BG99141A

BG99141A - Моноклонално антитяло срещу рецептора за човешкиинтерферон

Info

Publication number: BG99141A
Application number: BG99141A
Authority: BG
Inventors: Patrick Benoit; Francois Meyer; Debborah Maguire; Ivan Plavec; Michael Tovey
Original assignee: Laboratore Europeen De Biotechnologie S.A.
Priority date: 1992-03-31
Filing date: 1994-10-28
Publication date: 1995-07-28
Also published as: EP1329459A2; PT1329459E; EP0633931B1; RU94045826A; DE69332997T2; AU2349697A; DE69332997D1; DE69334158T2; US20070128701A1; ATE241008T1; DK0633931T3; CA2133106C; EP1329459B1; EP0633931A1; NO943625D0; CA2133106A1; FI944509A; US5919453A; US20020055492A1; US20080226647A1

Abstract

Изобретението се отнася за моноклонално антитяло,насочено срещу човешки рецептор за интерферон от клас i (ifn-r). То разпознава извънклетъчна областна човешкия ifn-r и има неутрализираща способностпо отношение на биологичните свойства на човешкия интерферон тип i-ifn. Изобретението се отнася и дотяхното използване за диагностициране.

Description

МОНОКЛОНАЛНИ АНТИТЕЛА СРЕЩУ РЕЦЕПТОРА ЗАИНТЕРФЕРОН С НЕУТРАЛИЗИРАЩО ДЕЙСТВИЕ

СПРЯМО ИНТЕРФЕРОН ТИП I Интерфероните (ΙΡΝ) представляват група секретира-ни протеини, които показват широка гама на биологичнодействие и се характеризират със способността си да ин-дуцират известна антивирусна активност в клетките на гръбначните животни (I. Сгеззег апП М.С. Тоуеу ВхосНет. Βίο_рНуз. Ас1а 516 г 231, 1978). Съществуват три антигенникласа ΙΡΝ : алфа ( об ), бета (/0 ) и гама.рр^оС и ррр/^са известни заедно като интерферон тип I. Естественият човешки интерферон тип I съдържа 12 и повече твърде сходни протеини, кодирани от различни ге-ни с висока степен на структурна хомоложност.(ПехззтаппапП УеЬег, Рго§. Цис1. АсхП. Кез. Μοί. Βί,οΐ. 33: 251,1986). Локусът на човешкияХРНс^, обхваща две подгрупи. Пър-вата подгрупа се състои от 14 неалелни гени и 4 псевдо-гени, показващи най-малко 80% хомолоЛожност.Вторатаподгру-па, о4II или омега ( (л) ) , съдържа 5 псевдогени и 1 функ-ционален ген, който показва 70% хомоложност с гените наΙΝΡ ьо ( Пехззглапп апП ИеЪег, 1986). Подтиповете на ΙΡΝса£, имат различни специфични ак-тивности, но притежават един и същи биологичен спектър (ЗГгеиН еЬ а1. ΡΝΑδ-ϋδΑ 78: 2848, 1981) й един и същиклетъчен рецептор (А§пе£ М. е! а1. ΐη "1п£ег£егоп 5", Εά. I. Сгеззег р.1-22,АсаНеттс Ргезз, ЬопНоп 1983). Интерферон/3 (ΙΓΝ^$ )се кодира от един единствен генкойто показва приблизително 50% хомоложност с гените на ΙΕΝοό. Подтиповете на интерферон ОС и интерферон /3 сесвързват с един и същи рецептор върху клетъчната повърх-ност . Интерферон гама ( ΙΓΝ гама) се кодира също от са-мо един ген, който показва слаба хомоложност с генитена ΙΕΝ об и ΙΓΝ/ό . Рецепторът за ΙΓΝ гама е различенот рецептора за интерферон 04 и /3, За целите на настоящото изобретение ще означим ре-цептора за класове 04 и /3 интерферони с ΙΓΝ-К. Товапредставлява естественият рецептор за тип I. Групата напротеините, съставляващи естествения интерферон 66 ,ще означим с ΙΓΝΟΟ , а Ι-ΙΓΝ ще означава както естественитеΙΓΝ ОС така и ΙΓΝ οΰ и ΙΓΝ/ό . Независимо от това, че интерферонът е мощен анти-вирусен агент, съществуват значителни доказателства, кои то позволяват да се предполага, че редица от характерни-те симптоми на острите вирусни заболявания, като напри-мер инфекциите на горните дихателни пътища, са причине-ни от свръхпроизводството на интерферон алфа. Нещо по -вече, посочва се, че интерферон алфа допринася за пато- генезата на някои хронични вирусни инфекции в експеримен-тални животни, като досегашните резултати предполагат,четакъв е случаят и при някои хронични вирусни заболява -ния, като например онези, които се причиняват от вирусана морбили. Интерфероните са също така мощни имунно -регулаторни молекули, които стимулират поликлоналната ак-тивация на В-клетките, повишават цитотоксичността на ΝΚ--клетките, инхибират функцията на Т-клетките и модули -рат въздействието на антигените от клас 1 на главния ком-плекс на тъканната съвместимост (МНС), които всички взе-мат участие в индуцирането на автоимунитет и в отхвър-лянето на присадките. Анормалното производство на интер-ферон Об е свързано с редица автоимунни заболявания и възпалителни процеси, в това число системен лупус еритема-тодес (5ЬЕ) , диабет от тип I, псориазис, ревматоиденартрит, множествена склероза, болестта на Бехчет, аплас-тична анемия, синдрома на придобита имунна недостатъч -ност (СПИН) и някои комбинирани заболявания на имунна не-достатъчност. Наличието на интерферон в серума на па- циенти със системен лупус еритематодес е свързано както с клинични, така и с хуморални признаци за нарастналатаактивност на заболяването. Произвеждането на интерферонв Ηΐν-позитивни индивиди също е силно показателно за ево-люцията на заболяването. Посочва се, че прилагането на интерферон оС изост- ря и утежнява хода на заболяването у пациенти с псориа-зис и множествена склероза и предизвиква подобен на 5ЬЕ - синдром у пациенти, при които липсва предишна анамне -за за предхождащо автоимунно заболяване. Посочва се съ-що така, че интерферон 01, предизвиква гломерулонефрит вобикновени мишки и ускорява проявлението на спонтанноавтоимунно заболяване при мишки ΝΖΒ/Μ. Интерферон 00 се произвежда също в хода на болест-та присадка срещу хазяин (ονΗϋ) , паралелно с характе -ристиката на повишена активност на ΝΚ -клетките присистемната болест присадка срещу хазяин (СУНО). Интер-ферон ос е главен модулатор на цитотоксичността на νκ_ клетките, като се посочва, че прилагането на интерферонутежнява чревните поражения от ονΗϋ при обикновени мишки. Предмет на настоящото изобретение е да се предло-жат нови антагонисти срещу биологичното действие на Ι-ΙΝΓу човека. Тези антагонисти могат да се използват за те-рапевтични, в това число и за профилактични цели, в слу-чаите когато човешки интерферон тип Ι-ΙΝΓ (ΙΝΡ06//3 )е произведен над нормалното и когато това свръхотделяне е свързано с патологични симптоми. Тези антагонисти мо-гат да се използват също за диагностицирането на различ-ни заболявания или за изследване на хода на тези заболя - вания. С оглед на дефинирането на такива антагонисти ав - торите на изобретението отчитат факта, че човешкият ес -тествен интерферон тип Ι-ΙΝΓ се състои фактически от ня-колко интерферона (подвида) и че съчетанието на тези раз-лични подвидове интерферони варира както количествено, така и качествено. Някои естествени интерферони, като например интер-фероните, отделяни от клетки Ната1юа (интерферон Иаша1ма)или от левкоцити (левкоцитен интерферон) са подробно изу-чени (Ν.