JP2002505121A - 平均化ｄｎａライブラリーの作製及び使用 - Google Patents

平均化ｄｎａライブラリーの作製及び使用

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Abstract

(57)【要約】 （ａ）環境サンプルからゲノムDNA集団を単離し、（ｂ）(i)単離されたDNA集団のコピー数の増幅、及び(ii)所望の特性を有する単離されたゲノムDNA画分の回収、のうち少なくとも一つを行い、そして（ｃ）ゲノムDNA集団内の種々のDNAの提示物を平均化して環境サンプルからゲノムDNAの平均化ライブラリーを作製することによる、環境サンプルから平均化されたゲノムDNAライブラリーを作製する方法を開示する。また、上記方法によって環境サンプルから作製された平均化ゲノムDNAライブラリーも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は遺伝子ライブラリーの作製とスクリーニングの分野に関し、より特定
して述べれば、微生物及び／又はその他の生物体の混合した集団から得た平均化
したゲノムＤＮＡライブラリーの作製及びスクリーニングに関する。
【０００２】発明の背景 研究用試薬業界、診断用試薬業界、および化学工学業界において新規の性能を
有する、タンパク質をベースとした触媒の需要は増大しつつある。現在のところ
は、このような需要は種々の培養細菌または真菌から精製された酵素を用いるこ
とに、主に着目されている。しかし、天然に存在する微生物で純粋培養中で増殖
しうるものは1%未満なので(Amann, 1995)、価値ある新製品となる可能性のある ものを得るために微生物の多様性を全範囲にわたって活用するためには別の技法
が開発されねばならない。
【０００３】 現在用いられている市販の酵素はほぼ全てが培養された生物体から由来するも
のである。そのような生物体の大多数は細菌または真菌である。Amannら(Amann,
1995)は環境中の微生物で分離培養されているものを次のとおり見積もっている
： 生息地 培養されたものの率(%) 海水 0.001〜0.1 真水 0.25 中栄養性湖水 0.01〜1.0 汚染されていない河口の水 0.1〜3.0 活性化スラッジ 1.0〜15.0 堆積物 0.25 土壌 0.3 これらのデータは上に示した種々の生息地から由来する分離培養された微生物
の数についての公表情報から求めたものである。
【０００４】 その他の研究でも、分離培養された生物体は環境中に存在するバイオマスの小
さな部分にすぎないことを示している。例えば、最近ある研究者グループは75種
類の濃縮培養物の55%に古細菌に特異的なプローブとハイブリダイズする細胞が 見出された、イエローストーン国立公園の「Obsidian Pool」から得た水と堆積 物サンプルの採集について報告している(Barns, 1994)。16S rRNAをコードする 配列のクローニングおよび増幅によって、このプールから以前に分離培養された
生物体から提示されたことのない、またはほとんどないユニークな配列が大部分
であることが明らかとなったが、このことは現在まで未知の形態学的、生理学的
および生化学的特徴を持つ古細菌が種々存在することを示唆している。別の研究
グループはイエローストーン公園のOctopus Springのシアノバクテリアの塊（ma
t）について同様の研究を行い、同じ結論に達した；すなわち、未だ培養されて いない非常に多様な生物が存在することが明らかとなった(Ward, 1990)。Giovan
noniら(1990)およびTorsvikら(1990a)は、それぞれサルガッソー海および土壌サ
ンプルから採集した細菌プランクトンを用いて同様な結果を報告している。これ
らの結果は、有用な酵素またはその他の生物活性のスクリーニングに培養生物体
のみしか用いないと、本来存在している多様な可能性のあるもののサンプリング
が非常に制限されてしまうことを示している。
【０００５】 培養サンプルから得た遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることが有用で
あることは既に証明されている。しかし、ライブラリー作製のために培養した生
物体のみを用いることは自然の多様性へのアクセスを制限することとなることが
最近明らかとなってきている。環境中に存在する分離培養されていない生物体、
及び／又は、その生物体から由来する酵素もしくはその他の生物活性は工業的方
法において有用である可能性がある。いかなる与えられた環境サンプルであって
もその中にある各生物体を培養するためには多大の時間と労力を要する。豊穣な
土壌サンプル中には10,000を超える種が存在しうると推測されている。これらの
種の各々を個別に培養しようと試みることがやっかいな仕事であることは明らか
である。従って、環境中に存在する多様性に効率的にアクセスする新規な方法は
非常に望ましいものである。
【０００６】発明の要旨 本発明は、単離された生物体、微生物の共同体、一次濃縮物、および環境サン
プルを含む種々のソースからＤＮＡを単離して、もとのサンプル中のゲノム集団
の提示において「平均化された」ライブラリーを作製し、これらのライブラリー
を酵素およびその他の生物活性についてスクリーニングする方法を提供すること
によって、この需要に応えようとするものである。
【０００７】 本発明は、培養された、または、好ましくは培養されていない(もしくは「環 境」)サンプルの混合微生物集団から構築するＤＮＡライブラリーの作製および スクリーニングのための、新規の、組換え技法を用いたアプローチを示すもので
ある。本発明を用いることによって、自然の集団中ではその存在量が大きく相異
する種々の微生物から得たゲノムを同等に提示するようなライブラリーが作製さ
れ、スクリーニングされる。この「平均化」アプローチは存在量の多い種からの
過剰なクローンの数は減らし、まれな種からのクローンの提示物を増大させる。
これらの平均化されたライブラリーによってスクリーニングの効率が増大し、そ
の結果新規の生物学的触媒をコードする遺伝子の単離が行えるようになる。
【０００８】 以前に試みられた混合集団のスクリーニングはやっかいな工程を必要とするの
で実行可能ではなく避けられていたが、本明細書に記載した技法が利用可能であ
り、生物体集団の混合されたものをスクリーニングすることは合理的なアプロー
チとなった。
【０００９】 本発明の1態様では、(a)環境サンプルからゲノムＤＮＡ集団を単離し；(b)(i)
単離された該ＤＮＡ集団のコピー数の増幅、および(ii)所望の特性を有する該単
