JP4598826B2 - 遺伝子発現カセット及び形質転換体、並びにこの形質転換体を用いた2−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法及び2−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法 - Google Patents
遺伝子発現カセット及び形質転換体、並びにこの形質転換体を用いた2−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法及び2−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4598826B2 JP4598826B2 JP2007512466A JP2007512466A JP4598826B2 JP 4598826 B2 JP4598826 B2 JP 4598826B2 JP 2007512466 A JP2007512466 A JP 2007512466A JP 2007512466 A JP2007512466 A JP 2007512466A JP 4598826 B2 JP4598826 B2 JP 4598826B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- deoxy
- inosose
- doi
- siro
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D309/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings
- C07D309/16—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
- C07D309/28—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
- C07D309/30—Oxygen atoms, e.g. delta-lactones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
- C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
- C12P7/26—Ketones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
- C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
- C12Y503/01009—Glucose-6-phosphate isomerase (5.3.1.9)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明による遺伝子発現カセットは、2−デオキシ−シロ−イノソースの合成に関与する遺伝子からなることを特徴とする。つまり、本発明による遺伝子発現カセットは、2−デオキシ−シロ−イノソースの合成に関与する遺伝子と、この遺伝子の発現させ得る例えばベクター等の遺伝子とからなるものであれば、特に制限されない。
本発明による遺伝子発現カセットにおいて、2−デオキシ−シロ−イノソースの合成に関与する遺伝子としては、2−デオキシ−シロ−イノソースを合成し得る公知のタンパク質をコードする遺伝子であればよい。この例としては、D−グルコースからのDOIを合成する、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)由来のDOI合成酵素の42kDaサブユニットをコードするbtrC遺伝子が例示される(特許文献1、非特許文献1及びGenbank AB066276等参照。)。もちろん、DOI合成酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子であれば、バチルス・サーキュランス以外の生物に由来する遺伝子も利用できる。また、上記遺伝子の塩基配列は、本発明のDOIの合成酵素活性を有する酵素を合成する遺伝子であれば、その遺伝子の塩基配列に欠失、置換、挿入等の変異が生じていてもよい。
本発明による遺伝子発現カセットの構築には、上述の2−デオキシ−シロ−イノソースの合成に関与する遺伝子を、下述する宿主細胞内で発現させ得る遺伝子を用いればよい。遺伝子発現カセットの遺伝子構成としては、プロモーター、転写活性化に関与する配列、RBS(リボソーム結合部位)、ターミネーター等が例示される。例えば、大腸菌を宿主細胞とするタンパク質の大量発現系においては、当該遺伝子の5’上流にプロモーター、転写活性化に関与する配列、RBS(リボソーム結合部位)等のDNA配列の連結、当該遺伝子の3’下流にターミネーター等のDNA配列を連結すればよい。これらのDNA配列は大腸菌内で機能する配列であればどのような配列でもよい。プロモーターには構成的に発現を行うものや誘導的に発現を行うものがあるが、いずれのプロモーターを用いてもよく、好ましくは発現の制御が可能なものである。また、大腸菌を宿主とする遺伝子発現においては、通常、IPTG(イソプロピル−チオ−ガラクトピラノシド;isopropyl−thio−galactopyranoside)をはじめとする比較的コストの高い誘導物質が一般的に用いられる。
本発明による形質転換体は、宿主細胞に、上述の遺伝子発現カセットを導入してなることを特徴とする。以下、本発明における宿主細胞について、説明する。
本発明による形質転換体に使用し得る宿主細胞としては、特に制限はなく、菌株の寄託機関(例えばIFO、ATCC等)に寄託されている菌を使用することができる。このような例としては、例えば、大腸菌が挙げられる。また、大腸菌以外の宿主細胞として、GILSP(Good Industrial Large−Scale Practice(優良工業規範))遺伝子組換え微生物リストに記載されている宿主細胞(平成18年3月現在のもの、バシラス・アミロリケファシエンス、バシラス・ブレビス HPD31、バシラス・ブレビス HPD31−M3、バシラス・リシェニフォルミス DN2461、バシラス・リシェニフォルミス DN2717、バシラス・サチリス K2A1、バシラス・サチリス M168由来株、コリネバクテリウム・グルタミカム、エシェリキア・コリ K12由来株、ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス)を用いてもよい。