Β. ПпЬег ап<3 К.Н. Еаи£ез, 1п1ег£егоп 2. 1980,р. 65-79 Г.Сгеззег ЕсИ1ог АсаПеттс Ргезз: К. Сап1е11 е£а1., 1п1ег£егоп 1, 1979, р.2-25-, Г.Сгеззег ЕсНбог АсаПе-ттс Ргезз) и са използвани от авторите на изобретениетопри определяне на естествените интерферони от тип I . При някои патологични случаи като СПИН, са опи-сани интерферони, притежаващи някои специални свойства(О.Т.РгеЬ1е е£ а1. Аппа1з о£ Ием-Уогк АсаПету о£ Зсхепсе,р.65-75). Този интерферон, участващ в патогенезата на за-болявания като СПИН, все пак се свързва към същия рецеп-тор, както бе вече описано по-горе. Една от целите на настоящото изобретение е да пред-ложи антагонист на интерферон тип Γ-ΓΝΕ, който да е всъстояние да инхибира или да неутрализира - до някакваопределена степен - биологичните свойства на човешкия ин-терферон тип 1-1ИЕ,или с други думи, да неутрализира ΐη νινο определено съчетание от подвидове ос ,Α ω В тази връзка авторите на изобретението са дефини-рали антитела, и по-специално, моноклонални антитела,кои то имат свойството да действат като антагонисти на ин -терферон тип Ι-ΙΝΕ-Тези антитела са насочени срещу рецептора на човешкия интерферон тип Ι-ΙΓΝ. Предлаганото изобретение третира също използване-то на моноклонални антитела за изготвянето на фармацев - тични препарати, приложими при лечението на симптоми , свързани със свръхнормалното производство на тип Ι-ΙΝΕ. Тези моноклонални антитела са подходящи също така за из готвянето на диагностични реагенти. Едно от моноклоналните антитела съгласно настоя-щото изобретение е ориентирано срещу рецептора за човеш-ки интерферон тип I (Ι-ΙΝΕ) и се характеризира със след-ните свойства: - разпознава извънклетъчния домен на човешкия ΙΕΝ-Κ - има неутрализиращо действие спрямо биологичнитесвойства на човешки интерферон тип I ( Ι-ΙΕΝ). Способността да неутрализира биологичните свойст-ва на 1-1ЕПможе да бъде дефинирана като функция на спо-собността на моноклоналните антитела да неутрализиратантивирусната активност на интерферон Ι-ΙΕΝ. Един такъв тест е подходящ за да се определи дали анализираното ан-титяло е включено в обсега на изобретението, въпреки чее ясно, че биологичните качества на тип Ι-ΙΝΕ не са ог-раничени само с неговите антивирусни свойства. В приме- рите са описани подробни процедури с оглед провежданетона такъв тест за антивирусната активност. За предпочитане е анализираните клетки да бъдат клетки на РаисН ,чийто афинитет към интерферон Ι-ΙΝΓ е добре известен. Ос-новните стъпки при текъв един тест са следните: - инкубиране на определена концентрация от човеш-ки клетки, чувствителни към човешки интерферон Ι-ΙΝΓ ,с човешки интерферон Ι-ΙΝΓ в присъствието на опреде-лена концентрация от моноклоналните антитела, които ис-каме да изследваме, като инкубирането продължи достатъчно дълго време, за да позволи формирането на комплексмежду моноклоналните антитела и ΙΝΓ-Κ на човешкитеклетки и/или между Ι-ΙΡΝ и ΙΡΝ-Κ на човешките клетки; _ инфектиране на инкубираните клетки с определен вирус, в определена концентрация, -промиване на клетките, - ресуспендиране на клетките в условията на култу ра, - инкубиране с продължителност, достатъчна да позволи репликация на вируса( - лизиране на клетките, - измерване на репликацията на вируса или измер-ване на инхибирането на цитопатичния ефект. Способността на моноклоналните антитела , предла-гани от изобретението, да неутрализират биологичнитесвойства на човешкия интерферон тип Ι-ΙΝΡ може да бъ- ,#*·» 'Че»- де модулирана като функция на дозата на използваните антела. Следователно, може да се получи стопроцентово иличастично инхибиране на биологичните свойства. Съгласно друго едно изпълнение на настоящото изо-бретение, моноклоналните антитела,насочени срещу ре-цептора за човешкия интерферон ΙΝΓ-Κ , се характеризи -рат освен това с обстоятелството, че притежават способ-ността да инхибират свързването на човешкия интерферон Ι-ΙΝΓ към човешкия ΙΠΕ-Κ. Едно моноклонално антитяло, притежаващо способ -ността да разпознава извънклетъчния домен на човешкиярецептор ΙΝΓ-β и да инхибира свързването на човешкияинтерферон тип Ι-ΙΝΕ към неговия рецептор, може да бъ-де селектирано по следния начин: - Предварително инкубиране на определена концен-трация от пречистени моноклонални антитела или на су-пернатант на хибридомна култура, съдържащ моноклонал-ните тела, които искаме да изследваме, с човешки клет-ки, способни да съдържат ΙΝΕ-Κ, - прибавяне на белязан човешки интерферон типΙ-ΙΝΓ в определена концентрация, към посочената по-горе предварително инкубирана среда; - инкубиране на среда, съдържаща човешки клетки,моноклонални антитела и белязания I *ΊΝΓ с продължител-ност, достатъчна да позволи достигането на равновесие между моноклоналните антитела, от една страна, и интер- ферон Ι-ΙΓΝ , от друга страна, с клетъчния рецепторΙΓΝ-Κ, - промиване на клетките, - определяне формирането на свързващия комплексмежду човешките клетки и белязания интерферон Ι-ΙΡΝчрез преброяване на количеството свързан белязан интер-ферон тип Ι-ΙΡΝ. Някои от моноклоналните антитела съгласно настоя-щото изобретение имат също така свойството да неутрали-зират антипролиферативната способност на човешкия ι-ινρ.Това качество също може да бъде оценено при клетки наОаиНл., < като се извърши следното: -клетките се оставят да растат в присъствието на човешки интерферон тип Ι-ΙΝΡ и определена концентрацияна моноклоналното антитяло (тАЬ ), - клетките се преброяват, за да се установи евен-туалното инхибиране на антипролиферативния ефект начовешкия Ι-ΙΝΓ. Едно от свойствата на моноклоналното антитяло съг-ласно предлаганото изобретение се явява неговата способ-ност да разпознава извънклетъчния домен, на рецептора за човешки Ι-ΙΝΡ. Тази способност на моноклоналното ан -титяло може да бъде проследена върху човешки клетки, но * сещи естествен човешки рецептор, но също така и върху из вънклетъчния домен на даден рекомбинантен ΙΡΝ-Κ , като този, експресиран върху прокариотни клетки, например при 10

