BRPI0607623B1 - escherichia coli transgênica - Google Patents

Abstract

CASSETE DE EXPRESSÃO DE GENE E UM TRANSFORMANTE, E UM MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE 2- DEÓXI-SCYLLO-INOSOSE E UM MÉTODO PARA PURIFICAR 2-DEÓXI-SCYLLO-INOSOSE USANDO REFERIDO TRANSFORMANTE. Um transformante é preparado para inserir pelo menos um cassete de expressão de gene compreendendo um gene envolvido na síntese de 2-deóxi-scyllo-inosose em E. coli como células hospedeiras. Uma 2-deóxi-scyllo-inosose é sintetizada a partir de D-glicose, oligossacarídeo, polissacarídeo, amido e farelo de arroz, usando-se o transformante. Uma solução de cultura contendo a 2-deôxi-scyllo-inosose é tratada com uma coluna tipo leito misturado, ou leito duplo, compreendendo uma forma de hidrogénio de resina de troca de cátion de ácido forte, e uma forma de íon orgânico de resina de troca de ânion básica. A 2-deóxi-scyllo-inosose conforme purificada é reagida com trimetoximetano para converter em 2-deóxi- scyllo-inosose dimetilcetal, e o dimetilacetal é cristalizado e purificado. Em seguida, a DOI é altamente purificada através da hidrolisação do dimetilcetal na presença de ácido.

Description

TÉCNICA RELACIONADA

[001] A presente invenção refere-se a um cassete de expressão de gene e a um transformante, e a um método para produção de 2- deóxi-scyllo-inosose, e a um método para purificação de 2-deóxi- scyllo-inosose usando o transformante.

TÉCNICA ANTERIOR

[002] O composto carbocíclico de seis membros tem sido produzido a partir de petróleo como materiais de partida na petroquímica. Por outro lado, 2-deóxi-scyllo-inosose sintase (DOI sintase) foi encontrado no produtor de butirosin Bacillus circulans, no qual a 2-deóxi- scyllo-inosose sintase catalisa uma reação de sintetização de 2-deóxi- scyllo-inosose (daqui por diante referida também como DOI), a partir de glicose-6-fosfato (G-6-P) como um substrato (ver figura 1, e Documento de patente relacionado 1).

[003] A DOI sintase é uma enzima envolvida na biossíntese dos antibióticos aminoglicosídeo contendo 2-deoxiestreptamina como um aglicon. A DOI, que é um produto da DOI sintase, é uma substância útil para pesquisas de medicina e químico-industrial. O método para sintetizar quimicamente a DOI é necessário para empregar a reação de etapa múltipla, e uso tóxico ou metais custosos. Por outro lado, pelo uso da DOI sintase, é possível eficiente e rapidamente produzir a DOI. O método para produzir rapidamente DOI a partir de glicose-6- fosfato tem sido estabelecido, usando-se uma DOI sintase recombi- nante obtida a partir de E. coli que expressa a DOI sintase (ver Documento relacionado de patente 1). Adicionalmente, é conhecido que a DOI

[004] pode ser sintetizada pela reação de enzima de duas etapas de reagir glicose com hexoquinase e a DOI sintase, ou pela reação de enzima de uma etapa de reagir glicose-6-fosfato com a DOI sintase (ver documento relacionado de patente 1, e documento de patente não-relacionado 1). Em adição, foi reportado que a DOI pode ser transformada em catecol pela concentração da solução de reação en- zimática e ação da mesma com ácido iodídrico em um ácido acético, sem purificação da DOI (ver documento de patente relacionado 1).

[005] Contudo, um método para sintetizar DOI com a fermentação a partir de D-glicose derivada de biomassa como materiais de partida usando E. coli introduzida na DOI sintase não foi proposto como uma discussão.

[006] Em adição, um método para purificar e isolar a própria DOI não foi ainda reportado, embora tenha sido reportado que a DOI é sintetizada pela reação enzimática, e que a DOI contida na mistura de reação é transformada. Adicionalmente, não existe qualquer informação envolvida em que a DOI é purificada a partir do meio de nutriente de micro-organismos contendo aminoácidos derivados de peptona, e vários tipos de íons metálicos em adição a vários tipos, e grandes quantidades de elementos constituintes de qualquer meio, e glicose como fonte de carbono. Isto é, não foi reportado que a DOI é purificada sob a circunstância de contaminar substâncias incluindo a solução de reação enzimática e o meio de nutriente de micro-organismos. Ainda mais, nunca foi reportado um método industrialmente aplicável para purificação de DOI.

[007] De modo a purificar DOI sob a circunstância da substância de contaminação, incluindo o meio de nutriente de micro-organismos, uma produção por HPLC, ou um método usando uma cromatografia de coluna de carvão vegetal, é conhecido como métodos laboratoriais. Contudo, compreende-se por si que a produção por HPLC não é útil para uma produção industrial. Em adição, no método usando-se a cromatografia de coluna de carvão vegetal, após os compostos orgâ- nicos no meio serem adsorvidos no carvão vegetal, eles serão subse-quentementeeluídos pela utilização da diferença de adsorbabilidade de substâncias, com mudança da concentração de solventes orgânicos tais como álcoois. Portanto, na produção de grandes quantidades de DOI, é necessário usar uma grande quantidade de carvão vegetal bastante para adsorver uma proporção enorme de compostos orgânicos no meio. Consequentemente, tal método é também inadequado para uma purificação de grande escala. Por tais razões, não foi estabelecido um método adequado para purificação de DOI com um método industrialmente aplicável.

[008] Documento de patente relacionado 1 Publicação de Pedido de Patente Japonês N°2000-236881 (JPB3122762).

[009] Documento de patente não relacionado 1 K. Kakinuma, E. Nango, F. Kudo, Y. Matsushima e T. Eguchi, Tetrahedron Letters, 2000, vol. 41, pp.1935-1938.

[0010] Documento de patente não relacionado 2 Ota, Y, e outros., J. Antibiot., 2000, vol. 53, pp.1158-1167.

[0011] Documento de patente não relacionado 3 Kudo, F, e outros., J. Antibiot., 1999, vol. 52, pp. 559-571.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO UM PROBLEMA A SER SOLUCIONADO PELA INVENÇÃO

[0012] A presente invenção é produzida em vista dos problemas acima mencionados. Isto é, a presente invenção é para proporcionar um cassete de expressão de gene que capacita um sistema para produção de DOI com escala industrial, um transformante compreendendo o cassete de expressão de gene, e um método para produção de 2- deóxi-scyllo-inosose, e um método para purificação de 2-deóxi-scyllo- inosose.

MEIOS PARA SOLUCIONAR O PROBLEMA

[0013] O cassete de expressão de gene, de acordo com a presen- te invenção, é caracterizado em:

[0014] Um cassete de expressão de gene compreendendo um gene envolvido em uma síntese de 2-deóxi-scyllo-inosose.

[0015] No cassete de expressão de gene, de acordo com a presente invenção, referido gene envolvido em uma síntese de 2-deóxi- scyllo-inosose é 2-deóxi-scyllo-inosose sintase. Com isto, é possível obter-se um transformante que pode produzir industrialmente DOI.

[0016] Em adição, o transformante, de acordo com a presente invenção, é caracterizado em que:

[0017] Um transformante compreendendo o cassete de expressão de gene transformado em uma célula hospedeira.

[0018] No transformante, de acordo com a presente invenção, referidacélula hospedeira é uma célula hospedeira selecionada a partir dos grupos consistindo em Escherichia coli e quaisquer das células hospedeiras citadas na lista de micro-organismos geneticamente modificados GILSP de março de 2006. Com isto, é possível realizar um método industrial para produção de DOI.

[0019] No transformante, de acordo com a presente invenção, referidacélula hospedeira é uma célula hospedeira que rompe pelo menos um dos genes selecionados a partir do grupo consistindo em gene pgi que codifica fosfoglucase isomerase, gene zwf que codifica glico- se-6-fosfato 1-de-hidrogenase, gene pgm que codifica fosfoglucomu- tase, e gene rmf que codifica fator de modulação de ribossoma envolvido em modificação de síntese de proteína durante fase estacionária. Com isto, é possível realizar um método industrial para produção de DOI com alta eficiência, em adição à matéria acima mencionada.

[0020] Por outro lado, o método para produção de 2-deóxi-scyllo- inosose, de acordo com a presente invenção, é caracterizado em que:

[0021] Um método para produção de 2-deóxi-scyllo-inosose compreendendo uma etapa de contatar o transformante acima mencionado com fonte de carbono. Com isto, é possível produzir industrialmente DOI.

[0022] No método para produção de 2-deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção, a referida fonte de carbono é pelo menos um tipo de fontes de carbono selecionado a partir do grupo consistindo de D-glicose, oligossacarídeo, polissacarídeo, amido, celulose, farelo de arroz e melaços, e biomassas capazes de obter D- glicose. Com isto, é possível produzir geralmente DOI, em adição à matéria acima mencionada.

[0023] A 2-deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção, é caracterizada em:

[0024] uma 2-deóxi-scyllo-inosose sendo obtida a partir do métodoacima mencionado para produção de 2-deóxi-scyllo-inosose. Com isto, é possível obter 2-deóxi-scyllo-inosose com o atributo do método de produção usando o transformante.

[0025] Adicionalmente, o método para purificar 2-deóxi-scyllo- inosose, de acordo com a presente invenção, é caracterizado em:

[0026] Um método para purificação de 2-deóxi-scyllo-inosose compreendendo as etapas de:

[0027] contatar o transformante acima mencionado com uma fonte de carbono para obter uma composição contendo 2-deóxi-scyllo- inosose; e

[0028] tratar a referida composição com coluna de leito misturado ou coluna de leito duplo compreendendo uma forma de íon de hidrogênio de uma resina de troca de cátion de ácido forte e uma forma de íon de ácido orgânico de uma resina de troca de ânion básica. Com isto, é possível obter industrialmente uma DOI altamente purificada.

[0029] No método para purificar 2-deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção, a referida forma de íon de ácido orgânico da resina de troca de ânion básica é forma de íon de acetato de resina de troca de ânion. Com isto, o método pode ser praticamente e preferivelmente usado, visto que ácido acético será removido pelo procedimento de concentração.

[0030] A 2-deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção, é caracterizada em:

[0031] Uma 2-deóxi-scyllo-inosose sendo obtida a partir do método acima mencionado para purificação de 2-deóxi-scyllo-inosose. Com isto, é possível obter uma alta pureza de 2-deóxi-scyllo-inosose com o atributo do método de produção usando o transformante.