離されたゲノムＤＮＡを含んでいる画分を回収することのうちの少なくとも1つ を行い；そして(c)該環境サンプルからのゲノムＤＮＡの平均化ライブラリーが 形成されるように該ゲノムＤＮＡ集団内の種々のＤＮＡの提示物を平均化するこ
とによって、環境サンプルからの平均化ゲノムＤＮＡライブラリーを形成するた
めの方法を提供する。
【００１０】 この態様の好ましい1実施形態においては、該方法は所望の特性を有する単離 されたゲノムＤＮＡの1画分を回収する段階を含む。
【００１１】 この態様の別の好ましい実施形態においては、該方法は単離されたＤＮＡ集団
のコピー数を増幅する段階を含む。
【００１２】 この態様の別の好ましい実施形態においては、ゲノムＤＮＡの増幅段階は平均
化段階に先行する。この態様のまた別の好ましい実施形態においては、ゲノムＤ
ＮＡの平均化段階は増幅段階に先行する。
【００１３】 この態様の別の好ましい実施形態においては、該方法は(i)単離されたＤＮＡ 集団のコピー数を増幅する段階、および(ii)所望の特性を有する単離されたゲノ
ムＤＮＡの画分を回収する段階の双方を含む。
【００１４】 本発明のまた別の態様では、(a)環境サンプルからゲノムＤＮＡ集団を単離し ；(b)(i)単離された該ＤＮＡ集団のコピー数の増幅、および(ii)所望の特性を有
する単離されたゲノムＤＮＡを含んでいる画分を回収することのうちの少なくと
も1つを行い；そして(c)該環境サンプルからのゲノムＤＮＡの平均化ライブラリ
ーが形成されるように該ゲノムＤＮＡ集団内の種々のＤＮＡの提示物を平均化す
る段階を含む方法によって、環境サンプルから形成される平均化ゲノムＤＮＡラ
イブラリーを提供する。本発明の上記の方法態様に関して述べられている種々の
好ましい実施形態が、本発明のこの態様に関しても同様に適用可能である。
【００１５】 本発明はまた、(a)環境サンプルからゲノムＤＮＡ集団を単離し；(b)(i)単離 された該ＤＮＡ集団のコピー数の増幅、および(ii)所望の特性を有する単離され
たゲノムＤＮＡを含んでいる画分を回収することのうちの少なくとも1つを行い ；そして(c)該環境サンプルからのゲノムＤＮＡの平均化ライブラリーが形成さ れるように該ゲノムＤＮＡ集団内の種々のＤＮＡの提示物を平均化することによ
って、環境サンプルから平均化ゲノムＤＮＡライブラリーを形成する方法をも提
供する。
【００１６】 本発明の別の態様では、(a)環境サンプルからゲノムＤＮＡ集団を単離し；(b)
(i)単離された該ＤＮＡ集団のコピー数の増幅、および(ii)所望の特性を有する 単離されたゲノムＤＮＡを含んでいる画分を回収することのうちの少なくとも1 つを行い；そして(c)該環境サンプルからのゲノムＤＮＡの平均化ライブラリー が形成されるように該ゲノムＤＮＡ集団内の種々のＤＮＡの提示物を平均化する
、の段階を含む方法によって環境サンプルから形成される平均化ゲノムＤＮＡラ
イブラリーを提供する。本発明の上記の方法態様に関して述べられている種々の
好ましい実施形態が、本発明のこの態様に関しても同様に適用可能である。
【００１７】発明の詳細な説明 ＤＮＡの単離 環境サンプルからの平均化ＤＮＡライブラリーの作製における重要なステップ
はそのサンプルからの核酸の調製である。当業界では公知の種々の技法を用いて
サンプルからＤＮＡを単離することができる(Nucleic Acids in the Environmen
t Methods & Applications, J.T. Trevors, D.D. van Elsas, Springer Laborat
ory, 1995)。好ましくは、得られるＤＮＡは大きなサイズであって酵素阻害剤お
よびその他の夾雑物を含まないものである。ＤＮＡは環境サンプルから直接的に
単離でき(直接溶解)、またはＤＮＡを回収する前に細胞をサンプルから採取する
ことができる(細胞分離)。直接溶解法は、細胞分離に基づくプロトコールに比べ
いくつかの利点がある。直接溶解技法は細胞分離技法を用いて回収されたＤＮＡ
に比べ、通常、その微生物コミュニティーを示すＤＮＡがより多量得られるが、
そこで得られるＤＮＡは時にサイズがより小さく、酵素阻害剤を含有している可
能性がより高い。高分子量で高純度のＤＮＡが得られる非常に有用な直接溶解技
法が最近記載されている(Barns, 1994; Holben, 1994)。酵素阻害剤が存在する 場合には細胞の単離を用いたいくつかのプロトコールを用いうる(Holben, 1994)
。さらに、ＤＮＡの純度を向上させるために下記のビス−ベンズイミド分離法( 塩化セシウム単離法)などの分画技法を用いることができる。
【００１８】分画 平均化前にＤＮＡサンプルを分画することによりサンプリングした生物体のプ
ールの少数種からのＤＮＡのクローニングが行える機会が増加する。本発明にお
いては、ＤＮＡは好ましくは密度遠心技法を用いて分画される。そのような技法
の1例としては塩化セシウム密度勾配がある。好ましくは、その技法は、ＤＮＡ の領域に結合し核酸の浮遊密度の変化を生じさせる核酸挿入剤の存在下で行う。
より好ましくは、その核酸挿入剤はＤＮＡの領域に選択的に結合するビス−ベン
ズイミド(ビス−ベンズイミドの場合にはATと)などの色素である(Muller, 1975;
Manuelidis, 1977)。ビス−ベンズイミドなどの挿入剤と複合体化させた核酸を
適切な塩化セシウム密度勾配中で分離させると、核酸が分画される。その挿入剤
が選択的にＤＮＡの領域、例えばGCまたはAT領域などに結合する場合には、核酸
はそのＤＮＡ中の相対的な塩基含量に基づいて分離される。多くの生物体からの
核酸がこの方法で分離しうる。
【００１９】 密度勾配法は現在核酸を分画するために用いられている。例えば、土壌の分類
およびバイオレメディエーションにおける使用のための微生物核酸の分離にビス
−ベンズイミド密度勾配の使用が記載されている。これらの実験においては、バ
イオレメディエーション処理の前後で細菌集団にどのような影響があるかを調べ
るために、固定化ベンズイミド勾配内でのA２６０ピークの相対的な量を評価す る。この技法は、平均すればある1種のGC含量は相対的に一定しているとの前提 に依存している。この技法は本発明においてゲノムの複雑な混合物を分画するた
めに応用されている。公表されている方法のとおり、サンプルから由来する核酸
を超遠心にかけ、A２６０を測定しつつ分画する。
【００２０】 本発明の1態様においては、各ピークから同量のA２６０ユニットを取り出し、
核酸を下記に述べる方法を含む当業界で公知の種々の増幅法を用いて増幅し、遺
伝子ライブラリーを調製する。あるいはまた、各ピークから同量のA260ユニット
