JPH07194383A - インターロイキン−１２受容体および抗体 - Google Patents
インターロイキン−１２受容体および抗体Info
- Publication number
- JPH07194383A JPH07194383A JP6166950A JP16695094A JPH07194383A JP H07194383 A JPH07194383 A JP H07194383A JP 6166950 A JP6166950 A JP 6166950A JP 16695094 A JP16695094 A JP 16695094A JP H07194383 A JPH07194383 A JP H07194383A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- receptor
- cells
- interleukin
- binding
- immunoglobulin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 インターロイキン−１２受容体をコードする
ＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を含むベクター、該ベクター
によって形質転換された宿主細胞、該ＤＮＡ分子により
コードされる低親和性のインターロイキン−１２受容体
タンパク質、該タンパク質に対する抗体、および該タン
パク質または該抗体を含有する医薬組成物。 【効果】 精製したインターロイキン−１２受容体タン
パク質およびその抗体は治療薬や診断薬として有用であ
る。
ＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を含むベクター、該ベクター
によって形質転換された宿主細胞、該ＤＮＡ分子により
コードされる低親和性のインターロイキン−１２受容体
タンパク質、該タンパク質に対する抗体、および該タン
パク質または該抗体を含有する医薬組成物。 【効果】 精製したインターロイキン−１２受容体タン
パク質およびその抗体は治療薬や診断薬として有用であ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般にはサイトカイン
受容体に関し、より詳細にはインターロイキン−１２受
容体に関する。
受容体に関し、より詳細にはインターロイキン−１２受
容体に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＩＬ−１２のような分子が細胞に対して
その効果を発揮するためには、該分子が受容体と呼ばれ
る細胞膜上に存在する分子と相互作用しなければならな
いことは当業者によって今や認められている。インター
ロイキン受容体を開示している特許として、Honjo らの
米国特許第4,816,565 号、Urdal らの米国特許第4,578,
335 号、Dower らの米国特許第5,180,812 号、およびTa
niguchi らの米国特許第5,198,359 号を挙げることがで
きる。
その効果を発揮するためには、該分子が受容体と呼ばれ
る細胞膜上に存在する分子と相互作用しなければならな
いことは当業者によって今や認められている。インター
ロイキン受容体を開示している特許として、Honjo らの
米国特許第4,816,565 号、Urdal らの米国特許第4,578,
335 号、Dower らの米国特許第5,180,812 号、およびTa
niguchi らの米国特許第5,198,359 号を挙げることがで
きる。
【０００３】可溶性形態のインターロイキン受容体も知
られている（Fanslow, W.C. et al.(1990) Science 24
8, 739-41 ）。インターロイキン−１（ＩＬ−１）のin
vivo 作用をその可溶性受容体を投与することによって
調節することができた。Fanslow らが報告した結果か
ら、可溶性のサイトカイン受容体（可溶性ＩＬ−１Ｒ）
はその外因的in vivo 投与により、おそらくは内因的に
産生される対応リガンド（ＩＬ−１）の中和剤として作
用することによって、生物学的活性を変調する能力を有
することが実証され、様々な臨床疾患の治療に可溶性の
サイトカイン受容体を応用することの可能性が提起され
た。ＩＬ−１受容体の可溶性の細胞外部分（可溶性ＩＬ
−１Ｒ）の全身投与は、in vivo 同種異系反応の発症に
対して顕著な抑制作用を及ぼした。異所心臓同種異系移
植片の生存は対照マウスでの１２日間から可溶性ＩＬ−
１Ｒで処置したマウスでの１７日間へと引き延ばすこと
ができた。同種異系細胞の局所注入に応答して起こるリ
ンパ節の過形成は、可溶性ＩＬ−１Ｒ処置によって完全
に阻止された。
られている（Fanslow, W.C. et al.(1990) Science 24
8, 739-41 ）。インターロイキン−１（ＩＬ−１）のin
vivo 作用をその可溶性受容体を投与することによって
調節することができた。Fanslow らが報告した結果か
ら、可溶性のサイトカイン受容体（可溶性ＩＬ−１Ｒ）
はその外因的in vivo 投与により、おそらくは内因的に
産生される対応リガンド（ＩＬ−１）の中和剤として作
用することによって、生物学的活性を変調する能力を有
することが実証され、様々な臨床疾患の治療に可溶性の
サイトカイン受容体を応用することの可能性が提起され
た。ＩＬ−１受容体の可溶性の細胞外部分（可溶性ＩＬ
−１Ｒ）の全身投与は、in vivo 同種異系反応の発症に
対して顕著な抑制作用を及ぼした。異所心臓同種異系移
植片の生存は対照マウスでの１２日間から可溶性ＩＬ−
１Ｒで処置したマウスでの１７日間へと引き延ばすこと
ができた。同種異系細胞の局所注入に応答して起こるリ
ンパ節の過形成は、可溶性ＩＬ−１Ｒ処置によって完全
に阻止された。
【０００４】インターロイキン−１２は、以前には細胞
障害性リンパ球成熟因子またはナチュラルキラー細胞刺
激因子として知られていたものであるが、４０ｋＤａ
（ｐ４０）サブユニットと３５ｋＤａ（ｐ３５）サブユ
ニットがジスルフィド結合によって結合された７５ｋＤ
ａのヘテロダイマーサイトカインで、多面的な活性を示
し、例えば活性化されたＴ細胞およびＮＫ細胞の増殖促
進（Gately, M.K. et al. (1991) J. Immunol., 147, 8
74；Kobayashi, M. et al. (1989) J. Exp. Med., 170,
827）、ＮＫ／ＬＡＫ細胞の溶解活性の増強（Kobayash
i, M. et al.前掲；Stern, A.S. et al. (1990) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6808）、細胞溶解性Ｔ細胞
応答の増強（M. Gately et al. (1992) Cell. Immunolo
gy, 143, 127）、休止型または活性型のＴ細胞およびＮ
Ｋ細胞によるインターフェロンγの誘導（M. Kobayashi
et al. 前掲；S.H. Chan et al. (1991) J. Exp. Me
d., 173, 869）、そしてＴｈ１型のヘルパー細胞応答の
促進（R. Manetti et al. (1993) J. Exp. Med., 177,
1199; C.S. Hsieh et al. (1993) Science 260, 547 ）
を示す。
障害性リンパ球成熟因子またはナチュラルキラー細胞刺
激因子として知られていたものであるが、４０ｋＤａ
（ｐ４０）サブユニットと３５ｋＤａ（ｐ３５）サブユ
ニットがジスルフィド結合によって結合された７５ｋＤ
ａのヘテロダイマーサイトカインで、多面的な活性を示
し、例えば活性化されたＴ細胞およびＮＫ細胞の増殖促
進（Gately, M.K. et al. (1991) J. Immunol., 147, 8
74；Kobayashi, M. et al. (1989) J. Exp. Med., 170,
827）、ＮＫ／ＬＡＫ細胞の溶解活性の増強（Kobayash
i, M. et al.前掲；Stern, A.S. et al. (1990) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6808）、細胞溶解性Ｔ細胞
応答の増強（M. Gately et al. (1992) Cell. Immunolo
gy, 143, 127）、休止型または活性型のＴ細胞およびＮ
Ｋ細胞によるインターフェロンγの誘導（M. Kobayashi
et al. 前掲；S.H. Chan et al. (1991) J. Exp. Me
d., 173, 869）、そしてＴｈ１型のヘルパー細胞応答の
促進（R. Manetti et al. (1993) J. Exp. Med., 177,
1199; C.S. Hsieh et al. (1993) Science 260, 547 ）
を示す。
【０００５】ＩＬ−１２の生物学的活性は、活性化され
たＴ細胞およびＮＫ細胞の表面または形質膜上にある受
容体へのＩＬ−１２分子の結合によって仲介される。し
かし、受容体結合およびシグナル変換において個々のサ
ブユニットｐ３５とｐ４０が果たす役割は不明のままで
ある。標識ＩＬ−１２を用いた研究から、この結合は特
異的にかつ飽和可能に起こることが明らかになった。Ｉ
Ｌ−１２は、ＰＨＡ活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細
胞上とＩＬ−２活性化ＣＤ５６＋ＮＫ細胞上で最初に同
定された受容体を介して標的細胞へシグナルを送達する
（R. Chizzonite et al. (1992) J. Immunol., 148, 31
17; B. Desai et al. (1992) J. Immunol., 148, 3125
）。Ｔ、Ｂ、ＮＫ細胞および骨髄単球系列に属する２
０以上のヒト細胞系の検定からは、ＩＬ−１２受容体を
構成的に発現しかつＩＬ−１２に応答する単一のＣＤ４
＋、ＩＬ−２依存性ヒトＴ細胞系（Ｋｉｔ２２５）が同
定されただけだった（B. Desai et al. (1992) J. Immu
nol., 148, 3125; B. Desaiet al. (1993) J. Immuno
l., 150, 207A）。かくして、新たに調製されたＰＨＡ
活性化ＰＢＭＣとＫｉｔ２２５細胞系は、そのほかにも
あり得るが、機能性ＩＬ−１２受容体の生化学を研究す
るための便利な細胞供給源である。 125Ｉ標識ＩＬ−１
２を用いた平衡結合検定から次のことが判明した：ｉ）
ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣは３種類の親和性、すなわち高親
和性＝５〜２０ｐＭ、中程度親和性＝５０〜２００ｐ
Ｍ、そして低親和性＝２〜６ｎＭを示す数千ものＩＬ−
１２受容体を発現する；ii）ＰＢＭＣ上でのＩＬ−１２
受容体の発現はマイトジェンやＩＬ−２刺激によって正
の調節（アップレギュレーション）を受ける；そしてii
i)ＩＬ−１２受容体の正の調節はＩＬ−１２に応答して
増殖する該細胞の能力と相関する（R. Chizzonite et a
l. (1992) J. Immunol., 148, 3117; B. Desai et al.
(1992) J. Immunol., 148, 3125 ）。この時点では、生
物学的に機能するＩＬ−１２受容体が１つ以上のサブユ
ニットからなるのか否かは不明であった。活性化ＰＢＭ
Ｃへの標識ＩＬ−１２の親和性架橋結合は、細胞表面の
ＩＬ−１２結合タンパク質の大きさが非還元条件下で約
１５０〜２００ｋＤａの範囲であることを示した。 125
Ｉ表面標識した活性化ＰＢＭＣに結合されたＩＬ−１２
を用いた別の親和性架橋結合および免疫沈降検定から
は、還元条件下で約１１０ｋＤａの大きさを有するＩＬ
−１２結合タンパク質が同定された（R. Chizzonite et
al. (1992) J. Immunol., 148, 3117）。
たＴ細胞およびＮＫ細胞の表面または形質膜上にある受
容体へのＩＬ−１２分子の結合によって仲介される。し
かし、受容体結合およびシグナル変換において個々のサ
ブユニットｐ３５とｐ４０が果たす役割は不明のままで
ある。標識ＩＬ−１２を用いた研究から、この結合は特
異的にかつ飽和可能に起こることが明らかになった。Ｉ
Ｌ−１２は、ＰＨＡ活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細
胞上とＩＬ−２活性化ＣＤ５６＋ＮＫ細胞上で最初に同
定された受容体を介して標的細胞へシグナルを送達する
（R. Chizzonite et al. (1992) J. Immunol., 148, 31
17; B. Desai et al. (1992) J. Immunol., 148, 3125
）。Ｔ、Ｂ、ＮＫ細胞および骨髄単球系列に属する２
０以上のヒト細胞系の検定からは、ＩＬ−１２受容体を
構成的に発現しかつＩＬ−１２に応答する単一のＣＤ４
＋、ＩＬ−２依存性ヒトＴ細胞系（Ｋｉｔ２２５）が同
定されただけだった（B. Desai et al. (1992) J. Immu
nol., 148, 3125; B. Desaiet al. (1993) J. Immuno
l., 150, 207A）。かくして、新たに調製されたＰＨＡ
活性化ＰＢＭＣとＫｉｔ２２５細胞系は、そのほかにも
あり得るが、機能性ＩＬ−１２受容体の生化学を研究す
るための便利な細胞供給源である。 125Ｉ標識ＩＬ−１
２を用いた平衡結合検定から次のことが判明した：ｉ）
ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣは３種類の親和性、すなわち高親
和性＝５〜２０ｐＭ、中程度親和性＝５０〜２００ｐ
Ｍ、そして低親和性＝２〜６ｎＭを示す数千ものＩＬ−
１２受容体を発現する；ii）ＰＢＭＣ上でのＩＬ−１２
受容体の発現はマイトジェンやＩＬ−２刺激によって正
の調節（アップレギュレーション）を受ける；そしてii
i)ＩＬ−１２受容体の正の調節はＩＬ−１２に応答して
増殖する該細胞の能力と相関する（R. Chizzonite et a
l. (1992) J. Immunol., 148, 3117; B. Desai et al.
(1992) J. Immunol., 148, 3125 ）。この時点では、生
物学的に機能するＩＬ−１２受容体が１つ以上のサブユ
ニットからなるのか否かは不明であった。活性化ＰＢＭ
Ｃへの標識ＩＬ−１２の親和性架橋結合は、細胞表面の
ＩＬ−１２結合タンパク質の大きさが非還元条件下で約
１５０〜２００ｋＤａの範囲であることを示した。 125
Ｉ表面標識した活性化ＰＢＭＣに結合されたＩＬ−１２
を用いた別の親和性架橋結合および免疫沈降検定から
は、還元条件下で約１１０ｋＤａの大きさを有するＩＬ
−１２結合タンパク質が同定された（R. Chizzonite et
al. (1992) J. Immunol., 148, 3117）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
の低親和性ＩＬ−１２受容体タンパク質またはそのサブ
ユニットをコードする単離したｃＤＮＡを提供すること
にある。このｃＤＮＡを哺乳動物細胞において発現させ
ると、特異的にかつ飽和可能にＩＬ−１２と結合する、
約２〜１０ｎＭ、好ましくは２〜５ｎＭの見かけの親和
性を有する、実質的に均一なＩＬ−１２受容体タンパク
質が生じる。さらに、本発明はインターロイキン−１２
受容体に対する新規な抗体をも提供する。本発明により
得られる代表的な抗インターロイキン−１２受容体抗血
清は、インターロイキン−１２受容体を発現する細胞へ
のインターロイキン−１２の結合を阻止し、しかもイン
ターロイキン−１２活性を中和することができる。
の低親和性ＩＬ−１２受容体タンパク質またはそのサブ
ユニットをコードする単離したｃＤＮＡを提供すること
にある。このｃＤＮＡを哺乳動物細胞において発現させ
ると、特異的にかつ飽和可能にＩＬ−１２と結合する、
約２〜１０ｎＭ、好ましくは２〜５ｎＭの見かけの親和
性を有する、実質的に均一なＩＬ−１２受容体タンパク
質が生じる。さらに、本発明はインターロイキン−１２
受容体に対する新規な抗体をも提供する。本発明により
得られる代表的な抗インターロイキン−１２受容体抗血
清は、インターロイキン−１２受容体を発現する細胞へ
のインターロイキン−１２の結合を阻止し、しかもイン
ターロイキン−１２活性を中和することができる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】最初に、図面について説
明する。図１は、ヒトＩＬ−１２受容体ｃＤＮＡクロー
ンＮｏ．５のＤＮＡ配列（翻訳部分＝ヌクレオチド６５
〜２０５０）（配列番号：１）を示す。
明する。図１は、ヒトＩＬ−１２受容体ｃＤＮＡクロー
ンＮｏ．５のＤＮＡ配列（翻訳部分＝ヌクレオチド６５
〜２０５０）（配列番号：１）を示す。
【０００８】
【０００９】図３は、ＩＬ−１２受容体タンパク質のサ
ブユニット配列とヒトｇｐ１３０、ヒト顆粒球コロニー
刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ）および白血病抑制因
子受容体（ＬＩＦ−Ｒ）の配列との配列相同性、および
その結果得られたコンセンサス配列を示す。小文字で示
したコンセンサス残基はＩＬ−１２受容体とｇｐ１３０
のみとの同一性を示す。次の配列域を採用した：ＩＬ−
１２受容体タンパク質（配列番号：２）＝残基４２〜６
６２；ｇｐ１３０＝残基１２４〜７４２（Hibiet al.
(1990) Cell, 63, 1149 ）；Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ＝残基９８
〜７３１（Fukunaga et al. (1990) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87, 8702 ）；ＬＩＦ−Ｒ＝残基３３１〜９
５０（Gearing et al. (1991) EMBO J., 10, 2839 ）。
ブユニット配列とヒトｇｐ１３０、ヒト顆粒球コロニー
刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ）および白血病抑制因
子受容体（ＬＩＦ−Ｒ）の配列との配列相同性、および
その結果得られたコンセンサス配列を示す。小文字で示
したコンセンサス残基はＩＬ−１２受容体とｇｐ１３０
のみとの同一性を示す。次の配列域を採用した：ＩＬ−
１２受容体タンパク質（配列番号：２）＝残基４２〜６
６２；ｇｐ１３０＝残基１２４〜７４２（Hibiet al.
(1990) Cell, 63, 1149 ）；Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ＝残基９８
〜７３１（Fukunaga et al. (1990) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87, 8702 ）；ＬＩＦ−Ｒ＝残基３３１〜９
５０（Gearing et al. (1991) EMBO J., 10, 2839 ）。
【００１０】図４は、ＣＯＳ細胞で発現させた組換えヒ
トＩＬ−１２受容体へのＩＬ−１２結合のスキャッチャ
ード分析を示す。図５は、ＣＯＳ細胞で発現させた組換
えヒトＩＬ−１２受容体への２−４Ｅ６抗体結合のスキ
ャッチャード分析を示す。図６は、還元条件下でのＩＬ
−１２受容体タンパク質の大きさの分析を示す。ＩＬ−
１２受容体ｃＤＮＡをＣＯＳ細胞に導入し、記載のとお
りに35Ｓシステインで標識した。分割量の細胞溶解液を
次のような異なる抗体により免疫沈降させた：レーン
１：陰性対照Ｉｇ；レーン２：２−４Ｅ６抗体；レーン
３：アイソタイプが一致した陰性対照抗体４Ｄ６。図面
の左側にマーカーのサイズをｋＤａで示してある。
トＩＬ−１２受容体へのＩＬ−１２結合のスキャッチャ
ード分析を示す。図５は、ＣＯＳ細胞で発現させた組換
えヒトＩＬ−１２受容体への２−４Ｅ６抗体結合のスキ
ャッチャード分析を示す。図６は、還元条件下でのＩＬ
−１２受容体タンパク質の大きさの分析を示す。ＩＬ−
１２受容体ｃＤＮＡをＣＯＳ細胞に導入し、記載のとお
りに35Ｓシステインで標識した。分割量の細胞溶解液を
次のような異なる抗体により免疫沈降させた：レーン
１：陰性対照Ｉｇ；レーン２：２−４Ｅ６抗体；レーン
３：アイソタイプが一致した陰性対照抗体４Ｄ６。図面
の左側にマーカーのサイズをｋＤａで示してある。
【００１１】図７は、ＲＮＡブロット法によるＩＬ−１
２受容体転写物の大きさの分析を示す。各レーンにつき
４μｇのポリＡ＋ＲＮＡを泳動させた。レーン１〜４お
よび５〜８は同一の負荷を表す。レーン１〜４は該受容
体の全長ｃＤＮＡをプローブとして検出し、レーン５〜
８は該受容体の細胞質部分にのみ対応するプローブを用
いて検出した。レーン１，５：刺激していない末梢血単
核細胞（ＰＢＭＣ）。レーン２，３，６，７：ＰＨＡで
刺激したＰＢＭＣ。レーン２と６はレーン１と５に示し
たサンプルの３日間の誘導を示す。レーン３と７のサン
プルは独立した４日間のＰＨＡ誘導から得られ、そして
レーン４と８はＫ６細胞由来のＲＮＡを表す。下のパネ
ルはブロットとリボソームタンパク質Ｌ３２のプローブ
との再ハイブリダイゼーションを示す（負荷対照）。
２受容体転写物の大きさの分析を示す。各レーンにつき
４μｇのポリＡ＋ＲＮＡを泳動させた。レーン１〜４お
よび５〜８は同一の負荷を表す。レーン１〜４は該受容
体の全長ｃＤＮＡをプローブとして検出し、レーン５〜
８は該受容体の細胞質部分にのみ対応するプローブを用
いて検出した。レーン１，５：刺激していない末梢血単
核細胞（ＰＢＭＣ）。レーン２，３，６，７：ＰＨＡで
刺激したＰＢＭＣ。レーン２と６はレーン１と５に示し
たサンプルの３日間の誘導を示す。レーン３と７のサン
プルは独立した４日間のＰＨＡ誘導から得られ、そして
レーン４と８はＫ６細胞由来のＲＮＡを表す。下のパネ
ルはブロットとリボソームタンパク質Ｌ３２のプローブ
との再ハイブリダイゼーションを示す（負荷対照）。
【００１２】図８は、マウス抗ＩＬ−１２Ｒ抗血清によ
るＩＬ−１２受容体（ＩＬ−１２Ｒ）への 125Ｉ−ＩＬ
−１２結合の阻害を示す。図９は、親和性架橋結合によ
るＩＬ−１２Ｒ陽性ヒト細胞上のＩＬ−１２結合タンパ
ク質の特性決定を示す。図10は、抗ＩＬ−１２Ｒ抗体に
よる可溶化 125Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ架橋結合
複合体の免疫沈降を示す。
るＩＬ−１２受容体（ＩＬ−１２Ｒ）への 125Ｉ−ＩＬ
−１２結合の阻害を示す。図９は、親和性架橋結合によ
るＩＬ−１２Ｒ陽性ヒト細胞上のＩＬ−１２結合タンパ
ク質の特性決定を示す。図10は、抗ＩＬ−１２Ｒ抗体に
よる可溶化 125Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ架橋結合
複合体の免疫沈降を示す。
【００１３】図11は、室温でのＰＨＡ活性化ＰＢＭＣへ
の 125Ｉ−２−４Ｅ６の平衡結合を示す。図12は、室温
でのヒトＫ６細胞への 125Ｉ−２−４Ｅ６の平衡結合を
示す。図13は、精製２−４Ｅ６（２４Ｅ６）、ヒトＩＬ
−１２（ＨＵＩＬ−１２）および対照抗体（対照Ｉｇ
Ｇ）によるＫ６細胞への 125Ｉ−２−４Ｅ６結合の阻害
を示す。
の 125Ｉ−２−４Ｅ６の平衡結合を示す。図12は、室温
でのヒトＫ６細胞への 125Ｉ−２−４Ｅ６の平衡結合を
示す。図13は、精製２−４Ｅ６（２４Ｅ６）、ヒトＩＬ
−１２（ＨＵＩＬ−１２）および対照抗体（対照Ｉｇ
Ｇ）によるＫ６細胞への 125Ｉ−２−４Ｅ６結合の阻害
を示す。
【００１４】図14は、室温でのヒトＫ６細胞への 125Ｉ
−ＩＬ−１２の平衡結合を示す。図15は、Ｋ６細胞由来
の界面活性剤可溶化ＩＬ−１２Ｒへの 125Ｉ−ＩＬ−１
２の平衡結合を示す。図16は、モノクローナル抗体２−
４Ｅ６による界面活性剤可溶化ＩＬ−１２Ｒのウエスタ
ンブロット分析を示す。
−ＩＬ−１２の平衡結合を示す。図15は、Ｋ６細胞由来
の界面活性剤可溶化ＩＬ−１２Ｒへの 125Ｉ−ＩＬ−１
２の平衡結合を示す。図16は、モノクローナル抗体２−
４Ｅ６による界面活性剤可溶化ＩＬ−１２Ｒのウエスタ
ンブロット分析を示す。
【００１５】図17は、フローサイトメトリーによるヒト
細胞上のＩＬ−１２受容体の検出を示す。図18は、トラ
ンスフェクションを行ったＣＯＳおよびＣＴＬＬ細胞の
表面に存在するＩＬ−１２受容体サブユニットの大きさ
を示す。８％ゲルを使用し、マーカーのサイズをｋＤａ
で示す。レーン１〜４：非還元条件下での親和性架橋結
合複合体の分析。矢じり＝標識した非架橋２−４Ｅ６抗
体。矢じるし＝標識した非架橋ＩＬ−１２。レーン５〜
12： 125Ｉ−ＣＯＳ細胞表面タンパク質の分析。サンプ
ルの還元、分析前の細胞への２５ｎＭ未標識ＩＬ−１２
の結合、および１ｍＭのＤＴＳＳＰ架橋剤の使用をレー
ンの下に示してある。レーン13〜16： 125Ｉ−ＣＴＬＬ
細胞表面タンパク質の分析。
細胞上のＩＬ−１２受容体の検出を示す。図18は、トラ
ンスフェクションを行ったＣＯＳおよびＣＴＬＬ細胞の
表面に存在するＩＬ−１２受容体サブユニットの大きさ
を示す。８％ゲルを使用し、マーカーのサイズをｋＤａ
で示す。レーン１〜４：非還元条件下での親和性架橋結
合複合体の分析。矢じり＝標識した非架橋２−４Ｅ６抗
体。矢じるし＝標識した非架橋ＩＬ−１２。レーン５〜
12： 125Ｉ−ＣＯＳ細胞表面タンパク質の分析。サンプ
ルの還元、分析前の細胞への２５ｎＭ未標識ＩＬ−１２
の結合、および１ｍＭのＤＴＳＳＰ架橋剤の使用をレー
ンの下に示してある。レーン13〜16： 125Ｉ−ＣＴＬＬ
細胞表面タンパク質の分析。
【００１６】図19は、２−４Ｅ６でトランスフェクトし
たＣＯＳ細胞に対してつくられた抗ＩＬ−１２Ｒ抗血清
（黒丸）、抗ＩＬ−１２Ｒ抗血清をつくるために使用し
たラットから得た免疫前血清（白丸）、およびヒトII型
ＩＬ−１ＲでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞に対して
つくられたラット抗血清（黒四角）における抗ＣＯＳ細
胞抗体のフローサイトメトリーによる滴定を示す。
たＣＯＳ細胞に対してつくられた抗ＩＬ−１２Ｒ抗血清
（黒丸）、抗ＩＬ−１２Ｒ抗血清をつくるために使用し
たラットから得た免疫前血清（白丸）、およびヒトII型
ＩＬ−１ＲでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞に対して
つくられたラット抗血清（黒四角）における抗ＣＯＳ細
胞抗体のフローサイトメトリーによる滴定を示す。
【００１７】図20は、ＩＬ−１２により誘導されるＰＨ
Ａ活性化ＰＢＭＣの増殖に及ぼすラット血清の影響を示
す。標準誤差は平均の１０％未満であった。図21は、Ｉ
Ｌ−２により誘導されるＰＨＡ活性化ＰＢＭＣの増殖に
及ぼすラット血清の影響を示す。標準誤差は平均の１０
％未満であった。図22は、ＩＬ−７により誘導されるＰ
ＨＡ活性化ＰＢＭＣの増殖に及ぼすラット血清の影響を
示す。標準誤差は平均の１０％未満であった。
Ａ活性化ＰＢＭＣの増殖に及ぼすラット血清の影響を示
す。標準誤差は平均の１０％未満であった。図21は、Ｉ
Ｌ−２により誘導されるＰＨＡ活性化ＰＢＭＣの増殖に
及ぼすラット血清の影響を示す。標準誤差は平均の１０
％未満であった。図22は、ＩＬ−７により誘導されるＰ
ＨＡ活性化ＰＢＭＣの増殖に及ぼすラット血清の影響を
示す。標準誤差は平均の１０％未満であった。
【００１８】図23は、ＩＬ−１２受容体サブユニットを
発現するＣＯＳ細胞への 125Ｉ−ＩＬ−１２の平衡結合
を示す。Ａ）ヒトＩＬ−１２およびＢ）マウスＩＬ−１
２。挿入図はスキャッチャードの方法による結合データ
の分析を示す。本発明はインターロイキン−１２（ＩＬ
−１２）の低親和性受容体に関する。本発明は対立遺伝
子変異体およびサブユニットを含む均一な天然ＩＬ−１
２受容体並びにその機能性誘導体（つまり、ＩＬ−１２
との結合活性を有する天然ＩＬ−１２受容体の断片を含
むタンパク質）を含むものである。さらに、本発明は組
換えＩＬ−１２受容体タンパク質並びに融合タンパク質
（すなわち、天然ＩＬ−１２受容体のアミノ酸配列また
はその部分配列と他のタンパク質から誘導されたアミノ
酸配列とからなるＩＬ−１２受容体の誘導体）を含むも
のである。本発明のタンパク質またはポリペプチドは、
以下の実施例に記載する標準検定で測定した際に、ＩＬ
−１２への結合活性を示す。
発現するＣＯＳ細胞への 125Ｉ−ＩＬ−１２の平衡結合
を示す。Ａ）ヒトＩＬ−１２およびＢ）マウスＩＬ−１
２。挿入図はスキャッチャードの方法による結合データ
の分析を示す。本発明はインターロイキン−１２（ＩＬ
−１２）の低親和性受容体に関する。本発明は対立遺伝
子変異体およびサブユニットを含む均一な天然ＩＬ−１
２受容体並びにその機能性誘導体（つまり、ＩＬ−１２
との結合活性を有する天然ＩＬ−１２受容体の断片を含
むタンパク質）を含むものである。さらに、本発明は組
換えＩＬ−１２受容体タンパク質並びに融合タンパク質
（すなわち、天然ＩＬ−１２受容体のアミノ酸配列また
はその部分配列と他のタンパク質から誘導されたアミノ
酸配列とからなるＩＬ−１２受容体の誘導体）を含むも
のである。本発明のタンパク質またはポリペプチドは、
以下の実施例に記載する標準検定で測定した際に、ＩＬ
−１２への結合活性を示す。
【００１９】本発明の好ましい面はヒトの低親和性ＩＬ
−１２受容体タンパク質またはそのサブユニットに関
し、より好ましくは配列番号：２または配列番号：３の
アミノ酸配列を有するヒトＩＬ−１２受容体タンパク質
に関する。また、本発明は可溶性形態のＩＬ−１２受容
体、好ましくはＩＬ−１２結合活性を示すタンパク質を
含み、該タンパク質は配列番号：２または配列番号：３
のアミノ酸配列を有するか、または末端切断型のＩＬ−
１２受容体タンパク質をコードするその部分配列を有す
る。可溶性形態のＩＬ−１２受容体は当業界で公知の方
法により調製することができ、例えばＩＬ−１２受容体
を発現する細胞の培地から可溶性ＩＬ−１２受容体タン
パク質を単離するか、ＩＬ−１２受容体タンパク質を化
学的にまたは酵素的に開裂するか、あるいは組換えＤＮ
Ａ技術を用いる。
−１２受容体タンパク質またはそのサブユニットに関
し、より好ましくは配列番号：２または配列番号：３の
アミノ酸配列を有するヒトＩＬ−１２受容体タンパク質
に関する。また、本発明は可溶性形態のＩＬ−１２受容
体、好ましくはＩＬ−１２結合活性を示すタンパク質を
含み、該タンパク質は配列番号：２または配列番号：３
のアミノ酸配列を有するか、または末端切断型のＩＬ−
１２受容体タンパク質をコードするその部分配列を有す
る。可溶性形態のＩＬ−１２受容体は当業界で公知の方
法により調製することができ、例えばＩＬ−１２受容体
を発現する細胞の培地から可溶性ＩＬ−１２受容体タン
パク質を単離するか、ＩＬ−１２受容体タンパク質を化
学的にまたは酵素的に開裂するか、あるいは組換えＤＮ
Ａ技術を用いる。
【００２０】精製した受容体（好ましくは、可溶性形
態）は治療に利用できる可能性がある。可溶性ＩＬ−１
２受容体を添加すると、インターロイキン分子が細胞膜
に自由に結合することができないので、該分子の細胞へ
の作用が妨げられる。それ故、本発明の一面は、ＩＬ−
１２受容体を有する細胞の過度の活性によって引き起こ
される病理学的症状を、該細胞へのＩＬ−１２の結合を
阻止するのに十分な量の可溶性ＩＬ−１２受容体を投与
することにより治療することに関する。この方法論をさ
らに発展させて、可溶性受容体を薬剤のスクリーニング
剤として用いてもよい。簡単に述べると、ＩＬ−１２受
容体へのＩＬ−１２結合の阻止によってＩＬ−１２アン
タゴニストとして作用する薬剤をスクリーニングするこ
とができる。ある物質がin vivo で有効であるか否かを
調べる前に、可能性のある薬剤と共に精製ＩＬ−１２受
容体を用いて結合が起こるかどうかを判定する。結合が
起こらなければ、その薬剤はもはや希望の候補薬剤とは
なり得ない。結合が実際に起こったならば、更なる試験
が実施される。
態）は治療に利用できる可能性がある。可溶性ＩＬ−１
２受容体を添加すると、インターロイキン分子が細胞膜
に自由に結合することができないので、該分子の細胞へ
の作用が妨げられる。それ故、本発明の一面は、ＩＬ−
１２受容体を有する細胞の過度の活性によって引き起こ
される病理学的症状を、該細胞へのＩＬ−１２の結合を
阻止するのに十分な量の可溶性ＩＬ−１２受容体を投与
することにより治療することに関する。この方法論をさ
らに発展させて、可溶性受容体を薬剤のスクリーニング
剤として用いてもよい。簡単に述べると、ＩＬ−１２受
容体へのＩＬ−１２結合の阻止によってＩＬ−１２アン
タゴニストとして作用する薬剤をスクリーニングするこ
とができる。ある物質がin vivo で有効であるか否かを
調べる前に、可能性のある薬剤と共に精製ＩＬ−１２受
容体を用いて結合が起こるかどうかを判定する。結合が
起こらなければ、その薬剤はもはや希望の候補薬剤とは
なり得ない。結合が実際に起こったならば、更なる試験
が実施される。
【００２１】本発明のＩＬ−１２受容体タンパク質には
天然に存在しないＩＬ−１２受容体の類似タンパク質ま
たは変異体も含まれる。この種の機能性誘導体は、天然
ＩＬ−１２受容体またはその断片の１個以上のアミノ酸
がＩＬ−１２受容体の結合活性を失うことなく置換もし
くは欠失されているタンパク質のことである。かかる類
似体はペプチド化学の公知方法により、あるいは組換え
ＤＮＡ技術により調製することができる。
天然に存在しないＩＬ−１２受容体の類似タンパク質ま
たは変異体も含まれる。この種の機能性誘導体は、天然
ＩＬ−１２受容体またはその断片の１個以上のアミノ酸
がＩＬ−１２受容体の結合活性を失うことなく置換もし
くは欠失されているタンパク質のことである。かかる類
似体はペプチド化学の公知方法により、あるいは組換え
ＤＮＡ技術により調製することができる。
【００２２】用語「ＩＬ−１２受容体タンパク質」は、
アミノ酸残基上に側鎖として存在する官能基から、もし