[0032] O método para purificar 2-deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção, é caracterizado em:

[0033] um método para purificação de 2-deóxi-scyllo-inosose compreendendo as etapas de:

[0034] reagir a 2-deóxi-scyllo-inosose acima mencionada com tri- alcoximetanos para obter 2-deóxi-scyllo-inosose dialquilcetais; e

[0035] hidrolisar referida 2-deóxi-scyllo-inosose dialquilcetais na presença de ácido. Com isto, é possível separar eficientemente as substâncias de contaminação, em adição à matéria acima mencionada.

[0036] No método para purificar 2-deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção, os referidos trialcoximetanos são trimetoxi- metanos. Com isto, o método pode ser praticamente e preferivelmente usado, visto que o metanol que será formado na etapa seguinte de reação de hidrólise pode ser facilmente removido pelo procedimento de concentração.

[0037] A 2-deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção, é caracterizada em:

[0038] Uma 2-deóxi-scyllo-inosose 2-deóxi-scyllo-inosose sendo obtida a partir do método acima mencionado para purificar 2-deóxi- scyllo-inosose. Com isto, é possível obter 2-deóxi-scyllo-inosose que é praticamente superior em vista da pureza.

EFEITO DA INVENÇÃO

[0039] O composto carbocíclico de seis membros que é importante para o material de partida de medicina e química industrial tem sido manufaturado pela química de petróleo usando o petróleo como materiais de partida. Contudo, é possível sintetizar 2-deóxi-scyllo-inosose sendo o composto carbocíclico de seis membros a partir de D-glicose derivada de biomassa regenerativa como materiais de partida por micro-organismos, por meio de uso de uma técnica da presente invenção. Em adição, é possível restaurar DOI purificada conforme tratada com o meio de cultura.

BREVE EXPLANAÇÃO DO DESENHO

[0040] A figura 1 é uma ilustração mostrando trajetórias de reação de formação de DOI de D-glicose, e uma reação catalisada pela DOI sintase.

[0041] A figura 2A é uma ilustração mostrando a estrutura depLEX-btrC.

[0042] A figura 2B é uma ilustração mostrando a estrutura depGAP-btrC.

[0043] A figura 2C é uma ilustração mostrando a estrutura depGAD-btrC.

[0044] A figura 2D é uma ilustração mostrando a estrutura depGAP-btrC/pGAD-btrC

[0045] A figura 3A é uma vista mostrando um modelo SDS-PAGE de extratos de célula a partir de cepa E. coli GI724 Δpgi compreendendo pLEX-btrC no caso da cepa cultivada em meio 2 X YT, ou o meio de farelo de arroz nos pontos de tempo indicados.

[0046] A figura 3B é uma vista mostrando um modelo SDS-PAGE de extratos de célula a partir de cepa E. coli GI724ΔpgiΔzwfΔpgm com-preendendo pGAP-btrC/pGAD-brtC no caso da cepa cultivada em meio 2 X YT nos pontos de tempo indicados.

[0047] A figura 4A é um gráfico de HPLC mostrando a oxima obtida a partir do sobrenadante do meio de cultura da cepa E. coli G172Δpgi compreendendo pLEX-btrC (3 L de 2 X YT, 30°C, pH 7,5, 5,5% de D-glicose, 24 horas de incubação).

[0048] A figura 4B é um gráfico de HPLC mostrando a oxima obtida a partir do sobrenadante do meio de cultura da cepa E. coli G172Δrmf compreendendo pLEX-btrC (10 mL de 2 X YT, 30°C, pH 7, 3% de D-glicose, 48 horas de incubação) (esquerda do gráfico a 0 hora de cultura).

[0049] A figura 5 é um gráfico mostrando cursos de tempo de (A) turbidez do meio, (B) concentração de D-glicose, e (C) produção de DOI durante a cultura do E. coli GI724Δpgi compreendendo pLEX-btrC (meio 2 X YT + 2% de glicose (♦) ou 2 X YT + 5% de glicose (■), 3 L, 30°C, pH 7,5) (os eixos horizontais correspondem ao tempo decorrido após adição de glicose).

[0050] A figura 6 é um gráfico mostrando cursos de tempo de (A) turbidez do meio, (B) concentração de D-glicose, e (C) produção de DOI durante a cultura do E. coli GI724ΔpgiΔzwf compreendendo pLEX- btrC (meio 2 X YT + 3% de manitol + 5% de D-glicose, 3 L, 30°C, pH 7,5) (os eixos horizontais correspondem ao tempo decorrido após adiçãode glicose).

[0051] A figura 7 é um gráfico mostrando cursos de tempo de tur- bidez derivada de micro-organismos (esquerda), concentração de D- glicose (centro), e produção de DOI (direita) durante a cultura do E. coli GI724Δpgi ΔzwfΔpgm compreendendo pLEX-btrC (meio 2 X YT + 5% de D-glicose + 0,5% de manitol, 3 L, 30°C, pH 7,5) (os eixos horizontais correspondem ao tempo decorrido após adição de glicose).

[0052] A figura 8 é um gráfico mostrando cursos de tempo de tur- bidez derivada de micro-organismos (esquerda), concentração de D- glicose (centro), e produção de DOI (direita) durante a cultura da cepa E. coli GI724ΔpgiΔzwfΔpgm (♦) compreendendo pLEX-btrC, e a cepa E. coli GI724ΔpgiΔzwfΔpgm (■) compreendendo pGAP-btr-C/pGAD- btrC (meio 2 X YT + 5% de D-glicose + 0,5% de manitol, 3 L, 30°C, pH 7,5) (os eixos horizontais correspondem ao tempo decorrido após adição de glicose).

[0053] A figura 9 é um gráfico mostrando cursos de tempo de tur- bidez derivada de micro-organismos (esquerda), concentração de D- glicose no meio (centro), e produção de DOI (direita) durante a cultura do E. coli tipo selvagem (♦) compreendendo pLEX-btrC, e a cepa E. coli GI724Δrmf (■) compreendendo pLEX-btrC (meio 2 X YT + 3% de D-glicose, 10 mL, 30°C, pH 7) (os eixos horizontais correspondem ao tempo decorrido após adição de glicose).

[0054] A figura 10 é um gráfico de pH, condutividade e concentração de DOI em cada fração obtida a partir do eluente no qual o meio cultivado é passado através de resina de troca de íon para obter o elu- ente, de acordo com o Exemplo 8.

[0055] A figura 11 é espectro 13C-RMN de DOI conforme purificado e obtido, de acordo com o método do Exemplo 8.

[0056] A figura 12 é um gráfico de pH, condutividade e concentração de DOI em cada fração obtida a partir do eluente no qual o meio cultivado é passado através de resina de troca de íon para obter o elu- ente, de acordo com o Exemplo 9.

[0057] A figura 13 é espectro 13C-RMN de DOI conforme purificado e obtido, de acordo com o método do Exemplo 9.

[0058] A figura 14 é uma ilustração mostrando um princípio do segundo aspecto do método de purificação de 2-deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção.

[0059] A figura 15 é espectro 1H-RMN de DOI conforme purificado e obtido, de acordo com o método do Exemplo 10.

[0060] A figura 16 é espectro 1H-RMN de DOI conforme purificado e obtido, de acordo com o método do Exemplo 11.

[0061] A figura 17 é espectro 1H-RMN de DOI conforme purificado e obtido, de acordo com o método do Exemplo 12.

MELHOR MODO DE EFETUAR A PRESENTE INVENÇÃO

[0062] Em vista da propriedade da DOI sintase, existe uma possibilidade que a DOI de recurso útil pode ser eficiente e rapidamente produzida a partir de biomassa derivada e D-glicose abundante como materiais de partida por meio de micro-organismos conforme introduzida à enzima.

[0063] Aqui, os inventores produziram a presente invenção de modo a desenvolver um método para produção de DOI por fermentação de células hospedeiras de E. coli com fácil procedimento e baixo custo, como um novo método de sintetizar DOI.

[0064] Em adição, no caso que um sistema que purifica industrialmente DOI será considerado, exemplos preferidos de métodos incluem vários métodos, um dos quais é aplicar o meio de cultura contendo DOI a partir do topo de uma coluna para eluir o DOI purificado a partir do fundo da coluna, o outro do qual é cristalizar DOI ou derivado de DOI, e separar deste, e ainda o outro do qual é combinar referidos métodos com referido outro de métodos. Em vista destes, a presente invenção é produzida por meio de pesquisa de materiais de coluna que adsorvem substratos outros do que DOI, não adsorvem DOI e, principalmente, eluem DOI, e por meio de pesquisa de derivados de DOI que são capazes de obter eficientemente DOI após cristalização e separação.

[0065] Referência será feita com relação às concretizações da presente invenção.

[0066] O cassete de expressão de gene de acordo com a presente invenção

[0067] O cassete de expressão de gene, de acordo com a presente invenção, é caracterizado em:

[0068] um cassete de expressão de gene compreendendo um gene envolvido em uma síntese de 2-deóxi-scyllo-inosose. Isto é, o cassete de expressão de gene, de acordo com a presente invenção, não é limitado, provido que o cassete de expressão de gene, de acordo com a presente invenção, compreende(m) gene(s) envolvido(s) em uma síntese de 2-deóxi-scyllo-inosose, e gene(s) capaz(es) de expressar o gene envolvido em uma síntese de 2-deóxi-scyllo-inosose.

(O gene envolvido em uma síntese de 2-deóxi-scyllo-inosose).

[0069] No cassete de expressão de gene, de acordo com a presente invenção, o gene envolvido em uma síntese de 2-deóxi-scyllo- inosose pode ser um gene que codifica as proteínas bem conhecidas que sintetizam a 2-deóxi-scyllo-inosose. Os exemplos destes incluem gene btrC que codificam subunidade de 42 kDa da DOI sintase derivada a partir de Bacillus circulans no qual a DOI sintase sintetiza DOI de D-glicose (ver documento de patente relacionado 1, documento de patente não-relacionado 2, e Genbank (Banco de Gene) N° AB066276, etc.). Naturalmente, genes derivados de quaisquer organismos outros do que Bacillus circulans podem ser também utilizados, provido que o gene codifica uma enzima tendo uma atividade de sintetização de DOI. Em adição, as sequências de nucleotídeo dos genes acima mencionados podem compreender quaisquer mutações incluindo anulação, substituição e inserção do(s) nucleotídeo(s), provido que referidos genes são um gene expressando uma enzima tendo uma atividade de sintetização de DOI.

(Construção do cassete de expressão de gene, de acordo com a presente invenção).

