JP3836500B2 - Ｉ型インターフェロンに対する中和活性を有するインターフェロン受容体に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Description

インターフェロン（IFN）は広範な生物学的活性を示し、脊椎動物細胞中に抗ウイルス状態を誘発するその能力を特徴とする分泌蛋白質の一群を構成する（I.Gresser and M.G.Tovey,Biochem.Biophys.Acta 516:231,1978）。IFNには３種類の抗原性種がある：即ちアルファ（α）、ベータ（β）及びガンマである。IFNα及びIFNβはともにＩ型インターフェロンとして公知である。
天然Ｉ型ヒトインターフェロンは、高度の構造的相同性を有する別個の遺伝子によりコードされる12又はそれ以上の非常に関連した蛋白質から成る（Weissmann and Weber,Prog.Nucl.Acid.Res.Mol.Biol.33:251,1986）。
ヒトIFNα遺伝子座は２つの亜科から成る。第一の亜科は、14個の非対立遺伝子と４個の偽遺伝子から成り、少なくとも80％の相同性を有する。第二の亜科、即ちαII又はオメガ（ω）は、５個の偽遺伝子及び１個の機能遺伝子を含有し、IFNα遺伝子との70％の相同性を示す（Weissmann and Weber,1986）。
IFNαのサブタイプは異なる特異的活性を有するが、しかしそれらは同一の生物学的範囲を有し（Streuli et al.,PNAS-USA 78:2848,1981）、同一細胞受容体を有する（Agnet M.et al.,in“Interferon 5”Ed.I.Gresser P.1-22,Acadimic Press,London 1983）。
インターフェロンβ（IFNβ）は、IFNα遺伝子と約50％の相同を有する。
インターフェロンαサブタイプ及びインターフェロンβは、細胞表面の同一受容体と結合する。
インターフェロンγ（IFNγ）も単一コピーによりコードされ、IFNα及びIFNβの遺伝子とほとんど相同でない。IFNγに対する受容体はα及びβインターフェロンとは異なっている。
本発明のために、IFNのα及びβ種の受容体をIFN-Rと呼ぶ。これは天然Ｉ型受容体に相当する。天然インターフェロンαを構成する蛋白質群をIFNαと呼び、Ｉ型IFNは天然IFNα，IFNω及びIFNβに相当する。
インターフェロンが有効な抗ウイルス剤であるという事実にもかかわらず、上気道感染のような急性ウイルス疾患の多数の特徴的症状はインターフェロンアルファの過剰産生によって引き起こされることを示唆するかなりの証拠がある。さらに、IFNアルファは実験動物におけるある種の慢性ウイルス感染の病因に関与することが示されており、有用な証拠は、これを麻疹ウイルスによるもののようなある種のヒト慢性ウイルス疾患に関する症例であることを示唆する。
インターフェロンαはさらにポリクローナルＢ細胞活性科を刺激し、NK細胞細胞毒性を増強し、Ｔ細胞機能を阻害し、そして多数の組織適合性複合体（MHC）１型抗原の発現を調節する有力な免疫調節分子であり、これらはすべて、自己免疫の誘発及び移植片拒否反応に関係する。インターフェロンαの異常産生は、多数の自己免疫疾患及び炎症性疾患を伴い、その例としては全身性エリテマトーデス（SLE）、Ｉ型糖尿病、乾癬、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、ベーチェット病、再生不良性貧血、後天性免疫不全症候群（AIDS）及び重傷複合型免疫不全が挙げられる。全身性エリテマトーデス患者の血清中のインターフェロンαの存在は、疾患活性増大の臨床的及び体液性徴候の両方に相関する。HIVウイルス陽性被験者におけるインターフェロンαの産生は疾患進展をも高度に予測する。
インターフェロンαの投与は、乾癬及び多発性硬化症患者における根本的疾患を悪化させ、自己免疫疾患の既往症のない患者にSLE様症状を誘発することが報告されている。インターフェロンαはさらに正常マウスに糸球体腎炎を誘発し、NZB／Ｗマウスの特発性自己免疫疾患の発症を促進することも示されている。
インターフェロンαはまた、全身性移植片対宿主疾患（GVHD）の特徴であるNK細胞活性増強と平行してGVDHの経過中に産生される。インターフェロンαはNK細胞細胞毒性の主要モジュレーターであって、インターフェロンαの投与は正常マウスのGVDHの小腸で生じる結果を増強することが示されている。