くはＮまたはＣ末端基から公知の方法で製造される誘導
体をも含み、それらが薬学的に許容される限り、すなわ
ちそれらが該タンパク質の活性を破壊せず、それを含有
する組成物に毒性を付与しない限り本発明に含まれるも
のとする。これら誘導体として、例えば抗原部位をマス
クして体液中のインターロイキン−１２受容体タンパク
質の滞留時間を引き延ばすことができるポリエチレング
リコール側鎖がある。その他の誘導体としては、カルボ
キシル基の脂肪族エステル、アンモニアとの反応あるい
は第一アミンまたは第二アミンとの反応によるカルボキ
シル基のアミド、アシル成分（例えば、アルカノイル基
または炭素環式アロイル基）により形成されるアミノ酸
残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、あるいはアシ
ル成分により形成される遊離ヒドロキシル基（例えば、
セリルまたはトレオニル残基の遊離ヒドロキシル基）の
Ｏ−アシル誘導体を挙げることができる。
アミノ酸残基上に側鎖として存在する官能基から、もし
くはＮまたはＣ末端基から公知の方法で製造される誘導
体をも含み、それらが薬学的に許容される限り、すなわ
ちそれらが該タンパク質の活性を破壊せず、それを含有
する組成物に毒性を付与しない限り本発明に含まれるも
のとする。これら誘導体として、例えば抗原部位をマス
クして体液中のインターロイキン−１２受容体タンパク
質の滞留時間を引き延ばすことができるポリエチレング
リコール側鎖がある。その他の誘導体としては、カルボ
キシル基の脂肪族エステル、アンモニアとの反応あるい
は第一アミンまたは第二アミンとの反応によるカルボキ
シル基のアミド、アシル成分（例えば、アルカノイル基
または炭素環式アロイル基）により形成されるアミノ酸
残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、あるいはアシ
ル成分により形成される遊離ヒドロキシル基（例えば、
セリルまたはトレオニル残基の遊離ヒドロキシル基）の
Ｏ−アシル誘導体を挙げることができる。
【００２３】本発明は、また、ＩＬ−１２受容体をコー
ドするクローン化ＤＮＡ配列および上記のタンパク質を
コードするポリヌクレオチド（ＩＬ−１２受容体をコー
ドするｃＤＮＡに相当する配列を含む）、ＩＬ−１２受
容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有す
る組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された
微生物、並びに該タンパク質、ポリヌクレオチドおよび
ベクターの作製方法に関する。
ドするクローン化ＤＮＡ配列および上記のタンパク質を
コードするポリヌクレオチド（ＩＬ−１２受容体をコー
ドするｃＤＮＡに相当する配列を含む）、ＩＬ−１２受
容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有す
る組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された
微生物、並びに該タンパク質、ポリヌクレオチドおよび
ベクターの作製方法に関する。
【００２４】用語「ＩＬ−１２受容体をコードするｃＤ
ＮＡに相当する配列を含むポリヌクレオチド」とは、Ｉ
Ｌ−１２受容体をコードする配列に相同であるかまたは
相補性である配列を含むポリヌクレオチドを指す。ｃＤ
ＮＡに対する相同度は約８０％以上、好ましくは約９０
％以上であろう。本発明の実施に際しては、特に指示さ
れない限り、当業者の技術の範囲内である分子生物学、
微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技法が用
いられる。かかる技法は文献に詳述されている。例え
ば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Clonin
g; a Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor L
aboratory Press, 1989 を参照されたい。
ＮＡに相当する配列を含むポリヌクレオチド」とは、Ｉ
Ｌ−１２受容体をコードする配列に相同であるかまたは
相補性である配列を含むポリヌクレオチドを指す。ｃＤ
ＮＡに対する相同度は約８０％以上、好ましくは約９０
％以上であろう。本発明の実施に際しては、特に指示さ
れない限り、当業者の技術の範囲内である分子生物学、
微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技法が用
いられる。かかる技法は文献に詳述されている。例え
ば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Clonin
g; a Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor L
aboratory Press, 1989 を参照されたい。
【００２５】本発明のＤＮＡ配列およびＤＮＡ分子は種
々の宿主−ベクターの組合せを用いて発現させることが
できる。例えば、有効な発現ベクターは染色体の、非染
色体のまたは合成のＤＮＡ配列のセグメントから構成さ
れたものであってよい。この種のベクターの例として、
ウイルスベクター（例えば、公知のＳＶ４０の各種誘導
体）、細菌ベクター（例えば、大腸菌由来のプラスミ
ド）、ファージＤＮＡ（例えば、ファージλ、Ｍ１３お
よび他の繊維状一本鎖ＤＮＡファージの各種誘導体）、
並びに酵母用のベクター（例えば、２μプラスミド）、
真核細胞用のベクター、好ましくは動物細胞用のベクタ
ー（例えば、ＳＶ４０、アデノウイルスおよび／または
レトロウイルス由来のＤＮＡ配列を含むもの）がある。
々の宿主−ベクターの組合せを用いて発現させることが
できる。例えば、有効な発現ベクターは染色体の、非染
色体のまたは合成のＤＮＡ配列のセグメントから構成さ
れたものであってよい。この種のベクターの例として、
ウイルスベクター（例えば、公知のＳＶ４０の各種誘導
体）、細菌ベクター（例えば、大腸菌由来のプラスミ
ド）、ファージＤＮＡ（例えば、ファージλ、Ｍ１３お
よび他の繊維状一本鎖ＤＮＡファージの各種誘導体）、
並びに酵母用のベクター（例えば、２μプラスミド）、
真核細胞用のベクター、好ましくは動物細胞用のベクタ
ー（例えば、ＳＶ４０、アデノウイルスおよび／または
レトロウイルス由来のＤＮＡ配列を含むもの）がある。
【００２６】本発明の一面は、上記のような低親和性の
インターロイキン−１２受容体をコードするＤＮＡ分子
の作製方法に関し、該方法は、ａ）抗インターロイキン
−１２受容体抗体を製造し、ｂ）ｃＤＮＡライブラリー
の発現産物を該抗体によりスクリーニングし、ｃ）イン
ターロイキン−１２受容体のｃＤＮＡを同定および単離
し、そしてｄ）場合により、機能性誘導体をコードする
ＤＮＡ分子を作製することを特徴としている。本発明の
別の面は、上記のような低親和性のインターロイキン−
１２受容体タンパク質の生産方法に関し、該方法は、
ａ）低親和性のインターロイキン−１２受容体タンパク
質をコードするクローン化遺伝子を含むベクターで細胞
を形質転換し、ｂ）該タンパク質を発現させ、ｃ）該タ
ンパク質を回収し、所望により、それをその機能性誘導
体に変換することを特徴としている。
インターロイキン−１２受容体をコードするＤＮＡ分子
の作製方法に関し、該方法は、ａ）抗インターロイキン
−１２受容体抗体を製造し、ｂ）ｃＤＮＡライブラリー
の発現産物を該抗体によりスクリーニングし、ｃ）イン
ターロイキン−１２受容体のｃＤＮＡを同定および単離
し、そしてｄ）場合により、機能性誘導体をコードする
ＤＮＡ分子を作製することを特徴としている。本発明の
別の面は、上記のような低親和性のインターロイキン−
１２受容体タンパク質の生産方法に関し、該方法は、
ａ）低親和性のインターロイキン−１２受容体タンパク
質をコードするクローン化遺伝子を含むベクターで細胞
を形質転換し、ｂ）該タンパク質を発現させ、ｃ）該タ
ンパク質を回収し、所望により、それをその機能性誘導
体に変換することを特徴としている。
【００２７】ここで用いる「ＤＮＡ配列」とは、独立し
た断片の形の、または大きいＤＮＡ構築物の成分として
のＤＮＡポリマーを指し、標準的な生化学的手法（例え
ば、クローニングベクターの使用）によりＤＮＡ配列お
よびその成分ヌクレオチド配列の同定、操作および回収
を可能にする量および濃度で、実質的に純粋な形で、つ
まり内因性物質の混入なしで、少なくとも一度単離され
たＤＮＡから誘導されたＤＮＡポリマーのことである。
このような配列は、真核生物の遺伝子中に一般に存在す
る内部非翻訳配列つまりイントロンによって分断されて
いないオープン・リーディング・フレームの形で提供さ
れることが好ましい。しかし、対象の配列を含むゲノム
ＤＮＡも使えることは明らかだろう。非翻訳ＤＮＡの配
列はオープン・リーディング・フレームの５’側または
３’側に存在してよいが、その場合はコード領域の操作
または発現を妨げないものである。
た断片の形の、または大きいＤＮＡ構築物の成分として
のＤＮＡポリマーを指し、標準的な生化学的手法（例え
ば、クローニングベクターの使用）によりＤＮＡ配列お
よびその成分ヌクレオチド配列の同定、操作および回収
を可能にする量および濃度で、実質的に純粋な形で、つ
まり内因性物質の混入なしで、少なくとも一度単離され
たＤＮＡから誘導されたＤＮＡポリマーのことである。
このような配列は、真核生物の遺伝子中に一般に存在す
る内部非翻訳配列つまりイントロンによって分断されて
いないオープン・リーディング・フレームの形で提供さ
れることが好ましい。しかし、対象の配列を含むゲノム
ＤＮＡも使えることは明らかだろう。非翻訳ＤＮＡの配
列はオープン・リーディング・フレームの５’側または
３’側に存在してよいが、その場合はコード領域の操作
または発現を妨げないものである。
【００２８】ここで用いる「発現ベクター」は、(1) 遺
伝子発現の調節的役割を果たしている１以上の遺伝要素
（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）；(2) ｍ
ＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造または
コード配列；および(3) 適当な転写および翻訳開始配列
並びに転写および翻訳終結配列；の構成からなる転写単
位を含むプラスミドを指す。種々の真核細胞発現系での
使用が意図される構成要素には、宿主細胞による翻訳タ
ンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含め
ることが好ましい。これとは別に、組換えタンパク質を
リーダーまたは輸送配列の不在下で発現させる場合は、
Ｎ末端にメチオニン残基を含めてもよい。その後、場合
により、この残基を発現組換えタンパク質から切り取っ
て最終産物を得ることができる。
伝子発現の調節的役割を果たしている１以上の遺伝要素
（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）；(2) ｍ
ＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造または
コード配列；および(3) 適当な転写および翻訳開始配列
並びに転写および翻訳終結配列；の構成からなる転写単
位を含むプラスミドを指す。種々の真核細胞発現系での
使用が意図される構成要素には、宿主細胞による翻訳タ
ンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含め
ることが好ましい。これとは別に、組換えタンパク質を
リーダーまたは輸送配列の不在下で発現させる場合は、
Ｎ末端にメチオニン残基を含めてもよい。その後、場合
により、この残基を発現組換えタンパク質から切り取っ
て最終産物を得ることができる。
【００２９】ＤＮＡ配列の発現に用いられる宿主細胞は
公知の各種宿主から選ばれる。このような宿主の例は原
核または真核細胞である。多くの宿主がアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）またはド
イッチェ・サムルング・フィール・ミクロオルガニスメ
ン（ＤＳＭ）といった寄託機関から入手可能である。原
核細胞宿主の例としては大腸菌、枯草菌などの細菌株が
ある。好ましい宿主はＳＶ４０を用いて形質転換したア
フリカミドリザルの腎細胞系ＣＯＳのような哺乳動物細
胞である。
公知の各種宿主から選ばれる。このような宿主の例は原
核または真核細胞である。多くの宿主がアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）またはド
イッチェ・サムルング・フィール・ミクロオルガニスメ
ン（ＤＳＭ）といった寄託機関から入手可能である。原
核細胞宿主の例としては大腸菌、枯草菌などの細菌株が
ある。好ましい宿主はＳＶ４０を用いて形質転換したア
フリカミドリザルの腎細胞系ＣＯＳのような哺乳動物細
胞である。
【００３０】本発明のＤＮＡ配列を用いて形質転換した
原核および真核細胞宿主の発酵により生産されたＩＬ−
１２受容体は、その後、公知の方法で実質的に均一にな
るまで精製されるが、かかる方法には、例えば、異なる
速度での遠心分離、硫酸アンモニウムによる沈降、透析
（常圧または減圧で実施）、分離用等電点電気泳動、分
離用ゲル電気泳動、または各種のクロマトグラフィー
法、例えばゲル濾過、高性能液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、逆相ク
ロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラ
フィー（例えば、SepharoseTM Blue CL-6B または担体
に結合させたモノクローナル抗体を使用）がある。
原核および真核細胞宿主の発酵により生産されたＩＬ−
１２受容体は、その後、公知の方法で実質的に均一にな
るまで精製されるが、かかる方法には、例えば、異なる
速度での遠心分離、硫酸アンモニウムによる沈降、透析
（常圧または減圧で実施）、分離用等電点電気泳動、分
離用ゲル電気泳動、または各種のクロマトグラフィー
法、例えばゲル濾過、高性能液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、逆相ク
ロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラ
フィー（例えば、SepharoseTM Blue CL-6B または担体
に結合させたモノクローナル抗体を使用）がある。
【００３１】細胞表面にあるＩＬ−１２受容体サブユニ
ットの大きさは標識ＩＬ−１２の親和性架橋結合実験と
細胞表面ラベリング実験により概算された。トランスフ
ェクションを行ったＣＯＳ細胞はＩＬ−１２受容体サブ
ユニットを約１００ｋＤａの大きさのタンパク質として
発現する。該タンパク質の成熟型について計算した分子
量は７０，４２６である。かくして、表面に発現された
タンパク質の分子量の約２５％が炭水化物であるよう
だ。トランスフェクションを行ったＣＯＳ細胞はより大
きい分子量型のＩＬ−１２受容体サブユニットも発現す
る。
ットの大きさは標識ＩＬ−１２の親和性架橋結合実験と
細胞表面ラベリング実験により概算された。トランスフ
ェクションを行ったＣＯＳ細胞はＩＬ−１２受容体サブ
ユニットを約１００ｋＤａの大きさのタンパク質として
発現する。該タンパク質の成熟型について計算した分子
量は７０，４２６である。かくして、表面に発現された
タンパク質の分子量の約２５％が炭水化物であるよう
だ。トランスフェクションを行ったＣＯＳ細胞はより大
きい分子量型のＩＬ−１２受容体サブユニットも発現す
る。
【００３２】ＩＬ−１２受容体のダイマー化／オリゴマ
ー化はＩＬ−１２の結合とは無関係であることを支持す
る証拠がある。これらの知見と同様に、ＥＰＯ受容体に
関して、ジスルフィド結合したダイマーおよびオリゴマ
ーが形成され、そしてＥＰＯ刺激は該受容体のダイマー
化に対して認めうる程度の影響を及ぼさないことが報告
されている（O. Miura et al. (1993) Archives Bioche
m. Biophys., 306, 200 ）。本発明者らのデータも、Ｉ
Ｌ−１２受容体のダイマー／オリゴマーだけがＩＬ−１
２と２〜５ｎＭの親和性（トランスフェクションを行っ
た無傷のＣＯＳ細胞で測定した）でもって結合すること
を示す。すなわち、ｉ）抗ＩＬ−１２抗体は１つのＩＬ
−１２と受容体ダイマー／オリゴマーからなる親和性架
橋結合複合体のみを免疫沈降させる。ii) １つの受容体
サブユニットと１つのＩＬ−１２について予測される大
きさの親和性架橋結合複合体は、トランスフェクション
を行ったＣＯＳ細胞で測定されたＫD に一致するＩＬ−
１２濃度できわめて非効率的にしか形成されない。iii)
該受容体サブユニットを安定して発現するマウスＣＴＬ
Ｌ細胞はきわめて非効率的にしかＩＬ−１２と結合しな
い（概算ＫD ＝５０ｎＭまたはそれ以下）。これらの細
胞もサブユニットのダイマー／オリゴマーを発現しな
い。ＣＯＳ細胞とＣＴＬＬ細胞がＩＬ−１２の結合を可
能にするようなやり方でＩＬ−１２受容体サブユニット
を発現する能力の点で相違するとは予測できないことで
あった。これはおそらく種特異性によるものだろう。つ
まり、マウスＣＴＬＬ細胞はなぜかヒトＩＬ−１２受容
体タンパク質を正しく「プロセシング」することができ
ず、その結果として効率の悪いダイマー化／オリゴマー
化およびＩＬ−１２の結合が生じるのだろう。ことによ
ると、ＣＯＳ細胞はＩＬ−１２受容体のダイマー化／オ
リゴマー化を起こさせる内因性タンパク質を発現するの
かもしれない。採用した実験条件下では、トランスフェ
クションを行ったＣＯＳ細胞あたりの低親和性ＩＬ−１
２受容体部位の数は常に１０5 より大であることから、
内因性のＣＯＳ細胞成分が該受容体サブユニットとダイ
マーまたはオリゴマーを形成する可能性はなさそうだ。
ー化はＩＬ−１２の結合とは無関係であることを支持す
る証拠がある。これらの知見と同様に、ＥＰＯ受容体に
関して、ジスルフィド結合したダイマーおよびオリゴマ
ーが形成され、そしてＥＰＯ刺激は該受容体のダイマー
化に対して認めうる程度の影響を及ぼさないことが報告
されている（O. Miura et al. (1993) Archives Bioche
m. Biophys., 306, 200 ）。本発明者らのデータも、Ｉ
Ｌ−１２受容体のダイマー／オリゴマーだけがＩＬ−１
２と２〜５ｎＭの親和性（トランスフェクションを行っ
た無傷のＣＯＳ細胞で測定した）でもって結合すること
を示す。すなわち、ｉ）抗ＩＬ−１２抗体は１つのＩＬ
−１２と受容体ダイマー／オリゴマーからなる親和性架
橋結合複合体のみを免疫沈降させる。ii) １つの受容体
サブユニットと１つのＩＬ−１２について予測される大
きさの親和性架橋結合複合体は、トランスフェクション
を行ったＣＯＳ細胞で測定されたＫD に一致するＩＬ−
１２濃度できわめて非効率的にしか形成されない。iii)
該受容体サブユニットを安定して発現するマウスＣＴＬ
Ｌ細胞はきわめて非効率的にしかＩＬ−１２と結合しな
い（概算ＫD ＝５０ｎＭまたはそれ以下）。これらの細
胞もサブユニットのダイマー／オリゴマーを発現しな
い。ＣＯＳ細胞とＣＴＬＬ細胞がＩＬ−１２の結合を可
能にするようなやり方でＩＬ−１２受容体サブユニット
を発現する能力の点で相違するとは予測できないことで
あった。これはおそらく種特異性によるものだろう。つ
まり、マウスＣＴＬＬ細胞はなぜかヒトＩＬ−１２受容
体タンパク質を正しく「プロセシング」することができ
ず、その結果として効率の悪いダイマー化／オリゴマー
化およびＩＬ−１２の結合が生じるのだろう。ことによ
ると、ＣＯＳ細胞はＩＬ−１２受容体のダイマー化／オ
リゴマー化を起こさせる内因性タンパク質を発現するの
かもしれない。採用した実験条件下では、トランスフェ
クションを行ったＣＯＳ細胞あたりの低親和性ＩＬ−１
２受容体部位の数は常に１０5 より大であることから、
内因性のＣＯＳ細胞成分が該受容体サブユニットとダイ
マーまたはオリゴマーを形成する可能性はなさそうだ。
【００３３】ＩＬ−１２受容体サブユニットはヘモポエ
チン (hemopoietin)受容体スーパーファミリーのメンバ
ーである。このファミリー内で、それは全長にわたって
ｇｐ１３０とＧ−ＣＳＦおよびＬＩＦの受容体とに最も
密接な関係がある。ＩＬ−１２受容体サブユニットの細
胞外部分も、ｇｐ１３０について報告されたもの（M.Hi
bi et al. (1990) Cell, 63, 1149）と同様に、５つの
フィブロネクチンIII型反復配列に分割することができ
る。ＩＬ−１２受容体およびｇｐ１３０のリガンド、す
なわちＩＬ−１２ｐ４０とＩＬ−６受容体もこのような
フィブロネクチンIII 型反復配列を含んでいることに留
意することはおもしろいだろう（Hibi et al.,前掲; Sc
hoenhaut et al. (1992) J. Immunol., 148, 3433 ）。
ＩＬ−１２受容体サブユニットの細胞質部分のいくつか
の特徴をさらに解説する値打ちがある。ｇｐ１３０（２
７６個のアミノ酸）およびＬＩＦの受容体（２３７個の
アミノ酸）の対応領域と比べて、それはむしろ短い。し
かし、突然変異誘発実験から、ｇｐ１３０については、
シグナルを変換するのに約１００個のアミノ酸だけで十
分であることがわかった（Murakami et al. (1991) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 11349）。ＩＬ−１２受
容体の細胞質部分の可能な機能性は、他の機能性造血受
容体（とりわけＧ−ＣＳＦ、ＥＰＯおよびＧＭ−ＣＳＦ
の受容体）において保存された多くの特徴の存在によっ
て裏付けられると思われる。保存領域１および２（Mura
kami et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,
11349）が明らかに存在し、かくして低親和性ＩＬ−１
２受容体成分にβ型サブユニットの構造を付与する（N.
Stahl et al., 1993, Cell, 74:587 ）。
チン (hemopoietin)受容体スーパーファミリーのメンバ
ーである。このファミリー内で、それは全長にわたって
ｇｐ１３０とＧ−ＣＳＦおよびＬＩＦの受容体とに最も
密接な関係がある。ＩＬ−１２受容体サブユニットの細
胞外部分も、ｇｐ１３０について報告されたもの（M.Hi
bi et al. (1990) Cell, 63, 1149）と同様に、５つの
フィブロネクチンIII型反復配列に分割することができ
る。ＩＬ−１２受容体およびｇｐ１３０のリガンド、す
なわちＩＬ−１２ｐ４０とＩＬ−６受容体もこのような
フィブロネクチンIII 型反復配列を含んでいることに留
意することはおもしろいだろう（Hibi et al.,前掲; Sc
hoenhaut et al. (1992) J. Immunol., 148, 3433 ）。
ＩＬ−１２受容体サブユニットの細胞質部分のいくつか
の特徴をさらに解説する値打ちがある。ｇｐ１３０（２
７６個のアミノ酸）およびＬＩＦの受容体（２３７個の
アミノ酸）の対応領域と比べて、それはむしろ短い。し
かし、突然変異誘発実験から、ｇｐ１３０については、
シグナルを変換するのに約１００個のアミノ酸だけで十
分であることがわかった（Murakami et al. (1991) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 11349）。ＩＬ−１２受
容体の細胞質部分の可能な機能性は、他の機能性造血受
容体（とりわけＧ−ＣＳＦ、ＥＰＯおよびＧＭ−ＣＳＦ
の受容体）において保存された多くの特徴の存在によっ
て裏付けられると思われる。保存領域１および２（Mura
kami et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,
11349）が明らかに存在し、かくして低親和性ＩＬ−１
２受容体成分にβ型サブユニットの構造を付与する（N.
Stahl et al., 1993, Cell, 74:587 ）。
【００３４】ＩＬ−１２受容体のｃＤＮＡは次の目的に
有効である。組換えＩＬ−１２受容体タンパク質の高レ
ベル発現および抗原としてのその使用は更なるモノクロ
ーナルおよびポリクローナル中和抗体の生産を可能にす
る。かかる中和抗体をin vivo モデルで使用して、ＩＬ
−１２とその受容体が正常および病的な免疫反応（すな
わち、自己免疫疾患、移植片対宿主病および慢性関節リ
ウマチのような活性化されたＴ細胞やＮＫ細胞によって
悪化する病状）において果たしている役割を解明するこ
とができる。
有効である。組換えＩＬ−１２受容体タンパク質の高レ
ベル発現および抗原としてのその使用は更なるモノクロ
ーナルおよびポリクローナル中和抗体の生産を可能にす
る。かかる中和抗体をin vivo モデルで使用して、ＩＬ
−１２とその受容体が正常および病的な免疫反応（すな
わち、自己免疫疾患、移植片対宿主病および慢性関節リ
ウマチのような活性化されたＴ細胞やＮＫ細胞によって
悪化する病状）において果たしている役割を解明するこ
とができる。
【００３５】ＩＬ−１２受容体タンパク質は、例えばヒ
トの免疫反応を抑制する目的で投与することができる。
多様な疾病または症状が同種異系拒絶反応および移植片
対宿主反応を含めた同種異系抗原に対する免疫反応によ
って引き起こされる。同種異系抗原によって誘導される
免疫反応では、ＩＬ−１２受容体がＴ細胞の活性化によ
り生じるリンパ増殖および炎症を抑えることができる。
従って、ＩＬ−１２受容体は、例えば同種異系移植（例
えば、皮膚、腎臓および心臓移植）の拒絶反応や骨髄移
植を行った患者の移植片対宿主反応といった臨床治療に
おいて同種異系抗原誘導免疫反応を効果的に抑えるため
に使用し得る。
トの免疫反応を抑制する目的で投与することができる。
多様な疾病または症状が同種異系拒絶反応および移植片
対宿主反応を含めた同種異系抗原に対する免疫反応によ
って引き起こされる。同種異系抗原によって誘導される
免疫反応では、ＩＬ−１２受容体がＴ細胞の活性化によ
り生じるリンパ増殖および炎症を抑えることができる。
従って、ＩＬ−１２受容体は、例えば同種異系移植（例
えば、皮膚、腎臓および心臓移植）の拒絶反応や骨髄移
植を行った患者の移植片対宿主反応といった臨床治療に
おいて同種異系抗原誘導免疫反応を効果的に抑えるため
に使用し得る。
【００３６】また、ＩＬ−１２受容体は、宿主に固有の
ものとして認識されない抗原に対するＴ細胞の活性化に
関係している慢性関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症
のような自己免疫疾患の臨床治療にも使用できる。さら
に、ＩＬ−１２受容体は、ＩＬ−１２に応答して産生さ
れるインターフェロンγが罹病や死亡の中心的役割を担
っている敗血症性ショックの治療にも有効であり得る
（Doherty et al. (1992) J. Immunol. 149, 1666 ）。
ものとして認識されない抗原に対するＴ細胞の活性化に
関係している慢性関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症
のような自己免疫疾患の臨床治療にも使用できる。さら
に、ＩＬ−１２受容体は、ＩＬ−１２に応答して産生さ
れるインターフェロンγが罹病や死亡の中心的役割を担
っている敗血症性ショックの治療にも有効であり得る
（Doherty et al. (1992) J. Immunol. 149, 1666 ）。
【００３７】精製したＩＬ−１２受容体組成物はＩＬ−
１２やＩＬ−１２受容体の診断上の検査に使用すること
ができ、さらに診断や治療に用いるＩＬ−１２受容体抗
体の生産にも使用できるだろう。加えて、精製したＩＬ
−１２受容体組成物はＩＬ−１２と結合させるかまたは
ＩＬ−１２を取り除くための治療に直接使用してもよ
く、こうしてＩＬ−１２の免疫または炎症作用を調節す
る手段が得られる。病的免疫反応を抑制または逆転させ
るために、可溶性のＩＬ−１２受容体を他のサイトカイ
ン受容体アンタゴニスト、例えばＩＬ−２受容体に対す
る抗体、可溶性ＴＮＦ受容体、ＩＬ−１受容体アンタゴ
ニストなどと併用してもよい。
１２やＩＬ−１２受容体の診断上の検査に使用すること
ができ、さらに診断や治療に用いるＩＬ−１２受容体抗
体の生産にも使用できるだろう。加えて、精製したＩＬ
−１２受容体組成物はＩＬ−１２と結合させるかまたは
ＩＬ−１２を取り除くための治療に直接使用してもよ
く、こうしてＩＬ−１２の免疫または炎症作用を調節す
る手段が得られる。病的免疫反応を抑制または逆転させ
るために、可溶性のＩＬ−１２受容体を他のサイトカイ
ン受容体アンタゴニスト、例えばＩＬ−２受容体に対す
る抗体、可溶性ＴＮＦ受容体、ＩＬ−１受容体アンタゴ
ニストなどと併用してもよい。
【００３８】ＩＬ−１２受容体タンパク質およびその断
片の投与量範囲は、過度の実験を行うことなく、当業者
が決めることができる。一般に、適量は希望する効果を
生むのに、例えば内因性ＩＬ−１２のその受容体への結
合を阻止するのに十分な量である。その投与量は望まし
くない交差反応、アナフィラキシー反応といった有害作
用を引き起こすほど多量であってはならない。通常、投
与量は患者の年齢、健康状態、性別および病気の重症
度、（もしあるとすれば）反対の徴候、免疫寛容性、そ
れに個々の医師によって調整されるその他の可変要因に
より変化するだろう。予想される投与量範囲は約１ｎｇ
／ｋｇ／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。ＩＬ−１２
受容体タンパク質およびその断片は注射や連続灌流によ
り非経口的に投与しうる。静脈内、腹腔内、筋肉内また
は皮下投与が可能である。
片の投与量範囲は、過度の実験を行うことなく、当業者
が決めることができる。一般に、適量は希望する効果を
生むのに、例えば内因性ＩＬ−１２のその受容体への結
合を阻止するのに十分な量である。その投与量は望まし
くない交差反応、アナフィラキシー反応といった有害作
用を引き起こすほど多量であってはならない。通常、投
与量は患者の年齢、健康状態、性別および病気の重症
度、（もしあるとすれば）反対の徴候、免疫寛容性、そ
れに個々の医師によって調整されるその他の可変要因に
より変化するだろう。予想される投与量範囲は約１ｎｇ
／ｋｇ／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。ＩＬ−１２
受容体タンパク質およびその断片は注射や連続灌流によ
り非経口的に投与しうる。静脈内、腹腔内、筋肉内また
は皮下投与が可能である。
【００３９】非経口投与用製剤としては無菌の水性また
は非水性の溶液剤、懸濁剤、および乳濁剤が含まれる。
非水性溶剤の例はプロピレングリコール、ポリエチレン
グリコール、オリーブ油のような植物油、オレイン酸エ
チルのような注入可能な有機エステルである。水性担体
としては水、アルコール／水の溶液、エマルジョンまた
は懸濁液（食塩水および緩衝化媒体を含む）がある。非
経口ビヒクルとして、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデ
キストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、
乳酸加リンゲル液、または不揮発性の油を挙げることが
できる。静脈内ビヒクルには液体および栄養分の補液、
電解質の補液、例えばリンゲルデキストロースに基づい
たものなどが含まれる。防腐剤や他の添加剤、例えば抗
菌剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性ガスなども含め
ることができる。一般的には、Remington's Pharmaceut
ical Science, 18th Ed., Mack Eds., 1990 を参照され
たい。
は非水性の溶液剤、懸濁剤、および乳濁剤が含まれる。
非水性溶剤の例はプロピレングリコール、ポリエチレン
グリコール、オリーブ油のような植物油、オレイン酸エ
チルのような注入可能な有機エステルである。水性担体
としては水、アルコール／水の溶液、エマルジョンまた
は懸濁液（食塩水および緩衝化媒体を含む）がある。非
経口ビヒクルとして、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデ
キストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、
乳酸加リンゲル液、または不揮発性の油を挙げることが
できる。静脈内ビヒクルには液体および栄養分の補液、
電解質の補液、例えばリンゲルデキストロースに基づい
たものなどが含まれる。防腐剤や他の添加剤、例えば抗
菌剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性ガスなども含め
ることができる。一般的には、Remington's Pharmaceut
ical Science, 18th Ed., Mack Eds., 1990 を参照され
たい。
【００４０】本発明は、また、上記の３種類すべての親
和性に関するヒトＩＬ−１２受容体に対する新規な抗血
清およびモノクローナル抗体を含む新規な免疫グロブリ
ンに関する。本発明によって提供される代表的な抗ＩＬ
−１２Ｒ抗血清は、ＩＬ−１２Ｒ発現細胞へのＩＬ−１
２の結合を阻止し、さらにＩＬ−１２活性を中和するこ
ともできる。本発明の別の態様では、Kohler and Milst
ein の方法のような公知の技法によってＩＬ−１２Ｒに
選択的なモノクローナル抗体が生産される。ＩＬ−１２
Ｒに対する適当なモノクローナル抗体を公知の方法によ
って修飾して、キメラ抗体、ヒト化抗体または一本鎖抗
体（ＳＣＡ）といった修飾抗体を得ることもできる。
和性に関するヒトＩＬ−１２受容体に対する新規な抗血
清およびモノクローナル抗体を含む新規な免疫グロブリ
ンに関する。本発明によって提供される代表的な抗ＩＬ
−１２Ｒ抗血清は、ＩＬ−１２Ｒ発現細胞へのＩＬ−１