[0070] Na construção do cassete de expressão de gene, de acordo com a presente invenção, um gene que pode expressar o gene en- volvido na 2-deóxi-scyllo-inosose nas células hospedeiras acima men-cionadas pode ser usado. A constituição do gene do cassete de ex-pressão de gene inclui um promotor, sequência relacionada à ativação transcricional, RBS (local de ligação de ribossoma), e um terminador. Por exemplo, em um sistema para expressão abundante de proteínas em células hospedeiras de E. coli, sequências de DNA incluindo o promotor, a sequência relacionada à ativação transcricional e RBS (local de ligação de ribossoma) podem estar ligadas na região a montante 5’ do gene, e sequências de DNA incluindo terminador podem estar ligadas na região a jusante 3’ do gene. Estas sequências de DNA podem ser usadas, considerando-se que sequências podem agir corretamente em E. coli. Existe um promotor que constitutivamente ou indutivamente expressa os genes alvos. Quaisquer promotores podem ser usados na presente invenção. O promotor que a expressão do gene alvo pode ser controlada é preferível. Deve ser notado que, na expressão de gene em E. coli como células hospedeiras, indutor(es) de alto custo para expressão de gene incluindo IPTG (isopropil-tio- galactopirano) pode(m) tipicamente ser(em) usados.

[0071] Na presente invenção, é desejável que sistema de expressão alta para o gene-alvo seja usado, sem usar o indutor de alto custo acima mencionado, tal como IPTG. Para esta proposta, o sistema de expressão usando o promotor GAP, o promotor GAD, o Sistema de Expressão PL (Invitrogen), pode ser utilizado.

[0072] No Sistema de Expressão PL, a expressão de gene introduzida no vetor (pLEX, marcador resistente à ampicilina) é controlada pelo promotor PL que é derivado de fago lambda, e que induz constitutiva e fortemente a expressão do gene-alvo. Em adição, o Sistema de Expressão PL é constituído tal que a expressão é controlada dependendo das concentrações de triptofano no meio de cultura, e que a expressão é induzida no meio contendo alta concentração de triptofano.

[0073] Por outro lado, nos sistemas de, ou um sistema usando promotor gapA (um gene que codifica gliceraldeído-3-fosfato de- hidrogenase A), ou um sistema usando promotor gadA (um gene que codifica glutamato decarboxilase A), ou um sistema usando ambos os promotores, o gene alvo introduzido no vetor (pUC origem, marcador resistente à ampicilina) é constitutiva e fortemente expresso na fase logarítmica, ou na fase estacionária das células. O sistema de expressão, tal como promotor gapA e promotor gadA, é constituído tal que a expressão é induzida na condição de cultura ordinária, sem uso de tipos particulares de reagentes e manipulações.

[0074] Por outro lado, no Sistema de Expressão de PL, existem bastantes quantidades de triptofano no meio completo conforme normalmente usado na cultura de E. coli para induzir a atividade do promotor. Desse modo, é necessário adicionar adicionalmente triptofano de modo a induzir a expressão. Em adição, não é necessário adicionar o indutor para induzir a expressão no sistema usando promotor gapA ou promotor gadA. Isto é, é possível expressar altamente o gene alvo sem usar indutor de alto custo.

[0075] O transformante de acordo com a presente invenção

[0076] O transformante, de acordo com a presente invenção, é caracterizado em:

[0077] Um transformante compreendendo o cassete de expressão de gene acima mencionado em uma célula hospedeira. Daqui por diante, as células hospedeiras da presente invenção serão explanadas.

(As células hospedeiras)

[0078] As células hospedeiras que podem ser usadas no transfor- mante, de acordo com a presente invenção, não são limitadas, e quaisquer tipos de células hospedeiras podem ser usados, incluindo micro-organismos que são depositados em instituições depositárias de cepas, tais como IFO e ATCC. Exemplos incluem E. coli. Em adição, as células hospedeiras conforme citadas em GILSP (Good Industrial Large-Scale Practice) podem ser usadas, incluindo as células hospe-deiras conforme citadas em GILSP em março de 2006, tais como Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis HPD31, Bacillus brevis HPD31- M3, Bacillus licheniformis DN2461, Bacillus licheniformis DN2717, Bacillus subtilis K2A1, Bacillus subtilis Marburg 168, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli K12, Geobascillus stearothermophilus.

(A cepa de gene rompido da presente invenção)

[0079] No transformante, de acordo com a presente invenção, as células hospedeiras conforme rompem os genes cromossomais e/ou os genes plasmídios podem ser usadas, em vista da síntese da 2- deóxi-scyllo-inosose. Nos aspectos preferidos da presente invenção, ou, ambos ou todos os genes de gene pgi, gene zwf e gene pgm nas células hospedeiras, no qual estes três genes são genes que codificam fosfoglucose isomerase, glicose-6-fosfato 1-de-hidrogenase e fos- foglucomutase, respectivamente, e no qual estas enzimas são relevantes ao metabolismo de glicose-6-fosfato, são rompidas (isto é, no caso que um dos genes é rompido, gene pgi, gene zwf, ou gene pmg; no caso que dois dos genes são rompidos, genes pgi e zwf, ou genes pgi e pgm; no caso que três dos genes são rompidos, genes pgi, zwf e pgm). Adicionalmente, nos aspectos preferidos da presente invenção, o gene que codifica proteína RMF envolvida na modificação de síntese de proteína durante fase estacionária (gene rmf) nas células hospedeiras,é simplesmente rompido, ou o gene rmf nas cepas acima mencionadas cujos genes que codificam enzimas relevantes ao metabolismo de glicose-6-fosfato são rompidos. Isto conduz a supressão da degradação de glicose-6-fosfato, que é substrato direto para produção de DOI, nos micro-organismos. Em adição, a produtividade de DOI foi dramaticamente aumentada devido à síntese de proteína na fase esta-cionária.

[0080] A cepa de gene rompido no qual o gene está relacionado à degradação de glicose-6-fosfato

[0081] De modo a sintetizar DOI com possivelmente alta produção, é necessário ser considerado suprimir possivelmente o catabolismo de D-glicose nos micro-organismos. Em E. coli, os genes que codificam enzimas relacionadas ao catabolismo de D-glicose incluem três genes nos quais os genes são: gene pgi que codifica fosfoglucose isomerase que se relaciona a transformante glicose-6-fosfato em frutose-6-fosfato no sistema glicolítico; gene zwf que codifica glicose-6-fosfato de- hidrogenase que se relaciona ao transformante glicose-6-fosfato em fosfogluconolactona na trajetória de fosfato pentose; e gene pgm que codifica fosfoglucomutase que se relaciona a transformante glicose-6- fosfato em glicose-1-fosfato. Pode ser considerado que, pelo rompimento destes genes, é possível suprimir o catabolismo de glicose-6- fosfato como substrato para a síntese de DOI, junto com o crescimento dos micro-organismos.

[0082] A cepa de gene rompido no qual o gene está relacionado a síntese de proteína durante a fase estacionária

[0083] De modo a cancelar a prevenção da síntese de proteína BtrC durante a fase estacionária, pode ser considerado que é necessário suprimir a produção de proteína RMF relacionada. Aqui, pode ser considerado que o gene rmf que codifica proteína RMF é rompido para continuar a síntese da proteína BtrC após a fase estacionária, continu-ando, desse modo, a síntese de DOI.

(Produção da cepa de gene rompido na presente invenção)

[0084] Na presente invenção, o método bem conhecido pode ser usado para produção da cepa de gene rompido na qual o gene particular da célula hospedeira é rompido. Por exemplo, exemplos de tal método incluem um método para indução da mutação (um método de geração natural, adição de mutageno, irradiação UV, radiação), um mé- todo de utilização de mutação aleatória (métodos usando sequência de inserção (IS) ou transposon (Tn)), e o método de rompimento de gene de local específico (método de passagem simples ou duplo). Entre estes, é preferível usar o método de rompimento de gene de local específico que pode inserir fragmentos compreendendo o gene resistenteà fármaco no gene-alvo, em vista de blindagem, para obter a cepa de gene rompido desejada. Deve ser notado que as células hospedeiras da presente invenção não estão limitadas conforme abaixo mencionado, embora as células hospedeiras de gene rompido que são usadas para o transformante de acordo com a presente invenção são produzidas pelo uso de Kit de Modificação BAC Rápida e Fácil (Bridges Gene).

(Método para produção do transformante de acordo com a presente invenção).

[0085] O transformante, de acordo com a presente invenção, pode ser usado para produzir o cassete de expressão de gene acima mencionado em células hospedeiras. O método para introdução inclui o método de competência e endocitose através de quaisquer receptores.

[0086] O método para produção de 2-deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção

[0087] O método para produção de 2-deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção, é caracterizado por contatar o trans- formante acima mencionado com uma fonte de carbono em qualquer meio adequado para desenvolver o transformante.

[0088] Como a fonte de carbono, D-glicose, monossacarídeos con-tendonitrogênio, tais como D-glucosamina e D-galactosamida, e mo- nossacarídeos derivados de açúcares ou oligossacarídeos, compreen-dendo dois ou mais de monossacarídeos, ou carboidratos (por exemplo, amido, farelo de arroz e melaços), podem ser usados.

[0089] Como o meio para efetuar o método para produção de 2- deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção, a forma do meio, tal como meio sólido, meio líquido não é limitado, provido que as células hospedeiras podem ser proliferadas e/ou desenvolvidas no meio bem conhecido. Exemplos de tais meios incluem o meio ágar, meio RMG, meio 2 X YT, meio LB, meio mínimo M9, e meio SOB. Estes meios contêm fontes de carbono, fontes de nitrogênio, sais inorgânicos, e outras fontes de nutriente orgânico. As fontes de carbono podem ser conforme as substâncias colocadas na Tabela 1, tais como manitol, em adição às substâncias acima mencionadas. Exemplos das fontes de nitrogênio incluem cloreto de amônio, ácido casamino, pep- tona e extrato de levedura. Exemplos dos sais inorgânicos incluem hi- drogenofosfato de sódio, di-hidrogenofosfato de potássio, cloreto de magnésio, e cloreto de sódio. Conforme acima mencionado, não é necessário usar o indutor de alto custo, no caso de usar o sistema de expressão de GAP-GAD e o Sistema de Expressão de PL (Invitrogen) como o sistema de vetor de células hospedeiras.

[0090] Por outro lado, o meio pode conter quaisquer aditivos adequados, dependendo do crescimento das células hospedeiras. De modo a expressar o gene envolvido na síntese do 2-deóxi-scyllo-inosose conforme introduzido no cassete de expressão gene, o meio pode conter compostos que aumentam a atividade do promotor, tais como IPTG, triptofano. Especialmente, o indutor pode ser de adicionado ao meio, no caso que a expressão do gene pelo promotor é por indução realizada.

[0091] No método para produção de 2-deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção, as condições de contatar o transfor- mante com a fonte de carbono, incluindo temperatura, duração e circunstância, não são limitadas, provido que as condições são adequadas ao crescimento do transformante. Por exemplo, a temperatura está mais preferivelmente na faixa de 20 a 37°C. Em a dição, a duração pode estar na faixa de 1 a 7 dias, embora a duração não seja limitada a esta.