本発明による形質転換体において、上述の宿主細胞は、2−デオキシ−シロ−イノソースの合成を考慮して、種々の染色体/プラスミド遺伝子を破壊した株を用いてもよい。本発明の好ましい態様では、宿主細胞が保有する、グルコース−6−リン酸の代謝に関わる酵素である、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコース−6−リン酸 1−デヒドロゲナーゼおよびホスホグルコムターゼをコードする遺伝子(それぞれ、pgi遺伝子、zwf遺伝子およびpgm遺伝子)がそれぞれ単独で遺伝子破壊されているか、または2つが同時に遺伝子破壊されている(pgi遺伝子とzwf遺伝子およびpgi遺伝子とpgm遺伝子)、もしくは3つが同時に遺伝子破壊されている。さらに、定常期におけるタンパク合成の制御に関わるRMFタンパク質をコードする遺伝子(rmf遺伝子)が単独で遺伝子破壊されているか、または上記のグルコース−6−リン酸の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子が破壊されている各種遺伝子破壊株に対してrmf遺伝子破壊されている。上記のこれによって、DOI生産のための直接の基質となるグルコース−6−リン酸の菌による分解代謝が抑制され、また定常期におけるタンパク質合成によりDOI生産能が飛躍的に高まった。
DOIを可能な限り高収率で合成するためには、菌体によるD−グルコースの異化代謝をできる限り抑制する必要があると考えられる。大腸菌において、D−グルコースの異化代謝に関わる酵素をコードする遺伝子としては、解糖系においてグルコース−6−リン酸からフルクトース−6−リン酸への変換に関わるホスホグルコース・イソメラーゼ(phosphoglucose isomerase)をコードする(pgi)遺伝子と、ペントースリン酸経路において、グルコース−6−リン酸からホスホグルコノラクトンヘの変換に関与する酵素であるグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(Gluxose−6−phosphate dehydrogenase)をコードするzwf遺伝子やグルコース−6−リン酸からグルコース−1−リン酸への変換に関わる酵素ホスホグルコムターゼ(phosphoglucomutase)をコードするpgm遺伝子の3種が存在する。これらの遺伝子を破壊することによって、DOI合成酵素の基質となるグルコース−6−リン酸の、菌体の増殖に伴う異化分解を抑制することが可能であると考えられる。
定常期におけるBtrCタンパク質合成の抑制を解除するためには、これに関与するRMFタンパク質の産生を抑制する必要があると考えられる。そこで、RMFタンパク質をコードするrmf遺伝子を破壊することによって、定常期以降もBtrCタンパク質の合成が継続し、さらにDOI合成が続くものと思われる。
本発明において、宿主細胞の特定の遺伝子を破壊した遺伝子破壊株を作製する方法としては、本技術分野公知の方法を用いればよい。例えば、突然変異を誘発させる方法(自然育種による方法、変異剤添加、紫外線照射、放射線照射等)、ランダムな突然変異による方法(Insertion Sequence(IS)、トランスポゾン(Tn)等による方法)、部位特異的な遺伝子破壊法(シングル及びダブルクロスオーバー法によるもの)等が例示される。なかでも、破壊対象の遺伝子に、薬剤耐性を示す遺伝子を含む断片を挿入し得る部位特異的な遺伝子破壊法は、所望する遺伝子破壊株のスクリーニングの点で、好ましい。なお、下述するように、本発明による形質転換体に用いる遺伝子破壊を行った宿主細胞は、Gene Bridges社のQuick and Easy BAC Modification Kitを用いて作製したが、これに限定されるものではない。
本発明による形質転換体は、上述の遺伝子発現カセットを、上述の宿主細胞に導入して作製すればよい。この導入方法としては、コンピテンス法や受容体を介したエンドサイトーシスを用いた方法などを挙げられる。
本発明による2−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法は、上述の形質転換体と、炭素源とを、形質転換体の成長等に適当な媒体中で接触させることを特徴とする。
本発明による2−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法は、上述の形質転換体と、炭素源とを接触させて2−デオキシ−シロ−イノソースを有する組成物を得る工程と、該組成物を、水素イオン型強酸性陽イオン交換樹脂と有機酸イオン型塩基性陰イオン交換樹脂とを有する混床式又は二床式カラムで処理する工程と、を有することを特徴とする。本発明による2−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法において、形質転換体と炭素源とを接触させるステップは、上述の本発明による2−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法に準じて行う。このステップにより、2−デオキシ−シロ−イノソースを含む組成物が得られる。この組成物は、上述の媒体からなるものであるが、以下、媒体として培地を用いた場合について、述べる。
本発明による2−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法は、上述の2−デオキシ−シロ−イノソースを、トリアルコキシメタンと反応させて、2−デオキシ−シロ−イノソースジアルキルケタールを得る工程と、該2−デオキシ−シロ−イノソースジアルキルケタールを、酸の存在下で加水分解する工程と、を有することを特徴とする。この態様において用い得る2−デオキシ−シロ−イノソースとしては、2−デオキシ−シロ−イノソースを含む上述の組成物の他、第一の態様で得た2−デオキシ−シロ−イノソースなどが挙げられる。以下、この第二の態様について説明する。
<<DOI合成酵素遺伝子>>
糖質環化酵素遺伝子としては、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)由来の、2−デオキシ−シロ−イノソース(DOI)合成酵素の42kDaサブユニットをコードするbtrC遺伝子(特許文献1、Genbank AB066276、非特許文献2等参照)を利用した。
<<組換えプラスミド及び組換え株の構築>>
<btrC遺伝子及びpLEX−btrC>
btrC遺伝子全長を含むプラスミドpDS4(非特許文献3)を鋳型として配列番号1に示すプライマー1と配列番号2に示すプライマー2とを用い、btrC遺伝子のPCR増幅には、KODポリメラーゼ(TOYOBO)を用い、PCRの反応条件は、94℃×30秒、52℃×30秒、68℃×1分を1サイクルとして、30サイクル行った。このようにPCR増幅したDNA断片を、NdeIとXbaIとで消化し、これをベクターpLEX(Invitrogen)のマルチクローニングサイトのNdeI−XbaI部位に挿入することによって、pLEX−btrCを構築した(図2A)。
gapAプロモーター遺伝子は、大腸菌の染色体DNAを鋳型として配列番号17に示すプライマーと配列番号18に示すプライマーとを用い、PCR増幅により、合成した。このgapAプロモーター遺伝子のPCR増幅には、KODポリメラーゼを用い、以下の反応条件で、行い、gapAプロモーター断片を得た。
