HUT69995A - Monoclonal antibodies against the human interferon receptor, with neutralizing activity against type i interferon, compositions containing them and process for preparing them - Google Patents

Description

Képviselő:

DANUBIA Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft., Budapest it

I. típusú interferon hatását semlegesítő, humán interferon receptort felismerő monoklonális ellenanyagok, ellena nyagtartalmú készítmények és eljárás az ellenanyagok előál lítására

Laboratoire Europeen de Biotechnologie S. A., Paris, Francé

Feltalálók:

Patrick BENŐIT, Paris

Francois MEYER, Paris

Debborah MAGUIRE, Paris

Iván PLAVEC, Fresnes

Michael TOVEY, Paris

Elsőbbsége:

A nemzetközi bejelentés száma:

A nemzetközi közrebocsátás száma:

Franciaország

09? _r

1994.09.30. ·

1992. 03. 31. (92400902.0) Európa

PCT/EP93/00770

WO 93/20187

80327-4829 PÁ

-2A találmány tárgyát I. típusú interferon hatását semlegesítő, humán interferon-receptort felismerő monoklonális ellenanyagok (mAb-ok), ellenanyagtartalmú készítmények és ellenanyag-előállítási eljárások képezik.

A találmány tárgyát képező monoklonális ellenanyagok előnyösen alkalmazhatók interferon-antagonista, proliferatív sejtaktivitással és/vagy vírusos sejtfertőződéssel összefüggő patológiás állapotok kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyszerek előállítására.

Az interferonok (IFN) a szekretált proteinek olyan csoportját alkotják melynek tagjai egész sor különböző biológiai aktivitással rendelkeznek, és jellemző rájuk, hogy gerincesek sejtjeiben antivirális állapotot képesek indukálni [Gresser, I. és mtsa.: Biochem. Biophys. Acta 516, (1978)]. Az interferonoknak három különböző antigénsajátságú osztálya van: alfa (a), béta (β) és gamma (γ). Az α-IFN-t és a β-IFN-t együttesen I. típusú interferonoknak nevezzük.

A természetes I. típusú interferonok csoportjának legalább 12 egymással közeli rokonságban álló tagja van, melyeket különböző gének kódolnak, de szerkezetük egymással meglehetősen homológ [Weissmann és mtsa.: Prog. Nucl. Acid. Rés. Mól. Bioi. 33, 251 (1986)].

A humán α-IFN lokusz két gén-alcsaládot tartalmaz. Az első alcsalád 14 nem-allélikus gént és 4 pszeudogént tartalmaz, melyek legalább 80 %bán homológok egymással. A második alcsalád, az a-2 vagy ómega (ω) alcsalád 5 pszeudogént és egy funkcionális gént tartalmaz, amely 70 %-ban homológ az α-IFN génekkel [Weismann és mtsa. (1986)].

Az α-IFN altípusok különböző specifikus aktivitásúak, de biológiai aktivitás-spektrumuk [Streuli és mtsai.: PNAS-USA. 78, 2848 (1981)] és receptoruk azonos [Agnet, M. és mtsai.: Interferon 5 c. könyv 1-22. old., szerk.: Gresser, I., Academic Press, London (1983)].

A β-interferont (β-IFN-t) egyetlen gén kódolja, amely hozzávetőleg 50 %-ban homológ az α-IFN génekkel.

-3Αζ α-IFN altípusok és a β-IFN ugyanahhoz a sejtfelszíni receptorhoz kötődnek.

A gamma-interferont (γ-IFN-t) szintén egyetlen gén kódolja, amelyik kevéssé homológ az α-IFN és a β-IFN génekkel. A γ-IFN receptora különbözik az a- és β-IFN-ok receptorától.

Jelen leírás vonatkozásában az a és b osztályba tartozó interferonok receptorát IFN-R-rel fogjuk jelölni. Ez a jelölés a természetes I. típusú receptort reprezentálja. A természetes interferonok a osztályát alkotó proteinek csoportját α-IFN-nel fogjuk jelölni, az I. típusú interferon elnevezés pedig vonatkozik mind a természetes α-, ω-, és β-IFN-okra.

Annak ellenére, hogy az interferon nagy hatású antivirális hatóanyag, figyelemreméltó bizonyítékok szólnak amellet, hogy az akut vírusos megbetegedések sok jellemző szimptómáját, mint például a felső légúti fertőzések esetén is, α-IFN túltermelés okozza. Ezenfelül kimutatták azt is, hogy az aIFN kísérleti állatokban szerepet játszik bizonyos krónikus vírusos fertőzések patogenézisében, és a rendelkezésre álló bizonyítékok arra utalnak, hogy ugyanez a helyzet bizonyos krónikus humán vírusos megbetegedések esetén is, például azoknál, melyeket a kanyaró vírusa okoz.

Az α-IFN-ok szintén hatásos immunregulátor molekulák, melyek stimulálják a poliklonális B-sejt-aktiválódást, fokozzák az NK-sejtek citotoxicitását, gátolja a T-sejt-működést és modulálják az I. osztályba tartozó fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) antigének expresszióját. Ezek a funkciók mind szerepet játszanak az autoimmunitás kialakulásában és az átültetett szövetek kilökődésében. Az α-IFN rendellenes termelődése összefüggésbe hozható egy sor autoimmun-betegséggel és gyulladásos rendellenességgel, mint például a szisztémás lupus erythematosis (SLE), I. típusú diabetes, psoriasis, reumás ízületi gyulladás, sklerosis multiplex, Behcetkór, aplasztikus anémia, szerzett immunhiányos tünetegyüttes (AIDS), valamint a súlyos összetett immunhiányos betegség. A szisztémás lupus páci

-4ensek szérumában az α-IFN-szint korrelál a betegség előrehaladtának klinikai és humorális jeleivel. Az α-IFN termelődés HIV-pozitív pácienseknél szintén erős prediktív jelzés a betegség előrehaladtára vonatkozóan.