[0092] Por exemplo, no método para produção de 2-deóxi-scyllo- inosose, de acordo com a presente invenção, o transformante é primeiramente contatado com quaisquer materiais capazes de serem assimilados em E. coli como a fonte de carbono. Em seguida, a DOI é recuperada a partir do sobrenadante de cultura obtido. Desse modo, é possível obter industrialmente DOI pelo método para produção de 2- deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção, usando o transformante.

[0093] A DOI pode ser obtida com alto rendimento de D-glicose pelas ações de hexoquinase e a DOI sintase, visto que o método para produção de 2-deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção, tem a constituição acima mencionada. Em adição, por meio de cultura das cepas transformadas, incluindo a cepa transformada GI724Δrmf, a cepa transformada GI724ΔpgiΔrmf, a cepa transformada GI724Δpgi, a cepa transformada GI724ΔpgiΔrmf e a cepa transformada GI724ΔpgiΔzwfΔpgm, compreendendo os plasmídios acima mencionados de pGAP-btrC, pGAD-btrC, pGAP-btrC/pGAD-btrC e pLEX-btrC, a DOI é produzida de D-glicose, via glicose-6-fosfato através de cinco etapas de reação catalisada pela DOI sintase, conforme mostrado na figura 1.

[0094] No método para produção de 2-deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção, o transformante é contatado com a fonte de carbono, obtendo-se, desse modo, uma composição compreendendo2-deóxi-scyllo-inosose (por exemplo, meio contendo 2-deóxi- scyllo-inosose e as células hospedeiras). Por exemplo, a DOI pode ser coletada a partir do sobrenadante de cultura, no caso que o meio de cultura contendo 2-deóxi-scyllo-inosose é usado como o material de partida de 2-deóxi-scyllo-inosose. Na presente invenção, como um mé- todo para recuperação de DOI a partir da solução de cultura, 2-deóxi- scyllo-inosose pode serrecuperada pelo método de extração bem co-nhecido, de acordo com, por exemplo, as características físi- cas/químicas de 2-deóxi-scyllo-inosose, e composições do meio de cultura. Por exemplo, o método seguinte pode ser usado. Isto é, após acabamento da cultura, o meio de cultura é primeiramente centrifugado pelo separador centrífugo e o filtrador, para remover os microorganismos a partir do meio, obtendo-se, desse modo, um sobrena- dante de cultura. Em seguida, o sobrenadante de cultura é adicionalmente filtrado para remover quaisquer materiais sólidos incluindo os micro-organismos, o filtrado é aplicado em resinas de troca de íon, e uma eluição é realizada com a água destilada. As frações não contendo quaisquer impurezas são coletadas através do monitoramento do índice de refração, pH, a condutividade, e solventes da assim obtida solução são removidos para recuperar DOI. A análise da DOI assim obtida é realizada por quaisquer métodos incluindo a cromatografia líquida de alta performance, e o método de ressonância magnética nuclear.

[0095] Primeiro aspecto do método para recuperação de 2-deóxi- scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção

[0096] O método para purificação de 2-deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção, é caracterizado em:

[0097] Um método para purificação de 2-deóxi-scyllo-inosose compreendendo as etapas de:

[0098] contatar o transformante acima mencionado com uma fonte de carbono para obter uma composição contendo 2-deóxi-scyllo- inosose; e

[0099] tratar a referida composição com coluna de leito misturado, ou coluna de leito duplo, compreendendo uma forma de íon de hidrogênio de uma resina de troca de cátion de ácido forte, e uma forma de íon de ácido orgânico de uma resina de troca de ânion básica. No método para purificação de 2-deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção, a etapa de contactar o transformante com a fonte de carbono é realizada de acordo com o método para produção de 2- deóxi-scyllo-inosose de acordo com a presente invenção. Esta etapa proporcionará uma composição contendo 2-deóxi-scyllo-inosose. Esta composição compreende o meio acima mencionado. Em seguida, referência será feita, no caso que o meio de cultura é usado como o meio acima mencionado.

[00100] Existem vários componentes do meio de cultura na solução de cultura após acabamento da cultura do transformante no meio contendo a fonte de carbono, em adição à glicose permanecida como a fonte de carbono. Exemplos destes vários componentes incluem ami- noácidos, peptídeos e íons metálicos. É necessário remover estes vários componentes de modo a obter DOI. O método de purificação de 2- deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção, proporcionará resolução da matéria acima mencionada.

[00101] As impurezas a serem removidas no meio de cultura incluem a D-glicose permanecida como a fonte de carbono, aminoácidos, peptídeos e íons metálicos, conforme mencionado acima. Verificou-se que é possível continuar a cultura até que a D-glicose seja completamente consumida, de acordo com o exame da condição de cultura. Aminoácidos, peptídeos e íons metálicos foram permanecidos no meio como as impurezas remanescentes. Os aminoácidos incluem, aminoá- cidos básicos compreendendo uma pluralidade de grupos amino, tais como lisina, histidina e triptofan, aminoácidos acídicos compreendendo uma pluralidade de grupos carboxila, tais como ácido glutâmico e áci-doaspártico. Em adição, os íons metálicos incluem cátions, e os íons contadores incluindo íon de cloreto, e íon de sulfato está presente no meio de cultura. Portanto, materiais de coluna serão pesquisados tal que todas de tais impurezas são adsorvidas no material, e a DOI não é adsorvida no material.

[00102] Os presentes inventores examinaram a pesquisa do material de coluna e condição para a eluição, de acordo com tal conceito. Como o resultado, a DOI não foi purificada em bom rendimento com um método usando resinas de troca de íon gerais, incluindo forma de íon de sódio e íon de hidrogênio de resina de troca de cátion de ácido forte, e forma de íon de cloreto ou íon de hidroxilato de resina de troca de íon básica. Isto é, a proposta acima mencionada não pode ser alcançada pelo uso de uma coluna de leito duplo ligando as resinas acima mencionadas, ou uma coluna de leito misturado pela mistura das resinas. Os aminoácidos se ligam a quaisquer das duas resinas de troca de íon acima mencionadas. Em adição, íons metálicos se ligam à resina de troca de cátion, enquanto a DOI tem uma propriedade de não ligar ambas das resinas de troca, visto que a DOI não tem grupos funcionais iônicos. Portanto, pode ser presumido que os aminoácidos e os sais metálicos se ligam às resinas de troca de íon, e a DOI é eluí- da sem ser adsorvida. Contudo, o resultado não é desse modo obtido. O rendimento da DOI foi menor do que 50%, e o rendimento foi grandemente mudado, dependendo das condições de uso da resina de troca de íon. Maiores rendimentos e performance estável são requeridos, de modo a ajustar um método industrial em escala de massa.

[00103] Os presentes inventores examinaram adicionalmente o material de coluna e as condições para a purificação. Como o resultado, os presentes inventores verificaram que a DOI pode ser eficientemente purificada pelo uso da coluna de leito misturado, ou coluna de leito duplo compreendendo íon de ácido orgânico como íon contador da resina de troca de íon, isto é, forma de íon de ácido orgânico de resina de troca de ânion básica, e forma de íon de hidrogênio de resina de troca de cátion de ácido forte. Exemplos do ácido orgânico incluem ácido acético, ácido propiônico, e ácido oxálico, especialmente ácido acético sendo preferivelmente usado. O ácido acético como o ácido orgânico é preferivelmente usado, visto que a DOI é fácil e extremamente degra-dada com o pH 8, e a DOI é somente estável na faixa acídica fraca de pH 3 a 5. Isto é, se a DOI foi completamente estável em ambas as faixas de faixa acídica e faixa básica, seria possível remover as impurezas, mesmo em um método para eluir o meio de cultura através da coluna de leito duplo de colunas separadas preenchidas com a resina de troca de ânion e a resina de troca de cátion conforme geralmente usado. Em adição, seria possível purificar a DOI com a coluna de leito misturado em ambas as faixas se a DOI tem estabilidade similar àquela da frutose. Os presentes inventores são as primeiras pessoas que verificaram que a DOI é instável na faixa alcalina, tal que a DOI é degradada mesmo pelo uso da coluna de leito misturado junto com a coluna de leito duplo.

[00104] De modo a solucionar este problema, os presentes inventores examinaram uma seleção do íon contador que se liga à resina de troca de íon a ser usada. Como o resultado, os presentes inventores encontraram um método que usa o íon de ácido orgânico como o íon contador para a resina de troca de íon. Isto conduzirá que o ácido or-gânico é permanecido no eluente, e é contaminado na DOI contendo frações. Isto é efetivo para manter pH do eluente ao redor de 4. Entre o ácido orgânico, ácido acético tem uma vantagem de ser capaz de ser removido pelo procedimento de concentração.

[00105] Verificou-se que a DOI pode ser purificada por meio da passagem da solução de cultura através de uma coluna de troca de íon compreendendo uma mistura de forma de hidrogênio de resina de troca de íon, e forma de íon de ácido orgânico de resina de troca de ânion. Portanto, a presente invenção foi completada. Este é um método desejado para produção industrialmente em escala de massa.

[00106] Impurezas carregadas, aminoácidos, peptídeos e íons metálicos que são derivados a partir do material de partida com remanescentes no meio de cultura que consumiu completamente glicose podem ser adsorvidos e removidos no método para purificação usando forma de coluna de leito misturado ou duplo de coluna de resina de troca de íon. Portanto, a DOI, que é neutra e não é adsorvida, pode ser eluída para purificá-la. Deve ser notado que existe uma possibilidade de contaminar quaisquer materiais neutros na DOI contendo fração, dependendo da condição da cultura. Consequentemente, um método de purificação adicional de DOI foi examinado para obter a DOI altamente purificada a partir da coluna de troca de íon. É presumido que a DOI é uma mistura de equilíbrio de formas ceto e hidrato, na base da análise de RMN. Desse modo, pode ser compreendido que é difícil cristalizar a DOI. Não foram reportados a cristalização da DOI e derivados de DOI. Daqui por diante, um método para purificar altamente a DOI será descrito.

[00107] Segundo aspecto do método para purificação de 2-deóxi- scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção

[00108] O método para purificação de 2-deóxi-scyllo-inosose, de acordo com a presente invenção, é caracterizado em:

[00109] Um método para purificação de 2-deóxi-scyllo-inosose compreendendo as etapas de:

[00110] reagir a 2-deóxi-scyllo-inosose acima mencionada com tri- alcoximetanos para obter 2-deóxi-scyllo-inosose dialquilcetais; e

[00111] hidrolisar referida 2-deóxi-scyllo-inosose dialquilcetais na presença de ácido. Exemplos da 2-deóxi-scyllo-inosose que podem ser usadas neste aspecto da presente invenção incluem a 2-deóxi- scyllo-inosose assim obtida no primeiro aspecto da presente invenção, em adição à composição acima mencionada contendo 2-deóxi-scyllo- inosose. Em seguida, o segundo aspecto será descrito.