50℃×30秒
68℃×1分を1サイクルとして、30サイクル
52℃×30秒
68℃×1分を1サイクルとして、30サイクル
55℃×30秒
68℃×1分を1サイクルとして、30サイクル
52℃×30秒
68℃×1分を1サイクルとして、30サイクル
50℃×30秒
68℃×1分を1サイクルとして、30サイクル
<<宿主細胞の調製>>
遺伝子破壊は、Gene Bridges社のQuick and Easy BAC Modification Kitを用い、その添付説明書の方法に基づいて行った。pgi遺伝子の単独破壊に用いるカセットの作製のために使用したPCRプライマーセットの配列を配列番号3と配列番号4とに示す。zwf遺伝子の単独破壊に用いるカセットの増幅に用いたPCRプライマーセットの配列を配列番号5と配列番号6とに示す。pgm遺伝子の単独破壊に用いるカセットの作製のためのPCRプライマーセットの配列を配列番号7、配列番号8、配列番号9及び配列番号10に示す。pgi遺伝子とzwf遺伝子の二重破壊株を得るために、zwf遺伝子の単独破壊株に対して、pgi遺伝子を破壊するためのカセットを増幅するために用いたPCRプライマーセットの配列を配列番号11と配列番号12とに示す。pgi遺伝子とpgm遺伝子の二重破壊株を得るために、pgi遺伝子の単独破壊株に対して、pgm遺伝子を破壊するためのカセットを増幅するために用いたPCRプライマーセットの配列を配列番号7、配列番号8、配列番号9及び配列番号10に示す。さらに、pgi遺伝子とzwf遺伝子とpgm遺伝子の三重破壊株を得るために、pgi遺伝子とpgm遺伝子の二重破壊株に対して、zwf遺伝子を破壊するためのカセットを増幅するために用いたPCRプライマーセットの配列を配列番号5と配列番号6とに示す。また、rmf遺伝子の破壊カセットに用いたプライマーは、配列番号13、配列番号14、配列番号15及び配列番号16に示す。
<<形質転換体>>
Gene Bridges社のKitの添付説明書に記載されているプロトコールに従って、上述の通り得たpLEX−btrCにより宿主大腸菌株(GI724)を形質転換し、アンピシリンを含む培地で選択することにより、GI724/pLEX−btrC株を得た。また、同様に、pGAP−btrC/pGAD−btrCを宿主大腸菌株(GI724)に形質転換し、アンピシリンを含む培地で選択することにより、GI724/pGAP−btrC/pGAD−btrC株を得た。さらに、GI724Δrmf、GI724Δpgi、GI724Δzwf、GI724Δpgm、GI724ΔpgiΔrmf、GI724ΔpgiΔzwf、GI724ΔpgiΔpgm及びGI724ΔpgiΔzwfΔpgmの各遺伝子破壊株に対しても同様にpGAP−btrC/pGAD−btrCを形質転換し、GI724Δrmf/pGAP−btrC/pGAD−btrC株、GI724Δpgi/pGAP−btrC/pGAD−btrC株、GI724Δzwf/pGAP−btrC/pGAD−btrC株、GI724Δpgm/pGAP−btrC/pGAD−btrC株、GI724ΔpgiΔrmf/pGAP−btrC/pGAD−btrC株、GI724ΔpgiΔzwf/pGAP−btrC/pGAD−btrC株、GI724ΔpgiΔpgm/pGAP−btrC/pGAD−btrC株やGI724ΔpgiΔzwfΔpgm/pGAP−btrC/pGAD−btrC株をそれぞれ得た。
<<DOI合成酵素の発現の確認>>
<GI724Δpgi/pLEX−btrC株>
GI724Δpgi/pLEX−btrC株を誘導培地(6%リン酸水素ナトリウム、3%リン酸二水素カリウム、0.5%塩化ナトリウム、1%塩化アンモニウム、0.2%カザミノ酸、0.5%D−グルコース、1mM塩化マグネシウム)にて、30℃でO.D600nm=0.7まで培養した後、2×YT培地(大腸菌用完全培地、1.6%トリプトファン、1%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム)に移し、37℃でさらに6時間培養した後、菌体を回収し、BtrCタンパク質の発現を12%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。その結果を図3Aに示す。2×YT培地で6時間培養することにより、BtrCが大量発現することが確認された。なお、図3Aの各レーンは、以下の通りである。
分子量マーカー(商品名:プレジションPlusプロテインスタンダード(BIO−RAD社製、カタログ番号:161−0374)、以下同様)
レーン1:
pLEX−btrCを含むGI724株を最少栄養培地(M9最少培地:0.6%リン酸水素ナトリウム、0.3%リン酸二水素カリウム、0.05%塩化ナトリウム、0.1%塩化アンモニウム)で6時間培養して得た菌体の抽出物(1×SDS Loding Buffer:50mM Tris−HCl(pH6.8);2%SDS;0.1%Bromophenolblue;10%Glycerol;100mMDithioyhreitol溶液で抽出、以下同様)
レーン2:
pLEX−btrCを含むGI724株を、トリプトファンを添加した誘導培地で、6時間培養した菌体の抽出物
レーン3:
pLEX−btrCを含むGI724株を、トリプトファンを添加しない誘導培地で、6時間培養した菌体の抽出物
レーン4:
米ぬか培地(組成:20%米ぬか酵素処理液)で2時間培養した菌体の抽出物
レーン5:
トリプトファンを添加した2×YT培地で米ぬか培地(組成:20%米ぬか酵素処理液)で6時間培養した菌体の抽出物
GI724ΔpgiΔzwfΔpgm/pGAP−btrC/pGAD−btrC株を前培養培地(0.6%リン酸水素二ナトリウム、0.3%リン酸二水素カリウム、0.05%塩化ナトリウム、0.1%塩化アンモニウム、2%カザミノ酸、1%グリセリン、1mM塩化マグネシウム)にて、30℃で一晩培養した。この前培養液を本培養培地として2×YT培地(大腸菌用完全培地;1.6%トリプトン、1%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム)に1%植菌し、さらに30℃でO.D.600nm=0.7まで培養した後、菌体を回収し、BtrCタンパク質の発現を12%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した。その結果を図3Bに示す。なお、図3Bの各レーンは、以下の通りある。
レーン2:本培養0時間後に採取した菌体抽出物
レーン3:本培養12時間後に採取した菌体抽出物
レーン4:本培養36時間後に採取した菌体抽出物
レーン5:本培養72時間後に採取した菌体抽出物
<<DOIの合成>>
<pLEX−btrCを含むGI724Δpgi株を用いたDOIの合成>