本発明の目的は、ヒトＩ型IFNの生物学的活性に対する新規の拮抗薬を提供することである。これらの拮抗薬は、Ｉ型IFN（IFNα／β）が異常に産生され、この異常産生が病的症状を伴う場合の予防を含めた治療目的に用い得る。このような拮抗薬は種々の疾患の診断に、あるいはこのような疾患の進展の研究に用いることもできる。
このような拮抗薬を定義するために、本発明人は、ヒト天然Ｉ型IFNが実際インターフェロン（亜種）の混合物で構成され、そして異なるサブタイプのインターフェロンのこの集まりの組成が量質ともに変化するという事実を考慮した。
Namalwa細胞から分泌されるもの（Namalwaインターフェロン）又は白血球から分泌されるもの（白血球インターフェロン）といったようないくつかの天然インターフェロンは詳細に研究されており（N.B.Finter and K.H.Fautes,Interferon 2,1980,P.65-79 I.Gresser Editor Academic Press;K.Cantell et al.,Interferon 1,1979 p.2-25,I.Gresser Academic Press）、天然Ｉ型インターフェロンを定義するために本発明人が用いた。
AIDSのようないくつかの病例において、何らかの特定の特性を有するインターフェロンが記載されている（O.T.Preble et al.,Annals of New-York Academy of Science p.65-75）。このインターフェロンはAIDSのような病例に関与するが、にもかかわらず上記と同様の受容体と結合する。
本発明の一目的はヒトＩ型IFNの生物学的特性を確定程度まで阻止又は中和し得る、言い換えればα，β，ω亜種の混合物をin vivoで中和し得るＩ型IFNの拮抗薬を提供することである。
したがって、本発明人はＩ型IFNに対する拮抗薬の有する特性を有する抗体、特にモノクローナル抗体を明確にした。これらの抗体はヒトＩ型IFN受容体に対するものである。
本発明はしたがってＩ型IFNの異常産生に伴う症状の治療に有用な製剤組成物の調製のためのモノクローナル抗体の使用に関する。これらのモノクローナル抗体は診断試薬の調製にも適している。
本発明のモノクローナル抗体はヒトＩ型インターフェロン受容体（IFN-R）に対するものであり、以下の：
−ヒトIFN-Rの細胞外ドメインを認識し、
−ヒトＩ型IFNの生物学的特性に対する中和能力を有する
という特性を特徴とする。
Ｉ型IFNの生物学的特性を中和する能力は、Ｉ型IFNの抗ウイルス活性を中和するモノクローナル抗体の能力の関数として概算し得る。このような試験は、検定される抗体が本発明の範囲内に含まれるか否かを確定するためには意味があるが、しかしＩ型IFNの生物学的特性がその抗ウイルス特性に限定されるわけではないことは明らかである。抗ウイルス活性についてのこのような試験を実施できるようにするために、詳細な手順を実施例に示す。試験する細胞は有益には、Ｉ型IFNに対する親和性が十分公知のDaudi細胞である。このような試験の主要工程は以下の：
− 確定濃度のヒトＩ型IFNに反応するヒト細胞を、検定される確定濃度のモノクローナル抗体の存在下でヒトＩ型IFNを用いて、モノクローナル抗体とヒト細胞のIFN-Rとの間、及び／又はＩ型IFNとヒト細胞のIFN-Rとの間に複合体を生成させるのに十分な時間インキュベートし；
− インキュベート化細胞を確定濃度の確定ウイルスに感染させ；
− 細胞を洗浄し；
− 細胞を培地中に再懸濁し；
− ウイルスを複製させるのに十分な時間インキュベートし；
− 細胞を溶解し；
− ウイルス複製を測定するか又は細胞変性作用の阻止を測定する
工程から成る。
ヒトＩ型IFNの生物学的特性を中和する本発明のモノクローナル抗体の能力は、使用する抗体容量の関数として調節し得る。したがって、生物学的特性の100％阻害又は部分阻害が得られる。
本発明の別の態様によれば、ヒトＩ型IFN受容体に対するモノクローナル抗体はさらに、それらがヒトＩ型IFNのヒトIFN-Rとの結合を阻止し得るという事実を特徴とする。
ヒトIFN-Rの細胞外ドメインを認識する能力を有する、そしてヒトＩ型IFNのその受容体との結合を阻止し得るモノクローナル抗体は、以下の：
− IFN-Rを保有できるヒトを用いて確定濃度の精製モノクローナル抗体又は検定されるモノクローナル抗体を含有するハイブリドーマ培養上清を予インキュベートし；