Е.соН или рекомбинантен 1ЕМ-К,какъвто се наблюдава в да-дена клетка на бозайник, примерно клетка СНС*.. Този рецептор може да покаже различни свойства в зависи-мост от това, дали е налице посттранслационно узряване или не. Авторите на изобретението посочват, че върху да-ден рекомбинантен рецептор, изявен в клетките на бозай -ници, могат да се извършат различни анализи с оглед дасе прецени способността на дадено моноклонално антитялов светлината на предлаганото изобретение, т.е. то да разпознава клетъчния ΙΕΝ-Κ. Фактически, един такъв рекомби-нантен рецептор има същите свойства, както и клетъчниярецептор, доколкото става дума за неговата разпознавател на .активност. Моноклоналните антитела съгласно предлаганото изо-бретение могат да бъдат получени срещу различни форми нарецептора, в това число срещу целия рецептор, срещу оп - ределен домен или срещу пептид с характерна за рецептора аминокиселинна последователност на рецептора, показан на фигура 3. Така например, антитела съгласно предлаганото изо-бретение могат да бъдат изготвени срещу разтворимата форма на рецептора. Разтворим във вода полипептид, съответ-стващ на разтворимата форма на ΙΝΕ-Κ е описан на фигура 2. Съгласно предлаганото изобретение разтворимата форма на ΙΝΓ-Ε отговаря на пептид или полипептид, който може да циркулира в тялото. Съгласно изобретението, могат да се изготвят и дру 11 ги моноклонални антитела срещу даден пептид, съдържащ се в извънклетъчния домен на рецептора, както това е описа-но на фигура 2. Подходящ е,например пептид, който съот-ветства на аминокиселинната верига, съдържаща се между аминокиселина 1 и аминокиселина 229. Съгласно друга ед-на постановка на изобретението, има възможност да се из-готвят антитела срещу даден полипептид, модифициран чрез заместване на една или повече аминокиселини, при поло - жение че антителата, насочени срещу немодифицирания из -вънклетъчен домен на ΙΓΝ-Κ разпознават модифицирания полипептид или пептид. Предпочитани моноклонални антитела съгласно настоящото изобретение са антителата от типа 1§С1. Измежду антителата съгласно настоящото изобретениедадено антитяло, притежаващо способността да инхибирасвързването на интерферон тип Ι-ΙΡΝ към неговия рецеп-тор, се характеризира предимно с това, че то забавя ϊηνΐϋΓο свързването на човешкия интерферон с човешкияклетъчен ΙΝΓ-Κ ,след като бъде инкубирано заеднос клет-ки, съдържащи човешки ΙΝΓ-Κ , в концентрация на антите-лата? равна или по-малка от 100 _р§/т1 , за предпочитанеравна или по-малка от 20 ^§/т1 или най-добре в обхва-та около 0,5 до 2 уп§/т1. Авторите на изобретението посочват , че силно изразената свързваща:способност на дадено антитяло не е до -статъчна, за да гарантира, че това антитяло ще е способ-но да инхибира свързващата активност но човешкия интер - 12 ферон тип Ι-ΙΝΓ към ΙΝΓ-Κ . Въпреки това силно изразена-та свързваща способност на моноклоналното антитяло е необходима, за да се установи след това способността на ан -титялото да инхибира свързването на интерферон тип Ι-ΙΝΓ към неговия клетъчен рецептор. Друго едно моноклонално антитяло се характеризирас това, че неутрализира ΐη νΐϋτο антипролиферативна-та активност на човешкия интерферон тип Ι-ΙΝΓ върхуклетки, силно чувствителни към този човешки Ι-ΙΝΓ? при-мерно клетки на ϋβικϋ, в концентрация от порядъка на 1до 10уп§/ш1. Съгласно едно друго решение на изобретението, ед-но от моноклоналните антитела се характеризира също та-ка с това, че неутрализира ίη νίϋτο антипролиферативна-та активност на човешкия интерферон тип Ι-ΙΝΓ върхуклетки, слабо чувствителни към този човешки интерферон,например клетки Ъу28 в концентрация от порядъка на 50до 100 _/п§/т1. Определена група моноклонални антитела съгласнопредлаганото изобретение се характеризира с това, че тенеутрализират антивирусната активност на човешкия интер-ферон тип Ι-ΙΝΓ върху клетки, силно чувствителни къмтози тип Ι-ΙΝΕ , например върху клетки на ОаисИ в кон-центрация от порядъка на 1 до 50 /1§/т1 , за предпочита- не от 1 до 20 ^1£/т1 , при концентрация на Ι-ΙΝΓ в гра-ници от 1 до 1000 единици, съгласно международния стан -дарт МКС 69/19. 13 Предимството е, че моноклетъчното антитяло съг-ласно предлаганото изобретение не се свързва към човеш-кия рецептор за ΙΝΡ -,гама. Едно специално антитяло, отговарящо на изисква -нията на изобретението, е антитяло, насочено срещу да - ден епитоп във веригата на аминокиселините, разположен между аминокиселина 27 и аминокиселина 427 на извънкле-тъчния домен на човешкия ΙΝΕ-Κ , както това е показа -но на фигура 2. Едно особено заслужаващо внимание моноклонално ан-титяло съгласно предлаганото изобретение е антитялото,обозначено с 64С12 под Ν5 92022605, представено предЕСАСС (Европейската сбирка на култури от животински клетки - Еигореап Со11есПоп о£ Ап1ша1 Се11 СиНигез РогТопϋονη ЗаПзЪигу,ΜίΙΤδΗΪΓβ 5Е4 056, ЦК ) на 26 февр . 1992г. Тези антитела могат да бъдат получени по извест-ните досега методи, използващи изготвянето на хибридом- ни клетки чрез сливането на миеломни клетки и клетки на слезка от животно, имунизирано предварително с пепти - ден антиген при условие, че антигенът , срещу който сеизработват антителата, се състои от извънклетъчния до -мен на ΙΝΕ-Κ или от някой полипептид или пептид от то-зи домен. Хибридомите се създават съгласно протокола наКоН1ег апН МИзбеъп (ИаТиге, 1974, 256: 495-497). Напри-мер хибридомните клетки' се получават от сливането на 14 описаните по-горе клетки от слезка с N51 на мишка(Ва1Ь1) НСРКТ в качеството на миеломни клетки. Друга процедура за получаването на моноклонални антитела съгласно изобретението се състои в осъществя-ване на сливането между обезсмъртени с вируса на ЕрзСегп/Вагг В-клетки и човешки В-лимфоцити, държани пред-варително в контакт с извънклетъчния домен (или част от него) на ΙΡΝ-Κ , рецептора срещу който искаме дасъздадем моноклонални антитела. В-клетките, поставенипредварително в контакт с извънклетъчния домен (или част от него) на ΙΓΝ-Κ , рецептора срещу който искамеда създадем моноклонални антитела, могат да се полу -чат от култура ΐη νϊϋΓο , в която влизат в контакт сантигените, като отделянето на В-клетките, покрити с такива антигени, се предшества от един или няколко ци-къла на стимулация. Предлаганото изобретение,следователно, се отнасяза човешки антитела, получени чрез осъществяване на гор-ната процедура, притежаващи споменатите по-горе свой - ства. Изобретението си поставя за цел също и получаване-то на моноклонални антитела, характеризиращи се с това,че променливи или допълнително определящи се области оттехните тежки и/или леки вериги са присадени към рамка-та и/или към константни области на дадено човешко анти- тяло 15 Освен това изобретението предлага препарат, при -тежаващ антагонистични свойства за биологичните харак -теристики на човешки интерферон тип Ι-ΙΝΓ, който препа рат се характеризира с това, че съдържа моноклонални ан-титела, както бе описано по-горе. Във връзка с това изобретението предлага фармацев-тичен препарат, характеризиращ се с това, че съдържа мо-ноклонални антитела, както бе дефинирано по-горе, заед -но с подходящ фармацевтичен вехикулум. Изобретението третира също така използването наедно моноклонално тяло, както бе дефинирано по-горе,за изготвянето на лекарства за лечение или профилактика на дадено патологично състояние или на симптоми, свърза-ни със свръхпроизводството на интерферон тип Ι-ΙΝΓ. Съгласно първия пример, антителата могат да бъдатизползвани като фармацевтично съединение за лечение на отхвърлянето на ало-присадката. Съгласно друг пример, антителата според предлага-ното изобретение се използват като активни основни със-тавки във фармацевтични препарати за лечението на ав -тоимунни и възпалителни заболявания. Тези заболяваниявключват системен лупус еритематодес, диабет тип I, псо-риазис, ревматоиден артрит, множествена склероза, бо -лестта на Бехчет, апластична анемия, синдром на придо -бита имунна недостатъчност (СПИН) и редица комбиниранизаболявания, дължащи се на имунна недостатъчност. Някои остри вирусни заболявания също могат да бъ - 16 дат лекувани с антителата, предлагани от настоящото изо-бретение. Като пример могат да бъдат посочени инфекции-те на горните дихателни пътища, хроничните вирусни ин-фекции, като например инфекциите, причинени от вирусана морбили. Антителата съгласно предлаганото изобретение мо-гат да бъдат използвани също за диагностициране ίη νίίτοна наличието на човешки интерферон тип Ι-ΙΓΝ - рецеп-тор или клетки. Повече подробности и допълнителни данни могат дасе видят от описанието на примерите и от фигурите. 17 ФИГУРИ 125 ФИГУРА 1 : свързване на белязани I моноклонал-ни антитела 34р10 и 64β12 към: - А : клетки на ОаисН - В : клетки Ьу28. г Накратко казано, 10° клетки се инкубират в продъл-д жение на 2 часа при температура 4°С в присъствието на различни количества белязани антитела, разредени в сре-да ΚΡΜΙ ,съдържаща 10% рсз (серум от телешки фетус).След това клетките се промиват в κρμι - 1 % рс5 и се преброяват за свързана радиоактивност. Неспецифично-то свързване е измерено чрез инкубация със стократно по-голямо количество студови антитела и се изважда от об-щата бройка. ФИГУРА 2 : нуклеотиди и съответствуващата аминоки-селинна верига на извънклетъчния домен на човешкия ΙΓΝ-Κ ** Моноклоналните антитела са създадени срещу ре- комбинантните разтворими форми на рецептора за човешкиинтерферон алфа-бета ( ΙΓΝ-Κ ), синтезирани в парака-риотни клетки (Е.соН)или в система от клетки на бозай-ник (Соз се11) .Тези разтворими форми са базирани наверигата на 0ΝΑ , описана на фигура 2. ФИГУРА 3 : нуклеотиди и съответствуващата амино-киселинна верига на човешкия ΙΓΝ-Κ. 18 ПРИМЕРИ ПРИМЕР 1: СИНТЕЗ НА РАЗТВОРИМИТЕ РЕЦЕПТОРИ СИНТЕЗ В Фрагмент от ДНК, съдържащ веригата, кодираща из-вънклетъчния домен (аминокиселини от 27 до 427) на чо-вешкия рецептор ΙΡΝ-Κ (фиг. 2), в който е въведен точ-но преди терминационния кодон допълнителна верига, коди-раща 5 хистадилни остатъци, бе клонирана във векторитена експресия рКК23. Този фрагмент бе получен чрез по-лимеразна верижна реакция (РСК)И получените плазмиди бя-ха подредени последователно, за да се потвърди както структурната инсерция с веригата 5Н1пе-0а1дагпо , та-ка и съответната нуклеотидна последователност, кодираща рецептора. Полихистидилната опашка, въведена в рекомбинант -ния протеин, дава възможност той да бъде пречистен бър-зо чрез афинитетна хроматография върху основа от нике-лов хелатид (колона ΝΤΑ ), както е описано в литература-та (НосНиН Е. е! а1., В1о/1есНпо1о§у, 1988, 1321-1325). Плазмидът бе въведен в щама на Е.соП ,ЦМ105, катосинтезата на протеина бе индуцирана чрез прибавянето наΙΡΨ2 към културата (рКК233-2, £ас рготоЬег). Протеините бяха извлечени от бактериалния пелет иразтворимият рецептор бе пречистен до хомогенност чрезафинитетна хроматография, както това е описано по-долу. 19 С помощта на тази процедура се получи протеин, койтомигрира във вид на 2 ивици около 50 кОа при условия на ре-дуциране и - във вид на 3 ивици при условия без редуциранеМаксималната концентрация на протеина,получен при различнипроцедури, бе средно 20 уп§/т1. Ν- краят на веригата на двата протеина, определенчрез електрофореза в гел, показва, че и двата протеина саочакваните фрагменти от рецептора. с СИНТЕЗ И ПРЕЧИСТВАНЕ НА НЕГЛЮКОЗИЛИРАНРАЗТВОРИМ РЕЦЕПТОР Бактериална култура (250 т1)