GI724Δpgi/pLEX−btrC株を300mL三角フラスコに入れた35mLの前培養液(RMG培地、0.6%リン酸水素ナトリウム、0.3%リン酸二水素カリウム、0.05%塩化ナトリウム、0.1%塩化アンモニウム、2%カザミノ酸、1%グリセリン、1mM塩化マグネシウム)に接種し、15時間培養した。次いで、3リットルの2×YT培地を入れた10リットル培養槽に1%の濃度で菌体を植菌した。これを培養温度30℃、攪拌速度300rpm、空気10L/分、pH7.7の条件で、600nmのO.D.が0.7になった時点でD−グルコースを2%または5%濃度添加し、さらに48時間培養を行った。所定の時間における培養液から遠心分離して菌体を除き、培養上清液1を回収した。
GI724△pgi△zwf/pLEX一btrC株を35mLの1%マンニトールを含むRMG培地(0.6%リン酸水素ナトリウム、0.3%リン酸二水素カリウム、0.05%塩化ナトリウム、0.1%塩化アンモニウム、2%カザミノ酸、1%グリセリン、1mM塩化マグネシウム)に植菌し、1晩前培養を行った。次いで、3リットルの3%マンニトールを含む2×YT培地(10リットル培養槽内)に1%の濃度で菌体を植菌し、30℃、攪拌速度300rpm、空気10L/分、pH7.7の条件で、培養し、600nmのO.D.が0.7となった時点でグルコースを3%濃度添加し、さらに培養を続けた。所定時間における培養液から遠心分離により菌体を除去し、培養上清液2を回収した。
pLEX−btrCを含むGI724ΔpgiΔzwfΔpgm株を300mL三角フラスコに50mLの前培養液(0.6%リン酸水素二ナトリウム、0.3%リン酸二水素カリウム、0.05%塩化ナトリウム、0.1%塩化アンモニウム、2%カザミノ酸、1%グリセロール、1mM塩化マグネシウム)に接種し、15時間培養した。この前培養液を、3Lの2×YT培地を入れた10L培養槽(丸菱バイオエンジ社MDL−6C型)に1%植菌した。これを培養温度25℃、攪拌速度300rpm、流入空気10L/分、pH7.0の条件で培養を行い、OD600nm=0.7になった時点でD−グルコースを5%濃度になるように添加し、さらに72時間培養を行った。所定の時間における培養液を遠心分離して菌体を除去し、培養上清液3を回収した。
pGAP−btrC/pGAD−btrCを含むGI724ΔpgiΔzwfΔpgm株を300mL三角フラスコに50mLの前培養液(0.6%リン酸水素二ナトリウム、0.3%リン酸二水素カリウム、0.05%塩化ナトリウム、0.1%塩化アンモニウム、2%カザミノ酸、1%グリセロール、1mM塩化マグネシウム)に接種し、15時間培養した。この前培養液を、3Lの2×YT培地を入れた10L培養槽に1%植菌した。これを培養温度25℃、攪拌速度300rpm、流入空気10L/分、pH6.0の条件で培養を行い、OD600nm=0.7になった時点でD−グルコースを5%濃度になるように添加し、さらに72時間培養を行った。所定時間における培養液から遠心分離して菌体を除去し、培養上清液4を回収した。
pLEX−btrCを含むGI724Δrmf株を試験管に3mLの前培養液(0.6%リン酸水素二ナトリウム、0.3%リン酸二水素カリウム、0.05%塩化ナトリウム、0.1%塩化アンモニウム、2%カザミノ酸、1%グリセロール、1mM塩化マグネシウム)に接種し、15時間培養した。この前培養液を、10mLの2×YT培地を入れたL型試験管に1%植菌した。これを培養温度30℃、振とう速度160rpm、pH7.0の条件で培養を行い、OD600nm=0.7になった時点でD−グルコースを3%濃度になるように添加し、さらに72時間培養を行った。所定時間における培養液から遠心分離して菌体を除去し、培養上清液5を回収した。
<<DOI生産量の測定>>
<DOIのオキシム化>
培養上清中に蓄積するDOIの定量を以下に示す手順に従って行った。培養上清液1及び2については、各時間において、培養液を採取し、上清液と等量の水、上清液の2倍量のメタノール、及び終濃度1.5 mg/mLのO−(4−ニ卜ロベンジル)ヒドロキシルアミン(NBHA)を加え混合し、60℃で1時間インキュベートすることによりDOIのオキシム化を誘導した。
このようにして得たDOIオキシム体について、Speep Vac System(Thermo社ISS110)で溶媒を蒸発させた後、オキシム化DOIを適当量のメタノールに溶解し、その一部をHPLC(高速液体クロマトグラフィー)分析法にて分析し、DOIの検出及び定量を行った。高速液体クロマトグラフィーではSHIMADZU社LC−10AT、カラムはPhrnomenex社Luna 5u C18(カラム長150mm、カラム内径4.6mm)を用い、溶離液として20%メタノールを用いた。262nmにおける紫外線吸収を測定した。DOIのO−(4−ニトロベンジル)オキシム誘導体の量を標準曲線法により定量した。なお、グルコースの定量は、Glucose assay procedure kit(Megazyme社製)を用いて、行った。
<pLEX−btrCを含むGI724Δpgi株を用いたDOIの合成>
GI724Δpgi/pLEX−btrC株を300mL三角フラスコに入れた35mLの前培養液(RMG培地:0.6%リン酸水素ナトリウム、0.3%リン酸二水素カリウム、0.05%塩化ナトリウム、0.1%塩化アンモニウム、2%カザミノ酸、1%グリセリン、1mM塩化マグネシウム)に接種し、15時間培養した。次いで、3リットルの2×YT培地を入れた10リットル培養槽に1%の濃度で菌体を植菌した。これを培養温度30℃、攪拌速度300rpm、空気10L/分、pH7.7の条件で、600nmのO.D.が0.7となった時点でD−グルコースを2%または5%濃度添加し、さらに24時間培養を行った。所定時間における培養液から遠心分離して菌体を除き、培養上清液11を回収した。
<pLEX−btrCを含むGI724ΔpgiΔzwfΔpgm株を用いたDOIの合成>
pLEX−btrCを含むGI724ΔpgiΔzwfΔpgm株を300mL三角フラスコに50mLの前培養液(0.6%リン酸水素二ナトリウム、0.3%リン酸二水素カリウム、0.05%塩化ナトリウム、0.1%塩化アンモニウム、2%カザミノ酸、1%グリセロール、1mM塩化マグネシウム)に接種し、15時間培養した。この前培養液を、3Lの2×YT培地を入れた10L培養槽(丸菱バイオエンジ社MDL−6C型)に1%植菌した。これを培養温度25℃、攪拌速度300rpm、流入空気10L/分、pH7.0の条件で培養を行い、OD600nm=0.7になった時点でD−グルコースを5%濃度になるように添加し、さらに72時間培養を行った。D−グルコース添加前及びD−グルコース添加後の培養液をそれぞれ回収し、この培養液を遠心分離して菌体を除去し、それぞれ培養上清液12及び13を回収した。
<pLEX−btrCを含むGI724野生型株を用いたDOIの合成>