[00112] Os presentes inventores examinaram a pesquisa de materiais e o exame de um método para purificação cumprindo com um princípio no qual o princípio é baseado em que a DOI conforme eluída é convertida em material(is) cristalizável(is), o material é cristalizado, o material cristalizado é separado e purificado, e o material cristalizável é eficientemente restaurado em DOI. A figura 14 mostra uma ilustração do princípio. A figura 14 é uma ilustração mostrando um princípio do segundo aspecto do método para purificação de 2-deóxi-scyllo- inosose, de acordo com a presente invenção.

[00113] De modo a cumprir com estes requerimentos, é necessário que reações para conversão de DOI e para restaurá-la em DOI pode ser realizada em uma condição ácida que não degrada DOI, que o(s) material(is) como derivado(s) convertido(s) é(são) facilmente cristali- zado(s) e restaurado(s) em DOI, e que este(s) procedimento(s) po- de(m) ser industrialmente realizado(s). Examinaram-se vários métodos cumprindo com estes requerimentos. Como o resultado, verificou-se que um método para reação de DOI com alcoximetanos em uma condição ácida em que DOI é estável para convertê-los em 2-deóxi-scyllo- inosose dialquilcetais (DOI-dak), e para cristalização e cristalização de DOI-dak.

[00114] No alcoximetano ((RO)3CH), exemplos de R não são limitados, provido que exemplos incluem alcanos tendo 1 a 4 de átomos de carbono, tais como metano, etano, propano e butano. Na presente in-venção, um exemplo mais preferível de trialcoximetanos é trimetoxime- tano, visto que um álcool que é formado na etapa seguinte de hidroli- zação pode ser facilmente removido. Deve ser notado que deóxi- scyllo-inosose dimetilcetal (DOI-dmk) será obtida no caso de uso de trimetoximetano.

[00115] A cristalização de 2-deóxi-scyllo-inosose alquilcetais pode ser realizada tal que 2-deóxi-scyllo-inosose alquilcetais são dissolvidas em um solvente apropriado (por exemplo, metanol, etanol e água), e um meio líquido que diminui a hidrofilicidade da fase líquida deste (por exemplo, clorofórmio, hexano e éteres) é usado. Desse modo, cristais de 2-deóxi-scyllo-inosose alquilcetais serão obtidos.

[00116] A 2-deóxi-scyllo-inosose alquilcetais assim obtida será hi- drolisada na presença de ácido para ser restaurada em 2-deóxi-scyllo- inosose. A reação de hidrólise pode ser realizada em um catalisador apropriado tal como ácido p-toluenossulfônico, ácido clorídrico e ácido sulfúrico. Após hidrólise, 2-deóxi-scyllo-inosose será obtida.

[00117] Portanto, o método para purificação de 2-deóxi-scyllo- inosose, de acordo com a presente invenção, é um método desejável para produção industrial em escala de massa.

CONCRETIZAÇÃO

[00118] Uma explanação será feita com relação à presente invenção de acordo com as concretizações. Deve ser notado que o escopo da presente invenção não é limitado a estas concretizações.

(EXEMPLO 1) Gene DOI sintase

[00119] Gene btrC foi utilizado para gene de enzima de ciclização de hidrocarboneto no qual o gene btrC codifica proteína de subunidade de 42 kDa de 2-deóxi-scyllo-inosose (DOI) sintase derivada de Bacillus circulans (ver documento de patente relacionado 1), Banco de Gene N° AB066276, e documento de patente não relacionado 2).

(EXEMPLO 2) Construção de plasmídio recombinante e cepa recombinante gene btrC e pLEX-btrC

[00120] Plasmídio pDS4 compreendendo comprimento total de gene btrC (Documento de patente não relacionado 1) como o gabarito, iniciador 1 citado como Sequência N° 1, e iniciador 2 como Sequência N° 2, foram usados. KOD polimerase (Toyobo) foi usada para amplifi- cação de PCR de gene btrC. 30 ciclos de reação de PCR foram reali-zados, no qual o ciclo consiste em um ciclo de reação de 94°C por 30 segundos, a 52°C por 30 segundos, e 68°C por 1 minu to. O fragmento de DNA assim obtido pela amplificação de PCR foi digerido com Nde I e XbaI, e foi inserido no local NdeI-XbaI do local de multiclonagem lo-calizado em um vetor pLEX para constituir pLEX-btrC (figura 2A). pGAP-btrC/p-GAD-btrC

[00121] O gene promotor gapA foi amplificado por PCR com DNA cromossomal de E. coli como o gabarito e um iniciador citado como Sequência N° 17 e um iniciador como Sequência N° 18. A amplificação de PCR do gene promotor gapA foi realizada com KOD polimerase na seguinte condição de reação para obter os fragmentos de promotor gapA.

[00122] 30 ciclos, o ciclo de reação:

[00123] a 94°C por 30 segundos;

[00124] a 50°C por 30 segundos; e

[00125] a 68°C por 1 minuto

[00126] Um gene promotor gadA foi amplificado por PCR com DNA cromossomal de E. coli como o gabarito, um iniciador citado como Se-quência N° 19 e um iniciador citado como Sequência N° 20. A amplifi-cação de PCR do gene promotor gadA foi realizada com KOD polime- rase na seguinte condição de reação para obter os fragmentos de promotor gadA.

[00127] 30 ciclos, o ciclo de reação:

[00128] a 94°C por 30 segundos;

[00129] a 52°C por 30 segundos; e

[00130] a 68°C por 1 minuto.

[00131] Um gene terminador aspA foi amplificado por PCR com um plasmídio pLEX (invitrogen) compreendendo o gene terminador spaA como o gabarito e um iniciador citado como Sequência N° 21 e um ini- ciador citado como Sequência N° 22. A amplificação de PCR do gene promotor aspA foi realizada com KOD polimerase (TOYOBO) na seguinte condição de reação para obter os fragmentos de terminador aspA.

[00132] 30 ciclos, o ciclo de reação:

[00133] a 94°C por 30 segundos;

[00134] a 55°C por 30 segundos; e

[00135] a 68°C por 1 minuto.

[00136] Os fragmentos de promotor gadA amplificados por PCR foram reagidos com o fragmento btrC acima mencionado a 16°C por 30 minutos, usando 2X mistura de ligação (TAKARA). O produto de ligação assim obtido como o gabarito, um iniciador citado como Sequência N° 2 e um iniciador citado como Sequência N° 5, foram usados para serem amplificados por PCR, usando KOD polimerase, nas seguintes condições, obtendo-se, desse modo, um fragmento de ga- dA-btrC ligado com os dois fragmentos acima mencionados.

[00137] 30 ciclos, o ciclo de reação:

[00138] a 94°C por 30 segundos;

[00139] a 52°C por 30 segundos; e

[00140] a 68°C por 1 minuto.

[00141] O fragmento digerido com XbaI foi inserido no local de XbaI do local de multiclonagem localizado no vetor pLEX (Invitrogen).

[00142] Em seguida, os fragmentos de promotor gapA amplificados por PCR foram reagidos com o fragmento btrC acima mencionado e o fragmento terminador aspA a 16°C por 30 minutos, us ando 2X mistura de ligação. O produto de ligação assim obtido como o gabarito, um ini-ciador citado como Sequência N° 8, foram usados para serem amplifi-cados por PCR, usando KOD polimerase, nas seguintes condições, obtendo-se, desse modo, um fragmento gapA promotor-btrC-aspA terminador ligado com os três fragmentos acima mencionados.

[00143] 30 ciclos, o ciclo de reação:

[00144] a 94°C por 30 segundos;

[00145] a 50°C por 30 segundos; e

[00146] a 68°C por 1 minuto.

[00147] O fragmento digerido com BamHI foi inserido no local de BamHI do local de multiclonagem localizado no vetor pLEX (Invitro- gen), que foi inserido o gadA-btrC para constituir pGAP-btrC/pGAD- brtC (figura 5).

(EXEMPLO 3)

[00148] O rompimento de genes foi realizado com Kit de Modificação de BAC Rápida e Fácil (Bridges Gene), de acordo com o método conforme citado no protocolo do fabricante do kit. Sequências de iniciador ajustadas para PCR que são usadas para produzir o cassete usando o rompimento simples do gene pgi são mostradas na Sequência N° 3 e Sequência N° 4. As sequências de iniciador ajustadas para a amplificação do cassete usando o rompimento simples do gene zwf são mostradas na Sequência N° 5 e Sequência N° 6. As sequências de iniciador ajustadas para produção de cassete usando o rompimento simples do gene pmg são mostradas na Sequência N° 7, Sequência N° 8, Sequência N° 9 e Sequência N° 10. As sequências de iniciador ajus-tadas que são usadas para amplificar o cassete para rompimento do gene pgi contra a cepa rompida por gene simples do gene zwf para obtenção da cepa rompida por gene duplo dos genes pgi e zwf, são mostradas na Sequência N° 11 e Sequência N° 12. As sequências de iniciador ajustadas que são usadas para amplificar o cassete para rompimento do gene pmg contra a cepa rompida por gene simples do gene pgi para obtenção da cepa rompida por gene duplo dos genes pgi e pgm, são mostradas na Sequência N° 7, Sequência N° 8, Sequência N° 9 e Sequência N° 10. Adicionalmente, as sequências de iniciador ajustadas que são usadas para amplificar o cassete para rompimento do gene zwf contra a cepa rompida por gene duplo dos genes pgi e pgm para obtenção da cepa rompida por gene triplo dos genes pgi, zwf e pgm, são mostradas na Sequência N° 5 e Sequência N° 6. Em adição, sequências de iniciadores para um cassete de rompimento do gene rmf são mostradas na Sequência N° 13, Sequência N° 14, Sequência N° 15 e Sequência N° 16.

[00149] Um vetor pSC101-BAD-gbaA-tetra foi introduzido em E. coli como as células hospedeiras, no qual o vetor codifica grupo de enzimas que aumentam a recombinação homóloga em E. coli (GI724), conforme revelado no Kit. A cepa d no meio LB suplementado com 3 μ g/ml de tetraciclina por toda a noite.