Kimutatták, hogy α-IFN adagolása a psoriasis és sclerosis multiplex páciensek esetén súlyosbítja a betegséget, valamint azt, hogy autoimmun betegségtől előzőleg nem szenvedő pácienseknél SLE-szerű szindrómát idéz elő. Kimutatták továbbá, hogy az α-IFN normális egerekben glomerulonefritist idéz elő és NZB/W-egerekben gyorsítja a spontán autoimmun betegség kialakulását.

Az α-IFN a szövetátültetés miatt kialakuló betegség (graft-versushost disease, GVHD) lefolyása során is termelődik, a szisztémás GVHD-re jellemző megnövekedett NK-sejt aktivitással párhuzamosan. Az α-IFN az NK-sejtek citotoxicitásának első számú modulátora és kimutatták, hogy aIFN adagolása normális egerekben súlyosbítja a GVDH bélrendszeri következményeit.

A találmány tárgyát az I. típusú humán interferonok biológiai hatásainak új antagonistái képezik. A találmány szerinti antagonisták felhasználhatók terápiás célokra - a profilaktikus alkalmazást is beleértve - olyan esetekben mikor az I. típusú IFN-ok (a- és β-IFN) abnormális mértékben termelődnek és ez az abnormális termelődés patológiás tüneteket idéz elő. Ezek az antagonisták ezen felül előnyösen alkalmazhatók bizonyos megbetegedések diagnosztizálására, valamint az ilyen betegségek előrehaladásának nyomon követésére is.

Ahhoz, hogy a találmány tárgyát képező antagonistákat azonosítani tudjuk, figyelembe vettük azt a tényt, hogy a természetes humán I. típusú interferonnak nevezett anyag valójában interferonok (interferon-altípusok) keveréke, valamint azt, hogy az I. típusú interferonban az altípusok szerinti összetétel mind kvantitatívan, mind kvalitatívan változó.

-5Bizonyos természetes interferonokat, mint például a Namalwa-sejtek által kiválasztott interferont (Namalwa-IFN) és a leukociták által kiválasztott interferont (leukocita-IFN) már részletesen tanulmányoztak [Finter, N. B. és mtsa.: Interferon 2, 65-79. old., szerk.: Gresser, I., Academic Press (1980); Cantell, K. és mtsai.: Interferon 1, 2-25. old., szerk.: Gresser, I., Academic Press (1979)] és mi is ezeket használtuk a természetes I. típusú IFN-ok azonosítására.

Bizonyos patológiás esetekkel kapcsolatosan, mint például az AIDS, speciális tulajdonságokkal rendelkező interferonok jelenlétéről számoltak be (Preble, Ο. T. és mtsai.: Annals of New-York Academy of Sciences, 65-75. old.). Ezek az interferonok - melyek szerepet játszanak az olyan patológiás esetek, mint például az AIDS kialakulásában - mindazáltal ugyanahhoz a fent leírt receptorhoz kötődnek.

A találmány tárgyát képezi tehát az I. típusú IFN antagonistája, amely képes egy meghatározott mértékig gátolni vagy semlegesíteni az I. típusú humán IFN biológiai tulajdonságait, azaz képes in vivő semlegesíteni az α-, β- és ω-altípusú IFN-ok keverékét.

Ennek megfelelően azonosítottunk olyan ellenanyagokat, különösen monoklonális ellenanyagokat, melyek I. típusú IFN-nal szemben antagonista sajátsággal rendelkeznek. Ezek az ellenanyagok az I. típusú humán IFNreceptorra specifikusak.

Az elmondottak értelmében a találmány vonatkozik a fenti monoklonális ellenanyagok I. típusú IFN abnormális mértékű termelődésével kapcsolatos rendellenességek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállításához történő felhasználására is. Az említett monoklonális ellenanyagok alkalmasak diagnosztikai reagensek előállítására is.

A találmány tárgyát képező egyik ellenanyag az I. típusú humán IFNreceptorra specifikus (IFN-R) és a következő tulajdonságok jellemzőek rá:

- a humán IFN-R extracelluláris doménjét ismeri fel, és

-6-1. típusú humán IFN biológiai hatásait semlegesítő' képességgel rendelkezik.

Az I. típusú IFN biológiai hatásait semlegesítő képességet annak alapján becsülhetjük, hogy milyen mértékben képes a monoklonális ellenanyag az I. típusú IFN antivirális hatását semlegesíteni. Az ilyen vizsgálati eljárások alkalmasak annak megállapítására, hogy a vizsgált ellenanyag a találmány oltalmi körébe esik-e, mindazáltal szakember számára nyilvánvaló, hogy az I. típusú interferon tulajdonságai nem korlátozódnak az antivirális hatásra. A leíráshoz tartozó példák között részletes leírásokat adunk, melyek alapján az ilyen, antivirális aktivitás vizsgálatát célzó eljárások végrehajthatók. Az ilyen vizsgálati eljárásokban előnyösen alkalmazhatunk Daudi-sejteket, melyek I. típusú IFN iránti affinitása közismert. Egy ilyen vizsgálati eljárás főbb lépései például a következők lehetnek:

- meghatározott mennyiségű I. típusú humán IFN-ra érzékeny humán sejtet meghatározott mennyiségű vizsgálandó monoklonális ellenanyag jelenlétében I. típusú humán IFN-nal olyan hosszú ideig inkubálunk, ami elégséges ahhoz, hogy a monoklonális ellenanyagok és a humán sejtek IFNreceptora és/vagy az I. típusú IFN és a humán sejtek IFN-receptora közötti kölcsönhatás következtében létrejövő komplexek kialakulhassanak;

- az előinkubált sejteket egy meghatározott vírus meghatározott mennyiségével megfertőzzük;

- a sejteket megmossuk;

- a sejteket táptalajban felszuszpendáljuk;

- a sejteket a vírus replikálódásához elegendő ideig inkubáljuk;

- a sejteket lizáltatjuk;

- meghatározzuk a vírus replikáció vagy a citopatikus hatás gátlódásának mértékét.

A találmány szerinti monoklonális ellenanyagok I. típusú humán IFN biológiai hatásait semlegesítő képessége az alkalmazott ellenanyagok

-7- - ·’. ··.' ·..* mennyiségének függvényében modulálható. Ennek értelmében vagy a biológiai hatások 100 %-os gátlása, vagy pedig részleges gátlás érhető el.