２の結合を阻止し、さらにＩＬ−１２活性を中和するこ
ともできる。本発明の別の態様では、Kohler and Milst
ein の方法のような公知の技法によってＩＬ−１２Ｒに
選択的なモノクローナル抗体が生産される。ＩＬ−１２
Ｒに対する適当なモノクローナル抗体を公知の方法によ
って修飾して、キメラ抗体、ヒト化抗体または一本鎖抗
体（ＳＣＡ）といった修飾抗体を得ることもできる。
【００４１】本発明による免疫グロブリンは、ＩＬ−１
２受容体へのＩＬ−１２の結合を阻止することができ、
かつＩＬ−１２受容体に結合することによってＩＬ−１
２の生物活性を中和することができる抗体を含むもので
ある。さらに、本発明には、ＩＬ−１２受容体に結合す
るが、ＩＬ−１２受容体へのＩＬ−１２の結合を阻止で
きず、かつＩＬ−１２受容体に結合することによってＩ
Ｌ−１２の生物活性を中和することもできない免疫グロ
ブリンも含まれる。
２受容体へのＩＬ−１２の結合を阻止することができ、
かつＩＬ−１２受容体に結合することによってＩＬ−１
２の生物活性を中和することができる抗体を含むもので
ある。さらに、本発明には、ＩＬ−１２受容体に結合す
るが、ＩＬ−１２受容体へのＩＬ−１２の結合を阻止で
きず、かつＩＬ−１２受容体に結合することによってＩ
Ｌ−１２の生物活性を中和することもできない免疫グロ
ブリンも含まれる。
【００４２】本発明のＩＬ−１２受容体抗体を使用する
と、正常および病的状態でのヒト細胞（例えば、末梢血
リンパ球および骨髄細胞）上のＩＬ−１２受容体の発現
を調べることができる。また、本発明の抗血清およびモ
ノクローナル抗体を使って、ＩＬ−１２受容体へのＩＬ
−１２の結合を阻止し、その生物活性を遮断することも
できる。かくして、本発明の中和抗体は活性化されたＴ
細胞やＮＫ細胞によって悪化する多くの病状（例えば、
自己免疫疾患、移植片対宿主病および慢性関節リウマ
チ）に治療介入させるべく使用される。最後に、本発明
の特異的抗体の具体例によって実証されたように、かか
る抗体はＩＬ−１２受容体をコードするｃＤＮＡを単離
するための発現クローニング戦略にも有用であろう。
と、正常および病的状態でのヒト細胞（例えば、末梢血
リンパ球および骨髄細胞）上のＩＬ−１２受容体の発現
を調べることができる。また、本発明の抗血清およびモ
ノクローナル抗体を使って、ＩＬ−１２受容体へのＩＬ
−１２の結合を阻止し、その生物活性を遮断することも
できる。かくして、本発明の中和抗体は活性化されたＴ
細胞やＮＫ細胞によって悪化する多くの病状（例えば、
自己免疫疾患、移植片対宿主病および慢性関節リウマ
チ）に治療介入させるべく使用される。最後に、本発明
の特異的抗体の具体例によって実証されたように、かか
る抗体はＩＬ−１２受容体をコードするｃＤＮＡを単離
するための発現クローニング戦略にも有用であろう。
【００４３】本発明の抗血清は、ＰＨＡ活性化ヒトＰＢ
ＭＣを用いて宿主動物を免疫することにより生産するこ
とが有利である。適当な宿主動物には、例えばマウス、
ラット、ウサギ、モルモットのようなげっ歯類、ヤギ、
ヒツジ、ウマなどの高等哺乳動物が含まれる。初期抗原
量および追加抗原量は動物の免疫反応を引き出すプロト
コールに従って投与することができ、例えば、好ましい
態様では、マウスに６×１０7 個の細胞を初期量として
投与し、その後追加抗原量として２〜５×１０ 7 個の細
胞を６か月間で５回投与する。ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣへ
の 125Ｉ−ＩＬ−１２結合の阻害（図８）およびＩＬ−
１２Ｒに架橋結合した 125Ｉ−ＩＬ−１２からなる複合
体の免疫沈降（この方法は希望の活性を有する抗血清を
産生している宿主をスクリーニングするための好適な方
法を提供する）により測定したところ、免疫したマウス
はヒトＩＬ−１２Ｒに対する免疫反応を発現しているこ
とが観察された。
ＭＣを用いて宿主動物を免疫することにより生産するこ
とが有利である。適当な宿主動物には、例えばマウス、
ラット、ウサギ、モルモットのようなげっ歯類、ヤギ、
ヒツジ、ウマなどの高等哺乳動物が含まれる。初期抗原
量および追加抗原量は動物の免疫反応を引き出すプロト
コールに従って投与することができ、例えば、好ましい
態様では、マウスに６×１０7 個の細胞を初期量として
投与し、その後追加抗原量として２〜５×１０ 7 個の細
胞を６か月間で５回投与する。ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣへ
の 125Ｉ−ＩＬ−１２結合の阻害（図８）およびＩＬ−
１２Ｒに架橋結合した 125Ｉ−ＩＬ−１２からなる複合
体の免疫沈降（この方法は希望の活性を有する抗血清を
産生している宿主をスクリーニングするための好適な方
法を提供する）により測定したところ、免疫したマウス
はヒトＩＬ−１２Ｒに対する免疫反応を発現しているこ
とが観察された。
【００４４】モノクローナル抗体は、上記の計画に従っ
てＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、続いてマウスに１×１
０7 個の細胞を腹腔内に、そして２．５×１０6 個の細
胞を静脈内に２日続けて注射する（細胞融合の４日前に
開始する）ことにより都合よく生産できる。もちろん、
抗体の分野でよく知られた他のプロトコールを利用して
もよい。ここに詳述する完全な免疫感作プロトコールは
ヒトＩＬ−１２受容体抗体にとって最適な血清抗体反応
のプロトコールを提供した。他の免疫感作プロトコール
は以下に記載するプロトコールよりも低い血清抗体反応
をもたらした。例えば、１）少ない数のＰＨＡ活性化リ
ンパ芽球を用いる免疫感作（０．７〜１．８×１０7 細
胞／追加免疫感作）；２）少ない回数の追加免疫感作を
用いる免疫感作、または２〜６×１０7 細胞／免疫感作
を用いる短期間（４０日間）にわたる免疫感作；および
３）ＰＨＡ活性化リンパ芽球由来の細胞膜（１〜４×１
０ 8 細胞／免疫感作に等しい膜）を用いる免疫感作はど
れも血清抗体反応を生起させたが、下記プロトコールほ
ど顕著ではなかった。ラットを免疫したときにも同様の
結果が得られた。
てＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、続いてマウスに１×１
０7 個の細胞を腹腔内に、そして２．５×１０6 個の細
胞を静脈内に２日続けて注射する（細胞融合の４日前に
開始する）ことにより都合よく生産できる。もちろん、
抗体の分野でよく知られた他のプロトコールを利用して
もよい。ここに詳述する完全な免疫感作プロトコールは
ヒトＩＬ−１２受容体抗体にとって最適な血清抗体反応
のプロトコールを提供した。他の免疫感作プロトコール
は以下に記載するプロトコールよりも低い血清抗体反応
をもたらした。例えば、１）少ない数のＰＨＡ活性化リ
ンパ芽球を用いる免疫感作（０．７〜１．８×１０7 細
胞／追加免疫感作）；２）少ない回数の追加免疫感作を
用いる免疫感作、または２〜６×１０7 細胞／免疫感作
を用いる短期間（４０日間）にわたる免疫感作；および
３）ＰＨＡ活性化リンパ芽球由来の細胞膜（１〜４×１
０ 8 細胞／免疫感作に等しい膜）を用いる免疫感作はど
れも血清抗体反応を生起させたが、下記プロトコールほ
ど顕著ではなかった。ラットを免疫したときにも同様の
結果が得られた。
【００４５】モノクローナル抗体産生細胞としては、宿
主の脾臓、末梢血、リンパ節または他の組織から得たＢ
リンパ球を使用する。最も好ましいＢリンパ球は脾臓か
ら得たものである。希望する本発明モノクローナル抗体
を産生する能力を有するハイブリドーマは、かかるＢリ
ンパ球と不滅細胞系（ハイブリッド細胞に長期の組織培
養安定性を付与する細胞系）との融合により得られる。
本発明の好ましい態様において、不滅細胞はリンパ芽球
様細胞または形質細胞腫細胞、例えばそれ自体抗体産生
細胞である上に悪性細胞でもあるミエローマ細胞であり
得る。ＩＬ−１２Ｒモノクローナル抗体を産生するマウ
スハイブリドーマはマウスのミエローマ細胞と、活性化
末梢血単核細胞の表面に発現されるｈＩＬ−１２Ｒに対
して免疫したマウスから得た脾細胞との融合により形成
される。キメラおよびヒト化モノクローナル抗体はハイ
ブリドーマ細胞から得た抗体発現遺伝子をクローニング
し、当分野で今や公知の組換えＤＮＡ法を用いてマウス
可変部のサブ配列をヒト定常部に結合させるか、ヒト枠
組み構造領域をドナーマウスまたはラットの免疫グロブ
リンから得た相補性決定領域（ＣＤＲ）と組み合わせる
ことにより作製することができる（ＥＰ 0239400）。親
和性の向上した抗体をもたらすマウスモノクローナル抗
体のヒト化を実施する改良法は国際特許出願第ＷＯ 92/
11018 に記載されている。
主の脾臓、末梢血、リンパ節または他の組織から得たＢ
リンパ球を使用する。最も好ましいＢリンパ球は脾臓か
ら得たものである。希望する本発明モノクローナル抗体
を産生する能力を有するハイブリドーマは、かかるＢリ
ンパ球と不滅細胞系（ハイブリッド細胞に長期の組織培
養安定性を付与する細胞系）との融合により得られる。
本発明の好ましい態様において、不滅細胞はリンパ芽球
様細胞または形質細胞腫細胞、例えばそれ自体抗体産生
細胞である上に悪性細胞でもあるミエローマ細胞であり
得る。ＩＬ−１２Ｒモノクローナル抗体を産生するマウ
スハイブリドーマはマウスのミエローマ細胞と、活性化
末梢血単核細胞の表面に発現されるｈＩＬ−１２Ｒに対
して免疫したマウスから得た脾細胞との融合により形成
される。キメラおよびヒト化モノクローナル抗体はハイ
ブリドーマ細胞から得た抗体発現遺伝子をクローニング
し、当分野で今や公知の組換えＤＮＡ法を用いてマウス
可変部のサブ配列をヒト定常部に結合させるか、ヒト枠
組み構造領域をドナーマウスまたはラットの免疫グロブ
リンから得た相補性決定領域（ＣＤＲ）と組み合わせる
ことにより作製することができる（ＥＰ 0239400）。親
和性の向上した抗体をもたらすマウスモノクローナル抗
体のヒト化を実施する改良法は国際特許出願第ＷＯ 92/
11018 に記載されている。
【００４６】本発明は、また、ａ）インターロイキン−
１２受容体を用いて宿主動物を免疫し、ｂ）該宿主動物
のＢリンパ球を不滅細胞系と融合させ、そしてｃ）得ら
れたハイブリドーマ細胞系を培養してモノクローナル抗
体を産生させることからなる、インターロイキン−１２
受容体に対するモノクローナル抗体の産生方法を含むも
のである。
１２受容体を用いて宿主動物を免疫し、ｂ）該宿主動物
のＢリンパ球を不滅細胞系と融合させ、そしてｃ）得ら
れたハイブリドーマ細胞系を培養してモノクローナル抗
体を産生させることからなる、インターロイキン−１２
受容体に対するモノクローナル抗体の産生方法を含むも
のである。
【００４７】１以上の免疫グロブリン活性を保持する、
一次抗体構造の一部分のみからなるポリペプチド断片を
作製することができる。これらのポリペプチド断片は公
知の方法によって完全な抗体を加水分解切断するか、部
位特異的突然変異誘発法を使って抗体遺伝子を含む発現
ベクターの希望の位置に停止コドンを挿入してＦａｂ断
片または（Ｆａｂ’）2 断片を作ることにより得られ
る。一本鎖抗体はＶＬおよびＶＨ領域をＤＮＡリンカー
を用いて結合させることにより作製しうる（Huston et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883 (19
88) および Birdet al., Science, 242, 423-426 (198
8)を参照されたい）。
一次抗体構造の一部分のみからなるポリペプチド断片を
作製することができる。これらのポリペプチド断片は公
知の方法によって完全な抗体を加水分解切断するか、部
位特異的突然変異誘発法を使って抗体遺伝子を含む発現
ベクターの希望の位置に停止コドンを挿入してＦａｂ断
片または（Ｆａｂ’）2 断片を作ることにより得られ
る。一本鎖抗体はＶＬおよびＶＨ領域をＤＮＡリンカー
を用いて結合させることにより作製しうる（Huston et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883 (19
88) および Birdet al., Science, 242, 423-426 (198
8)を参照されたい）。
【００４８】本発明のモノクローナル抗体を治療薬とし
て使用することも当分野の技術の範囲内である。精製し
たモノクローナル抗体産物をそのままであるいは断片と
して注射用の水に溶解し、滅菌濾過するといった公知の
方法で非経口投与用に製剤化することができる。投与形
態はタンパク質の非経口投与用の公知の賦形剤、緩衝
剤、安定剤、キャリアータンパク質などを含んでいても
よい。投与量は病気の程度や性質、それに患者の年齢、
体重、健康状態を考慮して医師が選択するだろう。免疫
グロブリンは患者において長い半減期をもつことが実証
されたので、１０〜１４日ごとの投薬で通常十分であ
る。また、毒素分子、例えばシュードモナス外毒素また
はリシンのＡ鎖とのハイブリッドを形成させることによ
ってモノクローナル抗体を修飾し、ＩＬ−１２Ｒを発現
する細胞を選択的に破壊しうるハイブリッド分子を提供
することも当分野の技術の範囲内である。
て使用することも当分野の技術の範囲内である。精製し
たモノクローナル抗体産物をそのままであるいは断片と
して注射用の水に溶解し、滅菌濾過するといった公知の
方法で非経口投与用に製剤化することができる。投与形
態はタンパク質の非経口投与用の公知の賦形剤、緩衝
剤、安定剤、キャリアータンパク質などを含んでいても
よい。投与量は病気の程度や性質、それに患者の年齢、
体重、健康状態を考慮して医師が選択するだろう。免疫
グロブリンは患者において長い半減期をもつことが実証
されたので、１０〜１４日ごとの投薬で通常十分であ
る。また、毒素分子、例えばシュードモナス外毒素また
はリシンのＡ鎖とのハイブリッドを形成させることによ
ってモノクローナル抗体を修飾し、ＩＬ−１２Ｒを発現
する細胞を選択的に破壊しうるハイブリッド分子を提供
することも当分野の技術の範囲内である。
【００４９】さらに、本発明は、対象の細胞を含むサン
プルを、ＩＬ−１２受容体と複合体を形成しうる物質と
接触させて、該物質とＩＬ−１２受容体との細胞性複合
体を形成させ、そして該細胞性複合体を検出することか
らなる、ＩＬ−１２受容体を発現する末梢血細胞の検出
方法にも関する。本発明の他の態様は、上記方法によっ
て末梢血細胞を検出することからなる被験者における細
胞活性の評価方法を提供する。
プルを、ＩＬ−１２受容体と複合体を形成しうる物質と
接触させて、該物質とＩＬ−１２受容体との細胞性複合
体を形成させ、そして該細胞性複合体を検出することか
らなる、ＩＬ−１２受容体を発現する末梢血細胞の検出
方法にも関する。本発明の他の態様は、上記方法によっ
て末梢血細胞を検出することからなる被験者における細
胞活性の評価方法を提供する。
【００５０】好ましい態様において、該物質は受容体を
発現した末梢血細胞の表面に存在するＩＬ−１２受容体
とのみ複合体を形成できるものである。該物質はＩＬ−
１２Ｒモノクローナル抗体であることが特に好ましい。
本発明の一態様は、 ａ．末梢血単核細胞を単離し； ｂ．該細胞をＩＬ−１２Ｒモノクローナル抗体で処理
し；そして ｃ．該細胞に結合したモノクローナル抗体の量を測定す
る；ことからなる、免疫細胞活性の評価方法を提供す
る。
発現した末梢血細胞の表面に存在するＩＬ−１２受容体
とのみ複合体を形成できるものである。該物質はＩＬ−
１２Ｒモノクローナル抗体であることが特に好ましい。
本発明の一態様は、 ａ．末梢血単核細胞を単離し； ｂ．該細胞をＩＬ−１２Ｒモノクローナル抗体で処理
し；そして ｃ．該細胞に結合したモノクローナル抗体の量を測定す
る；ことからなる、免疫細胞活性の評価方法を提供す
る。
【００５１】本発明は、また、被験者における免疫系の
異常の検査方法を含み、該方法は、被験者から得たサン
プル中のＴ細胞、ＮＫ細胞またはＢ細胞の数を測定し、
該サンプルをＩＬ−１２受容体との複合体を形成するこ
とができる物質と接触させ、そしてＩＬ−１２受容体を
有する該サンプル中のＴ細胞、ＮＫ細胞またはＢ細胞の
パーセンテージを求めることからなっている。このよう
にして求めたパーセンテージと免疫系の異常を示さない
正常被験者から得たサンプル中のＩＬ−１２受容体を有
する細胞のパーセンテージとを比較し、得られた該細胞
のパーセンテージの差異が免疫系異常の指標となる。好
ましくは、被験者は動物、例えばヒトである。
異常の検査方法を含み、該方法は、被験者から得たサン
プル中のＴ細胞、ＮＫ細胞またはＢ細胞の数を測定し、
該サンプルをＩＬ−１２受容体との複合体を形成するこ
とができる物質と接触させ、そしてＩＬ−１２受容体を
有する該サンプル中のＴ細胞、ＮＫ細胞またはＢ細胞の
パーセンテージを求めることからなっている。このよう
にして求めたパーセンテージと免疫系の異常を示さない
正常被験者から得たサンプル中のＩＬ−１２受容体を有
する細胞のパーセンテージとを比較し、得られた該細胞
のパーセンテージの差異が免疫系異常の指標となる。好
ましくは、被験者は動物、例えばヒトである。
【００５２】Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞の機能と関
連した分子として、ＩＬ−１２Ｒの発現を測定すること
は診断上重要である。ＩＬ−１２Ｒは活性化されたＴ細
胞、ＮＫ細胞またはＢ細胞に特有なものであるから、こ
れはリンパ球集団中のこれら細胞のための特異なマーカ
ーとなる。さらに、ＩＬ−１２Ｒの発現レベルはＴ細
胞、ＮＫ細胞またはＢ細胞の活性の尺度を提供する。こ
の情報は個体の免疫状態を評価する上で重要でありう
る。例えば、がんのような病気の治療には、免疫適格性
に影響を及ぼす薬剤がしばしば用いられる。ＩＬ−１２
Ｒ発現の検定を通して、医師は患者の免疫状態をモニタ
ーし、往々にして免疫無防備状態の患者には脅威となる
日和見感染症の危険を最小限にくい止めるように治療を
修正することができる。
連した分子として、ＩＬ−１２Ｒの発現を測定すること
は診断上重要である。ＩＬ−１２Ｒは活性化されたＴ細
胞、ＮＫ細胞またはＢ細胞に特有なものであるから、こ
れはリンパ球集団中のこれら細胞のための特異なマーカ
ーとなる。さらに、ＩＬ−１２Ｒの発現レベルはＴ細
胞、ＮＫ細胞またはＢ細胞の活性の尺度を提供する。こ
の情報は個体の免疫状態を評価する上で重要でありう
る。例えば、がんのような病気の治療には、免疫適格性
に影響を及ぼす薬剤がしばしば用いられる。ＩＬ−１２
Ｒ発現の検定を通して、医師は患者の免疫状態をモニタ
ーし、往々にして免疫無防備状態の患者には脅威となる
日和見感染症の危険を最小限にくい止めるように治療を
修正することができる。
【００５３】ＩＬ−１２Ｒ発現の検定は細胞表面抗原の
通常の免疫化学検定でありうる。患者から末梢血単核細
胞を取り出し、ＩＬ−１２Ｒモノクローナル抗体と表面
抗原とを結合させる条件下で該細胞をＩＬ−１２Ｒモノ
クローナル抗体とともにインキュベートする。細胞表面
に結合した抗体がＩＬ−１２Ｒ発現の尺度を提供する。
抗体と細胞との結合は放射性物質、蛍光物質または検出
可能な他の化合物を用いて標識したＩＬ−１２Ｒモノク
ローナル抗体を使うことにより測定できる。
通常の免疫化学検定でありうる。患者から末梢血単核細
胞を取り出し、ＩＬ−１２Ｒモノクローナル抗体と表面
抗原とを結合させる条件下で該細胞をＩＬ−１２Ｒモノ
クローナル抗体とともにインキュベートする。細胞表面
に結合した抗体がＩＬ−１２Ｒ発現の尺度を提供する。
抗体と細胞との結合は放射性物質、蛍光物質または検出
可能な他の化合物を用いて標識したＩＬ−１２Ｒモノク
ローナル抗体を使うことにより測定できる。
【００５４】本発明は、また、可溶性形態のＩＬ−１２
Ｒの増加または減少によって評価される免疫系の疾患、
がん、または他の病気を患う被験者から得たサンプル中
の可溶性ＩＬ−１２受容体の濃度の測定方法をも含むも
のである。可溶性ＩＬ−１２Ｒの検定は通常のサンドイ
ッチ免疫化学検定または固定化ＩＬ−１２Ｒへの 125Ｉ
−ＩＬ−１２結合検定でありうる。
Ｒの増加または減少によって評価される免疫系の疾患、
がん、または他の病気を患う被験者から得たサンプル中
の可溶性ＩＬ−１２受容体の濃度の測定方法をも含むも
のである。可溶性ＩＬ−１２Ｒの検定は通常のサンドイ
ッチ免疫化学検定または固定化ＩＬ−１２Ｒへの 125Ｉ
−ＩＬ−１２結合検定でありうる。
【００５５】ここで用いた用語および表現は説明のため
であって、限定のために使用したものではない。かかる
用語および表現の使用は記載した特徴またはその一部の
いかなる均等物をも除外することを意図しておらず、多
様な修飾が本発明の範囲内で可能であることが理解され
よう。本発明のいくつかの実施態様を以下の実施例に示
すが、実施例は本発明の理解を促すものであって、いか
なる場合も特許請求の範囲に記載した本発明を制限する
ものではない。
であって、限定のために使用したものではない。かかる
用語および表現の使用は記載した特徴またはその一部の
いかなる均等物をも除外することを意図しておらず、多
様な修飾が本発明の範囲内で可能であることが理解され
よう。本発明のいくつかの実施態様を以下の実施例に示
すが、実施例は本発明の理解を促すものであって、いか
なる場合も特許請求の範囲に記載した本発明を制限する
ものではない。
【００５６】
【実施例】材料および方法 タンパク質およびプラスミド 組換えヒトＩＬ−１２（U. Gubler et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA (1991) 88, 4143）およびマウスＩ
Ｌ−１２（D. Schoenhaut et al., J. Immunology (199
2), 148, 3433 ）は文献に記載のとおりに得られた。
l. Acad. Sci. USA (1991) 88, 4143）およびマウスＩ
Ｌ−１２（D. Schoenhaut et al., J. Immunology (199
2), 148, 3433 ）は文献に記載のとおりに得られた。
【００５７】ここで用いたマウスおよびヒトのＩＬ−１
２受容体モノクローナル抗体２−４Ｅ６は以下に記載す
るとおりに生産し、メーカー（Genex 社）の指示に従っ
てプロテインＧ−アガロースでアフィニティークロマト
グラフィーにより腹水から精製した。タンパク質は Iod
ogen法の変法により記載のとおりに 125Ｉで標識した
（Pierce Chemical 社、イリノイ州ロックフォード）。
一般に、ＩＬ−１２については5000〜7000 cpm/fmoleの
比放射能が、２−４Ｅ６抗体については1500〜2500 cpm
/fmoleの比放射能が得られた。プラスミドｐＥＦ−ＢＯ
ＳはｐＵＣ１１９の骨格を土台にしたものであり、Ｂｓ
ｔＸＩ部位に挿入した遺伝子の発現を駆動する延長因子
１αプロモーターを含んでいる（S. Mizushima and S.
Nagata (1990) Nucl. Acids Res. 18, 5322 ）。
２受容体モノクローナル抗体２−４Ｅ６は以下に記載す
るとおりに生産し、メーカー（Genex 社）の指示に従っ
てプロテインＧ−アガロースでアフィニティークロマト
グラフィーにより腹水から精製した。タンパク質は Iod
ogen法の変法により記載のとおりに 125Ｉで標識した
（Pierce Chemical 社、イリノイ州ロックフォード）。
一般に、ＩＬ−１２については5000〜7000 cpm/fmoleの
比放射能が、２−４Ｅ６抗体については1500〜2500 cpm
/fmoleの比放射能が得られた。プラスミドｐＥＦ−ＢＯ
ＳはｐＵＣ１１９の骨格を土台にしたものであり、Ｂｓ
ｔＸＩ部位に挿入した遺伝子の発現を駆動する延長因子
１αプロモーターを含んでいる（S. Mizushima and S.
Nagata (1990) Nucl. Acids Res. 18, 5322 ）。
【００５８】実施例１ ハイブリドーマ抗体の生産、特性決定および精製 Ｂａｌｂ／ｃマウス（Charles River 研究所）を腹腔内
経路で６×１０7 細胞／マウスのＰＨＡ（フィトヘムア
グルチニン）活性化ヒトＰＢＭＣ（ＰＨＡ活性化ＰＢＭ
Ｃ）を用いて免疫した。その後、マウスに２〜５×１０
7 細胞の追加免疫注射を６カ月間で５回行った。活性化
脾細胞の調製のために、細胞融合の４日前に開始して、
２日続けて２匹のマウスに１×１０7 細胞と２．５×１
０6 細胞をそれぞれ腹腔内および静脈内に注射した。こ
れらのマウスから脾細胞を取り出し、Fazekas et al.,
J. Immunol. Methods (1980) 35, 1に記載の方法に従っ
て３５ｖ／ｖ％のポリエチレングリコール 4000 (E. Me
rck 社) を用いてＳＰ２／０（ATCC CRL 1581 ）細胞と
１：１の比で融合させた。その後、１０％ＦＢＳ、グル
タミン（２ｍＭ）、β−メルカプトエタノール（０．１
ｍＭ）、ゲンタマイシン（５０ｇ／ｍｌ）、５％ ORIGE
N ハイブリドーマクローニングファクター（IGEN社）、
５％Ｐ３８８Ｄ１（ATCC CRL 46 ）上清（Nordan, R.P.
et al., J.Immunol. (1987) 139, 813）および１００
ユニット／ｍｌのｒＨｕＩＬ−６を補給したＩＭＤＭで
４８ウェルのクラスター皿中６×１０5 細胞／ｍｌ／ウ
ェルの密度で融合細胞をプレートした。ハイブリドーマ
上清について特異的抗ＩＬ−１２受容体抗体を次の方法
で検定した：１）ＩＬ−１２受容体に架橋結合した 125
Ｉ−ＨｕＩＬ−１２からなる可溶性複合体の免疫沈降
（１２５Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ）；２）ＰＨＡ
活性化ＰＢＭＣへの 125Ｉ−ＨｕＩＬ−１２結合の阻
害；および３）ＩＬ−１２受容体陽性細胞対受容体陰性
細胞への示差結合。特異的な抗受容体抗体を分泌するハ
イブリドーマ細胞系は限界希釈法によりクローニングし
た。抗体はメーカー（Genex 社）の指示に従って架橋ア
ガロースに結合させたプロテインＧでアフィニティーク
ロマトグラフィーにより腹水から精製した。
経路で６×１０7 細胞／マウスのＰＨＡ（フィトヘムア
グルチニン）活性化ヒトＰＢＭＣ（ＰＨＡ活性化ＰＢＭ
Ｃ）を用いて免疫した。その後、マウスに２〜５×１０
7 細胞の追加免疫注射を６カ月間で５回行った。活性化
脾細胞の調製のために、細胞融合の４日前に開始して、
２日続けて２匹のマウスに１×１０7 細胞と２．５×１
０6 細胞をそれぞれ腹腔内および静脈内に注射した。こ
れらのマウスから脾細胞を取り出し、Fazekas et al.,
J. Immunol. Methods (1980) 35, 1に記載の方法に従っ
て３５ｖ／ｖ％のポリエチレングリコール 4000 (E. Me
rck 社) を用いてＳＰ２／０（ATCC CRL 1581 ）細胞と
１：１の比で融合させた。その後、１０％ＦＢＳ、グル
タミン（２ｍＭ）、β−メルカプトエタノール（０．１
ｍＭ）、ゲンタマイシン（５０ｇ／ｍｌ）、５％ ORIGE
N ハイブリドーマクローニングファクター（IGEN社）、
５％Ｐ３８８Ｄ１（ATCC CRL 46 ）上清（Nordan, R.P.
et al., J.Immunol. (1987) 139, 813）および１００
ユニット／ｍｌのｒＨｕＩＬ−６を補給したＩＭＤＭで
４８ウェルのクラスター皿中６×１０5 細胞／ｍｌ／ウ
ェルの密度で融合細胞をプレートした。ハイブリドーマ
上清について特異的抗ＩＬ−１２受容体抗体を次の方法
で検定した：１）ＩＬ−１２受容体に架橋結合した 125
Ｉ−ＨｕＩＬ−１２からなる可溶性複合体の免疫沈降
（１２５Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ）；２）ＰＨＡ
活性化ＰＢＭＣへの 125Ｉ−ＨｕＩＬ−１２結合の阻
害；および３）ＩＬ−１２受容体陽性細胞対受容体陰性
細胞への示差結合。特異的な抗受容体抗体を分泌するハ
イブリドーマ細胞系は限界希釈法によりクローニングし
た。抗体はメーカー（Genex 社）の指示に従って架橋ア
ガロースに結合させたプロテインＧでアフィニティーク
ロマトグラフィーにより腹水から精製した。
【００５９】実施例２ ヒトＰＨＡリンパ芽球の調製およびＩＬ−１２受容体結
合検定 ヒト末梢血単核細胞を単離し（Gately et al., J. Nat
l. Cancer Inst. 69, (1982) 1245を参照）、０．１％
ＰＨＡ−Ｐ（Difco 社）を含む組織培養基（ＴＣＭ）
中、５×１０5 細胞／ｍｌの密度で３７℃にて培養し
た。３日後、培養物を新しいＴＣＭにより１：１に分割
し、各培養物にヒトｒＩＬ−２を加えて最終濃度を５０
ユニット／ｍｌとした。培養物をさらに１〜２日間培養
した後で検定に供した。
合検定 ヒト末梢血単核細胞を単離し（Gately et al., J. Nat
l. Cancer Inst. 69, (1982) 1245を参照）、０．１％
ＰＨＡ−Ｐ（Difco 社）を含む組織培養基（ＴＣＭ）
中、５×１０5 細胞／ｍｌの密度で３７℃にて培養し
た。３日後、培養物を新しいＴＣＭにより１：１に分割
し、各培養物にヒトｒＩＬ−２を加えて最終濃度を５０
ユニット／ｍｌとした。培養物をさらに１〜２日間培養
した後で検定に供した。
【００６０】ＰＨＡ活性化ヒトＰＢＭＣを結合用緩衝液
（RPMI-1640, 5% FBS, 25 mM HEPESpH 7.4 ）で１回洗
い、７×１０6 細胞／ｍｌの細胞密度で結合用緩衝液中
に再懸濁した。リンパ芽球（７×１０5 細胞）を種々の
濃度の 125Ｉ−ＩＬ−１２（5 〜10000 pM）とともに室
温で指定した時間インキュベートした。検定混合物を
０．１ｍｌのオイル混合物（トーマス・シリコーン液 6
428-R15 (A.H. Thomas)とシリコーン油 AR 200 (Gallar
d-Schlessinger)の１：２混合物）に通して４℃、10,00
0×g で９０秒間遠心することにより、細胞に結合した
放射能を遊離の 1 25Ｉ−ＩＬ−１２から分離した。細胞
ペレットを含む先端部分を切り取り、細胞に結合した放
射能をガンマカウンターで計測した。非特異的結合は検
定に１００ｎＭの未標識ＩＬ−１２を加えることにより
測定した。インキュベーションは２回または３回反復し
て行った。受容体結合データは、Elsevier-BIOSOFTから
McPherson, J. Pharmacol. Methods (1985) 14, 213に
よりＩＢＭパーソナルコンピューターに適合させた非線
形回帰プログラム EBDA および LIGAND を使って解析し
た。
（RPMI-1640, 5% FBS, 25 mM HEPESpH 7.4 ）で１回洗
い、７×１０6 細胞／ｍｌの細胞密度で結合用緩衝液中
に再懸濁した。リンパ芽球（７×１０5 細胞）を種々の
濃度の 125Ｉ−ＩＬ−１２（5 〜10000 pM）とともに室
温で指定した時間インキュベートした。検定混合物を
０．１ｍｌのオイル混合物（トーマス・シリコーン液 6
428-R15 (A.H. Thomas)とシリコーン油 AR 200 (Gallar
d-Schlessinger)の１：２混合物）に通して４℃、10,00
0×g で９０秒間遠心することにより、細胞に結合した
放射能を遊離の 1 25Ｉ−ＩＬ−１２から分離した。細胞
ペレットを含む先端部分を切り取り、細胞に結合した放
射能をガンマカウンターで計測した。非特異的結合は検
定に１００ｎＭの未標識ＩＬ−１２を加えることにより
測定した。インキュベーションは２回または３回反復し
て行った。受容体結合データは、Elsevier-BIOSOFTから
McPherson, J. Pharmacol. Methods (1985) 14, 213に
よりＩＢＭパーソナルコンピューターに適合させた非線
形回帰プログラム EBDA および LIGAND を使って解析し
た。
【００６１】実施例３ ＩＬ−１２受容体保有細胞系への 125Ｉ−ＩＬ−１２の
親和性架橋結合 ＩＬ−１２受容体を保有する細胞を、過剰の未標識ＩＬ
−１２の存在下または不在下に 125Ｉ−ＩＬ−１２（１
００〜５００ｐＭ）とともに室温で２時間インキュベー
トした。次に、細胞を氷冷ＰＢＳｐＨ８．３（25 mM リ
ン酸ナトリウムpH 8.3, 0.15 M NaClおよび 1 mM MgCl
2 ）で洗い、ＰＢＳｐＨ８．３中に０．５〜１．０×１
０7 細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。ジメチルスルホキ
シド中のＢＳ３（Pierce社）を加えて０．４ｍＭの最終
濃度とした。絶えず攪拌しながら４℃で３０分間インキ
ュベートした。細胞を氷冷した２５ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび５ｍＭ
ＥＤＴＡで洗い、その後可溶化緩衝液（8 mM CHAPS, 0.
25 M NaCl, 5 mM EDTA, 40μg/ml PMSF, 0.05% NaN 3,お
よび 1% BSA を含有する50 mM トリス-HCl (pH 8.0) ）
中０．５〜１．０×１０8 細胞／ｍｌで４℃、１時間可
溶化した。抽出液を12,000×g 、４℃で４５分間遠心し
て核と他の細胞破片を除いた。
親和性架橋結合 ＩＬ−１２受容体を保有する細胞を、過剰の未標識ＩＬ
−１２の存在下または不在下に 125Ｉ−ＩＬ−１２（１
００〜５００ｐＭ）とともに室温で２時間インキュベー
トした。次に、細胞を氷冷ＰＢＳｐＨ８．３（25 mM リ
ン酸ナトリウムpH 8.3, 0.15 M NaClおよび 1 mM MgCl
2 ）で洗い、ＰＢＳｐＨ８．３中に０．５〜１．０×１
０7 細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。ジメチルスルホキ
シド中のＢＳ３（Pierce社）を加えて０．４ｍＭの最終
濃度とした。絶えず攪拌しながら４℃で３０分間インキ
ュベートした。細胞を氷冷した２５ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび５ｍＭ
ＥＤＴＡで洗い、その後可溶化緩衝液（8 mM CHAPS, 0.