を取り出し、遺伝子ライブラリーをこの核酸から直接的に調製する。このように
、遺伝子ライブラリーは各ピークからの同量のＤＮＡの組み合わせから調製され
る。この方策によって環境サンプルおよび集積物中に少数しか存在しない生物体
から由来する遺伝子へのアクセスが可能となるが、そのゲノムは、その生物体が
少量しか存在しないので、もしライブラリーが分画されていないＤＮＡサンプル
全体から構築されたものであるとすれば示されていないかまたは失われている可
能性すらある。あるいはまた、ＤＮＡは下記に述べる技法を用いて分画後に平均
化することができる。ＤＮＡライブラリーは次いでこの分画され/平均化された ＤＮＡから作製することができる。
【００２１】 分画された核酸の複数の画分の組成は、当業界では公知のPCR関連の分類増幅 法を用いて決定することができる。
【００２２】平均化 以前の平均化プロトコールは平均化ｃＤＮＡライブラリーを構築するためにデ
ザインされたものであった(WO 95/08647, WO 95/11986)。これらのプロトコール
はもともとはmRNAから由来するまれなcDNAのクローニングと単離のため開発され
たものであった。本発明は、培養していない、または環境からのサンプルからの
平均化ゲノムＤＮＡ遺伝子ライブラリーの作製に関する。
【００２３】 環境サンプルまたは一次集積培養から直接的に単離した核酸サンプルは典型的
には非常に多数の微生物からのゲノムを含んでいる。これらの生物体の複雑なコ
ミュニティーはある1集団中に存在する種の絶対数およびそのサンプル中の各生 物体の相対的な存在量で説明することができる。1サンプル中の各生物体を総体 的に平均化させることは非常に困難である。光学的ピンセットなどの分離技法を
、サンプル中の形態学的に他と異なるメンバーを拾い出すために用いることがで
きる。次いで各メンバーから得た細胞を同数ずつ組み合わせるかまたは1サンプ ル中の各メンバーの純粋培養を行い各純粋培養から同数の細胞を組み合わせて平
均化を達成することができる。実際には、このことは、特に高スループットで行
おうとするとき、実施が非常に困難である。
【００２４】 本発明は、環境サンプル中に存在するゲノムの平均化、平均化された核酸から
のＤＮＡライブラリーの作製、およびそのライブラリーについて対象とする活性
のスクリーニングを行うための技法の使用を含む。
【００２５】 本発明の1態様においては、ＤＮＡはサンプルから単離され分画される。核酸 の鎖は次いで融解され固定された条件下で選択的に再アニールされる(C０tによ るハイブリダイゼーション)。あるいはまた、ＤＮＡはこの融解プロセス前には 分画されない。核酸断片の混合物を融解しストリンジェントな条件下で再アニー
ルさせると、一般的に存在する配列はまれな配列より早くそれと相補的な鎖を見
つけ出す。任意の一重鎖核酸単離段階の後、まれな配列の集積を表す一重鎖核酸
を増幅し遺伝子ライブラリー作製のために用いる。この方法により、まれな、ま
たは少ない量の核酸分子が増幅される。次いで、これらの分子を用いて、遺伝子
ライブラリーを作製する。全てのＤＮＡが回収される一方、そのＤＮＡをもとも
と含有している生物体の同定はできなくなる。この方法によって「クローン化で
きないソース」からのＤＮＡの回収が行えるようになる。
【００２６】 上述の技法を用いて得た核酸サンプルを増幅して平均化プロセスを完了させる
。例えば、サンプルはKoら(Ko, 1990b; Ko, 1990a; Takahashi, 1994)によって 記載されているものなどのようなPCR増幅プロトコールを用いて、またはより好 ましくは、Barnes(1994)またはCheng(1994)によって記載されているようなロン グPCRプロトコールを用いて増幅することができる。
【００２７】 平均化は直接行うことができ、または平均化プロセスの前に核酸プールの複雑
性を低減させるための段階を行うことができる。そのような複雑性の低減は現れ
ている程度の低い生物体からの核酸を回収するには有利である。
【００２８】 ライブラリーを調製するもとの微生物としては、真正細菌および古細菌などの
原核微生物、ならびに真菌、ある種の藻類および原生動物などの下等な真核微生
物が挙げられる。該微生物は培養された微生物または環境サンプルから得られた
培養されていない微生物であってよく、そのような微生物は、好熱菌、高度好熱
菌、好冷菌、好冷栄養菌(psychrotrophs)などの極端な状態で生育する細菌(extr
emophiles)であってもよい。
【００２９】 上述のとおり、ライブラリーは環境サンプルから作製することができ、その場
合にはＤＮＡは生物体を培養することなく回収でき、またはＤＮＡは培養生物体
から回収できる。
【００３０】 標的ＤＮＡが得られる出発材料のライブラリーとしての微生物ＤＮＡのソース
としては、北極および南極の氷、水、または永久凍土ソース、火山起源の材料、
熱帯の土壌または植物ソースからの材料などから得られた微生物サンプルなどの
環境サンプルを含むことを特に意図している。例えば、ゲノムＤＮＡは培養可能
なまたは培養できない生物体のどちらからでも回収でき、その後に行う酵素活性
の測定のための適切な組換え発現ライブラリーを作製するために用いることがで
きる。
【００３１】 細菌及び多くの真核生物は遺伝子を制御するための協調機作を持っており、そ
れらの遺伝子産物が関連プロセスにおいて役割を担っている。該遺伝子は、単一
の染色体上の「遺伝子クラスター」と呼ばれる構造にクラスター化され、そのク
ラスター全体の転写を開始させる単一のプロモーターを含む単一の制御配列によ
る調節のもとに一緒に転写される。該遺伝子クラスター、プロモーター、および
制御の際に機能するその他の配列はまとめて「オペロン」と呼ばれ、20以上の遺
伝子を含むこともあるが、通常は2〜6個の遺伝子である。このように、遺伝子ク
ラスターとは、通常はそれらの機能に関して同一かまたは関連しているかのいず
れかの隣接した遺伝子の一群である。
【００３２】 いくつかの遺伝子ファミリーは同一のメンバーから構成されている。クラスタ
ー化された遺伝子が同一である必要はないが、クラスター化は遺伝子間の同一性
を維持するために欠くことができない。遺伝子クラスターは重複が隣接した関連
遺伝子と行われるような極端なものから何百もの同一の遺伝子が直列になってい
る場合まで様々である。時には特定の遺伝子の繰り返しに意味が見出せないこと
もある。このことの主たる例はいくつかの種におけるインシュリン遺伝子の重複
であり、一方他の哺乳類種では単一のインシュリン遺伝子で十分である。
【００３３】 遺伝子クラスターをさらに研究してその完全長のクラスターのどの程度がそこ