pLEX−btrCを含むGI724野生型株を、3mLの前培養液(0.6%リン酸水素二ナトリウム、0.3%リン酸二水素カリウム、0.05%塩化ナトリウム、0.1%塩化アンモニウム、2%カザミノ酸、1%グリセロール、1mM塩化マグネシウム)を有する試験管に接種し、15時間培養した。この前培養液を、10mLの2×YT培地を入れたL型試験管に1%植菌した。これを培養温度30℃、振とう速度160rpm、pH7.0の条件で培養を行い、OD600nm=0.7になった時点でD−グルコースを3%濃度になるように添加し、さらに72時間培養を行った。所定時間における培養液から遠心分離して菌体を除去し、培養上清液14を回収した。
<DOI生産量の測定>
上述の通り得た培養上清液11乃至14中に蓄積するDOIの定量を以下に示す手順に従って行った。
<アンバーライトIR120とアンバーライトIRA410の混床式カラムを用いる方法>
水素イオン型のアンバーライトIR120と酢酸イオン型のアンバーライトIRA410とを各200mLずつ混合した後、カラム(φ5cm×25cm)に充填し、カラムをpH2.96に調整した、参考例1の培養液100mL(1.4gのDOIを含む)を添加した後、蒸留水を流速2mL/分で流すことにより溶離を行った。6mLずつのフラクションを集め、得られたフラクションについて1本おきにpHおよび伝導度を測定した。また、3本おきにDOIの定量も行った。DOIの定量は、O−(4−nitrobenzyl)oximeに誘導した後、HPLCで面積を測定した後、検量線より計算した。このときの結果を図10に示す。また、フラクションを4つのブロックに分けて集めて凍結乾燥した後、それぞれのブロック中のDOIの純度および量を測定した。結果を表2に示す。得られた精製DOIの13C−NMRスペクトルを図11に示す。13C−NMRスペクトルは、重水に溶解した試料をBruker社のDPX−250NMR装置(13C核は、67.5MHzで共鳴)を用いて測定した。
<アンバーライトIR200とアンバーライトIRA410の混床式カラムを用いる方法>
水素イオン型のアンバーライトIR200と酢酸イオン型のアンバーライトIRA410とを各200mLずつ混合した後、カラム(φ5cm×25cm)に充填した。これにpH2.97に調整した、参考例1の培養液50mL(562mgのDOIを含む)を添加した後、蒸留水を流速2mL/分で流すことにより溶出を行った。6mLずつのフラクションを集め、得られたフラクションについて1本おきにpHおよび伝導度を測定した。また、3本おきにDOIの定量も行った。このときの結果を図12に示す。また、フラクションを4つのブロックに分けて集めて凍結乾燥した後、それぞれのブロック中のDOIの純度および量を測定した。結果を表3に示す。得られた精製DOIの13C−NMRスペクトルを図13に示す。DOIの定量方法および13C−NMRスペクトルの測定方法は実施例8と同様にして行った。
<アンバーライト200CTとアンバーライトIRA 96SBの二床式カラムを用いる方法>
DOI含有培養液(DOI含有量:22.1g/850mL)を陽イオン交換樹脂カラム(アンバーライト200CT、水素イオン型、400mL)に負荷し、水で溶出させた。溶出液のTLC分析によりDOIが含まれている画分を陰イオン交換樹脂カラム(アンバーライトIRA96SB、酢酸イオン型、600mL)に通液し、続いて水で溶出させた。溶出液のTLC分析によりDOIが含まれている画分を減圧濃縮すると、図15の1H−NMRに示す純度のDOIが20.8g得られた。その純度は混床式カラムによる精製法の場合とほぼ同程度であった。1H−NMRは、重水に溶解した試料をBruker社のDPX−250NMR装置を用いて測定した。
<ジメチルケタール誘導体に変換して結晶化・精製した後、2−デオキシ−シロ−イノソースを復元する方法>
実施例10の精製DOI(17.8g)をメタノール(835mL)に溶解し、トリメトキシメタン(310mL)、トシル酸一水和物(2.12g)を加え3時間攪拌した後、重曹(30.6g)により反応液を中和し、濾過後に減圧濃縮を行った。残渣をメタノールに溶解し、その3倍量のシリカゲル(C−200、60g)を加えて減圧濃縮することでDOIをシリカゲル表面上に吸着させた。そのDOIを吸着させたシリカゲルを酢酸エチル:メタノール=5:1で作成したシリカゲルカラムに充填した。その後、酢酸エチル:メタノール=5:1の混合溶媒を用いDOIを溶出させた。DOIが含まれている溶出液を集めて減圧濃縮すると、ジメチルケタール誘導体(20.7g)を得た。続いて、メタノールを25mL加えて溶かした溶液に、クロロホルム100mLとヘキサン7.5mLとを加熱しながら加えて冷却して析出する白色結晶を分離すると、2−デオキシ−シロ−イノソース ジメチルケタール結晶9.1gを得た。図16に示す1H−NMRにおいて、不純物のシグナルは検出されていない。
本発明において使用される寄託微生物の表示は、以下のとおりである。
GI724ΔpgiΔzwfΔpgm/pGAP−btrC/pGAD−btrC
FERM AP−20809
1.受領機関名: 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
2.受領日: 平成18年2月24日
3.受領番号: FERM AP−20809
GI724ΔrmfΔpgi/pLEX−btrC
FERM AP−20808
1.受領機関名: 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
2.受領日: 平成18年2月24日
3.受領番号: FERM AP−20808
Claims (8)
- 宿主細胞に、2−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素をコードする遺伝子を有する遺伝子発現カセットを導入してなる形質転換体であって、
前記宿主細胞は、ホスホグルコースイソメラーゼをコードするpgi遺伝子、グルコース−6−リン酸 1−デヒドロゲナーゼをコードするzwf遺伝子、ホスホグルコムターゼをコードするpgm遺伝子及び定常期におけるタンパク質合成の修飾を担うリボソーム修飾因子タンパク質をコードするrmf遺伝子からなる群から選択された少なくとも1つの遺伝子が破壊された宿主細胞である、前記形質転換体。 - 前記宿主細胞は、大腸菌種、バシラス・アミロリケファシエンス、バシラス・サチリス M168由来株、コリネバクテリウム・グルタミカム、エシェリキア・コリ K12由来株及びゲオバシラス・ステアロサーモフィラスからなる群から選択された宿主細胞である、請求項1に記載の形質転換体。
- 請求項1または2に記載の形質転換体と、炭素源とを接触させる工程を含む、2−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法。