I

I Индукция с 1РТС 3 часа

I

I Клетъчен пелет 6П гуанидин хидрохлорид рН 8 Центрофугиране

I чЬг Колона ΝΤΑ промиване рН 8 урея ЗМ , рН 6,3 урея 8М ! рН 5,9 урея 8М Изплакване рН урея 8М

I

I Двойно разреждане, диализа спрямо Тг1 в 0 , 1 М рН 9 Диализа РВ5 20 Като използвахме същия РСК- подход, построихме и вектор на експресия, кодиращ аминокиселинната верига от1 до 427, с допълнителни 5 хистидилни остатъци в С-краяна веригата, включен във вектора на експресия рХМТ-3.Точната нуклеотидна последователност на инсерцираната ве-рига бе също потвърдена. Полученият плазмид бе въведен чрез електропора -ция в клетки Соз 7 за междинен израз и рекомбинантниятпротеин бе пречистен до хомогенност с помощта на афини-тетна хроматография, последвана от ионообменна хромато-графия на моно- ζ) (Фармация), както е описано по-долу. 21 ПРЕЧИСТВАНЕ НА РАЗТВОРИМ ΙΕΝ-Κ ОТ КЛЕТКИ СОЗ Подготвителна електропорация наклетките соз 1 18 часа

I Среда без серум

I Супернатанти, взети след48 часа, 72 часа, 96 часа

I

I Концентрация

I

ΝΤΑ -колонаI 1 промиване Изплакване №,1 М МаОАс рН 5,5

I | неутрализация Концентрация , 30 000 сряза

I Моно 0 (0-0,5 М ИаС1) От това пречистване се получава протеин 76 кОапри който аминокиселинната последователност на Ν-края на веригата на очакваната последователност на рецептори те с известна хетерогенност на челната верига. 22 ПРИМЕР 2: ПОЛУЧАВАНЕ НА МОНОКЛОНАЛНИ АНТИТЕЛА

СРЕЩУ РЕЦЕПТОРА НА ИНТЕРФЕРОН ТИП I 1) Изготвяне на моноклонални антитела Извършена е имунизация на мишки чрез инжектиране на рекомбинантен разтворим интерферон (г δΙΕΝ-Κ),пре-чистен от Е.соНили от супернатанти от културата наклетки Соз7.Първоначално мишките бяха инжектирани ин -траперитонеално и подкожно с пречистен протеин в в пъ-лен адювант на ЕгеипН. След това мишките бяха инжектира-ни веднъж седмично интраперитонеално с пречистени про-теини, измити в буфериран физиологичен разтвор. Всекипът бяха инжектирани по 10 /п§ от рекомбинантните проте-ини . След четвъртата инжекция бе взета кръв и в присъствие-то на специфичен серум антителата бяха изследвани и с ЕЪ15А,и с Цез^егп Ъ1о1спрямо рекомбинантния рецептор. Най-силнореагиралите животни бяха инжектирани допълнително с 10/П§антиген, едната половина от който интравенозно, а друга-та половина интраперитонеално. 2) Сливане на клетките Четири дни след инжектирането на последното коли-чество ударна доза бяха взети клетки от слезката на иму-низираното животно и слети с миеломни клетки N51(мишка) - 23 (,Ва1Ъо) НСРКТ по метода, описан от З.Еагеказ еЬ а1. (Л\ 1ттипо1. МеЬНоЗз 35: 1-32, 1980). Накратко казано, 7 7 5 х 10 клетки от слезка бяха слети с 30 х 10 миелом-ни клетки в 1т1 разтвор на полиетилен гликол и разпре-делени на 5 96-ямкови плочки върху хранителен слой отперитонеални макрофаги в среда НАТ (хипоксантин, амино-протеин и тимидин). Тази процедура бе повторена 4 пъ -ти, като от имунизираната мишка бяха получени 20 х 10?клетки от слезка. Скринингът за специфични хибридоми беизвършен след като в изследваните култури се образуваха големи колонии. За скрининга бе извършено изследване за наличиетона.специфични антитела посредством директен ЕЬ15А ме-тод: а) пластинки ЕЬ13А бяха държани в продължение наедна нощ при температура 4°С с намазка от пречистенирецептори 3ΙΕΝ-Κ ,получени от Е.соН или от клетки Созразредени в РВЗ. За откриването на неспецифично свързва-не бяха използвани пластинки, покрити с В5А; б) пластинките бяха наситени чрез инкубация с 3%ВЗА в РВЗ в продължгение на 1 час при температура 37°С в) пластинките бяха инкубирани в продължение на 4часа при стайна температура с хибридомни супернатанти,разредени 1 : 4 с РВЗ 0,05 г) свързаните антитела бяха установени чрез дву-етапна процедура, включваща първоначално инкубиране собработен с биотин антимиши имуноглобулин от коза, по- - 24 - следван от стрептавидин-пероксидазен комплекс (и дватаот АшегзЬаш и разредени 1/1000 в рвз-0,05% Тмееп 20). Позитивните антитела, секреТиращи хибридоми, бяхаразпределени върху 24 ямкови плочки върху хранителенпласт от клетки от слезка, като реактивността им бе про-верена отново както с ЕЪ15А ,така и с Уез1егп-Ъ1о1.