25 M NaCl, 5 mM EDTA, 40μg/ml PMSF, 0.05% NaN 3,お
よび 1% BSA を含有する50 mM トリス-HCl (pH 8.0) ）
中０．５〜１．０×１０8 細胞／ｍｌで４℃、１時間可
溶化した。抽出液を12,000×g 、４℃で４５分間遠心し
て核と他の細胞破片を除いた。
【００６２】実施例４ ヒトＩＬ−１２Ｒに架橋結合した 125Ｉ−ＩＬ−１２の
可溶性複合体の免疫沈降検定 免疫沈降検定のために、ハイブリドーマ培養上清（０．
５ｍｌ）、希釈した抗血清、または精製したＩｇＧを、
アガロースに結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ（Sigma Ch
em. 社）またはセファロース４Ｂに結合させたプロテイ
ンＧ（Pharmacia 社）の５０％懸濁液０．１ｍｌを含む
微量遠心管に加えた。ＩＰ緩衝液（PBS(0.25 M NaCl)
中の 8 mM CHAPS, 1% BSA, 5 mM EDTA）を用いて検定容
量を１．０ｍｌとなし、この混合物を回転ミキサーを使
って室温で２時間インキュベートした。遠心によりビー
ズをペレット化し、 125Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ
（10〜20,000 cpm）を含むＩＰ緩衝液１ｍｌ中に再懸濁
し、混合物を回転ミキサー上で４℃、１６時間インキュ
ベートした。このインキュベーション後、遠心によりビ
ーズをペレット化し、ＢＳＡ不含ＩＰ緩衝液を用いて２
回洗った。固相抗体に結合した 125Ｉ標識受容体複合体
は、１０％のβ−メルカプトエタノールを含むまたは含
まない２×レムリ (Laemmli)サンプル緩衝液（Nature 2
27, 680 (1970)）１００μｌを加えて、９５℃で５分間
加熱することにより遊離させた。免疫沈降したタンパク
質を８％または４〜１５％勾配のポリアクリルアミドゲ
ルでＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、オートラジオグラフィー
で視覚化した。
可溶性複合体の免疫沈降検定 免疫沈降検定のために、ハイブリドーマ培養上清（０．
５ｍｌ）、希釈した抗血清、または精製したＩｇＧを、
アガロースに結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ（Sigma Ch
em. 社）またはセファロース４Ｂに結合させたプロテイ
ンＧ（Pharmacia 社）の５０％懸濁液０．１ｍｌを含む
微量遠心管に加えた。ＩＰ緩衝液（PBS(0.25 M NaCl)
中の 8 mM CHAPS, 1% BSA, 5 mM EDTA）を用いて検定容
量を１．０ｍｌとなし、この混合物を回転ミキサーを使
って室温で２時間インキュベートした。遠心によりビー
ズをペレット化し、 125Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ
（10〜20,000 cpm）を含むＩＰ緩衝液１ｍｌ中に再懸濁
し、混合物を回転ミキサー上で４℃、１６時間インキュ
ベートした。このインキュベーション後、遠心によりビ
ーズをペレット化し、ＢＳＡ不含ＩＰ緩衝液を用いて２
回洗った。固相抗体に結合した 125Ｉ標識受容体複合体
は、１０％のβ−メルカプトエタノールを含むまたは含
まない２×レムリ (Laemmli)サンプル緩衝液（Nature 2
27, 680 (1970)）１００μｌを加えて、９５℃で５分間
加熱することにより遊離させた。免疫沈降したタンパク
質を８％または４〜１５％勾配のポリアクリルアミドゲ
ルでＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、オートラジオグラフィー
で視覚化した。
【００６３】実施例５ ＩＬ−１２受容体を発現する細胞から可溶化したＩＬ−
１２Ｒの検定 免疫沈降検定により同定した抗体がＩＬ−１２Ｒに対し
て特異的であることを確かめるために、免疫沈降／可溶
性ＩＬ−１２Ｒ結合検定を開発した。上記の実施例１に
記載したように、抗体（ハイブリドーマ上清、精製Ｉｇ
Ｇ（５０μｇ）または抗血清として）はアガロースに結
合させたヤギ抗マウスＩｇＧ（１００μｌ；Sigma Che
m. 社）またはセファロース４Ｂに結合させたプロテイ
ンＧ（１００μｌ；Pharmacia 社）に結合させることに
より固定化した。一部の実験では、検定で使用する前
に、抗体をプロテインＧ−セファロース４Ｂに共有結合
で結合させた。Stern and Podlaski, Techniques in Pr
otein Chemistry (1993)を参照されたい。固定化抗体を
ＩＰ緩衝液（０．３ｍｌ）中に再懸濁し、ＩＬ−１２Ｒ
を含むＰＨＡ活性化ＰＢＭＣまたはＫ６細胞の界面活性
剤可溶化抽出液０．２ｍｌを加えた。界面活性剤可溶化
ＩＬ−１２Ｒ調製物を調製するために、細胞を氷冷した
２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ
ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＥＤＴＡで洗い、その後可溶化
緩衝液（8 mM CHAPS, 0.25 M NaCl, 5 mMEDTA, 40μg/m
l PMSF, 0.05% NaN3,および 1% BSA を含有する50 mM
トリス-HCl(pH 8.0) ）中１．５×１０8 細胞／ｍｌで
４℃、１時間可溶化した。抽出液を120,000 ×g 、４℃
で６０分間遠心して核と他の細胞破片を除いた。この混
合物を回転ミキサー上で４℃、１６時間インキュベート
した。このインキュベーション後、遠心によりビーズを
ペレット化し、０．０５〜７．５ｎＭの濃度範囲で 1 25
Ｉ−ＨｕＩＬ−１２を含むＩＰ緩衝液（０．１５ｍｌ）
中に再懸濁した。抗体被覆ビーズ上に固定されたＩＬ−
１２Ｒを振とう機上で 125Ｉ−ＨｕＩＬ−１２とともに
室温で２時間インキュベートした。このインキュベーシ
ョン後、ビーズをペレット化し、ＩＰ緩衝液を用いて２
回洗い、結合放射能をガンマカウンターで計測した。非
特異的結合はこの検定に７０ｎＭの未標識ヒトＩＬ−１
２を加えることにより測定した。可溶化ＩＬ−１２Ｒ結
合データは、Elsevier-BIOSOFTから McPherson（前掲）
によりＩＢＭパーソナルコンピューターに適合させた非
線形回帰プログラム EBDA および LIGAND を使って、ス
キャッチャードの方法（Assn. N.Y. Acad. Sci. 51, 66
0 (1949)）により解析した。
１２Ｒの検定 免疫沈降検定により同定した抗体がＩＬ−１２Ｒに対し
て特異的であることを確かめるために、免疫沈降／可溶
性ＩＬ−１２Ｒ結合検定を開発した。上記の実施例１に
記載したように、抗体（ハイブリドーマ上清、精製Ｉｇ
Ｇ（５０μｇ）または抗血清として）はアガロースに結
合させたヤギ抗マウスＩｇＧ（１００μｌ；Sigma Che
m. 社）またはセファロース４Ｂに結合させたプロテイ
ンＧ（１００μｌ；Pharmacia 社）に結合させることに
より固定化した。一部の実験では、検定で使用する前
に、抗体をプロテインＧ−セファロース４Ｂに共有結合
で結合させた。Stern and Podlaski, Techniques in Pr
otein Chemistry (1993)を参照されたい。固定化抗体を
ＩＰ緩衝液（０．３ｍｌ）中に再懸濁し、ＩＬ−１２Ｒ
を含むＰＨＡ活性化ＰＢＭＣまたはＫ６細胞の界面活性
剤可溶化抽出液０．２ｍｌを加えた。界面活性剤可溶化
ＩＬ−１２Ｒ調製物を調製するために、細胞を氷冷した
２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ
ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＥＤＴＡで洗い、その後可溶化
緩衝液（8 mM CHAPS, 0.25 M NaCl, 5 mMEDTA, 40μg/m
l PMSF, 0.05% NaN3,および 1% BSA を含有する50 mM
トリス-HCl(pH 8.0) ）中１．５×１０8 細胞／ｍｌで
４℃、１時間可溶化した。抽出液を120,000 ×g 、４℃
で６０分間遠心して核と他の細胞破片を除いた。この混
合物を回転ミキサー上で４℃、１６時間インキュベート
した。このインキュベーション後、遠心によりビーズを
ペレット化し、０．０５〜７．５ｎＭの濃度範囲で 1 25
Ｉ−ＨｕＩＬ−１２を含むＩＰ緩衝液（０．１５ｍｌ）
中に再懸濁した。抗体被覆ビーズ上に固定されたＩＬ−
１２Ｒを振とう機上で 125Ｉ−ＨｕＩＬ−１２とともに
室温で２時間インキュベートした。このインキュベーシ
ョン後、ビーズをペレット化し、ＩＰ緩衝液を用いて２
回洗い、結合放射能をガンマカウンターで計測した。非
特異的結合はこの検定に７０ｎＭの未標識ヒトＩＬ−１
２を加えることにより測定した。可溶化ＩＬ−１２Ｒ結
合データは、Elsevier-BIOSOFTから McPherson（前掲）
によりＩＢＭパーソナルコンピューターに適合させた非
線形回帰プログラム EBDA および LIGAND を使って、ス
キャッチャードの方法（Assn. N.Y. Acad. Sci. 51, 66
0 (1949)）により解析した。
【００６４】実施例６ 抗体による 125Ｉ−ＩＬ−１２受容体の競合的阻害 ＰＨＡ活性化リンパ芽球への 125Ｉ−ＩＬ−１２の結合
を阻害するハイブリドーマ上清液、精製ＩｇＧまたは抗
血清の能力を次のようにして測定した。培養上清、精製
ＩｇＧまたは抗血清の連続希釈液を結合用緩衝液（RPMI
-1640, 5% FBS,25 mM HEPES pH 7.4 ）中で活性化リン
パ芽球（１〜１．５×１０6 細胞）と混合し、旋回振と
う機上で室温で１時間インキュベートした。各チューブ
に 125Ｉ−ＨｕＩＬ−１２（１×１０5 ｃｐｍ）を加
え、室温で１〜２時間インキュベートした。非特異的結
合はこの検定に１０ｎＭの未標識ＩＬ−１２を加えるこ
とにより測定した。インキュベーションは２回または３
回反復して行った。検定混合物を上記のような０．１ｍ
ｌのオイル混合物を通して遠心することにより、細胞に
結合した放射能を遊離の 125Ｉ−ＩＬ−１２から分離し
た。細胞ペレットを含む先端部分を取り出し、細胞結合
放射能をガンマカウンターで計測した。
を阻害するハイブリドーマ上清液、精製ＩｇＧまたは抗
血清の能力を次のようにして測定した。培養上清、精製
ＩｇＧまたは抗血清の連続希釈液を結合用緩衝液（RPMI
-1640, 5% FBS,25 mM HEPES pH 7.4 ）中で活性化リン
パ芽球（１〜１．５×１０6 細胞）と混合し、旋回振と
う機上で室温で１時間インキュベートした。各チューブ
に 125Ｉ−ＨｕＩＬ−１２（１×１０5 ｃｐｍ）を加
え、室温で１〜２時間インキュベートした。非特異的結
合はこの検定に１０ｎＭの未標識ＩＬ−１２を加えるこ
とにより測定した。インキュベーションは２回または３
回反復して行った。検定混合物を上記のような０．１ｍ
ｌのオイル混合物を通して遠心することにより、細胞に
結合した放射能を遊離の 125Ｉ−ＩＬ−１２から分離し
た。細胞ペレットを含む先端部分を取り出し、細胞結合
放射能をガンマカウンターで計測した。
【００６５】実施例７ 125ＩによるヒトＩＬ−１２およびＭａｂ ２−４Ｅ６
の標識 Ｉｏｄｏｇｅｎ法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
社、イリノイ州ロックフォード）の変法によりヒトＩＬ
−１２および精製２−４Ｅ６（実施例１３）ＩｇＧを
125Ｉで標識した。Ｉｏｄｏｇｅｎをクロロホルムに溶
解し、１２ｘ１５ｍｍの珪硼酸ガラス管中で０．０５ｍ
ｇを乾燥した。放射性標識を行うために、Ｔｒｉｓ−ヨ
ウ素化緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．
５、０．４ＭＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ）０．０
５ｍｌを含むＩｏｄｏｇｅｎでコーティングした管に、
１．０ｍＣｉのＮａ［125Ｉ］（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、
イリノイ州シカゴ）を加えて、室温で４分インキュベー
トした。活性化125Ｉ溶液を、Ｔｒｉｓ−ヨウ素化緩衝
液中に０．０５〜０．１ｍｌのＩＬ−１２（７μｇ）ま
たはＩｇＧ（１００μｇ）を含む管に移して反応物を室
温で９分インキュベートした。インキュベーションの最
後にＩｏｄｏｇｅｎストップ緩衝液（Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ’ｓ ＰＢＳ、ｐＨ７．４０中の１０ｍｇ／ｍｌチロ
シン、１０％グリセロール）０．０５ｍｌを加えて３分
反応させた。次いでこの混合物をＴｒｉｓ−ヨウ素化緩
衝液１．０ｍｌで希釈し、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ１０ＤＧ
脱塩カラム（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）でカラムクロマトグラフィーに付した。カラムをＴ
ｒｉｓ−ヨウ素化緩衝液で溶出し、ピーク量の標識タン
パク質を含む画分（１ｍｌ）を合わせ、Ｔｒｉｓ−ヨウ
素化緩衝液中の１％ＢＳＡで１×１０8ｃｐｍ／ｍｌに
希釈した。ＴＣＡ沈降性放射能（ＴＣＡ最終濃度１０
％）は典型的には全放射能の９５％以上であった。比放
射能は典型的には２−４Ｅ６ ＩｇＧについては約１５
００〜２０００ｃｐｍ／ｆｍｏｌであり、ＩＬ−１２に
ついては５０００〜７０００ｃｐｍ／ｆｍｏｌであっ
た。
の標識 Ｉｏｄｏｇｅｎ法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
社、イリノイ州ロックフォード）の変法によりヒトＩＬ
−１２および精製２−４Ｅ６（実施例１３）ＩｇＧを
125Ｉで標識した。Ｉｏｄｏｇｅｎをクロロホルムに溶
解し、１２ｘ１５ｍｍの珪硼酸ガラス管中で０．０５ｍ
ｇを乾燥した。放射性標識を行うために、Ｔｒｉｓ−ヨ
ウ素化緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．
５、０．４ＭＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ）０．０
５ｍｌを含むＩｏｄｏｇｅｎでコーティングした管に、
１．０ｍＣｉのＮａ［125Ｉ］（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、
イリノイ州シカゴ）を加えて、室温で４分インキュベー
トした。活性化125Ｉ溶液を、Ｔｒｉｓ−ヨウ素化緩衝
液中に０．０５〜０．１ｍｌのＩＬ−１２（７μｇ）ま
たはＩｇＧ（１００μｇ）を含む管に移して反応物を室
温で９分インキュベートした。インキュベーションの最
後にＩｏｄｏｇｅｎストップ緩衝液（Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ’ｓ ＰＢＳ、ｐＨ７．４０中の１０ｍｇ／ｍｌチロ
シン、１０％グリセロール）０．０５ｍｌを加えて３分
反応させた。次いでこの混合物をＴｒｉｓ−ヨウ素化緩
衝液１．０ｍｌで希釈し、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ１０ＤＧ
脱塩カラム（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）でカラムクロマトグラフィーに付した。カラムをＴ
ｒｉｓ−ヨウ素化緩衝液で溶出し、ピーク量の標識タン
パク質を含む画分（１ｍｌ）を合わせ、Ｔｒｉｓ−ヨウ
素化緩衝液中の１％ＢＳＡで１×１０8ｃｐｍ／ｍｌに
希釈した。ＴＣＡ沈降性放射能（ＴＣＡ最終濃度１０
％）は典型的には全放射能の９５％以上であった。比放
射能は典型的には２−４Ｅ６ ＩｇＧについては約１５
００〜２０００ｃｐｍ／ｆｍｏｌであり、ＩＬ−１２に
ついては５０００〜７０００ｃｐｍ／ｆｍｏｌであっ
た。
【００６６】実施例８ 完全細胞に対する125Ｉ−２−４Ｅ６の結合検定 ＰＨＡ−活性化ヒトＰＢＭＣを結合緩衝液（ＲＰＭＩ１
６４０、５％ＦＢＳおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７．４）中で１回洗浄し、１．５ｘ１０7細胞／ｍｌの
細胞密度となるよう結合緩衝液中に懸濁した。リンパ芽
球（１．５ｘ１０6細胞）を各種濃度の125Ｉ−２−４Ｅ
６−ＩｇＧ（０．００５〜２ｎＭ）とともに室温で１．
５時間インキュベートした。検定混合物をシリコーン油
０．１ｍｌ中、１０，０００ｘｇで４℃、９０秒遠心す
ることにより、遊離の125Ｉ−２−４Ｅ６ ＩｇＧから
細胞に結合した放射能を分離した。細胞ペレットを含む
先端を切り出し、細胞に結合した放射能をガンマカウン
ターで測定した。検定に６７ｎＭの非標識２−４Ｅ６
ＩｇＧを含めることにより非特異的結合を測定した。イ
ンキュベーションは２回または３回反復して行った。受
容体結合データは、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ＢＩＯＳＯＦＴ
からの上記ＭｃＰｈｅｒｓｏｎによるＩＢＭパーソナル
コンピューターのための非線形回帰プログラムＥＢＤ
Ａ，ＬｉｇａｎｄおよびＫｉｎｅｔｉｃｓを用いて分析
した。
６４０、５％ＦＢＳおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７．４）中で１回洗浄し、１．５ｘ１０7細胞／ｍｌの
細胞密度となるよう結合緩衝液中に懸濁した。リンパ芽
球（１．５ｘ１０6細胞）を各種濃度の125Ｉ−２−４Ｅ
６−ＩｇＧ（０．００５〜２ｎＭ）とともに室温で１．
５時間インキュベートした。検定混合物をシリコーン油
０．１ｍｌ中、１０，０００ｘｇで４℃、９０秒遠心す
ることにより、遊離の125Ｉ−２−４Ｅ６ ＩｇＧから
細胞に結合した放射能を分離した。細胞ペレットを含む
先端を切り出し、細胞に結合した放射能をガンマカウン
ターで測定した。検定に６７ｎＭの非標識２−４Ｅ６
ＩｇＧを含めることにより非特異的結合を測定した。イ
ンキュベーションは２回または３回反復して行った。受
容体結合データは、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ＢＩＯＳＯＦＴ
からの上記ＭｃＰｈｅｒｓｏｎによるＩＢＭパーソナル
コンピューターのための非線形回帰プログラムＥＢＤ
Ａ，ＬｉｇａｎｄおよびＫｉｎｅｔｉｃｓを用いて分析
した。
【００６７】実施例９ ＣＯＳ細胞中における組換えＩＬ−１２Ｒの発現および
125Ｉ−２−４Ｅ６結合の測定 製造者のプロトコールに従いＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ
Ｐｕｌｓｅｒ（２５０μＦ、２５０ボルト）中で、本明
細書で後述する組換えヒトＩＬ−１２Ｒを発現するプラ
スミドＤＮＡ２５μｇを用いてエレクトロポレーション
によりＣＯＳ細胞（４−５ｘ１０7）をトランスフェク
ションした。細胞を６００ｃｍ2の培養プレート中に置
き、７２時間後に掻き取って回収し、洗浄して結合緩衝
液中に再懸濁した。トランスフェクションした細胞（８
ｘ１０4）を徐々に増加する濃度の1 25Ｉで標識した２−
４Ｅ６またはＩＬ−１２とともに室温で２時間インキュ
ベートした。細胞に結合した放射能を上記のように遊離
の125Ｉで標識した２−４Ｅ６またはＩＬ−１２から分
離した。
125Ｉ−２−４Ｅ６結合の測定 製造者のプロトコールに従いＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ
Ｐｕｌｓｅｒ（２５０μＦ、２５０ボルト）中で、本明
細書で後述する組換えヒトＩＬ−１２Ｒを発現するプラ
スミドＤＮＡ２５μｇを用いてエレクトロポレーション
によりＣＯＳ細胞（４−５ｘ１０7）をトランスフェク
ションした。細胞を６００ｃｍ2の培養プレート中に置
き、７２時間後に掻き取って回収し、洗浄して結合緩衝
液中に再懸濁した。トランスフェクションした細胞（８
ｘ１０4）を徐々に増加する濃度の1 25Ｉで標識した２−
４Ｅ６またはＩＬ−１２とともに室温で２時間インキュ
ベートした。細胞に結合した放射能を上記のように遊離
の125Ｉで標識した２−４Ｅ６またはＩＬ−１２から分
離した。
【００６８】実施例１０ ｍＡｂ ２−４Ｅ６を用いた可溶性ＩＬ−１２Ｒのウエ
スタンブロット分析 ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、可
溶化緩衝液（８ｍＭＣＨＡＰＳ、０．２５Ｍ ＮａＣ
ｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、４０μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ、
０．０５％ ＮａＮ3および１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含
む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中に、
０．５〜１ｘ１０8細胞／ｍｌの濃度で４℃、１時間可
溶化した。抽出物を１２，０００ｘｇ、４℃で４５分間
遠心することにより核およびその他の破片を除去した。
抽出物を、架橋アガロース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ社）上に固定化したヤギ抗マウスＩｇＧに結合させ
た２−４Ｅ６ ＩｇＧまたは対照ＩｇＧとともにインキ
ュベートした。沈殿したタンパク質を０．１Ｍグリシン
ｐＨ２．３で処理することによって放出し、３Ｍ Ｔｒ
ｉｓで中和し、１／５容量の５ｘＬａｅｍｍｌｉサンプ
ル緩衝液と混合し、そして８％プレキャストアクリルア
ミドゲル（ＮＯＶＥＸ）上でＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分
離した。分離したタンパク質を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７６．８ｍＭグリシン、２０％
メタノールおよび０．０１％ＳＤＳ中、１００ボルトで
１６時間ニトロセルロース膜（０．２μＭ）に移し取っ
た。ニトロセルロース膜をＢＬＯＴＴＯ（ＰＢＳ＋０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０中の５．０％ｗ／ｖの脱脂粉乳）
でブロックし、２通りのブロットを125Ｉ−２−４Ｅ６
ＩｇＧ（ＰＢＳ中の８ｍＭ ＣＨＡＰＳ、０．２５Ｍ
ＮａＣｌ、１０％ＢＳＡおよび５ｍＭ ＥＤＴＡ中で
１ｘ１０6ｃｐｍ／ｍｌ）＋非標識２−４Ｅ６ ＩｇＧ
（６７ｎＭ）で検出した。
スタンブロット分析 ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、可
溶化緩衝液（８ｍＭＣＨＡＰＳ、０．２５Ｍ ＮａＣ
ｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、４０μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ、
０．０５％ ＮａＮ3および１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含
む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中に、
０．５〜１ｘ１０8細胞／ｍｌの濃度で４℃、１時間可
溶化した。抽出物を１２，０００ｘｇ、４℃で４５分間
遠心することにより核およびその他の破片を除去した。
抽出物を、架橋アガロース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ社）上に固定化したヤギ抗マウスＩｇＧに結合させ
た２−４Ｅ６ ＩｇＧまたは対照ＩｇＧとともにインキ
ュベートした。沈殿したタンパク質を０．１Ｍグリシン
ｐＨ２．３で処理することによって放出し、３Ｍ Ｔｒ
ｉｓで中和し、１／５容量の５ｘＬａｅｍｍｌｉサンプ
ル緩衝液と混合し、そして８％プレキャストアクリルア
ミドゲル（ＮＯＶＥＸ）上でＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分
離した。分離したタンパク質を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７６．８ｍＭグリシン、２０％
メタノールおよび０．０１％ＳＤＳ中、１００ボルトで
１６時間ニトロセルロース膜（０．２μＭ）に移し取っ
た。ニトロセルロース膜をＢＬＯＴＴＯ（ＰＢＳ＋０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０中の５．０％ｗ／ｖの脱脂粉乳）
でブロックし、２通りのブロットを125Ｉ−２−４Ｅ６
ＩｇＧ（ＰＢＳ中の８ｍＭ ＣＨＡＰＳ、０．２５Ｍ
ＮａＣｌ、１０％ＢＳＡおよび５ｍＭ ＥＤＴＡ中で
１ｘ１０6ｃｐｍ／ｍｌ）＋非標識２−４Ｅ６ ＩｇＧ
（６７ｎＭ）で検出した。
【００６９】実施例１１ ｍＡｂ ２−４Ｅ６を用いる蛍光活性化細胞選別法によ
るヒト細胞におけるＩＬ−１２受容体発現の分析 ＩＬ−１２受容体を発現する細胞を染色するために、染
色緩衝液（２％ＦＢＳおよび０．１％ＮａＮ3を含むＰ
ＢＳ）１００μｌ中の１ｘ１０6細胞を、２−４Ｅ６腹
水１０μｌとともに４℃で２５分間インキュベートし
た。次いで細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、ヤギＦ（ａ
ｂ）2抗マウスＩｇ−ＰＥ（Ｔａｇｏ、カリフォルニア
州バーリンゲーム）の１：１００希釈液とともに４℃で
２５分間インキュベートした。染色した細胞を染色緩衝
液で２回洗浄し、ついでＦＡＣＳｃａｎフローサイトメ
ーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析し
た。
るヒト細胞におけるＩＬ−１２受容体発現の分析 ＩＬ−１２受容体を発現する細胞を染色するために、染
色緩衝液（２％ＦＢＳおよび０．１％ＮａＮ3を含むＰ
ＢＳ）１００μｌ中の１ｘ１０6細胞を、２−４Ｅ６腹
水１０μｌとともに４℃で２５分間インキュベートし
た。次いで細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、ヤギＦ（ａ
ｂ）2抗マウスＩｇ−ＰＥ（Ｔａｇｏ、カリフォルニア
州バーリンゲーム）の１：１００希釈液とともに４℃で
２５分間インキュベートした。染色した細胞を染色緩衝
液で２回洗浄し、ついでＦＡＣＳｃａｎフローサイトメ
ーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析し
た。
【００７０】実施例１２ マウス抗−ＩＬ−１２Ｒ抗血清によるヒトＰＨＡ−リン
パ芽球へのＩＬ−１２結合の阻害 ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣで感作したマウスは、ＰＨＡ−
活性化ＰＢＭＣへの12 5Ｉ−ＩＬ−１２結合の阻害（図
８）およびＩＬ−１２Ｒと架橋した125Ｉ−ＩＬ−１２
複合体の免疫沈降（データ示さず）によって測定したと
ころ、ヒトＩＬ−１２Ｒに対する免疫反応を生じてい
た。ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣへの125Ｉ−ＩＬ−１２結
合の半−最大阻害の希釈率は、動物２１１−１および２
１１−２についてそれぞれ１／５００および１／２５０
であった（図８）。これらの抗血清はまた、ＰＨＡ−リ
ンパ芽球増殖検定で測定したところ、ＩＬ−１２の生物
学的活性を中和した（データ示さず）。これらのマウス
から単離した脾細胞をＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合
して得られるハイブリドーマについてまず125Ｉ−ＩＬ
−１２／ＩＬ−１２Ｒ複合体の免疫沈降と、ＩＬ−１２
Ｒへの125Ｉ−ＩＬ−１２結合の阻害によって、ＩＬ−
１２Ｒ特異的抗体をスクリーニングした。
パ芽球へのＩＬ−１２結合の阻害 ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣで感作したマウスは、ＰＨＡ−
活性化ＰＢＭＣへの12 5Ｉ−ＩＬ−１２結合の阻害（図
８）およびＩＬ−１２Ｒと架橋した125Ｉ−ＩＬ−１２
複合体の免疫沈降（データ示さず）によって測定したと
ころ、ヒトＩＬ−１２Ｒに対する免疫反応を生じてい
た。ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣへの125Ｉ−ＩＬ−１２結
合の半−最大阻害の希釈率は、動物２１１−１および２
１１−２についてそれぞれ１／５００および１／２５０
であった（図８）。これらの抗血清はまた、ＰＨＡ−リ
ンパ芽球増殖検定で測定したところ、ＩＬ−１２の生物
学的活性を中和した（データ示さず）。これらのマウス
から単離した脾細胞をＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合
して得られるハイブリドーマについてまず125Ｉ−ＩＬ
−１２／ＩＬ−１２Ｒ複合体の免疫沈降と、ＩＬ−１２
Ｒへの125Ｉ−ＩＬ−１２結合の阻害によって、ＩＬ−
１２Ｒ特異的抗体をスクリーニングした。
【００７１】図８では、125Ｉ−ＩＬ−１２（１００ｐ
Ｍ）の添加前に、マウス抗ＩＬ−１２Ｒ免疫血清（＃２
１１−１および＃２１１−２）と正常マウス血清（ＮＭ
Ｓ）の１０倍連続希釈をＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣととも
にＲＴ（室温）で６０分プレインキュベーションした。
125Ｉ−ＩＬ−１２を加えた後、反応物をＲＴで１〜２
時間インキュベートし、細胞に結合した放射能を測定し
た。データは血清不在下における特異的結合と比較した
免疫血清の存在下での125Ｉ−ＩＬ−１２結合の阻害％
で示した。
Ｍ）の添加前に、マウス抗ＩＬ−１２Ｒ免疫血清（＃２
１１−１および＃２１１−２）と正常マウス血清（ＮＭ
Ｓ）の１０倍連続希釈をＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣととも
にＲＴ（室温）で６０分プレインキュベーションした。
125Ｉ−ＩＬ−１２を加えた後、反応物をＲＴで１〜２
時間インキュベートし、細胞に結合した放射能を測定し
た。データは血清不在下における特異的結合と比較した
免疫血清の存在下での125Ｉ−ＩＬ−１２結合の阻害％
で示した。
【００７２】実施例１３ モノクローナル抗ＩＬ−１２Ｒ抗体の同定および性状決
定 免疫沈降検定により推定上の非中和性抗ＩＬ−１２Ｒ抗
体を分泌する１３個のハイブリドーマを同定し、一方Ｉ
Ｌ−１２Ｒ結合検定により３個の推定上の中和性ＩＬ−
１２Ｒ抗体を同定した（表１）。免疫沈降検定は、固相
上に固定化された推定上の抗ＩＬ−１２Ｒ抗体の、125
Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒの可溶化複合体を捕捉す
る能力を測定した。固定化抗体によって免疫沈降された
放射能が 125Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒの複合体中
に存在することを実証するために、免疫沈降したタンパ
ク質を可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、オートラ
ジオグラフィーで可視化した。ＰＨＡ−活性化ＰＢＭ
Ｃ、Ｋｉｔ−２２５およびＫ６細胞から可溶化した125
Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ複合体の調製物は２１０
−２５０ｋＤａおよび７５ｋＤａの２つの主要な放射性
バンドに分割された（図９）。２１０−２５０ｋＤａお
よび７５ｋＤａ複合体は、それぞれ125Ｉ−ＩＬ−１２
／ＩＬ−１２Ｒ複合体および受容体と複合していない
125Ｉ−ＩＬ−１２であると同定された（図９）。Ｃｈ
ｉｚｚｏｎｉｔｅらのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，３
１１７（１９９２）を参照されたい。細胞抽出物から可
視化された放射性７５ｋＤａのバンドは125Ｉ−ＩＬ−
１２とともに泳動し、このことからそれはＩＬ−１２Ｒ
と結合してはいるがＩＬ−１２Ｒと共有結合的に架橋結
合していない125Ｉ−ＩＬ−１２であることがわかる。
２１０−２５０ｋＤａのバンドは共有結合的に架橋結合
した125Ｉ−ＩＬ−１２のオリゴマーではなかった。な
ぜなら架橋剤ＢＳ３を125Ｉ−ＩＬ−１２に直接加えた
ときにはこのバンドは生成しなかったからである（図
９）。
定 免疫沈降検定により推定上の非中和性抗ＩＬ−１２Ｒ抗
体を分泌する１３個のハイブリドーマを同定し、一方Ｉ
Ｌ−１２Ｒ結合検定により３個の推定上の中和性ＩＬ−
１２Ｒ抗体を同定した（表１）。免疫沈降検定は、固相
上に固定化された推定上の抗ＩＬ−１２Ｒ抗体の、125
Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒの可溶化複合体を捕捉す
る能力を測定した。固定化抗体によって免疫沈降された
放射能が 125Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒの複合体中
に存在することを実証するために、免疫沈降したタンパ
ク質を可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、オートラ
ジオグラフィーで可視化した。ＰＨＡ−活性化ＰＢＭ
Ｃ、Ｋｉｔ−２２５およびＫ６細胞から可溶化した125
Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ複合体の調製物は２１０
−２５０ｋＤａおよび７５ｋＤａの２つの主要な放射性
バンドに分割された（図９）。２１０−２５０ｋＤａお
よび７５ｋＤａ複合体は、それぞれ125Ｉ−ＩＬ−１２
／ＩＬ−１２Ｒ複合体および受容体と複合していない
125Ｉ−ＩＬ−１２であると同定された（図９）。Ｃｈ
ｉｚｚｏｎｉｔｅらのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，３
１１７（１９９２）を参照されたい。細胞抽出物から可
視化された放射性７５ｋＤａのバンドは125Ｉ−ＩＬ−
１２とともに泳動し、このことからそれはＩＬ−１２Ｒ
と結合してはいるがＩＬ−１２Ｒと共有結合的に架橋結
合していない125Ｉ−ＩＬ−１２であることがわかる。