- 前記炭素源は、D−グルコース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか及び廃糖蜜並びにD−グルコースを得ることが可能なバイオマスからなる群から選択された少なくとも1種類の炭素源であることを特徴とする請求項3に記載の2−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法。
- 請求項1または2に記載の形質転換体と、炭素源とを接触させて2−デオキシ−シロ−イノソースを有する組成物を得る工程と、
該組成物を、水素イオン型強酸性陽イオン交換樹脂と有機酸イオン型塩基性陰イオン交換樹脂とを有する混床式又は二床式カラムで処理する工程と、
を含む、2−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法。 - 前記有機酸イオン型塩基性陰イオン交換樹脂は、酢酸イオン型陰イオン交換樹脂であることを特徴とする請求項5に記載の2−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法。
- 2−デオキシ−シロ−イノソースを、トリアルコキシメタンと反応させて、2−デオキシ−シロ−イノソースジアルキルケタールを得る工程と、
該2−デオキシ−シロ−イノソースジアルキルケタールを、酸の存在下で加水分解する工程と、
をさらに含む、請求項5または6に記載の2−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法。 - 前記トリアルコキシメタンは、トリメトキシメタンである、請求項7に記載の2−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/JP2005/006022 WO2006112000A1 (ja) | 2005-03-30 | 2005-03-30 | 大腸菌変異株による2-デオキシ-シロ-イノソースの合成および精製する方法並びに得られた2-デオキシ-シロ-イノソース |
JPPCT/JP2005/006022 | 2005-03-30 | ||
PCT/JP2006/305782 WO2006109479A1 (ja) | 2005-03-30 | 2006-03-23 | 遺伝子発現カセット及び形質転換体、並びにこの形質転換体を用いた2-デオキシ-シロ-イノソースの製造方法及び2-デオキシ-シロ-イノソースの精製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2006109479A1 JPWO2006109479A1 (ja) | 2008-10-23 |
JP4598826B2 true JP4598826B2 (ja) | 2010-12-15 |
Family
ID=37086767
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007512466A Active JP4598826B2 (ja) | 2005-03-30 | 2006-03-23 | 遺伝子発現カセット及び形質転換体、並びにこの形質転換体を用いた2−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法及び2−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8758741B2 (ja) |
EP (1) | EP1865056B1 (ja) |
JP (1) | JP4598826B2 (ja) |
KR (1) | KR101019759B1 (ja) |
CN (1) | CN101151368B (ja) |
BR (1) | BRPI0607623B1 (ja) |
DE (1) | DE602006019835D1 (ja) |
WO (2) | WO2006112000A1 (ja) |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7521481B2 (en) | 2003-02-27 | 2009-04-21 | Mclaurin Joanne | Methods of preventing, treating and diagnosing disorders of protein aggregation |
ES2425264T3 (es) | 2007-04-12 | 2013-10-14 | Waratah Pharmaceuticals, Inc. | Uso de derivados de ciclohexanohexol en el tratamiento de enfermedades oculares |
CN101990528B (zh) | 2008-04-11 | 2013-07-31 | 三井化学株式会社 | 儿茶酚的制备方法 |
US8647642B2 (en) | 2008-09-18 | 2014-02-11 | Aviex Technologies, Llc | Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment |
JP5254353B2 (ja) * | 2008-11-05 | 2013-08-07 | 三井化学株式会社 | 2−デオキシ−シロ−イノソース(doi)生産細菌及びこれを用いた2−デオキシ−シロ−イノソース(doi)生産方法 |
JP5661250B2 (ja) * | 2009-03-26 | 2015-01-28 | 旭化成ケミカルズ株式会社 | 新規グルコース−6−リン酸定量方法および定量試薬 |
TWI408229B (zh) * | 2009-03-26 | 2013-09-11 | Asahi Kasei Chemicals Corp | 新穎之2-脫氧蟹肌醇合成酶 |
JP5457058B2 (ja) * | 2009-03-27 | 2014-04-02 | 旭化成ケミカルズ株式会社 | リン酸濃度制御による2−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法 |
US8604253B2 (en) | 2009-04-28 | 2013-12-10 | Mitsui Chemicals, Inc. | Method for producing polyhydric phenol |
WO2013125666A1 (ja) * | 2012-02-23 | 2013-08-29 | 株式会社日本触媒 | イノシトール高生産微生物およびそれを用いたイノシトールの製造方法 |
JP6321645B2 (ja) * | 2013-07-12 | 2018-05-09 | 三井化学株式会社 | 2−デオキシ−シロ−イノソースの生産方法 |
JP6487852B2 (ja) | 2013-12-16 | 2019-03-20 | 旭化成株式会社 | 2−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素 |
