JP4273116B2 - 神経障害処置剤 - Google Patents

Description

本発明は、グルクロン酸及び／若しくはＮ−アセチルグルコサミンを少なくとも構成糖とする低分子量の糖（特に、低分子量ヒアルロン酸）又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、神経障害処置剤に関する。

特開平１１−１４０１０３号公報には、ＨＡ（ヒアルロン酸）またはその薬学的に許容される塩を含有する水性溶液からなる脊髄潅流液が開示されており、この潅流液は脊髄損傷における脊髄潅流療法に用いることができる旨が記載されている。そして、ＨＡの重量平均分子量の例示として５０万〜４００万のものが記載されている。
しかし、ＧｌｃＡ（グルクロン酸）及び／若しくはＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）を少なくとも構成糖とする低分子量の糖（特に低分子量ＨＡ）を用いることについては開示も示唆もなく、従って、このような低分子量の糖がさらに優れた効果を奏することについての開示も示唆もない。

まず、本明細書において用いる略号を説明する。
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン
ＧｌｃＡ：グルクロン酸
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩液
ＳＣＥＰ：脊髄誘発電位
本発明は、ＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖（特に低分子量ＨＡ）又はその薬学的に許容される塩を有効成分とし、安全で有用な神経障害処置剤を提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖（特に低分子量ＨＡ）が、神経障害、特に脊髄損傷に対して極めて優れた効果を発揮することを見出し、これにより上記課題を解決しうる神経障害処置剤を提供して、本発明に至った。
すなわち本発明は、ＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、神経障害処置剤（以下、本発明処置剤という）を提供する。
ここにいう「ＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖」は、低分子量ＨＡであるものが好ましい。また「低分子量ＨＡ」はＨＡ２糖〜ＨＡ２５００糖であるものが好ましく、ＨＡ２糖〜ＨＡ５０糖であるものがより好ましく、ＨＡ４糖であるものが特に好ましい。
また、本発明処置剤は、脊髄損傷又は神経の外傷に対する処置剤であることが好ましい。
本発明はまた、ＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖又はその薬学的に許容される塩の有効量を神経障害に罹患した動物（特にヒトを含む哺乳動物）に投与することを特徴とする、神経障害の処置方法を提供する。
本発明はさらに、神経障害処置剤を製造するためのＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖又はその薬学的に許容される塩の使用を提供する。

図１は薬効薬理試験方法の模式図を示す。
図２は軽度損傷モデル（Ａ）と強度損傷モデル（Ｉ）（Ｂ）における損傷の程度を示す図である（写真）。
図３はＨＡ４を投与した場合の、軽度損傷モデルにおけるＳＣＥＰの測定結果を示す図である。図中の「＊」は、生食群に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓの多重比較検定）。
図４はＨＡ４を投与した場合の、強度損傷モデル（Ｉ）におけるＳＣＥＰの測定結果を示す図である。ＭＰＳＳはコハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム投与群を示す。また、図中の「＊」、「＊＊」、「＊＊＊」は、生食群に対して、それぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０００１で有意差があることを示す（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓの多重比較検定）。
図５は強度損傷モデル（ＩＩ）におけるＳＣＥＰの測定結果を示す図である。図中の「＊」は、生食群に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定）。