[00150] Os micro-organismos pré-cultivados foram inoculados no meio LB adicionado com 3 μ g/ml de tetraciclina a 1% de concentração, e, em seguida, desenvolvidos a 30°C até O.D. = 0,2. No momento, arabinose foi adicionada na concentração final de 0,2%, e adicionalmente cultivada a 37°C por 1 hora para expressar in dutivamente o grupo de enzimas envolvido no aumento da recombinação homóloga. Adicionalmente, a transformação foi realizada com o cassete para o rompimento do gene para induzir o rompimento do gene para os genes-alvo. O assim obtido transformante foi selecionado a 37°C com o meio LB suplementado com um, dois ou três cloranfenicol, neomicina (canamicina) ou estreptomicina, para obter as cepas de gene rompido desejadas incluindo cepa de gene rompido pgi (cepa Δpgi), cepa de gene rompido pgm (Δpgm), cepa de gene rompido duplo pgi/zwf (cepa ΔpgiΔzwf), cepa de gene rompido duplo pgi/pgm (cepa ΔpgiΔpgm), e cepa de gene rompido triplo pgi/zwf/pgm (cepa ΔpgiΔzwfΔpgm). As cepas de gene rompido rmf para cada uma das cepas de gene rompido acima mencionadas foram obtidas de acordo com o procedimento acima mencionado. O crescimento e desenvolvimento de cepa tipo selvagem e cada uma das cepas de gene rompido em qualquer uma das fontes de carbono são mostradas na Tabela 1.

[00151] As taxas de crescimento das cepas Δpgi, Δzwf e Δpgm foram marcadamente retardadas em comparação com o tipo selvagem, mesmo embora estas cepas de gene rompido possam utilizar glicose como a fonte de carbono. Pode ser compreendido que o consumo de D-glicose é suprimido nos micro-organismos. Em adição, o crescimento das cepas ΔpgiΔzwf, ΔpgiΔpgm e ΔpgiΔzwfΔpgm foram extremamentedifíceis no meio contendo D-glicose como a fonte de carbono simples. Pode ser compreendido que a degradação de glicose-6-fosfato é quase completamente suprimida. Isto assegurará que a produção de DOI e a taxa de conversão em DOI são mais aumentadas em comparação com o tipo selvagem, por meio de uso destas cepas de gene rompido. Em adição, é possível aperfeiçoar o crescimento das cepas de gene rompido triplo pela adição suplementar de fonte de carbono não fermentada, tais como manitol e gluconato (ver Tabela 1). Em adição, com relação à fonte de carbono na cepa de gene rompido rmf, o mesmo crescimento foi observado similar às cepas nas quais os genes de enzima metabólica glicose-6-fosfato foram rompidos. TABELA 1

[00152] (Na tabela 1,

[00153] uma marca "++" indica que as células são extremamente desenvolvidas,

[00154] uma marca "+" indica que as células são bem desenvolvi- das,

[00155] uma marca "+/-" indica que as células são levemente de-senvolvidas, e

[00156] uma marca "-" indica que as células são menos desenvolvidas).

(EXEMPLO 4) O transformante

[00157] As células hospedeiras de E. coli foram transformadas com pLEC-btrC conforme obtidas, e selecionadas no meio contendo ampi- cilina para obter cepa GI172/pLEX-btrC, de acordo com o protocolo conforme citado no protocolo do fabricante do Kit produzido por Gene Bridges. Em adição, as células hospedeiras de E. coli (GI724) foram transformadas com pGAP-btrC/pGAD-btrC conforme obtidas, e seleci-onadas no meio contendo ampicilina para obter cepa GI724/pGAP- btrC/pGAD-btrC, em um modo similar. Adicionalmente, várias cepas eram de gene rompido incluindo GI724Δrmf, GI724Δpgi, GI724Δzwf, GI724Δpgm, GI724Δrmf, GI724ΔpgiΔzwf, GI724ΔpgiΔpgm e GI724ΔpgiΔzwfΔpgm foram também transformados com pGAP- btrC/pGAD-btrC para obter cepa GI724Δrmf/pGAP-btrC/pGAD-btrC, cepa GI724Δpgi/pGAP-btrC/pGAD-btrC, cepa GI724Δzwf/pGAP- btrC/pGAD-btrC, cepa GI724Δpmg/pGAP-btrC/pGAD-btrC, cepa GI724ΔpgiΔrmf/pGAP-btrC/pGAD-btrC, cepa GI724ΔpgiΔzwf/pGAP- btrC/pGAD-btrC, cepa GI724ΔpgiΔpgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC, e cepa G I724Δpg iΔzwfΔpg m/pGAP-btrC/pGAD-btrC.

(EXEMPLO 5) Confirmação para a expressão da DOI sintaseCepa GI724Δpgi/pLEX-btrC

[00158] A cepa GI724Δpgi/pLEX-btrC foi desenvolvida a 30°C em um meio de indução (6% de hidrogenofosfato de sódio, 3% de di- hidrogenofosfato de potássio, 0,5% de cloreto de sódio, 1% de cloreto de amônia, 0,2% de ácido casamino, 0,5% de D-glicose, 1 mM de cloreto de magnésio) até que O.D. 600 foi alcançado a 0,7. Em seguida, a cepa foi transferida em meio 2 X YT (meio completo para E. coli, 1,6% de tritofano, 1% de extrato de levedura, 0,5% de cloreto de sódio), e adicionalmente cultivada a 37°C por 6 horas. Em seg uida, a cepa foi coletada. A expressão de proteína BtrC foi confirmada com 12% de SDS poliacrilamida gel eletroforese. O resultado é mostrado na figura 3A. Foi confirmado que a proteína BtrC foi abundantemente expressa na cultura de meio 2 X YT por 6 horas. Deve ser notado que os itens seguintes sofreram eletroforese em cada raia da figura 3A.

Coluna M:

[00159] Marcador de peso molecular (Precision Plus Protein Stan-dards(BIO-RAD), Catálogo N° 161-0374, daqui por diante, pelo mesmo sinal).

Coluna 1:

[00160] Extrato de célula com tampão de Carregamento 1XSDS (daqui por diante, pelo mesmo sinal) a partir da cepa após a cultura de cepa GI724 compreendendo pLEX-btrC por 6 horas no meio nutritivo mínimo (0,6% de hidrogenofosfato de sódio, 0,3% de di- hidrogenofosfato de potássio, 0,05% de cloreto de sódio, 0,1% de cloreto de amônia) (Tampão de Carregamento 1xSDS: 50 mM de Tris- HCl (pH6,8); 2% SDS; 0,1% de Bromofenolazul; 10% de Glicerol; 100 mM de solução de Ditiotreitol).

Coluna 2:

[00161] Extrato de célula a partir da cepa após a cultura de cepa GI724 compreendendo pLEX-btrC por 6 horas no meio de indução suplementado com triptofano.

Coluna 3:

[00162] Extrato de célula a partir da cepa após a cultura de cepa GI724 compreendendo pLEX-btrC por 6 horas no meio de indução não suplementado com triptofano.

Coluna 4:

[00163] Extrato de célula a partir da cepa após a cultura por 2 horas em um meio de farelo de arroz (composição: contendo 20% de farelo de arroz tratado com uma enzima).

Coluna 5:

[00164] Extrato de célula a partir da cepa após a cultura por 6 horas em um meio de farelo de arroz (composição: contendo 20% de farelo de arroz tratado com uma enzima) suplementado com triptofano.

[00165] A proteína BtrC foi abundantemente expressa na cepa cultivada no meio 2 X YT mesmo embora o meio não fosse suplementado com triptofan. Em adição, a proteína BtrC foi abundantemente expressa na cepa cultivada no meio de farelo de arroz. Portanto, foi mostrado que o gene de DOI sintase pode ser altamente expresso nestes sistemas de expressão sem usar o indutor de alto custo.

A cepa GI724ΔpgiΔzwfΔpgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC

[00166] A cepa GI724ΔpgiΔzwfΔpgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC>foi cultivada em um meio de pré-cultura (0,6% de hidrogenofosfato dissó- dio, 0,3% de di-hidrogenofosfato de potássio, 0,05% de cloreto de sódio, 0,1% de cloreto de amônia, 2% de ácido casamino, 1% de glicerina, 1 mM de cloreto de magnésio) a 30°C por toda a noite. 1% da cepa no meio de pré-cultura foi adicionado em meio 2 X YT (meio completo para E. coli, 1,6% de triptofano, 1% de extrato de levedura, 0,5% de cloreto de sódio), e cultivado a 30°C até que O.D. 600 foi alcançado para 0,7. Em seguida, a cepa foi coletada. A expressão de proteína BtrC foi confirmada com 12% de SDS poliacrilamida gel eletroforese. O resultado é mostrado na figura 3B. Deve ser notado que os itens seguintes sofreram eletroforese em cada raia da figura 3B.

[00167] Coluna 1: Marcador de peso molecular

[00168] Coluna 2: Extrato de célula da cepa obtida a partir da cultu- ra em 0 hora.

[00169] Coluna 3: Extrato de célula da cepa obtida a partir da culturaapós 12 horas.

[00170] Coluna 4: Extrato de célula da cepa obtida a partir da culturaapós 36 horas.

[00171] Coluna 5: Extrato de célula da cepa obtida a partir da culturaapós 72 horas.

[00172] Foi confirmado que a proteína BtrC foi abundantemente expressa na cepa cultivada no meio 2 X YT por 6 horas, conforme mostrado na figura 3B. Portanto, foi mostrado que o gene de DOI sintase pode ser altamente expresso nestes sistemas de expressão sem usar o indutor de alto custo.

(EXEMPLO 6) Síntese de DOI Síntese de DOI usando a cepa GI724Δpgi compreendendo pLEX- btrC

[00173] A cepa GI724Δpgi/pLEX-btrC foi inoculada em 35 mL de uma solução pré-cultivada (meio RMG, 0,6% de hidrogenofosfato de sódio, 0,3% de di-hidrogenofosfato de potássio, 0,05% de cloreto de sódio, 0,1% de cloreto de amônia, 2% de ácido casamino, 1% de glicerina, 1 mM de cloreto de magnésio) contida em frasco cônico de 300 mL, e cultivada por 15 horas. Em seguida, 1% da cepa foi inoculada em 3L de meio 2 X YT contido em jarro fermentador de 10L. A cepa foi cultivada em uma condição de 30°C de temperatura de cultura, 300 rpm de velocidade de mistura, 10 L de ar por minuto e pH 7,7 até que O.D. 600 nm foi alcançado para 0,7, e, em seguida, 2% ou 5% de D- glicose foi adicionado na cultura, e a cepa foi adicionalmente cultivada por 48 horas. A solução cultivada nos pontos de tempo indicados foi centrifugada para remover a cepa, coletando, desse modo, um sobre- nadante de cultura 1.