3) Идентифициране на реактивността към

рецептора за естествен интерферон тип I Реактивността на моноклоналните антитела (шАЬз) ,разпознаващи рекомбинантния 3ΙΓΝ-Κ , бе изследва -на спрямо рецептора за естествен интерферон клас I, по-лучен по повърхността на клетки на Оаидт с помощта намембранна имунофлуоресценция. Казано накратко, 5 х 10^клетки на Оаи<И бяха инкубирани в 100 ^П1 супернатантот култура от избрани хибридоми в продължение на 30 ми-нути при 4°С. След това клетките бяха промити 4 пъти в ΚΡΜΙ ,,съдържаща 1 7, ВЗА , като след това бяхаинкубирани с разреден Р1ТС , белязан антимиши серум откоза ГСаЪ/^в продължение на 30 минути при 4°С. Следпромиване клетките бяха анализирани с помощта на поточ-на цитометрия. Установи се, че едно от 35-те анализира-ни антитела, изработени срещу рекомбинантния Е.соН Ре_цептор, и 5 от 6-те изпитани антитела, изработени сре-щу рекомбинантния С05 рецептор, {Разпознават естестве-ния рецептор на клетките на Оаидх. След това бе извършено клониране на тези хибридо- 25 ми чрез пределно (лимитиращо) разреждане. Изотопът натези тАЬз бе определен с помощта на ЕЬ15А метод,използващ изотопно специфични антитела. Установено бе, че всичките 6 тАЬз са 1§С1 с леки капа-вериги. Прег лед на реактивността на тези 6 антитела е даден на

Таблица 1. Моноклоналните антитела бяха пречистени от супер-натанти на културата чрез хроматография с протеин С. Таблица 1 Реактивност на моноклоналните антителапротив ΙΓΝ-Κ Реактивност срещурекомбивантен рецептор Реактивност срещу х)клетъчен рецептор Е.СОН СО5 ΕΙΙ5Α иезсегп ΕΙΙ5Λ иесгегп имуносЬлуорисцен- ция 34П0 ♦ ♦ * ·♦· ♦ 64012 * + ♦ 63 Е 6 64 С 2640106508 • ♦ ♦ слаба ♦ х) измерена върху клетки на Раидт 26 ПРИМЕР 3 ИНХИБИРАНЕ НА СВЪРЗВАНЕТО НА ИНТЕРФЕРОНА КЪМ ЧОВЕШКИ КЛЕТЪЧНИ линии Инхибирането на свързването на интерферона към чо-вешки клетки бе изследвано по следния начин: 10θ клетки бяха предварително инкубирани в продъл-жение на 3.0 минути при температура 4°С с различни раз-твори от супернатанти на хибридомни култури или пре-чистени антитела ( тАЪз ), или само със среда . Към концентрация от 100 рМ и клетки, инкубиранидопълнително 2 часа при 4°С бе прибавен 1251-белязанΙΕΝ - алфа 8 или алфа 2. Тези процедури на инкубациябяха осъществени в среда ΚΡΜΙ ,съдържаща 20шМ НЕРЕЗрН 7,4 и 10% серум от телешки фетус (ЕС5). След товаклетките бяха промити 4 пъти с ΚΡΜΙ - 1£ ЕС5 и из-броени, за да се определи свързаната радиоактивност. Антитялото, секретирано от хибридомната линияЧ» 64С12 (обозначено по-долу като тАЬ 64С12 ) пока- за при изследването, че инхибира свързването на бе-лязания ΙΕΝ към клетките в зависимост от дозата. 50% инхибиране на свързването към клетки на ОаисН( ВигкИС НтрНота се11 Нпе; К1егп еб а1., СапсегКезеагсН, 28: 1300-1310, 1968) бе получено при концен-трация на тАЬ от 0,4 /гп§/т1. Същото инхибиране бе по-лучено с клетки К562 (СНгоптс туе1о§епоиз 1еикет1а^Εοζζίο апП Εοζζίο, Се11, 45: 321-334, 1975 ), но 50% - 27 - забавяне, беше получено и при 11 /П£/т1 за клетки/ (Рготуе1осу Ис 1еикет1а, СоШпз 5.С. еС а1., НаЬиге,270: 347-349, 1977) и 60 /П§/т1 за клетки Ъу28 (ΚΙείηС. е! а1. Ιηί. б. Сапсег, 10: 44-57, 1972). Таблица 2 Инхибиране на свързването на белязанΙΡΝ -алфа 2 към различни клетъчнилинии чрез тАВ 64С12 Клетъчна линия Концентрация на тАВ , която дава 50%инхибиране на свързването ι ОаисН К562 0,4 цд/т1 НЬбО 11 мд/т1 1>у28 бо цд/т1 Разликата в концентрацията на тАЪ , при която е получено 50% .инхибиране на свързването на ΙΡΝ , бе125 изследвана чрез директното свързване на I _ беляза-ни тА'Вз 64<;12 и 34р10 към едни и същи клетъчни линиианализ ЗсНаЬсНагб ρΐοϋ на резултатите. В обхвата наконцентрация от 0,1 до 1,5 /п§/ш1 бяха констатирани ви-соки стойности на афинитетно свързване на тАЪ 34Р10(ПОпМ) по всички клетъчни линии, докато силно афи- нитетно свързване на тАЪ 64С12 бе констатирано самокъм клетки на ОаисИ и към клетки К562 (Фиг. 1). ПРИМЕР 4

ИНХИБИРАНЕ НА ФУНКЦИИТЕ НА ИНТЕРФЕРОН ТИП I Инхибирането на функциите на интерферон тип I спомощта на пречистени тАЪ-64012 бе демонстрирано приантивирусното изследване на клетки на ОаисИ , като беизползван или рекомбинантен ΙΕΝ алфа 2, ΙΓΝ бета иΙΕΝ омега, или пречистен интерферон Цата1ма и левко-цитен интерферон, а също така и при един антипролифе-ративен анализ с рекомбинантен ΙΕΝ алфа 2. х) Антивирусна активност Бе направено антивирусно изследване на клетки наОаисИ » съгласно съществуващо описание (м. Бгоп апНМ.С. Тоуеу, Л. Сеп. \Нго1., 64: 2641-2647, 1983).Клет-ките (0,5 х 10 ) бяха инкубирани в продължение на 24часа в присъствието на интерферон и антитела. След това 10° клетки, поставени в 1 т1 , бяха инфектирани впродължение на 1 час при температура 37°С с вируса навезикуларния стоматит (νδν), измити три пъти, ресуспендирани в културна среда и инкубирани в продължение на18 часа при температура 37°С. След това клетките бяхализирани чрез замразяване/размразяване и бе измерена ре-пликацията на вируса чрез титриране на супернатантите λνο 93/20187 1/5 РСТ/ЕР93/00770 СйтЬрзаМо^антатдло (ρΜ) 10 - • ♦ ♦ В о 64(312• 34Р10

Концентрация на антитялото(пМ) ФИГУРА 1А Свързано антитяло (рМ) 80 60 40 20 0 « Ο 34РЮ ♦ 64(312 0 2 4 6 8 10 12 Концентрация на антитялото(пМ) ФИГУРА 1В зивзтлгитЕ знеет РСТ/ЕР93/00770 «*** ννΟ 93/20187 2 / 5 СТССАСССАТСТССОСССССТСССАС АТС АТС СТС СТС СТС СТС ССС ССС АСС АСС СТА СТС СТС СТС ССС СТС ССС ССА МеЪ МеЪ Уа1 Уа1 Ьеи Ьеи С1у А1а ТЬг ТЬг Ьеи ν·ι Ьеи Уа1 А1а Уа1 С1у Рго тсс СТС ТТС ТСС ССА ССС ССА ССТ ССА ААА ААТ СТА ААА ТСТ ССТ САА ААА СТА Тгр ν&ι Ьеи Зег А1а А1а А1а С1у С1у Ьув Авп Ьеи Ьув Зег Рго С1п Ьув Уа1 САС СТС САС АТС АТА САТ САС ААС ТТТ АТС СТС АСС ТСС ААС АСС АСС САТ САС С1и Уа1 Аер Х1е Х1е Авр Авр Авп РЬе Х1е Ьеи Агд Тгр Авп Агд Зег Авр С1и ТСТ СТС ссс ААТ СТС АСТ ТТТ ТСА ТТС САТ ТАТ САА ААА АСТ ССС АТС САТ ААТ Зег νβΐ С1у Авп Уа1 ТЬг РЬе Зег РЬе Авр Туг С1п Ьув ТЬг С1у Ме£ Авр Авп ТСС АТА ААА ТТС ТСТ ССС ТСТ САС ААТ АТТ АСТ АСТ АСС ААА ТСС ААС ТТТ ТСТ Тгр 11е Ьув Ьеи 5ег С1у Сув С1п Авп 11· ТЬг Зег ТЬг Ьув Сув Авп РЬе Зег ТСА СТС ААС СТС ААТ СТТ ТАТ САА САА АТТ ААА ТТС ССТ АТА АСА ССА САА ААА 5ег Ьеи Ьув Ьеи Авп Уа1 Туг С1и С1и 11е Ьув Ьеи Агд Х1е Агд А1а С1и Ьув САА ААС АСТ ТСТ ТСА ТСС ТАТ САС СТТ САС ТСА ТТТ АСА ССА ТТТ ССС ААА ССТ С1и АВП ТЬг Зег Зег Тгр Туг С1и Уа1 Авр Зег РЬе ТЬг Рго РЬе Агд Ьув А1а САС АТТ ССТ ССТ ССА САА СТА САТ ТТА САА ССТ САА САТ ААС ССА АТА СТС АТА С1п Не С1у Рго Рго С1и ν·ι Нхв Ьеи С1и А1а С1и Авр Ьув А1а Х1е Уа1 Х1е САС АТС ТСТ ССТ ССА АСА ААА САТ АСТ СТТ АТС ТСС ССТ ТТС САТ ССТ ТТА АСС Нхв 11е Зег Рго С1у ТЬг Ьув Авр 5ег Уа1 МеЬ Тгр А1а Ьеи Авр С1у Ьеи Зег ттт АСА ТАТ АСС ТТА СТТ АТС ТСС ААА ААС ТСТ ТСА ССТ СТА САА САА АСС АТТ РЬе ТЬг Туг Зег Ьеи Ьеи Х1е Тгр Ьув Авп Зег Зег С1у ν&ι С1и С1и Агд Х1е САА ААТ АТТ ТАТ ТСС АСА САТ ААА АТТ ТАТ ААА СТС ТСА ССА САС АСТ АСТ ТАТ С1и Авп 11· Туг 5ег Агд Нхв Ьув Х1е Туг Ьув Ьеи Зег Рго С1и ТЬг ТЬг Туг ТСТ СТА ААА СТТ ААА ССА ССА СТА СТТ АСС ТСА ТСС ААА АТТ ССТ СТС ТАТ АСТ Сув Ьеи Ьув Уа1 Ьув А1а А1а Ьеи Ьеи ТЬг Зег Тгр Ьув Не С1у Уа1 Туг Зег ССА СТА САТ ТСТ АТА ААС АСС АСА СТТ САА ААТ САА СТА ССТ ССА ССА САА ААТ Рго Уа1 Нхв Сув Х1е Ьув ТЬг ТЬг Уа1 С1и Авп С1и Ьеи Рго Рго Рго С1и Авп АТА САА СТС АСТ СТС САА ААТ САС ААС ТАТ СТТ СТТ ААА ТСС САТ ТАТ АСА ТАТ Не С1и Уа1 Зег ν·ι С1п Авп С1п Авп Туг Уа1 Ьеи Ьув Тгр Авр Туг ТЬг Туг ССА ААС АТС АСС ТТТ САА СТТ САС ТСС СТС САС ССС ТТТ ТТА ААА АСС ААТ ССТ А1а Авп МеГ ТЬг РЬе С1п Уа1 С1п Тгр Ьеи Н1в А1а РЬе Ьеи Ьув Агд Авп Рго ССА ААС САТ ТТС ТАТ ААА ТСС ААА САА АТА ССТ САС ТСТ САА ААТ СТС ААА АСТ С1у Авп Нхв Ьеи Туг Ьув Тгр Ьу· С1п Х1е Рго Авр Сув С1и Авп ν·ι Ьув ТЬг АСС САС ТСТ СТС ТТТ ССТ САА ААС СТТ ТТС САА ААА ССА АТТ ТАС СТТ СТС ССС ТЬг С1п Сув Уа1 РЬе Рго С1п Авп Уа1 РЬе С1п Ьув С1у 11е Туг Ьеи Ьеи Агд СТА САА ССА ТСТ САТ ССА ААТ ААС АСА ТСТ ттт тсс ТСТ САА САС АТА ААС ТТТ Уа1 С1п А1а Зег Аер С1у Авп Авп ТЬг Зег РЬе тгр зег С1и С1и Х1е Ьув РЬе САТ АСТ САА АТА САА ССТ ТТС СТА СТТ ССТ ССА СТС ттт ААС АТТ АСА ТСС СТТ Авр ТЬг С1и Х1е С1п А1а РЬе Ьеи Ьеи Рго Рго Уа1 РЬе Авп Х1е Агд Зег Ьеи ФИГУРА 2А зивзт!титЕ знеет 3/5 РСТ/ЕР93/00770 ννο 93/20187 АСТ САТ ТСА ттс САТ АТС ТАТ Зег Авр Зег РЬе Нхв 11е Туг СТС АТС САС САТ ТАТ ССА СТС ν&1 Не С1п Авр Туг Рго Ьеи ААТ ССТ САС АСА ААА АТТ АТС Авп А1а С1и Агд Ьув Х1е Х1е ААА ССА СТС АСТ СТА ТАТ ТСТ Ьув Рго Ьеи ТЬг ν»ι Туг Сув СТС ААТ ААА АСС АСТ стт ттт Ьеи Авп Ьув Зег Зег Уа1 РЬе ААТ Асс ТСТ ААА ТСА ССТ АСС Авп ТЬг Зег Ьув АТС ССТ ССТ ССА ААА САС ТСТ ССА ААС АСС ССТ 11е С1у А1а Рго Ьув С1п Зег С1у АВП ТЬг Рго АТТ ТАТ САА АТТ АТТ ТТТ тсс САА ААС АСТ ТСА Х1е Туг С1и Х1е Х1е РЬе Тгр СХи Авп ТЬг Зег САС ААА ААА АСТ САТ СТТ АСА СТТ ССТ ААТ ТТС С1и Ьув Ьув ТЬг Авр Уа1 ТЬг Уа1 Рго Авп Ьеи СТС ААА ссс АСА ССА САС АСС АТС САТ САА ААС ν<1 Ьув А1а Агд А1а Н1в ТЬг МеЬ Авр С1и Ьув АСТ САС ССТ СТА ТСТ САС ААА АСА ААА ССА ССА Зег Авр А1а Уа1 Сув С1и Ьув ТЬГ Ьув Рго С1у ФИГУРА 2Β зивзтггитЕ знеет РСТ/ЕР93/00770 \Υ0 93/20187 4/5 СТССАСССЛТСТСС^ЗССССТССПЧС АТС АТС СТС СТС СТС СТС ССС ССС АСС АСС СТА СТС СТС СТС ССС СТС ССС ССА Ней Ней УаХ УаХ Ьеи Ьеи СХу АХа ТЬг ТЬГ Ьеи УаХ Ьеи УаХ АХа УаХ СХу Рго тсс СТС ТТС тсс ССА ССС ССА ССТ ССА ААА ААТ СТА ААА ТСТ ССТ САА ААА СТА Тгр УаХ Ьеи Бег АХа АХа АХа СХу СХу Ьув Авп Ьеи Ьув Зег Рго СХп Ьув УаХ САС Ьтс САС АТС АТА САТ САС ААС ТТТ АТС СТС АСС ТСС ААС АСС АСС САТ САС СХи УаХ Авр ХХе 1Хе Авр Авр Авп РЬе ХХе Ьеи Агд Тгр Авп Агд Зег Авр СХи ТСТ СТС ССС ААТ СТС АСТ ТТТ ТСА ТТС САТ ТАТ САА ААА АСТ ССС АТС САТ ААТ Зег УаХ СХу Авп УаХ ТЬг РЬе Зег РЬе Авр Туг СХп Ьув ТЬг СХу Ней Авр Авп ТСС АТА ААА ТТС ТСТ ССС ТСТ САС ААТ АТТ АСТ АСТ АСС ААА ТСС ААС ТТТ ТСТ Тгр Х1е Ьув Ьеи Зег СХу Сув СХп Авп ХХе ТЬг Зег ТЬг Ьув Сув Авп РЬе Зег ТСА СТС ААС СТС ААТ СТТ ТАТ САА САА АТТ ААА ТТС ССТ АТА АСА ССА САА ААА Бег Ьеи Ьув Ьеи Авп УаХ Туг СХи СХи ХХе Ьув Ьеи Агд ХХе Агд АХа СХи ьув САА ААС АСТ ТСТ ТСА ТСС ТАТ САС СТТ САС ТСА ТТТ АСА ССА ТТТ ССС ААА ССТ СХи Авп ТЬг Зег Зег Тгр Туг СХи УаХ Авр Зег РЬе ТЬг Рго РЬе Агд Ьув АХа САС АТТ ССТ ССТ ССА САА СТА САТ ТТА САА ССТ САА САТ ААС ССА АТА СТС АТА С1п ХХе СХу Рго Рго СХи УаХ Н1в Ьеи СХи АХа СХи Авр Ьув АХа ХХе УаХ ХХе САС АТС ТСТ ССТ ССА АСА ААА САТ АСТ СТТ АТС ТСС ССТ ТТС САТ ССТ ТТА АСС Нхв 11е Зег РГО СХу ТЬг Ьув Авр Зег Уа1 Кей Тгр АХа Ьеи Авр СХу Ьеи Зег ттт АСА ТАТ АСС ТТА СТТ АТС ТСС ААА ААС ТСТ ТСА ССТ СТА САА САА АСС АТТ РЬе ТЬг Туг Зег Ьеи Ьеи ХХе Тгр Ьув Авп Зег Зег СХу УаХ СХи СХи Агд ХХе САА ААТ АТТ ТАТ ТСС АСА САТ ААА АТТ ТАТ ААА СТС ТСА ССА САС АСТ АСТ ТАТ СХи Авп ХХе Туг Зег Агд Нхв Ьув ХХе Туг Ьув Ьеи Зег Рго СХи ТЬГ ТЬг Туг ТСТ СТА ААА стт ААА ССА ССА СТА СТТ АСС ТСА ТСС ААА АТТ ССТ СТС ТАТ АСТ Сув Ьеи Ьув УаХ Ьув АХа АХа Ьеи Ьеи ТЬГ Зег Тгр Ьув ХХе СХу УаХ Туг Зег ССА СТА САТ ТСТ АТА ААС АСС АСА СТТ САА ААТ САА СТА ССТ ССА ССА САА ААТ Рго УаХ НХв Сув Х1е Ьув ТЬг ТЬг ν&χ СХи Авп СХи Ьеи Рго Рго РГО СХи Авп АТА САА СТС АСТ СТС САА ААТ САС ААС ТАТ СТТ СТТ ААА ТСС САТ ТАТ АСА ТАТ Не СХи УаХ Зег УаХ СХп Авп СХп Авп Туг УаХ Ьеи Ьув Тгр Авр Туг ТЬг Туг ССА ААС АТС АСС ТТТ САА СТТ САС ТСС СТС САС ССС ТТТ ТТА ААА АСС ААТ ССТ АХа Авп Ней тьг РЬе СХп УаХ СХп Тгр Ьеи Н1в АХа РЬе Ьеи Ьув Агд Авп Рго ССА ААС САТ ТТС ТАТ ААА ТСС ААА САА АТА ССТ САС ТСТ САА ААТ СТС ААА АСТ СХу Авп Нхв Ьеи Туг Ьув Тгр Ьув СХп ХХе Рго Авр Сув СХи Авп УаХ Ьув ТЬг АСС САС ТСТ СТС ТТТ ССТ САА ААС СТТ ТТС САА ААА ССА АТТ ТАС СТТ СТС ССС ТЬг СХп Сув УаХ РЬе Рго СХп Авп УаХ РЬе СХп Ьув СХу ХХе Туг Ьеи Ьеи Агд СТА САА ССА ТСТ САТ ССА ААТ ААС АСА ТСТ ТТТ тсс ТСТ САА САС АТА ААС ТТТ УаХ СХп АХа 5ег Авр СХу Авп Авп тьг Зег РЬе Тгр Зег СХи СХи ХХе Ьув РЬе САТ АСТ САА АТА САА ССТ ТТС СТА стт ССТ ССА СТС ттт ААС АТТ АСА ТСС СТТ Авр ТЬг СХи 1Хе СХП АХа РЬе Ьеи Ьеи Рго Рго УаХ РЬе Авп 1Хе Агд Зег Ьеи ФИГУРА ЗА Я1 ΙΡΑΤΙΤυΤΕ 8НЕЕТ 5/5 РСГ/ЕР93/00770 ννο 93/20187 АСТ САТ ТСА ТТС САТ АТС ТАТ АТС ССТ ССТ ССА ААА САС тг*»» ССА ААС АСС ССТ Зег Авр Зег РЬе НХ8 Не Туг Не С1у А1а Рго ьу· С1п Зег С1у Авп ТЬг Рго СТО АТС САС САТ ТАТ ССА СТС АТТ ТАТ САА АТТ АТТ ТТТ ТСС САА ААС АСТ ТСА Уа1 Не С1п Авр Туг Рго Ьеи Не Туг С1и Не Не РЬе Тгр С1и Авп ТЬг Зег ААТ ССТ САС АСА ААА АТТ АТС САС ААА ААА АСТ САТ СТТ АСА СТТ ССТ ААТ ТТС Авп А1а С1и Агд Ьув Не Не С1и Ьув Ьув ТЬг Авр Уа1 ТЬг Уа1 Рго Авп Ьеи ААА ССА СТС АСТ СТА ТАТ ТСТ СТС ААА ССС АСА ССА САС АСС АТС САТ САА ААС Ьув Рго Ьеи ТЬг Уа1 Туг Сув Уа1 Ьув А1а Агд А1а Ηίβ ТЬг МеЬ Авр С1и Ьув СТС ААТ ААА АСС АСТ СТТ ТТТ АСТ САС ССТ СТА ТСТ САС ААА АСА ААА ССА ССА Ьеи Авп Ьув Зег Зег Уа1 РЬе Зег Авр А1а Уа1 Сув С1и ьув ТЬг Ьув Рго С1у ААТ АСС ТСТ ААА АТТ ТСС СТТ АТА СТТ ССА АТТ ТСТ АТТ ССА ТТА ТТТ ССТ СТС Авп ТЬг зег Ьув Не Тгр Ьеи Не Уа1 С1у Не Сув Не А1а Ьеи РЬе А1а Ьеи ССС ТТТ СТС АТТ ТАТ ССТ ССС ААА СТС ТТС ТТС АСА ТСС АТС ААТ ТАТ СТС ТТС Рго РЬе Уа1 Не Туг А1а А1а Ьув Уа1 РЬе Ьеи Агд Сув Не Авп Туг Уа1 РЬе ттт ССА ТСА СТТ ААА ССТ ТСТ ТСС АСТ АТА САТ САС ТАТ ТТС ТСТ САА САС ССА РЬе Рго Зег Ьеи Ьув Рго Зег Зег Зег Не Авр С1и Туг РЬе Зег С1и С1п Рго ттс ААС ААТ СТТ СТС СТТ ТСА АСТ ТСТ САС САА САА АТС САА ААА ТСТ ТТС АТА Ьеи Ьув Авп Ьеи Ьеи Ьеи Зег ТЬг Зег С1и С1и С1п Не С1и Ьув Сув РЬе Не АТТ САА ААТ АТА АСС АСА АТТ ССТ АСА СТА САА САА АСТ ААТ САА АСТ САТ САА Не С1и Авп Не Зег ТЬг Не А1а ТЬг Уа1 С1и С1и ТЬг Авп СХп ТЬг Авр С1и САТ САТ ААА ААА ТАС АСТ ТСС САА АСТ АСС САА САТ ТСА ССА ААТ ТАТ ТСТ ААТ Авр Нхв Ьув Ьув Туг Зег Зег С1п ТЬг Зег С1п Авр Зег С1у Авп Туг Зег Авп САА САТ САА АСС САА АСТ ААА АСА АСТ САА САА СТА САС САС САС ТТТ СТА ТСА С1и Авр С1и Зег С1и Зег Ьув ТЬг Зег С1и С1и Ьеи С1п С1п Авр РЬе Уа1 ССАСАААТСААСТСТСТСААСТАТААССТТТТТСАССАССАСТТАСАСТССТАСС с.пгурл зв дивзтггитЕ знеет

Claims

ПАТЕНТНИ ПР Е Т Е Н Ц И И

1. Моноклонално антитяло, насочено срещу рецепто-ра за човешки интерферон тип I (ΙΡΝ-Κ),характеризиращосе със следните свойства: - разпознава извънклетъчния домен на човешкия ΙΡΝ-Κ, - има неутрализираща способност по отношение набиологичните свойства на човешкия интерферон тип Ι-ΙΕΝ.
2. Моноклонално антитяло, насочено срещу рецепто-ра за човешки интерферон тип I - ΙΡΝ-Κ,съгласно претенция 1,характеризиращо се със способността си да инхибира свърз-ването на патологичен човешки интерферон тип Ι-ιρν към ΙΓΝ-Κ.
3. Моноклонално антитяло съгласно претенции 1 или2, което може да се получи от дадена хибридомна клетка, получена чрез сливането на миеломна клетка с клетки от слезка на животно, имунизирано предварително с разтвори-ма форма на човешки ιρν-Κ.
4. Моноклонално антитяло съгласноции 1, 2 или 3, характеризиращо се с тоепитоп върху някоя разтворима форма начен ιρν-Κ или на някакъв рекомбинантен една от претен- ва, че разпознава човешкия клетъ - ΙΡΝ-Κ.
5. Моноклонално антитяло съгласно една от претен-ции 1 до 4, характеризиращо се с това, че инхибира £пνΐϋΓΟ свързването на човешки интерферон Ι-ΙΡΝ към чо-вешкия клетъчен ΙΝΓ-Κ > след като бъде инкубирано съв- при кон -20 /п§/т1, До 2 /П§/т1 местно с клетки, притежаващи човешки ΙΓΝ-Κ , центрация на антителата равна или по-малка от за предпочитане в обхвата от приблизително 0,5
6. Моноклонално антитяло съгласно една от претен-ции 1 до 5, характеризиращо се с това, че неутрализираίη νϊίΓΟ антипролиферативната активност на човешкияΙ-ΙΓΝ върху клетки, силно чувствителни към този човеш-ки Ι-ΙΡΝ , например клетки на ОаисН , в концентрация отпорядъка на 1 до 10 /п§/т1.
7. Моноклонално антитяло съгласно една от претен-ции 1 до 6, характеризиращо се с това, че неутрализи-ра ίη νίίΓΟ антипролиферативната активност на човешкиΙ-ΙΓΗ върху клетки, слабочувствителни към човешки ин-терферон Ι-ΙΓΝ, например клетки Ьу28 , в концентрацияот порядъка на 50 до 100 /п§/т1.
8. Моноклонално антитяло съгласно една от претен -ции 1 до 7, характеризиращо се с това, че не се свързвакъм човешкия рецептор за ΙΡΝ- гама.
9. Моноклонално антитялоции 1 до 8, характеризиращо се ден епитоп от аминокиселинната човешкия ΙΝΡ-Κ. съгласно една от претен- с това, че разпознава да- верига от 27 до 427 на
10. Моноклонално антитяло съгласно една от претен-ции 1 до 9, характеризиращо се с това, че неутрализираίη νίίΓΟ антивирусната активност на човешки Ι-ΙΡΝ вър- ху клетки, силно чувствителни към този човешки Ι-ΙΓΝ ,например клетки на ОаисИ ,в концентрация от порядъка от1 до 10 /П§/т1.
11. Моноклонално антитяло съгласно една от претен-ции 1 до 10, характеризиращо се с това, че неутрализираίη νΐίΓο антивирусната активност на човешкия Ι-ΙΝΓвърху клетки, слабо чувствителни към този човешки Ι-ΙΝΓ,например клетки Ьу28 ,в концентрация от порядъка на 50 *** до 100 /П£/т1.
12. Моноклонално антитяло съгласно една от претен- ции 1 до 11, характеризиращо се с това, че представляваантитяло 64С12 , представено пред ЕСАСС на 26 фев - руари 1992 г. под № 92022605.7
13. Моноклонално антитяло съгласно една от претен-ции 1 до 11, характеризиращо се с това, че представлявахуманизирано антитяло, характеризиращо се например с то-ва, че променливи или комплементарно детерминирани зони Чет от неговите тежки и леки вериги са присадени върху рам- ката и константните зони на дадено човешко антитяло.
14. Моноклонално антитяло съгласно една от претен-ции 1 до 11, характеризиращо се с това, че представлява човешко антитяло.
15. Моноклонално антитяло съгласно една от претен-ции 1 до 11, характеризиращо се с това, че е антитяло оттипа 1§С1.

- ь -
16. Хибридомна клетка, характеризираща се с това, че произвежда моноклонални антитела съгласно претенции 1 до 13.
17. Препарат, притежаващ антагонистични свойствапо отношение на Ι-ΙΓΗ , характеризиращ се с това, че сместа съдържа моноклонални антитела съгласно една от претенции 1 до 16.
18. Фармацевтичен препарат, характеризиращ се стова, че съдържа моноклонални антитела съгласно една отпретенции 1 до 17, заедно с някакъв подходящ фармацевти чен вихикулум.
19. Използване на моноклонални антитела съгласноедна от претенции 1 до 17 за получаването на лекарствоза лечение или профилактика на патологично състояние,свързано с пролиферативна активност на клетките и/илис вирусна клетъчна инфекция.
20. Процедура за селекция на моноклонално анти -тяло, притежаващо свойството да разпознава извънклетъч-ния домен на човешкия ΙΓΝ-Κ и способно да инхибирасвързването на човешкия интерферон тип Ι-ΙΓΝ към ΙΓΝ-Κкоято процедура се характеризира със следните стъпки: - предварително инкубиране на определена концен-трация на пречистени моноклетъчни антитела съгласно ед-на от претенции 1 до 15 или на някакъв супернатант нахибридомна култура, съдържащ моноклонални антитела, с човешки клетки, способни да притежават ΙΡΝ-Κ; - прибавяне на белязан човешки интерферон ι-ιρν в определена концентрация към посочената по-горе предва - рително инкубирана среда; - инкубиране на среда, съдържаща човешки клетки ,моноклонални антитела и белязан интерферон Ι-ΙΡΝ за време достатъчно да позволи установяването на равнове - сие между моноклоналните антитела, от една страна, иинтерферон Ι-ΙΝΡ , от друга страна, с клетъчния ΙΡΝ-Κ; - промиване на клетките; - определяне на образуването на свързващ комплексмежду човешките клетки и интерферон 1-1МРчрез преброя-ване на количеството на свързания белязан интерферонтип I.
21. Процедура за селекция на моноклонално антитя-ло, притежаващо свойството да разпознава извънклетъчниядомен на човешкия рецептор за интерферон ΙΝΓ-Κ и спо-собно да неутрализира антипролиферативната активностна Ι-ΙΝΓ върху човешки клетки, която процедура се харак-теризира със следните стъпки: - инкубиране на клетки с Ι-ΙΝΡ и моноклонални ан- титела съгласно една от претенции 1 до 15, в определениконцентрации, за време, достатъчно да позволи образува-нето на свързващ комплекс между моноклоналните антителаи ΙΝΓ-Κ на човешки клетки и/или между интерферон Ι-ΙΝΓ и ΙΝΓ-Κ на човешки клетки; - инфектиране на посочените по-горе инкубирани клетки с определена концентрация от даден вирус; - промиване на клетките; - ресуспендиране на клетките в културна среда; - инкубиране в продължение на време, достатъчно да позволи репликацията на вируса; - лизиране на клетките; - измерване на репликацията на вируса или измер ване на инхибирането на цитопатичния ефект.