２１０−２５０ｋＤａのバンドは共有結合的に架橋結合
した125Ｉ−ＩＬ−１２のオリゴマーではなかった。な
ぜなら架橋剤ＢＳ３を125Ｉ−ＩＬ−１２に直接加えた
ときにはこのバンドは生成しなかったからである（図
９）。
【００７３】次に推定上の抗ＩＬ−１２Ｒ抗体を分泌す
るハイブリドーマ細胞を限界希釈によりクローン化し、
それぞれ非中和抗体および中和抗体を同定する免疫沈降
ならびに結合検定の阻害の両方によってスクリーニング
した。このクローニングとスクリーニングの間に、推定
上の中和抗ＩＬ−１２Ｒ抗体を分泌するハイブリドーマ
系は回収されなかったが、非中和抗体はもとの免疫沈降
および阻害性陽性ハイブリドーマの両方から回収され
た。この最初の同定とクローニングの後、直接結合検定
を用いて非中和抗体がＩＬ−１２Ｒを発現する細胞にの
み結合するのかどうか調べた。この検定によって、非中
和抗体は、ＩＬ−１２Ｒ陽性ヒト細胞にのみ結合するも
のと、ほとんどのヒト細胞に結合するものとの２つのク
ラスに大別されることがわかった（データ示さず）。そ
れぞれのクラスの代表的抗体である２−４Ｅ６および２
Ｃ６を腹水から産生し、プロテインＧアフィニティーク
ロマトグラフィーによって精製して詳しく性状決定し
た。
るハイブリドーマ細胞を限界希釈によりクローン化し、
それぞれ非中和抗体および中和抗体を同定する免疫沈降
ならびに結合検定の阻害の両方によってスクリーニング
した。このクローニングとスクリーニングの間に、推定
上の中和抗ＩＬ−１２Ｒ抗体を分泌するハイブリドーマ
系は回収されなかったが、非中和抗体はもとの免疫沈降
および阻害性陽性ハイブリドーマの両方から回収され
た。この最初の同定とクローニングの後、直接結合検定
を用いて非中和抗体がＩＬ−１２Ｒを発現する細胞にの
み結合するのかどうか調べた。この検定によって、非中
和抗体は、ＩＬ−１２Ｒ陽性ヒト細胞にのみ結合するも
のと、ほとんどのヒト細胞に結合するものとの２つのク
ラスに大別されることがわかった（データ示さず）。そ
れぞれのクラスの代表的抗体である２−４Ｅ６および２
Ｃ６を腹水から産生し、プロテインＧアフィニティーク
ロマトグラフィーによって精製して詳しく性状決定し
た。
【００７４】図９では、ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣ（ＰＨ
Ａ−ＰＢＭＣ）、Ｋｉｔ−２２５（Ｋｉｔ−２２５）お
よびＫ６（Ｋ６）細胞（１ｘ１０7細胞／ｍｌ）を、２
５ｎＭ非標識ＩＬ−１２の非存在下または存在下に、室
温で２時間125Ｉ−ＩＬ−１２（１００−５００ｐＭ）
とともにインキュベートした。次いで細胞を洗浄し、Ｂ
Ｓ３（最終濃度０．４ｍＭ）とアフィニティー架橋さ
せ、上記のようにして細胞抽出物を調製した。細胞抽出
物を上記した固体支持体に結合したコムギ胚芽レクチン
で沈降させた。沈降したタンパク質をサンプル緩衝液で
処理して放出させ、８．０％スラブゲル上でのＳＤＳ−
ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析し
た。ＩＬ−１２受容体と架橋した125Ｉ−ＩＬ−１２の
複合体は約２１０−２５０ｋＤａの単一主要バンドとし
て泳動する。７５ｋＤａで泳動するバンドは、ＩＬ−１
２受容体と結合するがこれとは架橋しない125Ｉ−ＩＬ
−１２である。125Ｉ−ＩＬ−１２（ＩＬ−１２）およ
びＢＳ３架橋剤で処理した125Ｉ−ＩＬ−１２（ＩＬ−
１２／ＢＳ３）は、７５ｋＤａのＩＬ−１２ヘテロダイ
マーおよびＢＳ３架橋剤により形成されるＩＬ−１２の
オリゴマーのためのマーカーとして平行レーンで電気泳
動にかけた。横に示した分子量は平行レーンで泳動させ
た標準品から概算した。露光時間は７日間であった。
Ａ−ＰＢＭＣ）、Ｋｉｔ−２２５（Ｋｉｔ−２２５）お
よびＫ６（Ｋ６）細胞（１ｘ１０7細胞／ｍｌ）を、２
５ｎＭ非標識ＩＬ−１２の非存在下または存在下に、室
温で２時間125Ｉ−ＩＬ−１２（１００−５００ｐＭ）
とともにインキュベートした。次いで細胞を洗浄し、Ｂ
Ｓ３（最終濃度０．４ｍＭ）とアフィニティー架橋さ
せ、上記のようにして細胞抽出物を調製した。細胞抽出
物を上記した固体支持体に結合したコムギ胚芽レクチン
で沈降させた。沈降したタンパク質をサンプル緩衝液で
処理して放出させ、８．０％スラブゲル上でのＳＤＳ−
ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析し
た。ＩＬ−１２受容体と架橋した125Ｉ−ＩＬ−１２の
複合体は約２１０−２５０ｋＤａの単一主要バンドとし
て泳動する。７５ｋＤａで泳動するバンドは、ＩＬ−１
２受容体と結合するがこれとは架橋しない125Ｉ−ＩＬ
−１２である。125Ｉ−ＩＬ−１２（ＩＬ−１２）およ
びＢＳ３架橋剤で処理した125Ｉ−ＩＬ−１２（ＩＬ−
１２／ＢＳ３）は、７５ｋＤａのＩＬ−１２ヘテロダイ
マーおよびＢＳ３架橋剤により形成されるＩＬ−１２の
オリゴマーのためのマーカーとして平行レーンで電気泳
動にかけた。横に示した分子量は平行レーンで泳動させ
た標準品から概算した。露光時間は７日間であった。
【００７５】 表１ 抗ＩＬ−１２受容体抗体を分泌するハイブリドーマの最初の同定： マウス＃２１１−１および＃２１１−２からの脾細胞 ハイブリドーマ／抗体Ｉ．Ｐ．検定 1 阻害検定 2 （結合ｃｐｍ） ＩＬ−１２Ｒ ２Ｃ６3 １９００ − ２１１−１ １Ａ５ ７２２ − ４Ｅ６ ８４０ − ５Ｃ１ ３１２ ＋ ２１１−２ ３Ｂ１ １３２３ − ４Ａ３ ２１７２ − ４Ｄ６ ８０４ − ５Ｄ５ ８７７ − ４Ａ５ ５０９ ＋ ４Ｃ６ ４５６ ＋ １Ｄ１ １３９５ − ５Ｅ６ ２０４３ − ２−４Ｅ６ ２８３６ − 対照ｍＡｂ ４０２ − 注） １．Ｉ．Ｐ．検定は固定化抗体によって結合される125
Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ複合体の量を測定する。 ２．阻害検定は、125Ｉ−ＩＬ−１２のＰＨＡ−活性化
ＰＢＭＣへの結合を抗体が阻害しうるか、を測定する。 ３．ＩＬ−１２Ｒ ２Ｃ６は、125Ｉ−ＩＬ−１２／Ｉ
Ｌ−１２Ｒ複合体を免疫沈降させ、また多くのＩＬ−１
２Ｒ陽性および陰性ヒト細胞と結合する抗体である。こ
の抗体は多分ＩＬ−１２Ｒと密接に関連する成分を認識
する。
Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ複合体の量を測定する。 ２．阻害検定は、125Ｉ−ＩＬ−１２のＰＨＡ−活性化
ＰＢＭＣへの結合を抗体が阻害しうるか、を測定する。 ３．ＩＬ−１２Ｒ ２Ｃ６は、125Ｉ−ＩＬ−１２／Ｉ
Ｌ−１２Ｒ複合体を免疫沈降させ、また多くのＩＬ−１
２Ｒ陽性および陰性ヒト細胞と結合する抗体である。こ
の抗体は多分ＩＬ−１２Ｒと密接に関連する成分を認識
する。
【００７６】実施例１４ 天然ＩＬ−１２Ｒと結合するモノクローナル抗ＩＬ−１
２Ｒ抗体２−４Ｅ６の性状決定 ｍＡｂ ２−４Ｅ６は、ＰＨＡ−活性化ヒトリンパ芽
球、Ｋｉｔ−２２５およびＫ６細胞から可溶化された
125Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ複合体を免疫沈降す
る（図１０、データはＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣについて
示す）が、これらの細胞上で発現したＩＬ−１２Ｒへの
125Ｉ−ＩＬ−１２の結合を阻害しない。これらのデー
タは２−４Ｅ６抗体が非阻害性または非中和性の抗ＩＬ
−１２Ｒ抗体であることを示唆した。２−４Ｅ６がＩＬ
−１２Ｒに対して特異的な非阻害性抗体であることを確
認するために、２−４Ｅ６を125Ｉで標識してＩＬ−１
２Ｒ陽性および陰性細胞との直接結合検定を実施した。
125Ｉ−２−４Ｅ６はＩＬ−１２Ｒ保持細胞と３３７ｐ
Ｍから９０４ｐＭの範囲の親和性で結合し、１細胞当た
り１５００から５０００の結合部位を同定する（ＰＨＡ
−活性化ＰＢＭＣ、図１１；Ｋ６細胞、図１２）。ＩＬ
−１２は、125Ｉ−２−４Ｅ６のＰＨＡ−活性化ＰＢＭ
Ｃへの結合を阻害せず、２−４Ｅ６が非阻害性／非中和
性抗体であることを示す（図１３）。125Ｉ−２−４Ｅ
６はＫｉｔ−２２５やＹＴ細胞などのＩＬ−１２Ｒを発
現するその他の細胞と結合するが、ＩＬ−１２Ｒ陰性細
胞（非活性化ヒトＰＢＭＣ、ＭＲＣ−５繊維芽細胞およ
びＨＬ−６０細胞）とは結合しない（表２）。
２Ｒ抗体２−４Ｅ６の性状決定 ｍＡｂ ２−４Ｅ６は、ＰＨＡ−活性化ヒトリンパ芽
球、Ｋｉｔ−２２５およびＫ６細胞から可溶化された
125Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ複合体を免疫沈降す
る（図１０、データはＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣについて
示す）が、これらの細胞上で発現したＩＬ−１２Ｒへの
125Ｉ−ＩＬ−１２の結合を阻害しない。これらのデー
タは２−４Ｅ６抗体が非阻害性または非中和性の抗ＩＬ
−１２Ｒ抗体であることを示唆した。２−４Ｅ６がＩＬ
−１２Ｒに対して特異的な非阻害性抗体であることを確
認するために、２−４Ｅ６を125Ｉで標識してＩＬ−１
２Ｒ陽性および陰性細胞との直接結合検定を実施した。
125Ｉ−２−４Ｅ６はＩＬ−１２Ｒ保持細胞と３３７ｐ
Ｍから９０４ｐＭの範囲の親和性で結合し、１細胞当た
り１５００から５０００の結合部位を同定する（ＰＨＡ
−活性化ＰＢＭＣ、図１１；Ｋ６細胞、図１２）。ＩＬ
−１２は、125Ｉ−２−４Ｅ６のＰＨＡ−活性化ＰＢＭ
Ｃへの結合を阻害せず、２−４Ｅ６が非阻害性／非中和
性抗体であることを示す（図１３）。125Ｉ−２−４Ｅ
６はＫｉｔ−２２５やＹＴ細胞などのＩＬ−１２Ｒを発
現するその他の細胞と結合するが、ＩＬ−１２Ｒ陰性細
胞（非活性化ヒトＰＢＭＣ、ＭＲＣ−５繊維芽細胞およ
びＨＬ−６０細胞）とは結合しない（表２）。
【００７７】平衡結合検定により、125Ｉ−ＩＬ−１２
はＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣ、Ｋｉｔ−２２５およびＫ６
細胞の表面上の３つの異なる結合部位を同定することが
示された（Ｋ６細胞のデータは図１４および表２）。上
記スキャッチャード法によるこの結合データの分析は、
これらの親和性がそれぞれ約５−２０ｐＭ、５０−２０
０ｐＭおよび２−６ｎＭであることを示す。１細胞当た
りの125Ｉ−ＩＬ−１２の結合部位の合計数は約１５０
０から５０００であり、これは125Ｉ−２−４Ｅ６によ
って同定された結合部位の合計数とよく一致する（表
２）。このデータはまた、２−４Ｅ６がＩＬ−１２受容
体の低親和性（２−５ｎＭ）結合成分を認識することを
示唆するが、これはちょうど抗−ＴＡＣ抗体がＩＬ−２
受容体の低親和性成分（ｐ５５サブユニット）を認識す
るのと同じである。
はＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣ、Ｋｉｔ−２２５およびＫ６
細胞の表面上の３つの異なる結合部位を同定することが
示された（Ｋ６細胞のデータは図１４および表２）。上
記スキャッチャード法によるこの結合データの分析は、
これらの親和性がそれぞれ約５−２０ｐＭ、５０−２０
０ｐＭおよび２−６ｎＭであることを示す。１細胞当た
りの125Ｉ−ＩＬ−１２の結合部位の合計数は約１５０
０から５０００であり、これは125Ｉ−２−４Ｅ６によ
って同定された結合部位の合計数とよく一致する（表
２）。このデータはまた、２−４Ｅ６がＩＬ−１２受容
体の低親和性（２−５ｎＭ）結合成分を認識することを
示唆するが、これはちょうど抗−ＴＡＣ抗体がＩＬ−２
受容体の低親和性成分（ｐ５５サブユニット）を認識す
るのと同じである。
【００７８】このデータはｍＡｂ ２−４Ｅ６がＩＬ−
１２Ｒに対して特異的な非中和性抗体であることを示唆
するので、ＩＬ−１２Ｒ陽性細胞の表面からｍＡｂ ２
−４Ｅ６によって免疫沈降されたタンパク質の分子量と
125Ｉ−ＩＬ−１２結合性状とを検討した。ＰＨＡ−活
性化ＰＢＭＣ、Ｋｉｔ−２２５およびＫ６細胞の可溶化
抽出物から固定化２−４Ｅ６によって免疫沈降されたタ
ンパク質に対する125Ｉ−ＩＬ−１２の定常状態での結
合は飽和可能で特異的であった（図１５、Ｋ６細胞から
の抽出物についてのデータ）。スキャッチャード法によ
る結合データの換算によって、１８８ｐＭの見かけ親和
性を有する１つの結合部位が明らかとなった。細胞抽出
物から２−４Ｅ６によって免疫沈降されたタンパク質を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロース膜に移し取
り、ウエスタンブロットにおいて 125Ｉ−２−４Ｅ６で
検出した。ウエスタンブロットでは、125Ｉ−２−４Ｅ
６は約９０ｋＤａタンパク質と結合し、このタンパク質
は２−４Ｅ６によってのみ免疫沈降され、抗ＩＬ−１２
抗体または対照抗体によっては免疫沈降されなかった
（図１６、ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣについてのデータを
示す）。要約すると、得られたすべてのデータは、ｍＡ
ｂ ２−４Ｅ６がＩＬ−１２Ｒ陽性細胞の表面上の約９
０ｋＤａの、125Ｉ−ＩＬ−１２と特異的に結合するタ
ンパク質と結合することを示した。
１２Ｒに対して特異的な非中和性抗体であることを示唆
するので、ＩＬ−１２Ｒ陽性細胞の表面からｍＡｂ ２
−４Ｅ６によって免疫沈降されたタンパク質の分子量と
125Ｉ−ＩＬ−１２結合性状とを検討した。ＰＨＡ−活
性化ＰＢＭＣ、Ｋｉｔ−２２５およびＫ６細胞の可溶化
抽出物から固定化２−４Ｅ６によって免疫沈降されたタ
ンパク質に対する125Ｉ−ＩＬ−１２の定常状態での結
合は飽和可能で特異的であった（図１５、Ｋ６細胞から
の抽出物についてのデータ）。スキャッチャード法によ
る結合データの換算によって、１８８ｐＭの見かけ親和
性を有する１つの結合部位が明らかとなった。細胞抽出
物から２−４Ｅ６によって免疫沈降されたタンパク質を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロース膜に移し取
り、ウエスタンブロットにおいて 125Ｉ−２−４Ｅ６で
検出した。ウエスタンブロットでは、125Ｉ−２−４Ｅ
６は約９０ｋＤａタンパク質と結合し、このタンパク質
は２−４Ｅ６によってのみ免疫沈降され、抗ＩＬ−１２
抗体または対照抗体によっては免疫沈降されなかった
（図１６、ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣについてのデータを
示す）。要約すると、得られたすべてのデータは、ｍＡ
ｂ ２−４Ｅ６がＩＬ−１２Ｒ陽性細胞の表面上の約９
０ｋＤａの、125Ｉ−ＩＬ−１２と特異的に結合するタ
ンパク質と結合することを示した。
【００７９】図１０では、125Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−
１２Ｒの可溶性複合体を上記のようにしてＰＨＡ−活性
化ヒトＰＢＭＣから調製し（図９も参照されたい）、固
定化抗体２−４Ｅ６、２Ｃ６、４Ｄ６、２０Ｃ２および
対照によって免疫沈降させた。可溶性複合体は架橋アガ
ロース上で固定化したコムギ胚芽レクチンによっても免
疫沈降させた。沈降したタンパク質を本明細書および図
９に記載する方法で分析した。抗体４Ｄ６および２０Ｃ
２はそれぞれ非中和性および中和性の抗ＩＬ−１２抗体
であった。４Ｄ６は125Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ
複合体ならびに遊離の125Ｉ−ＩＬ−１２を免疫沈降さ
せ、一方２０Ｃ２は遊離の125Ｉ−ＩＬ−１２のみを免
疫沈降させた。２−４Ｅ６および２Ｃ６はいずれも125
Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ複合体を認識する。125
Ｉ−ＩＬ−１２（ＩＬ−１２）およびＢＳ３架橋剤で処
理した125Ｉ−ＩＬ−１２（ＩＬ−１２／ＢＳ３）は、
７５ｋＤａのＩＬ−１２ヘテロダイマーおよびＢＳ３架
橋剤により形成されるＩＬ−１２のオリゴマーのための
マーカーとして平行レーンで電気泳動にかけた。横に示
した分子量は平行レーンで泳動した標準品から概算し
た。露光時間は７日間であった。
１２Ｒの可溶性複合体を上記のようにしてＰＨＡ−活性
化ヒトＰＢＭＣから調製し（図９も参照されたい）、固
定化抗体２−４Ｅ６、２Ｃ６、４Ｄ６、２０Ｃ２および
対照によって免疫沈降させた。可溶性複合体は架橋アガ
ロース上で固定化したコムギ胚芽レクチンによっても免
疫沈降させた。沈降したタンパク質を本明細書および図
９に記載する方法で分析した。抗体４Ｄ６および２０Ｃ
２はそれぞれ非中和性および中和性の抗ＩＬ−１２抗体
であった。４Ｄ６は125Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ
複合体ならびに遊離の125Ｉ−ＩＬ−１２を免疫沈降さ
せ、一方２０Ｃ２は遊離の125Ｉ−ＩＬ−１２のみを免
疫沈降させた。２−４Ｅ６および２Ｃ６はいずれも125
Ｉ−ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ複合体を認識する。125
Ｉ−ＩＬ−１２（ＩＬ−１２）およびＢＳ３架橋剤で処
理した125Ｉ−ＩＬ−１２（ＩＬ−１２／ＢＳ３）は、
７５ｋＤａのＩＬ−１２ヘテロダイマーおよびＢＳ３架
橋剤により形成されるＩＬ−１２のオリゴマーのための
マーカーとして平行レーンで電気泳動にかけた。横に示
した分子量は平行レーンで泳動した標準品から概算し
た。露光時間は７日間であった。
【００８０】図１１では、リンパ芽球（１ｘ１０6細
胞）を２５ｎＭ非標識２−４Ｅ６の非存在下（白丸）ま
たは存在下（黒丸）に、増加する濃度の125Ｉ−２−４
Ｅ６とともに室温で２時間インキュベートした。全体
（白丸）および非特異的（黒丸）細胞結合放射能を上記
のようにして決定した。125Ｉ−２−４Ｅ６の特異的結
合（白三角）は全体の結合から非特異的結合を引くこと
によって計算した。右側の図は、単一部位モデルによる
Ｌｉｇａｎｄコンピュータープログラムによって決定し
たスキャッチャード法による結合データの分析を示す。
胞）を２５ｎＭ非標識２−４Ｅ６の非存在下（白丸）ま
たは存在下（黒丸）に、増加する濃度の125Ｉ−２−４
Ｅ６とともに室温で２時間インキュベートした。全体
（白丸）および非特異的（黒丸）細胞結合放射能を上記
のようにして決定した。125Ｉ−２−４Ｅ６の特異的結
合（白三角）は全体の結合から非特異的結合を引くこと
によって計算した。右側の図は、単一部位モデルによる
Ｌｉｇａｎｄコンピュータープログラムによって決定し
たスキャッチャード法による結合データの分析を示す。
【００８１】図１２では、Ｋ６細胞（１ｘ１０6細胞）
を２５ｎＭ非標識２−４Ｅ６の非存在下（黒丸）または
存在下（白三角）に、増加する濃度の125Ｉ−２−４Ｅ
６とともに室温で２時間インキュベートした。全体（黒
丸）および非特異的（白三角）細胞結合放射能を上記の
ようにして決定した。125Ｉ−２−４Ｅ６の特異的結合
（黒三角）は全体の結合から非特異的結合を引くことに
よって計算した。右側の図は、単一部位モデルによるＬ
ｉｇａｎｄによって決定したスキャッチャード法による
結合データの分析を示す。
を２５ｎＭ非標識２−４Ｅ６の非存在下（黒丸）または
存在下（白三角）に、増加する濃度の125Ｉ−２−４Ｅ
６とともに室温で２時間インキュベートした。全体（黒
丸）および非特異的（白三角）細胞結合放射能を上記の
ようにして決定した。125Ｉ−２−４Ｅ６の特異的結合
（黒三角）は全体の結合から非特異的結合を引くことに
よって計算した。右側の図は、単一部位モデルによるＬ
ｉｇａｎｄによって決定したスキャッチャード法による
結合データの分析を示す。
【００８２】図１３では、データは、非標識競合物質の
非存在下における全体の特異的結合と比較したときの、
表示濃度の非標識抗体またはＩＬ−１２の存在下におい
て細胞に結合した125Ｉ−２−４Ｅ６の量［結合ｃｐｍ
（％）］として表してある。図１４では、Ｋ６細胞（１
ｘ１０6細胞）を５０ｎＭ非標識ＩＬ−１２の非存在下
（白丸）または存在下（黒丸）に、増加する濃度の125
Ｉ−ＩＬ−１２とともに室温で２時間インキュベートし
た。全体（白丸）および非特異的（黒丸）細胞結合放射
能を上記のようにして決定した。125Ｉ−ＩＬ−１２の
特異的結合（白三角）は全体の結合から非特異的結合を
引くことによって計算した。右側の図は、単一部位モデ
ルによるＬｉｇａｎｄによって決定したスキャッチャー
ド法による結合データの分析を示す。
非存在下における全体の特異的結合と比較したときの、
表示濃度の非標識抗体またはＩＬ−１２の存在下におい
て細胞に結合した125Ｉ−２−４Ｅ６の量［結合ｃｐｍ
（％）］として表してある。図１４では、Ｋ６細胞（１
ｘ１０6細胞）を５０ｎＭ非標識ＩＬ−１２の非存在下
（白丸）または存在下（黒丸）に、増加する濃度の125
Ｉ−ＩＬ−１２とともに室温で２時間インキュベートし
た。全体（白丸）および非特異的（黒丸）細胞結合放射
能を上記のようにして決定した。125Ｉ−ＩＬ−１２の
特異的結合（白三角）は全体の結合から非特異的結合を
引くことによって計算した。右側の図は、単一部位モデ
ルによるＬｉｇａｎｄによって決定したスキャッチャー
ド法による結合データの分析を示す。
【００８３】図１５では、Ｋ６細胞（１．５ｘ１０8細
胞／ｍｌ）を８ｍＭ ＣＨＡＰＳ抽出緩衝液で可溶化
し、細胞抽出物（０．２ｍｌ）を、上記のようにしてア
ガロースにカップリングしたヤギ抗マウスＩｇＧ上に固
定化したｍＡｂ ２−４Ｅ６で、４℃、１６時間免疫沈
降させた。このインキュベーションの後、ビーズをペレ
ットとし、洗浄して、７ｐＭから７．５ｎＭの濃度で
125Ｉ−ＩＬ−１２を含むＩＰ緩衝液中に再懸濁した。
２−４Ｅ６でコーティングしたビーズ上に固定化したＩ
Ｌ−１２Ｒを125Ｉ−ＩＬ−１２とともに室温で２時間
インキュベートし、５０ｎＭ非標識ＩＬ−１２の存在下
にＩＬ−１２Ｒ結合放射能を測定した。右側の図は、単
一部位モデルによるＬｉｇａｎｄによって決定したスキ
ャッチャード法による結合データの分析を示す。
胞／ｍｌ）を８ｍＭ ＣＨＡＰＳ抽出緩衝液で可溶化
し、細胞抽出物（０．２ｍｌ）を、上記のようにしてア
ガロースにカップリングしたヤギ抗マウスＩｇＧ上に固
定化したｍＡｂ ２−４Ｅ６で、４℃、１６時間免疫沈
降させた。このインキュベーションの後、ビーズをペレ
ットとし、洗浄して、７ｐＭから７．５ｎＭの濃度で
125Ｉ−ＩＬ−１２を含むＩＰ緩衝液中に再懸濁した。
２−４Ｅ６でコーティングしたビーズ上に固定化したＩ
Ｌ−１２Ｒを125Ｉ−ＩＬ−１２とともに室温で２時間
インキュベートし、５０ｎＭ非標識ＩＬ−１２の存在下
にＩＬ−１２Ｒ結合放射能を測定した。右側の図は、単
一部位モデルによるＬｉｇａｎｄによって決定したスキ
ャッチャード法による結合データの分析を示す。
【００８４】図１６では、ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣ（１
ｘ１０8細胞／ｍｌ）を８ｍＭ ＣＨＡＰＳ抽出緩衝液
で可溶化し、細胞抽出物（１ｍｌ）を図１４に記載した
ようにして免疫沈降させた。このインキュベーションの
後、ビーズをペレットとし、洗浄して、０．１Ｍグリシ
ンｐＨ２．３で処理することによって結合タンパク質を
放出させた。放出されたタンパク質を８％ゲルで非還元
ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜
に移して、上記のように125Ｉ−２−４Ｅ６で検出し
た。横に示した分子量は平行レーンで泳動した標準品
（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｈｉｇｈ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ
ｓ）から概算した。露光時間は７日間であった。
ｘ１０8細胞／ｍｌ）を８ｍＭ ＣＨＡＰＳ抽出緩衝液
で可溶化し、細胞抽出物（１ｍｌ）を図１４に記載した
ようにして免疫沈降させた。このインキュベーションの
後、ビーズをペレットとし、洗浄して、０．１Ｍグリシ
ンｐＨ２．３で処理することによって結合タンパク質を
放出させた。放出されたタンパク質を８％ゲルで非還元
ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜
に移して、上記のように125Ｉ−２−４Ｅ６で検出し
た。横に示した分子量は平行レーンで泳動した標準品
（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｈｉｇｈ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ
ｓ）から概算した。露光時間は７日間であった。
【００８５】 表２ ＩＬ−１２受容体を発現するヒト細胞への ＩＬ−１２および２−４Ｅ６の結合の比較 細胞タイプ ＩＬ−１２結合 1 ２−４Ｅ６結合 2 ＫD 部位数／細胞 ＫD 部位数／細胞 （ｎＭ） （ｎＭ）ヒト細胞 非活性化 ヒトＰＢＭＣ3 全く検出せず 全く検出せず ＰＨＡ−ＰＢＭＣ 0.018 312 0.745 1472-2246 （５−７日） 0.084 501 （３部位） 1.800 1406 Ｋ６細胞 0.016 707 0.489 3116-5259 （３部位） 0.057 939 2.400 4036 Ｋｉｔ−２２５ 0.023 100 0.594 1950 （３部位） 0.210 250 2.360 755 ＹＴ細胞 0.006 24 0.904 4522 （２部位） 0.109 117 ＲＡＪＩ細胞 全く検出できず 0.450 561 ＭＲＣ−５ 全く検出できず 全く検出できずＨＬ−６０ 全く検出できず 全く検出できず 注） １．定常状態125Ｉ−ＩＬ−１２結合検定。見かけ解離
定数（ＫD）および細胞当たりの結合部位数はスキャッ
チャード法によりデータを換算することによって計算し
た。 ２．定数状態125Ｉ−２−４Ｅ６結合検定。スキャッチ
ャード法によりデータを換算した。 ３．ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を方法で記載した
ようにしてＰＨＡで活性化した（ＰＨＡ−ＰＢＭＣ）。
定数（ＫD）および細胞当たりの結合部位数はスキャッ
チャード法によりデータを換算することによって計算し
た。 ２．定数状態125Ｉ−２−４Ｅ６結合検定。スキャッチ
ャード法によりデータを換算した。 ３．ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を方法で記載した
ようにしてＰＨＡで活性化した（ＰＨＡ−ＰＢＭＣ）。
【００８６】実施例１５ ＣＯＳ細胞で発現させたヒト組換えＩＬ−１２Ｒへのｍ
Ａｂ ２−４Ｅ６の結合 ｍＡｂ ２−４Ｅ６によって結合されるタンパク質の性
状はＩＬ−１２Ｒに対する標準的基準を満たすので、ヒ
トＩＬ−１２ＲをコードするｃＤＮＡを単離するための
発現クローニング戦略に２−４Ｅ６を用いた。ヒトＩＬ
−１２ＲをコードするｃＤＮＡをこの方法によって単離
した。ＩＬ−１２Ｒ ｃＤＮＡを哺乳動物細胞発現ベク
ター中に遺伝子操作し、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６５１）細胞中に導入し、そして125Ｉ−ＩＬ−１
２および125Ｉ−２−４Ｅ６の結合に対する特異性を測
定した。ｒＩＬ−１２Ｒを発現するＣＯＳ細胞への125
Ｉ−ＩＬ−１２の定常状態での結合により、２−６ｎＭ
の見かけ親和性と約１５０，０００部位／細胞を有する
１つの結合部位が同定される（図４）。この低親和性の
ＩＬ−１２結合部位は、自然界でＩＬ−１２Ｒを発現す
るヒト細胞による結合検定で見られた低親和性部位に対
応する。ＣＯＳ細胞中で発現したｒＩＬ−１２Ｒへの
125Ｉ−２−４Ｅ６の結合は飽和性で特異的であり、約
５００，０００部位／細胞を同定する（図５）。無関係
なプラスミドでトランスフェクションされたＣＯＳ細胞
は125Ｉ−ＩＬ−１２とも125Ｉ−２−４Ｅ６とも結合し
ない（データ示さず）。これらのデータは明らかに、ｍ
Ａｂ ２−４Ｅ６がＩＬ−１２Ｒの低親和性成分に特異
的であることを示した。
Ａｂ ２−４Ｅ６の結合 ｍＡｂ ２−４Ｅ６によって結合されるタンパク質の性
状はＩＬ−１２Ｒに対する標準的基準を満たすので、ヒ
トＩＬ−１２ＲをコードするｃＤＮＡを単離するための
発現クローニング戦略に２−４Ｅ６を用いた。ヒトＩＬ
−１２ＲをコードするｃＤＮＡをこの方法によって単離
した。ＩＬ−１２Ｒ ｃＤＮＡを哺乳動物細胞発現ベク
ター中に遺伝子操作し、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６５１）細胞中に導入し、そして125Ｉ−ＩＬ−１
２および125Ｉ−２−４Ｅ６の結合に対する特異性を測
定した。ｒＩＬ−１２Ｒを発現するＣＯＳ細胞への125
Ｉ−ＩＬ−１２の定常状態での結合により、２−６ｎＭ
の見かけ親和性と約１５０，０００部位／細胞を有する
１つの結合部位が同定される（図４）。この低親和性の
ＩＬ−１２結合部位は、自然界でＩＬ−１２Ｒを発現す
るヒト細胞による結合検定で見られた低親和性部位に対
応する。ＣＯＳ細胞中で発現したｒＩＬ−１２Ｒへの
125Ｉ−２−４Ｅ６の結合は飽和性で特異的であり、約
５００，０００部位／細胞を同定する（図５）。無関係
なプラスミドでトランスフェクションされたＣＯＳ細胞
は125Ｉ−ＩＬ−１２とも125Ｉ−２−４Ｅ６とも結合し
ない（データ示さず）。これらのデータは明らかに、ｍ
Ａｂ ２−４Ｅ６がＩＬ−１２Ｒの低親和性成分に特異
的であることを示した。
【００８７】図４では、上記のようにヒトｒＩＬ−１２
Ｒを発現するプラスミドでＣＯＳ細胞をトランスフェク
ションした。３日後に、トランスフェクションした細胞
（１ｘ１０4細胞）を、５０ｎＭ非標識ＩＬ−１２の非
存在下（白丸）または存在下（白四角）に、増加する濃
度の125Ｉ−ＩＬ−１２とともに室温で２時間インキュ
ベートした。全体（白丸）および非特異的（白四角）細
胞結合放射能を上記のようにして決定した。125Ｉ−Ｉ
Ｌ−１２の特異的結合（黒三角）は全体の結合から非特
異的結合を引くことによって計算した。右側の図は、単
一部位モデルによるＬｉｇａｎｄによって決定したスキ
ャッチャード法による結合データの分析を示す。
Ｒを発現するプラスミドでＣＯＳ細胞をトランスフェク
ションした。３日後に、トランスフェクションした細胞
（１ｘ１０4細胞）を、５０ｎＭ非標識ＩＬ−１２の非
存在下（白丸）または存在下（白四角）に、増加する濃
度の125Ｉ−ＩＬ−１２とともに室温で２時間インキュ
ベートした。全体（白丸）および非特異的（白四角）細
胞結合放射能を上記のようにして決定した。125Ｉ−Ｉ
Ｌ−１２の特異的結合（黒三角）は全体の結合から非特
異的結合を引くことによって計算した。右側の図は、単
一部位モデルによるＬｉｇａｎｄによって決定したスキ
ャッチャード法による結合データの分析を示す。
【００８８】図５では、上記のようにヒトｒＩＬ−１２
Ｒを発現するプラスミドでＣＯＳ細胞をトランスフェク
ションした。３日後に、トランスフェクションした細胞
（１ｘ１０4細胞）を、５０ｎＭ非標識２−４Ｅ６の非
存在下（白丸）または存在下（白四角）に、増加する濃
度の125Ｉ−２−４Ｅ６とともに室温で２時間インキュ
ベートした。全体（白丸）および非特異的（白四角）細
胞結合放射能を上記のようにして決定した。125Ｉ−２
−４Ｅ６の特異的結合（黒三角）は全体の結合から非特
異的結合を引くことによって計算した。右側の図は、単
一部位モデルによるＬｉｇａｎｄによって決定したスキ
ャッチャード法による結合データの分析を示す。
Ｒを発現するプラスミドでＣＯＳ細胞をトランスフェク
ションした。３日後に、トランスフェクションした細胞
（１ｘ１０4細胞）を、５０ｎＭ非標識２−４Ｅ６の非
存在下（白丸）または存在下（白四角）に、増加する濃
度の125Ｉ−２−４Ｅ６とともに室温で２時間インキュ
ベートした。全体（白丸）および非特異的（白四角）細
胞結合放射能を上記のようにして決定した。125Ｉ−２
−４Ｅ６の特異的結合（黒三角）は全体の結合から非特
異的結合を引くことによって計算した。右側の図は、単
一部位モデルによるＬｉｇａｎｄによって決定したスキ
ャッチャード法による結合データの分析を示す。
【００８９】実施例１６ 蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）によるＩＬ−１２Ｒ
陽性ヒト細胞へのｍＡｂ２−４Ｅ６結合の分析 ヒト細胞上でのＩＬ−１２Ｒの発現レベルは、細胞の活
性状態、細胞のサイクルまたは細胞が単離された状況に
よって制御されうる。以前のデータにより、ＰＢＭＣを
ＰＨＡによって活性化するとＩＬ−１２Ｒ発現が徐々に
上昇し、活性化の３−４日後に最大に達し、その後減少
することが示された。Desai et al. (1992) J. Immuno
l., 148, 3125。ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣ、Ｋｉｔ−２
２５およびＫ６細胞上におけるＩＬ−１２Ｒ発現の不均
一性を調べるために、これらの細胞上でのＩＬ−１２Ｒ
のＦＡＣＳ分析をｍＡｂ ２−４Ｅ６を用いて行った
（図１７）。２−４Ｅ６の結合の蛍光強度は特異的であ
り、これらの３つの型の細胞はおよそ等しい数のＩＬ−
１２Ｒを発現することを示唆した。興味深いことに、Ｆ
ＡＣＳ分析によると、細胞集団はかなり均一で、ある集
団がＩＬ−１２Ｒを全く、あるいは低い数で発現し、第
２集団は非常に高い数のＩＬ−１２Ｒを発現するという
ことはないことを示唆した。
陽性ヒト細胞へのｍＡｂ２−４Ｅ６結合の分析 ヒト細胞上でのＩＬ−１２Ｒの発現レベルは、細胞の活
性状態、細胞のサイクルまたは細胞が単離された状況に
よって制御されうる。以前のデータにより、ＰＢＭＣを
ＰＨＡによって活性化するとＩＬ−１２Ｒ発現が徐々に
上昇し、活性化の３−４日後に最大に達し、その後減少
することが示された。Desai et al. (1992) J. Immuno
l., 148, 3125。ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣ、Ｋｉｔ−２
２５およびＫ６細胞上におけるＩＬ−１２Ｒ発現の不均
一性を調べるために、これらの細胞上でのＩＬ−１２Ｒ
のＦＡＣＳ分析をｍＡｂ ２−４Ｅ６を用いて行った
（図１７）。２−４Ｅ６の結合の蛍光強度は特異的であ
り、これらの３つの型の細胞はおよそ等しい数のＩＬ−
１２Ｒを発現することを示唆した。興味深いことに、Ｆ
ＡＣＳ分析によると、細胞集団はかなり均一で、ある集
団がＩＬ−１２Ｒを全く、あるいは低い数で発現し、第
２集団は非常に高い数のＩＬ−１２Ｒを発現するという
ことはないことを示唆した。