Síntese de DOI usando a cepa GI724ΔpgiΔzwf compreendendo pLEX-btrC

[00174] A cepa GI724ΔpgiΔzwf/pLEX-btrC foi inoculada em 35 mL de um meio RMG contendo 1% de manitol (0,6% de hidrogenofosfato de sódio, 0,3% de di-hidrogenofosfato de potássio, 0,05% de cloreto de sódio, 0,1% de cloreto de amônia, 2% de ácido casamino, 1% de glicerina, 1 mM de cloreto de magnésio), e cultivada por toda a noite. Em seguida, 1% da cepa foi inoculada em 3L de meio 2 X YT contendo 3% de manitol contido em jarro fermentador de 10L, e foram cultivados em uma condição de 30°C de temperatura de cul tura, 300 rpm de velocidade de mistura, 10 L de ar por minuto e pH 7,7 até que O.D. 600 nm foi alcançado para 0,7, e, em seguida, 3% de D-glicose foi adicionado na cultura, e a cultura foi continuada. A solução de cultura nos pontos de tempo indicados foi centrifugada para remover a cepa, coletando, desse modo, um sobrenadante de cultura 2.

Síntese de DOI usando a cepa GI724ΔpgiΔzwfΔpgm compreendendo pLEX-btrC

[00175] A cepa GI724ΔpgiΔzwfΔpgm compreendendo pLEX-btrC foi inoculada em 50 mL de um meio de pré-cultura contido em um frasco cônico de 300 mL (0,6% de hidrogenofosfato dissódio, 0,3% de di- hidrogenofosfato de potássio, 0,05% de cloreto de sódio, 0,1% de cloreto de amônia, 2% de ácido casamino, 1% de glicerina, 1 mM de cloreto de magnésio), e cultivada por 15 horas. Em seguida, 1% da cepa da solução de pré-cultura foi inoculada em 3L de meio 2 X YT contido em jarro fermentador de 10L (MDL-6C, produzido por Marubishi Bioengineering). A cepa foi cultivada em uma condição de 25°C de temperatura de cultura, 300 rpm de velocidade de mistura, 10 L de ar por minuto e pH 7,7 até que O.D. 600 nm foi alcançado para 0,7, e, em seguida, 5% de D-glicose foi adicionado na cultura, e a cultura foi adicionalmente cultivada por 72 horas. A solução de cultura nos pontos de tempo indicados foi centrifugada para remover a cepa, coletando, desse modo, um sobrenadante de cultura 3.

Síntese de DOI usando a cepa GI724ΔpgiΔzwfΔpgm compreendendo pGAP-btrC/pGAD-btrC

[00176] A cepa GI724ΔpgiΔzwfΔpgm compreendendo pGAP- btrC/pGAD-btrC foi inoculada em 50 mL de uma solução de pré-cultura contida em um frasco cônico de 300 mL (0,6% de hidrogenofosfato dissódio, 0,3% de di-hidrogenofosfato de potássio, 0,05% de cloreto de sódio, 0,1% de cloreto de amônia, 2% de ácido casamino, 1% de glice- rol, 1 mM de cloreto de magnésio), e cultivada por 15 horas. Em seguida, 1% da cepa da solução de pré-cultura foi inoculada em 3L de meio 2 X YT contido em jarro fermentador de 10L, e foi cultivada em uma condição de 25°C de temperatura de cultura, 300 rpm de velocidade de mistura, 10 L de ar por minuto e pH 6,0 até que O.D. 600 nm foi alcançado para 0,7, e, em seguida, 5% de D-glicose foi adicionado na cultura, e a cultura foi adicionalmente cultivada por 72 horas. A soluçãode cultura nos pontos de tempo indicados foi centrifugada para remover a cepa, coletando, desse modo, um sobrenadante de cultura 4.

Síntese de DOI usando a cepa GI724Δrmf compreendendo pLEX- btrC

[00177] A cepa GI724Δrmf compreendendo pLEX-btrC foi inoculada em 3 mL de uma solução de pré-cultura contida em um tubo de teste (0,6% de hidrogenofosfato de dissódio, 0,3% de di-hidrogenofosfato de potássio, 0,05% de cloreto de sódio, 0,1% de cloreto de amônia, 2% de ácido casamino, 1% de glicerol, 1 mM de cloreto de magnésio), e cultivada por 15 horas. 1% da cepa da solução de pré-cultura foi inoculada em 10 mL de meio 2 X YT contido em um tubo de teste em forma de L. A cepa foi cultivada em uma condição de 30°C de temperatura de cultura, 160 rpm de velocidade de mistura e pH 7,0, até que O.D. 600 nm foi alcançado para 0,7, e, em seguida, 3% de D-glicose foi adi-cionado na cultura, e a cultura foi adicionalmente cultivada por 72 horas. A solução de cultura nos pontos de tempo indicados foi centrifugada para remover a cepa, coletando, desse modo, um sobrenadante de cultura 5.

(EXEMPLO 7) Medição de produção de DOI Oximação de DOI

[00178] A medição de DOI acumulado no sobrenadante de cultura foi realizada conforme se segue. Isto é, com relação aos sobrenadan- tes de cultura 1 e 2, a(s) solução(ões) de cultura nos pontos de tempo indicados foi(foram) coletada(s). Um volume de água, dois volumes de metanol, e 1,5 mg/ml de O-(4-nitrobenzil)hidroxilamina (NBHA), com relação ao volume do(s) sobrenadante(s) foram adicionados ao(s) so- brenadante(s) e misturados, e incubados a 60°C para obter derivados de oxima de DOI.

[00179] Com relação aos sobrenadantes de cultura 3, 4 e 5, 9 volumes de água destilada foram adicionados ao(s) sobrenadante(s), e adicionado um volume de metanol com relação a esta solução, e, em seguida, 30 mg/ml de sal de cloridrato O-(4-nitrobenzil) hidroxilamina (NBHA) foram adicionados e misturados, e incubados a 60°C por 1 hora para obter derivados de oxima de DOI.

Detecção de DOI

[00180] O solvente foi evaporado a partir da oxima de DOI assim obtida com Sistema Vac de Velocidade (ISS110, produzido por Ther- mol), o derivado de oxima obtido de DOI foi dissolvido em um volume apropriado de metanol, a alíquota foi analisada com HPLC (cromato- grafia líquida de alta performance) para realizar a detecção e quantificação de DOI. Na HPLC, LC-10AT (Shimadzu), e coluna Luna 5u C18 (Phrnomenex, comprimento de coluna 150 mm, diâmetro de coluna 4,6 mm) foram usados, 20% de metanol foram usados como um eluente, a absorção de ultravioleta a 262 nm foi medida. A quantidade do derivado de oxima de DOI com O-(4-nitrobenzil) foi quantificada com curva padrão deste. Deve ser notado que a quantificação de glicose foi realizada com kit de procedimento de ensaio de glicose (Megazyme).

[00181] Conforme mostrado nas figuras 4A e 4B, o pico correspondente do derivado de oxima de DOI foi confirmado na análise de HPLC. Em adição, as figuras 5 a 7 mostram um curso de tempo da produção de DOI, turbidez ao meio, e a concentração de D-glicose. (EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1)

Síntese de DOI usando cepa GI724Δpgi compreendendo pLEX- btrC

[00182] A cepa GI724Δpgi compreendendo pLEX-btrC foi inoculada em 3 mL de uma solução de pré-cultura contida em um frasco cônico de 300 mL (meio de RMG: 0,6% de hidrogenofosfato de sódio, 0,3% di-hidrogenofosfato de potássio, 0,05% de cloreto de sódio, 0,1% de cloreto de amônia, 2% de ácido casamino, 1% de glicerina, 1 mM de cloreto de magnésio), e cultivada por 15 horas. Em seguida, 1% da cepa da solução de pré-cultura foi inoculado em 3 L de meio 2 X YT contido em jarro fermentador de 10 L. A cepa foi cultivada em uma condição de 30°C de temperatura de cultura, 300 rpm de velocidade de mistura 10 L de ar por minuto e pH 7,7, até que O.D. 600 nm foi alcançado para 0,7, e, em seguida, 2% ou 5% de D-glicose foram adicionados na cultura, e a cultura foi adicionalmente cultivada por 24 horas. A solução de cultura nos pontos de tempo indicados foi centrifugada para remover a cepa, coletando, desse modo, um sobrenadante de cultura 11.

(EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2) Síntese de DOI usando cepa GI724ΔpgiΔzwfΔpgm compreendendo pLEX-btrC

[00183] A cepa GI724ΔpgiΔzwfΔpgm compreendendo pLEX-btrC foi inoculada em 50 mL de uma solução de pré-cultura contida em um frasco cônico de 300 mL (0,6% de hidrogenofosfato dissódio, 0,3% de di-hidrogenofosfato de potássio, 0,05% de cloreto de sódio, 0,1% de cloreto de amônia, 2% de ácido casamino, 1% de glicerol, 1 mM de cloreto de magnésio), e cultivada por 15 horas. Em seguida, 1% da cepa da solução de pré-cultura foi inoculada em 3 L de meio 2 X YT contido em jarro fermentador de 10 L (MDL-6C, produzido por Maru- bishi Bioengineering). A cepa foi cultivada em uma condição de 25°C de temperatura de cultura, 300 rpm de velocidade de mistura e 10 L de ar por minuto e pH 7,0, até que O.D. 600 nm foi alcançado para 0,7, e, em seguida, 5% de D-glicose foi adicionado na cultura, e a cultura foi adicionalmente cultivada por 72 horas. As soluções de cultura antes e após adição de D-glicose foram coletadas, e foram centrifugadas para remover a cepa, coletando, desse modo, sobrenadantes de cultura 12 e 13.

(EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3) Síntese de DOI usando cepa GI724 tipo selvagem compreendendo pLEX-btrC

[00184] A cepa GI724 tipo selvagem compreendendo pLEX-btrC foi inoculada em 3 mL de uma solução de pré-cultura contida em tubo de teste (0,6% de hidrogenofosfato dissódio, 0,3% de di-hidrogenofosfato de potássio, 0,05% de cloreto de sódio, 0,1% de cloreto de amônia, 2% de ácido casamino, 1% de glicerol, 1 mM de cloreto de magnésio), e cultivada por 15 horas. 1% da cepa da solução de pré-cultura foi ino-culada em 10 mL de meio 2 X YT contido em tubo de teste em forma de L. A cepa foi cultivada em uma condição de 30°C de temperatura de cultura, 160 rpm de velocidade de mistura e pH 7,0, até que O.D. 600 nm foi alcançado para 0,7, e, em seguida, 3% de D-glicose foi adicionado na cultura, e a cultura foi adicionalmente cultivada por 72 ho- ras. As soluções de cultura nos pontos de tempo indicados foram cole-tadas, e foram centrifugadas para remover a cepa, coletando, desse modo, um sobrenadante de cultura 14.

(EXEMPLO DE REFERÊNCIA 4) Medição de produção de DOI

[00185] A quantificação da produção de DOI acumulada nos sobre- nadantes de cultura 11 a 14 assim obtidos foi realizada conforme se segue.

[00186] Um volume de água, dois volumes de metanol e 15 mg/ml de O-(4-nitrobenzil)hidroxilamino (NBHA), com relação ao volume do sobrenadante de cultura 11, foram adicionados e misturados no so- brenadante de cultura 11, e incubados a 60°C por 1 hora, para obter o derivado de oxima de DOI.

[00187] Com relação aos sobrenadantes de cultura 12, 13 e 14, 9 volumes de água destilada foram adicionados ao(s) sobrenadante(s), e adicionado um volume de metanol com relação a esta solução, e, em seguida, 30 mg/ml de sal de cloridrato de O-(4-nitrobenzil) hidroxilami- na (NBHA) foram adicionados e misturados, e incubados a 60°C por 1 hora para obter o derivado de oxima de DOI.

[00188] O solvente foi evaporado a partir da solução do derivado de oxima de DOI assim obtida com Sistema Vac de Velocidade (ISS110, produzido por Thermol), o derivado de oxima obtido de DOI foi dissolvido em um volume apropriado de metanol, a alíquota foi analisada com HPLC (cromatografia líquida de alta performance) para realizar a detecção e determinação da quantidade de DOI. Na HPLC, LC-9A (Shimadzu), e coluna Luna 5u C18 (Phrnomenex, comprimento de coluna 150 mm, diâmetro de coluna 4,6 mm) foram usados, 20% de metanol foram usados como um eluente, a absorção de ultravioleta a 262 nm foi medida. A quantidade do derivado de oxima de DOI com O-(4- nitrobenzil) foi quantificada com curva padrão deste.

(EXEMPLO 8)

[00189] Um método usando uma coluna de leito fixo de Amberlite IR120 e Amberlite IRA410

[00190] 200 mL de uma forma de hidrogênio de Amberlite IR 120 e200 mL de uma forma de acetato de Amberlite IRA410 foram misturados, e preenchidos em uma coluna (Φ 5 cm x 25 cm). 100 mL do meio de cultura conforme obtido a partir do exemplo de referência 1 e ajustado para pH 2,96 (contendo 1,4 g de DOI) foram aplicados à coluna, uma eluição foi realizada com água a 2 mL por minuto. 6 mL de eluído por uma fração foram coletados, e pH e a condutividade de toda outra fração foram medidos. Em adição, a quantidade de DOI foi medida em todas as três frações. A medição da quantidade de DOI foi realizada tal que a DOI foi derivada na O-(4-nitrobenzil) oxima e, em seguida, a área de pico na HPLC foi medida, e a quantidade de DOI foi estimada a partir da curva de calibração baseada na área de pico. O resultado desse modo obtido é mostrado na figura 10. Em adição, após as frações serem agrupadas em 4 blocos, e cada bloco foi congelado- secado, a pureza e quantidade de DOI em cada grupo foi medida. O resultado é mostrado na Tabela 2. Espectro 13C-RMN da DOI purificada assim obtida é mostrado na figura 11. O espectro 13C-RMN foi medido com aparelho DPX-250 RMN (13C núcleo foi repercutido a 67,5 MHz) produzido por Bruker, com relação à amostra dissolvida em água deuterada.

(EXEMPLO 9)

[00191] Um método usando uma coluna de leito misturado de Amberlite IR200 e Amberlite IRA410

[00192] 200 mL de uma forma de hidrogênio de Amberlite IR 200 e200 mL de uma forma de acetato de Amberlite IRA410 foram misturados, e preenchidos em uma coluna (Φ 5 cm x 25 cm). 100 mL do meio de cultura conforme obtido a partir do exemplo de referência 1 e ajus- tado para pH 2,97 (contendo 562 mg de DOI) foram aplicados à coluna, uma eluição foi realizada com água a uma taxa de fluxo de 2 mL por minuto. 6 mL de eluído por uma fração foram coletados, e pH e a condutividade de toda outra fração foram medidos. Em adição, a quan-tidade de DOI foi medida em todas as três frações. O resultado desse modo obtido é mostrado na figura 12. Em adição, após as frações serem agrupadas em 4 blocos, e cada bloco foi congelado-secado, a pureza e quantidade de DOI em cada grupo foram medidas. O resultado é mostrado na Tabela 3. Espectro 13C-RMN da DOI purificada assim obtida é mostrado na figura 13. A medição da quantidade de DOI e a medição do espectro 13C-RMN foram realizadas de acordo com o exemplo 8. TABELA 2

TABELA 3

(EXEMPLO 10)

[00193] Um método usando uma coluna de leito duplo de Amberlite 200CT e e Amberlite IRA96SB

[00194] Uma DOI contendo solução de cultura (quantidade de DOI: 22,1 g/850 mL) foi aplicada em uma coluna de resina de troca de cá- tion (Amberlite 200CT, uma forma de hidrogênio, 400 mL), e eluída com água. Frações que contêm DOI nos eluentes obtidos analisados por TLC foram aplicadas em uma coluna de resina de troca de ânion (Aberlite IRA96SB, uma forma de acetato, 600 mL), e eluídas com água. As frações que contêm DOI nos eluentes obtidos confirmadas pela análise com TLC foram concentradas em vácuo. Como o resultado, 20,8 g de DOI, que tem uma pureza conforme observada em um espectro 1H-RMN mostrado na figura 15, foram obtidos. A pureza é aproximadamente a mesma conforme aquela obtida a partir do método da purificação usando a coluna de leito misturado acima mencionada. O espectro 1H-RMN foi medido com aparelho DPX-250 RMN produzido por Bruker com relação á amostra dissolvida na água deuterada.

(EXEMPLO 11)

[00195] Um método para restaurar 2-deóxi-scillo-inosose, seguindo converter DOI no derivado dimetilcetal, para cristalizar e purificar

[00196] A DOI purificada, conforme obtida no Exemplo 10, foi dissolvida em metanol (835 mL) e trimetoximetano (310 mL) e monohidra- to de ácido p-toluenossulfônico (2,12 g) foram adicionados, e agitados por 3 horas. Em seguida, a mistura de reação foi neutralizada com bicarbonato de sódio (30,6 g), e a concentração de vácuo realizada após filtração. O resíduo foi dissolvido em metanol, três volumes de sílica gel (C-200, 60 g) foram adicionados, e a concentração de vácuo foi realizada para adsorver DOI na superfície da sílica-gel. A DOI adsorvi- da na sílica-gel foi preenchida em uma coluna de sílica-gel com etil acetato e metanol (5:1). Em seguida, a DOI foi eluída a partir da coluna com solvente misturado de etil acetato e metanol (5:1). Os eluentes que contêm DOI foram coletados, e a concentração de vácuo foi realizada com os eluentes coletados, obtendo-se, desse modo, os derivados de dimetilcetal de DOI (20,7 g). Subsequentemente, uma solução do derivado de dimetilcetal dissolvido em 25 mL de metanol foi adicionada a 100 mL de clorofórmio e 7,5 mL de hexano sob aquecimento, e, em seguida, arrefecido para precipitar e separar cristais brancos, obtendo-se, desse modo, o cristal de 2-deóxi-scillo-inosose dimetilcetal (9,1 g). Quaisquer sinais originados de quaisquer impurezas não foram observados em 1H-RMN conforme mostrado na figura 16.

[00197] Os cristais do derivado de dimetilcetal (995 mg) foram dis-solvidos em acetona (22 mL), e monohidrato de ácido p- toluenossulfônico (280 mg) e água destilada (6 mL) foram adicionados, e a solução foi agitada por 5 horas. Após os materiais de partida terem desaparecido pela confirmação com análise de TLC, a concentração de vácuo foi realizada. O resíduo dissolvido em água foi aplicado em uma coluna de resina de troca de ânion (IRA96SB, uma forma de acetato, 10 mL), e os eluentes contendo o produto alvo, foram concentrados para obter quantitativamente DOI altamente purificada (770 mg). Quaisquer sinais originados de quaisquer impurezas não foram observados em 1H-RMN, conforme mostrado na figura 17.

[00198] Designação de micro-organismos conforme depositados

[00199] Designações de micro-organismo conforme depositado que é usado na presente invenção são conforme se segue.

[00200] Escherichia coli

[00201] GI724ΔpgiΔzwfΔpgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC

[00202] FERM AP-20809

[00203] Nome da organização de recebimento: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology/International Patent Or-ganismo Depositary

[00204] Data de recebimento: 24 de fevereiro de 2006

[00205] Número de recebimento: FERM AP-20809

[00206] Escherichia coli

[00207] GI724ΔrmfΔpgi/pLEX-btrC

[00208] FERM AP-20808

[00209] Nome da organização de recibo: National Institute of Ad vanced Industrial Science and Technology/International Patent Orga-nismo Depositary

[00210] Data de recebimento: 24 de fevereiro de 2006

[00211] Número de recebimento: FERM AP-20808

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[00212] De acordo com a presente invenção, é possível produzir DOI com alta pureza, que é um material de partida para produção de vários tipos de compostos carbocíclicos de seis membros, por fermentação usando materiais de partida derivados de biomassa, tal como amido, que são fontes regenerativas, ao invés de compostos químicos derivados de petróleo na técnica anterior.

[00213] Conforme mencionado acima, a presente invenção foi descrita de acordo com as concretizações preferidas desta. É óbvio que modificações e alterações podem ser feitas nas concretizações, sem fugir do espírito e escopo da presente invenção conforme descrita nas reivindicações, embora a presente invenção tenha sido descrita de acordo com as concretizações específicas. Isto é, a presente invenção não deve ser construída em limitação no detalhe das concretizações e o desenho conforme em anexo.

Claims (1)

1. Escherichia coli transgênica, caracterizada pelo fato de que é transformada pela introdução de um cassete de expressão gêni- ca que compreende o gene btrC representado pela SEQ ID NO: 23 que codifica a subunidade de 42kDa da 2-deoxi-scyllo-inosose sintase em uma célula hospedeira,em que a referida célula hospedeira é uma célula hospedeira na qual pelo menos um dos genes selecionados dentre o grupo consistindo em gene pgi que codifica fosfoglicose isomerase, gene zwf que codifica glicose-6-fosfato 1-dehidrogenase, gene pgm que codifica fosfoglicomutase, e gene rmf que codifica fator proteico de modulação de ribossomo envolvido em modificação de síntese de proteína durante fase estacionária é rompido, a célula hospedeira é Escherichia coli e 2-deoxi-scyllo-inosose é sintetizada na célula hospedeira.

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