− 標識化ヒトＩ型IFNを確定濃度で上記予インキュベーション中培地に加え；
−ヒト細胞、モノクローナル抗体及び標識化Ｉ型IFNを含有する培地を細胞性IFN-Rを用いて一方ではモノクローナル抗体と他方ではＩ型IFNとの間に平衡を生じさせるのに十分な時間インキュベートし；
− 細胞を洗浄し；
− 付着標識化Ｉ型IFNの量を計数することによりヒト細胞と標識化Ｉ型IFNとの間の結合複合体の生成を確定する
工程により選択し得る。
本発明のいくつかのモノクローナル抗体は、ヒトＩ型IFNの抗増殖特性を中和する能力をも有する。この特性は、Daudi細胞で以下の：
− ヒトIFNの存在下で、且つ確定濃度のmABの存在下で細胞を増殖させ；
− ヒトＩ型IFNの抗増殖作用の阻止を検出するために細胞を計数する
工程を実行することにより検定し得る。
本発明のモノクローナル抗体の一特性は、ヒトIFN受容体の細胞外ドメインを認識するその能力にある。モノクローナル抗体のこの特性は天然ヒト受容体を保有するヒト細胞で検定し得るが、しかし原核細胞、例えば大腸菌で発現されるような組換え体IFN-R又は哺乳類細胞、例えばCHO細胞のような真核細胞で発現されるような組換え体IFN-Rの細胞外ドメインでも検定し得る。
この受容体は実際、それが原核又は真核細胞中に産生されるという事実によって、したがって翻訳後成熟が起きるか又は起きないという事実によって異なる特性を示し得る。本発明人はおもしろいことに、本発明のモノクローナル抗体の能力を評価するための、即ち細胞性IFN-Rを認識するための関連した検定を哺乳類細胞で発現される組換え体受容体で実施し得るということを示した。実際、このような組換え体受容体は、その認識活性に関するかぎり、細胞性受容体と同様の特性を有する。
本発明のモノクローナル抗体は、完全受容体、図３に示す受容体のアミノ酸配列を特徴とする特定のドメイン又はペプチドを含めた種々の形態の受容体に対して得られる。
本発明のモノクローナル抗体は、例えば可溶性形態の受容体に対して調製し得る。可溶性形態のIFN-Rに対する水溶性ポリペプチドを図２に説明する。本発明によれば、可溶性形態のIFN-Rは身体中を循環し得るペプチド又はポリペプチドに相応する。
本発明の他のモノクローナル抗体は、図２に説明したような受容体の細胞外ドメインに含まれるペプチドに対して調製してもよい。有益なペプチドは、例えばアミノ酸１とアミノ酸229との間を構成するアミノ酸配列に相応する。本発明の別の態様によれば、IFN-Rの非修飾化細胞外ドメインに対する抗体が修飾ポリペプチド又はペプチドを認識するとすれば、抗体は１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換により修飾されるポリペプチドに対して調製し得る。
本発明の好ましいモノクローナル抗体は、IgG１型のものである。
本発明の抗体のうち、Ｉ型IFNのその受容体との結合を阻止する能力を有する抗体は、100μｇ／ml以下、好ましくは50μｇ／ml以下、有益には20μｇ／ml以下、さらに好ましくは約0.5〜２μｇ／mlの抗体濃度でhu-IFN-Rを有する細胞と同時インキュベートされる場合、好ましくはヒトＩ型IFNのヒト細胞性IFN-Rとの結合をin vitroで阻止することを特徴とする。
本発明は、モノクローナル抗体の高親和性結合能力が、この抗体ヒトＩ型IFNのIFN-Rとの結合活性を阻害し得ることを保証するには十分でないことを示している。にもかかわらず、Ｉ型IFNのその細胞性受容体との結合を阻止する抗体の能力をさらに調べるためには、モノクローナル抗体の高親和性結合能力が必要である。
別のモノクローナル抗体は、それが１〜10μｇ／mlの範囲の濃度で、このヒトＩ型IFNに高度に反応する細胞、例えばDaudi細胞におけるヒトＩ型IFNの抗増殖活性をin vitroで中和することを特徴とする。
別の態様によれば、モノクローナル抗体はさらに、ヒトＩ型IFNの抗増殖活性をこのヒトＩ型IFNにあまり反応しない細胞、例えばLy28細胞上で50〜100μｇ／mlの範囲の濃度でin vitroに中和することを特徴とする。
本発明のモノクローナル抗体の特定の群は、ヒトＩ型IFNの抗ウイルス活性を、このヒトＩ型IFNに高度に反応する細胞、例えばDaudi細胞において、国際標準MRC69／19に関して１〜1000単位の範囲のＩ型IFNの濃度に対して１〜50μｇ／ml、好ましくは１〜20μｇ／mlの範囲の濃度で、in vitroに中和することを特徴とする。