A találmány tárgyát képező I. típusú humán IFN-receptor-specifikus monoklonális ellenanyagok más szempontból tovább jellemezhetők azzal, hogy képesek megakadályozni valamely I. típusú humán interferon IFN-Rhoz történő kötődését.

Olyan monoklonális ellenanyagot, amely képes felismerni a humán IFN-R extracelluláris doménjét és képes az I. típusú humán IFN receptorkötődését megakadályozni, a következő lépések végrehajtásával izolálhatunk:

- tisztított monoklonális ellenanyagok előre meghatározott mennyiségét vagy vizsgálni kívánt monoklonális ellenanyagokat tartalmazó hibridóma-tenyészet-felülúszót előinkubálunk olyan humán sejtekkel, amelyek feltételezhetően tartalmaznak IFN-R-t;

- a fenti előinkubált táptalajhoz előre meghatározott koncentrációban jelzett I. típusú humán IFN-t adunk;

- a humán sejteket, a monoklonális ellenanyagokat és a jelzett humán I. típusú ellenanyagokat tartalmazó táptalajt olyan hosszú ideig inkubáljuk, ami elégséges az egyensúly beálltához a celluláris IFN-R és egyrészt a monoklonális ellenanyagok, másrészt pedig az I. típusú IFN között;

- megmossuk a sejteket;

- a sejtekhez asszociálódott jelzett I. típusú IFN mennyiségének meghatározásával eldöntjük, hogy kialakult-e a receptorkötési komplex a humán sejtek és a jelzett I. típusú IFN közötti.

A találmány tárgyához tartozó monoklonális ellenanyagok közül némelyek képesek az I. típusú humán IFN antiproliferatív hatását semlegesíteni. Ezt a sajátságot is vizsgálhatjuk Daudi-sejtek segítségével, a következő lépések végrehajtásával:

- a sejteket I. típusú humán IFN és meghatározott koncentrációjú mAb jelenlétében nőni hagyjuk;

I

-8- ··· .:. ·..· ·..'

- az l. típusú humán IFN antiproliferatív hatása gátlódásának kimutatása céljából megszámoljuk a sejteket.

A találmány tárgyához tartozó monoklonális ellenanyagok egyik jellemző sajátsága, hogy képesek a humán IFN-receptor extracelluláris doménjét felismerni. A monoklonális ellenanyagok ezen sajátságát vizsgálhatjuk a természetes humán receptort hordozó humán sejtek alkalmazásával, de vizsgálhatjuk prokariota sejtben (például E. coliban) kifejezett rekombináns IFN-R-extracelluláris-doménen vagy eukariota (például emlős, azon belül például CHO) sejtben kifejezett rekombináns IFN-receptoron is.

A fenti vizsgálatban alkalmazott receptorok valójában egymástól eltérő tulajdonságokkal is rendelkezhetnek attól függően, hogy prokariota vagy eukariota sejtben termelődtek-e és ebből következően a poszttranszlációs érési folyamat végbement-e vagy sem. Fontosnak tartjuk megjegyezni, hogy kimutattuk, hogy a találmány tárgyához tartozó monoklonális ellenanyagoknak például az IFN-R-felismerő képessége releváns módon jellemezhető emlős sejtekben kifejezett rekombináns receptorokon végrehajtott vizsgálati eljárások útján. Valójában az ilyen rekombináns receptorok, legalábbis ami a felismerőképességet illeti, a celluláris receptorokkal azonos tulaj donságúak.

A találmány tárgyához tartozó monoklonális ellenanyagokat a receptor legkülönbözőbb formái ellen termeltethetünk, például a teljes receptor ellen vagy a 3. ábrán látható aminosav-sorrendű receptor valamelyik jellemző doménja vagy peptidje ellen.

A találmány tárgyához tartozó monoklonális ellenanyagokat termeltethetjük például a receptor szolúbilis formája ellen is. A 2. ábrán egy IFN-R szolúbilis formájának megfelelő vízoldható polipeptid szekvenciáját láthatjuk. A jelen leírás vonatkozásában az IFN-R szolúbilis formájának olyan peptidet vagy polipeptidet nevezünk, amely képes a testben cirkulálni.

« Λ

-9A találmány tárgyához tartozó más monoklonális ellenanyagokat termeltethetünk például a 2. ábrán látható szekvenciájú receptor extracelluláris doménjében található peptid ellen is. Egy ilyen előnyös pepiid szekvenciája például megfelel a megadott szekvencia 1-229. aminosavainak. A találmány tárgyához tartozó megint más ellenanyagokat termeltethetünk például egy, egy vagy több aminosav helyettesítésével módosított polipeptid ellen is, feltéve, hogy az IFN-R módosítatlan extracelluláris doménje ellen termelődött ellenanyagok felismerik az illető polipeptidet vagy peptidet.

A találmány tárgyához tartozó monoklonális ellenanyagok előnyösen IgGl-típusú ellenanyagok.

A találmány tárgyához tartozó monoklonális ellenanyagok közül azok, amelyek képesek gátolni az I. típusú IFN receptorkötődését előnyösen azzal jellemezhetők, hogy in vitro gátolják az I. típusú humán IFN kötődését a humán celluláris IFN-R-hoz ha 100 pg/ml vagy annál kisebb, előnyösen 50 pg/ml vagy annál kisebb, előnyösebben 20 pg/ml vagy annál kisebb, még előnyösebben körülbelül 0,5-2 pg/ml koncentrációban hu-IFN-R-t hordozó sejtekkel inkubáljuk őket.

Kimutattuk, hogy a nagy affinitású kötőképesség önmagában nem elegendő ahhoz, hogy eldönthessük, vajon egy monoklonális ellenanyag képes lesz-e megakadályozni az I. típusú humán IFN receptorkötődését. Mindazáltal a nagy affinitású kötőképesség megléte szükséges ahhoz, hogy az ellenanyag I. típusú IFN celluláris receptorkötődését gátló hatását tovább vizsgálhassuk.