【００９０】図１７では、４日目のＰＨＡ−活性化リン
パ芽球、Ｋｉｔ−２２５およびＫ６細胞を、上記した間
接蛍光抗体標識法を用いてＩＬ−１２Ｒ発現細胞につい
て分析した。図は、ｍＡｂ ２−４Ｅ６の存在下に得ら
れたＩＬ−１２Ｒの特異的染色、およびＩＬ−１受容体
に特異的な対照抗体（抗−ＨｕＩＬ−１Ｒ）、ヒトＩＬ
−１２に特異的な対照抗体（４Ｄ６＋ＧＡＲＴ−ＰＥ
ＣＴＲＬ）およびＰＥと結合したヤギ抗−マウス抗体
（ＧＡＲＴ−ＰＥ ＣＴＲＬ）の存在下に得られた非特
異的染色を示す。
パ芽球、Ｋｉｔ−２２５およびＫ６細胞を、上記した間
接蛍光抗体標識法を用いてＩＬ−１２Ｒ発現細胞につい
て分析した。図は、ｍＡｂ ２−４Ｅ６の存在下に得ら
れたＩＬ−１２Ｒの特異的染色、およびＩＬ−１受容体
に特異的な対照抗体（抗−ＨｕＩＬ−１Ｒ）、ヒトＩＬ
−１２に特異的な対照抗体（４Ｄ６＋ＧＡＲＴ−ＰＥ
ＣＴＲＬ）およびＰＥと結合したヤギ抗−マウス抗体
（ＧＡＲＴ−ＰＥ ＣＴＲＬ）の存在下に得られた非特
異的染色を示す。
【００９１】実施例１７ 細胞培養 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は健常人から採取した血液
から単離した。血液をヘパリン化注射器に取り、等量の
ハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で希釈してＦｉｃ
ｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ上にのせた。管を２０００ｒｐ
ｍで室温、２０分間遠心した。表面にあるＰＢＭＣを回
収してＰＢＳ中の２０％スクロースのクッション１５ｍ
ｌを通して１５００ｒｐｍで１０分間ペレット化した。
ペレット化したＰＢＭＣを組織培養培地に再懸濁して同
じ培地（５％血清を含むＲＰＭＩ１６４０）中で２回洗
浄した。最後に、細胞を１μｇ／ｍｌ ＰＨＡ−Ｐ（Ｄ
ｉｆｃｏ）を含む組織培養培地中、０．５−１ｘ１０6
細胞／ｍｌで、３７℃、５％ＣＯ2で３日間培養した。
細胞を５０Ｕ／ｍｌ ｒｈｕＩＬ−２（Ｒｏｃｈｅ）を
含む培養培地中に１：１で分けて９５％以上のＴ細胞を
得た。翌日、これらの細胞を用いてＩＬ−１２に対する
応答性、放射性リガンド（ＩＬ−１２）結合検定、およ
びＩＬ−１２受容体検出のためのフローサイトメトリー
検定を行った。
から単離した。血液をヘパリン化注射器に取り、等量の
ハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で希釈してＦｉｃ
ｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ上にのせた。管を２０００ｒｐ
ｍで室温、２０分間遠心した。表面にあるＰＢＭＣを回
収してＰＢＳ中の２０％スクロースのクッション１５ｍ
ｌを通して１５００ｒｐｍで１０分間ペレット化した。
ペレット化したＰＢＭＣを組織培養培地に再懸濁して同
じ培地（５％血清を含むＲＰＭＩ１６４０）中で２回洗
浄した。最後に、細胞を１μｇ／ｍｌ ＰＨＡ−Ｐ（Ｄ
ｉｆｃｏ）を含む組織培養培地中、０．５−１ｘ１０6
細胞／ｍｌで、３７℃、５％ＣＯ2で３日間培養した。
細胞を５０Ｕ／ｍｌ ｒｈｕＩＬ−２（Ｒｏｃｈｅ）を
含む培養培地中に１：１で分けて９５％以上のＴ細胞を
得た。翌日、これらの細胞を用いてＩＬ−１２に対する
応答性、放射性リガンド（ＩＬ−１２）結合検定、およ
びＩＬ−１２受容体検出のためのフローサイトメトリー
検定を行った。
【００９２】このような４日間の活性化ＰＨＡ芽球上で
のＩＬ−１２受容体のフローサイトメトリーによる検出
は以下のようにして行った：細胞をＰＢＳで２回洗浄
し、２％ウシ胎児血清および０．１％アジ化ナトリウム
を含むＰＢＳ中に２ｘ１０6細胞／ｍｌで再懸濁した。
以下のすべての操作は４℃で実施した。１ｘ１０6個の
細胞を１ｎＭヒトＩＬ−１２中で４０分間インキュベー
トした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、ビオチン化
ラット抗ヒトｐ４０ ＩＬ−１２サブユニット抗体４Ｄ
６（実施例１３）約１μｇとともに２０分間インキュベ
ートした。細胞を再び洗浄し、５μｇ／ｍｌストレプト
アビジン−フィコエリスリチン結合体（Ｆｉｓｈｅｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈ）１００μｌ中に１５分間再懸濁した。
次いで細胞を再び洗浄し、その後ＦＡＣＳＡＮフローサ
イトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で
分析した。
のＩＬ−１２受容体のフローサイトメトリーによる検出
は以下のようにして行った：細胞をＰＢＳで２回洗浄
し、２％ウシ胎児血清および０．１％アジ化ナトリウム
を含むＰＢＳ中に２ｘ１０6細胞／ｍｌで再懸濁した。
以下のすべての操作は４℃で実施した。１ｘ１０6個の
細胞を１ｎＭヒトＩＬ−１２中で４０分間インキュベー
トした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、ビオチン化
ラット抗ヒトｐ４０ ＩＬ−１２サブユニット抗体４Ｄ
６（実施例１３）約１μｇとともに２０分間インキュベ
ートした。細胞を再び洗浄し、５μｇ／ｍｌストレプト
アビジン−フィコエリスリチン結合体（Ｆｉｓｈｅｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈ）１００μｌ中に１５分間再懸濁した。
次いで細胞を再び洗浄し、その後ＦＡＣＳＡＮフローサ
イトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で
分析した。
【００９３】実施例１８ ＲＮＡの抽出および性状決定 上記のＰＨＡ活性化細胞を２−３日で回収して全ＲＮＡ
を文献（P.Chomczynski and N.Sacchi (1987) Anal. Bi
ochem., 162, 156）記載のイソチアン酸グアニジン／フ
ェノール法を用いて抽出した。文献（K.Kuribayashi et
al. (1988) Nucl. Acids Res. Symposium Series 19,
61）記載の方法を用いて、オリゴｄＴラテックスビーズ
への１バッチ吸収によって全ＲＮＡからＰｏｌｙ Ａ＋
ＲＮＡを単離した。この精製の質量収率は約４％であっ
た。
を文献（P.Chomczynski and N.Sacchi (1987) Anal. Bi
ochem., 162, 156）記載のイソチアン酸グアニジン／フ
ェノール法を用いて抽出した。文献（K.Kuribayashi et
al. (1988) Nucl. Acids Res. Symposium Series 19,
61）記載の方法を用いて、オリゴｄＴラテックスビーズ
への１バッチ吸収によって全ＲＮＡからＰｏｌｙ Ａ＋
ＲＮＡを単離した。この精製の質量収率は約４％であっ
た。
【００９４】ＲＮＡブロットは以下のように行った。Ｒ
ＮＡを、２．２Ｍホルムアルデヒドの存在下に変性条件
下で１．２％アガロースゲル中に分画し、次いで文献
（Molecular Cloning, a Laboratory Manual, second e
dition, J.Sambrook, E.F.Fritsch, T.Maniatis, Cold
Spring Harbour Laboratory Press 1989 (以下、 Molecu
lar Cloning Manualという））記載の方法でニトロセル
ロースに移した。ＲＮＡブロットを、５ｘＳＳＣ（１ｘ
ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ−０．０１５Ｍクエン酸
ナトリウム）−５０％ホルムアミド−５ｘＤｅｎｈａｒ
ｄｔｓ溶液（１ｘＤｅｎｈａｒｄｔｓ＝０．０２％ポリ
ビニルピロリドン、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ４００、
０．０２％ウシ血清アルブミン分画Ｖ）−０．３％ Ｓ
ＤＳ−２５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子キャリアＤＮＡ
中、標識プローブと３７℃で一晩ハイブリダイズした
（７ｘ１０5ｃｐｍ／ｍｌ、３０ｍｌ）。プローブは上
記マニュアルに記載の方法で、ＩＬ−１２受容体ｃＤＮ
ＡクローンＮｏ．５由来のゲル単離したインサートをラ
ンダムプライマー標識することにより作製した。ブロッ
トをまず室温中、２ｘＳＳＣで素早くリンスし、ついで
０．１ｘＳＳＣで５０℃、３０分洗浄し、乾燥してＫｏ
ｄａｋ ＸＡＲフィルムに−７０℃で３日間露光した。
ＮＡを、２．２Ｍホルムアルデヒドの存在下に変性条件
下で１．２％アガロースゲル中に分画し、次いで文献
（Molecular Cloning, a Laboratory Manual, second e
dition, J.Sambrook, E.F.Fritsch, T.Maniatis, Cold
Spring Harbour Laboratory Press 1989 (以下、 Molecu
lar Cloning Manualという））記載の方法でニトロセル
ロースに移した。ＲＮＡブロットを、５ｘＳＳＣ（１ｘ
ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ−０．０１５Ｍクエン酸
ナトリウム）−５０％ホルムアミド−５ｘＤｅｎｈａｒ
ｄｔｓ溶液（１ｘＤｅｎｈａｒｄｔｓ＝０．０２％ポリ
ビニルピロリドン、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ４００、
０．０２％ウシ血清アルブミン分画Ｖ）−０．３％ Ｓ
ＤＳ−２５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子キャリアＤＮＡ
中、標識プローブと３７℃で一晩ハイブリダイズした
（７ｘ１０5ｃｐｍ／ｍｌ、３０ｍｌ）。プローブは上
記マニュアルに記載の方法で、ＩＬ−１２受容体ｃＤＮ
ＡクローンＮｏ．５由来のゲル単離したインサートをラ
ンダムプライマー標識することにより作製した。ブロッ
トをまず室温中、２ｘＳＳＣで素早くリンスし、ついで
０．１ｘＳＳＣで５０℃、３０分洗浄し、乾燥してＫｏ
ｄａｋ ＸＡＲフィルムに−７０℃で３日間露光した。
【００９５】実施例１９ ｃＤＮＡライブラリー 上記のＰｏｌｙ Ａ＋ＲＮＡから、以下のようにして哺
乳動物発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ中にｃＤＮＡライブ
ラリーを樹立した：Ｐｏｌｙ Ａ＋ＲＮＡ３μｇをＲＮ
ａｓｅＨマイナス逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｐ．
Ｏ．Ｂｏｘ ９４１８、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍ
Ｄ ２０８９８）を用いて一本鎖ｃＤＮＡに逆転写し
た。得られたｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを確立さ
れた手法（U.Gubler and A.Chua, Essential Molecular
Biology Volume II, T.A.Brown 編集、 pp.39-56, IRL
Press1991）で平滑末端二本鎖ｃＤＮＡに変換した。Ｂ
ｓｔＸＩリンカー（A.Aruffo and B.Seed, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1987) 84, 8573）を得られたｃＤＮ
Ａにライゲートし、８００塩基対（ｂｐ）以上のｃＤＮ
ＡをＳｅｐｈａｃｒｙｌＳＦ５００カラムで選択した。
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ＳＦ５００カラム（０．８ｘ２９
ｃｍ）は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．８−１
ｍＭ ＥＤＴＡ−１００ｍＭ 酢酸ナトリウム中で重力
によって充填した。ＢｓｔＸＩ結合ｃＤＮＡをカラムに
かけ、０．５ｍｌの分画を回収した。各分画から少量を
とり、１％アガロースゲル上で電気泳動し、ゲルを乾燥
し、ゲルをＸ線フィルムに露光することにより放射性ｃ
ＤＮＡのサイズ分布を可視化した。８００ｂｐ以上のｃ
ＤＮＡ分子をこのようにして選択し、これを集めてエタ
ノール沈殿によって濃縮し、次いでクローニングベクタ
ーにライゲートした。クローニングベクターは、あらか
じめＢｓｔＸＩで切断し２回連続してゲル精製したプラ
スミドｐＥＦ ＢＯＳ（下記の文献を参照のこと）であ
った。プラスミドＤＮＡ３００ｎｇを上記のサイズ選択
したｃＤＮＡ３０ｎｇと、ライゲーション緩衝液（５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．８−１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2−１０ｍＭ ＤＴＴ−１ｍＭｒＡＴＰ−２５μｇ
／ｍｌウシ血清アルブミン）６０μｌ中、１５℃で一晩
ライゲートさせた。翌日、ライゲーション反応物をフェ
ノールで抽出し、イガイグリコーゲン６μｇを加え、核
酸をエタノールで沈殿させた。沈殿を水に溶解し、沈殿
を繰り返し、次いで８０％エタノールで洗浄した。最後
にペレットを水６μｌに溶解し、そのうちの１μｌを
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ−１０Ｂ（ＢＲＬ）株にエレクトロ
ポレーションした。このようにして５つをエレクトロポ
レーションし、約１０００万個の組換え体のライブラリ
ーを作製し、以後の試験に使用した。
乳動物発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ中にｃＤＮＡライブ
ラリーを樹立した：Ｐｏｌｙ Ａ＋ＲＮＡ３μｇをＲＮ
ａｓｅＨマイナス逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｐ．
Ｏ．Ｂｏｘ ９４１８、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍ
Ｄ ２０８９８）を用いて一本鎖ｃＤＮＡに逆転写し
た。得られたｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを確立さ
れた手法（U.Gubler and A.Chua, Essential Molecular
Biology Volume II, T.A.Brown 編集、 pp.39-56, IRL
Press1991）で平滑末端二本鎖ｃＤＮＡに変換した。Ｂ
ｓｔＸＩリンカー（A.Aruffo and B.Seed, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1987) 84, 8573）を得られたｃＤＮ
Ａにライゲートし、８００塩基対（ｂｐ）以上のｃＤＮ
ＡをＳｅｐｈａｃｒｙｌＳＦ５００カラムで選択した。
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ＳＦ５００カラム（０．８ｘ２９
ｃｍ）は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．８−１
ｍＭ ＥＤＴＡ−１００ｍＭ 酢酸ナトリウム中で重力
によって充填した。ＢｓｔＸＩ結合ｃＤＮＡをカラムに
かけ、０．５ｍｌの分画を回収した。各分画から少量を
とり、１％アガロースゲル上で電気泳動し、ゲルを乾燥
し、ゲルをＸ線フィルムに露光することにより放射性ｃ
ＤＮＡのサイズ分布を可視化した。８００ｂｐ以上のｃ
ＤＮＡ分子をこのようにして選択し、これを集めてエタ
ノール沈殿によって濃縮し、次いでクローニングベクタ
ーにライゲートした。クローニングベクターは、あらか
じめＢｓｔＸＩで切断し２回連続してゲル精製したプラ
スミドｐＥＦ ＢＯＳ（下記の文献を参照のこと）であ
った。プラスミドＤＮＡ３００ｎｇを上記のサイズ選択
したｃＤＮＡ３０ｎｇと、ライゲーション緩衝液（５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．８−１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2−１０ｍＭ ＤＴＴ−１ｍＭｒＡＴＰ−２５μｇ
／ｍｌウシ血清アルブミン）６０μｌ中、１５℃で一晩
ライゲートさせた。翌日、ライゲーション反応物をフェ
ノールで抽出し、イガイグリコーゲン６μｇを加え、核
酸をエタノールで沈殿させた。沈殿を水に溶解し、沈殿
を繰り返し、次いで８０％エタノールで洗浄した。最後
にペレットを水６μｌに溶解し、そのうちの１μｌを
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ−１０Ｂ（ＢＲＬ）株にエレクトロ
ポレーションした。このようにして５つをエレクトロポ
レーションし、約１０００万個の組換え体のライブラリ
ーを作製し、以後の試験に使用した。
【００９６】実施例２０ パニングによるＩＬ−１２受容体ｃＤＮＡのスクリーニ
ング パニング法の基本原理は以下に示すように A.Aruffo an
d B.Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84, 85
73に記載されている。それぞれ約５０，０００クローン
を表す１０ライブラリーアリコットをＬＢ ａｍｐプレ
ートに入れて、一晩増殖した。翌日、各プールからのコ
ロニーを各５０ｍｌアリコットのＬＢ＋ａｍｐ中に掻き
取り、さらに２時間培養を続け、ＱＩＡＧＥＮプラスミ
ドキットを用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。次い
で、ＤＥＡＥデキストラン法を用いて１０個のＤＮＡプ
ールをＣＯＳ細胞にトランスフェクションした（２００
万個ＣＯＳ細胞／直径９ｃｍプレートおよびＤＮＡ２．
５μｇ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａ
ｎｕａｌ）。２〜３日後に、ＰＢＳ中の０．５ｍＭＥＤ
ＴＡ／０．０２％アジ化ナトリウムを用いてＣＯＳ細胞
をプレートから分離し、各プレートにつき単一細胞懸濁
液を調製した。次いで上記したモノクローナル抗ＩＬ−
１２受容体抗体２−４Ｅ６を懸濁液中の細胞と結合させ
た（ＰＢＳ−０．５ｍＭ ＥＤＴＡ−０．０２％アジ化
ナトリウム−５％ＦＣＳ中１０μｇ／ｍｌ、１時間、氷
上）。次いで細胞懸濁液を上記緩衝液中の２％Ｆｉｃｏ
ｌｌ層を通して遠心（卓上遠心、１０００ｒｐｍ、４
分）して過剰の非結合抗体を除去し、細胞をおだやかに
同じ緩衝液中に再懸濁した。次いで１つのプールからの
細胞を、あらかじめポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ
（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．５中２０μｇ
／ｍｌ、室温／一晩（ＯＮ））でコーティングしＰＢＳ
中の１％ＢＳＡでブロックしておいた（３７℃／１時
間）１つの細菌用ペトリ皿（直径９ｃｍ）に加えた。こ
のようにしてＣＯＳ細胞を室温で２時間パニングした。
次いで非接着細胞をＰＢＳでおだやかに洗浄し去り、残
った皿に接着した細胞にＨｉｒｔ溶菌溶液（０．６％Ｓ
ＤＳ−１０ｍＭ ＥＤＴＡ）０．８ｍｌを加えて溶菌し
た。エッペンドルフ管に移した後、溶菌物を１Ｍ Ｎａ
Ｃｌとし、４℃でＯＮインキュベートし、次いで冷却し
て１５，０００ｒｐｍで１０分遠心した。上清をフェノ
ールで１回抽出し、イガイグリコーゲン１２μｇを加え
て７．５Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ０．５容量とエタノール２．
５容量を加えることによりＤＮＡを２回沈殿させた。得
られたＤＮＡペレットを８０％エタノールで洗浄し、乾
燥して蒸留水１μｌ中に取った。次いで全沈殿物をＥ．
ｃｏｌｉ ＤＨ−１０Ｂ株にエレクトロポレーションし
得られたコロニーをＯＮ増殖した。これがパニング１サ
イクルを表す。１０個のライブラリーアリコットにつき
それぞれ別々に合計３サイクルのパニングを行った。
ング パニング法の基本原理は以下に示すように A.Aruffo an
d B.Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84, 85
73に記載されている。それぞれ約５０，０００クローン
を表す１０ライブラリーアリコットをＬＢ ａｍｐプレ
ートに入れて、一晩増殖した。翌日、各プールからのコ
ロニーを各５０ｍｌアリコットのＬＢ＋ａｍｐ中に掻き
取り、さらに２時間培養を続け、ＱＩＡＧＥＮプラスミ
ドキットを用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。次い
で、ＤＥＡＥデキストラン法を用いて１０個のＤＮＡプ
ールをＣＯＳ細胞にトランスフェクションした（２００
万個ＣＯＳ細胞／直径９ｃｍプレートおよびＤＮＡ２．
５μｇ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａ
ｎｕａｌ）。２〜３日後に、ＰＢＳ中の０．５ｍＭＥＤ
ＴＡ／０．０２％アジ化ナトリウムを用いてＣＯＳ細胞
をプレートから分離し、各プレートにつき単一細胞懸濁
液を調製した。次いで上記したモノクローナル抗ＩＬ−
１２受容体抗体２−４Ｅ６を懸濁液中の細胞と結合させ
た（ＰＢＳ−０．５ｍＭ ＥＤＴＡ−０．０２％アジ化
ナトリウム−５％ＦＣＳ中１０μｇ／ｍｌ、１時間、氷
上）。次いで細胞懸濁液を上記緩衝液中の２％Ｆｉｃｏ
ｌｌ層を通して遠心（卓上遠心、１０００ｒｐｍ、４
分）して過剰の非結合抗体を除去し、細胞をおだやかに
同じ緩衝液中に再懸濁した。次いで１つのプールからの
細胞を、あらかじめポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ
（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．５中２０μｇ
／ｍｌ、室温／一晩（ＯＮ））でコーティングしＰＢＳ
中の１％ＢＳＡでブロックしておいた（３７℃／１時
間）１つの細菌用ペトリ皿（直径９ｃｍ）に加えた。こ
のようにしてＣＯＳ細胞を室温で２時間パニングした。
次いで非接着細胞をＰＢＳでおだやかに洗浄し去り、残
った皿に接着した細胞にＨｉｒｔ溶菌溶液（０．６％Ｓ
ＤＳ−１０ｍＭ ＥＤＴＡ）０．８ｍｌを加えて溶菌し
た。エッペンドルフ管に移した後、溶菌物を１Ｍ Ｎａ
Ｃｌとし、４℃でＯＮインキュベートし、次いで冷却し
て１５，０００ｒｐｍで１０分遠心した。上清をフェノ
ールで１回抽出し、イガイグリコーゲン１２μｇを加え
て７．５Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ０．５容量とエタノール２．
５容量を加えることによりＤＮＡを２回沈殿させた。得
られたＤＮＡペレットを８０％エタノールで洗浄し、乾
燥して蒸留水１μｌ中に取った。次いで全沈殿物をＥ．
ｃｏｌｉ ＤＨ−１０Ｂ株にエレクトロポレーションし
得られたコロニーをＯＮ増殖した。これがパニング１サ
イクルを表す。１０個のライブラリーアリコットにつき
それぞれ別々に合計３サイクルのパニングを行った。
【００９７】各プールの最後のサイクルからＤＮＡを再
度抽出し、プラスティック１室顕微鏡スライド（１プー
ル当たりスライド２枚）上に置いたＣＯＳ細胞中にトラ
ンスフェクションした。トランスフェクションの２〜３
日後に、１枚のスライドには標識ヒトＩＬ−１２を結合
させ（５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中１０6ｃｐ
ｍ／ｍｌ＝３００ｐＭ、２〜３時間、４℃）、もう１枚
のスライドには標識モノクローナル抗体２−４Ｅ６を結
合させた（５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中２ｘ１
０6ｃｐｍ／ｍｌ＝１ｎＭ、１時間、室温）。これらの
スライドをＰＢＳ中で洗浄し、メタノール：アセトン
（７：３）の冷混合物中で４０秒間固定しし、風乾し
た。次いでスライドをＫｏｄａｋ写真用乳剤ＮＴＢ２中
に浸して風乾し、暗室で２〜４日、４℃で露光した。こ
れらをＫｏｄａｋ Ｄ１０現像液中で製造者の指示にし
たがって現像し、１０〜４０倍の明視野倍率を用いる光
学顕微鏡で評価した。１０個のプールのうちの１つであ
るＮｏ．５はＩＬ−１２および２−４Ｅ６の両方に結合
した多数の陽性細胞を示した。このパニングを３回行っ
たプールからのＥ．ｃｏｌｉクローンを次いでマイクロ
タイタープレートにのせた（合計２８８クローンを１ウ
エル当たり３クローン）。このプレートからの８列１２
カラムを表すプールを増殖させ、そのプラスミドＤＮＡ
を抽出した。この２０沈殿物を１２ウエルプレート上の
ＣＯＳ細胞に別々にトランスフェクションした（１０5
細胞ウエル、１プール当たり４ウエル）。トランスフェ
クションの２〜３日後に、２個のウエル中の細胞に標識
ＩＬ−１２を結合（全結合）させ、一方他の１プール当
たり２個のウエルには標識ＩＬ−１２および１００倍モ
ル過剰の冷ＩＬ−１２を結合（非特異的結合）させた。
ウエルを洗浄し、結合放射能を１％ＳＤＳ０．５ｍｌで
溶出し、ガンマカウンターで計数した。このようにして
２個の陽性プールを同定し、このうちの１つはカラム１
を表し、他の１つはマイクロタイタープレートからのＦ
列を表す。したがって、ウエルＦ１からのＥ．ｃｏｌｉ
クローンがＩＬ−１２結合活性を含んでいるに違いな
い。このウエルからのクローンをまいて、１０個の単一
コロニーからのＤＮＡを分析してプラスミドインサート
の大きさを測定した。１０個のコロニーのうちの３個が
約２．１キロ塩基の長さを示し、これはＩＬ−１２受容
体をコードするには十分な大きさである。これらのクロ
ーンのうちの１つを用いてさらに分析を行った。
度抽出し、プラスティック１室顕微鏡スライド（１プー
ル当たりスライド２枚）上に置いたＣＯＳ細胞中にトラ
ンスフェクションした。トランスフェクションの２〜３
日後に、１枚のスライドには標識ヒトＩＬ−１２を結合
させ（５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中１０6ｃｐ
ｍ／ｍｌ＝３００ｐＭ、２〜３時間、４℃）、もう１枚
のスライドには標識モノクローナル抗体２−４Ｅ６を結
合させた（５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中２ｘ１
０6ｃｐｍ／ｍｌ＝１ｎＭ、１時間、室温）。これらの
スライドをＰＢＳ中で洗浄し、メタノール：アセトン
（７：３）の冷混合物中で４０秒間固定しし、風乾し
た。次いでスライドをＫｏｄａｋ写真用乳剤ＮＴＢ２中
に浸して風乾し、暗室で２〜４日、４℃で露光した。こ
れらをＫｏｄａｋ Ｄ１０現像液中で製造者の指示にし
たがって現像し、１０〜４０倍の明視野倍率を用いる光
学顕微鏡で評価した。１０個のプールのうちの１つであ
るＮｏ．５はＩＬ−１２および２−４Ｅ６の両方に結合
した多数の陽性細胞を示した。このパニングを３回行っ
たプールからのＥ．ｃｏｌｉクローンを次いでマイクロ
タイタープレートにのせた（合計２８８クローンを１ウ
エル当たり３クローン）。このプレートからの８列１２
カラムを表すプールを増殖させ、そのプラスミドＤＮＡ
を抽出した。この２０沈殿物を１２ウエルプレート上の
ＣＯＳ細胞に別々にトランスフェクションした（１０5
細胞ウエル、１プール当たり４ウエル）。トランスフェ
クションの２〜３日後に、２個のウエル中の細胞に標識
ＩＬ−１２を結合（全結合）させ、一方他の１プール当
たり２個のウエルには標識ＩＬ−１２および１００倍モ
ル過剰の冷ＩＬ−１２を結合（非特異的結合）させた。
ウエルを洗浄し、結合放射能を１％ＳＤＳ０．５ｍｌで
溶出し、ガンマカウンターで計数した。このようにして
２個の陽性プールを同定し、このうちの１つはカラム１
を表し、他の１つはマイクロタイタープレートからのＦ
列を表す。したがって、ウエルＦ１からのＥ．ｃｏｌｉ
クローンがＩＬ−１２結合活性を含んでいるに違いな
い。このウエルからのクローンをまいて、１０個の単一
コロニーからのＤＮＡを分析してプラスミドインサート
の大きさを測定した。１０個のコロニーのうちの３個が
約２．１キロ塩基の長さを示し、これはＩＬ−１２受容
体をコードするには十分な大きさである。これらのクロ
ーンのうちの１つを用いてさらに分析を行った。
【００９８】実施例２１ ＩＬ−１２受容体ｃＤＮＡの性状決定 ＩＬ−１２受容体クローンＮｏ．５を上記のようにして
取り出しプラスミドＤＮＡを単離した。次いでゲル単離
したインサートを、熱安定ＤＮＡポリメラーゼおよび染
料標識ジデオキシヌクレオチドをターミネーターとして
結合したＡＢＩ自動ＤＮＡ配列決定機を用いて両方の鎖
の配列を決定した。
取り出しプラスミドＤＮＡを単離した。次いでゲル単離
したインサートを、熱安定ＤＮＡポリメラーゼおよび染
料標識ジデオキシヌクレオチドをターミネーターとして
結合したＡＢＩ自動ＤＮＡ配列決定機を用いて両方の鎖
の配列を決定した。
【００９９】突然変異データマトリックスをもつＡＬＩ
ＧＮプログラム（M.O.Dayhoff et al. (1983) Meth. En
zymol. 91, 524）を用いて、６および１００ランダムラ
ンのブレークペナルティーで配列を解析した。クローン
化ＩＬ−１２受容体ｃＤＮＡを、ＤＥＡＥデキストラン
トランスフェクションまたはエレクトロポレーション法
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａ
ｌ）を用いてＣＯＳ細胞中で発現させた。抗ヒトＩＬ−
１２受容体抗体のもとにおける標識ＩＬ−１２または標
識２−４Ｅ６抗体との結合検定を上記した方法で行っ
た。結合データを分析し、抗ヒトＩＬ−１２受容体抗体
のもとにおける上記したＬｉｇａｎｄプログラムを用い
て、スキャッチャード法によってＫｄ値を計算した。35
ＳシステインによるＣＯＳ細胞（直径３５ｍｍの組織培
養皿当たり３ｘ１０5細胞）のインビボ標識（６時間）
をトランスフェクションの３日後に上記のように行った
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａ
ｌ）。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、ＣＨＡＰＳ溶菌緩衝液
（１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ−３００ｍＭ ＮａＣｌ−５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４−２ｍｇ／ｍｌイ
ンドアセトアミド−０．１７ｍｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ）中
で溶菌し、プロテインＧセファロースビーズ（１ｍｌ当
たり５０μｌ充填ビーズ、Ｇｅｎｅｘ）および正常マウ
ス血清（最終濃度２５％）とともに４℃で一晩インキュ
ベーションして前精製した。ビーズを遠心して、試料１
ｍｌ当たり２−４Ｅ６抗体５μｇを加えることにより精
製溶菌物から標識ＩＬ−１２受容体を特異的に免疫沈降
させた。抗体を１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中
に希釈し、充填ビーズ５０μｌ上に４℃で２〜３時間の
せた。免疫沈降は４℃一晩で実施した。翌日、ビーズを
ＣＨＡＰＳ溶菌緩衝液中で３〜４回洗浄した後、上記の
方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕ
ａｌ）によりＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析し
た。
ＧＮプログラム（M.O.Dayhoff et al. (1983) Meth. En
zymol. 91, 524）を用いて、６および１００ランダムラ
ンのブレークペナルティーで配列を解析した。クローン
化ＩＬ−１２受容体ｃＤＮＡを、ＤＥＡＥデキストラン
トランスフェクションまたはエレクトロポレーション法
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａ
ｌ）を用いてＣＯＳ細胞中で発現させた。抗ヒトＩＬ−
１２受容体抗体のもとにおける標識ＩＬ−１２または標
識２−４Ｅ６抗体との結合検定を上記した方法で行っ
た。結合データを分析し、抗ヒトＩＬ−１２受容体抗体
のもとにおける上記したＬｉｇａｎｄプログラムを用い
て、スキャッチャード法によってＫｄ値を計算した。35
ＳシステインによるＣＯＳ細胞（直径３５ｍｍの組織培
養皿当たり３ｘ１０5細胞）のインビボ標識（６時間）
をトランスフェクションの３日後に上記のように行った
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａ
ｌ）。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、ＣＨＡＰＳ溶菌緩衝液
（１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ−３００ｍＭ ＮａＣｌ−５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４−２ｍｇ／ｍｌイ
ンドアセトアミド−０．１７ｍｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ）中
で溶菌し、プロテインＧセファロースビーズ（１ｍｌ当
たり５０μｌ充填ビーズ、Ｇｅｎｅｘ）および正常マウ
ス血清（最終濃度２５％）とともに４℃で一晩インキュ
ベーションして前精製した。ビーズを遠心して、試料１
ｍｌ当たり２−４Ｅ６抗体５μｇを加えることにより精
製溶菌物から標識ＩＬ−１２受容体を特異的に免疫沈降
させた。抗体を１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中
に希釈し、充填ビーズ５０μｌ上に４℃で２〜３時間の
せた。免疫沈降は４℃一晩で実施した。翌日、ビーズを
ＣＨＡＰＳ溶菌緩衝液中で３〜４回洗浄した後、上記の
方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕ
ａｌ）によりＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析し
た。
【０１００】実施例２２ リンパ球増殖検定 ラット抗血清のサイトカイン−誘導化増殖を阻害する能
力を評価するために、上記の方法（M.K.Gately et al.