有益には、本発明のモノクローナル抗体は、これらの抗体がIFNγに対するヒト受容体と結合しないものである。
本発明の要件を満たすある特定の抗体は、図２に示すように、それがヒトIFN-Rの細胞外ドメインのアミノ酸27とアミノ酸427との間を構成するアミノ酸配列上のエピトープに対して向けられるようなものである。
本発明の特に興味深い一モノクローナル抗体は、ｎ′92022605の下に1992年２月26日にECACC（European Collection of Animal Cell Cultures Porton Down Salisbury,Wiltshire SP4 056,United Kingdom）に寄託された64G12と呼ばれる抗体である。
これらの抗体は、抗体が生成される抗原がIFN-Rの細胞外ドメインあるいはこのドメインのあらゆるポリペプチド又はペプチドで構成されるような条件で、骨髄腫細胞とペプチド抗原で予め免疫化した動物の脾臓細胞との融合によるハイブリドーマ細胞の調製を包含する慣用的方法により調製し得る。
ハイブリドーマは、KohlerとMilstein（Nature,1974,256:495-497）のプロトコールに従って構築する。例えば、ハイブリドーマは、上記の脾臓細胞と骨髄腫細胞としてNS１マウス（BalbC）HGPRTとの融合から得られる。
本発明のモノクローナル抗体の産生のための第二の手法は、Epstein／Barrウイルスで不滅化した血液のＢ細胞と、モノクローナル抗体を生成することを決定するIFN-Rの細胞外ドメイン又はその断片に予め接触させておいたヒトＢ型リンパ球との間の融合を実行することから成る。モノクローナル抗体を生成することを決定するIFN-Rの細胞外ドメイン又はその断片に予め接触させておいたＢ細胞は、抗原に接触させたin vitro培養により得られ、１回又は何サイクルかの刺激の後にこれらの抗原にコートされたＢ細胞の回収がなされる。
したがって本発明は、上記の特性を有する上記の手法を実行することにより得られるようなヒト抗体に関する。
本発明はさらに、そのＨ及び／又はＬ鎖の可変部又は相補的決定領域がヒト抗体のフレームワーク又は不変部に移植されることを特徴とするモノクローナル抗体を提供することを目的とする。
本発明はさらに、上記のようなモノクローナル抗体を含有することを特徴とするヒトＩ型IFNの生物学的特性に対する拮抗剤特性を有する組成物を提供する。
したがって、本発明は、上記のようなモノクローナル抗体を適切な製剤ビヒクルとともに含有することを特徴とする製剤組成物を提供する。
本発明はさらに、Ｉ型IFNの過剰産生に伴う病的状態及び症状の治療又は予防のための薬剤の製造のための上記のモノクローナル抗体の使用に関する。
第一の実施例によれば、抗体は同種移植片拒否反応の治療のために製剤組成物中に用い得る。
別の実施例によれば、本発明の抗体は自己免疫及び炎症性疾患の治療のための製剤組成物中の活性成分として用いられる。このような疾患の例としては、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、乾癬、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、ベーチェット病、再生不良性貧血、後天性免疫不全症候群（AIDS）及び重傷複合型免疫不全が挙げられる。
急性ウイルス疾患の治療も本発明の抗体を用いて実施し得る。上気道感染の例として、麻疹ウイルスによるもののような慢性ウイルス感染が挙げられる。
本発明の抗体は、ヒトＩ型IFN受容体又は細胞の存在のin vitro診断にも用い得る。
以下の実施例及び図の説明により本発明をさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
− 図１：¹²⁶Ｉ標識化モノクローナル抗体34F10及び64G12の下記のものとの結合：
− Ａ：Daudi細胞
− Ｂ：Ly28細胞。
手短に言えば、10⁶個の細胞を10％ウシ胎仔血清（FCS）を含有するRPMI培地中に希釈した種々の量の標識化抗体の存在下で４℃で２時間インキュベートした。次に細胞をRPMI−１％FCSで４回洗浄し、結合放射能を計数した。100倍過剰の冷却抗体を用いてインキュベートし、総計数から消去することにより非特異的結合を測定した。
− 図２：ヒトIFN-Rの細胞外ドメインのヌクレオチド及び対応するアミノ酸配列。