A találmány tárgyához tartozó más monoklonális ellenanyagok azzal jellemezhetőek, hogy I. típusú humán IFN-ra nagyon érzékeny sejtekben in vitro semlegesítik az I. típusú humán IFN antiproliferatív hatását, például Daudi-sejtek esetén 50-100 pg/ml körüli koncentrációban.

A találmány tárgyához tartozó ismét más monoklonális ellenanyagok azzal jellemezhetőek, hogy I. típusú humán IFN-ra nagyon érzékeny sejtek- 10ben in vitro semlegesítik az I. típusú humán IFN antivirális hatását, például Daudi-sejtek esetén 1-50 pg/ml körüli, előnyösen 1-20 gg/ml koncentrációban, 1-1000 egység I. típusú IFN jelenlétében (az egység definícióját lásd az MRC 69/16 sz. nemzetközi szabványban).

A találmány tárgyához tartozó monoklonális ellenanyagok előnyösen nem kötődnek a humán y-IFN-receptorhoz.

A találmány tárgyához tartozó egyik ellenanyag a 2. ábrán bemutatott szekvenciájú humán IFN-R extracelluláris doménjének 27-427. aminosavai által meghatározott epitópok valamelyikét ismeri fel.

A találmány tárgyához tartozó egyik jellemző, 64G12-jelű ellenanyagot a 92022605 számon deponáltuk az ECACC-nél (“European Collection of Animál Cell Cultures”, Porton Down Salisbury, Wiltshire SP4 056, United Kingdom), 1992. február 26-án.

A találmány tárgyához tartozó ellenanyagokat előállíthatjuk hagyományos eljárásokkal, melyek magukba foglalják hibridóma-sejtek előállítását valamely olyan állatból származó lépsejtek és mielóma-sejtek fúziójával, mely állatot előzőleg olyan peptid-antigénnel immunizáltak, amely az IFN-R extracelluláris doménjét vagy annak valamely polipeptid- vagy peptidfragmensét reprezentálja.

A hibridómákat Kohler és Milstein eljárása [Natúré 256, 495 (1974)] alapján állíthatjuk elő. Előállíthatunk például hibridómákat a fent leírt lépsejtek és NSl-(egér)-(BalbC)-HGPRT’-mielóma-sejtek fúziójával.

A találmány tárgyához tartozó monoklonális ellenanyagokat előállíthatjuk másképpen úgy is, hogy vérből származó Epstein/Barr vírussal halhatatlanná tett B-sejteket és olyan humán B-limfocitákat fúzionáltatunk, melyeket előzőleg érintkezésbe hoztunk az IFN-R extracelluláris régiójával vagy annak valamely olyan fragmensével, amely ellen ellenanyagokat kívánunk termeltetni. Az előzetesen antigénnel érintkeztetett B-sejteket in vitro tenyészetben állíthatjuk elő, ahol az IFN-R extracelluláris régiójával vagy • ·

- 11 annak valamely fragmensével érintkeztetjük őket, és az antigénekkel fedett B-sejteket egy vagy több stimulálási ciklus után izoláljuk.

A találmány tárgyához tartoznak tehát a fenti módon előállított, fent leírt tulajdonságokkal rendelkező humán ellenanyagok.

A találmány tárgyához tartoznak olyan monoklonális ellenanyagok is melyekre jellemző, hogy valamely ellenanyag nehéz és/vagy könnyű láncainak variábilis vagy komplementer meghatározó régióit egy humán ellenanyag keret- és/vagy konstans régióiba ültettük be.

A találmány tárgyához tartoznak olyan gyógyászati készítmények is melyek az I. típusú humán IFN biológiai tulajdonságaival antagonista hatásúak és jellemző rájuk, hogy a fent meghatározott monoklonális ellenanyagok valamelyikét tartalmazzák.

A találmány tárgyához tartoznak tehát értelemszerűen olyan gyógyászati készítmények is melyek a fent meghatározott monoklonális ellenanyagok valamelyikét, valamint gyógyszergyártásban alkalmazott hordozó és/vagy egyéb segédanyagokat tartalmaznak.

A találmány tárgyához tartozik ezen felül a fenti monoklonális ellenanyagok felhasználása I. típusú IFN-túltermeléssel összefüggő tünetek vagy patológiás esetek megelőzésében vagy kezelésében hatásos gyógyászati készítmény előállításához.

A találmány szerinti ellenanyagokat felhasználhatjuk például transzplantátumok kilökődésének kezelésére használható gyógyászati készítmények előállításához.

A találmány szerinti ellenanyagokat felhasználhatjuk autoimmun- és gyulladásos betegségek kezelésére szolgáló gyógyászati készítmények aktív hatóanyagaként is. Ilyen betegségek például a szisztémás lupus erythematosys, az 1. típusú diabetes, a psoriasis, a reumás ízületi gyulladás, a sclerosis multiplex, a Bechet-kór, az aszplatikus anémia, a szerzett immunhiányos tünetegyüttes (AIDS) és a súlyos összetett immunhiányos betegség.

• ·

- 12A találmány szerinti ellenanyagok alkalmazhatóak akut vírusos megbetegedések kezelésére is. Példaként említhetjük a felső légúti fertőzéseket, valamint az olyan krónikus vírusfertőzéseket mint a kanyaró-vírus okozta fertőzések.

A találmány tárgyához tartozó ellenanyagokat felhasználhatjuk az I. típusú humán IFN-receptor vagy a receptort hordozó sejtek jelenlétének in vitro diagnosztikai kimutatására is.

A találmány vonatkozásában további részletek és információk találhatók a következőkben leírt példákban és a bemutatott ábrákon.

A következőkben a leíráshoz csatolt ábrák rövid magyarázatát ismertetjük.

Az 1. ábrán a ¹²⁵I-jelzett 34F10- és 64G12-jelű ellenanyagok kötődését ábrázoltuk

- A: Daudi-sejtekhez,

- B: Ly28-sejtekhez.