(1992) Current Protocols in Immunology, vol. 1.,
J.E.Coligan et al. eds., John Wiley & Sons, New Yo
rk, NY, p.6.16.1）に以下の修飾を加えてリンパ球増殖
検定を行った。ヒトＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣ（１ウエル
当たり２ｘ１０4）アリコットおよび希釈ラット血清を
９６ウエルプレートのウエル上で混合し、３７℃で３０
分インキュベートした。次いでサイトカイン（ＩＬ−１
２、ＩＬ−２またはＩＬ−７）をウエルに加えて、培養
物を３７℃で４８時間インキュベートした。次いで、各
ウエルに3Ｈ−ＴｄＲを加え、さらに３７℃、７時間後
に培養物を回収した。すべての値は３回の平均である。
力を評価するために、上記の方法（M.K.Gately et al.
(1992) Current Protocols in Immunology, vol. 1.,
J.E.Coligan et al. eds., John Wiley & Sons, New Yo
rk, NY, p.6.16.1）に以下の修飾を加えてリンパ球増殖
検定を行った。ヒトＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣ（１ウエル
当たり２ｘ１０4）アリコットおよび希釈ラット血清を
９６ウエルプレートのウエル上で混合し、３７℃で３０
分インキュベートした。次いでサイトカイン（ＩＬ−１
２、ＩＬ−２またはＩＬ−７）をウエルに加えて、培養
物を３７℃で４８時間インキュベートした。次いで、各
ウエルに3Ｈ−ＴｄＲを加え、さらに３７℃、７時間後
に培養物を回収した。すべての値は３回の平均である。
【０１０１】実施例２３ フローサイトメトリー 各種ラット抗血清中における抗−ＣＯＳ細胞抗体の力価
を以下のフローサイトメトリーによって評価した。トラ
ンスフェクションしていないＣＯＳ細胞（１０ 6細胞／
０．１ｍｌの２％熱不活性化ＦＣＳおよび０．１％アジ
化ナトリウムを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ）を
正常ラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズー
リ）４００μｇ／ｍｌとともに氷上で１５分、次いで指
示する量のラット血清とともに氷上で３０分プレインキ
ュベートした。細胞を洗浄し、さらにＦＩＴＣ−結合Ｆ
（ａｂ’）2マウス抗−ラットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ
ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，Ｉｎｃ．ウエストグローブ、ペンシルベニア）２
μｇ／ｍｌとともに氷上でさらに３０分インキュベート
した。細胞を再び洗浄し、次いでＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅ
ｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、マウンテンヴュー、カ
リフォルニア）を用いるフローサイトメトリーによって
分析した。
を以下のフローサイトメトリーによって評価した。トラ
ンスフェクションしていないＣＯＳ細胞（１０ 6細胞／
０．１ｍｌの２％熱不活性化ＦＣＳおよび０．１％アジ
化ナトリウムを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ）を
正常ラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズー
リ）４００μｇ／ｍｌとともに氷上で１５分、次いで指
示する量のラット血清とともに氷上で３０分プレインキ
ュベートした。細胞を洗浄し、さらにＦＩＴＣ−結合Ｆ
（ａｂ’）2マウス抗−ラットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ
ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，Ｉｎｃ．ウエストグローブ、ペンシルベニア）２
μｇ／ｍｌとともに氷上でさらに３０分インキュベート
した。細胞を再び洗浄し、次いでＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅ
ｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、マウンテンヴュー、カ
リフォルニア）を用いるフローサイトメトリーによって
分析した。
【０１０２】実施例２４ 抗ＩＬ−１２Ｒ抗血清によるＩＬ−１２−誘導化リンパ
芽球増殖の阻害 クローン化ＩＬ−１２ＲサブユニットがＩＬ−１２−誘
導化生物学的応答に本質的な役割を果たしているか、を
検討するために、クローン化ＩＬ−１２Ｒサブユニット
に対する抗血清がＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣのＩＬ−１２
−誘導化増殖を阻害できるか否かを試験した。この抗血
清は、ラットを２−４Ｅ６でトランスフェクションした
ＣＯＳ細胞で免疫することによって作製したので、（推
定的）ＩＬ−１２Ｒサブユニットに対する抗体と同様抗
−ＣＯＳ抗体をも含んでいた。対照として用いるため、
ＩＬ−１２Ｒとは無関係なタンパク質を発現するＣＯＳ
細胞でラットを免疫することによってあらかじめ調製し
ておいた幾つかの他のラット抗血清をスクリーニングし
た。このような抗血清の１つをヒトタイプII ＩＬ−１
ＲでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞に対して作製
したところ、抗−ＩＬ−１２Ｒ抗血清の力価と実質的に
同じ抗−ＣＯＳ細胞抗体の力価を示した（図１９）。次
いで、ＩＬ−１２、ＩＬ−２またはＩＬ−７によって誘
導されたリンパ芽球増殖に対する抗−ＩＬ−１２Ｒ抗血
清、抗−ＩＬ−１Ｒ抗血清、および前免疫血清（抗ＩＬ
−１２Ｒを調製したのに使用したラットからのもの）の
効果を比較した。ＩＬ−１２、ＩＬ−２およびＩＬ−７
の濃度はそれぞれ０．２５ｎｇ／ｍｌ、１．２５ｎｇ／
ｍｌおよび０．４ｎｇ／ｍｌであった。これらの濃度
は、これらの濃度が同等のレベルの3Ｔ−ＴｄＲ取り込
みをもたらし、用量応答曲線の急勾配部分にあることか
ら選択された。この実験では、飽和量のサイトカインの
存在下における3Ｔ−ＴｄＲ取り込みの最大レベルは、
ＩＬ−１２、ＩＬ−２およびＩＬ−７に対してそれぞれ
３８，８２０、１１１，３０３および８９，５４１であ
った。サイトカイン非存在下における3Ｔ−ＴｄＲ取り
込みのレベルを水平点線で示した。２回の実験を行い実
質的に同じ結果を得た。そのうちの１つを図２０−図２
２に示す。抗−ＩＬ−１２Ｒ抗血清はＩＬ−１２−誘導
化リンパ芽球増殖の用量依存的阻害をもたらしたが、Ｉ
Ｌ−２またはＩＬ−７によって誘導された増殖には何ら
効果を及ぼさなかった。これとは対照的に、前免疫血清
も抗−ＩＬ−１Ｒ抗血清も、これら３つのサイトカイン
試験によって誘導されたリンパ芽球増殖を阻害しなかっ
た。これらの結果は、クローン化ＩＬ−１２Ｒサブユニ
ットが、ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣのＩＬ−１２−誘導化
増殖の媒介に本質的役割を果たしていることを強く示唆
する。
芽球増殖の阻害 クローン化ＩＬ−１２ＲサブユニットがＩＬ−１２−誘
導化生物学的応答に本質的な役割を果たしているか、を
検討するために、クローン化ＩＬ−１２Ｒサブユニット
に対する抗血清がＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣのＩＬ−１２
−誘導化増殖を阻害できるか否かを試験した。この抗血
清は、ラットを２−４Ｅ６でトランスフェクションした
ＣＯＳ細胞で免疫することによって作製したので、（推
定的）ＩＬ−１２Ｒサブユニットに対する抗体と同様抗
−ＣＯＳ抗体をも含んでいた。対照として用いるため、
ＩＬ−１２Ｒとは無関係なタンパク質を発現するＣＯＳ
細胞でラットを免疫することによってあらかじめ調製し
ておいた幾つかの他のラット抗血清をスクリーニングし
た。このような抗血清の１つをヒトタイプII ＩＬ−１
ＲでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞に対して作製
したところ、抗−ＩＬ−１２Ｒ抗血清の力価と実質的に
同じ抗−ＣＯＳ細胞抗体の力価を示した（図１９）。次
いで、ＩＬ−１２、ＩＬ−２またはＩＬ−７によって誘
導されたリンパ芽球増殖に対する抗−ＩＬ−１２Ｒ抗血
清、抗−ＩＬ−１Ｒ抗血清、および前免疫血清（抗ＩＬ
−１２Ｒを調製したのに使用したラットからのもの）の
効果を比較した。ＩＬ−１２、ＩＬ−２およびＩＬ−７
の濃度はそれぞれ０．２５ｎｇ／ｍｌ、１．２５ｎｇ／
ｍｌおよび０．４ｎｇ／ｍｌであった。これらの濃度
は、これらの濃度が同等のレベルの3Ｔ−ＴｄＲ取り込
みをもたらし、用量応答曲線の急勾配部分にあることか
ら選択された。この実験では、飽和量のサイトカインの
存在下における3Ｔ−ＴｄＲ取り込みの最大レベルは、
ＩＬ−１２、ＩＬ−２およびＩＬ−７に対してそれぞれ
３８，８２０、１１１，３０３および８９，５４１であ
った。サイトカイン非存在下における3Ｔ−ＴｄＲ取り
込みのレベルを水平点線で示した。２回の実験を行い実
質的に同じ結果を得た。そのうちの１つを図２０−図２
２に示す。抗−ＩＬ−１２Ｒ抗血清はＩＬ−１２−誘導
化リンパ芽球増殖の用量依存的阻害をもたらしたが、Ｉ
Ｌ−２またはＩＬ−７によって誘導された増殖には何ら
効果を及ぼさなかった。これとは対照的に、前免疫血清
も抗−ＩＬ−１Ｒ抗血清も、これら３つのサイトカイン
試験によって誘導されたリンパ芽球増殖を阻害しなかっ
た。これらの結果は、クローン化ＩＬ−１２Ｒサブユニ
ットが、ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣのＩＬ−１２−誘導化
増殖の媒介に本質的役割を果たしていることを強く示唆
する。
【０１０３】実施例２５ ＩＬ−１２受容体ｃＤＮＡクローンの配列分析 クローンＮｏ．５からのＩＬ−１２受容体ｃＤＮＡイン
サートのＤＮＡ配列を図１に示す。コードされる受容体
タンパク質から演繹されるアミノ酸配列を図２に示す。
このようにＩＬ−１２受容体タンパク質は６６２アミノ
酸からなり、以下の特徴をもつ：Ｎ−末端シグナルペプ
チド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質テ
イル。典型的な疎水性Ｎ−末端シグナルペプチドは２０
−２４アミノ酸の長さであると予測される。シグナルペ
プチドの開裂はアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙ
ｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎの後でほとんど起こることが示され
ている（G. von Heijne, Nucl. Acids Res. (1986) 14,
4683）。したがって、ＩＬ−１２受容体では、開裂は
図２に示す配列のＧｌｎ２０、Ａｌａ２３またはＣｙｓ
２４の後で起こりうる。Ｃｙｓ２４で開裂するとすると
６３８アミノ酸の成熟タンパク質（計算分子量＝７０，
４２６）をもたらす。受容体の細胞外ドメインは図２に
示す配列中、シグナルペプチドのＣ−末端からアミノ酸
Ｎｏ．５４０までの領域を包含すると予測される。疎水
性の分析により、アミノ酸Ｎｏ．５４１から５７１まで
の領域が疎水性であることを示し、膜貫通アンカー領域
であることが予測できる。この予測される膜貫通領域の
Ｎ−末端にもＣ−末端にも荷電した転移停止残基が見ら
れる。したがって、受容体の細胞外ドメインは５１６ア
ミノ酸の長さであり、６つの予測されるＮ−連結グリコ
シル化部位のすべてを含む。細胞質部分は９１アミノ酸
の長さ（アミノ酸Ｎｏ．５７２から６６２）であり、カ
ゼインキナーゼIIのための３つの可能性のあるリン酸化
部位（Ｓ／ＴＸＸＤ／Ｅ）を含む。
サートのＤＮＡ配列を図１に示す。コードされる受容体
タンパク質から演繹されるアミノ酸配列を図２に示す。
このようにＩＬ−１２受容体タンパク質は６６２アミノ
酸からなり、以下の特徴をもつ：Ｎ−末端シグナルペプ
チド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質テ
イル。典型的な疎水性Ｎ−末端シグナルペプチドは２０
−２４アミノ酸の長さであると予測される。シグナルペ
プチドの開裂はアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙ
ｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎの後でほとんど起こることが示され
ている（G. von Heijne, Nucl. Acids Res. (1986) 14,
4683）。したがって、ＩＬ−１２受容体では、開裂は
図２に示す配列のＧｌｎ２０、Ａｌａ２３またはＣｙｓ
２４の後で起こりうる。Ｃｙｓ２４で開裂するとすると
６３８アミノ酸の成熟タンパク質（計算分子量＝７０，
４２６）をもたらす。受容体の細胞外ドメインは図２に
示す配列中、シグナルペプチドのＣ−末端からアミノ酸
Ｎｏ．５４０までの領域を包含すると予測される。疎水
性の分析により、アミノ酸Ｎｏ．５４１から５７１まで
の領域が疎水性であることを示し、膜貫通アンカー領域
であることが予測できる。この予測される膜貫通領域の
Ｎ−末端にもＣ−末端にも荷電した転移停止残基が見ら
れる。したがって、受容体の細胞外ドメインは５１６ア
ミノ酸の長さであり、６つの予測されるＮ−連結グリコ
シル化部位のすべてを含む。細胞質部分は９１アミノ酸
の長さ（アミノ酸Ｎｏ．５７２から６６２）であり、カ
ゼインキナーゼIIのための３つの可能性のあるリン酸化
部位（Ｓ／ＴＸＸＤ／Ｅ）を含む。
【０１０４】クローンＮｏ．５からのインサートをプロ
ーブとして用いてｃＤＮＡライブラリーを再度スクリー
ニングし、第２の独立ｃＤＮＡを単離した（クローンＮ
ｏ．１７）。このｃＤＮＡは３’非翻訳領域にさらに２
０２ｂｐを含んでいた。ＩＬ−１２受容体タンパク質に
対するこのクローンから演繹されるアミノ酸配列（配列
番号：３）は図２（配列番号：２）に示す配列とほとん
ど完全に一致したが、ｃＤＮＡ中のストップコドンの直
前における１３ｂｐの欠失が受容体のＣ−末端における
リーディングフレームを変更し、２アミノ酸短いタンパ
ク質を与える（配列番号：３）。クローン５と１７を表
すｍＲＮＡの間で異なると予測される領域にわたる１対
のプライマーを用いて非クローン化ｃＤＮＡ上でサイク
ルサンプリングＰＣＲを実施した。この分析により、受
容体サブユニットのこれら２つの膜結合変異体をコード
する転写物がいずれも、ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣから単
離されたｍＲＮＡ集団中ほぼ同量で存在することが示さ
れた（データ示さず）。２つの転写物は異なるスプライ
シングから生じたものと思われる。
ーブとして用いてｃＤＮＡライブラリーを再度スクリー
ニングし、第２の独立ｃＤＮＡを単離した（クローンＮ
ｏ．１７）。このｃＤＮＡは３’非翻訳領域にさらに２
０２ｂｐを含んでいた。ＩＬ−１２受容体タンパク質に
対するこのクローンから演繹されるアミノ酸配列（配列
番号：３）は図２（配列番号：２）に示す配列とほとん
ど完全に一致したが、ｃＤＮＡ中のストップコドンの直
前における１３ｂｐの欠失が受容体のＣ−末端における
リーディングフレームを変更し、２アミノ酸短いタンパ
ク質を与える（配列番号：３）。クローン５と１７を表
すｍＲＮＡの間で異なると予測される領域にわたる１対
のプライマーを用いて非クローン化ｃＤＮＡ上でサイク
ルサンプリングＰＣＲを実施した。この分析により、受
容体サブユニットのこれら２つの膜結合変異体をコード
する転写物がいずれも、ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣから単
離されたｍＲＮＡ集団中ほぼ同量で存在することが示さ
れた（データ示さず）。２つの転写物は異なるスプライ
シングから生じたものと思われる。
【０１０５】ＩＬ−１２受容体のアミノ酸配列をさらに
分析することにより、これが［Ｃｙｓ５２−−−Ｃｙｓ
６２ＳＷ］および［Ｗ２２２ＳＫＷＳ］の配列モチーフ
のために、サイトカイン受容体スーパーファミリーの一
員であることが示された。ＡＬＩＧＮプログラムでＩＬ
−１２受容体配列をスーパーファミリーのすべてのメン
バーと比較することにより、ＩＬ−１２受容体がヒトｇ
ｐ１３０と最も高い相同性を有することが示された。
分析することにより、これが［Ｃｙｓ５２−−−Ｃｙｓ
６２ＳＷ］および［Ｗ２２２ＳＫＷＳ］の配列モチーフ
のために、サイトカイン受容体スーパーファミリーの一
員であることが示された。ＡＬＩＧＮプログラムでＩＬ
−１２受容体配列をスーパーファミリーのすべてのメン
バーと比較することにより、ＩＬ−１２受容体がヒトｇ
ｐ１３０と最も高い相同性を有することが示された。
【０１０６】ＩＬ−１２受容体細胞外ドメインの配列分
析により、ヘムタンパク質受容体の存在を証明する特
徴、すなわち２対の保存システイン残基およびＷＳＸＷ
Ｓモチーフが示された。ヘムタンパク質受容体スーパー
ファミリーとのさらなる比較により、新たに単離された
ＩＬ−１２受容体成分が、ｇｐ１３０、Ｇ−ＣＳＦ−受
容体およびＬＩＦ−受容体からなるファミリーメンバー
のサブグループと高度に関連することが示された（図
３）；並列（ａｌｉｇｎ）スコアは１２．３７（ＩＬ−
１２／ｇｐ１３０）、７．３５（ＩＬ−１２／Ｇ−ＣＳ
Ｆ−Ｒ）および６．３１（ＩＬ−１２／ＬＩＦ−Ｒベー
タ）であった。ＩＬ−１２受容体成分とこれら３つのタ
ンパク質との類似性はヘムタンパク質受容体ドメインを
越えて、ＷＳＸＷＳモチーフから膜貫通領域までの領域
を含む（図３）。ｇｐ１３０の細胞外部分（M.Hibi et
al. (1999) Cell, 63, 1149）は、ｉ）ヘムタンパク質
受容体スーパーファミリードメインを含み、かつｉｉ）
約９０アミノ酸の長さの６つのタイプIIIフィブロネク
チン反復（A.R. Kornblihtt et al. (1985) EMBO J.,
4, 1755; L.Patthy (1990) Cell, 61, 13）からなる、
ことが示された。同様に、ＩＬ−１２受容体の細胞外ド
メインは、このような５つのフィブロネクチンタイプII
I反復に分けられる（４３−１３３、１４３−２３６、
２３７−３３７、３３８−４４４および４４５−５４０
残基）。ＩＬ−１２受容体細胞外ドメインはｇｐ１３０
に見られるＮ−末端Ｉｇドメインを欠いており、したが
って５つのフィブロネクチンタイプIII反復のみを収容
する。ＩＬ−１２受容体、ｇｐ１３０、Ｇ−ＣＳＦ−受
容体およびＬＩＦ−受容体との間のさらなる配列類似性
は細胞質領域に見られる（図３）。多数の異なるスーパ
ーファミリーメンバーで保存されている８アミノ酸のボ
ックス中のＰＸＸＰＸＰモチーフ、および第２の１２ア
ミノ酸の長さの保存ボックスがｇｐ１３０によって媒介
されるシグナル伝達にとって重要であることが見いださ
れている（M.Murakami et al. (1991) Proc. Natl. Aca
d. Sci. (USA) 88, 11349）。これらのいずれのモチー
フもＩＬ−１２受容体配列の細胞質部分の保存領域中
（アミノ酸残基５７７−５８４およびアミノ酸残基６１
８−６２９)にも見られる。
析により、ヘムタンパク質受容体の存在を証明する特
徴、すなわち２対の保存システイン残基およびＷＳＸＷ
Ｓモチーフが示された。ヘムタンパク質受容体スーパー
ファミリーとのさらなる比較により、新たに単離された
ＩＬ−１２受容体成分が、ｇｐ１３０、Ｇ−ＣＳＦ−受
容体およびＬＩＦ−受容体からなるファミリーメンバー
のサブグループと高度に関連することが示された（図
３）；並列（ａｌｉｇｎ）スコアは１２．３７（ＩＬ−
１２／ｇｐ１３０）、７．３５（ＩＬ−１２／Ｇ−ＣＳ
Ｆ−Ｒ）および６．３１（ＩＬ−１２／ＬＩＦ−Ｒベー
タ）であった。ＩＬ−１２受容体成分とこれら３つのタ
ンパク質との類似性はヘムタンパク質受容体ドメインを
越えて、ＷＳＸＷＳモチーフから膜貫通領域までの領域
を含む（図３）。ｇｐ１３０の細胞外部分（M.Hibi et
al. (1999) Cell, 63, 1149）は、ｉ）ヘムタンパク質
受容体スーパーファミリードメインを含み、かつｉｉ）
約９０アミノ酸の長さの６つのタイプIIIフィブロネク
チン反復（A.R. Kornblihtt et al. (1985) EMBO J.,
4, 1755; L.Patthy (1990) Cell, 61, 13）からなる、
ことが示された。同様に、ＩＬ−１２受容体の細胞外ド
メインは、このような５つのフィブロネクチンタイプII
I反復に分けられる（４３−１３３、１４３−２３６、
２３７−３３７、３３８−４４４および４４５−５４０
残基）。ＩＬ−１２受容体細胞外ドメインはｇｐ１３０
に見られるＮ−末端Ｉｇドメインを欠いており、したが
って５つのフィブロネクチンタイプIII反復のみを収容
する。ＩＬ−１２受容体、ｇｐ１３０、Ｇ−ＣＳＦ−受
容体およびＬＩＦ−受容体との間のさらなる配列類似性
は細胞質領域に見られる（図３）。多数の異なるスーパ
ーファミリーメンバーで保存されている８アミノ酸のボ
ックス中のＰＸＸＰＸＰモチーフ、および第２の１２ア
ミノ酸の長さの保存ボックスがｇｐ１３０によって媒介
されるシグナル伝達にとって重要であることが見いださ
れている（M.Murakami et al. (1991) Proc. Natl. Aca
d. Sci. (USA) 88, 11349）。これらのいずれのモチー
フもＩＬ−１２受容体配列の細胞質部分の保存領域中
（アミノ酸残基５７７−５８４およびアミノ酸残基６１
８−６２９)にも見られる。
【０１０７】実施例２６ ＩＬ−１２受容体ｍＲＮＡ発現の分析 ＩＬ−１２に応答することが知られている細胞、すなわ
ちＰＨＡ−刺激したＰＢＭＣおよびＣＤ４＋Ｔ−細胞系
Ｋｉｔ２２５由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを用いてＲＮＡ
ブロットを行った。ブロットを全長ｃＤＮＡで検出した
とき、約３Ｋｂおよび２．３Ｋｂの大きさの２つのＲＮ
Ａ転写物が明らかである（図７、レーン１−３）。ＰＢ
ＭＣをＰＨＡで３日間活性化するといずれのＲＮＡも検
出できないか、あるいは非常に低いレベルであった（レ
ーン１と２とを比較されたい）。Ｋｉｔ２２５細胞はい
ずれの転写物も構成的に発現する（レーン３）。ホスホ
イメジャーによる分析により、大きいＲＮＡのレベルは
小さいＲＮＡのレベルの約３−５倍高いことが示され
た。驚くべきことに、小さいＲＮＡは細胞質ドメイン由
来のプローブとはハイブリダイズしない（レーン４−
６）。この知見は、ｉ）可溶性ＩＬ−１２受容体タンパ
ク質、ｉｉ）細胞質領域を全くもっていない膜結合ＩＬ
−１２受容体、またはｉｉｉ）クローン５および１７に
存在するものとは全く異なる細胞質配列をもつＩＬ−１
２受容体をコードするＲＮＡの存在を示唆する。この疑
問を解決するには、小さいＲＮＡ転写物由来のｃＤＮＡ
クローンの単離を待たねばならない。
ちＰＨＡ−刺激したＰＢＭＣおよびＣＤ４＋Ｔ−細胞系
Ｋｉｔ２２５由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを用いてＲＮＡ
ブロットを行った。ブロットを全長ｃＤＮＡで検出した
とき、約３Ｋｂおよび２．３Ｋｂの大きさの２つのＲＮ
Ａ転写物が明らかである（図７、レーン１−３）。ＰＢ
ＭＣをＰＨＡで３日間活性化するといずれのＲＮＡも検
出できないか、あるいは非常に低いレベルであった（レ
ーン１と２とを比較されたい）。Ｋｉｔ２２５細胞はい
ずれの転写物も構成的に発現する（レーン３）。ホスホ
イメジャーによる分析により、大きいＲＮＡのレベルは
小さいＲＮＡのレベルの約３−５倍高いことが示され
た。驚くべきことに、小さいＲＮＡは細胞質ドメイン由
来のプローブとはハイブリダイズしない（レーン４−
６）。この知見は、ｉ）可溶性ＩＬ−１２受容体タンパ
ク質、ｉｉ）細胞質領域を全くもっていない膜結合ＩＬ
−１２受容体、またはｉｉｉ）クローン５および１７に
存在するものとは全く異なる細胞質配列をもつＩＬ−１
２受容体をコードするＲＮＡの存在を示唆する。この疑
問を解決するには、小さいＲＮＡ転写物由来のｃＤＮＡ
クローンの単離を待たねばならない。
【０１０８】実施例２７ 組換えＩＬ−１２受容体の性状決定 ＩＬ−１２受容体ｃＤＮＡ（クローンＮｏ．５）（配列
番号：１）をＣＯＳ細胞にエレクトロポレーションし、
標識ヒトおよびネズミＩＬ−１２の細胞への平衡結合を
行い、上記のようにして分析した（R.Chizzonite et a
l., 1992, J. Immunol., 148, 3117）。結果を図２３に
示す。ヒトおよびネズミＩＬ−１２は、それぞれ３．４
±１．３ｎＭ（ｎ＝７）および２．１±０．５ｎＭ（ｎ
＝４）の単一親和性（ＫD）で組換えＩＬ−１２受容体
（配列番号：２）と結合し、この値はＰＨＡ−活性化Ｐ
ＢＭＣ上の機能性ＩＬ−１２受容体の低親和性成分に対
応する。スキャッチャード法による変換の後、平衡結合
データはＬＩＧＡＮＤプログラムによって決定した単一
受容体部位モデルによって最もよく表される。図２３に
示した部位数は、すべての細胞が受容体を発現するもの
と仮定して計算した。クローンＮｏ．１７（配列番号：
３）によって発現されるＩＬ−１２受容体タンパク質は
これらの結合検定において同様の結果を与えた。配列番
号：３も配列番号：２と同じ領域をもっている。
番号：１）をＣＯＳ細胞にエレクトロポレーションし、
標識ヒトおよびネズミＩＬ−１２の細胞への平衡結合を
行い、上記のようにして分析した（R.Chizzonite et a
l., 1992, J. Immunol., 148, 3117）。結果を図２３に
示す。ヒトおよびネズミＩＬ−１２は、それぞれ３．４
±１．３ｎＭ（ｎ＝７）および２．１±０．５ｎＭ（ｎ
＝４）の単一親和性（ＫD）で組換えＩＬ−１２受容体
（配列番号：２）と結合し、この値はＰＨＡ−活性化Ｐ
ＢＭＣ上の機能性ＩＬ−１２受容体の低親和性成分に対
応する。スキャッチャード法による変換の後、平衡結合
データはＬＩＧＡＮＤプログラムによって決定した単一
受容体部位モデルによって最もよく表される。図２３に
示した部位数は、すべての細胞が受容体を発現するもの
と仮定して計算した。クローンＮｏ．１７（配列番号：
３）によって発現されるＩＬ−１２受容体タンパク質は
これらの結合検定において同様の結果を与えた。配列番
号：３も配列番号：２と同じ領域をもっている。
【０１０９】ＣＯＳ細胞中で発現するＩＬ−１２受容体
サブユニットの代謝標識および免疫沈降は、還元的条件
下におけるゲル分析によって決定したその大きさが約１
００ＫＤａであることを示唆した。細胞表面での受容体
の大きさを分析するために、親和性架橋試験を行った。
特に記載しない場合には、ＩＬ−１２受容体タンパク質
の性状決定は配列番号：２で行った。トランスフェクシ
ョンしたＣＯＳ細胞、ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣまたはＫ
６細胞のいずれかと、０．２ｎＭ 125Ｉ−標識ＩＬ−
１２の架橋は２００ＫＤａ以上に移動する複合体を与え
た（図１８、レーン１、３および４；矢印は非架橋のＩ
Ｌ−１２を示す）。２ｎＭ 125Ｉ−ＩＬ−１２（ＫDと
平衡な濃度）での架橋は同様な結果を与えた（データ示
さず）。１つの受容体サブユニットと１つのＩＬ−１２
リガンドからなる複合体の大きさは約１７５ＫＤａであ
ると予測される。しかしながら、図１８は１７５ＫＤａ
の複合体が、もし存在するとしても非常に低いレベルで
しか存在しないことを示す。使用したゲル系では１５０
ＫＤａのＩｇと２００ＫＤａのマーカーとを分離できな
いので、１７５ＫＤａのＩＬ−１２／ＩＬ−１２受容体
複合体はこれらと一緒に移動すると予測される。比較の
ため、レーン２は標識２−４Ｅ６抗体と架橋したトラン
スフェクションしたＣＯＳ細胞を示す（矢印の頭は非架
橋２−４Ｅ６）。ｉ）ＩＬ−１２を結合しない細胞（例
えばＲａｊｉ細胞）、ｉｉ）疑似トランスフェクション
したＣＯＳ細胞、またはｉｉｉ）過剰の冷ＩＬ−１２の
存在下にトランスフェクションしたＣＯＳ細胞への標識
ＩＬ−１２の架橋は何も産物を生じなかった（データ示
さず）。図１８では、標識ＩＬ−１２（０．２ｎＭ）を
ＢＳ３（０．４ｍＭ）と結合して架橋させＣＯＳ細胞
（レーン１）、ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣ（レーン３）ま
たはＫ６細胞（レーン４）をトランスフェクションし
た。標識２−４Ｅ６抗体（０．５ｎＭ）をＢＳ３（０．
４ｍＭ）と結合して架橋させＣＯＳ細胞（レーン２）を
トランスフェクションした。抗−ＩＬ−１２受容体抗体
２−４Ｅ６（レーン５、７）、抗−ＩＬ−１２抗体４Ｄ
６（レーン９、１１）、および対照抗体（レーン６、
８、１０、１２）を用いた。抗体２−４Ｅ６（レーン１
３、１５）および対照抗体（レーン１４、１６）を用い
た。
サブユニットの代謝標識および免疫沈降は、還元的条件
下におけるゲル分析によって決定したその大きさが約１
００ＫＤａであることを示唆した。細胞表面での受容体
の大きさを分析するために、親和性架橋試験を行った。
特に記載しない場合には、ＩＬ−１２受容体タンパク質
の性状決定は配列番号：２で行った。トランスフェクシ
ョンしたＣＯＳ細胞、ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣまたはＫ
６細胞のいずれかと、０．２ｎＭ 125Ｉ−標識ＩＬ−
１２の架橋は２００ＫＤａ以上に移動する複合体を与え
た（図１８、レーン１、３および４；矢印は非架橋のＩ
Ｌ−１２を示す）。２ｎＭ 125Ｉ−ＩＬ−１２（ＫDと
平衡な濃度）での架橋は同様な結果を与えた（データ示
さず）。１つの受容体サブユニットと１つのＩＬ−１２
リガンドからなる複合体の大きさは約１７５ＫＤａであ
ると予測される。しかしながら、図１８は１７５ＫＤａ
の複合体が、もし存在するとしても非常に低いレベルで
しか存在しないことを示す。使用したゲル系では１５０
ＫＤａのＩｇと２００ＫＤａのマーカーとを分離できな
いので、１７５ＫＤａのＩＬ−１２／ＩＬ−１２受容体
複合体はこれらと一緒に移動すると予測される。比較の
ため、レーン２は標識２−４Ｅ６抗体と架橋したトラン
スフェクションしたＣＯＳ細胞を示す（矢印の頭は非架
橋２−４Ｅ６）。ｉ）ＩＬ−１２を結合しない細胞（例
えばＲａｊｉ細胞）、ｉｉ）疑似トランスフェクション
したＣＯＳ細胞、またはｉｉｉ）過剰の冷ＩＬ−１２の
存在下にトランスフェクションしたＣＯＳ細胞への標識
ＩＬ−１２の架橋は何も産物を生じなかった（データ示
さず）。図１８では、標識ＩＬ−１２（０．２ｎＭ）を
ＢＳ３（０．４ｍＭ）と結合して架橋させＣＯＳ細胞
（レーン１）、ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣ（レーン３）ま
たはＫ６細胞（レーン４）をトランスフェクションし
た。標識２−４Ｅ６抗体（０．５ｎＭ）をＢＳ３（０．
４ｍＭ）と結合して架橋させＣＯＳ細胞（レーン２）を
トランスフェクションした。抗−ＩＬ−１２受容体抗体
２−４Ｅ６（レーン５、７）、抗−ＩＬ−１２抗体４Ｄ
６（レーン９、１１）、および対照抗体（レーン６、
８、１０、１２）を用いた。抗体２−４Ｅ６（レーン１
３、１５）および対照抗体（レーン１４、１６）を用い
た。
【０１１０】標識ＩＬ−１２のＩＬ−１２受容体への架
橋は、１つの受容体と１つのＩＬ−１２リガンドとの複
合体として予測されるよりも大きいがその大きさの評価
が困難な産物をもたらしたので、トランスフェクション
したＣＯＳ細胞の細胞表面標識および免疫沈降実験を行
った。試料を還元的および非還元的条件下で分析した
（図１８、レーン５−１２）。結果は以下のようにまと
められる：ｉ）トランスフェクションしたＣＯＳ細胞は
ＩＬ−１２受容体サブユニットをモノマーとして、また
ダイマーまたはオリゴマーでありうる第２のより大きい
産物として発現する。これらのいずれの産物もおよそ同
量で存在する（レーン５）；ｉｉ）ダイマー化／オリゴ
マー化はＩＬ−１２結合に依存しない。もしもＩＬ−１
２が細胞にあらかじめ結合しているならば、得られる結
合パターンは変化しない（データ示さず）；またｉｉ
ｉ）ダイマー／オリゴマーは還元によりモノマーに変換
されることができ、したがってジスルフィド結合でなけ
ればならない（レーン７）。したがって、架橋および表
面標識実験からのデータは、ダイマー／オリゴマー受容
体サブユニット形のみが、トランスフェクションしたＣ
ＯＳ細胞上で測定して３ｎＭアフィニティーでＩＬ−１
２と結合することを示唆する。この可能性をさらに以下
のようにして調べた。125Ｉ−表面標識ＣＯＳ細胞への
非標識ＩＬ−１２の結合、および開裂可能な架橋剤での
架橋により産生される複合体を抗−ＩＬ−１２抗体によ
って免疫沈降し、非還元的および還元的条件下に分析し
た（図１８、レーン９−１２）。抗−ＩＬ−１２抗体
は、ダイマー／オリゴマーと結合したＩＬ−１２に対応
する複合体のみを沈降させ、ＩＬ−１２受容体サブユニ
ットのモノマーと結合したＩＬ−１２に対応する複合体
を沈降させなかった（レーン９）。還元的条件下におけ
るこの複合体の分析により、ＩＬ−１２受容体モノマー
と一緒に移動した標識タンパク質を同定した（レーン１
１）。ＩＬ−１２受容体サブユニットを安定に発現する
ネズミＣＴＬＬ細胞トランスフェクタントを用いる実験
は我々のこの知見をさらに支持する。これらの細胞は２
−４Ｅ６抗体結合によって測定した場合、１細胞当たり
約３０００から５０００の受容体サブユニットを発現す
る。しかしながら、細胞はＩＬ−１２と非常に非効率的
に結合し、５０ｎＭまたはそれ以上のＫｄと予測された
（データ示さず）。ＣＴＬＬトランスフェクタントによ
る表面標識および免疫沈降実験から得た結果は、これら
がＩＬ−１２受容体サブユニットモノマーのみを発現す
ることをはっきりと示唆する（図１８、レーン１３−１
６）。まとめると、受容体サブユニットダイマー／オリ
ゴマーのみが、トランスフェクションしたＣＯＳ細胞上
で測定した場合に低親和性（３ｎＭ）でＩＬ−１２と結
合する、という仮説をデータは支持する。
橋は、１つの受容体と１つのＩＬ−１２リガンドとの複
合体として予測されるよりも大きいがその大きさの評価
が困難な産物をもたらしたので、トランスフェクション
したＣＯＳ細胞の細胞表面標識および免疫沈降実験を行
った。試料を還元的および非還元的条件下で分析した
（図１８、レーン５−１２）。結果は以下のようにまと
められる：ｉ）トランスフェクションしたＣＯＳ細胞は
ＩＬ−１２受容体サブユニットをモノマーとして、また
ダイマーまたはオリゴマーでありうる第２のより大きい
産物として発現する。これらのいずれの産物もおよそ同
量で存在する（レーン５）；ｉｉ）ダイマー化／オリゴ
マー化はＩＬ−１２結合に依存しない。もしもＩＬ−１
２が細胞にあらかじめ結合しているならば、得られる結
合パターンは変化しない（データ示さず）；またｉｉ
ｉ）ダイマー／オリゴマーは還元によりモノマーに変換
されることができ、したがってジスルフィド結合でなけ
ればならない（レーン７）。したがって、架橋および表
面標識実験からのデータは、ダイマー／オリゴマー受容
体サブユニット形のみが、トランスフェクションしたＣ
ＯＳ細胞上で測定して３ｎＭアフィニティーでＩＬ−１
２と結合することを示唆する。この可能性をさらに以下
のようにして調べた。125Ｉ−表面標識ＣＯＳ細胞への
非標識ＩＬ−１２の結合、および開裂可能な架橋剤での
架橋により産生される複合体を抗−ＩＬ−１２抗体によ
って免疫沈降し、非還元的および還元的条件下に分析し
た（図１８、レーン９−１２）。抗−ＩＬ−１２抗体
は、ダイマー／オリゴマーと結合したＩＬ−１２に対応
する複合体のみを沈降させ、ＩＬ−１２受容体サブユニ