図６は軽度損傷モデルのＰＢＳ投与群における損傷部位領域の観察結果を示す図である（写真）。ｂの矢印は脱落したミエリンを示す。
図７は軽度損傷モデルのＨＡ４を投与した群における損傷部位領域の観察結果を示す図である（写真）。楕円は損傷部位を示す。
図８は損傷領域の測定方法の模式図である。
図９は軽度損傷モデルにＨＡ４を投与した場合の、「損傷エリア」の測定結果を示す図である。
図１０は白質〜灰白質の横断部分の観察結果を示す図である（写真）。（Ａ）は生食群を、（Ｂ）はＨＡ４群を示す。また、矢印は白質−灰白質を横断する軸索を示す。
図１１は軽度損傷モデルにおける白質〜灰白質を横断（交差）する軸索の本数の測定結果を示す図である。
図１２は強度損傷モデル（ＩＩ）における脊髄損傷７日後の後肢スリップ数の測定結果を示す図である。（Ａ）が平均台横断、（Ｂ）が金網横断の結果を示す。図中の「＊＊＊」は、生食群に対してｐ＜０．０００１で有意差があることを示す（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定）。
図１３は強度損傷モデル（ＩＩ）における脊髄損傷後、７日間の後肢運動機能検査の測定結果（ＢＢＢスケール）を示す図である。図中の「＊＊＊」は、生食群に対してｐ＜０．０００１で有意差があることを示す（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定）。

本発明を以下で詳細に説明する。
＜１＞本発明処置剤の有効成分
（１）ＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖又はその薬学的に許容される塩
本明細書において「ＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖」には、「ＧｌｃＡを少なくとも構成糖とする低分子量の糖」、「ＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖」及び「ＧｌｃＡとＧｌｃＮＡｃとを少なくとも構成糖とする低分子量の糖」が含有される。そして「ＧｌｃＡを少なくとも構成糖とする低分子量の糖」には単糖としての「ＧｌｃＡ」も包含され、「ＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖」には単糖としての「ＧｌｃＮＡｃ」も包含される。
ＧｌｃＡはＤ−グルクロン酸であることが好ましく、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンであることが好ましい。
このような「ＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖」としては低分子量ＨＡが好ましい。また、このような低分子量の糖としては硫酸基を有しないものが好ましい。
本明細書において「低分子量ＨＡ」とは、ＨＡの構成二糖組成と同様の組成からなる低分子量の糖鎖である。具体的は、ＧｌｃＡとＧｌｃＮＡｃとが交互にグリコシド結合している低分子量の糖鎖を意味する。
そしてこのような低分子量の糖鎖である限りにおいて、当該糖鎖の非還元末端がＧｌｃＡであるものの他、非還元末端がＧｌｃＮＡｃであるものも、ここでいう「低分子量ＨＡ」に包含される。なかでも、非還元末端に位置する単糖がＧｌｃＡであるものが好ましい。また、その還元末端に位置する単糖はＧｌｃＮＡｃであるものが好ましい。
非還元末端に位置する単糖は、飽和糖（単糖中の炭素・炭素間の結合に二重結合を含まないもの）でも不飽和糖（単糖中の炭素・炭素間の結合に二重結合を含むもの）でもよい。なかでも非還元末端に位置する単糖が飽和糖であるものが好ましい。
本明細書において「低分子量」とは、当技術分野（特にグリコサミノグリカンに関する技術分野）における当業者において、低分子量であると認識される程度の分子量を意味する。少なくとも、重量平均分子量が１０００ｋＤを超えるものについては、当技術分野において「低分子量」であると認識されるものではない。
「低分子量ＨＡ」としてはＨＡ２糖〜ＨＡ２５００糖が好ましく、ＨＡ２糖〜ＨＡ２０００糖がより好ましく、ＨＡ２糖〜ＨＡ１５００糖がさらに好ましく、ＨＡ２糖〜ＨＡ１０００糖がさらにより好ましく、ＨＡ２糖〜ＨＡ５００糖が特に好ましく、ＨＡ２糖〜ＨＡ２５０糖が非常に好ましく、ＨＡ２糖〜ＨＡ１００糖が極めて好ましい。そのなかでもＨＡオリゴ糖が極めて好ましい。