Az ábrán látható kísérletek rövid leírása: 10⁶ sejtet inkubáltunk 2 órán keresztül 4 °C-on különböző mennyiségű, 10 % boíjúsavót (FCS-t) is tartalmazó RPMI-táptalajban hígított jelzett ellenanyag jelenlétében. A sejteket ezután 1 % FCS-t tartalmazó RPMI-vel 4-szer mostuk, majd meghatároztuk a sejthez kötött radioaktivitás mértékét. A nem-specifikus ellenanyagkötődés mértékét úgy határoztuk meg, hogy a sejteket 100-szoros hideg ellenanyag-felesleg jelenlétében inkubáltuk a jelzett ellenanyaggal. Az így kapott háttér értéket a specifikus kötődés mérésekor a teljes beütésszámból minden esetben levontuk.

A 2. ábrán a humán IFN-R extracelluláris doménjének nukleotidszekvenciáját és az annak megfelelő aminosavsorrendet láthatjuk.

A monoklonális ellenanyagokat rekombináns humán α-β-IFN-receptor (IFN-R) szolúbilis formái ellen termeltettük, amiket vagy prokariota sejtekben (E. coli), vagy emlős sejtrendszerben (Cos-sejtek) szintetizáltat- 13 tünk. Ezen oldható formák aminosavsorrendje a 2. ábrán látható DNSszekvencián alapult.

A 3. ábrán a humán IFN-R nukleotid-szekvenciáját és az annak megfelelő aminosavsorrendet láthatjuk.

1. példa

A szolúbilis receptorok szintézise E. coliban

Egy, a humán IFN-R extracelluláris doménjét (27-427. aminosavak) kódoló és a kódoló régióban közvetlenül a terminációs kodon előtt 5 hisztidin aminosavat kódoló inszertet tartalmazó DNS-fragmenst a pKK233-2-jelű expressziós vektorokba klónoztunk. Az említett fragmenst polimeráz-láncreakció (PCR) útján állítottuk elő és a keletkezett plazmidok szekvenciáját meghatároztuk annak igazolására, hogy az inszert a ShineDalgamo-szekvenciához képest helyes leolvasási fázisban van és, hogy a receptort kódoló régió szekvenciája hibátlan.

A rekombináns fehéijébe épített polihisztidil farok lehetővé teszi a fehérje nikkel-kelát oszlopon (NTA-oszlopon) végzett affinitás-kromatográfiával történő gyors tisztítását, a szakirodalomból ismert eljárás alapján [Hochuli, E. és mtsai.: Bio/technology, 1321-1325 (1988)].

A kialakított plazmidot a JM105-jelű E. co/z-törzsbe transzformáltuk és a fehérje szintézisét IPTG táptalajhoz adásával indítottuk (pKK233-2, tac-promoter).

A leülepített baktériumsejtekből kivontuk a fehérjéket, majd az oldható receptort affinitás-kromatográfiával homogenitásig tisztítottuk, ahogy azt az alábbiakban részletesen ismertetni fogjuk. Ezzel az eljárással egy olyan fehérjét izoláltunk, amely redukáló körülmények között az elektroforézisgélen két 50 kDa körüli sávot ad, nem redukáló körülmények között pedig hármat. A különböző alkalmazott eljárásokkal maximálisan közelítőleg 20 gg/ml koncentrációban tudtuk az említett fehérjét előállítani.

• ·

- 14- **· ··· ··* *··* *··*

A gél-elektroforézissel detektálható, két különböző viselkedésű fehérje N-terminális szekvencia-analízise igazolta, hogy mindkettő a receptor kívánt fragmense.

Glikozilálatlan oldható receptor szintézise és tisztítása baktérium tenyészet (250 ml)

I

I indukció IPTG-vel (3 óra)

I

I kiülepített sejtek

M guanidin-hidroklorid, pH=8 centriíugálás

I

I

NTA-oszlop mosások: 8 mol/1 karbamid, pH=8 mol/1 karbamid, pH=6,3 8 mol/1 karbamid, pH=5,9 elúció: 8 mol/1 karbamid, pH=4

I

I refolding hígítás; dialízis 0,1 mol/1 Tris-szel | szemben (pH=9)

I dialízis (PBS)

Azonos PCR-eljárást alkalmazva olyan pXMT-3-alapú expressziós vektort is készítettünk, amely az IFN-R 1-427. aminosavait, valamint egy 5 hisztidinből álló C-termnális végződést kódolt. Az inszert nukleotid-szekvenciájának pontosságát ellenőriztük.

Az előállított plazmidot elektroporációval átmeneti expresszálás céljából Cos7-sejtekbe juttattuk és a kifejezett rekombináns fehérjét affinitáskromatográfiával, majd mono-Q (Pharmacia) oszlopon végzett ioncserés kromatográfiával homogenitásig tisztítottuk, ahogy azt az alábbiakban részletezzük.

Az oldható IFN-R tisztítása Cos7-sejtekből

Cos-sejtek preparatív elektroporációja (18 óra)

I

I szérum mentes táptalaj

I

I órás, 72 órás és 96 órás felülúszók

I

I bekoncentrálás

I

I NTA-oszlop mosás: PBS

I

I elúció: 0,1 mol/1 NaOAc, pH=5,5 semlegesítés

I bekoncentrálás (30 000 D molekulatömegnél vágó szűrőn)

I

Mono-Q (0-0,5 mol/1 NaCl)

A fent ismertetett tisztítási eljárás egy 76 kD-os fehérjét eredményezett, amelynek N-terminális szekvenciája megegyezett a várható receptorszekvenciával és a szignál-szekvencia lehasadásában bizonyos heterogenitást tapasztaltunk.

2. példa

Monoklonális ellenanyagok termeltetése az I. típusú interferonreceptor ellen

1. Ellenanyagok termeltetése

Egereket immunizáltunk E. coliból tisztított rekombináns oldható interferon-receptorral (r-sIFN-R) vagy Cos7-sejttenyészet felülúszójával. Az egereket először mind intraperitoneálisan, mind szubkután beinjektáltuk a komplett Freund-adjuvánsban felvett tisztított fehéijével. Ezután az egereket hetente egyszer injektáltuk intraperitoneálisan, puffereit sóoldatban hígí- 16-

tott tisztított fehérjével. Minden esetben 10 pg rekombináns fehéijét injektáltunk.