モノクローナル抗体は、原核細胞（大腸菌）又は哺乳類細胞系（Cos細胞）で合成されるヒトインターフェロンα−β受容体の組換え対可溶性形態に対して産生された。これらの可溶性形態は、図２に記載したDNA配列を基礎にしていた。
− 図３：ヒトIFN-Rのヌクレオチド及び対応するアミノ酸配列。
実施例
実施例１：
可溶性受容体の合成
大腸菌における合成
５個のヒスチジル残基をコードするエキストラシーケンスが終止コドン直前に導入されたヒトIFN-Rの細胞外ドメイン（アミノ酸27〜427）をコードする配列を含有するDNAの断片（図２）を、発現ベクターPkk233-2中でクローン化した。ポリメラーゼ鎖反応（PCR）によりこの断片を生成し、その結果生じたプラスミドをシーケンシングしてShine-Dalgarno配列によるインフレーム挿入及び受容体をコードする適切な配列を確証した。
組換え体蛋白質に導入されるポリヒスチジル尾部は、前に記載されているように（Hochuli E.et al,Bio/technology,1988,1321-1325）、キレート化ニッケル支持体（NTAカラム）上でのアフィニティークロマトグラフィーにより迅速にそれを精製させる。
プラスミドを大腸菌JM105株に導入し、培地にIPTGをふかして蛋白質合成を誘発した（pKK233-2,tacプロモーター）。
細菌ペレットから蛋白質を抽出し、後述のようなアフィニティークロマトグラフィーにより可溶性受容体を均質に精製した。この手法は、還元条件下で50kDa辺りに２つの帯として、そして非還元条件下では３つの帯として移動する蛋白質を生成した。異なる手法により得られた蛋白質の最大濃度は約20μｇ／mlであった。
ゲル電気泳動により検出された２つの蛋白質のＮ末端配列は、両蛋白質が受容体の予測断片であることを示した。
非グリコシル化可溶性受容体の合成及び精製：

同一PCRアプローチを用いて、我々は、発現ベクターpXMTに挿入されたＣ末端に付加的５−ヒスチジル残基を有するIFN-Rアミノ酸配列１〜427をコードする発現ベクターをも構築した。挿入物の正確なヌクレオチド配列も確証した。
その結果生じたプラスミドを一過性発現のために電気穿孔によりCos７細胞に導入し、アフィニティークロマトグラフィーにより、その後後述するようなモノＱ（Pharmacia）上でのイオン交換クロマトグラフィーにより組換え体蛋白質を精製して均質にした。
Cos７からの可溶性IFN-Rの精製

この精製により、Ｎ末端配列がリーダー配列のプロセッシングにおいて何らかの異質を伴う予測受容体配列に相応する76kDa蛋白質が生じた。
実施例２：
Ｉ型インターフェロン受容体に対するモノクローナル抗体の産生
１）モノクローナル抗体の産生
大腸菌から又はCos７細胞の培養上清から精製した組換え体可溶性インターフェロン（r sIFN-R）の注入によりマウスを免疫化した。先ずマウスに完全フロイントアジュバントに溶解した精製蛋白質を腹腔内及び皮下注射した。次いで、緩衝食塩溶液で希釈した精製蛋白質をマウスに週１回腹腔内注射した。組換え体蛋白質10μｇを毎回注射した。
４回目の注射の後、血液を採取し、特異的血清抗体の存在を組換え体受容体に対するELISA及びウエスターンブロットにより調べた。次に最も強い反応体を計10μｇの抗体で二次免疫注射して、その半分を静脈内にそして半分を腹腔内に注入した。
２）細胞融合
追加免疫後４日目に、免疫化動物からの脾臓細胞を採取し、S.Fazekas等（J.Immunol.Methods 35:1-32,1980）が記載の方法に従ってNS１（マウス）（Balbc)HGPRT骨髄腫細胞と融合させた。手短に言えば、５×10⁷個の脾臓細胞をポリエチレングリコール溶液１mlに溶解した３×10⁷個の骨髄腫細胞と融合させて、HAT（ヒポキサンチン、アミノプロテイン及びチミジン）中の腹膜マクロファージ支持細胞層上の５つの96ウエルプレート中に分布させた。この手順を４回繰り返して、免疫化マウスから20×10⁷個の脾臓細胞を得た。大型コロニーが培養ウエル中に検出された場合は、特異的ハイブリドーマに対するスクリーニングを試みた。
スクリーニングのためには、特異的抗体の存在を直接ELISA法により測定した：
ａ）ELISAプレートをPBSに希釈した精製大腸菌発現性又はCos７発現性sIFN-Rを用いて４℃で一夜コーティングした。BSAでコーティングしたプレートを用いて非特異的結合を検出した。
ｂ）PBSに溶解した３％BSAを用いて37℃で１時間インキュベートすることによりプレートを飽和させた。
