gtgcctggct ccattccaaa ctcctggaag 2160 tggactgtgg aacacattgt ctataaagcc ttgcgctcac acattctgcc tcctaaacat 2220 ttcacagaag atggaaatat cctgcagctt gctaacctgc ctgatctata caaagtcttt 2280 gagaggtgtt aaatatggtt atttatgcac tgtgggatgt gttcttcttt ctctgtattc 2340 cgatacaaag tgttgtatca aagtgtgata tacaaagtgt accaacataa gtgttggtag 2400 cacttaagac ttatacttgc cttctgatag tattccttta tacacagtgg attgattata 2460 aataaataga tgtgtcttaa cata 2484 <210> 11 <211> 426 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cgaggcggat cgggtgttgc atccatggag cgagctgaga gctcgagtac agaacctgct 60 aaggccacca aacctattga tcggaagtca gtccatcaga tttgctctgg gcaggtggta 120 ctgagtctaa gcactgcggt aaaggagtta gtagaaaaca gtctggatgc tggtgccact 180 aatattgatc taaagcttaa ggactatgga gtggatctta ttgaagtttc agacaatgga 240 tgtggggtag aagaagaaaa cttcgaaggc ttaactctga aacatcacac atctaagatt 300 caagagtttg ccgacctaac tcaggttgaa acttttggct ttcgggggga agctctgagc 360 tcactttgtg cactgagcga tgtcaccatt tctacctgcc acgcatcggc gaaggttgga 420 acttga 426 <210> 12 <211> 1408 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ggcgctccta cctgcaagtg gctagtgcca agtgctgggc cgccgctcct gccgtgcatg 60 ttggggagcc agtacatgca ggtgggctcc acacggagag gggcgcagac ccggtgacag 120

ggctttacct ggtacatcgg catggcgcaa ccaaagcaag agagggtggc gcgtgccaga ISO caccaacggt cggaaaccgc cagacaccaa cggtcggaaa ccgccaagac accaacgctc 240 ggaaaccgcc agacaccaac gctcggaaac cgccagacac caaggctcgg aatccacgcc 300 aggccacgac ggagggcgac tacctccctt ctgaccctgc tgctggcgtt cggaaaaaac 360 gcagtccggt gtgctctgat tggtccaggc tctttgacgt cacggactcg acctttgaca 420 gagccactag gcgaaaagga gagacgggaa gtattttttc cgccccgccc ggaaagggCg 460 gagcacaacg tcgaaagcag ccgttgggag cccaggaggc ggggcgcctg tgggagccgt 540 ggagggaact ttcccagtcc ccgaggcgga tccggtgttg catccttgga gcgagctgag 6 00 aactcgagta cagaacctgc taaggccatc aaacctattg atcggaagtc agtccatcag 660 atttgctctg ggccggtggt accgagtcCa aggccgaatg cggtgaagga gttagtagaa 720 aacagtctgg atgctggtgc cactaatgtt gatctaaagc ttaaggacta tggagtggat 780 ctcattgaag ttteaggcaa tggatgtggg gtagaagaag aaaacttcga aggctttact 840 ctgaaacatc acacatgtaa gattcaagag tttgccgacc taactcaggt ggaaactttt 900 ggctttcggg gggaagctct gagctcactt tgtgcactga gtgatgtcac catttctacc 960 tgccgtgtat cagcgaaggt tgggactcga ctggtgtttg atcactatgg gaaaatcatc 1020 cagaaaaccc cctacccccg ccccagaggg atgacagtca gcgtgaagca gfctattttct 1080 acgctacctg tgcaccataa agaatttcaa aggaatatta agaagaaacg tgcctgcttc 1140 cccttcgcct tctgccgtga ttgtcagttt cctgaggcct ccccagccat gcttcctgta 1200 cagcctgtag aactgactcc tagaagtacc ccaccccacc cctgctcctt ggaggacaac 1260 gtgatcactg tattcagctc tgtcaagaat ggtccaggtt cttctagatg atctgcacaa 1320 atggttcctc tcctccttcc tgatgtctgc cattagcatt ggaataaagt tcctgctgaa 1380 aatccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1408 <210> 13 <211> 1785 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 tttttagaaa ctgatgttta ttttccatca accatttttc catgctgctt aagagaatat 60 gcaagaacag cttaagacca gtcagtggtt gctcctaccc attcagtggc ctgagcagtg 120 gggagctgca gaccagtctt ccgtggcagg ctgagcgctc cagtctCcag tagggaattg 180 ctgaataggc acagagggca cctgtacacc ttcagaccag tctgcaacct caggctgagt 240 agcagtgaac tcaggagcgg gagcagtcca ttcaccctga aattcctcct tggtcactgc 300 cttctcagca gcagcctgct cttctttttc aatctcttca ggatctctgt agaagtacag 360 atcaggcatg acctcccatg ggtgttcacg ggaaatggtg ccacgcatgc gcagaacttc 420 ccgagccagc atccaccaca ttaaacccac tgagtgagct ccettgttgt tgcatgggat 480 ggcaatgtcc acatagcgea gaggagaatc tgtgttacae agcgcaatgg taggtaggtt 540 aacataagat gcctccgtga gaggcgaagg ggcggcggga cccgggcctg gcccgtatgt 600 gtccttggcg gcccagacta ggccgtcgct gtatggtgag cccc&amp;gggag gcggatctgg 660 gcccccagaa ggacacccgc ctggatttgc cccgtagccc ggcccgggcc cctcgggagc 720 agaacagcct tggtgaggtg gacaggaggg gacctcgcga gcagacgcgc gcgccagcga 780 cagcagcccc gccccggcct etcgggagcc ggggggcaga ggctgcggag ccccaggagg 840 gtctatcagc cacagtctct gcatgtttcc aagagcaaca ggaaatgaac acattgcagg 900 ggccagtgtc attcaaagat gtggctgtgg atttcaccca ggaggagtgg cggcaactgg 960 accctgatga gaagatagca tacggggatg tgatgttgga gaactacagc catctagttt 1020 ctgtggggta tgattatcac caagccaaac atcatcatgg agtggaggtg aaggaagtgg 1080 agcagggaga ggagccgtgg ataatggaag gtgaatttcc atgtcaacat agtccagaac 1140 ctgctaaggc catcaaacct attgatcgga agtcagtcca tcagatttgc tctgggccag 1200 tggtactgag tctaagcact gcagtgaagg agttagtaga aaacagtctg gatgctggtg 1260 ccactaatat tgatctaaag cttaaggact atggagtgga tctcattgaa gtttcagaca 1320 atggatgtgg ggtagaagaa gaaaactttg aaggcttaat ctctttcagc tctgaaacat 1380 cacacatgta agattcaaga gtttgccgac ccaactgaag ttgaaacttt cggttttcag 1440 ggggaagctc tgagctcact gtgtgcactg agcgatgtca ccatttctae ctgccacgcg 1500 ttggtgaagg ttgggactcg actggtgttt gatcacgatg ggaaaatcat ccaggaaacc 1560 ccctaccccc accccagagg gaccacagtc agcgtgaagc agttattttc tacgctacct 1620 gtgcgccata aggaatccca aaggaatatt aagaagacgt gcctgcttcc ccttcgcctt 1680 ctgccgtgat tgtcagtttc ctgaggcctc cccagccatg cttcctgtac agcctgcaga 1740 actgtgagtc aattaaacct cttttcttca taaattaaaa aaaaa 1785

<210> 14 <211> 795 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 atgtgtcctt ggcggcctag actaggccgt cgctgtatgg tgagccccag ggaggcggat 60 ctgggccccc agaaggacac ccgcctggat ttgccccgta gcccggcccg ggcccctcgg 120 gagcagaaca gccttggtga ggtggacagg aggggacctc gcgagcagac gcgcgcgcca 180 gcgacagcag ccccgccccg gcctctcggg agccgggggg cagaggctgc ggagccccag 240 gagggtctat cagccacagt ctctgcatgt ttccaagagc aacaggaaat gaacacattg 300 caggggccag tgtcattcaa agatgtggct gtggatttca cccaggagga gtggcggcaa 360 ctggaccctg atgagaagat agcatacggg gatgtgatgt tggagaacta cagccatcta 420 gtttctgtgg ggtatgatta tcaccaagcc aaacatcatc atggagtgga ggtgaaggaa 480 gtggagcagg gagaggagcc gtggataatg gaaggtgaat ttccatgtca acatagtcca 540 gaacctgcta aggccatcaa acctattgat cggaagtcag tccatcagat ttgctctggg 600 ccagtggtac tgagtctaag cactgcagtg aaggagttag tagaaaacag tctggatgct 660 ggtgccacta atattgatct aaagcttaag gactatggag tggatctcat tgaagtttca 720 gacaatggat gtggggtaga agaagaaaac tttgaaggct taatctcttt cagctctgaa 780 acatcacaca tgtaa 795

<210> 15 <211> 769 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 15

Met Ser Leu Arg Ile Lys Ala Leu Asp Ala Ser Val val Asn Lys Ile 1 5 10 15

Ala Ala Gly Glu Ile Ile Ile Ser Pro Val Asn Ala Leu Lys Glu Met 20 25 30

Met Glu Asn Ser Ile Asp Ala Asn Ala Thr Met Ile Asp Ile Leu Val 15 40 45

Lys Glu Gly Gly Ile Lys Val Leu Gin Ile Thr Asp Asn Gly Ser Gly 50 55 60

Ile Asn Lys Ala Asp Leu Pro Ile Leu Cys Glu Arg phe Thr Thr Ser 65 70 75 80

Lys Leu Gin Lys Phe Glu Asp Leu Ser Gin Ile Gin Thr Tyr Gly Phe 85 90 95

Arg Gly Glu Ala Leu Ala Ser ile Ser His Val Ala Arg Val Thr Val 100 10S 110

Thr Thr Lys Val Lys Glu Asp Arg Cys Ala Trp Arg val Ser Tyr Ala 115 120 125

Glu Gly Lys Met Leu Glu Ser Pro Lys Pro Val Ala Gly Lys Asp Gly 130 135 140

Thr Thr Ile Leu Val Glu Asp Leu Phe Phe Asn ile Pro Ser Arg Leu 145 150 155 160

Arg Ala Leu Arg Ser His Asn Asp Glu Tyr Ser Lys Ile Leu Asp Val 165 170 175

Val Gly Arg Tyr Ala Ile His Ser Lys Asp Ile Gly Phe Ser Cys Lys Ιβο 185 190

Lys Phe Gly Asp Ser Asn Tyr Ser Leu Ser Val Lys Pro Ser Tyr Thr 195 200 205

Val Gin Asp Arg Ile Arg Thr Val Phe Asn Lys Ser Val Ala Ser Asn 210 215 220

Leu He Thr Phe His lie Ser Lys Val Glu Asp Leu Asn Leu Glu Ser 225 230 235 240

Val Asp Gly Lys Val Cys Asn Leu Asn Phe He Ser Lys Lys Ser He 245 250 255

Ser Leu Ile Phe Phe Ile Asn Asn Arg Leu Val Thr Cys Asp Leu Leu 260 265 270

Arg Arg Ala Leu Asn Ser Val Tyr Ser Asn Tyr Leu Pro Lys Gly Phe 275 280 285

Arg Pro Phe lie Tyr Leu Gly He Val lie Asp Pro Ala Ala Val Asp 290 295 300

Val Asn Val His Pro Thr Lys Arg Glu Val Arg Phe Leu Ser Gin Asp 305 310 315 320

Glu He lie Glu Lys lie Ala Asn Gin Leu His Ala Glu Leu Ser Ala 325 330 335 lie Asp Thr Ser Arg Thr Phe Lys Ala Ser Ser He Ser Thr Asn Lys 340 345 350