A negyedik injektálás után vért vettünk és a rekombináns receptorelleni specifikus szérum-ellenanyagok jelenlétét mind ELISA-val, mind Westem-blottal vizsgáltuk. A legerősebb reakciókat adó egereket ezután összesen 10 pg antigénnel megerősítő immunizálásnak vetettük alá, amely mennyiség felét intravénásán, másik felét pedig intraperitoneálisan injektáltuk be.

2. Sejtfúzió

A megerősítő immunizálás után 4 nappal lépsejteket vettünk az immunizált állatoktól, melyeket Fazekas, S. és mtsai. eljárása alapján [J. Immunoi. Methods 35, 1 (1980)] NSl-(egér)-(Balbc)-HGPRT-mielómasejtekkel fuzionáltattunk. Röviden: 5x10 lépsejtet fuzionáltattunk 3x10 mielóma-sejttel 1 ml polietilén-glikol oldatban, majd az oldatot öt 96tenyésztőhelyű tálcán szétosztottuk, HAT-táptalajban (hipoxantin, aminoprotein és timidin) felvitt peritoneális makrofág tápláló réteget alkalmazva. Az eljárást négyszer ismételtük, mivel az immunizált egerekből 20x10⁷ lépsejtet vettünk. A specifikus hibridómák kimutatását célzó szűrővizsgálatot akkor végeztük, mikor már a tenyésztőhelyeken nagyméretű kiónok voltak láthatóak.

A szűrővizsgálatot a specifikus ellenanyagok jelenlétét kimutató direkt-ELISA eljárással végeztük:

i) az ELISA-tálcákat egy éjszakán át 4 °C-on “coaf’-oltuk (“coat”: a mérőhelyekre felvitt alapréteg) tisztított, PBS-ben hígított, E. coliban vagy Cos-sejtekben kifejezett sIFN-R-ral; az aspecifikus kötődés mértékének megállapítására BSA-val coat-olt tálcákat használtunk;

ii) a tálcák szabadon maradt kötőhelyeit 3 % BSA-val fedtük le (1 óra, 37 °C);

·« iii) a tálcákat a 0,05 % Tween 20 tartalmú PBS-pufferrel ötszörösre hígított hibridóma felülúszókkal 4 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk;

iv) a megkötődött ellenanyagok jelenlétét egy kétlépéses eljárással mutattuk ki, mely egyrészt biotinilált kecske-(anti-egér)-immunoglobulinokkal végzett, majd ezt követően streptavidin-tormaperoxidáz-komplexszel végzett inkubációból állt (mindkét reagenst az Amersham-től szereztük be és 0,05 % Tween 20 tartalmú PBS-pufferrel 1000-szeresre hígítottuk őket).

A pozitív ellenanyagokat szekretáló hibridómákat lépsejt táplálóréteget tartalmazó 24-helyes tálcákra passzáltuk és az ellenanyagok reaktivitását ismét ELISA-val és Westem-blottal ellenőriztük.

3. Az ellenanyagok természetes I. típusú interferon-receptorral szembeni reaktivitásának vizsgálata

A rekombináns sIFN-R-t felismerő monoklonális ellenanyagok (mAbok) Daudi-sejtek felszínén kifejezett természetes I. típusú receptorral szembeni reaktivitását membrán-immunfluoreszcenciával vizsgáltuk. Röviden: 5xl0⁵ Daudi-sejtet inkubáltunk 30 percig 4 °C-on a kiválasztott hibridómatenyészet felülúszójának 100 μΐ-ével. A sejteket ezután 4-szer mostuk 1 % BSA-tartalmú RPM1-táptalajjal, majd 30 percig 4 °C-on tovább inkubáltuk őket FITC-jelzett kecske-(anti-egér)-F(ab’)₂-vel. A sejteket végül - újabb mosás után - áramlási citométerben analizáltuk. Az E. coliban termelt rekombináns receptor ellen termeltetett 35 vizsgált ellenanyag közül 1, a Cossejtekből származó rekombináns receptor ellen termeltetett 6 vizsgált ellenanyag közül pedig 5 ismerte fel Daudi-sejtek felszínén található természetes receptort.

A pozitívnak bizonyult hibridóma-tenyészeteket ezután limitáló hígításos módszerrel klónoztuk. Az így kapott mAb-ok izotípusát izotípusspecifikus ellenanyagok alkalmazásával, ELISA-módszerrel határoztuk • «

- 18·« meg. Mind a 6 pozitív mAb kappa-könnyü-láncú IgGl-izotípusúnak bizonyult. A kapott 6 mAb reaktivitásának összefoglalását az 1. táblázatban láthatjuk.

A monoklonális ellenanyagokat a felülúszókból G-protein-kromatográfíával tisztítottuk.

1. táblázat

Az IFN-R-elleni ellenanyagok reaktivitása rekombináns receptor elleni reaktivitás celluláris receptor elleni reaktivitás*

E. coli Cos

	ELISA	Western	ELISA	Western	immunfluoreszcencia
34F10	+	+	4-	+	+
64G12	+	+	+	+	+
63F6	-	-	+	+ (gyenge)	+
64G2	-	-	+	+ (gyenge)	+
64D10	-	-	+	+(gyenge)	+
65D8	-	-	4-	+ (gyenge)	+

♦ Daudi-sejteken mérve

3. példa

Interferon humán sejtekhez kötődésének gátlódása

Az interferon humán sejtekhez kötődésének gátlódását a következőképpen vizsgáltuk: 10⁶ sejtet 30 percig 4 °C-on előinkubáltunk a hibridómatenyészetek különböző mértékben hígított felülúszóival vagy tisztított mAbokkal vagy csak táptalajjal. A sejtekhez ezután 100 pmol/1 koncentrációban ¹²⁵I-jelzett α-8-IFN-t vagy α-2-IFN-t adtunk, majd további két órán át 4 °C-on inkubáltuk őket. Az inkubálásokat 20 mmol/1 HEPES-t (pH=7,4) és 10 % boíjúsavót (FCS-t) tartalmazó RPMI-táptalajban végeztük. A sejteket végül 4-szer mostuk 1 % FCS-tartalmú RPMI-vel, majd a kötött radioaktivitás mértékét meghatároztuk.