ｃ）PBS−0.05％Tween 20を用いて４対１に希釈したハイブリドーマ上清を用いて室温で４時間プレートをインキュベートした。
ｄ）先ずヤギ抗マウスビオチニル化イムノグロブリンを用いて、その後ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（両方ともにAmershamより入手。PBS−0.05％Tween 20で１／1000に希釈）を用いてインキュベートすることから成る２工程手法により結合抗体を検出した。
陽性抗体分泌ハイブリドーマを脾臓細胞支持細胞層上で24ウエルプレート中で継代接種して、それらの反応性をELISA及びウエスタンブロットで再び点検した。
３）天然Ｉ型インターフェロン受容体に対する反応性の同定組換え体sIFN-Rを認識するモノクローナル抗体（mAbs）の反応性を、膜蛍光抗体法によりDaudi細胞の表面に発現される天然Ｉ種受容体に対して調べた。手短に言えば、５×10⁵個のDaudi細胞を選択したハイブリドーマの培養上清100μｌ中で４℃で30分インキュベートした。次に１％BSAを含有するRPMI培養中で細胞を４回洗浄し、希釈FITC標識化ヤギ抗マウスＦ（ab′）₂を用いて４℃で30分間さらにインキュベートした。洗浄後、流動細胞計測法により細胞を最後に分析した。大腸菌組換え体受容体に対して産生された35の試験抗体のうちの１つ、並びにCos組換え体受容体に対して産生された６つの試験抗体のうち５つは、Daudi細胞上の天然受容体を認識することが判明した。
次に、希釈を限定することにより、これらのハイブリドーマのクローニングを実行した。イソタイプ特異的抗体を用いたELISA法により、これらのmAbsのイソタイプを確定した。６つのmAbsのすべてがカッパーＬ鎖を有するIgG１であることが分かった。これら６つのmAbsの反応性の要約を表１に示す。
モノクローナル抗体は蛋白質Ｇクロマトグラフィーにより培養上清から精製した。

実施例３：
インターフェロンのヒト細胞株との結合の阻止
ヒト細胞と結合するインターフェロンの阻害を以下のように検定した。10⁶個の細胞を、ハイブリドーマ培養上清又は精製mAbsの種々の希釈液を用いて、又は培地のみを用いて４℃で30分予インキュベートした。¹²⁵Ｉ標識化IFNアルファ８又はアルファ２を100pMの濃度で加えて、細胞を４℃でさらに２時間インキュベートした。これらのインキュベーションは、20mM HEPES,pH7.4及び10％ウシ胎仔血清（FCS）を含有するRPMI培地中で実施した。最後に細胞をRPMI−１％FCSで４回洗浄し、計数して結合放射能を確定した。
ハイブリドーマ64G12株が分泌したmAb（mAb 64G12）は、用量依存的に標識化IFNの細胞との結合を阻止することが本検定において示された。Daudi細胞との結合の50％阻止（Burkittリンパ腫細胞；Klein et al.,Cancer Research,28:1300-1310,1968）は、0.4μｇ／mlのmAb濃度で得られた。同一の阻止はＫ562細胞で得られた（慢性骨髄性白血病，Lozzio and Lozzio,Cell,45:321-334,1975）が、しかし50％阻止はHL60細胞（前骨髄細胞性白血病，Collins S.J.et al.,Nature,270:347-349,1977）に関して11μｇ／mlで、Ly28細胞（Klein G.et al.,Int.J.Cancer,10:44-57,1972）に関しては60μｇ／mlで得られた。

¹²⁵Ｉ標識化mAb 64G12及び34F10の同一細胞株との直接結合、並びにその結果のスキャッチャードプロット分析により、IFNの結合の50％阻止が得られるmAb濃度の差異を直接調べた。0.1〜1.5μｇ／mlの濃度範囲では、mAb 34F10の高親和性結合が全細胞株で観察されたが、一方mAb 64G12の高親和性結合はDaudi細胞及びＫ562細胞で検出されただけであった（図１）。
実施例４：
Ｉ型インターフェロンの機能の阻止
組換え体IFNアルファ２、IFNベータ及びIFNオメガ、又は精製Namalwa及び白血球インターフェロンを用いたDaudi細胞に関する抗ウイルス検定で、そして組換え体IFNアルファを用いた抗増殖検定で、精製mAb 64G12によるＩ型インターフェロンの機能的阻止を立証した。
＊抗ウイルス活性
記載（M.Dron and M.G.Tovey,J.Gen.Virol.64:2641-2647,1983）通りにDaudi細胞での抗ウイルス検定を実行した。細胞（0.5×10⁶／ml）をインターフェロン及び抗体の存在下で24時間インキュベートした。次に１ml中10⁶個の細胞を水疱性口内炎ウイルス（VSV）に37℃で１時間感染させた後、３回洗浄して、培地に再懸濁し、37℃で18時間インキュベートした。次に凍結融解により細胞を溶解させて、Ｌ929細胞での上清の滴定によりウイルス複製を測定した。Ｉ型IFNの種々の亜型の抗ウイルス活性の用量依存性阻止を、精製mAb 64G12に関して立証した。
Wish細胞を用いた抗ウイルス検定に関しては、mAbの存在下で種々の濃度のインターフェロンを用いて細胞を24時間インキュベートした後、VSVで試験した。この検定では、mAb 64G12は白血球IFN（50Ｕ／ml）、組換え体IFNアルファ２（50Ｕ／ml）及びAIDS患者の血清からのインターフェロン（50,75及び150Ｕ／ml）の抗ウイルス活性を完全に遮断することが立証された。
＊抗増殖活性
抗増殖検定に関しては、インターフェロン及び精製阻止又は制御抗体の存在下で96ウエルプレート中の１ml当り細胞10⁵個という濃度でDaudi細胞を植えつけた。次いで、24,48及び72時間後にCoulter計数器を用いて細胞を計数し、トリパンブルー排除試験により生存能力を点検した。精製mAb 64G12は、インターフェロンアルファ２の抗増殖活性の用量依存性阻止を立証した。

Claims (24)

1. 以下の：
   (a)ヒトＩ型インターフェロン受容体（ヒトＩ型IFN-R）のアミノ酸配列27〜427上のエピトープを認識し、
   (b)ヒトＩ型インターフェロン（ヒトＩ型IFN）の抗増殖活性又は抗ウィルス活性に対する中和能力を有する、
   という特性を特徴とするヒトＩ型IFN-Rに対するモノクローナル抗体。
2. ヒト病態Ｉ型IFNのIFN-Rとの結合を阻止する能力を特徴とする請求項１記載のヒトＩ型IFN-Rに対するモノクローナル抗体。
3. 骨髄腫細胞と可溶性形態のヒトIFN-Rで予め免疫化した動物からの脾臓細胞との融合により調製されるハイブリドーマ細胞から得られる請求項１または２記載のモノクローナル抗体。
4. 100μｇ／ml以下の抗体濃度でhu-IFN-Rを保有する細胞と同時インキュベートされる場合に、ヒトＩ型IFNのヒト細胞性IFN-Rとの結合をin vitroで阻止することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
5. 50μｇ／ml以下の抗体濃度でhu-IFN-Rを保有する細胞と同時インキュベートされる場合に、ヒトＩ型IFNのヒト細胞性IFN-Rとの結合をin vitroで阻止することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
6. 20μｇ／ml以下の抗体濃度でhu-IFN-Rを保有する細胞と同時インキュベートされる場合に、ヒトＩ型IFNのヒト細胞性IFN-Rとの結合をin vitroで阻止することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
7. 約0.5〜２μｇ／mlの抗体濃度でhu-IFN-Rを保有する細胞と同時インキュベートされる場合に、ヒトＩ型IFNのヒト細胞性IFN-Rとの結合をin vitroで阻止することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
8. ヒトＩ型IFNに対し反応性である細胞に対するヒトＩ型IFNの抗増殖活性をin vitroで中和することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
9. 前記細胞がDaudi細胞であり、そして前記抗体の濃度が１〜10μｇ／mlである、請求項８記載のモノクローナル抗体。
10. 前記細胞がLy28細胞であり、そして前記抗体の濃度が50〜100μｇ／mlである、請求項１〜９のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
11. IFNガンマのヒト受容体と結合しないことを特徴とする請求項１〜10のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