から得られるタンパク質の発現に必要であるのかを調べることは重要である。さ
らに、遺伝子クラスターは継続的に再構成される。従って、例えば細菌または他
の原核生物ソースからの遺伝子クラスターの異種のライブラリーを創出する能力
は、特に例えばポリケチド合成酵素（膨大な有用な活性を有しているポリケチド
の合成に与る酵素である）などの新規のタンパク質のソースを求めることにおい
て価値のあるものである。遺伝子クラスターの産物である他のタイプのタンパク
質もまた意図されており、そのようなものとしては例えば抗生物質、抗ウイルス
剤、抗腫瘍剤、およびインシュリンなどの制御タンパク質が挙げられる。
【００３４】 ポリケチドは生物活性に非常に富むソースであり、それらとしては抗生物質( テトラサイクリンおよびエリスロマイシンなど)、抗癌剤(ダウノマイシン)、免 疫抑制剤(FK506およびラパマイシン)、ならびに動物用製剤(モネンシン)が挙げ られる。多数のポリケチド(ポリケチド合成酵素により産生される)が治療用剤と
して価値がある。ポリケチド合成酵素は、長さおよび機能のパターンならびに環
状化の状態の異なる非常に様々な炭素鎖の生合成を触媒する多機能酵素である。
ポリケチド合成酵素遺伝子は遺伝子クラスターをなしており少なくとも1つのタ イプの(タイプIと呼ばれる)ポリケチド合成酵素は大きなサイズの遺伝子と酵素 であって、遺伝子操作とこれらの遺伝子/タンパク質のin vitroでの研究を複雑 なものとしている。
【００３５】 研究用の新規のポリケチドを作製するために、ポリケチドおよびポリケチド生
合成後の遺伝子のライブラリーから所望の成分を選択して組み合わせることがで
きることは魅力的なことである。本発明の方法は、大きなインサート(特にf因子
をベースとしたベクターを用いる場合に)を含有するクローンを用いた遺伝子バ ンクを作製することができ、それが遺伝子クラスターのクローニングを容易にす
るので、新規のポリケチド合成酵素のクローニングが可能となり、容易となる。
【００３６】 好ましくは、該遺伝子クラスターＤＮＡはベクター中に連結され、特にベクタ
ーは、さらに連結された遺伝子クラスターからの検出可能なタンパク質またはタ
ンパク質関連の一連の活性の産生を調節し制御する発現制御配列を含む。外来性
ＤＮＡの導入に対して極めて大きな容量を有するベクターを使用することはこの
ような遺伝子クラスターと共に用いるためには特に適切であり、そのベクターの
使用に大腸菌(E.coli)のf因子(もしくは稔性因子とも呼ぶ)を含むことを本明細 書において例示として述べる。この大腸菌のf因子はコンジュゲートの際にそれ 自体が高頻度に移転されるプラスミドであり、混合微生物サンプルからの遺伝子
クラスターなどの大きなＤＮＡ断片の移転を達成し安定に増殖させるために理想
的なものである。
【００３７】ライブラリーのスクリーニング 平均化されたライブラリーを作製した後、本明細書に記載の高スループットロ
ボティックフォーマットを含む種々のフォーマットで各種の固相または液相スク
リーニングアッセイ法を用いてユニークな酵素活性を発見することができる。該
ライブラリーを構築するために用いられたＤＮＡの平均化は該プロセスのキイと
なる要素である。平均化によって、サンプル中に少量しか含まれていないものを
含む重要な生物体からのＤＮＡがより多く現れることとなる。
【００３８】実施例１ ＤＮＡの単離 1. サンプルを下記のバッファー中に直接再懸濁する： 500mM Tris-HCl, pH 8.0 100mM NaCl 1mM クエン酸ナトリウム 100μg/ml ポリアデノシン 5mg/ml リゾチーム
【００３９】 2. 時々攪拌しつつ37℃で1時間インキュベートする。
【００４０】 3. 2mg/mlのプロテイナーゼK酵素(Boehringer Mannheim)を用いて37℃で30 分間消化する。
【００４１】 4. 8mlの溶解バッファー[200mM Tris-HCl, pH 8.0／100mM NaCl／4%(w/v) S
DS／10%(w/v) 4-アミノサリチル酸]を添加し、反転させて穏和に混合する。
【００４２】 5. ドライアイス−エタノール浴中での凍結と65℃水浴中での融解とを3サイ
クル行って核酸を遊離させる。
【００４３】 6. 該混合物をフェノールで、次いでフェノール／クロロホルム／イソアミ ルアルコールで抽出する。
【００４４】 7. 酸で洗ったポリビニルポリピロリドン(PVPP) 4gを水相に添加し、37℃で
30分間インキュベートして有機物の混入物を除去する。
【００４５】 8. PVPPをペレット化し、上清を0.45μmの膜でろ過して残存PVPPを除去する
。
【００４６】 9. 核酸をイソプロピルアルコールで沈殿させる。
【００４７】 10. ペレットを500μLのTE(10mM Tris-HCl, pH 8.0／1.0mM EDTA)に再懸濁す
る。
【００４８】 11. 0.1gの酢酸アンモニウムを添加し、混合物を4℃で30分間遠心する。
【００４９】 12. 核酸をイソプロパノールで沈殿させる。
【００５０】実施例２ ビス−ベンズイミドでのＤＮＡの分離 ウェルチ菌(Clostridium perfringens)（27% G＋C）、大腸菌(E.coli)（49% G
＋C）、およびミクロコッカス(Micrococcus lysodictium)（72% G＋C）から得た
ゲノムＤＮＡからなるサンプルを塩化セシウム密度勾配で精製した。塩化セシウ
ム(Rf＝1.3980)溶液を0.2μmのフィルターでろ過し、その15mlを35mlのOptiSeal
管(Beckman)にロードした。該ＤＮＡを添加し十分混合した。10μgのビス−ベン
ズイミド(Sigma; Hoechst 33258)を添加し十分に混合した。次いで、その管をろ
過した塩化セシウム溶液で満たし、Beckman L8-70 超遠心機でVTi50ローターを 用い、33,000rpmで72時間遠心した。遠心後、シリンジポンプおよびフラクショ ネーター(Brandel Model 186)を用いて、280nmにセットしたISCO UA-5 UV吸光度
検出器に密度勾配を通した。3種の生物体からのＤＮＡを示す3つのピークが得ら
れた。大腸菌(E.coli)のピークの10倍希釈液からの、ｒＲＮＡをコードするＤＮ
ＡのPCR増幅を下記のプライマーを用いて行い真正細菌配列を増幅した： 順方向プライマー：(27F) 5'−AGAGTTTGATCCTGGCTCAG−3' 逆方向プライマー：(1492R) 5'−GGTTACCTTGTTACGACTT−3'