WO2017029353A1 (en) | 2015-08-20 | 2017-02-23 | Transition Therapeutics Ireland Limited | Treatment of behaviors in dementia patients |
KR101718508B1 (ko) * | 2015-11-17 | 2017-03-21 | 고려대학교 산학협력단 | 2-데옥시-실로-이노소스 생합성 경로를 가지는 재조합 고초균 및 이를 이용한 2-데옥시-실로-이노소스의 제조방법 |
US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
EP3604526A4 (en) | 2017-03-27 | 2020-12-02 | The Niigata Institute of Science and Technology | 2-DEOXY-SCYLLO-INOSOSE MUTANT SYNTHASE |
JP7260872B2 (ja) * | 2018-10-25 | 2023-04-19 | 株式会社Ihi | トリヒドロキシベンゼンを製造するためのシステム |
JP7173538B2 (ja) * | 2018-10-25 | 2022-11-16 | 株式会社Ihi | トリヒドロキシベンゼンの製造方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000236881A (ja) * | 1999-02-22 | 2000-09-05 | Tokyo Inst Of Technol | 2−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素、アミノ酸配列、遺伝子塩基配列 |
JP2001299372A (ja) * | 2000-03-23 | 2001-10-30 | Degussa Ag | dapC−遺伝子をコードするヌクレオチド配列およびL−リシンの製法 |
JP2002306191A (ja) * | 2000-12-22 | 2002-10-22 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4303526B2 (ja) * | 2003-06-11 | 2009-07-29 | 北興化学工業株式会社 | (−)−2−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法 |
-
2005
- 2005-03-30 WO PCT/JP2005/006022 patent/WO2006112000A1/ja not_active Application Discontinuation
-
2006
- 2006-03-23 DE DE602006019835T patent/DE602006019835D1/de active Active
- 2006-03-23 KR KR1020077024620A patent/KR101019759B1/ko active IP Right Grant
- 2006-03-23 WO PCT/JP2006/305782 patent/WO2006109479A1/ja active Application Filing
- 2006-03-23 EP EP06729749A patent/EP1865056B1/en active Active
- 2006-03-23 CN CN2006800107712A patent/CN101151368B/zh active Active
- 2006-03-23 BR BRPI0607623-8A patent/BRPI0607623B1/pt active IP Right Grant
- 2006-03-23 JP JP2007512466A patent/JP4598826B2/ja active Active
- 2006-03-23 US US11/887,445 patent/US8758741B2/en active Active
-
2014
- 2014-02-12 US US14/178,496 patent/US20140256960A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000236881A (ja) * | 1999-02-22 | 2000-09-05 | Tokyo Inst Of Technol | 2−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素、アミノ酸配列、遺伝子塩基配列 |
JP2001299372A (ja) * | 2000-03-23 | 2001-10-30 | Degussa Ag | dapC−遺伝子をコードするヌクレオチド配列およびL−リシンの製法 |
JP2002306191A (ja) * | 2000-12-22 | 2002-10-22 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20100015672A1 (en) | 2010-01-21 |
KR20080005931A (ko) | 2008-01-15 |
CN101151368B (zh) | 2011-06-15 |
JPWO2006109479A1 (ja) | 2008-10-23 |
WO2006109479A1 (ja) | 2006-10-19 |
CN101151368A (zh) | 2008-03-26 |
KR101019759B1 (ko) | 2011-03-04 |
EP1865056A4 (en) | 2008-04-16 |
BRPI0607623B1 (pt) | 2021-03-02 |
WO2006112000A1 (ja) | 2006-10-26 |
EP1865056B1 (en) | 2011-01-26 |
BRPI0607623A2 (pt) | 2009-09-22 |
US8758741B2 (en) | 2014-06-24 |
DE602006019835D1 (de) | 2011-03-10 |
US20140256960A1 (en) | 2014-09-11 |
EP1865056A1 (en) | 2007-12-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4598826B2 (ja) | 遺伝子発現カセット及び形質転換体、並びにこの形質転換体を用いた2−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法及び2−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法 | |