Pro Glu Ser Leu lie Pro Phe Asn Asp Thr lie Glu Ser Asp Arg Asn 355 360 365

Arg Lys Ser Leu Arg Gin Ala Gin Val Val Glu Asn Ser Tyr Thr Thr 370 375 380

Ala Asn Ser Gin Leu Arg Lys Ala Lye Arg Gin Glu Asn Lys Leu val 385 390 395 400

Arg lie Asp Ala Ser Gin Ala Lys He Thr Ser Phe Leu Ser Ser Ser 405 410 415

Gin Gin Phe Asn Phe Glu Gly Ser Ser Thr Lys Arg Gin Leu Ser Glu 420 425 430

Pro Lys Val Thr Asn Val Ser His ser Gin Glu Ala Glu Lys Leu Thr 435 440 445

Leu Asn Glu Ser Glu Gin Pro Arg Asp Ala Asn Thr He Asn Asp Asn 450 455 460

Asp Leu Lys Asp Gin Pro Lys Lys Lys Gin Lys Leu Gly Asp Tyr Lys 465 470 475 480

Val Pro Ser Ile Ala Asp Asp Glu Lys Asn Ala Leu Pro Ile Ser Lys 485 490 495

Asp Gly Tyr Ile Arg Val Pro Lys Glu Arg Val Asn Val Asn Leu Thr 500 505 510

Ser Ile Lys Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp Asp Ser Ile His Arg Glu 515 520 525

Leu Thr Asp Ile Phe Ala Asn Leu Asn Tyr Val Gly Val Val Asp Glu 530 535 540

Glu Arg Arg Leu Ala Ala Ile Gin His Asp Leu Lys Leu Phe Leu Ile 545 550 555 560

Asp Tyr Gly Ser Val Cys Tyr Glu Leu Phe Tyr Gin Ile Gly Leu Thr 565 570 575

Asp Phe Ala Asn Phe Gly Lys Ile Asn Leu Gin Ser Thr Asn Val Ser 580 585 590

Asp Asp Ile Val Leu Tyr Asn Leu Leu Ser Glu Phe Asp Glu Leu Asn 595 600 605

Asp Asp Ala Ser Lys Glu Lys Ile Ile Ser Lys Ile Trp Asp Met Ser 610 615 620

Ser Met Leu Asn Glu Tyr Tyr Ser Ile Glu Leu Val Asn Asp Gly Leu $25 630 635 640

Asp Asn Asp Leu Lys Ser Val Lys Leu Lys Ser Leu Pro Leu Leu Leu 645 650 655

Lys Gly Tyr Ile Pro Ser Leu Val Lys Leu Pro Phe Phe Ile Tyr Arg 660 665 670

Leu Gly Lys Glu Val Asp Trp Glu Asp Glu Gin Glu Cys Leu Asp Gly 675 680 685

Ile Leu Arg Glu Ile Ala Leu Leu Tyr Ile Pro Asp Met Val Pro Lys 690 695 700

Val Asp Thr Leu Asp Ala Ser Leu Ser Glu Asp Glu Lys Ala Gin Phe 705 710 715 720

Ile Asn Arg Lys Glu His Ile Ser Ser Leu Leu Glu His Val Leu Phe 725 730 735

Pro Cys Ile Lys Arg Arg Phe Leu Ala Pro Arg His Ile Leu Lys Asp 740 745 750

Val Val Glu Ile Ala Asn Leu Pro Asp Leu Tyr Lys Val Phe Glu Arg 755 760 765

Cys <210> 16 <211> 859 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16

Met Glu Gin Thr Glu Gly Val Ser Thr Glu Cys Ala Lys Ala lie

Lys 15 10 35

Pro lie Asp Gly Lys Ser Val His Gin Ile Cys Ser Gly Gin Val He 20 25 30

Leu Ser Leu Ser Thr Ala Val Lys Glu Leu Ile Glu Asn Ser Val Asp 35 40 45

Ala Gly Ala Thr Thr lie Asp Leu Arg Leu Lys Asp Tyr Gly Val Asp 50 55 60

Leu He Glu Val Ser Asp Asn Gly Cys Gly Val Glu Glu Glu Asn Phe 65 70 75 80

Glu Gly Leu Ala Leu Lys His His Thr Ser Lys lie Gin Glu Phe Ala 85 90 95

Asp Leu Thr Gin Val Glu Thr Phe Gly Phe Arg Gly Glu Ala Leu Ser 100 105 no

Ser Leu Cys Ala Leu Ser Asp Val Thr He Ser Thr Cys His Gly Ser 115 120 125

Ala Ser Val Gly Thr Arg Leu Val Phe Asp His Asn Gly Lys lie Thr 130 135 140

Gin Lys Thr Pro Tyr Pro Arg Pro Lys Gly Thr Thr Val Ser Val Gin 145 150 155 160

His Leu Phe Tyr Thr Leu Pro Val Arg Tyr Lya Glu Phe Gin Arg Asn 165 170 175 lie Lys Lys Glu Tyr Ser Lys Met Val Gin val Leu Gin Ala Tyr Cys 180 185 190 lie lie Ser Ala Gly Val Arg Val Ser Cys Thr Asn Gin Leu Gly Gin 195 200 205

Gly Lys Arg His Ala Val Val Cys Thr Ser Gly Thr Ser Gly Met Lys 210 215 220

Glu Asn lie Gly Ser Val Phe Gly Gin Lys Gin Leu Gin Ser Leu lie 225 230 235 240

Pro Phe Val Gin Leu Pro Pro Ser Asp Ala Val Cys Glu Glu Tyr Gly 245 250 255

Leu Ser Thr Ser Gly Arg His Lys Thr Phe Ser Thr Phe Arg Ala Ser 260 265 270

Phe His Ser Ala Arg Thr Ala Pro Gly Gly Val Gin Gin Thr Gly Ser 275 280 285

Phe Ser Ser Ser Ile Arg Gly Pro Val Thr Gin Gin Arg ser Leu Ser 290 295 300

Leu Ser Met Arg Phe Tyr His Met Tyr Asn Arg His Gin Tyr pro Phe 305 310 315 320

Val Val Leu Asn Val Ser Val Asp Ser Glu Cys Val Asp Ile Asn val 325 330 335

Thr Pro Asp Lys Arg Gin Ile Len Leu Gin Glu Glu Lys Leu Leu Leu 340 345 350

Ala Val Leu Lys Thr Ser Leu Ile Gly Met Phe Asp Ser Asp Ala Asn 355 360 365

Lys Leu Asn Val Asn Gin Gin Pro Leu Leu Asp Val Glu Gly Asn Leu 370 375 380 val Lys Leu His Thr Ala Glu Leu Glu Lys Pro Val Pro Gly Lys

Gin 385 390 395 400

Asp Asn Ser Pro Ser Leu Lys Ser Thr Ala Asp Glu Lys Arg Val Ala 405 410 415

Ser Ile Ser Arg Leu Arg Glu Ala Phe Ser Leu His Pro Thr Lys Glu 420 425 430

Ile Lys Ser Arg Gly Pro Glu Thr Ala Glu Leu Thr Arg Sex Phe Pro 435 440 445

Ser Glu Lys Arg Gly Val Leu Ser Ser Tyr Pro Ser Asp Val Ile Ser 450 455 460

Tyr Arg Gly Leu Arg Gly Ser Gin Asp Lys Leu val Ser Pro Thr Asp 465 470 475 480

Ser Pro Gly Asp Cys Met Asp Arg Glu Lys ile Glu Lys Asp Ser Gly 485 490 495

Leu Ser Ser Thr Ser Ala Gly Ser Glu Glu Glu Phe Ser Thr Pro Glu 500 505 510

Val Ala Ser Ser Phe Ser Ser Asp Tyr Asn Val Ser Ser Leu Glu Asp 515 520 525

Arg Pro Ser Gin Glu Thr Ile Asn Cys Gly Asp Leu Asp Cys Arg Pro 530 535 540

Pro Gly Thr Gly Gin Ser Leu Lys Pro Glu Asp His Gly Tyr Gin

Cys 545 550 555 560

Lys Ala Leu Pro Leu Ala Arg Leu Ser Pro Thr Asn Ala Lys Arg Phe S65 570 575

Lys Thr Glu Glu Arg Pro Ser Asn Val Asn lie Ser Gin Arg Leu Pro 580 585 590

Gly Pro Gin Ser Thr Ser Ala Ala Glu Val Asp Val Ala Ile Lys Met 595 600 605

Asn Lys Arg lie Val Leu Leu Glu Phe Ser Leu Ser Ser Leu Ala Lys 610 615 620

Arg Met Lys Gin Leu Gin His Leu Lye Ala Gin Asn Lys His Glu Leu 625 630 635 640

Ser Tyr Arg Lys Phe Arg Ala Lys lie Cys Pro Gly Glu Asn Gin Ala 645 650 655

Ala Glu Asp Glu Leu Arg Lys Glu He Ser Lys Ser Met Phe Ala Glu 660 665 670

Met Glu He Leu Gly Gin Phe Asn Leu Gly Phe lie val Thr Lys Leu 675 680 685

Lys Glu Asp Leu Phe Leu Val Asp Gin His Ala Ala Asp Glu Lys Tyr 690 695 700

Asn Phe Glu Met Leu Gin Gin His Thr Val Leu Gin Ala Gin Arg Leu 705 710 715 720 lie Thr Pro Gin Thr Leu Asn Leu Thr Ala Val Asn Glu Ala Val Leu 725 730 735 lie Glu Asn Leu Glu He Phe Arg Lys Asn Gly Phe Asp Phe Val lie 740 745 750

Asp Glu Asp Ala Pro Val Thr Glu Arg Ala Lys Leu lie Ser Leu Pro 755 760 765

Thr Ser Lys Asn Trp Thr Phe Gly Pro Gin Asp lie Asp Glu Leu He 770 775 780

Phe Met Leu Ser Asp Ser Pro Gly Val Met Cys Arg Pro Ser Arg Val 785 790 795 800

Arg Gin Met Phe Ala Ser Arg Ala Cys Arg Lys Ser Val Met He Gly 80S 810 815

Thr Ala Leu Asn Ala Ser Glu Met Lys Lys Leu He Thr His Met Gly 820 825 830

Glu Met Asp His Pro Trp Asn Cys Pro His Gly Arg Pro Thr Met Arg 835 840 845

His Val Ala Asn Leu Asp Val lie Ser Gin Asn 850 855 <210> 17 <211> 932 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17

Met Lys Gin Leu Pro Ala Ala Thr Val Arg Leu Leu Ser Ser Ser Gin 15 10 15

Ile Ile Thr Ser Val Val Ser Val Val Lys Glu Leu ile Glu Asn Ser 20 25 30

Leu Asp Ala Gly Ala Thr Ser Val Asp Val Lys Leu Glu Asn Tyr Gly 35 40 45

Phe Asp Lys Ile Glu Val Arg Asp Asn Gly Glu Gly Ile Lys Ala Val 50 55 60

Asp Ala Pro Val Met Ala Met Lys Tyr Tyr Thr Ser Lys Ile Asn Ser

65 70 75 SO

His Glu Asp Leu Glu Asn Leu Thr Thr Tyr Gly phe Arg Gly Glu Ala 85 90 95

Leu Gly Ser Ile Cys Cys Ile Ala Glu Val Leu Ile Thr Thr Arg Thr

100 105 HO

Ala Ala Asp Asn Phe Ser Thr Gin Tyr Val Leu Asp Gly Ser Gly His 115 120 125

Ile Leu Ser Gin Lys Pro Ser His Leu Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 130 135 140

Ala Leu Arg Leu Phe Lys Asn Leu pro Val Arg Lys Gin Phe Tyr Ser 145 150 155 160

Thr Ala Lys Lys Cys Lys Asp Glu Ile Lys Lys Ile Gin Asp Leu Leu 165 170 175

Met Ser Phe Gly Ile Leu Lys Pro Asp Leu Arg Ile Val Phe Val His 180 185 190

Asn Lys Ala Val Ile Trp Gin Lys Ser Arg Val Ser Asp His Lys Met 195 200 205

Ala Leu Met Ser Val Leu Gly Thr Ala Val Met Asn Asn Met Glu Ser 210 215 220

Phe Gin Tyr His Ser Glu Glu Ser Gin Ile Tyr Leu Ser Gly Phe Leu 225 230 235 240

Pro Lys Cys Asp Ala Asp His Ser Phe Thr Ser Leu Ser Thr Pro Glu 245 250 255

Arg Ser Phe Ile Phe Ile Asn Ser Arg Pro val His Gin Lys Asp Ile 260 265 270

Leu Lys Leu Ile Arg His His Tyr Asn Leu Lys Cys Leu Lys Glu Scjt 275 280 285

Thr Arg Leu Tyr Pro Val Phe Phe Leu Lys Ile Asp Val Pro Thr Ala 290 295 300

Asp Val Asp Val Asn Leu Thr Pro Asp Lys Ser Gin Val Leu Leu Gin 305 310 315 320

Asn Lys Glu Ser Val Leu Ile Ala Leu Glu Asn Leu Met Thr Thr Cys 325 330 335

Tyr Gly Pro Leu Pro Ser Thr Αεη Ser Tyr Glu Asn Asn Lys Thr Asp 340 345 350

Val Ser Ala Ala Asp Ile Val Leu Ser Lys Thr Ala Glu Thr Asp Val 355 360 365

Leu Phe Asn Lys Val Glu Ser Ser Gly Lys Asn Tyr Ser Asn Val Asp 370 375 380

Thr Ser Val Ile Pro Phe Gin Asn Asp Met His Asn Asp Glu Ser Gly 385 390 395 400

Lys Asn Thr Asp Asp Cys Leu Asn His Gin Ile Ser Ile Gly Asp Phe 405 410 415

Gly Tyr Gly His Cys Ser Ser Glu Ile Ser Asn Ile Asp Lys Asn Thr 420 425 430

Lys Asn Ala Phe Gin Asp Ile Ser Met Ser Asn Val Ser Trp Glu Asn 435 440 445

Ser Gin Thr Glu Tyr Ser Lys Thr Cys Phe Ile Ser Ser Val Lys Kis 450 4S5 460

Thr Gin Ser Glu Asn Gly Asn Lys Asp His Ile Asp Glu Ser Gly Glu 465 470 475 480

Asn Glu Glu Glu Ala Gly Leu Glu Asn Ser Ser Glu Ile Ser Ala Asp 485 490 495

Glu Trp Ser Arg Gly Asn Ile Leu Lys Asn Ser Val Gly Glu Asn Ile 500 505 510

Glu Pro Val Lys Ile Leu Val Pro Glu Lys Ser Leu Pro Cys Lys Val 515 520 525

Ser Asn Asn Asn Tyr Pro Ile Pro Glu Gin Met Asn Leu Asn Glu Asp 530 535 540

Ser Cys Asn Lys Lys Ser Asn Val Ile Asp Asn Lys Ser Gly Lys Val 545 550 555 560

Thr Ala Tyr Asp Leu Leu Ser Asn Arg Val Ile Lys Lys Pro Met

Ser 565 570 575

Ala Ser Ala Leu Phe Val Gin Asp His Arg Pro Gin Phe Leu ile Glu 580 585 590

Asn Pro Lys Thr Ser Leu Glu Asp Ala Thr Leu Gin Ile Glu Glu Leu 595 600 605

Trp Lys Thr Leu Ser Glu Glu Glu Lys Leu Lys Tyr Glu Glu Lys

Ala 610 615 620

Thr Lys Asp Leu Glu Arg Tyr Asn Ser Gin Met Lys Arg Ala Ile Glu 625 630 635 640

Gin Glu Ser Gin Met Ser Leu Lys Asp Gly Arg Lys Lys Ile Lys Pro 645 650 655

Thr Ser Ala Trp Asn Leu Ala Gin Lys His Lys Leu Lys Thr Ser Leu 660 665 670

Ser Asn Gin Pro Lys Leu Asp Glu Leu Leu Gin Ser Gin Ile Glu Lys 675 680 685

Arg Arg Ser Gin Asn Ile Lys Met Val Gin Ile Pro Phe Ser Met Lys 690 695 700

Asn Leu Lys Ile Asn Phe Lys Lys Gin Asn Lys val Asp Leu Glu Glu 705 710 715 720

Lys Asp Glu Pro Cys Leu Ile His Asn Leu Arg phe Pro Asp Ala Trp 725 730 735

Leu Met Thr Ser Lye Thr Glu Val Met Leu Leu Asn Pro Tyr Arg Val 740 745 750

Glu Glu Ala Leu Leu Phe Lys Arg Leu Leu Glu Asn His Lys Leu Pro 755 760 765

Ala Glu Pro Leu Glu Lys Pro Ile Met Leu Thr Glu Ser Leu Phe Asn 770 775 780

Gly Ser His Tyr Leu Asp Val Leu Tyr Lys Met Thr Ala Asp Asp Gin 785 790 795 800

Arg Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Leu Ser Asp Pro Arg Leu Thr Ala Asn 805 810 815

Gly Phe Lys Ile Lys Leu Ile Pro Gly Val Ser ile Thr Glu Asn Tyr 820 825 830

Leu Glu Ile Glu Gly Met Ala Asn Cys Leu Pro Phe Tyr Gly Val Ala 835 840 845

Asp Leu Lys Glu Ile Leu Asn Ala Ile Leu Asn Arg Asn Ala Lys Glu 850 855 860

Val Tyr Glu Cys Arg Pro Arg Lys Val Ile Ser Tyr Leu Glu Gly

Glu 865 870 875 880

Ala Val Arg Leu Ser Arg Gin Leu Pro Met Tyr Leu Ser Lys Glu Asp 885 890 895

Ile Gin Asp ile Ile Tyr Arg Met Lys Mis Gin Phe Gly Asn Glu Ile 900 905 910

Lys Glu Cys Val His Gly Arg Pro Phe Phe His His Leu Thr Tyr Leu 915 920 925

Pro Glu Thr Thr 930 <210> 18 <211> 932 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18

Met Lys Gin Leu Pro Ala Ala Thr Val Arg Leu Leu Ser Ser Ser Gin 15 10 15

Ile Ile Thr Ser Val Val Ser Val val Lys Glu Leu Ile Glu Asn Ser 20 25 30

Leu Asp Ala Gly Ala Thr Ser Val Asp Val Lys Leu Glu Asn Tyr Gly 35 40 45

Phe Asp Lys Ile Glu Val Arg Asp Asn Gly Glu Gly Ile Lys Ala Val 50 55 60

Asp Ala Pro Val Met Ala Met Lys Tyr Tyr Thr Ser Lys Ile Asn Ser 65 70 75 80

His Glu Asp Leu Glu Asn Leu Thr Thr Tyr Gly Phe Arg Gly Glu Ala 85 90 95

Leu Gly Ser Ile Cys Cys Ile Ala Glu Val Leu Ile Thr Thr Arg Thr 100 105 110

Ala Ala Asp Asn Phe Sex Thr Gin Tyr Val Leu Asp Gly Ser Gly His 115 120 125

Ile Leu Ser Gin Lys Pro Ser His Leu Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 130 135 140

Ala Leu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Pro Val Arg Lys Gin Phe Tyr

Ser 145 150 155 160

Thr Ala Lys Lys Cys Lys Asp Glu Ile Lys Lys Ile Gin Asp Leu Leu 165 170 175

Met Ser Phe Gly Ile Leu Lys Pro Asp Leu Arg Ile val Phe Val His lao 185 190

Asn Lys Ala Val Ile Trp Gin Lys Ser Arg Val Ser Asp His Lys

Met

195 200 20S

Ala Leu Met Ser Val Leu Gly Thr Ala Val Met Asn Asn Met Glu Ser 210 215 220

Phe Gin Tyr His Ser Glu Glu Ser Gin Ile Tyr Leu Ser Gly Phe Leu 225 230 235 240

Pro Lys Cys Asp Ala Asp His Ser Phe Thr Ser Leu Ser Thr Pro Glu 245 250 255

Arg Ser Phe Ile Phe Ile Asn Ser Arg Pro Val His Gin Lys Asp ile 260 265 270

Leu Lys Leu Ile Arg His His Tyr Asn Leu Lys Cys Leu Lys Glu Ser 275 280 285

Thr Arg Leu Tyr Pro Val Phe Phe Leu Lys Ile Asp Val pro Thr Ala 290 295 300

Asp Val Asp Val Asn Leu Thr Pro Asp Lys Ser Gin Val Leu Leu Gin 305 310 315 320

Asn Lys Glu Ser Val Leu ile Ala Leu Glu Asn Leu Met Thr Thr Cys 325 330 335

Tyr Gly Pro Leu Pro Ser Thr Asn Ser Tyr Glu Asn Asn Lys Thr Asp 340 345 350

Val Ser Ala Ala Asp Ile Val Leu Ser Lys Thr Ala Glu Thr Asp

Val 355 360 365

Leu Phe Asn Lys Val Glu Ser Ser Gly Lys Asn Tyr Ser Asn Val Asp 370 375 380

Thr Ser Val Ile Pro Phe Gin Asn Asp Met His Asn Asp Glu Ser Gly 385 390 395 400

Lys Asn Thr Asp Asp Cys Leu Asn His Gin Ile Ser Ile Gly Asp

Phe 405 4io 415

Gly Tyr Gly His Cys Ser Ser Glu Ile Ser Asn Ile Asp Lys Asn Thr 420 425 430

Lys Asn Ala Phe Gin Asp Ile Ser Met Ser Asn Val Ser Trp Glu Asn 435 440 445 ser Gin Thr Glu Tyr Sex Lys Thr cys Phe Ile Ser Ser val Lys

His 450 455 460

Thr Gin Ser Glu Asn Gly Asn Lys Asp His Ile Asp Glu Ser Gly Glu 465 470 475 480

Asn Glu Glu Glu Ala Gly Leu Glu Asn Ser Ser Glu Ile Ser Ala Asp 485 490 495

Glu Trp Ser Arg Gly Asn Ile Leu Lys Asn Ser Val Gly Glu Asn Ile 500 505 510

Glu Pro Val Lys Ile Leu Val Pro Glu Lys Ser Leu Pro Cys Lys Val 515 520 525

Ser Asn Asn Asn Tyr Pro Ile Pro Glu Gin Met Asn Leu Asn Glu Asp 530 535 540

Ser Cys Asn Lys Lys Ser Asn Val Ile Asp Asn Lys Ser Gly Lys val 545 550 555 560

Thr Ala Tyr Asp Leu Leu Ser Asn Arg Val Ile Lys Lys Pro Met Ser 565 570 575

Ala Ser Ala Leu Phe Val Gin Asp His Arg Pro Gin Phe Leu Ile Glu 580 585 590

Asn Pro Lys Thr Ser Leu Glu Asp Ala Thr Leu Gin Ile Glu Glu Leu

595 600 60S

Trp Lys Thr Leu Ser Glu Glu Glu Lys Leu Lya Tyr Glu Glu Lys Ala 610 615 620

Thr Lys Asp Leu Glu Arg Tyr Asn Ser Gin Met Lys Arg Ala Ile Glu 625 630 635 £40

Gin Glu Ser Gin Met Ser Leu Lys Asp Gly Arg Lys Lys Ile Lys Pro 645 650 655

Thr Ser Ala Trp Asn Leu Ala Gin Lys His Lys Leu Lys Thr Ser Leu 660 665 670

Ser Asn Gin Pro Lys Leu Asp Glu Leu Leu Gin Ser Gin Ile Glu Lys 675 680 685

Arg Arg Ser Gin Asn Ile Lys Met Val Gin Ile Pro Phe Ser Miet Lys 690 695 700

Asn Leu Lys Ile Asn Phe Lys Lys Gin Asn Lys Val Asp Leu Glu Glu 705 710 715 720

Lys Asp Glu Pro Cys Leu Ile His Asn Leu Arg Phe Pro Asp Ala Trp 725 730 735

Leu Met Thr Ser Lys Thr Glu Val Met Leu Leu Asn Pro Tyr Arg Val 740 745 750

Glu Glu Ala Leu Leu Phe Lys Arg Leu Leu Glu Asn His Lys Leu Pro 755 760 765

Ala Glu Pro Leu Glu Lys Pro Ile Met Leu Thr Glu Ser Leu Phe

Asn 770 775 780

Gly Ser His Tyr Leu Asp Val Leu Tyr Lys Met Thr Ala Asp Asp Gin 785 790 795 800

Arg Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Leu Ser Asp Pro Arg Leu Thr Ala Asn 805 810 815

Gly Phe Lys Ile Lys Leu Ile Pro Gly Val Ser Ile Thr Glu Asn Tyr 820 825 830

Leu Glu Ile Glu Gly Met Ala Asn Cys Leu Pro Phe Tyr Gly Val Ala 835 840 845

Asp Leu Lys Glu Ile Leu Asn Ala Ile Leu Asn Arg Asn Ala Lys Glu 850 855 860

Val Tyr Glu Cys Arg Pro Arg Lys Val Ile Ser Tyr Leu Glu Gly Glu 865 870 875 880

Ala Val Arg Leu Ser Arg Gin Leu Pro Met Tyr Leu Ser Lys Glu Asp 885 890 895

Ile Gin Asp Ile Ile Tyr Arg Met Lys His Gin phe Gly Asn Glu Ile 900 905 910

Lys Glu Cys Val His Gly Arg Pro Phe Phe His His Leu Thr Tyr Leu 915 920 925

Pro Glu Thr Thr 930 <210> 19 <211> 934 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19

Met Ala Val Gin Pro Lys Glu Thr Leu Gin Leu Glu Ser Ala Ala Glu 15 10 15

Val Gly Phe Val Arg Phe Phe Gin Gly Met Pro Glu Lys Pro Thr Thr 20 25 30

Thr Val Arg Leu Phe Asp Arg Gly Asp Phe Tyr Thr Ala His Gly Glu 35 40 45

Asp Ala Leu Leu Ala Ala Arg Glu Val Phe Lys Thr Gin Gly Val Ile 50 55 60

Lys Tyr Met Gly Pro Ala Gly Ala Lys Asn Leu Gin Ser Val Val Leu 65 70 75 80

Ser Lys Met Asn Phe Glu Ser Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu Val Arg 85 90 95

Gin Tyr Arg val Glu Val Tyr Lys Asn Arg Ala Gly Asn Lys Ala Ser 100 105 110

Lys Glu Asn Asp Trp Tyr Leu Ala Tyr Lys Ala Ser Pro Gly Asn Leu 115 120 125

Ser Gin Phe Glu Asp 11« Leu Phe Gly Asn Asn Asp Met Ser Ala Ser 130 135 140

Ile Gly Val Val Gly Val Lys Met Ser Ala Val Asp Gly Gin Arg

Gin 145 150 155 160

Val Gly Val Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gin Arg Lys Leu Gly Leu Cye 165 170 175

Glu Phe Pro Asp Asn Asp Gin Phe Ser Asn Leu Glu Ala Leu Leu Ile 180 185 190

Gin Ile Gly Pro Lys Glu Cys Val Leu Pro Gly Gly Glu Thr Ala Gly 195 200 205

Asp Met Gly Lys Leu Arg Gin Ile Ile Gin Arg Gly Gly ile Leu Ile 210 215 220

Thr Glu Arg Lys Lys Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ile Tyr Gin Asp 225 230 235 240

Leu Asn Arg Leu Leu Lys Gly Lya Lys Gly Glu Gin Met Asn Ser Ala 245 250 255

Val Leu Pro Glu Met Glu Asn Gin Val Ala Val Ser Ser Leu Ser Ala 260 265 270

Val Ile Lys Phe Leu Glu Leu Leu Ser Asp Asp Ser Asn Phe Gly Gin 2T5 280 285

Phe Glu Leu Thr Thr Phe Asp Phe Ser Gin Tyr Met Lys Leu Asp Ile 290 295 300

Ala Ala Val Arg Ala Leu Asn Leu Phe Gin Gly Ser Val Glu Asp Thr 305 310 315 320

Thr Gly Ser Gin Ser Leu Ala Ala Leu Leu Asn Lys Cys Lys Thr Pro 325 330 335

Gin Gly Gin Arg Leu Val Asn Gin Trp Ile Lys Gin Pro Leu Met Asp 340 345 350

Lys Asn Arg ile Glu Glu Arg Leu Asn Leu val Glu Ala Phe Val Glu 355 360 365

Asp Ala Glu Leu Arg Gin Thr Leu Gin Glu Asp Leu Leu Arg Arg Phe 370 375 380

Pro Asp Leu Asn Arg Leu Ala Lys Lys Phe Gin Arg Gin Ala Ala Asn 385 390 395 400

Leu Gin Asp Cys Tyr Arg Leu Tyr Gin Gly He Asn Gin Leu Pro Asn 405 410 415

Val lie Gin Ala Leu Glu Lys His Glu Gly Lys His Gin Lys Leu Leu 420 425 430

Leu Ala Val Phe Val Thr Pro Leu Thr Asp Leu Arg Ser Asp Phe Ser 435 440 445

Lys Phe Gin Glu Met He Glu Thr Thr Leu Asp Met Asp Gin Val Glu 450 455 400

Asn His Glu Phe Leu Val Lys Pro Ser Phe Asp Pro Asn Leu Ser Glu 465 470 475 480

Leu Arg Glu He Met Asn Asp Leu Glu Lys Lys Met Gin Ser Thr Leu 485 490 495

He Ser Ala Ala Arg Asp Leu Gly Leu Asp Pro Gly Lys Gin lie Lys 500 505 510

Leu Asp Ser Ser Ala Gin Phe Gly Tyr Tyr Phe Arg val Thr Cys Lys 515 520 525

Glu Glu Lys Val Leu Arg Asn Asn Lys Asn Phe Ser Thr Val Asp He 530 535 540

Gin Lys Asn Gly Val Lys Phe Thr Asn Ser Lys Leu Thr Ser Leu Asn 545 550 S55 560

Glu Glu Tyr Thr Lys Asn Lys Thr Glu Tyr Glu Glu Ala Gin Asp Ala 565 570 575 lie val Lys Glu He Val Asn He Ser Ser Gly Tyr Val Glu Pro Met 580 585 590

Gin Thr Leu Asn Asp Val Leu Ala Gin Leu Asp Ala Val Val Ser Phe 595 600 605

Ala His Val Ser Asn Gly Ala Pro Val Pro Tyr Val Arg Pro Ala lie 610 £15 620

Leu Glu Lys Gly Gin Gly Arg lie lie Leu Lys Ala Ser Arg His

Ala 625 630 635 640

Cys Val Glu Val Gin Asp Glu lie Ala Phe He Pro Asn Asp Val Tyr 645 650 655

Phe Glu Lys Asp Lys Gin Met Phe His lie lie Thr Gly Pro Asn Met 660 665 670

Gly Gly Lys Sex Thr Tyr lie Arg Gin Thr Gly Val lie Val Leu Met 675 680 685

Ala Gin He Gly Cys Phe Val Pro Cys Glu Ser Ala Glu Val Ser lie 690 695 700

Val A3p Cys Ile Leu Ala Arg Val Gly Ala Gly Asp Ser Gin Leu Lys 705 710 715 720

Gly Val Ser Thr Phe Met Ala Glu Met Leu Glu Thr Ala Ser Ile Leu 725 730 735

Arg Ser Ala Thr Lys Asp Ser Leu Ile Ile Ile Asp Glu Leu Gly Arg 740 745 750

Gly Thr Ser Thr Tyr Asp Gly Phe Gly Leu Ala Trp Ala Ile Ser Glu 755 760 765

Tyr Ile Ala Thr Lys Ile Gly Ala Phe Cys Met Phe Ala Thr His Phe 770 775 780

His Glu Leu Thr Ala Leu Ala Asn Gin Ile Pro Thr Val Asn Asn Leu 785 790 795 800

His Val Thr Ala Leu Thr Thr Glu Glu Thr Leu Thr Met Leu Tyr Gin. 805 818 815

Val Lys Lys Gly Val Cys Asp Gin Ser Phe Gly Ile His Val Ala Glu 820 825 830

Leu Ala Asn Phe Pro Lys His Val Ile Glu Cys Ala Lys Gin Lys Ala 835 840 845

Leu Glu Leu Glu Glu Phe Gin Tyr Ile Gly Glu Ser Gin Gly Tyr Asp 850 855 860

Ile Met Glu Pro Ala Ala Lys Lys Cys Tyr Leu Glu Arg Glu Gin Gly 865 870 875 880

Glu Lys Ile Ile Gin Glu Phe Leu Ser Lys Val Lys Gin Met Pro Phe 885 890 895

Thr Glu Met Ser Glu Glu Asn Ile Thr Ile Lys Leu Lys Gin Leu Lys 900 905 910

Ala Glu Val Ile Ala Lys Asn Asn Ser Phe Val Asn Glu Ile Ile

Ser 915 920 925

Arg Ile Lys Val Thr Thr 930 <210> 20 <211> 756 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20

Met Ser Phe Val Ala Gly Val Ile Arg Arg Leu Asp Glu Thr Val val 15 10 15

Asn Arg Ha Ala Ala Gly Glu Val Ile Gin Arg Pro Ala Asn Ala Ile 20 25 30

Lys Glu Met Ile Glu Asn Cys Leu Asp Ala Lys Ser Thr Ser Ile Gin 35 40 45

Val Ile Val Lys Glu Gly Gly Leu Lys Leu ile Gin Ile Gin Asp Asn 50 55 60

Gly Thr Gly Ile Arg Lys Glu Asp Leu Asp Ile Val Cys Glu Arg Phe 65 70 75 80

Thr Thr Ser Lys Leu Gin Ser Phe Glu Asp Leu Ala Ser Ile Ser Thr Θ5 90 95

Tyr Gly Phe Arg Gly Glu Ala Leu Ala Ser Ile Ser His Val Ala His 100 IDS 110

Val Thr Ile Thr Thr Lys Thr Ala Asp Gly Lys Cys Ala Tyr Arg Ala 115 120 125

Ser Tyr Ser Asp Gly Lys Leu Lys Ala Pro Pro Lys Pro Cys Ala Gly 130 135 140

Aen Gin Gly Thr Gin Ile Thr Val Glu Asp Leu Phe Tyr Asn Ile Ala 145 150 155 160

Thr Arg Arg Lys Ala Leu Lys Asn Pro Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Ile 165 170 175

Leu Glu Val Val Gly Arg Tyr Ser Val His Asn Ala Gly Ile Ser Phe 180 185 190

Ser Val Lys Lys Gin Gly Glu Thr Val Ala Asp Val Arg Thr Leu Pro 195 200 205

Asn Ala ser Thr Val Asp Asn Ile Arg Ser Ile Phe Gly Asn Ala Val 210 215 220 Ser Arg Glu Leu Ile Glu Ile Gly Cys Glu Asp Lys Thr Leu Ala Phe 225 230 235 240

Lys Met Asn Gly Tyr ile Ser Asn Ala Asn Tyr Ser Val Lys Lys Cys 245 250 2S5

Ile Phe Lau Leu phe ile Asn His Arg Leu Val Glu Ser Thr Ser Leu 260 265 270 ATG Lys Ala Ile Glu Thr Val Tyr Ala Ala Tyr Leu Pro Lys Asn

Thr 275 280 2B5

His Pro phe Leu Tyr Leu Ser Leu Glu ile Ser Pro Gin Asn Val Asp 250 295 300

Val Asn Val His Pro Thr Lys His Glu Val His Pbe Leu His Glu Glu 305 310 315 320

Ser Ile Leu Glu Arg Val Gin Gin His Ile Glu Ser Lys Leu Leu Gly 325 330 335

Ser Asn Ser Ser Arg Met Tyr Phe Thr Gin Thr Leu Leu Pro Gly Leu 340 345 350

Ala Gly Pro Ser Gly Glu Met Val Lys Ser Thr Thr Ser Leu Thr Ser 355 360 365

Ser Ser Thr Ser Gly Ser Ser Asp Lys Val Tyr Ala His Gin Met Val 370 375 380

Arg Thr Asp Ser Arg Glu Gin Lye Leu Asp Ala Phe Leu Gin Pro

Leu 385 390 395 400

Ser Lys Pro Leu Ser Ser Gin Pro Gin Ala Ile Val Thr Glu Asp Lys 405 410 415

Thr Asp Ile Ser Ser Gly Arg Ala Arg Gin Gin Asp Glu Glu Met

Leu 420 425 430

Glu Leu Pro Ala Pro Ala Glu Val Ala Ala Lys Asn Gin Ser Leu Glu 435 440 445

Gly Asp Thr Thr Lys Gly Thr Ser Glu Met Ser Glu Lys Arg Gly Pro 450 455 460

Thr Ser Ser Asn Pro Arg Lys Arg His Arg Glu Asp Ser Asp Val Glu 465 470 475 480

Met Val Glu Asp Asp Ser Arg Lys Glu Met Thr Ala Ala Cys Thr Pro 485 490 495

Arg Arg Arg Ile Ile Asn Leu Thr Ser Val Leu Ser Leu Gin Glu Glu 500 505 510

Ile Asn Glu Gin Gly His Glu Val Leu Arg Glu Met Leu His Asn His 515 520 525

Ser Phe val Gly Cys val Asn Pro Gin Trp Ala Leu Ala Gin His Gin 530 535 540

Thr Lys Leu Tyr Leu Leu Asn Thr Thr Lys Leu Ser Glu Glu Leu Phe 545 550 555 560

Tyr Gin Ile Leu Ile Tyr Asp Phe Ala Asn phe Gly Val Leu Arg Leu 565 570 575

Ser Glu Pro Ala Pro Leu Phe Asp Leu Ala Met Leu Ala Leu Asp Ser 580 ses 590

Pro Glu Ser Gly Trp Thr Glu Glu Asp Gly Pro Lys Glu Gly Leu Ala 595 600 605

Glu Tyr ile Val Glu Phe Leu Lys Lys Lys Ala Glu Met Leu Ala Asp 610 615 620

Tyr Phe Ser Leu Glu Ile Asp Glu Glu Gly Asn Leu Ile Gly Leu Pro 625 630 635 640

Leu Leu Ile Asp Asn Tyr Val Pro Pro Leu Glu Gly Leu Pro Ile Phe 645 650 655

Ile Leu Arg Leu Ala Thr Glu Val Asn Trp Asp Glu Glu Lys Glu Cys 660 665 670

Phe Glu Ser Leu Ser Lys Glu Cys Ala Met Phe Tyr Ser Ile Arg Lys 675 680 685

Gin Tyr Ile Ser Glu Glu Ser Thr Leu Ser Gly Gin Gin Ser Glu Val 690 695 700

Pro Gly Ser Ile Pro Asn Ser Trp Lys Trp Thr Val Glu His Ile Val 705 710 715 720

Tyr Lys Ala Leu Arg Ser His Ile Leu Pro Pro Lys His Phe Thr Glu 725 730 735

Asp Gly Asn Ile Leu Gin Leu Ala Asn Leu Pro Asp Leu Tyr Lys Val 740 745 750

Phe Glu Arg Cys 755 <210> 21 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21

Met Lys Gin Leu Pro Ala Ala Thr Val Arg Leu Leu Ser Ser Ser

Gin 15 10 15

Ile Ile Thr Ser Val Val Ser Val Val Lys Glu Leu Ile Glu Asn

Ser 20 25 30

Leu Asp Ala Gly Ala Thr Ser Val Asp Val Lys Leu Glu Asn Tyr

Gly 35 40 45

Phe Asp Lys Ile Glu Val Arg Asp Asn Gly Glu Gly ile Lys Ala

Val 50 55 60

Asp Ala Pro val Met Ala Met Lys Tyr Tyr Thr Ser Lys Ile Asn

Ser 65 70 75 80

His Glu Asp Leu Glu Asn Leu Thr Thr Tyr Gly Phe Arg Gly Glu Ala 65 90 95

Leu Gly Ser Ile Cys Cys Ile Ala Glu Val Leu Ile Thr Thr Arg Thr 100 105 110

Ala Ala Asp Asn Phe Ser Thr Gin Tyr val Leu Asp Gly Ser Gly His 115 120 125 lie Leu Ser Gin Lys 130 c210> 22 <211> 1360 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22

Met Ser Arg Gin Ser Thr Leu Tyr Ser Phe Phe pro Lys Ser Pro Ala 15 10 15

Leu Ser Asp Ala Asn Lys Ala Ser Ala Arg Ala Ser Arg Glu Gly Gly 20 25 30

Arg Ala Ala Ala Ala Pro Gly Ala Ser Pro Ser Pro Gly Gly Asp Ala 35 40 45

Ala Trp Ser Glu Ala Gly Pro Gly Pro Arg Pro Leu Ala Arg Ser Ala 50 55 60

Ser Pro Pro Lys Ala Lys Asn Leu Asn Gly Gly Leu Arg Arg Ser Val 65 70 75 80

Ala Pro Ala Ala Pro Thr Ser Cys Asp Phe Ser pro Gly Asp Leu

Val 85 90 95

Trp Ala Lys Met Glu Gly Tyr Pro Trp Trp Pro Cys Leu Val Tyr Asn 100 105 110

His Pro Phe Asp Gly Thr Phe lie Arg Glu Lys Gly Lys Ser Val Arg 115 120 125

Val His Val Gin Phe Phe Asp Asp Ser Pro Thr Arg Gly Trp Val Ser 130 135 140

Lys Arg Leu Leu Lys Pro Tyr Thr Gly Ser Lys Ser Lys Glu Ala Gin 145 150 155 160

Lys Gly Gly His Phe Tyr Ser Ala Lys Pro Glu He Leu Arg Ala Met 165 170 175

Gin Arg Ala Asp Glu Ala Leu Asn Lys Asp Lys lie Lys Arg Leu Glu 180 185 190

Leu Ala Val Cys Asp Glu Pro Ser Glu Pro Glu Glu Glu Glu Glu Met 195 200 205

Glu Val Gly Thr Thr Tyr Val Thr Asp Lys Ser Glu Glu Asp Asn Glu 210 215 220 lie Glu Ser Glu Glu Glu val Gin Pro Lys Thr Gin Gly Ser Arg Arg 225 230 235 240

Ser Ser Arg Gin Ile Lys Lys Arg Arg Val Ile Ser Asp Ser Glu Seir 245 250 255

Asp Ile Gly Gly Ser Asp Val Glu Phe Lys Pro Asp Thr Lys Glu Glu 260 265 270

Gly Ser Ser Asp Glu Ile Ser Ser Gly Val Gly Asp Ser Glu Ser Glu 275 280 285

Gly Leu Asn Ser Pro Val Lys Val Ala Arg Lys Arg Lys Arg Met

Val 290 295 300

Thr Gly Asn Gly Ser Leu Lys Arg Lys Ser Ser Arg Lys Glu Thr Pro 305 310 515 320

Ser Ala Thr Lys Gin. Ala Thr Ser He Ser Ser Glu Thr Lys Asn. Thr 325 330 335

Leu Arg Ala Phe Ser Ala Pro Gin Asn Ser Glu Ser Gin Ala His Val 340 345 350

Ser Gly Gly Gly Asp Asp Ser Ser Arg Pro Thr Val Tip lyr His

Glu 355 360 365

Thr Leu Glu Trp Leu Lys Glu Glu Lys Arg Arg Asp Glu His Arg Arg 370 375 380

Arg Pro Asp His Pro Asp Phe Asp Ala Ser Thr Leu Tyr Val Pio Glu 385 390 395 400

Asp Phe Leu Asn Ser Cys Thr Pro Gly Met Arg Lys Trp Trp Gin Ile 405 410 415

Lys Ser Gin Asn Phe Asp Leu Val Ile Cys Tyr Lys Val Gly Lys Phe 420 425 430

Tyr Glu Leu Tyr His Met Asp Ala Leu Ile Gly Val Ser Glu Leu Gly 435 440 445

Leu Val Phe Met Lys Gly Asn Trp Ala His Ser Gly Phe Pro Glu Ile 450 455 460

Ala Phe Gly Arg Tyr Ser Asp Ser Leu Val Gin Lys Gly Tyr Lys Val 465 470 475 480

Ala Arg Val Glu Gin Thr Glu Thr Pro Glu Met Met Glu Ala Arg Cys 485 490 495

Arg Lys Met Ala His Ile Ser Lys Tyr Asp Arg Val Val Arg Arg Glu 500 505 510

Ile Cys Arg Ile Ile Thr Lys Gly Thr Gin Thr Tyr Sar Val Leu Glu 515 520 525

Gly Asp Pro Ser Glu Asn Tyr Ser Lys Tyr Leu Leu Ser Leu Lys Glu 530 535 540

Lys Glu Glu Asp Ser Ser Gly His Thr Arg Ala Tyr Gly Val Cys Phe 545 550 555 560

Val Asp Thr Ser Leu Gly Lys Phe Phe ile Gly Gin Phe Ser Asp Asp 565 570 575

Arg His Cys Ser Arg Phe Arg Thr Leu Val Ala His Tyr Pro Pro Val 580 585 590

Gin Val Leu Phe Glu Lys Gly Asn Leu Ser Lys Glu Thr Lys Thr

Ile 595 600 605

Leu Lys Ser Ser Leu Ser Cys Ser Leu Gin Glu Gly Leu Ile Pro Gly 610 615 620

Ser Gin Phe Trp Asp Ala Sex Lys Thr Leu Arg Thr Leu Leu Glu Glu 625 630 £35 640

Glu Tyr Phe Arg Glu Lys Leu Ser Asp Gly Ile Gly Val Met Leu

Pro 645 650 655

Gin Val Leu Lys Gly Met Thr Ser Glu Ser Asp Ser Ile Gly Leu Thr 660 665 670

Pro Gly Glu Lys Ser Glu Leu Ala Leu Ser Ala Leu Gly Gly Cya Val 675 680 685

Phe Tyr Leu Lys Lys Cys Leu Ile Asp Gin Glu Leu Leu Ser Met Ala 690 695 700

Asn Phe Glu Glu Tyr Ile Pro Leu Asp Ser Asp Thr Val Ser Thr Thr 705 710 715 720

Arg Ser Gly Ala Ile Phe Thr Lys Ala Tyr Gin Arg Met Val Leu Asp 725 730 735

Ala Val Thr Leu Asn Asn Leu Glu Ile Phe Leu Asn Gly Thr Asn Gly 740 745 750

Ser Thr Glu Gly Thr Leu Leu Glu Arg val Asp Thr Cys His Thr Pro 755 760 765

Phe Gly Lys Arg Leu Leu Lys Gin Trp Leu Cys Ala Pro Leu Cys Asn 770 775 780

His Tyr Ala Ile Asn Asp Arg Leu Asp Ala Ile Glu Asp Leu Met val 785 790 795 800

Val Pro Asp Lys Ile Ser Glu Val Val Glu Leu Leu Lys Lys Leu Pro 805 810 815

Asp Leu Glu Arg Leu Leu Ser Lys Ile His Asn Val Gly Ser Pro Leu 820 825 830

Lys Ser Gin Asn His Pro Asp Ser Arg Ala Ile Met Tyr Glu Glu Thr 835 840 845

Thr Tyr Ser Lys Lys Lys Ile Ile Asp Phe Leu Ser Ala Leu Glu Gly 850 855 860

Phe Lys Val Met Cys Lys Ile Ile Gly ile Met Glu Glu Val Ala Asp 865 870 875 880

Gly Phe Lys Ser Lys Ile Leu Lys Gin Val Ile Ser Leu Gin Thr Lys 885 890 895

Asn Pro Glu Gly Arg Phe Pro Asp Leu Thr Val Glu Leu Asn Arg Trp 900 905 910

Asp Thr Ala Phe Asp His Glu Lys Ala Arg Lys Thr Gly Leu Ile Thr 915 920 925

Pro Lys Ala Gly Phe Asp Ser Asp Tyr Asp Gin Ala Leu Ala Asp Ile 930 935 940

Arg Glu Asn Glu Gin Ser Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Lys Gin Arg

Asn 945 950 955 960

Arg Ile Gly Cys Arg Thr Ile Val Tyr Trp Gly Ile Gly Arg Asn Arg 965 970 975

Tyr Gin Leu Glu Ile Pro Glu Asn Phe Thr Thr Arg Asn Leu Pro Glu 980 985 990

Glu Tyr Glu Leu Lys Ser Thr Lys Lys Gly Cys Lys Arg Tyr Trp Thr 995 1000 1005

Lys Thr Ile Glu Lys Lys Leu Ala Asn Leu Ile Asn Ala Glu Glu Arg 1010 1015 1020

Arg Asp Val Ser Leu Lys Asp Cys Met Arg Arg Leu Phe Tyr Asn Phe 1025 1030 1035 1040

Asp Lys Asn Tyr Lys Asp Trp Gin Ser Ala Val Glu Cys Ile Ala Val 1045 1050 1055

Leu Asp Val Leu Leu Cys Leu Ala Asn Tyr Ser Arg Gly Gly Asp Gly 1060 1065 1070

Pro Met Cys Arg Pro Val Ile Leu Leu Pro Glu Asp Thr Pro Pro Phe 1075 1080 1085

Leu Glu Leu Lys Gly Ser Arg His Pro Cys Ile Thr Lys Thr Phe Phe 1090 1095 1100

Gly Asp Asp Phe Ile Pro Asn Asp Ile Leu Ile Gly Cys Glu Glu Glu 1105 1110 1115 1120

Glu Gin Glu Asn Gly Lys Ala Tyr Cys Val Leu Val Thr Gly Pro Asn 1125 1130 1135

Met Gly Gly Lys Ser Thr Leu Met Arg Gin Ala Gly Leu Leu Ala Val 1140 1145 1150

Met Ala Gin Met Gly Cys Tyr Val Pro Ala Glu Val Cys Arg Leu Thr 1155 1160 1165 pro Ile Asp Arg Val phe Thr Arg Leu Gly Ala Ser Asp Arg Ile Met 1170 1175 1180

Ser Gly Glu Ser Thr Phe Phe Val Glu Leu Ser Glu Thr Ala Ser Ile 1185 1190 1195 1200

Leu Met His Ala Thr Ala Kis Ser Leu Val Leu Val Asp Glu Leu Gly 1205 1210 1215

Arg Gly Thr Ala Thr Phe Asp Gly Thr Ala Ile Ala Asn Ala Val Val 1220 1225 1230

Lys Glu Leu Ala Glu Thr Ile Lys Cys Arg Thr Leu Phe Ser Thr His 1235 1240 1245

Tyr His Ser Leu Val Glu Asp Tyr Ser Gin Asn Val Ala Val Arg Leu 1250 1255 1260

Gly His Met Ala Cys Met Val Glu Asn Glu Cys Glu Asp Pro Ser Gin 1265 1270 1275 1280

Glu Thr Ile Thr Phe Leu Tyr Lys Phe Ile Lys Gly Ala Cys Pro Lys 1285 1290 1295

Ser Tyr Gly Phe Asn Ala Ala Arg Leu Ala Asn Leu Pro Glu Glu Val 1300 1305 1310

Ile Gin Lys Gly His Arg Lys Ala Arg Glu Phe Glu Lys Met Asn

Gin 1315 1320 1325

Ser Leu Arg Leu Phe Arg Glu Val Cys Leu Ala Ser Glu Arg Ser

Thr 1330 1335 1340

Val Asp Ala Glu Ala Val His Lys Leu Leu Thr Leu Ile Lys Glu Leu 1345 1350 1355 1360 <210> 23 <211> 389 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23

Met Ala Gin Pro Lys Gin Glu Arg Val Ala Arg Ala Arg His Gin Arg 15 10 is

Ser Glu Thr Ala Arg His Gin Arg Ser Glu Thr Ala Lys Thr Pro Tb r 20 25 30

Leu Gly Asn Arg Gin Thr Pro Thr Leu Gly Asn Arg Gin Thr Pro Arg 35 40 45

Leu Gly ile His Ala Arg Pro Arg Arg Arg Ala Thr Thr Ser Leu Leu 50 55 60

Thr Leu Leu Leu Ala Phe Gly Lys Asn Ala Val Arg Cys Ala Leu Ile 65 70 75 80

Gly Pro Gly Ser Leu Thr Ser Arg Thr Arg Pro Leu Thr Glu Pro Leu 85 90 95

Gly Glu Lys Glu Arg Arg Glu Val Phe Phe Pro Pro Arg Pro Glu Arg 100 105 110

Val Glu His Asn Val Glu Ser Ser Arg Trp Glu Pro Arg Arg Arg Gly 115 120 125

Ala Cys Gly Ser Arg Gly Gly Asn Phe Pro Ser Pro Arg Gly Gly Ser 130 135 140

Gly Val Ala Ser Leu Glu Arg Ala Glu Asn Ser Ser Thr Glu Pro Ala 145 150 155 160

Lys Ala Ile Lys Pro Ile Asp Arg Lys Ser Val His Gin Ile Cys Ser 165 170 175

Gly Pro Val Val Pro Ser Leu Arg Pro Asn Ala Val Lys Glu Leu

Val 180 185 190

Glu Asn Ser Leu Asp Ala Gly Ala Thr Asn Val Asp Leu Lys Leu Lys 195 200 205

Asp Tyr Gly Val Asp Leu Ile Glu Val Ser Gly Asn Gly Cys Gly Val 210 215 220

Glu Glu Glu Asn Phe Glu Gly Phe Thr Leu Lys Hie His Thr Cys Lys 225 230 235 240

Ile Gin Glu Phe Ala Asp Leu Thr Gin Val Glu Thr Phe Gly Phe Arg 245 250 255

Gly Glu Ala Leu Ser Ser Leu Cys Ala Leu Ser Asp Val Thr Ile Ser 260 265 270

Thr Cys Arg Val Ser Ala Lys Val Gly Thr Arg Leu Val Phe Asp His 275 280 285

Tyr Gly Lys Ile Ile Gin Lys Thr Pro Tyr Pro Arg Pro Arg Gly Met 290 295 300

Thr Val Ser Val Lys Gin Leu Phe Ser Thr Leu Pro Val His His Lys 305 310 315 320

Glu Phe Qln Arg Asn Ile Lys Lys Lys Arg Ala Cys phe Pro phe Ala 325 330 335

Phe Cys Arg Asp Cys Gin Phe Pro Glu Ala Ser Pro Ala Met Leu Pro 340 345 350

Val Gin Pro Val Glu Leu Thr Pro Arg Ser Thr Pro Pro His Pro Cys 355 360 365

Ser Leu Glu Asp Asn val Ile Thr Val Phe Ser ser Val Lys Asn Gly 370 375 380

Pro Gly Ser Ser Arg 385 <210> 24 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24

Met Cys pro Trp Arg Pro Arg Leu Gly Arg Arg Cys Met Val Ser Pro 15 10 15

Arg Glu Ala Asp Leu Gly Pro Gin Lys Asp Thr Arg Leu Asp Leu Pro 20 25 30

Arg Ser Pro Ala Arg Ala Pro Arg Glu Gin Asn Ser Leu Gly Glu Val 35 40 45

Asp Arg Arg Gly Pro Arg Glu Gin Thr Arg Ala Pro Ala Thr Ala Ala 50 55 60

Pro pro Arg Pro Leu Gly Ser Arg Gly Ala Glu Ala Ala Glu Pro Gin 65 70 75 80

Glu Gly Leu Ser Ala Thr Val Ser Ala Cys Phe Gin Glu Gin Gin Glu 85 90 95

Met Asn Thr Leu Gin Gly Pro Val Ser Phe Lys Asp Val Ala val Asp 100 105 no

Phe Thr Gin Glu Glu Trp Arg Gin Leu Asp Pro Asp Glu Lys Ile Ala 115 120 125

Tyr Gly Asp Val Met Leu Glu Asn Tyr Ser His Leu Val Ser Val Gly 130 135 140

Tyr Asp Tyr His Gin Ala Lys His His His Gly Val Glu Val Lys Glu 145 150 155 160

Val Glu Gin Gly Glu Glu Pro Trp Ile Met Glu Gly Glu Phe Pro Cys 165 170 175

Gin His Ser Pro Glu Pro Ala Lys Ala Ile Lys Pro Ile Asp Arg Lys 180 185 190

Ser Val His Gin Ile Cys Ser Gly Pro Val Val Leu Ser Leu Ser 1'hr 195 200 205

Ala Val Lys Glu Leu Val Glu Asn Ser Leu Asp Ala Gly Ala Thr Asn 210 215 220

Ile Asp Leu Lys Leu Lys Asp Tyr Gly Val Asp Leu Ile Glu Val Ser 225 230 235 240

Asp Asn Gly Cys Gly Val Glu Glu Glu Asn Phe Glu Gly Leu Ile Ser 245 250 255

Phe Ser Ser Glu Thr Ser His Met 260 <210> 25 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25

Met Cys Pro Trp Arg Pro Arg Leu Gly Arg Arg Cys Met Val Ser Pro 15 10 15

Arg Glu Ala Asp Leu Gly Pro Gin Lys Asp Thr Arg Leu Asp Leu Pro 20 25 30

Arg Ser Pro Ala Arg Ala Pro Arg Glu Gin Asn ser Leu Gly Glu Val 35 40 45

Asp Arg Arg Gly Pro Arg Glu Gin Thr Arg Ala Pro Ala Thr Ala Ala 50 55 60

Pro Pro Arg Pro Leu Gly Ser Arg Gly Ala Glu Ala Ala Glu Pro Gin 65 70 75 80

Glu Gly Leu Ser Ala Thr Val Ser Ala Cys Phe Gin Glu Gin Gin Glu 85 90 95

Met Asn Thr Leu Gin Gly Pro Val Ser Phe Lys Asp Val Ala Val Asp 100 105 110

Phe Thr Gin Glu Glu Trp Arg Gin Leu Asp Pro Asp Glu Lys Ile ila 115

Tyr Gly Asp Val Met Leu Glu Asn Tyr Ser His Leu Val Ser val Gly 130 135 140

Tyr Asp Tyr His Gin Ala Lys His His His Gly Val Glu val Lys Glu 145 150 155 160

Val Glu Gin Gly Glu Glu Pro Trp Ile Met Glu Gly Glu Phe Pro

Cvs 165 170 175

Gin His Ser Pro Glu Pro Ala Lys Ala Ile Lys Pro Ile Asp Arg Lys 180 185 190

Ser Val His Gin Ile Cys Ser Gly Pro Val Val Leu Ser Leu Ser Thr 195 200 205

Ala Val Lys Glu Leu Val Glu Asn Ser Leu Asp Ala Gly Ala Thr Asn 210 215 220

Ile Asp Leu Lys Leu Lys Asp Tyr Gly Val Asp Leu Ile Glu Val Ser 225 230 235 240

Asp Asn Gly Cys Gly Val Glu Glu Glu Asn Phe Glu Gly Leu Ile Ser 245 250 255

Phe Ser Ser Glu Thr Ser His Met 260 <210> 26 <400> 26 000

Claims (84)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en hypermutabel gær, hvilken fremgangsmåde omfatter trinnene: indføring af et polynukleotid i en gær, hvilket polynukleotid omfatter en dominant negativ allel af et fejlparringsreparationsgen, hvor den dominante negative allel reguleres inducerbart, således at ekspressionen af den dominante negative allel kan svækkes eller elimineres, hvorved cellen bliver hypermutabel.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor fejlparringsreparationsgenet er en MutH-homolog.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor fejlparringsreparationsgenet er . en MutS-homolog.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor fejlparringsreparationsgenet er en MutL-homolog.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor fejlparringsreparationsgenet er en MutY-homolog.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor fejlparringsreparationsgenet er PMS2.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor fejlparringsreparationsgenet er vegetabilsk PMS2.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor fejlparringsreparationsgenet er MLH1.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor fejlparringsreparationsgenet er MLH3.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor fejlparringsreparationsgenet er MSH2.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor fejlparringsreparationsgenet er en PMSR- eller PMSL-homolog.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 4, hvor allelen omfatter en trunkeringsmutation.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 6, hvor allelen omfatter en trunkeringsmutation.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 7, hvor allelen omfatter en trunkeringsmutation.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 3, hvor allelen omfatter en trunke ringsmutation.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 3, hvor ailelen omfatter en trunke-ringsmutation i kodon 134.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 4, hvor allelen omfatter en trunkeringsmutation i kodon 134.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 6, hvor allelen omfatter en trunke-ringsmutation i kodon 134.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor polynukleotidet indføres i en gær ved parring.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 6, hvor fejlparringsreparationsgenet er pattedyr-PAfS2.

21. Fremgangsmåde ifølge krav 14, hvor fejlparringsreparationsgenet er vegetabilsk PM52.

22. Fremgangsmåde ifølge krav 12, hvor fejlparringsreparationsgenet er MLH1.

23. Fremgangsmåde ifølge krav 12, hvor fejlparringsreparationsgenet er MLH3.

24. Fremgangsmåde ifølge krav 15, hvor fejlparringsreparationsgenet er MSH2.

25. Fremgangsmåde ifølge krav 15, hvor fejlparringsreparationsgenet er MSH3.

26. Fremgangsmåde ifølge krav 15, hvor fejlparringsreparationsgenet er MSH6.

27. Fremgangsmåde ifølge krav 12, hvor fejlparringsreparationsgenet er en vegetabilsk MutL-homolog.

28. Sammensætning af dyrket, hypermutabel gær, hvilken sammensætning omfatter en dominant negativ allel af et fejlparringsreparationsgen, hvor den dominante negative alle) reguleres inducerbart, således at ekspression af den dominante negative allel kan svækkes eller elimineres.