【００５１】実施例３ 宿主から物理的に分離することのできない内部共生者が住みついているハマグリ のひだ組織から得たＤＮＡのサンプル 1. 記載されているプロトコル(Sambrook, 1989)に従って塩化セシウム密度 勾配でＤＮＡを精製する。
【００５２】 2. 第2の塩化セシウム溶液を調製する；(Rf＝1.3980) 0.2μmのフィルター
でろ過し、その15mlを35mlのOptiSeal管(Beckman)にロードする。
【００５３】 3． 10μgのビス−ベンズイミド(Sigma; Hoechst 33258)を添加し混合する。
【００５４】 4. 50μgの精製ＤＮＡを添加し十分に混合する。
【００５５】 5. Beckman L8−70超遠心機でVTi50ローターを用いて33,000rpmで72時間遠 心する。
【００５６】 6. シリンジポンプおよびフラクショネーター(Brandel Model 186)を用いて
、280nmにセットしたISCO UA-5 UV 吸光度検出器に密度勾配を通す。
【００５７】実施例４ 複雑性（complexity）分析 1. 環境サンプルから実施例1に概説したプロトコルにしたがって回収したＤ
ＮＡ(Reysenbach, 1992; DeLong, 1992; Barns, 1994)の複雑性を分析するため に16S ｒＲＮＡ分析を用いる。
【００５８】 2. 下記のプライマーを用いて真正細菌配列を増幅する。 順方向： 5'−AGAGTTTGATCCTGGCTCAG−3' 逆方向： 5'−GGTTACCTTGTTACGACTT−3' 古細菌配列は下記のプライマーを用いて増幅する。 順方向： 5'−GCGGATCCGCGGCCGCTGCACAYCTGGTYGATYCTGCC−3' 逆方向： 5'−GACGGGCGGTGTGTRCA−3' (R＝プリン；Y＝ピリミジン)
【００５９】 3. 増幅反応は記載されているとおり進める。古細菌配列の増幅に用いる反 応バッファー中には5%のアセトアミドが含まれる(Barns, 1994)。
【００６０】 4. 増幅反応の産物をPfu ＤＮＡポリメラーゼとインキュベートすることに よって平滑末端化する。
【００６１】 5. 平滑末端をpCR-Script プラスミド中にSrfI制限エンドヌクレアーゼの存
在下で製造者のプロトコルに従って連結する(Stratagene Cloning Systems)。
【００６２】 6. サンプルを標準的な配列決定プロトコル(参考文献)を用いて配列を決定 し、サンプル中に存在する異なる配列の数を求める。
【００６３】実施例５ 平均化(Normalization) 精製したDNAを、実施例(2)のビス-ベンズイミドプロトコルに従って分画し、 回収したDNAを剪断または酵素で消化して、３〜６kbの断片とする。ローン(lone
)-リンカープライマーを連結し、該DNAをサイズ選択する。必要ならば、サイズ 選択したDNAをPCRで増幅する。
【００６４】 次に、平均化は以下のようにして実施する。
【００６５】 １．二本鎖DNAサンプルをハイブリダイゼーション用バッファー中（0.12M NaH2P
O4、pH 6.8／0.82M NaCl／１mM EDTA／0.1% SDS）に再懸濁する。
【００６６】 ２．サンプルに鉱物油を載せ、10分間沸騰させることによりサンプルを変性させ
る。
【００６７】 ３．サンプルを68℃にて12〜36時間インキュベートする。
【００６８】 ４．標準的なプロトコル（Sambrook, 1989）に従い、ヒドロキシアパタイトで60
℃にて二本鎖DNAを一本鎖DNAから分離する。
【００６９】 ５．一本鎖DNA画分を脱塩し、PCRで増幅する。
【００７０】 ６．このプロセスを数回以上（５回以上）繰り返す。
【００７１】実施例６ ライブラリーの構築 １．TEバッファー中に溶解させたゲノムDNAを、剪断した断片が所望のサイズ範 囲になるまで、25ゲージの二枚付き針（double-hubbed needle）に勢いよく通す
。
【００７２】 ２．DNA末端を大豆ヌクレアーゼで「研磨（polish）」すなわち平滑末端化する 。
【００７３】 ３．この標的DNA内のEcoRI制限部位をEcoRIメチラーゼで保護する。
【００７４】 ４．非常に高モル比率のリンカー対標的DNAを用いて、EcoRIリンカー［GGAATTCC
］を上記の平滑末端化／保護化DNAに連結する。
【００７５】 ５．リンカーをEcoRI制限エンドヌクレアーゼで切り出し、ショ糖勾配を用いて 該DNAをサイズ分画する。
【００７６】 ６．標的DNAをλZAPIIベクターに連結し、in vitroλパッキング抽出物を用いて
パッケージングし、適切な大腸菌（E.coli）XLI Blue宿主細胞内で増殖させる。
【００７７】実施例７ ライブラリーのスクリーニング 以下は、実施例６に従って調製した発現ライブラリーのスクリーニング手法の
代表的な例である。
【００７８】 各種の化学的特性を試験するための一般的な手法は、概ね、本実施例で具体的
に言及されているもの以外の基質についても適用可能である。
【００７９】活性のスクリーニング 実施例６に記載のようにして調製したライブラリーのプレートを用い、各ウェ
ルに200μLのLB Amp/Meth、グリセロールを含有する単一プレートに多重に接種 する。この段階は、Beckman Biomekの高密度複製ツール（High Density Replica
ting Tool：HDRT）を用い、各接種間で、１%の漂白剤、水、イソプロパノール、
風乾の滅菌サイクルで行う。この単一プレートを37℃にて２時間増殖させ、次い
でこれを用いて２枚の白色の96ウェルDynatechマイクロタイター娘プレート（各
ウェル中に250μLのLB Amp/Meth、グリセロールを含有）に接種する。元の単一 プレートは37℃にて18時間インキュベートし、次いで−80℃で保存する。上記２
枚の濃縮娘プレートもまた37℃にて18時間インキュベートする。次いで、この濃
縮娘プレートを70℃で45分間加熱して細胞を死滅させ、宿主大腸菌の酵素を不活
性化させる。DMSO中に５mg/mLのモルフォウレアフェニルアラニル-7-アミノ-4- トリフルオロメチルクマリン（MuPheAFC、「基質」）を含有するストック溶液を
、0.6mg/mLの界面活性剤ドデシルマルトシドを含有する50mM pH7.5 Hepesバッフ
ァーで600μMに希釈する。
【００８０】
【化１】 50μLの600μM MuPheAFC溶液を、上記白色濃縮プレートの各々のウェルに、Bi
omekを用いて、１回の100μL混合サイクルで添加して、約100μMの最終濃度の基
質を得る。該基質の添加直後（ｔ＝０）にプレート読取蛍光測定計で蛍光値を記
録する（励起＝400nm、発光＝505nm）。該プレートを70℃にて100分間インキュ ベートし、次いでさらに１５分間にわたり周辺温度まで冷却する。蛍光値を再度
記録する（ｔ＝100）。ｔ＝０での値をｔ＝100での値から差し引いて、活性なク
ローンが存在するか否かを判定する。
【００８１】 このデータから、特定のウェル内のクローンのうちの１つが該基質を加水分解
しているかどうかが示される。活性を有する個々のクローンを決定するために、
供給源ライブラリープレートを解凍し、個々のクローンを用いて、LB Amp/Meth 、グリセロールを含有する新たなプレートに単一に接種する。上記したように、
このプレートを37℃にてインキュベートして細胞を増殖させ、70℃に加熱して宿
主の酵素を不活性化し、Biomek を用いて50μLの600μM MuPheAFCを添加する。 さらに3種の他の基質を試験する。それらはメチルウンベリフェロンヘプタノエ ート、CBZ-アルギニンローダミン誘導体およびフルオレセイン結合カゼイン（カ
ゼイン1mol当たり約3.2molのフルオレセイン）である。
【００８２】
【化２】 メチルウンベリフェロンヘプタノエート
【化３】 （CBZ-アルギニン）２ローダミン110 上記ウンベリフェロンおよびローダミンは、50μLのHepesバッファー中の600 μMのストック溶液として添加する。フルオレセイン結合カゼインも、50μL中に
20および200mg/mLのストック濃度で添加する。これらの基質を添加した後、ｔ＝
０での蛍光値を記録し、該プレートを70℃でインキュベートし、ｔ＝100分での 値を上記のようにして記録する。
【００８３】 これらのデータから、どのプレートに活性なクローンが存在し、どこでこの活
性によりアルギニンローダミン誘導体もまたターンオーバーするが、リパーゼ基
質であるメチルウンベリフェロンヘプタノエートおよびタンパク質であるフルオ
レセイン結合カゼインは基質として機能しないのか、が示される。
【００８４】 キラルアミノエステルは少なくとも以下の基質を用いて調べることができる。
【００８５】
【化４】 ターンオーバーする各基質について、エナンチオ選択性値Ｅを次の方程式に従
って求める。
【００８６】
【数１】 式中、eep＝加水分解生成物のエナンチオマー過剰率（ee）であり、ｃ＝反応の 転換率（％）である。WongおよびWhitesides, Enzymes in Synthetic Organic C
hemistry（合成有機化学の酵素）, 1994, Elsevier, Tarrytown, New York, 9~1
2頁を参照のこと。
【００８７】 エナンチオマー過剰率は、キラル高速液体クロマトグラフィー（HPLC）または
キラルキャピラリー電気泳動（CE）のいずれかにより求める。アッセイは次のよ
うにして行う：適当なバッファー200μLを96ウェル白色マイクロタイタープレー
トの各ウェルに添加した後、部分的もしくは完全に精製した酵素溶液50μLを添 加し、基質50μLを添加し、蛍光発光の増大を、該基質の50％が消費されるかま たは反応が停止するかのどちらか先に起こるまで、時間に対して（経時的に）モ
ニターする。
【００８８】実施例８ 安定で大きなインサートであるピコプランクトン・ゲノムDNAライブラリーの構 築 細胞の採取およびDNAの調製 濃縮したピコプランクトン（picoplankton）細胞を含有するアガロースプラグ
を、オレゴン州ニューポート（Newport, Oregon）からハワイ州ホノルル（Honol
ulu, Hawaii）までの海洋巡航で採取したサンプルから調製した。Niskinビンに 海水（30リットル）を採取し、10μmのNitexで篩い、陥凹ファイバー濾過（Amic
on DC10）により30,000分子量カットオフのポリフルホン(polyfulfone)フィルタ
ーを通して濃縮した。濃縮した細菌性プランクトンの細胞を0.22μm、47mm Dura
poreフィルターで集め、最終密度が1ml当たり約1×1010個の細胞となるように2 ×STEバッファー（1M NaCl, 0.1M EDTA, 10mM Tris, pH 8.0）1mlに再懸濁した 。この細胞懸濁液を１倍容量の１%溶融Seaplaque LMPアガロース（FMC）（40℃ に冷却したもの）と混合し、その後すぐに１ml容のシリンジに吸い上げた。この
シリンジをパラフィルムで密封し、氷上に10分間置いた。細胞含有アガロースプ
ラグを10mlの溶解バッファー（10mM Tris pH 8.0, 50mM NaCl, 0.1M EDTA, 1% S
arkosyl, 0.2% デオキシコール酸ナトリウム, 1mg/ml リゾチーム）中に押し出 し、37℃にて１時間インキュベートした。次に、このアガロースプラグを40mls のESPバッファー（0.5M EDTA中、1% Sarkosyl, １mg/ml プロテイナーゼＫ）に 移し、55℃にて16時間インキュベートした。この溶液をデカンテーションし、新
しいESPバッファーと交換し、55℃にてさらに１時間インキュベートした。次に このアガロースプラグを50mM EDTA中に入れ、海洋巡航の間中は船上で４℃にて 保存した。
【００８９】 オレゴン沿岸から採取したサンプルから調製したアガロースプラグの一つの切
片（72μl）を２mL容マイクロ遠心管内で１mLのバッファーＡ（100mM NaCl, 10m
M ビストリスプロパン-HCl, 100μg/mlアセチル化BSA: pH 7.0、25℃）に対して
４℃にて一夜透析した。この溶液を、10mM MgCl2および1mM DTTを含有する新し いバッファーＡの250μLと交換し、揺動式プラットフォーム（rocking platform
）上で室温にて１時間インキュベートした。次いで、この溶液を、４UのSau3AI （NEB）を含有する同じバッファーの250μLに替え、水浴内で37℃に平衡化し、 次いで揺動式プラットフォーム上で37℃インキュベーター内で45分間インキュベ
ートした。このプラグを1.5ml容マイクロ遠心管に移し、68℃にて30分間インキ ュベートして、該酵素を不活性化し、アガロースを溶かした。製造業者の推奨に
従って、ゲラーゼ（Gelase）およびHK-ホスファターゼ（Epicentre）をそれぞれ
用いてこのアガロースを消化し、DNAを脱リン酸化した。穏やかなフェノール／ クロロホルム抽出によりタンパク質を除去し、DNAをエタノール沈殿させ、ペレ ット化し、次いで70％エタノールで洗浄した。この部分消化DNAを滅菌水に再懸 濁して濃度2.5ng/μlとし、pFOS1ベクターへの連結用とした。
【００９０】 幾つかのアガロースプラグからのPCR増幅の結果より（データは示さず）、有 意な量の古細菌（archaeal）DNAの存在が示された。オレゴン沿岸の深さ200ｍの