JP5762666B2 (ja) | フロログルシノールの生合成およびそれからの1,3−ジヒドロキシベンゼンの製造 | |
KR20110046560A (ko) | 2-히드록시-이소부티레이트 (2-hiba)의 효소적 생산 | |
Simkhada et al. | Genetic engineering approach for the production of rhamnosyl and allosyl flavonoids from Escherichia coli | |
WO2004018672A1 (ja) | 新規アルドラーゼおよび置換α−ケト酸の製造方法 | |
EP2986730B1 (en) | Biosynthetic pathways and products | |
JP6144804B2 (ja) | グルカル酸の製造方法 | |
EP2176415B1 (en) | Preparing method for (s)-3-hydroxybutyric acid and (s)-3-hydroxybutyrate ester using recombinant microorganism | |
CN110791488A (zh) | 用于拆分手性化合物的脂肪酶及其制备方法和应用 | |
JP2016135135A (ja) | シロ‐イノシトールの製造方法 | |
JP2015530121A (ja) | 有機酸を産生するための組換え微生物 | |
CN112779232B (zh) | 一种手性胺醇化合物的合成方法 | |
CN110607335B (zh) | 一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类化合物生物合成方法 | |
KR20160043498A (ko) | D-자일로스로부터 1,2,4-부탄트리올을 생산하는 재조합 대장균, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 1,2,4-부탄트리올을 생산하는 방법 | |
JP2006262846A (ja) | 酵母による2−デオキシ−シロ−イノソースの合成および精製する方法並びに得られた2−デオキシ−シロ−イノソース | |
CN111944774B (zh) | 醇脱氢酶及其编码基因和在催化合成(r)-苯基乙二醇中的应用 | |
JP4381132B2 (ja) | アミノヒドロキシ芳香族カルボン酸の生産に関与する遺伝子およびアミノヒドロキシ安息香酸類の製造方法 | |
JP5109460B2 (ja) | 3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドの製造に用いられる新規微生物、該微生物を用いて3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドを製造する方法および該3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドにより得られたポリマー | |
KR101785150B1 (ko) | 모듈식 스캐폴드를 이용한 감마 아미노부티르산의 생산방법 | |
JP2004525606A (ja) | トランス−ジヒドロキシシクロヘキサジエンカルボン酸および/またはその誘導体の改善された製造および単離のための方法、ならびに該方法に適した遺伝的に改変された微生物 | |
KR20220032084A (ko) | 유전자 재조합 미생물 및 디아민 화합물의 제조 방법 | |
KR101718508B1 (ko) | 2-데옥시-실로-이노소스 생합성 경로를 가지는 재조합 고초균 및 이를 이용한 2-데옥시-실로-이노소스의 제조방법 | |
Thuy et al. | Biosynthesis of dTDP-6-deoxy-β-d-allose, biochemical characterization of dTDP-4-keto-6-deoxyglucose reductase (GerKI) from Streptomyces sp. KCTC 0041BP | |
KR101217670B1 (ko) | 신규한 라이보스-6-인산 이성화효소 또는 그 돌연변이체에 의한 알로스 생산 | |
Sun et al. | Characterization of Methyltransferase from Apramycin Biosynthetic Gene Cluster and Improvement Production of Apramycin in Engineered Streptoalloteichus Tenebrarius |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20090209 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20090209 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091215 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20091215 |
|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20100107 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100224 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20100326 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100326 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100624 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100820 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100910 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100924 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4598826 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131001 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |