JPH07505526A - Ｉ型インターフェロンに対する中和活性を有するインターフェロン受容体に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ー　付着標識化１１ＦＮの量を計数することによりヒト細胞とＩ型ＩＦＮとの間 の結合複合体の生成を確定する工程を特徴とする方法。

２１、ヒト　ＩＦＮ−Ｒの細胞外ドメインを認識する能力を有し、そしてヒト細 胞における■型ＩＦＮの抗増殖活性に対する中和能力を有するモノクローナル抗 体の選択方法であって、以下のニー　ヒトＩＦＮの存在下で、且つ確定濃度の請 求項１〜１５のいずれかに記載のモノクローナル抗体の存在下で細胞を増殖させ ；−Ｉ型ＪＰＮの抗増殖作用の阻止を検出するために細胞を計数する 工程を特徴とする方法。

２２、ヒト　ＩＦＮ−Ｒの細胞外ドメインを認識する能力を有し、そしてヒト細 胞における天然の、非病懇性又は病態性のＩ型ｒＦＮの抗ウィルス活性に対する 中和能力を有するモノクローナル抗体の選択方法であって、以下のニ ー　Ｉ型ＩＦＮ及び請求項１〜１５のいずれかに記載のモノクローナル抗体を確 定濃度で用いてモノクローナル抗体とヒト細胞のＩＰＮ−Ｒとの間、及び／又は Ｉ型ＩＦＮとヒト細胞のＩＦＮ−Ｒとの間に複合体を生成させるのに十分な時間 インキュベートシ：−上記インキュベート細胞を確定濃度のウィルスに感染させ ニー　細胞を洗浄し； −細胞を培地中に再懸濁し； −ウィルスを複製させるのに十分な時間インキュベートシ：−細胞を溶解し； −ウィルス複製を測定するか又は細胞変性作用の阻止を測定する 工程を特徴とする特許 明細書 Ｉ型インターフェロンに対する中和活性を有するインターフェロン受容体に対す るモノクローナル抗体 発明の詳細な説明 インターフェロン（ＩＦＮ）は広範な生物学的活性を示し、を椎動物細胞中に抗 ウイルス状態を誘発するその能力を特徴とする分泌蛋白質の一群を構成する（１ ．　Ｇｒｅｓｓｅｒ　ａｎｄ　Ｍ、Ｇ、　Ｔｏｖｅｙ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｅｔａ　５１６　：　２３１．１９’７８）。［ＦＮには ３種類の抗原性種がある：即ちアルファ（α）、ベータ（β）及びガンマである 。ＩＦＮα及びＩＦＮβはともにＩ型インターフェロンとして公知である。

天然Ｉ型ヒトインターフェロンは、高度の構造的相同性を有する別個の遺伝子に よりコードされる１２又はそれ以上の非常に関連した蛋白質から成る（Ｗｅｉｓ ｓｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｗｅｂｅｒ、　Ｐｒｏｇ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒ ｅｓ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、３３　：　２５１．１９８６）。

ヒトＩＰＮα遺伝子座は２つの亜科から成る。第一の亜科は、１４個の非対立遺 伝子と４個の偽遺伝子から成り、少なくとも８０％の相同性を有する。第二の亜 科、即ちαＩ！又はオメガ（ω）は、５個の偽遺伝子及び１個の機能遺伝子を含 有し、　ＩＦＮα遺伝子との７０％の相同性を示す（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ　ａｎ ｄ　Ｗｅｂｅｒ、　１９８６）。

ＩＦＮαのサブタイプは異なる特異的活性を有するが、しかしそれらは同一の生 物学的範囲を有しく５ｔｒｅｕｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、ＰＮＡｓ−ＵＳＡ　７８　 ：　２８４８゜１９８１）、同一細胞受容体を有する（Ａｇｎｅｔ　Ｍ、　ｅｔ 　ａｌ、、　ｉｎ″Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ５”　Ｅｄ、　１．　Ｇｒｅｓｓｅｒ 　Ｐ、１−２２．　Ａｃａｄｉｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ　１９８３ ）。

インターフェロンβ（ＩＦＮβ）は、　ＩＦＮα遺伝子と約５０％の相同を有す る。

インターフェロンαサブタイプ及びインターフェロンβは、細胞表面の同一受容 体と結合する。

インターフェロンγ（ＩＦＮγ）も単一コピーによりコードされ、ＩＦＮα及び ＩＰＮβの遺伝子とほとんど相同でない。ＩＦＮγに対する受容体はα及びβイ ンターフェロンとは異なっている。

本発明のために、　［ＦＮのα及びβ種の受容体をＩＰＮ−Ｒと呼ぶ。これは天 然Ｉ型受容体に相当する。天然インターフェロンαを構成する蛋白質群をＩＦＮ αと呼び、Ｉ型ＩＦＮは天然ＩＦＮα、　ＩＦＮω及びＩＦＮβに相当する。

インターフェロンが有効な抗ウィルス剤であるという事実にもかかわらず、上気 道感染のような急性ウィルス疾患の多数の特徴的症状はインターフェロンアルフ ァの過剰産生によって引き起こされることを示唆するかなりの証拠がある。さら に、　ＩＦＮアルファは実験動物におけるある種の慢性ウィルス感染の病因に関 与することが示されており、有用な証拠は、これを麻疹ウィルスによるもののよ うなある種のヒト慢性ウィルス疾患に関する症例であることを示唆する。

インターフェロンαはさらにポリクローナルＢ細胞活性科を刺激し、ＮＫ細胞細 胞毒性を増強し、Ｔ細胞機能を阻害し、そして多数の組織適合性複合体（ＭＨＣ ）　１型抗原の発現を調節する有力な免疫調節分子であり、これらはすべて、自 己免疫の誘発及び移植片拒否反応に関係する。インターフェロンαの異常産生は 、多数の自己免疫疾患及び炎症性疾患を伴い、その例としては全身性エリテマト ーデス（ＳＬＥ）、■型糖尿病、乾癖、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、ベー チェット病、再生不良性貧血、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び重傷複合 型免疫不全が挙げられる。全身性エリテマトーデス患者の血清中のインターフェ ロンαの存在は、疾患活性増大の臨床的及び体液性徴候の両方に相関する。ＨＩ Ｖウィルス陽性被験者におけるイ：７ターフェロンαの産生は疾患進展をも高度 に予測する。

インターフェロンαの投与は、乾癖及び多発性硬化症患者における枦本的疾患を 悪化させ、自己免疫疾患の既往症のない患者１：　ＳＬＥ様症状を誘発すること が報告されている。インターフェロンαはさらに正常マウスに糸球体腎炎を誘発 し、ＮＺＢ／Ｗマウスの特発性自己免疫疾患の発症を促進することも示されてい る。

イ：、・クーフェロ゛／αはまた、全身性秒植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の特徴 であるＮＫ細胞活性増強と平行してＧＶＤＨの経過中に産生される。

、インターフェロンαはＮＫ細胞細胞毒性の主要モジ】レータ−であって、イン ターフェロンαの投与は正常マウスのＧＶＤＨの小腸で生じる結果を増強するこ とが示されている。

本発明の目的は、ヒ）−Ｔ型ＩＦＮの生物学的活性に対する新規の拮抗薬を提供 することである。これらの拮抗薬は、Ｉ型ＩＦＮ　（ＩＦＮα／β）が異常に産 生され、この異常産生が病的症状を伴う場合の予防を含めた治療目的に用い得る 。このような拮抗薬は種々の疾患の診断に、あるいはこのような疾患の進展の研 究に用いることもできる。

このような拮抗薬を定義するために、本発明人は、ヒト天然夏型ＩＦＮが実際イ ンターフェロン（亜種）の混合物で構成され、そして異なるサブタイプのインタ ーフェロンのこの集まりの組成が量質ともに変化するという事実を考慮した。

Ｎａｍａ１ｗａ細胞から分泌されるもの（Ｎａｍａ１ｗａインターフェロン）又 は白血球から分泌されるもの（白血球インターフェロン）といったようないくつ かの天然インターフェロンは詳細に研究されており（Ｎ、Ｂ、　Ｆｉｎｔｅｒ　 ａｎｄ　Ｋ、）（、Ｆａｕｔｅｓ、　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　２．１９８０．　 Ｐ、６５−７９１゜Ｇｒｅｓｓｅｒ　Ｅｄｉｔｏｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ　；　Ｋ、　Ｃａｎｔｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｌ、 　１９７９　ｐ、２−２５．１．　Ｇｒｅｓｓｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ）、天然Ｉ壓インターフェロンを定義するために本発明人が用いた。

ＡＩＤＳのようないくつかの症例において、何らかの特定の特性を有するインタ ーフェロンが記載されている（０．Ｔ、　Ｐｒｅｂｌｅ　ｅｔ　ａｌ、。

Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃ ｅ　ｐ、６５−７５）。このインターフェロンはＡＩＤＳのような症例に関与す るが、にもかかわらず上−記と同様の受容体と結合する。

本発明の一目的はヒ）−Ｉ型ＩＦＮの生物学的特性を確定程度まで阻止又は中和 し得る、言い換えればα、β、ω亜種の混合物をｉｎ　ｖｉν０で中和し得るＩ 型ＩＦＮの拮抗薬を提供することである。

したがって、本発明人はＩ型［ＦＮに対する拮抗薬の有する特性を有する抗体、 特にモノクローナル抗体を明確にした。これらの抗体はヒト１型ＩＦＮ受容体に 対するものである。

本発明はしたがって■型ＩＦＮの異常産生に伴う症状の治療に有用な製剤組成物 の調製のためのモノクローナル抗体の使用に関する。

これらのモノクローナル抗体は診断試薬の調製にも適している。

本発明のモノクローナル抗体はヒト■型インターフェロン受容体（ＩＦＮ−Ｒ） に対するものであり、以下の：・−ヒトＩＦＮ−Ｒの細胞外ドメインを認識し、 −ヒト１型ＩＦＮの生物学的特性に対する中和能力を有するという特性を特徴と する。

■型ＩＦＮの生物学的特性を中和する能力は、Ｉ型ＩＦＮの抗ウィルス活性を中 和するモノクローナル抗体の能力の関数として概算し得る。このような試験は、 検定される抗体が本発明の範囲内に含まれるか否かを確定するためには意味があ るが、しかし■型ＩＦＮの生物学的特性がその抗ウイルス特性に限定されるわけ ではないことは明らかである。抗ウィルス活性についてのこのような試験を実施 できるようにするために、詳細な手順を実施例に示す。試験する細胞は有益には 、■型ＩＦＮに対する親和性が十分公知のＤａｕｄｉ細胞である。

このような試験の主要工程は以下のニ ー　確定濃度のヒト１型ＩＦＮに反応するヒト細胞を、検定される確定濃度のモ ノクローナル抗体の存在下でヒト１型ＩＦＮを用いて、モノクローナル抗体とヒ ト細胞のＩＦＮ−Ｒとの間、及び／又は■型ＩＦＮとヒト細胞のＩＦＮ−Ｒとの 間に複合体を生成させるのに十分な時間インキュベートシ； −　インキュベート化細胞を確定濃度の確定ウィルスに感染させ；−細胞を洗浄 し； −細胞を培地中に再懸濁し； −ウィルスを複製させるのに十分な時間インキュベートしミー　細胞を溶解し； −ウィルス複製を測定するか又は細胞変性作用の阻止を測定する 工程から成る。

ヒト１型ＩＦＮの生物学的特性を中和する本発明のモノクローナル抗体の能力は 、使用する抗体容量の関数として調節し得る。したがって、生物学的特性の１０ ０％阻害又は部分阻害が得られる。

本発明の別の態様によれば、ヒト１型ＩＦＮ受容体に対するモノクローナル抗体 はさらに、それらがヒト１型ＩＦＮのヒト　［ＦＮ−Ｒとの結合を阻止し得ると いう事実を特徴とする。

ヒト　ＩＦＮ−Ｒの細胞外ドメインを認識する能力を有する、そしてヒト１型Ｉ ＦＮのその受容体との結合を阻止し得るモノクローナル抗体は、以下のニ ー　ＩＦＮ−Ｒを保育できるヒトを用いて確定濃度の精製モノクローナル抗体又 は検定されるモノクローナル抗体を含有する）１イプリドーマ培養上清を予イン キュベートシ： −標識化ヒト１型ＩＦＮを確定濃度で上記予インキュベーション中培地に加え； 一ヒト細胞、モノクローナル抗体及び標識化Ｉ型［ＰＮを含有する培地を細胞性 ＩＰＮ−Ｒを用いて一方ではモノクローナル抗体と他方では■型ＩＦＮとの間に 平衡を生じさせるのに十分な時間インキュベートしニ ー　細胞を洗浄し； −付着標識化■型ＩＦＮの量を計数することによりヒト細胞と標識化■型ＩＦＮ との間の結合複合体の生成を確定する工程により選択し得る。

本発明のいくつかのモノクローナル抗体は、ヒト１型ＩＦＮの抗増殖特性を中和 する能力をも有する。この特性は、Ｄａｕｄ　ｉ細胞で以下のニ ー　ヒトＩＦＨの存在下で、且つ確定濃度のｍＡＢの存在下で細胞を増殖させニ ー　ヒトｌｆｆ１ｒＦＮの抗増殖作用の阻止を検出するために細胞を計数する 工程を実行することにより検定し得る。

本発明のモノクローナル抗体の一特性は、ヒトＩＦＮ受容体の細胞外ドメインを 認識するその能力にある。モノクローナル抗体のこの特性は天然ヒト受容体を保 有するヒト細胞で検定し得るが、しかし原核細胞、例えば大腸菌で発現されるよ うな組換え体ＩＦＮ−Ｒ又は哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞のような真核細胞で 発現されるような組換え体１ＦＮ−Ｒの細胞外ドメインでも検定し得る。

この受容体は実際、それが原核又は真核細胞中に産生されるという事実によって 、したがって翻訳後成熟が起きるか又は起きないという事実によって異なる特性 を示し得る。本発明人はおもしろいことに、本発明のモノクローナル抗体の能力 を評価するための、即ち細胞性ＩＦＮ−Ｒを認識するための関連した検定を哺乳 類細胞で発現される組換え体骨容体で実施し得るということを示した。実際、こ のような組換え体骨容体は、その認識活性に関するかぎり、細胞性受容体と同様 の特性を有する。

本発明のモノクローナル抗体は、完全受容体、図３に示す受容体のアミノ酸配列 を特徴とする特定のドメイン又はペプチドを含めた種々の形態の受容体に対して 得られる。

本発明のモノクローナル抗体は、例えば可溶性形態の受容体に対して調製し得る 。可溶性形態のＩＦＮ−Ｒに対する水溶性ポリペプチドを図２に説明する。本発 明によれば、可溶性形態のＩＦＮ−Ｒは身体中を循環し得るペプチド又はポリペ プチドに相応する。

本発明の他のモノクローナル抗体は、図２に説明したような受容体の細胞外ドメ インに含まれるペプチドに対して調製してもよい。

有益なペプチドは、例えばアミノ酸１とアミノ酸２２９との間を構成するアミノ 酸配列に相応する。本発明の別の態様によれば、ＩＦＮ−Ｒの非修飾化細胞外ド メインに対する抗体が修飾ポリペプチド又はペプチドを認識するとすれば、抗体 は１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換により修飾されるポリペプチドに対して調 製し得る。

本発明の好ましいモノクローナル抗体は、　ＩｇＧ　Ｉ型のものである。

本発明の抗体のうち、Ｉ型ＩＦＮのその受容体との結合を阻止する能力を有する 抗体は、１００μｇ／ｍ１以下、好ましくは５０μｇ／ｍｌ以下、有益には２０ μｇ／ｍ１以下、さらに好ましくは約０．５〜２μｇ／ｍｌの抗体濃度でｈυ− ＩＦＮ−Ｒを有する細胞と同時インキュベートされる場合、好ましくはヒト１型 ＩＦＮのヒト細胞性ＩＦＮ−Ｒとの結合を１ｎｖｉ　ｔｒｏで阻止することを特 徴とする。

本発明は、モノクローナル抗体の高親和性結合能力が、この抗体がヒト１型ＩＦ ＮのＩＦＮ−Ｒとの結合活性を阻害し得ることを保証するには十分でないことを 示している。にもかかわらず、■型ＩＦＮのその細胞性受容体との結合を阻止す る抗体の能力をさらに調べるためには、モノクローナル抗体の高親和性結合能力 が必要である。

別のモノクロ・−ナル抗体は、それが１−１０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で、この ヒト１型ＩＦＮに高度に反応する細胞、例えばＤａｕｄｉ細胞におけるヒト１型 ＩＦＮの抗増殖活性をｉｎ　ｖｉｔｒｏで中和することを特徴とする。

別の態様によれば、モノクローナル抗体はさらに、ヒト１型ｉＦＮの抗増殖活性 をこのヒト１型ＩＦＮにあまり反応しない細胞、例えばＬＹ２８細胞上で５０〜 １００μｇ／ｍｌの範囲の濃度でｉｎ　ｖｉｔｒｏに中和することを特徴とする 。

本発明のモノクローナル抗体の特定の群は、ヒト１型ＩＦＮの抗ウィルス活性を 、このヒト１型ＩＦＮに高度に反応する細胞、例えばＤａｕｄ　ｉ細胞において 、国際標準ＭＲＣ６９／１９に関して１−１０００単位の範囲の■型ＩＰＮの濃 度に対して１〜５０μｇ／ｍＬ好ましくは１〜２０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で、 ｉｎ　ｖｉｔｒｏに中和することを特徴とする。

有益には、本発明のモノクローナル抗体は、これらの抗体がＩＦＮγに対するヒ ト受容体と結合しないものである。

本発明の要件を満たすある特定の抗体は、図２に示すように、それがヒト　ＪＰ Ｎ−Ｒの細胞外ドメインのアミノ酸２７とアミノ酸４２７との間を構成するアミ ノ酸配列上のエピトープに対して向けられるようなものである。

本発明の特に興味深い−モノクローナル抗体は、ｎ　’　９２０２２６０５の下 に１９９２年２月２６日にＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ ｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌＣｕｌｔｕｒｅｓ　Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ 　５ａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ　ＳＦ３　０５６．　Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）に寄託された６４Ｇ１２と呼ばれる抗体である。

これらの抗体は、抗体が生成される抗原がＩＦＮ−Ｒの細胞外ドメインあるいは このドメインのあらゆるポリペプチド又はペプチドで構成されるような条件で、 骨髄腫細胞とペプチド抗原で予め免疫化した動物の牌臓細胞との融合によるハイ ブリドーマ細胞の調製を包含する慣用的方法により調製し得る。

ハイブリドーマは、ＫｏｈｌｅｒどＭｉｌｓｔｅｉｎ　（Ｎａｔｕｒｅ、１９７ ４．　２５６　：４９５−４９７）のプロトコールに従って構築する。例えば、 ハイブリドーマは、上記の牌臓細胞と骨髄腫細胞としてＮＳＩマウス（Ｂａｌｂ Ｃ）ＨＧＰＲＴとの融合から得られる。

本発明のモノクローナル抗体の産生のための第二の手法は、Ｅｐｓｔｅｉｎ／　 Ｂａｒｒウィルスで不滅化した血液のＢ細胞と、モノクローナル抗体を生成する ことを決定するＩＦＮ−Ｒの細胞外ドメイン又はその断片に予め接触させておい たヒトＢ型リンパ球との間の融合を実行することから成る。モノクローナル抗体 を生成することを決定するＩＦＮ−Ｒの細胞外ドメイン又はその断片に予め接触 させておいたＢ細胞は、抗原に接触させたｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養により得られ、 １回又は何サイクルかの刺激の後にこれらの抗原にコートされたＢ細胞の回収が なされる。

したがって本発明は、上記の特性を有する上記の手法を実行することにより得ら れるようなヒト抗体に関する。

本発明はさらに、そのＨ及び／又はＬ鎖の可変部又は相補的決定領域がヒト抗体 のフレームワーク又は不変部に移植されることを特徴とするモノクローナル抗体 を提供することを目的とする。

本発明はさらに、上記のようなモノクローナル抗体を含有することを特徴とする ヒト１型ＩＦＮの生物学的特性に対する拮抗剤特性を有する組成物を提供する。

したがって、本発明は、上記のようなモノクローナル抗体を適切な製剤ビヒクル ととにも含有することを特徴とする製剤組成物を提供する。

本発明はさらに、Ｉ型ＩＦＮの過剰産生に伴う病的状態及び症状の治療又は予防 のための薬剤の製造のための上記のモノクローナル抗体の使用に関する。

第一の実施例によれば、抗体は同種移植片拒否反応の治療のために製剤組成物中 に用い得る。

別の実施例によれば、本発明の抗体は自己免疫及び炎症性疾患の治療のための製 剤組成物中の活性成分として用いられる。このような疾患の例としては、全身性 エリテマトーデス、ｌ型糖尿病、乾癖、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、ベー チェット病、再生不良性貧血、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び重傷複合 型免疫不全が挙げられる。

急性ウィルス疾患の治療も本発明の抗体を用いて実施し得る。上気道感染の例と して、麻疹ウィルスによるもののような慢性ウィルス感染が挙げられる。

本発明の抗体は、ヒト１型ｒＦＮ受容体又は細胞の存在のｉｎ　ｖｉｔｒ。

診断にも用い得る。

以下の実施例及び図の説明により本発明をさらに詳細に説明する。

図面の簡単な説明 −図ｘ、１２＠）標識化モノクローナル抗体３４Ｐ１０及び６４Ｇ１２の下記の ものとの結合ニ ー　Ａ　：　Ｄａｕｄｉ細胞 −Ｂ　：　ＬＹ２８細胞。

手短に言えば、１０＠個の細胞を１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰ ＩＪＩ培地中に希釈した種々の量の標識化抗体の存在下で４°Ｃで２時間インキ ュベートした。次に細胞をＲＰＭＩ−１％ＦＣＳで４回洗浄し、結合放射能を計 数した。１００倍過剰の冷却抗体を用いてインキュベートし、総計数から消去す ることにより非特異的結合を測定した。

−図２＝ヒトＩＦＮ−Ｒの細胞外ドメインのヌクレオチド及び対応するアミノ酸 配列。

モノクローナル抗体は、原核細胞（大腸菌）又は哺乳類細胞系（Ｃｏｓ細胞）で 合成されるヒトインターフェロンα−β受容体の組換え対可溶性形態に対して産 生された。これらの可溶性形態は、図２に記載したＤＮＡ配列を基礎にしていた 。

−図３＝ヒトＩＦＮ−Ｒのヌクレオチド及び対応するアミノ酸配列。

実施例 実施例１： ５個のヒスチジル残基をコードするエキストラシーケンスが終止コドン直前に導 入されたヒト　ＩＦＮ−Ｒの細胞外ドメイン（アミノ酸２７〜４２７）をコード する配列を含有するＤＮＡの断片（図２）を、発現ベクターＰｋｋ２３３−２中 でクローン化した。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によりこの断片を生成し、そ の結果化じたプラスミドをシーケンシングしてＳｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配 列によるインフレーム挿入及び受容体をコードする適切な配列を確証した。

組換え体蛋白質に導入されるポリヒスチジル尾部は、前に記載されているように （Ｈｏｃｈｕｌｉ　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏ／ｌｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　１ ９８８．１３２１１３２５）　、キレート化ニッケル支持体（ＮＴＡカラム）上 でのアフィニティークロマトグラフィーにより迅速にそれを精製させる。

プラスミドを大腸菌ＪＭ１０５株に導入し、培地に［ＰＴＧをふかして蛋白質合 成を誘発した（ｐＫＫ２３３−２．　ｔａｃプロモーター）。

細菌ペレットから蛋白質を抽出し、後述のようなアフィニティークロマトグラフ ィーにより可溶性受容体を均質に精製した。この手法は、還元条件下で５０ｋＤ ａ辺りに２つの帯として、そして非還元条件下では３つの帯として移動する蛋白 質を生成した。異なる手法により得られた蛋白質の最大濃度は約２０μｇ／ｍｌ であった。

ゲル電気泳動により検出された２つの蛋白質のＮ末端配列は、両蛋白質が受容体 の予測断片であることを示した。

非グリコジル化可溶性受容体の合成及び精製：細菌培養（２５０ｍｌ） ↓ ＩＰＴＧ導入　３時間 ↓ 細胞ペレット ６Ｍ　塩酸グアニジン、ｐＨ８ ↓ 遠心分離 ↓ ＮＴＡカラム：　洗浄　ｐ１１８　尿素８Ｍ↓　ｐＨ６，３尿素８Ｍ ↓　ｐＨ５，９尿素８Ｍ ↓ 溶離、ｐＨ４尿素８Ｍ ↓ 再折りたたみ、希釈、Ｔｒｉｓ　Ｏ，Ｉ　Ｍ、　ｐＨ９に対する透析↓ 透析ＰＢＳ 同−ＰＣＲアプローチを用いて、我々は、発現ベクターｐＸＭＴに挿入されたＣ 末端に付加的５−ヒスチジル残基を有するｒＦＮ−Ｒアミノ酸配列１〜４２７を コードする発現ベクターをも構築した。挿入物の正確なヌクレオチド配列も確証 した。

その結果生じたプラスミドを一過性発現のために電気穿孔によりＣｏｓ　７細胞 に導入し、アフィニティークロマトグラフィーにより、その後後述するようなモ ノＱ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でのイオン交換クロマトグラフィーにより組換 え体蛋白質を精製して均質にした。

Ｃｏｓ　７からの可溶性ＩＦＮ−Ｒの精製Ｃｏｓ細胞の予備的電気穿孔 ↓　１８時間 ↓ 血清無含有培地 ↓ ４８、７２．９６時間後に採取した上清↓ 濃縮 ↓ ＮＴＡカラム ↓ ↓　洗浄　ＰＢＳ 溶離　０．　ｌ　Ｍ　Ｎａ０Ａｃ　ｐＨ５，５↓ ↓　中和 濃縮　３０．０００　切り離し ↓ モノＱ　（０〜０，５　Ｍ　ＮａＣ１）この精製により、Ｎ末端配列がリーダー 配列のプロセッシングにおいて何らかの異質を伴う予測受容体配列に相応する７ ６ｋＤａ蛋白質が生じた。

実施例２： ■Ｙインターフェロン受容体に対するモノクローナル抗体の産生１）モノクロー ナル抗体の産生 大腸菌から又はＣｏｓ　７細胞の培養上清から精製した組換え体可溶性インター フェロン（ｒ　５ＩＦＮ−Ｒ）の注入によりマウスを免疫化した。

先ずマウスに完全フロインドアジュバントに溶解した精製蛋白質を腹腔内及び皮 下注射した。次いで、緩衝食塩溶液で希釈した精製蛋白質をマウスに週１回腹腔 内注射した。組換え体蛋白質ＩＯμｇを毎回注射した。

４回目の注射の後、血液を採取し、特異的血清抗体の存在を組換え体骨容体に対 するＥＬＩＳＡ及びウェスターンプロットにより調べた。

次に最も強い反応体を計ｌＯμｇの抗体で二次免疫注射して、その半分を静脈内 にそして半分を腹腔内に注入した。

２）細胞融合 追加免疫後４日目に、免疫化動物からの牌臘細胞を採取し、Ｓ。

Ｆａｚｅｋａｓ等（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３５　：　１− ３２．１９８０）が記載の方法に従ってＮ５Ｉ（マウスＸＢａ１ｂｃ）　ＨＧＰ ＲＴ骨髄腫細胞と融合させた。手短に言えば、５Ｘ１０’個の牌臓細胞をポリエ チレングリコール溶液１ｍｌに溶解した３Ｘ１０７個の骨髄腫細胞と融合させて 、ＨＡＴ　（ヒボキサンチン、アミノプロティン及びチミジン）中の腹膜マクロ ファージ支持細胞層上の５つの９６ウエルプレート中に分布させた。この手順を ４回繰り返して、免疫化マウスから２０Ｘ１０７個の牌臓細胞を得た。大型コロ ニーが培養ウェル中に検出された場合は、特異的ハイブリドーマに対するスクリ ーニングを試みた。

スクリーニングのためには、特異的抗体の存在を直接ＥＬＩＳＡ法により測定し た： ａ）ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳに希釈した精製大腸菌発現性又はＣｏｓ　７発 現性５ｌＰＮ−Ｒを用いて４°Ｃで一夜コーティングした。ＢＳＡでコーティン グしたプレートを用いて非特異的結合を検出した。

ｂ）ＰＢＳに溶融した３％ＢＳＡを用いて３７°Ｃで１時間インキュベートする ことによりプレートを飽和させた。

ｃ）　ＰＢＳ−０，０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を用いて４対１に希釈したハイブリ ドーマ上清を用いて室温で４時間プレートをインキュベートした。

ｄ）先ずヤギ抗マウスビオチニル化イムノグロブリンを用いて、その後ストレブ トアビジンーホースラディッノユベルオキシダーゼ複合体（両方ともにＡｍｅｒ ｓｈａｍより入手。ＰＢＳ　−０，０５％Ｔｗｅｅｎ　２０で１／１０００に希 釈）を用いてインキュベートすることから成る２工程手法により結合抗体を検出 した。

陽性抗体分泌ハイブリドーマを牌臓細胞支持細胞層上で２４ウエルプレート中で 継代接種して、それらの反応性をＥＬＩＳＡ及びウェスターンプロットで再び点 検した。

３）天然Ｉ型インターフェロン受容体に対する反応性の同定組換え体５ＩＦＮ− Ｒを認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の反応性を、膜蛍光抗体法により Ｄａｕｄｉ細胞の表面に発現される天然１種受容体に対して調べた。手短に言え ば、５Ｘ１０’個のＤａｕｄｉ細胞を選択したハイブリドーマの培養上清１００ μｍ中で４°Ｃで３０分インキュベートした。次に１％ＢＳＡを含有するＲＰＭ Ｉ培地中で細胞を４回洗浄し、希釈ＦＩＴＣ標識化ヤギ抗マウスＦ　（ａｂ’　 ）！を用いて４℃で３０分間さらにインキュベートした。洗浄後、流動細胞計測 法により細胞を最後に分析した。大腸菌組換え体骨容体に対して産生された３５ の試験抗体のうちの１つ、並びにＣｏｓ組換え体骨容体に対して産生された６つ の試験抗体のうち５つは、Ｄａｕｄｉ細胞上の天然受容体を認識することが判明 した。

次に、希釈を限定することにより、これらのハイブリドーマのクローニングを実 行した。イソタイプ特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により、これらのｍＡｂｓ のイソタイプを確定した。６つのｍＡｂｓのすべてがカッパーＬ鎖を有する［ｇ Ｇ　１であることが分かった。これら６つのｍＡｂｓの反応性の要約を表１に示 す。

モノクローナル抗体は蛋白質Ｇクロマトグラフィーにより培養上清から精製した 。　− ＥＬＩＳＡウェスタン　ＥＬＩＳＡウェスタン　蛍光抗体法３４Ｆ１０＋　＋　 ＋　＋　＋ ３Ｆ６ ５Ｄ８ ＊　Ｄａｕｄｉ細胞に関して測定。

実施例３： インターフェロンのヒト細胞株との結合の阻止ヒト細胞と結合するインターフェ ロンの阻害を以下のように検定した。１０’個の細胞を、ハイブリドーマ培養上 清又は精製ｍＡｂｓの種々の希釈液を用いて、又は培地のみを用いて４°Ｃで３ ０分子インキュベートした。　Ｉｔｓ　７標識化ＩＦＮアルフア８又はアルファ ２を１００９Ｍの濃度で加えて、細胞を４°Ｃでさらに２時間インキュベートし た。

これらのインキュベーションは、２０ｍＭ　ＨＥＰ）ＥＳ、　ｐＨ７，４及び１ ０％ウシ胎仔血清（Ｆｅ２）を含有するＲＰＭＩ培地中で実施した。最後に細胞 をＲＰＭｒ−１％ＦＣ３で４回洗浄し、計数して結合放射能を確定した。

ハイブリドーマ６４Ｇ１２株が分泌したｍＡｂ　（ｍＡｂ　６４Ｇ１２）は、用 量依存的に標識化ＩＦＮの細胞との結合を阻止することが本検定において示され た。Ｄａｕｄ　ｉ細胞との結合の５０％阻止（Ｂｕｒｋｉｔｔ　ＩＪンパ腫細胞 ；　Ｋｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　２８　 ：　１３００−１３１０．１９６８）は、０．４μｇ／ｍｌのｍＡｂ濃度で得ら れた。同一の阻止はに５６２細胞で得られた（慢性骨髄性白血病、　Ｌｏｚｚｉ ｏ　ａｎｄ　Ｌｏｚｚｉｏ、　Ｃｅ１１．４５　：　３２１−３３４、１９７５ ）が、しかし５０％阻止はＨＬ６０細胞（前骨髄細胞性白血病。

Ｃｏ１１ｉｎｓ　Ｓ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７０　：　３ ４７−３４９．１９７７）に関して１１１１ｇ／ｒｎＩで、ＬＹ２８細胞（Ｋｌ ｅｉｎ　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　［ｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　１０　：４ ４−５７．１９７２）に関しては６０μｇ／ｍｌで得られた。

細胞株　結合の５０％阻止を生じるｍＡｂの濃度ＨＬ６０　１１　、ｃｚｇ／ｍ １ Ｈｙ２８　６０　ｕ　ｇ／ｍｌ ＋２６１標識化ｍＡｂ　６４Ｇ１２及び３４Ｆ１０の同一細胞株との直接結合、 並びにその結果のスキャッチャードプロット分析により、　［ＦＮの結合の５０ ％阻止が得られるｍＡｂ濃度の差異を直接調べた。０．１−１．５μｇ／ｍｌの 濃度範囲では、ｍＡｂ　３４ＦＩＯの高親和性結合が全細胞株で観察されたが、 一方ｍＡｂ　６４Ｇ１２の高親和性結合はＤａｕｄｉ細胞及びに５６２細胞で検 出されただけであった（図１）。

実施例４： ｌｆｆ１インターフエロンの機能の阻止組換え体ｒＦＮアルファ２、ＩＦＮベー タ及びＩＦＮオメガ、又は精製Ｎａｍａ１ｗａ及び白血球インターフェロンを用 いたＤａｕｄ　ｉ細胞に関する抗ウイルス検定で、そして組換え体ＩＦＮアルフ ァを用いた抗増殖検定で、精製ｍＡｂ　６４Ｇ１２による■型インターフェロン の機能的阻止を記載（Ｍ、　Ｄｒｏｎ　ａｎｄ　Ｍ、Ｇ、　Ｔｏｖｅｙ、　Ｊ、 　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６４　：　２６４１−２６４７゜１９８３）通りに Ｄａｕｄｉ細胞での抗ウイルス検定を実行した。細胞（ｏ、５ｘｌＯ”　／ｍｌ ）をインターフェロン及び抗体の存在下で２４時間インキュベートした。次にｉ ｎ＋１ｎ＋１中細０＠胞を水痘性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）に３７°Ｃで１時間 感染させた後、３回洗浄して、培地に再懸濁し、３７°Ｃで１８時間インキュベ ートした。次に凍結融解により細胞を溶解させて、Ｌ９２９細胞での上清の滴定 によりウィルス複製を測定した。Ｉ型ＩＦＮの種々の亜型の抗ウィルス活性の用 量依存性阻止を、精製ｍＡｂ　６４Ｇ１２に関して立証した。

Ｗｉ　ｓｈ細胞を用いた抗ウイルス検定に関しては、ｍＡｂの存在下で種々の濃 度のインターフェロンを用いて細胞を２４時間インキュベートした後、ＶＳＶで 試験した。この検定では、ｍＡｂ　６４Ｇ１２は白血球ＩＦＮ（５０Ｕ／ｍｌ） 　、組換え体ＩＦＮアルフｙ　２　（５０Ｕ／ｍｌ）及びＡＩＤＳ患者の血清か らのインターフェロン（５０，７５及び１５０Ｕ／ｆｉ１１）の抗ウィルス活性 を完全に遮断することが立証された。

＊抗増殖活性 抗増殖検定に関しては、インターフェロン及び精製阻止又は制御抗体の存在下で ９６ウエルプレート中の１ｍｌ当り細胞１０’個という濃度でＤａｕｄｉ細胞を 植えつけた。次いで、２４．４８及び７２時間後にＣｏｕｌｔｅｒ計数器を用い て細胞を計数し、トリパンブルー排除試験により生存能力を点検した。精製ｍＡ ｂ　６４Ｇ１２は、インターフェロンアルファ２の抗増殖活性の用量依存性阻止 を立証した。

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ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＺ。

Ｆ　Ｉ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、Ｎｏ 、ＮＺ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、　ＵＡ、　ＵＳ Ｉ （７２）発明者　マギール、デポラ フランス国、エフ−７５００５パリ、リュメートルーアルベール、２４ （７２）発明者　プラベク、イバン フランス国、エフ−９２２６０フレスネ、アレウ　デュ　カビテーヌーデュポン 、１（７２）発明者　トーベイ、ミシェル　ジェ。

フランス国、エフ−７５００５パリ、リュデ　クアトレファジュ、６

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の： −ヒトＩＦＮ−Ｒの細胞外ドメインを認識し、−ヒトＩ型ＩＦＮの生物学的特性 に対する中和能力を有するという特性を特徴とするヒトＩ型インターフェロン受 容体（ＩＦＮ−Ｒ）に対するモノクローナル抗体。
2. ２．ヒト病態Ｉ型ＩＦＮのＩＦＮ−Ｒとの結合を阻止するその能力を特徴とする 請求項１記載のヒトＩ型ＩＦＮ−Ｒに対するモノクローナル抗体。
3. ３．骨髄腫細胞と可溶性形態のヒトＩＦＮ−Ｒで予め免疫化した動物からの脾臓 細胞との融合により調製されるハイプリドーマ細胞から得られる請求項１または ２記載のモノクローナル抗体。
4. ４．可溶性形態のヒト細胞性ＩＦＮ−Ｒ又は組換え体ＩＦＮ−Ｒ上のエピトープ を認識することを特徴とする請求項１，２または３のいずれかに記載のモノクロ ーナル抗体。
5. ５．１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは５０μｇ／ｍｌ以下、有益には２０μｇ ／ｍｌ以下、さらに好ましくは約０．５〜２μｇ／ｍｌの抗体濃度でｈｕ−ＩＦ Ｎ−Ｒを保有する細胞と同時インキュベートされる場合に、ヒトＩ型ＩＦＮのヒ ト細胞性ＩＦＮ−Ｒとの結合をｉｎｖｉｔｒｏで阻止することを特徴とする請求 項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
6. ６．ヒトＩ型ＩＦＮの抗増殖活性をこのヒトＩ型ＩＦＮに高度に反応する細胞、 例えばＤａｕｄｉ細胞上で１〜１０μｇ／ｍｌの範囲の濃度でｉｎｖｉｔｒｏに 中和することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体 。
7. ７．ヒトＩ型ＩＦＮの抗増殖活性をこのヒトＩ型ＩＦＮにあまり反応しない細胞 、例えばＬｙ２８細胞上で５０〜１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度でｉｎｖｉｔｒ ｏに中和することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル 抗体。
8. ８．ＩＦＮガンマのヒト受容体と結合しないことを特徴とする請求項１〜７のい ずれかに記載のモノクローナル抗体。
9. ９．ヒトＩＦＮ−Ｒのアミノ酸配列２７〜４２７上のエピトープを認識すること を特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
10. １０．ヒトＩ型ＩＦＮの抗ウイルス活性をこのヒトＩ型ＩＦＮに高度に反応する 細胞、例えばＤａｕｄｉ細胞上で１〜１０μｇ／ｍｌの範囲の濃度でｉｎｖｉｔ ｒｏに中和することを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のモノクローナ ル抗体。
11. １１．ヒトＩ型ＩＦＮの抗ウイルス活性をこのヒトＩＦＮにあまり反応しない細 胞、例えばＬｙ２８細胞上で５０〜１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度でｉｎｖｉｔ ｒｏに中和することを特徴とする請求抗１〜１０のいずれかに記載のモノクロー ナル抗体。
12. １２．ｎ′９２０２２６０５の下に１９９２年２月２６日にＥＣＡＣＣに寄託さ れた抗体６４Ｇ１２であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の モノクローナル抗体。
13. １３．人体適合化抗体であることを特徴とする、例えばＨ及びＬ鎖の可変部又は 相補的決定領域がヒト抗体のフレームワーク及び不変部にグラフトされることを 特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
14. １４．ヒト抗体であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のモノ クローナル抗体。
15. １５．ＩｇＧ１抗体であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の モノクローナル抗体。
16. １６．請求項１〜１３記載のモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハ イブリドーマ細胞。
17. １７．請求項１〜１６のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有することを 特徴とするＩ型ＩＦＮに対する拮抗剤特性を有する組成物。
18. １８．適切な薬剤ビヒクルと一緒に請求項１〜１７のいずれかに記載のモノクロ ーナル抗体を含有することを特徴とする製剤組成物。
19. １９．増殖性細胞活性及び／又はウイルス細胞感染に関連した病態の治療又は予 防のための薬剤の製造のための請求項１〜１７のいずれかに記載のモノクローナ ル抗体の使用。
20. ２０．ヒトＩＦＮ−Ｒの細胞外ドメインを認識する能力及びヒトＩ型ＩＦＮのＩ ＦＮ−Ｒとの結合を阻止する能力を有するモノクローナル抗体の選択方法であっ て、以下の： −ＩＦＮ−Ｒを保有できるヒトを用いて確定濃度の請求項１〜１５のいずれかに 記載の精製モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体を含有するハイプリドー マ培養上清を予インキュベートし；−確定濃度の標識化ヒトＩ型ＩＦＮを上記予 インキュベーション中培地に加え； −ヒト細胞、モノクローナル抗体及び標識化Ｉ型ＩＦＮを含有する培地を細胞性 ＩＦＮ−Ｒを用いて一方ではモノクローナル抗体と他方ではＩ型ＩＦＮとの間に 平衡を生じさせるのに十分な時間インキュベートし； −細胞を洗浄し； −付着標識化Ｉ型ＩＦＮの量を計数することによりヒト細胞とＩ型ＩＦＮとの間 の結合複合体の生成を確定する工程を特徴とする方法。
21. ２１．ヒトＩＦＮ−Ｒの細胞外ドメインを認識する能力を有し、そしてヒト細胞 におけるＩ型ＩＦＮの抗増殖活性に対する中和能力を有するモノクローナル抗体 の選択方法であって、以下の：−ヒトＩＦＮの存在下で、且つ確定濃度の請求項 １〜１５のいずれかに記載のモノクローナル抗体の存在下で細胞を増殖させ；− Ｉ型ＩＦＮの抗増殖作用の阻止を検出するために細胞を計数する 工種を特徴とする方法。
22. ２２．ヒトＩＦＮ−Ｒの細胞外ドメインを認識する能力を有し、そしてヒト細胞 における天然の、非病態性又は病態性のＩ型ＩＦＮの抗ウイルス活性に対する中 和能力を有するモノクローナル抗体の選択方法であって、以下の： −Ｉ型ＩＦＮ及び請求項１〜１５のいずれかに記載のモノクローナル抗体を確定 濃度で用いてモノクローナル抗体とヒト細胞のＩＦＮ−Ｒとの間、及び／又はＩ 型ＩＦＮとヒト細胞のＩＦＮ−Ｒとの間に複合体を生成させるのに十分な時間イ ンキュベートし；−上記インキュベート細胞を確定濃度のウイルスに感染させ； 一細胞を洗浄し； 一細胞を培地中に再懸濁し； −ウイルスを複製させるのに十分な時間インキュベートし；−細胞を溶解し； −ウイルス複製を測定するか又は細胞変性作用の阻止を測定する 工程を特徴とする方法。