12. ヒトＩ型IFNに対し反応性である細胞に対するヒトＩ型IFNの抗ウィルス活性をin vitroで中和することを特徴とする、請求項１〜11のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
13. 前記細胞がDaudi細胞であり、そして前記抗体の濃度が１〜10μｇ／mlである、請求項12記載のモノクローナル抗体。
14. 前記細胞がLy28細胞であり、そして前記抗体の濃度が50〜100μｇ／mlである、請求項１〜13のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
15. ｎ′92022605の下に1992年２月26日にECACCに寄託された抗体64G12であることを特徴とする請求項１〜14のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
16. ヒト化抗体であることを特徴とする請求項１〜14のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
17. 抗体重鎖及び軽鎖の可変部又は相補的決定領域がヒト抗体のフレームワーク及び定常部にグラフトされることを特徴とする請求項16記載のモノクローナル抗体。
18. ヒト抗体であることを特徴とする請求項１〜14のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
19. IgG１抗体であることを特徴とする請求項１〜14のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
20. 請求項１〜16のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ細胞。
21. 適切な薬剤ビヒクルと一緒に請求項１〜19のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有することを特徴とする、上気道感染及び／又は慢性ウィルス感染の治療又は予防のための医薬組成物。
22. ヒトIFN-Rの細胞外ドメインを認識する能力及びヒトＩ型IFNのIFN-Rとの結合を阻止する能力を有するモノクローナル抗体の選択方法であって、以下の：
    (a)IFN-Rを保有できるヒト細胞を用いて確定濃度の請求項１〜19のいずれかに記載の精製モノクローナル抗体又は当該モノクローナル抗体を含有するハイブリドーマ培養上清を予インキュベートし；
    (b)確定濃度の標識化ヒトＩ型IFNを上記予インキュベーション中の培地に加え；
    (c)ヒト細胞、モノクローナル抗体及び標識化Ｉ型IFNを含有する培地を細胞性IFN-Rを用いて一方ではモノクローナル抗体と他方ではＩ型IFNとの間に平衡を生じさせるのに十分な時間インキュベートし；
    (d)細胞を洗浄し；
    (e)付着標識化Ｉ型IFNの量を計数することによりヒト細胞とＩ型IFNとの間の結合複合体の生成を確定する；
    工程を特徴とする方法。
23. ヒトIFN-Rの細胞外ドメインを認識する能力を有し、そしてヒト細胞に対するＩ型IFNの抗増殖活性を中和する能力を有するモノクローナル抗体の選択方法であって、以下の：
    (a)ヒトＩ型IFNの存在下で、且つ確定濃度の請求項１〜19のいずれかに記載のモノクローナル抗体の存在下で細胞を増殖させ；
    (b)ヒトＩ型IFNの抗増殖作用の阻止を検出するための細胞を計数する；
    工程を特徴とする方法。
24. ヒトIFN-Rの細胞外ドメインを認識する能力を有し、そしてヒト細胞に対する非病態性又は病態性のＩ型IFNの抗ウィルス活性を中和する能力を有するモノクローナル抗体の選択方法であって、以下の：
    (a)Ｉ型IFN及び請求項１〜19のいずれかに記載のモノクローナル抗体を確定濃度で用いてモノクローナル抗体とヒト細胞のIFN-Rとの間、及び／又はＩ型IFNとヒト細胞のIFN-Rとの間に複合体を生成させるのに十分な時間インキュベートし；
    (b)上記インキュベート細胞を確定濃度のウィルスに感染させ；
    (c)細胞を洗浄し；
    (d)細胞を培地中に再懸濁し；
    (e)ウィルスを複製させるのに十分な時間インキュベートし；
    (f)細胞を溶解し；
    (g)ウィルス複製を測定するか又は細胞変性作用の阻止を測定する；
    工程を特徴とする方法。

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