ここで「オリゴ糖」とは、当技術分野における当業者において、オリゴ糖であると認識される程度の糖鎖を意味する。例えば「ＨＡオリゴ糖」としては、ＨＡ２糖〜ＨＡ５０糖が例示されるが、ＨＡ２糖〜ＨＡ３０糖が好ましく、ＨＡ２糖〜ＨＡ２０糖がより好ましく、ＨＡ２糖〜ＨＡ１０糖がさらに好ましく、ＨＡ４糖がさらにより好ましい。
なお、低分子量ＨＡは種々の分子量の糖の混合物であってもよい。したがって、前記ＨＡ４糖とは、ＨＡ４糖のみからなるものだけでなく、ＨＡ４糖を主成分として含むＨＡオリゴ糖の混合物も包含される。ここでいうＨＡオリゴ糖には前記例示のＨＡオリゴ糖の混合物が包含される。
ＧｌｃＡとＧｌｃＮＡｃとの間におけるグリコシド結合はβ１→３結合であることが好ましく、ＧｌｃＮＡｃとＧｌｃＡとの間におけるグリコシド結合はβ１→４結合であることが好ましい。
本発明処置剤において用いることができる「ＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖又はその薬学的に許容される塩」の由来は特に限定されない。例えば、このような糖鎖として低分子量ＨＡを用いる場合には、鶏冠、臍帯、ＨＡを産生する微生物等から分離、精製されたＨＡを分解する方法（例えば酵素分解法、化学分解法、加熱処理法、超音波処理法等）や、合成（例えば化学合成法や酵素合成法）によって製造できる。
酵素分解法としては、ヒアルロニダーゼ（睾丸由来）、ヒアルロニダーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来）、ヒアルロニダーゼＳＤ、コンドロイチナーゼＡＣＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣなどの、ＨＡを分解できる酵素をＨＡに作用させる方法が挙げられる（新生化学実験講座「糖質ＩＩ−プロテオグリカンとグリコサミノグリカン−」ｐ２４４−２４８、１９９１年発行、東京化学同人、又はＧｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１２、ｐ４２１−４２６、２００２年、参照）。低分子量ＨＡを得るためには、ＨＡを分解できる酵素としてＨＡ加水分解酵素を用いることが好ましい。
化学分解法としては、アルカリ分解法やＤＭＳＯ法等が挙げられる。アルカリ分解法は、例えばＨＡの溶液に１Ｎ程度の水酸化ナトリウム等の塩基を加え、数時間加温して低分子化させた後、塩酸等の酸を加えて中和することにより行うことができる。ＤＭＳＯ法としてはＮａｇａｓａｗａらの方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．，１４１，ｐ９９−１１０，１９８５）が挙げられる。超音波処理法としてはＢｉｏｃｈｅｍ．，３３，ｐ６５０３−６５０７（１９９４）等に記載された方法が挙げられる。
合成による製造方法としてはＧｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．，ｐ４５３−４３９（１９９３）、国際公開ＷＯ９３／２０８２７等に記載された方法が挙げられる。
以上のような方法によって低分子量ＨＡを含む画分が得られるが、この画分は通常の糖鎖の分離、精製の手法によってさらに精製することができる。例えば、吸着クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、濾紙電気泳動法、濾紙クロマトグラフィー、塩析、有機溶媒による分画、あるいはこれらの組み合わせ等の操作によって行うことができる（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１２、ｐ４２１−４２６、２００２年）が、これらに限定されるものではない。
このような方法によって画分中の低分子量ＨＡの含有率を高めることができ、また医薬として混入が許されない物質を排除することもできる。
このようにして得られる低分子量ＨＡは、高純度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものが好ましい。
ＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖の薬学的に許容される塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩のうち、薬学的に許容される塩を用いることができる。なかでもナトリウム塩であることが好ましい。
上記のようなＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖又はその薬学的に許容される塩を用いることにより、極めて優れた薬理作用を有する神経障害処置剤とすることができる。
なお、本発明処置剤に使用されるＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖又はその薬学的に許容される塩中のエンドトキシン濃度は、本発明処置剤を液剤とした場合において０．３ＥＵ／ｍＬ以下、液剤以外の剤とした場合においては前記液剤のエンドトキシン含量に相当する量以下であることが好ましい。本発明処置剤中のエンドトキシン濃度は、当業者に周知慣用のエンドトキシンの測定法を用いて測定することができるが、カブトガニ・アメボサイト・ライセート成分を用いるリムルス試験法が好ましい。なおＥＵ（エンドトキシン単位）は、日本工業規格生化学試薬通則（ＪＩＳ Ｋ８００８）に従って測定・算出できる。また、鉄含量は２０ｐｐｍ以下であることが好ましい。
（２）本発明処置剤の剤型等
本発明処置剤の投与方法は、本発明処置剤による神経障害に対する作用が発揮される限りにおいて特に限定されないが、例えば注射（硬膜内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経鼻、経口、経皮、吸入等の投与経路が挙げられる。その投与方法は、注射による特定部位への直接投与や、点滴による投与など、適用される疾患や部位等によって適宜選択される。硬膜内等に投与する場合には、植込み型の薬剤注入ポンプを体内に植え込んで、持続投与してもよい。
このような投与経路や投与方法に応じて、前記の低分子量の糖又はその薬学的に許容される塩を適宜製剤化して、本発明処置剤とすることができる。剤型としては、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、液剤、顆粒剤、散剤、リポ化剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、貼付剤、ゲル剤、坐剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等が挙げられるが、注射剤等の液剤の形態とすることが好ましい。
液剤は、例えば適当な水性溶媒あるいは医薬品に慣用される溶媒に、ＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖又はその薬学的に許容される塩を溶解させることにより製造することができる。このような溶媒としては、蒸留水、緩衝液、生理食塩水、水混和性有機溶媒を含む水等が例示される。
本発明処置剤を注射剤として提供する場合、その形態は、溶液、凍結物、または凍結乾燥物のいずれであってもよい。これをアンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させあるいは保存して、注射剤として投与することができる。
本発明処置剤の製剤化には公知の方法を用いることができる。また製剤化にあたり、前記の糖又はその薬学的に許容される塩に悪影響を与えず、かつ本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分（例えば抗炎症剤、鎮痛剤、ビタミン剤、抗菌剤、成長因子、接着因子など）や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用できる。
本発明処置剤は、ＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖又はその薬学的に許容される塩を有効成分とすることから、少なくともＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖又はその薬学的に許容される塩が含有されていればよく、他の分子サイズや他の種類の糖を含んでいても差し支えない。
（３）本発明処置剤の投与対象等
本発明処置剤は、神経障害の処置に資せんとするものであるから、神経障害に対する処置が望まれる状況にある動物、すなわち神経障害に罹患した動物に対して適用することができる。
「神経障害に対する処置が望まれる状況」は、特に限定されるものではないが、例えば脊髄損傷や頭部外傷などの神経の外傷、脳性（小児）麻痺、脊髄血管障害、頚部脊椎症、老人性痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄小脳変性症（遺伝性痙性対麻痺）等が例示される。なかでも脊髄損傷や神経の外傷に対して適用されることが好ましく、脊髄損傷に対して適用されることがより好ましい。脊髄損傷としては、外傷性脊髄損傷、脊椎変性疾患（脊椎症等）、脊椎炎症性疾患（脊椎炎、慢性関節リウマチ等）、腫瘍（脊髄腫瘍、脊椎腫瘍等）、血管性疾患（脊髄出血、脳卒中、髄外血管障害による脊髄麻痺等）、脊髄炎（クモ膜炎、ウイルス性脊髄炎、細菌性脊髄炎等）、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症等が挙げられる。特に外傷性脊髄損傷に有効である。
すなわち、本発明処置剤は、脊髄損傷や神経の外傷に対する処置剤であることが好ましく、脊髄損傷に対する処置剤であることがより好ましく、外傷性脊髄損傷に対する処置剤であることが特に好ましい。
本発明処置剤を動物に投与する場合、これが投与される動物は、脊椎動物、特にヒトを含む哺乳動物が好ましい。本発明処置剤による「処置」の目的も特に限定されないが、神経障害の進行抑制（悪化防止）、症状の改善、治療等を目的とすることができる。
本発明処置剤におけるＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖又はその薬学的に許容される塩の配合量、１回あたりの投与量、投与間隔等は、本発明処置剤の投与方法、投与形態、使用目的等、患者の具体的症状、年齢、性別、体重等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定されないが、ＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖又はその薬学的に許容される塩の臨床量として成人１人１回当り１００μｇ〜１０００ｍｇが例示される。
また本発明処置剤の投与間隔は、１日１回程度でもよく、１日２〜３回に分けて投与することもできる。また、前記のような植込み型の薬剤注入ポンプ等を用いて持続的に投与することもできる。
なお本発明は、本発明処置剤だけでなく、神経障害に対する処置が望まれる適用対象（動物）にＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖又はその薬学的に許容される塩を投与することを特徴とする、神経障害の処置方法も包含する。

以下に、本発明の実施例を具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
＜材料等＞
まず、本実施例において用いた物質等を説明する。
試薬等
ＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖として、低分子量ＨＡを用いた。
低分子量ＨＡは、生化学工業株式会社から提供されたものを用いた。この低分子量ＨＡは、以下の構造を有し、以下の性質を有するものであった（カッコ内は、本実施例において用いる略号を示す。下記式中、「−」はグリコシド結合を表す。）
・ＨＡ飽和４糖（以下、「ＨＡ４」という。）
ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ
ＨＡ４は、Ｎａｇａｓａｗａらの方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．，１４１，ｐ９９−１１０，１９８５）に準じて、塩酸（ＨＣｌ）を含有するＤＭＳＯでＨＡを処理して得られた分解産物を、陰イオン交換クロマトグラフィーでサイズごとに分画することによって得た。
ＨＡ４は、以下の薬効薬理試験に応じて所定の濃度となるようにＰＢＳに溶解して用いた。ＰＢＳに溶解した後のエンドトキシン濃度はいずれも０．３ＥＵ／ｍＬ以下であり、また鉄含量はいずれも２０ｐｐｍ以下であった。
＜薬効薬理試験＞ 脊随損傷に対するＨＡ４の作用
（１）脊髄損傷モデルの作製およびＨＡ４の投与（図１、２）
本試験の模式図を図１に示す。
動物としてＷｉｓｔａｒラット（ＳＰＦ、雄）を用い、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ体重）の麻酔下に、頸部から臀部にかけて電気バリカンで剪毛し、７０％エタノールおよびイソジン（明治製菓株式会社製）で清拭した。背部皮膚を切開し、Ｔ５からＴ１０胸椎を露出させた後、第六胸椎（Ｔ６胸椎）を半椎弓切除し、硬膜に小切開を加え、キシロカイン（アストラゼネカ製）で局所麻酔した後、Ｔ６の位置でスパーテル（先端を０．３ｍｍに加工したもの）を背側から腹部椎体に届くまで刺入して１０秒間保持することによって脊髄を坐滅させたもの（軽度損傷モデル）と、ピンセット（先端を０．３ｍｍに加工したもの）をその先端が腹部椎体に届くまで刺入して両側から１０秒間はさむことによって脊髄を坐滅させたもの（強度損傷モデル）の２種類のモデルを作製した。人工呼吸器（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒ）は脊髄誘発電位測定時のみ使用した。１．０〜２．０％ハロタン麻酔下で気管に挿官後、筋弛緩剤で非動化した。それぞれのモデルの損傷の程度を図２に示す。
損傷後、直ちにＨＡ４（６μｌ）をマイクロシリンジ（２５μｌ；株式会社伊藤製作所製）を用いて硬膜内に投与した。その後、ＨＡ４を充填した浸透圧ポンプ（モデル１００２，Ａｌｚｅｔ製）に接続したチューブの先端（ＯＤ：０．３ｍｍ）を損傷部頭部側の硬膜下に留置し、ＨＡ４を７日間持続投与した。また、陽性対照としてコハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム（ＭＰＳＳ、ファルマシア社製）３０ｍｇ／ｋｇを、損傷後５分目、２時間目、４時間目および６時間目に尾静脈内投与した。損傷部と周囲組織の隔離のために、ゼラチンスポンジ（Ｇｅｌｆｏｒｍ；ファルマシア社製）を置き、創部を縫合し、飼育ケージに戻した。
本試験の群構成は以下の通りである。
１．軽度損傷モデル：
（１）無損傷・無処理群
（２）ＰＢＳ投与群（生食群）
（３）ＨＡ４ ６０μｇ／匹／日投与群
２．強度損傷モデル（Ｉ）：
（１）無損傷・無処理群
（２）ＰＢＳ投与群（生食群）
（３）メチルプレドニゾロン（ＭＰＳＳ）３０ｍｇ／ｋｇ体重／日 ｘ４回投与群
（４）ＨＡ４ ０．６μｇ／匹／日投与群
（５）ＨＡ４ ６．０μｇ／匹／日投与群
３．強度損傷モデル（ＩＩ）：
（１）硬膜に小切開を行った偽手術群（Ｓｈａｍ）
（２）ＰＢＳ投与群（生食群）
（３）ＨＡ４ ６．０μｇ／匹／日投与群
（２）一般状態の評価
試験物質を投与した後、一般状態の観察を行った。その結果、ＰＢＳ投与群では投与７日目においても歩行困難が観察されたが、ＨＡ４投与群ではほぼ正常と同様の歩行が観察された。
（３）ＨＡ４の脊髄誘発電位（ＳＣＥＰ）に与える影響
脊髄誘発電位は脊髄損傷後７日目に測定した。ハロセン麻酔（導入時４．０％、維持時１．０）下で気管内挿管し、筋弛緩剤で非動化し、腹臥位に頭部を固定して人工呼吸器により維持した。第２／３頸椎間および第１３胸椎／第１腰椎間からカテーテル電極を挿入し、筋電計（Ｐｏｗｅｒｐｏｉｎｔ；ダンテック社製）を用いて、最大上刺激（刺激頻度：１Ｈｚ、持続期間：０．０５ミリ秒）し、脊髄誘発電位（ＳＣＥＰ）を測定し、「平均値±ＳＤ」を算出した。得られた電位の評価は、第１電位の振幅を指標とした。軽度損傷モデルにおける結果を図３に、強度損傷モデル（Ｉ）における結果を図４にそれぞれ示す。図中の「＊」は、生食群に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓの多重比較検定）。
その結果、軽度損傷モデルにおいては、ＰＢＳ投与群と比較して、ＨＡ４ ６０μｇ／匹／日投与群において有意なＳＣＥＰ振幅の低下抑制あるいは回復（ｐ＜０．０５）が認められた。このレベルは、正常レベル（無損傷・無処理群）と同等であった（図３）。強度損傷モデルでは、ＰＢＳ投与群と比較して、ＨＡ４ ０．６μｇ／匹／日および６μｇ／匹／日投与群でいずれも有意なＳＣＥＰ振幅の低下抑制あるいは回復がみられ（それぞれ、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．００１；正常レベルと同等）、６μｇ／匹／日投与群ではＭＰＳＳより強い効果が認められた（図４）。また、強度損傷モデル（ＩＩ）においても上記と同様にＳＣＥＰの測定を行った。結果を図５に示す。その結果、生食投与群と比較して、ＨＡ４ ６．０μｇ／匹／日投与群で有意なＳＣＥＰ振幅の回復（ｐ＜０．０５）が認められた（図５）。なお、図中の「＊」は、生食群に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定）。
（４）病理組織学的見地からの評価（軽度損傷モデル）
損傷部位を中心として約２ｃｍ長の脊髄を中性緩衝ホルマリンで固定した後、パラフィンに包埋した。背側から冠状面（ｃｏｒｏｎａｌ）な面の連続切片を作製し、クリューラバレラ染色（ミエリンが青に染まる）を行った。中心管を含む位置の組織標本にて、（ａ）損傷部位領域および（ｂ）白質−灰白質を横断する軸索（第６胸髄で入出する軸索）を観察した。ＰＢＳ投与群における結果を図６に、ＨＡ４を投与した群における結果を図７に示す。
その結果、ＰＢＳ投与群において、組織傷害領域は、損傷を加えた部位（損傷部位）のみならず、損傷部位から１ｃｍ以上も離れた白質においても浮腫、ミエリンの脱落が認められた（図６）。この白質における組織傷害は、連続的あるいは、飛び石状を呈していた（図６）。ＨＡ４を投与した群では、組織傷害は損傷部位近傍に限定されており、白質における浮腫・ミエリンの脱落はまれにしか認められなかった（図７）。
図８に示す通り、冠状面（ｃｏｒｏｎａｌ）の中心管を含む面において、両側及び頭部側（ｒｏｓｔｒａｌ）、尾側（ｃａｕｄａｌ）の遠位端の損傷部位４点を結ぶ四角形（図８中の太線内）を「損傷エリア」として損傷された広さを測定した。その結果、ＨＡ４を投与した群では、ＰＢＳ投与群に比して有意な低値を示した（図９）。
また、白質〜灰白質を横断（交差）する軸索の本数（損傷部位のｒｏｓｔｒａｌ／ｃａｕｄａｌ方向５ｍｍの範囲）を測定したところ、その軸索数は、生食群に比べＨＡ４投与群において有意に多数であった（図１０、図１１）。
（５）行動学的見地からの評価（強度損傷モデル（ＩＩ））
動物は脊髄損傷作製前から平均台（３ｃｍ×１００ｃｍ）および金網（２０ｃｍ×１００ｃｍ）の横断検査のために、トレーニングを５〜７日間実施した。トレーニング終了後、各動物について上記（１）−３と同様にして強度脊髄損傷モデル（ＩＩ）を作製し、その後７日間ＰＢＳ又はＨＡ４を腹腔内持続投与した後に、両障害を動物当たり４回それぞれ横断させ、後肢スリップ数を記録し、その平均値を用いて評価した（図１２）。なお、硬膜に小切開を行った偽手術群（Ｓｈａｍ）についても後肢スリップ数を測定した。
また、脊髄損傷後、ＰＢＳ又はＨＡ４投与群及び偽手術群について７日間毎日、後肢運動機能検査を行った。Ｂａｓｓｏらの方法に準じ、Ｂａｓｓｏ−Ｂｅｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）スケールを用いて、２人の試験官がブラインドで独立して評価を行い、その平均点を最終評点とした（図１３）。
平均台・金網横断において、両障害からの後肢スリップ数の有意な低値（Ｐ＜０．０００１）がみられ（図１２）、ＢＢＢスケールを用いた後肢運動機能検査においても、生食投与群と比較して、脊髄損傷後１から７日を通して、ＨＡ４ ６μｇ／ｄａｙ投与で有意な後肢運動機能の回復（Ｐ＜０．０００１）が認められた（図１３）。なお、図中の「＊＊＊」は、生食群に対してｐ＜０．０００１で有意差があることを示す（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定）。
以上の結果から、ＨＡ４投与による脊髄誘発電位の低下の抑制あるいは回復が示された。このことは、ＨＡ４が脊髄損傷による神経機能の低下抑制あるいは回復をもたらす作用を有していることを示している。事実、ＨＡ４を投与した群では後肢運動機能の有意な回復が認められている。
病理組織学的評価においても、ＨＡ４投与群では組織傷害が抑制されており、ＨＡ４の神経機能への作用が、この組織傷害抑制と結びついていることが示唆される。特にＨＡ４によるミエリンの脱落（２次損傷における脱髄）の抑制および軸索数の減少（損傷による神経細胞あるいはオリゴデンドロサイトのアポトーシスによって消失したものと考えられる）の抑制は、ＨＡ４による神経機能の低下抑制に深く関与していることを示している。
また、動物を用いた上記試験の結果によって、本発明処置剤の安全性が裏付けられた。
以上の結果から、「ＧｌｃＡ及び／若しくはＧｌｃＮＡｃを少なくとも構成糖とする低分子量の糖」である「低分子量ＨＡ」（特にＨＡ４）又はその薬学的に許容される塩は、神経障害（特に神経の外傷によるもの。特に脊髄損傷。）の処置に極めて有用であり、しかも安全性が高いことが示された。

産業上の利用の可能性

本発明処置剤は、神経障害、特に脊髄損傷や神経の外傷による神経障害に対して優れた効果を発揮し、しかも安全性が高いことから極めて有用である。

Claims (1)

1. ヒアルロン酸４糖又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、外傷性脊髄損傷による神経機能の低下を回復させるための神経機能回復剤。

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