ところから採取した１つのサンプルから抽出したrRNAを用いた定量的ハイブリダ
イゼーション実験から、この集団（assemblage）中のプランクトン古細菌が総ピ
コプランクトンバイオマスの約4.7％を構成することが示された（このサンプル は、DeLongら, high abundance of Archaea in Antarctic marine picoplankton
（南極海のピコプランクトンにおける多量の古細菌）, Nature, 371:695-698, 1
994の表１中の”PACI”-200mに該当する）。アガロースプラグ溶解物について実
施した古細菌バイアスrDNAのPCR増幅の結果から、このサンプル中には比較的多 量の古細菌DNAが存在することが確認された。このピコプランクトンサンプルか ら調製したアガロースプラグを、続いて行われるホスミド(fosmid)ライブラリー
調製用に選択した。この部位からの各１mlのアガロースプラグは約7.5×105個の
細胞を含んでおり、したがって部分消化DNAの調製に用いられる72μlの切片中に
は約5.4×105個の細胞が存在した。
【００９１】 Kimら（Stable propagation of casmid sized human DNA inserts in an F fa
ctor based vector（F因子ベースのベクターにおける、カスミド(casmid)サイズ
化ヒトDNAインサートの安定な増殖）, Nucl. Acids Res., 20:10832-10835, 199
2）が記載のようにしてpFOS1からベクターアームを調製した。簡単に説明すると
、このプラスミドをAstIIで完全に消化し、HKホスファターゼで脱リン酸化し、 次いでBamHIで消化して、２本のアームを得た。これらの各々は35〜45kbpの間の
連結DNAをクローニングおよびパッケージングするためにcos部位を適切な向きで
含んでいた。この部分消化ピコプランクトンDNAを、ベクターおよびインサート をそれぞれ25ngと１ＵのT4 DNAリガーゼ（Boehringer-Mannheim）とを含有する1
5μlの連結反応物中で、該PFOS1アームに一夜連結させた。この反応物の４μl中
に含まれる連結DNAを、Gigapack XLパッケージングシステム（Stratagene）、大
腸菌 DH10B株（BRL）にトランスフェクトしたホスミド粒子およびLBcm15プレー トに塗沫した細胞を用いてin vitroパッケージングした。こうして得られたホス
ミドクローンを、７％グリセロールを補充したLBcm15を含有する96ウェルのマイ
クロタイターディッシュに選択した。それぞれ約40kbのピコプランクトンDNAイ ンサートを含む組換えホスミドから、約1.4×108塩基対のクローン化DNAを含む3
.552個のホスミドクローンのライブラリーが得られた。調べたクローンは全て、
38〜42kbpの範囲のインサートを含んでいた。このライブラリーは、その後の分 析用として−80℃で凍結保存した。
【００９２】 上記の技術から鑑みて本発明では非常に多くの変更および改変が可能である。
したがって、本発明は、特許請求の範囲内で、特に記載した以外のように実施す
ることが可能である。
【００９３】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例2で述べた種々の供試ゲノムＤＮＡ単離物中のG＋Cによって示す総ＤＮ Ａ含量の百分率を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA17 AA20 BA07 CA01 CA10 CA20 HA09 HA11 4B063 QA01 QQ05 QQ42 QQ44 QR08 QR14 QR32 QR42 QR62 QS25 QS28

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 環境サンプルから平均化されたゲノムDNAライブラリーを作 製する方法であって、 （ａ）環境サンプルからゲノムDNA集団を単離し、 （ｂ）(i)単離されたDNA集団のコピー数の増幅、及び(ii)所望の特性を有する単
    離されたゲノムDNA画分の回収、からなる群から選択される段階のうち少なくと も一つを行い、そして （ｃ）ゲノムDNA集団内の種々のDNAの提示物を平均化して環境サンプルからゲノ
    ムDNAの平均化ライブラリーを作製する 段階を含む、上記方法。
  2. 【請求項２】 所望の特性を有する単離されたゲノムDNA画分を回収する段 階を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 単離されたDNA集団のコピー数を増幅する段階を含む、請求 項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 ゲノムDNAの増幅段階が平均化段階の前である、請求項１に 記載の方法。
  5. 【請求項５】 ゲノムDNAの平均化段階が増幅段階の前である、請求項１に 記載の方法。
  6. 【請求項６】 (i)単離されたDNA集団のコピー数を増幅する段階、及び (ii)所望の特性を有する単離されたゲノムDNA画分を回収する段階、 の双方を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 環境サンプルから作製された平均化ゲノムDNAライブラリー であって、 （ａ）環境サンプルからゲノムDNA集団を単離し、 （ｂ）(i)単離されたDNA集団のコピー数の増幅、及び(ii)所望の特性を有する単
    離されたゲノムDNA画分の回収、のうち少なくとも一つを行い、そして （ｃ）ゲノムDNA集団内の種々のDNAの提示物を平均化して環境サンプルからゲノ
    ムDNAの平均化ライブラリーを作製する 段階を含む方法によって作製された、上記ライブラリー。
  8. 【請求項８】 上記ライブラリーの作製方法が所望の特性を有する単離され
    たゲノムDNA画分を回収する段階を含む、請求項１に記載のライブラリー。
  9. 【請求項９】 上記ライブラリーの作製方法が単離されたDNA集団のコピー 数を増幅する段階を含む、請求項１に記載のライブラリー。
  10. 【請求項１０】 上記ライブラリーの作製方法において、ゲノムDNAの増幅 段階が平均化段階の前である、請求項１に記載のライブラリー。
  11. 【請求項１１】 上記ライブラリーの作製方法において、ゲノムDNAの平均 化段階が増幅段階の前である、請求項１に記載のライブラリー。