- 19A 64G12-jelű hibridóma-sejtvonal által szekretált mAb-ról (melyet később 64G12-jelű mAb-nak neveztünk el) a fenti vizsgálati eljárással kimutattuk, hogy a jelzett IFN sejtekhez kötődését koncentrációfuggő módon gátolja. Az IFN Daudi-sejtekhez [Burkitt-limfóma-sejtvonal; Kiéin és mtsai.: Cancer Research 28, 1300 (1968)] kötődését az említett mAb 0,4 gg/ml koncentrációban gátolta 50 %-osan. Azonos gátlást kaptunk K562-sejtek [krónikus mielogén leukémia-sejtek; Lozzio és Lozzio: Cell 45, 321 (1975)] esetén is, HL60 sejtek [promielocita-leukémia-sejtek; Collins, S. J. és mtsai.: Natúré 270, 347 (1977)] esetén azonban az 50 %-os gátlást 11 pg/ml koncentrációnál értük el, Ly28 sejtek [Kiéin, G. és mtsai.: Int. J. Cancer 10, 44 (1972)] esetén pedig 60 úg/ml koncentrációál.

2. táblázat

Jelzett α-2-IFN különböző sejtekhez történő kötődésének gátlása mAb64G12-vel

Sejtvonal	mAb koncentráció 50 % gátlásnál
Daudi	0,4 pg/ml
K562	0,4 pg/ml
HL60	11 gg/ml
Ly28	60 pg/ml

Azt a tényt, hogy különböző sejtek esetén különböző ellenanyagkoncentrációkkal sikerült az 50 %-os gátlást elérnünk, tovább vizsgáltuk direktjelzett 64G12- és 34F10-jelű mAb-ok azonos sejtvonalakhoz történő kötődési eredményeinek Scatchard-pont-analízisével. A 0,1-1,5 pg/ml koncentrációtartományban a 34F10 esetén minden egyes sejtvonalhoz nagy affinitású («10 nmol/1) kötődést kaptunk, a 64G12 esetén azonban csak a Daudiés K562-sejtekhez kaptunk nagy affinitású kötődést (1. ábra).

« ·

-20• f*···· · · · · · · · ·*· ·♦· ·· ·· ·4

4. példa

I. típusú interferon funkciójának gátlása

Az I. típusú IFN funkcionális gátlását tisztított mAb64G 12-vel egyrészt rekombináns α-2-IFN, β-IFN, ω-IFN, tisztított Namalwa-IFN vagy tisztított leukocita-IFN alkalmazásával végrehajtott antivirális hatást detektáló vizsgálati eljárással, másrészt α-2-IFN alkalmazásával végrehajtott antiproliferatív hatást detektáló vizsgálati eljárással demonstráltuk, Daudisejteken.

Antivirális hatást kimutató vizsgálati eljárás

Az antivirális hatást kimutató vizsgálati eljárást Daudi-sejteken a szakirodalomban leírt módon hajtottuk végre (Dron, M. és mtsa.: J. Gén. Virol. 64, 2641 (1983)]. A sejteket (0,5xl0⁶/ml) 24 órán át interferon és ellenanyagok jelenlétében inkubáltuk. Ezután 10⁶ sejtet 1 ml térfogatban 1 órán keresztül 37 °C-on fertőztünk vezikuláris szomatitisz-vírussal (VSV), majd 3-szor mostuk őket, ezután táptalajban felszuszpendáltuk és 37 °C-on 18 órán át tovább inkubáltuk a sejteket. A sejteket ezután fagyasztás-olvasztás ciklussal lizáltattuk, majd a vírus replikáció mértékét a felülúszó L929-sejteken történő titrálásával határoztuk meg. A tisztított 64G12jelű mAb esetén kimutattuk a különböző I. típusú IFN-altípusok antivirális aktivitásának koncentrációfüggő gátlását.

A Wish-sejteken végrehajtott antivirális hatást kimutató vizsgálati eljárásban a sejteket a VSV-fertőzést megelőzően 24 órán át mAb-ok jelenlétében különböző koncentrációjú interferonokkal inkubáltuk. Ezzel a vizsgálati eljárással kimutattuk, hogy a 64G12-jelű mAb teljesen meggátolja a leukocita-IFN (50 U/ml), a rekombináns α-2-IFN (50 U/ml) valamint egy AIDS-páciensek szérumából származó interferon (50, 75 és 150 U/ml) antivirális aktivitását.

-21- ·«· .i.

Antiproliferatív hatást kimutató vizsgálati eljárás

Az antiproliferatív hatást kimutató vizsgálati eljárás során 10⁵ sejt/ml koncentrációban Daudi-sejteket vittünk fel egy 96-mérőhelyes lemezre interferon és tisztított gátló vagy kontroll ellenanyagok jelenlétében. A sejteket ezután 24, 48 és 72 óra elteltével Coulter-számlálóval megszámoltuk és életképességüket trypan-kék kizárással vizsgáltuk. Kimutattuk, hogy a tisztított 64G12-jelű mAb koncentrációfüggő módon gátolja az α-2-IFN antiproliferatív aktivitását.