29. Isoleret, hypermutabel gær ifølge krav 28, hvor fejlparringsreparationsgenet er et mutL-gen eller en mutL-homolog.

30. Isoleret, hypermutabel gær ifølge krav 28, hvor fejlparringsreparationsgenet er et PMS2-gen eller en PMS2-homo!og.

31. Isoleret, hypermutabel gær ifølge krav 28, hvor fejlparringsrepara-tionsgenet er et MLH1 eller en homolog.

32. Isoleret, hypermutabel gær ifølge krav 28, hvor fejlparringsrepara-tionsgenet er en PMSK-homolog.

33. Isoleret, hypermutabel gær ifølge krav 28, hvor fejlparringsreparationsgenet er mutS eller en homolog.

34. Isoleret, hypermutabel gær ifølge krav 28, hvor fejlparringsreparationsgenet er eukaryot.

35. Isoleret, hypermutabel gær ifølge krav 28, hvor fejlparringsreparationsgenet er prokaryot.

36. Isoleret, hypermutabel gær ifølge krav 30, hvor cellerne udtrykker et protein, som består af de første 133 aminosyrer af PMS2.

37. Isoleret, hypermutabel gær ifølge krav 30, hvilken gær omfatter et protein, der består af de første 133 aminosyrer af PMS2.

38. Isoleret, hypermutabel gær ifølge krav 33, hvilken gær omfatter et pattedyr-MutS-protein.

39. Isoleret, hypermutabel gær ifølge krav 31, hvilken gær omfatter et protein, der består af et pattedyr-MutL-protein.

40. Isoleret, hypermutabel gær ifølge krav 28, hvilken gær omfatter et eukaryot MutL-protein.

41. Isoleret, hypermutabel gær ifølge krav 28, hvilken gær omfatter et eukaryot MutS-protein.

42. Fremgangsmåde til dannelse af en mutation i et gen af interesse, hvilken fremgangsmåde omfatter trinnene med dyrkning af en gærcelle, som omfatter genet af interesse og en dominant negativ allel af et fejlparringsreparationsgen, hvilken dominant negativ allel reguleres inducerbart, således at ekspression af den dominante negative allel kan svækkes eller elimineres, hvor cellen er hypermutabel; undersøgelse af cellen til bestemmelse af, hvorvidt genet af interesse indeholder en mutation; og genoprettelse af normal fejlparringsreparationsaktivitet i gærcellen.

43. Fremgangsmåde ifølge krav 42, hvor trinnet med undersøgelse omfatter analyse af en nukleotidsekvens af genet af interesse.

44. Fremgangsmåde ifølge krav 42, hvor trinnet med undersøgelse omfatter analyse af mRNA, der er transkriberet fra genet af interesse.

45. Fremgangsmåde ifølge krav 42, hvor trinnet med undersøgelse omfatter analyse af et protein, der er kodet af genet af interesse.

46. Fremgangsmåde ifølge krav 42, hvor trinnet med undersøgelse om- fatter analyse af en fænotype, der er forbundet med genet af interesse.

47. Fremgangsmåde ifølge krav 42, hvor gæren fremstilles ved hjælp af den fremgangsmåde at indføre et polynukleotid, som omfatter en dominant negativ allel af et fejlparringsreparationsgen, i en gærcelle, hvorved gærcellen bliver hypermutabel.

48. Fremgangsmåde ifølge krav 47, hvor trinnet med undersøgelse omfatter analyse af nukleotidsekvensen fra genet af interesse.

49. Fremgangsmåde ifølge krav 47, hvor trinnet med undersøgelse omfatter analyse af et protein, der er kodet af genet af interesse.

50. Fremgangsmåde ifølge krav 47, hvor trinnet med undersøgelse omfatter analyse af fænotypen af genet af interesse.

51. Fremgangsmåde til dannelse af en mutation i et gen af interesse i en hypermutabel celle og efterfølgende stabilisering af genomet af cellen, hvilken fremgangsmåde omfatter trinnene: dyrkning af en hypermutabel gærcelle, som omfatter genet af interesse og et polynukleotid, der koder for en dominant negativ allel af et fejlparringsreparationsgen under regulering af et inducerbart transkriptionsregulatorisk element, til dannelse af en population af muterede, hypermutable gærceller; dyrkning af populationen af muterede, hypermutable gærceller under betingelser, hvor træk selekteres; undersøgelse af gærcellerne, som vokser under betingelser, hvor træk selekteres, for at bestemme, hvorvidt genet af interesse indeholder en mutation; og genoprettelse af fejlparringsreparationsaktivitet i cellen ved faldende ekspression af den dominante negative allel, hvorved der dannes en mutation i genet af interesse, og cellens genom stabiliseres.

52. Fremgangsmåde ifølge krav 51, hvor trinnet med undersøgelse omfatter analyse af en nukleotidsekvens af genet af interesse.

53. Fremgangsmåde ifølge krav 51, hvor trinnet med undersøgelse omfatter analyse af mRNA, der er transkriberet fra genet af interesse,

54. Fremgangsmåde ifølge krav 51, hvor trinnet med undersøgelse omfatter analyse af et protein, der er kodet af genet af interesse.

55. Fremgangsmåde ifølge krav 51, hvor trinnet med undersøgelse omfatter analyse af en fænotype, der er forbundet med genet af interesse.

56. Fremgangsmåde ifølge krav 51, hvilken fremgangsmåde yderligere omfatter trinnet med anvendelse af gærcellerne, som indeholder en mutation i genet af interesse, til frembringelse af et rekombinant produkt.

57. Fremgangsmåde ifølge krav 51, hvilken fremgangsmåde yderligere omfatter trinnet med anvendelse af gærcellerne, som indeholder en mutation i genet af interesse, til udførelse af en biotransformation.

58. Fremgangsmåde ifølge krav 51, hvilken fremgangsmåde yderligere omfatter trinnet med anvendelse af gærcellerne, som indeholder en mutation i genet af interesse, til udførelse af bioremediering.

59. Fremgangsmåde ifølge krav 51, hvilken fremgangsmåde yderligere omfatter trinnet med anvendelse af gærcellerne, som indeholder en mutation i genet af interesse, til identificering af gener, der koder for virusantigener.

60. Fremgangsmåde ifølge krav 51, hvilken fremgangsmåde yderligere omfatter trinnet med anvendelse af gærcellerne, som indeholder en mutation i genet af interesse, til identificering af gærantigener.

61. Fremgangsmåde ifølge krav 51, hvilken fremgangsmåde yderligere omfatter trinnet med anvendelse af gærcellerne, som indeholder en mutation i genet af interesse, til identificering af farmaceutiske mål.

62. Fremgangsmåde ifølge krav 51, hvor mutationen i genet af interesse forårsager antibiotisk resistens, og genet klones.

63. Fremgangsmåde ifølge krav 51, hvilken fremgangsmåde yderligere omfatter trinnet med anvendelse af gærcellerne, som indeholder en mutation i genet af interesse, til screening af sammensatte biblioteker.

64. Fremgangsmåde til dannelse af hypemnutationsfremmet gær, hvilken fremgangsmåde omfatter trinnene: eksponering af en gærcelle for et mutagen, hvor gærcellen er defekt med hensyn til fejlparringsreparation (MMR) på grund af tilstedeværelsen af en dominant negativ allel af mindst ét MMR-gen, som reguleres inducerbart, således at ekspression af den dominante negative allel kan svækkes eller elimineres, hvorved der opnås en forøget mutationsrate af gærcellen.

65. Fremgangsmåde ifølge krav 64, hvor mutagenet er et DNA- alkyleringsmiddel.

66. Fremgangsmåde ifølge krav 64, hvor mutagenet er et DNA- interkalerende middel.

67. Fremgangsmåde ifølge krav 64, hvor mutagenet er et DNA- oxidationsmiddel.

68. Fremgangsmåde ifølge krav 64, hvor mutagenet er ioniserende stråling.

69. Fremgangsmåde ifølge krav 64, hvor mutagenet er ultraviolet bestråling.

70. Fremgangsmåde ifølge krav 64, hvor den dominante negative allel reguleres inducerbart.

71. Fremgangsmåde til dannelse af fejlparringsreparation (MMR)- kompetent gær med nye træk, hvilken fremgangsmåde omfatter trinnene: dyrkning af en gærcelle, som omfatter et gen af interesse og et poly-nukleotid, der koder for en dominant negativ allel af et fejlparringsreparationsgen, som reguleres inducerbart, således at ekspressionen af den dominante negative allel kan svækkes eller elimineres, til fremstilling af en population af muterede, hypermutable gærceller; dyrkning af populationen af muterede, hypermutable gærceller under betingelser, hvor træk selekteres; undersøgelse af gærcellerne, som vokser under betingelser, hvor træk selekteres, for at bestemme, hvorvidt genet af interesse indeholder en mutation; genoprettelse af normal fejlparringsreparationsaktivitet i gærcellerne.

72. Fremgangsmåde ifølge krav 71, hvor gærcellen eksponeres for et mutagen til forøgelse af mutationsraten inden dyrkningstrinnet.

73. Fremgangsmåde ifølge krav 71, hvor trinnet med genoprettelse af normal fejlparringsreparationsaktivitet omfatter fjernelse af en inducer, som regulerer transkription af den dominante negative alle! fra gærcellerne.

74. Fremgangsmåde ifølge krav 72, hvor trinnet med genoprettelse af normal fejlparringsreparationsaktivitet omfatter fjernelse af en inducer, som regulerer transkription af den dominante negative allel fra gærcellerne.

75. Fremgangsmåde ifølge krav 73, hvor induceren er methanol.

76. Fremgangsmåde ifølge krav 73, hvor induceren er galactose.

77. Fremgangsmåde ifølge krav 71, hvor trinnet med genoprettelse af normal fejlparringsreparationsaktivitet omfatter udskæring af den dominante negative allel ved homolog rekombination.

78. Fremgangsmåde ifølge krav 71, hvor trinnet med genoprettelse af normal fejlparringsreparationsaktivitet involverer inaktivering af den dominante negative allel.

79. Fremgangsmåde ifølge krav 71, hvor trinnet med genoprettelse af normal fejlparringsreparationsaktivitet omfatter anvendelse af selektionsbetingelser på gærcellerne, hvorunder celler, der har mistet den dominante negative allel, kan vokse, men hvorunder celler, som indeholder den dominante negative allel, ikke kan vokse.

80. Fremgangsmåde ifølge krav 71, hvor trinnet med genoprettelse af normal fejlparringsreparationsaktivitet udføres efter trinnet med dyrkning under betingelser, hvor træk selekteres.

81. Fremgangsmåde ifølge krav 72, hvor trinnet med genoprettelse af normal fejlparringsreparationsaktivitet udføres efter trinnet med eksponering for et mutagen og efter trinnet med dyrkning under betingelser, hvor træk selekteres.

82. Fremgangsmåde ifølge krav 72, hvor mutagenet er ioniserende stråling.

83. Fremgangsmåde ifølge krav 72, hvor mutagenet er ultraviolet (UV) bestråling.

84. Fremgangsmåde ifølge krav 71, hvor normal fejlparringsreparationsaktivitet genoprettes ved hjælp af komplementering med en vildtype-fejlparringsreparationsallel.