  12. 【請求項１２】 上記ライブラリーを作製する方法が、(i)単離されたDNA集
    団のコピー数の増幅、及び(ii)所望の特性を有する単離されたゲノムDNA画分の 回収、の双方の段階を含む、請求項１に記載のライブラリー。
  13. 【請求項１３】 環境サンプルからゲノム遺伝子クラスターの平均化ライブ
    ラリーを作製する方法であって、 （ａ）環境サンプルからゲノムDNA集団を単離し、 （ｂ）(i)単離されたDNA集団のコピー数の増幅、及び(ii)所望の特性を有する単
    離されたゲノムDNA画分の回収、のうち少なくとも一つを行い、そして （ｃ）ゲノムDNA集団内の種々のDNAの提示物を平均化して環境サンプルからゲノ
    ムDNAの平均化ライブラリーを作製する 段階を含む、上記方法。
  14. 【請求項１４】 環境サンプルから作製されたゲノム遺伝子クラスターの平
    均化ライブラリーであって、 （ａ）環境サンプルからゲノムDNA集団を単離し、 （ｂ）(i)単離されたDNA集団のコピー数の増幅、及び(ii)所望の特性を有する単
    離されたゲノムDNA画分の回収、のうち少なくとも一つを行い、そして （ｃ）ゲノムDNA集団内の種々のDNAの提示物を平均化して環境サンプルからゲノ
    ムDNAの平均化ライブラリーを作製する 段階を含む方法によって作製される、上記ライブラリー。
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8476011B1 (en) 1996-06-18 2013-07-02 Bp Corporation North America Inc. Construction and use of catalogued nucleic acid libraries that contain advantageously adjusted representations of defined components
US5763239A (en) 1996-06-18 1998-06-09 Diversa Corporation Production and use of normalized DNA libraries
US6326204B1 (en) 1997-01-17 2001-12-04 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
US6399334B1 (en) * 1997-09-24 2002-06-04 Invitrogen Corporation Normalized nucleic acid libraries and methods of production thereof
US6605430B1 (en) 1998-08-12 2003-08-12 Maxygen, Inc. DNA shuffling of monooxygenase genes for production of industrial chemicals
JP2002526107A (ja) 1998-10-07 2002-08-20 マキシジェン， インコーポレイテッド マイコトキシンの解毒のための核酸を生成するためのｄｎａシャッフリング
WO2000028018A1 (en) 1998-11-10 2000-05-18 Maxygen, Inc. Modified adp-glucose pyrophosphorylase for improvement and optimization of plant phenotypes
US6436675B1 (en) 1999-09-28 2002-08-20 Maxygen, Inc. Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling
US6376246B1 (en) 1999-02-05 2002-04-23 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US7384387B1 (en) 1999-02-11 2008-06-10 Maxygen, Inc. High throughput mass spectrometry
US6531316B1 (en) 1999-03-05 2003-03-11 Maxyag, Inc. Encryption of traits using split gene sequences and engineered genetic elements
US6686515B1 (en) 1999-11-23 2004-02-03 Maxygen, Inc. Homologous recombination in plants
FR2808276B1 (fr) 2000-04-26 2004-04-02 Renaud Nalin Procede d'extraction indirecte de l'adn d'organismes non cultivables et adn susceptible d'etre obtenu par ledit procede
CA2411828A1 (en) 2000-06-23 2002-01-03 Maxygen, Inc. Novel co-stimulatory molecules
US6858422B2 (en) 2000-07-13 2005-02-22 Codexis, Inc. Lipase genes
US8008459B2 (en) 2001-01-25 2011-08-30 Evolva Sa Concatemers of differentially expressed multiple genes
EP1356037B1 (en) 2001-01-25 2011-03-09 Evolva Ltd. A library of a collection of cells
EP1386966A1 (en) 2002-07-24 2004-02-04 Libragen Method for the expression of unknown environmental DNA into adapted host cells

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US5763239A (en) * 1996-06-18 1998-06-09 Diversa Corporation Production and use of normalized DNA libraries

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