Claims (23)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. I. típusú humán interferon-receptorhoz (IFN-R-hoz) kötődő monoklonális ellenanyag, azzal jellemezve, hogy (i) a humán IFN-R extracelluláris doménjét ismeri fel, és (ii) I. típusú humán IFN biológiai aktivitásait semlegesítő hatása van.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag, azzal jellemezve, hogy képes a patológiás humán I. típusú interferon (IFN) IFN-R-hoz történő kötődését gátolni.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyag, azzal jellemezve, hogy előzetesen oldható formájú humán IFN-R-ral immunizált állat lépsejtjei és mielóma-sejtek fúziójával előállított hibridó ma-sejtből nyerhető.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyag, azzal jellemezve, hogy a humán celluláris IFN-R valamely oldható formáján és/vagy egy rekombináns IFN-R oldható formáján található epitópot ismer fel.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyag, azzal jellemezve, hogy in vitro gátolja az I. típusú humán IFN humán celluláris IFN-R-hoz történő kötődését, amennyiben humán IFN-R-t hordozó sejtekkel 100 pg/ml vagy kisebb, előnyösen 50 pg/ml vagy kisebb, előnyösebben 20 pg/ml vagy kisebb, még előnyösebben pedig közelítőleg 0,52 pg/ml koncentrációban inkubáljuk.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyag, azzal jellemezve, hogy in vitro 1-10 μg/ml koncentrációtartományban alkalmazva semlegesíti az I. típusú humán IFN-nak az I. típusú humán IFN-ra kifejezetten érzékeny sejtekre, például Daudi-sejtekre kifejtett antiproliferatív aktivitását.
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyag, azzal jellemezve, hogy in vitro 50-100 pg/ml koncentrációtartományban al-23- kalmazva semlegesíti az I. típusú humán IFN-nak az I. típusú humán IFNra kevéssé érzékeny sejtekre, például Ly28-sejtekre kifejtett antiproliferatív aktivitását.
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyag, azzal jellemezve, hogy a γ-IFN humán receptorához nem kötődik.
9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyag, azzal jellemezve, hogy a humán IFN-R 27-427. aminosavai által meghatározott epitópok valamelyikét ismeri fel.
10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyag, azzal jellemezve, hogy in vitro 1-10 pg/ml koncentrációtartományban alkalmazva semlegesíti az I. típusú humán IFN-nak az I. típusú humán IFN-ra kifejezetten érzékeny sejtekre, például Daudi-sejtekre kifejtett antivirális aktivitását.
11. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyag, azzal jellemezve, hogy in vitro 50-100 μβ/ml koncentrációtartományban alkalmazva semlegesíti az I. típusú humán IFN-nak az I. típusú humán IFN-ra kevéssé érzékeny sejtekre, például Ly28-sejtekre kifejtett antivirális aktivitását.
12. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyag, azzal jellemezve, hogy a 92022605 nyilvántartási számon az ECACCnél 1992 február 26-án deponált 64G12-jelű ellenanyag.
13. 13. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyag, azzal jellemezve, hogy humanizált ellenanyag, azaz például az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti IFN-R-kötő ellenanyag könnyű és nehéz láncainak variábilis komplementer meghatározó régiói egy humán ellenanyag keret- és konstans régióiba vannak beültetve.
14. 14. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyag, azzal jellemezve, hogy humán ellenanyag.

    ·♦·· 4«
15. 15. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyag, azzal jellemezve, hogy IgG 1-típusú ellenanyag.
16. 16. Hibridóma sejt, azzal jellemezve, hogy az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyagot termel.
17. 17. I. típusú IFN-antagonista hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyagot tartalmaz.
18. 18. I. típusú IFN-antagonista hatású gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyagot és gyógyszergyártáshoz használt hordozót és/vagy egyéb segédanyagokat tartalmaz.
19. 19. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyagok alkalmazása proliferatív sejtaktivitással és/vagy vírusos sejtfertőződéssel összefüggő patológiás állapot kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítására.
20. 20. Eljárás humán IFN-R extracelluláris doménjét felismerő monoklonális ellenanyagok szelektálására, azzal jellemezve, hogy

    a) humán I. típusú IFN receptor-kötését gátló ellenanyag szelektálásakor (i) az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti tisztított monoklonális ellenanyag meghatározott mennyiségét vagy monoklonális ellenanyagokat tartalmazó hibridóma-felülúszót feltehetően IFN-R-t hordozó humán sejtekkel előinkubálunk;

    (ii) a fenti előinkubáló táptalajhoz meghatározott koncentrációban I. típusú jelzett humán IFN-t adunk;

    (iii) a fenti humán sejteket, monoklonális ellenanyagokat és jelzett I. típusú IFN-t tartalmazó táptalajt olyan hosszú ideig inkubáljuk, ami elegendő ahhoz, hogy beálljon a kötődési egyensúly egyrészt a monoklonális el-

    -25 lenanyagok, másrészt pedig az I. típusú IFN, valamint a celluláris IFN-R között;

    (iv) a sejteket megmossuk; és (v) a kötött IFN mennyiségének meghatározása útján meghatározzuk a humán sejtek és az I. típusú IFN közötti kötési komplex kialakulásának mértékét;

    b) I. típusú IFN humán sejtekre kifejtett antiproliferatív hatását semlegesítő ellenanyag szelektálásakor (i) sejteket I. típusú humán IFN és 1-15. igénypontok bármelyike szerinti meghatározott mennyiségű monoklonális ellenanyag jelenlétében szaporodni engedünk; és (ii) a sejteket megszámoljuk az I. típusú IFN antiproliferatív hatása gátlásának kimutatása céljából;

    c) természetes nem patológiás vagy patológiás I. típusú IFN humán sejtekre kifejtett antivirális hatását semlegesítő ellenanyag szelektálásakor (i) sejteket I. típusú humán IFN és 1-15. igénypontok bármelyike szerinti meghatározott mennyiségű monoklonális ellenanyag jelenlétében olyan hosszú ideig inkubálunk, ami elegendő a monoklonális ellenanyagok és a humán sejteken található IFN-R és/vagy az I. típusú IFN és a humán sejteken található IFN-R közötti komplex kialakulásához;

    (ii) a fenti előinkubált sejteket meghatározott koncentrációban vírussal megfertőzzük;

    (iii) a sejteket megmossuk;

    (iv) a sejteket táptalajban ismét felszuszpendáljuk;

    (v) a sejteket a vírus-replikáció megtörténtéhez elegendő ideig inkubáljuk;

    (vi) a sejteket lizáltatjuk; és (vii) meghatározzuk a vírus replikáció vagy a citopatikus hatás gátlásának mértékét.
21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán I. típusú IFN receptor-kötését gátló ellenanyagot szelektálunk.
22. 22. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy I. típusú IFN humán sejtekre kifejtett antiproliferatív hatását semlegesítő ellenanyagot szelektálunk.
23. 23. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy természetes nem patológiás vagy patológiás I. típusú IFN humán sejtekre kifejtett antivirális hatását semlegesítő ellenanyagot szelektálunk.

    i.

    A meghatalmazott

    Aktaszámunk: 80327-4829

    DANUBIA