ットのモノマーと結合したＩＬ−１２に対応する複合体
を沈降させなかった（レーン９）。還元的条件下におけ
るこの複合体の分析により、ＩＬ−１２受容体モノマー
と一緒に移動した標識タンパク質を同定した（レーン１
１）。ＩＬ−１２受容体サブユニットを安定に発現する
ネズミＣＴＬＬ細胞トランスフェクタントを用いる実験
は我々のこの知見をさらに支持する。これらの細胞は２
−４Ｅ６抗体結合によって測定した場合、１細胞当たり
約３０００から５０００の受容体サブユニットを発現す
る。しかしながら、細胞はＩＬ−１２と非常に非効率的
に結合し、５０ｎＭまたはそれ以上のＫｄと予測された
（データ示さず）。ＣＴＬＬトランスフェクタントによ
る表面標識および免疫沈降実験から得た結果は、これら
がＩＬ−１２受容体サブユニットモノマーのみを発現す
ることをはっきりと示唆する（図１８、レーン１３−１
６）。まとめると、受容体サブユニットダイマー／オリ
ゴマーのみが、トランスフェクションしたＣＯＳ細胞上
で測定した場合に低親和性（３ｎＭ）でＩＬ−１２と結
合する、という仮説をデータは支持する。
【０１１１】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２１０４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：No 起源 生物名：Homo sapiens 細胞の種類：ヒトＴ細胞 直接の起源 ライブラリー名：library 3 day PHA/pEF-BOS クローン名：ヒトインターロイキン−１２受容体クロー
ン＃５ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：65..2050 配列
ン＃５ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：65..2050 配列
【０１１２】
【化１】
【０１１３】
【０１１４】
【０１１５】
【０１１６】配列番号：２ 配列の長さ：６６２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：1..23 他の情報：／注＝“N-末端シグナルペプチド(1..20また
は23または24) ” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：541..570 他の情報：／注＝“膜貫通領域” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：571..662 他の情報：／注＝“細胞質尾部” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：577..584 他の情報：／注＝“細胞質尾部の保存領域” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：618..629 他の情報：／注＝“細胞質尾部の保存領域” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：52..64 他の情報：／注＝“サイトカイン受容体スーパーファミ
リー Cys52..Cys62SW” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：222..226 他の情報：／注＝“サイトカイン受容体スーパーファミ
リー モチーフ(W222SKWS)” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：121..123 他の情報：／注＝“N-結合グリコシル化部位” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：329..331 他の情報：／注＝“N-結合グリコシル化部位” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：346..348 他の情報：／注＝“N-結合グリコシル化部位” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：352..354 他の情報：／注＝“N-結合グリコシル化部位” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：442..444 他の情報：／注＝“N-結合グリコシル化部位” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：456..458 他の情報：／注＝“N-結合グリコシル化部位” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：24..540 他の情報：／注＝“細胞外領域” 配列
は23または24) ” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：541..570 他の情報：／注＝“膜貫通領域” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：571..662 他の情報：／注＝“細胞質尾部” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：577..584 他の情報：／注＝“細胞質尾部の保存領域” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：618..629 他の情報：／注＝“細胞質尾部の保存領域” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：52..64 他の情報：／注＝“サイトカイン受容体スーパーファミ
リー Cys52..Cys62SW” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：222..226 他の情報：／注＝“サイトカイン受容体スーパーファミ
リー モチーフ(W222SKWS)” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：121..123 他の情報：／注＝“N-結合グリコシル化部位” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：329..331 他の情報：／注＝“N-結合グリコシル化部位” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：346..348 他の情報：／注＝“N-結合グリコシル化部位” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：352..354 他の情報：／注＝“N-結合グリコシル化部位” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：442..444 他の情報：／注＝“N-結合グリコシル化部位” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：456..458 他の情報：／注＝“N-結合グリコシル化部位” 配列の特徴 特徴を表す記号：Region 存在位置：24..540 他の情報：／注＝“細胞外領域” 配列
【０１１７】
【化２】
【０１１８】
【０１１９】
【０１２０】配列番号：３ 配列の長さ：６６０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１２１】
【化３】
【０１２２】
【０１２３】
【図１】ヒトＩＬ−１２受容体のｃＤＮＡクローンＮ
ｏ．５のＤＮＡ配列（翻訳部分＝ヌクレオチド６５〜２
０５０）（配列番号：１）を示す。
ｏ．５のＤＮＡ配列（翻訳部分＝ヌクレオチド６５〜２
０５０）（配列番号：１）を示す。
【図２】図１のｃＤＮＡ配列から推定されるヒトＩＬ−
１２受容体タンパク質のアミノ酸配列を示す。
１２受容体タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図３】ＩＬ−１２受容体タンパク質のサブユニット配
列とヒトｇｐ１３０、ヒト顆粒球コロニー刺激因子受容
体（Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ）および白血病抑制因子受容体（Ｌ
ＩＦ−Ｒ）の配列とを比較した配列相同性を示す。
列とヒトｇｐ１３０、ヒト顆粒球コロニー刺激因子受容
体（Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ）および白血病抑制因子受容体（Ｌ
ＩＦ−Ｒ）の配列とを比較した配列相同性を示す。
【図４】ＣＯＳ細胞で発現させた組換えヒトＩＬ−１２
受容体へのＩＬ−１２の結合のスキャッチャード分析を
示す。
受容体へのＩＬ−１２の結合のスキャッチャード分析を
示す。
【図５】ＣＯＳ細胞で発現させた組換えヒトＩＬ−１２
受容体への２−４Ｅ６抗体の結合のスキャッチャード分
析を示す。
受容体への２−４Ｅ６抗体の結合のスキャッチャード分
析を示す。
【図６】還元条件下でのＩＬ−１２受容体タンパク質の
大きさのゲル電気泳動分析を示す。
大きさのゲル電気泳動分析を示す。
【図７】ＲＮＡブロット法によるＩＬ−１２受容体転写
物の大きさのゲル電気泳動分析を示す。
物の大きさのゲル電気泳動分析を示す。
【図８】マウス抗ＩＬ−１２Ｒ抗血清によるＩＬ−１２
受容体への 125Ｉ−ＩＬ−１２結合の阻害を示す。
受容体への 125Ｉ−ＩＬ−１２結合の阻害を示す。
【図９】親和性架橋結合によるＩＬ−１２Ｒ陽性ヒト細
胞上のＩＬ−１２結合タンパク質の特性決定を示す。
胞上のＩＬ−１２結合タンパク質の特性決定を示す。
【図10】抗ＩＬ−１２Ｒ抗体による可溶化 125Ｉ−ＩＬ
−１２／ＩＬ−１２Ｒ架橋結合複合体の免疫沈降を示
す。
−１２／ＩＬ−１２Ｒ架橋結合複合体の免疫沈降を示
す。
【図11】室温でのＰＨＡ活性化ＰＢＭＣへの 125Ｉ−２
−４Ｅ６の平衡結合を示す。
−４Ｅ６の平衡結合を示す。
【図12】室温でのヒトＫ６細胞への 125Ｉ−２−４Ｅ６
の平衡結合を示す。
の平衡結合を示す。
【図13】精製した２−４Ｅ６（２４Ｅ６）、ヒトＩＬ−
１２（ＨＵＩＬ−１２）および対照抗体（対照ＩｇＧ）
によるＫ６細胞への 125Ｉ−２−４Ｅ６結合の阻害を示
す。
１２（ＨＵＩＬ−１２）および対照抗体（対照ＩｇＧ）
によるＫ６細胞への 125Ｉ−２−４Ｅ６結合の阻害を示
す。
【図14】室温でのヒトＫ６細胞への 125Ｉ−ＩＬ−１２
の平衡結合を示す。
の平衡結合を示す。
【図15】Ｋ６細胞由来の界面活性剤可溶化ＩＬ−１２Ｒ
への 125Ｉ−ＩＬ−１２の平衡結合を示す。
への 125Ｉ−ＩＬ−１２の平衡結合を示す。
【図16】モノクローナル抗体２−４Ｅ６による界面活性
剤可溶化ＩＬ−１２Ｒのウエスタンブロット分析を示
す。
剤可溶化ＩＬ−１２Ｒのウエスタンブロット分析を示
す。
【図17】フローサイトメトリーによるヒト細胞上のＩＬ
−１２受容体の検出を示す。
−１２受容体の検出を示す。
【図18】トランスフェクションを行ったＣＯＳおよびＣ
ＴＬＬ細胞の表面に存在するＩＬ−１２受容体サブユニ
ットの大きさを示す。レーン１〜４：非還元条件下での
親和性架橋結合複合体の分析。レーン５〜12： 125Ｉ−
ＣＯＳ細胞表面タンパク質の分析。レーン13〜16： 125
Ｉ−ＣＴＬＬ細胞表面タンパク質の分析。
ＴＬＬ細胞の表面に存在するＩＬ−１２受容体サブユニ
ットの大きさを示す。レーン１〜４：非還元条件下での
親和性架橋結合複合体の分析。レーン５〜12： 125Ｉ−
ＣＯＳ細胞表面タンパク質の分析。レーン13〜16： 125
Ｉ−ＣＴＬＬ細胞表面タンパク質の分析。
【図19】ラットの抗ＩＬ−１２Ｒ抗血清、免疫前血清お
よび抗ＩＬ−１Ｒ抗血清における抗ＣＯＳ細胞抗体のフ
ローサイトメトリーによる滴定を示す。
よび抗ＩＬ−１Ｒ抗血清における抗ＣＯＳ細胞抗体のフ
ローサイトメトリーによる滴定を示す。
【図20】ＩＬ−１２により誘導されるＰＨＡ活性化ＰＢ
ＭＣの増殖に及ぼすラット血清の影響を示す。
ＭＣの増殖に及ぼすラット血清の影響を示す。
【図21】ＩＬ−２により誘導されるＰＨＡ活性化ＰＢＭ
Ｃの増殖に及ぼすラット血清の影響を示す。
Ｃの増殖に及ぼすラット血清の影響を示す。
【図22】ＩＬ−７により誘導されるＰＨＡ活性化ＰＢＭ
Ｃの増殖に及ぼすラット血清の影響を示す。
Ｃの増殖に及ぼすラット血清の影響を示す。
【図23】ＩＬ−１２受容体サブユニットを発現するＣＯ
Ｓ細胞への 125Ｉ−ＩＬ−１２の平衡結合を示す。Ａ）
ヒトＩＬ−１２、Ｂ）マウスＩＬ−１２。挿入図はスキ
ャッチャード法による結合データの分析を示す。
Ｓ細胞への 125Ｉ−ＩＬ−１２の平衡結合を示す。Ａ）
ヒトＩＬ−１２、Ｂ）マウスＩＬ−１２。挿入図はスキ
ャッチャード法による結合データの分析を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年１１月２９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＩＬ−１２受容体のｃＤＮＡクローンＮ
ｏ．５のＤＮＡ配列（翻訳部分＝ヌクレオチド６５〜２
０５０）（配列番号：１）を示す図である。
ｏ．５のＤＮＡ配列（翻訳部分＝ヌクレオチド６５〜２
０５０）（配列番号：１）を示す図である。
【図２】図１のｃＤＮＡ配列から推定されるヒトＩＬ−
１２受容体タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
１２受容体タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】ＩＬ−１２受容体タンパク質のサブユニット配
列とヒトｇｐ１３０、ヒト顆粒球コロニー刺激因子受容
体（Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ）および白血病抑制因子受容体（Ｌ
ＩＦ−Ｒ）の配列とを比較した配列相同性を示す図であ
る。
列とヒトｇｐ１３０、ヒト顆粒球コロニー刺激因子受容
体（Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ）および白血病抑制因子受容体（Ｌ
ＩＦ−Ｒ）の配列とを比較した配列相同性を示す図であ
る。
【図４】ＣＯＳ細胞で発現させた組換えヒトＩＬ−１２
受容体へのＩＬ−１２の結合のスキャッチャード分析を
示す図である。
受容体へのＩＬ−１２の結合のスキャッチャード分析を
示す図である。
【図５】ＣＯＳ細胞で発現させた組換えヒトＩＬ−１２
受容体への２−４Ｅ６抗体の結合のスキャッチャード分
析を示す図である。
受容体への２−４Ｅ６抗体の結合のスキャッチャード分
析を示す図である。
【図６】還元条件下でのＩＬ−１２受容体タンパク質の
大きさのゲル電気泳動分析を示す写真である。
大きさのゲル電気泳動分析を示す写真である。
【図７】ＲＮＡブロット法によるＩＬ−１２受容体転写
物の大きさのゲル電気泳動分析を示す写真である。
物の大きさのゲル電気泳動分析を示す写真である。
【図８】マウス抗ＩＬ−１２Ｒ抗血清によるＩＬ−１２
受容体への 125Ｉ−ＩＬ−１２結合の阻害を示す図であ
る。
受容体への 125Ｉ−ＩＬ−１２結合の阻害を示す図であ
る。
【図９】親和性架橋結合によるＩＬ−１２Ｒ陽性ヒト細
胞上のＩＬ−１２結合タンパク質の特性決定を示す電気
泳動の写真である。
胞上のＩＬ−１２結合タンパク質の特性決定を示す電気
泳動の写真である。
【図10】抗ＩＬ−１２Ｒ抗体による可溶化 125Ｉ−ＩＬ
−１２／ＩＬ−１２Ｒ架橋結合複合体の免疫沈降を示す
電気泳動の写真である。
−１２／ＩＬ−１２Ｒ架橋結合複合体の免疫沈降を示す
電気泳動の写真である。
【図11】室温でのＰＨＡ活性化ＰＢＭＣへの 125Ｉ−２
−４Ｅ６の平衡結合を示す図である。
−４Ｅ６の平衡結合を示す図である。
【図12】室温でのヒトＫ６細胞への 125Ｉ−２−４Ｅ６
の平衡結合を示す図である。
の平衡結合を示す図である。
【図13】精製した２−４Ｅ６（２４Ｅ６）、ヒトＩＬ−
１２（ＨＵＩＬ−１２）および対照抗体（対照ＩｇＧ）
によるＫ６細胞への 125Ｉ−２−４Ｅ６結合の阻害を示
す図である。
１２（ＨＵＩＬ−１２）および対照抗体（対照ＩｇＧ）
によるＫ６細胞への 125Ｉ−２−４Ｅ６結合の阻害を示
す図である。
【図14】室温でのヒトＫ６細胞への 125Ｉ−ＩＬ−１２
の平衡結合を示す図である。
の平衡結合を示す図である。
【図15】Ｋ６細胞由来の界面活性剤可溶化ＩＬ−１２Ｒ
への 125Ｉ−ＩＬ−１２の平衡結合を示す図である。
への 125Ｉ−ＩＬ−１２の平衡結合を示す図である。
【図16】モノクローナル抗体２−４Ｅ６による界面活性
剤可溶化ＩＬ−１２Ｒのウエスタンブロット分析を示す
電気泳動の写真である。
剤可溶化ＩＬ−１２Ｒのウエスタンブロット分析を示す
電気泳動の写真である。
【図17】フローサイトメトリーによるヒト細胞上のＩＬ
−１２受容体の検出を示す図である。
−１２受容体の検出を示す図である。
【図18】トランスフェクションを行ったＣＯＳおよびＣ
ＴＬＬ細胞の表面に存在するＩＬ−１２受容体サブユニ
ットの大きさを示す電気泳動の写真である。レーン１〜
４：非還元条件下での親和性架橋結合複合体の分析。レ
ーン５〜12： 125Ｉ−ＣＯＳ細胞表面タンパク質の分
析。レーン13〜16： 125Ｉ−ＣＴＬＬ細胞表面タンパク
質の分析。
ＴＬＬ細胞の表面に存在するＩＬ−１２受容体サブユニ
ットの大きさを示す電気泳動の写真である。レーン１〜
４：非還元条件下での親和性架橋結合複合体の分析。レ
ーン５〜12： 125Ｉ−ＣＯＳ細胞表面タンパク質の分
析。レーン13〜16： 125Ｉ−ＣＴＬＬ細胞表面タンパク
質の分析。
【図19】ラットの抗ＩＬ−１２Ｒ抗血清、免疫前血清お
よび抗ＩＬ−１Ｒ抗血清における抗ＣＯＳ細胞抗体のフ
ローサイトメトリーによる滴定を示す図である。
よび抗ＩＬ−１Ｒ抗血清における抗ＣＯＳ細胞抗体のフ
ローサイトメトリーによる滴定を示す図である。
【図20】ＩＬ−１２により誘導されるＰＨＡ活性化ＰＢ
ＭＣの増殖に及ぼすラット血清の影響を示す図である。
ＭＣの増殖に及ぼすラット血清の影響を示す図である。
【図21】ＩＬ−２により誘導されるＰＨＡ活性化ＰＢＭ
Ｃの増殖に及ぼすラット血清の影響を示す図である。
Ｃの増殖に及ぼすラット血清の影響を示す図である。
【図22】ＩＬ−７により誘導されるＰＨＡ活性化ＰＢＭ
Ｃの増殖に及ぼすラット血清の影響を示す図である。
Ｃの増殖に及ぼすラット血清の影響を示す図である。
【図23】ＩＬ−１２受容体サブユニットを発現するＣＯ
Ｓ細胞への 125Ｉ−ＩＬ−１２の平衡結合を示す図であ
る。Ａ）ヒトＩＬ−１２、Ｂ）マウスＩＬ−１２。挿入
図はスキャッチャード法による結合データの分析を示
す。
Ｓ細胞への 125Ｉ−ＩＬ−１２の平衡結合を示す図であ
る。Ａ）ヒトＩＬ−１２、Ｂ）マウスＩＬ−１２。挿入
図はスキャッチャード法による結合データの分析を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/71 8318−4Ｈ 14/715 8318−4Ｈ 16/28 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｐ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 アン オン チュア アメリカ合衆国 07470 ニュージャージ ー州 ウェイン， カレン コート ５ (72)発明者 ウルリッヒ アンドレア グブラー アメリカ合衆国 07028 ニュージャージ ー州 グレン リッジ，イネス プレイス ４ (72)発明者 セレサ パトリシア トゥルーイット アメリカ合衆国 07003 ニュージャージ ー州 ブルームフィールド， ガーナー アベニュー 109
Claims (31)
- 【請求項１】 インターロイキン−１２と特異的に結合
する低親和性のインターロイキン−１２受容体またはそ
の機能性誘導体をコードするＤＮＡ分子。 - 【請求項２】 インターロイキン−１２と特異的に結合
するヒトの低親和性インターロイキン−１２受容体また
はその機能性誘導体をコードする、請求項１記載のＤＮ
Ａ分子。 - 【請求項３】 配列番号：１の配列またはその縮重変異
配列を有する、請求項１または２記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項４】 配列番号：２または配列番号：３のアミ
ノ酸配列またはその一部分をコードする、請求項１〜３
のいずれか１つに記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項５】 可溶性の末端切断型インターロイキン−
１２受容体タンパク質をコードする、請求項１〜４のい
ずれか１つに記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１つに記載のＤ
ＮＡ分子を含むベクター。 - 【請求項７】 請求項６のベクターによって形質転換さ
れた宿主細胞。 - 【請求項８】 インターロイキン−１２と特異的に結合
する低親和性のインターロイキン−１２受容体タンパク
質またはその機能性誘導体。 - 【請求項９】 請求項１〜５のいずれか１つに記載のＤ
ＮＡ分子によりコードされる低親和性のインターロイキ
ン−１２受容体タンパク質。 - 【請求項10】 約２〜１０ｎＭのＫD 、好ましくは約２
〜５ｎＭのＫD を有する、請求項８または９記載の低親
和性のインターロイキン−１２受容体タンパク質。 - 【請求項11】 還元条件下でゲル電気泳動により測定し
た見かけの分子量が約１００ｋＤａである、請求項８〜
10のいずれか１つに記載の低親和性のインターロイキン
−１２受容体タンパク質。 - 【請求項12】 １００ｋＤａ受容体サブユニットのダイ
マーまたはオリゴマーである、請求項８〜11のいずれか
１つに記載の低親和性のインターロイキン−１２受容体
タンパク質。 - 【請求項13】 ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣ上の機能性インタ
ーロイキン−１２受容体の低親和性成分に相当する、請
求項８〜12のいずれか１つに記載の低親和性のインター
ロイキン−１２受容体タンパク質。 - 【請求項14】 請求項８〜13のいずれか１つに記載のイ
ンターロイキン−１２受容体タンパク質と選択的に結合
することができる免疫グロブリン。 - 【請求項15】 抗血清組成物またはモノクローナル抗体
の形態である、請求項14記載の免疫グロブリン。 - 【請求項16】 インターロイキン−１２受容体へのイン
ターロイキン−１２の結合を阻止することができ、かつ
ＩＬ−１２受容体と結合することによってＩＬ−１２の
生物活性を中和することができる、請求項14または15記
載の免疫グロブリン。 - 【請求項17】 インターロイキン−１２受容体と結合す
るが、インターロイキン−１２受容体へのインターロイ
キン−１２の結合を阻止することができず、ヒトＩＬ−
１２受容体と結合することによってインターロイキン−
１２の生物活性を中和することもできない、請求項14ま
たは15記載の免疫グロブリン。 - 【請求項18】 インターロイキン−１２に結合させるた
めのまたはインターロイキン−１２を取り除くための請
求項８〜13のいずれか１つに記載のタンパク質。 - 【請求項19】 インターロイキン−１２の生物活性を中
和および／または阻止するための請求項14〜17のいずれ
か１つに記載の免疫グロブリン。 - 【請求項20】 請求項８〜13のいずれか１つに記載の低
親和性のインターロイキン−１２受容体タンパク質およ
び適当な希釈剤または担体を含有してなる医薬組成物。 - 【請求項21】 １種またはそれ以上の他のサイトカイン
受容体アンタゴニストを含有する、請求項20記載の組成
物。 - 【請求項22】 請求項14〜17のいずれか１つに記載の免
疫グロブリンおよび適当な希釈剤または担体を含有して
なる医薬組成物。 - 【請求項23】 請求項14〜17のいずれか１つに記載の免
疫グロブリンと結合したインターロイキン−１２受容体
を発現するように活性化されたヒト細胞を含有する組成
物であって、該免疫グロブリンが検出可能に標識されて
いることを特徴とする組成物。 - 【請求項24】 医薬組成物を調製するための請求項８〜
13のいずれか１つに記載のインターロイキン−１２受容
体の使用法。 - 【請求項25】 同種異系抗原に対する免疫反応によって
引き起こされる疾病または症状の治療用医薬組成物、あ
るいは自己免疫疾患の治療用医薬組成物を調製するため
の請求項24記載の使用法。 - 【請求項26】 インターロイキン−１２に結合させるた
めのまたはインターロイキン−１２を取り除くための請
求項８〜13のいずれか１つに記載のインターロイキン−
１２受容体タンパク質の使用法。 - 【請求項27】 医薬組成物を調製するための請求項14〜
17のいずれか１つに記載の免疫グロブリンの使用法。 - 【請求項28】 インターロイキン−１２受容体の検出方
法であって、インターロイキン−１２受容体を発現する
細胞を被験者から単離し、該細胞のサンプルをインター
ロイキン−１２受容体と選択的に結合することができる
検出可能な免疫グロブリンと接触させ、検出可能な免疫
グロブリンをインターロイキン−１２受容体に結合させ
る条件下で該細胞をインキュベートし、そして該細胞の
該免疫グロブリンへの結合を検出することからなる方
法。 - 【請求項29】 前記の免疫グロブリンが固体の樹脂に共
有結合で結合されており、そして／または該免疫グロブ
リンが検出可能に標識されている、請求項28記載の方
法。 - 【請求項30】 可溶性のインターロイキン−１２受容体
の検出方法であって、ＩＬ−１２受容体と選択的に結合
することができる免疫グロブリンを用いて該受容体を捕
捉し、そして標識したインターロイキン−１２との結合
検定を実施することからなる方法。 - 【請求項31】 被験者における免疫系の異常の検査方法
であって、被験者から得たサンプル中のＴ細胞、ＮＫ細
胞またはＢ細胞の数を測定し、該サンプルをヒトＩＬ−
１２受容体との複合体を形成することができる免疫グロ
ブリンと接触させてヒトＩＬ−１２受容体と該免疫グロ
ブリンとの細胞性複合体を形成させ、ヒトＩＬ−１２受
容体を有する該サンプル中のＴ細胞、ＮＫ細胞またはＢ
細胞のパーセンテージを求め、そして該細胞のパーセン
テージと免疫系の異常を示さない正常被験者から得た該
細胞のパーセンテージとを比較することからなり、この
ようにして得られた該細胞のパーセンテージの差異が免
疫系異常の指標となることを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9471393A | 1993-07-19 | 1993-07-19 | |
| US9464993A | 1993-07-19 | 1993-07-19 | |
| US094649 | 1994-05-31 | ||
| US094713 | 1994-05-31 | ||
| US08/248,532 US5536657A (en) | 1993-07-19 | 1994-05-31 | Recombinant DNA encoding human receptor for interleukin-12 |
| US248532 | 2003-01-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07194383A true JPH07194383A (ja) | 1995-08-01 |
Family
ID=27377770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6166950A Pending JPH07194383A (ja) | 1993-07-19 | 1994-07-19 | インターロイキン−１２受容体および抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0638644A1 (ja) |
| JP (1) | JPH07194383A (ja) |
| AU (1) | AU676325B2 (ja) |
| CA (1) | CA2128151A1 (ja) |
| NZ (1) | NZ264003A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012524524A (ja) * | 2009-04-27 | 2012-10-18 | ノバルティス アーゲー | ＩＬ−１２レセプターβ１サブユニットに特異的な治療用抗体の組成物および使用方法 |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA95960B (en) † | 1994-03-14 | 1995-10-10 | Genetics Inst | Use of interleukin-12 antagonists in the treatment of autoimmune diseases |
| US6706264B1 (en) | 1994-03-14 | 2004-03-16 | Genetics Institute, Llc | Use of IL-12 antagonists in the treatment of conditions promoted by an increase in levels of IFN-y |
| DK1243597T3 (da) * | 1995-08-01 | 2008-09-22 | Hoffmann La Roche | Receptorer for det humane interleukin-12 |
| US5945511A (en) * | 1997-02-20 | 1999-08-31 | Zymogenetics, Inc. | Class II cytokine receptor |
| US6054487A (en) * | 1997-03-18 | 2000-04-25 | Basf Aktiengesellschaft | Methods and compositions for modulating responsiveness to corticosteroids |
| WO1999025737A1 (en) * | 1997-11-19 | 1999-05-27 | Tanox Pharma B.V. | Compositions and methods for treatment of autoimmune diseases, using a monoclonal antibody to the interleukin-12 beta2-chain |
| US6914128B1 (en) | 1999-03-25 | 2005-07-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing |
| US7883704B2 (en) | 1999-03-25 | 2011-02-08 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Methods for inhibiting the activity of the P40 subunit of human IL-12 |
| CN104524567A (zh) | 2007-01-16 | 2015-04-22 | 阿布维公司 | 用于治疗银屑病的方法 |
| KR20100014674A (ko) | 2007-03-29 | 2010-02-10 | 아보트 러보러터리즈 | 결정성 항-사람 ｉｌ-12 항체 |
| RU2497545C2 (ru) | 2008-03-18 | 2013-11-10 | Эбботт Лэборетриз | Способ лечения псориаза (варианты) |
| AU2010291927A1 (en) | 2009-09-14 | 2012-04-12 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Methods for treating psoriasis |
| MA45488A (fr) | 2015-10-22 | 2018-08-29 | Juno Therapeutics Gmbh | Procédés, kits et appareil de culture de cellules |
| CN114466657A (zh) * | 2019-07-25 | 2022-05-10 | 芝加哥大学 | 包括蛋白酶激活治疗剂的组合物和方法 |
-
1994
- 1994-07-08 EP EP94110657A patent/EP0638644A1/en not_active Withdrawn
- 1994-07-14 NZ NZ264003A patent/NZ264003A/en unknown
- 1994-07-15 CA CA002128151A patent/CA2128151A1/en not_active Abandoned
- 1994-07-15 AU AU67505/94A patent/AU676325B2/en not_active Ceased
- 1994-07-19 JP JP6166950A patent/JPH07194383A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012524524A (ja) * | 2009-04-27 | 2012-10-18 | ノバルティス アーゲー | ＩＬ−１２レセプターβ１サブユニットに特異的な治療用抗体の組成物および使用方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2128151A1 (en) | 1995-01-20 |
| EP0638644A1 (en) | 1995-02-15 |
| AU6750594A (en) | 1995-01-27 |
| NZ264003A (en) | 1995-12-21 |
| AU676325B2 (en) | 1997-03-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tanaka et al. | A novel monoclonal antibody against murine IL-2 receptor beta-chain. Characterization of receptor expression in normal lymphoid cells and EL-4 cells. | |
| KR100912994B1 (ko) | Ｎｋｇ２ｄ의 조절 | |
| EP0724456B1 (en) | Antibodies to cd40 | |
| EP1073465B1 (en) | T cell inhibitory receptor compositions and uses thereof | |
| US6177078B1 (en) | Monoclonal antibody antagonists to IL-3 | |
| JP3836500B2 (ja) | Ｉ型インターフェロンに対する中和活性を有するインターフェロン受容体に対するモノクローナル抗体 | |
| JP2017536825A (ja) | 抗突然変異ｋｒａｓ ｔ細胞受容体 | |
| JPH09512163A (ja) | ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リセプターに対するアゴニスト抗体とその使用 | |
| JPH07194383A (ja) | インターロイキン−１２受容体および抗体 | |
| JP2004521654A (ja) | Ｉｌ−１２及びｉｌ−１８に対する二特異的モノクローナル抗体 | |
| US5536657A (en) | Recombinant DNA encoding human receptor for interleukin-12 | |
| US5852176A (en) | Antibodies to receptors for human interleukin-12 | |
| US5853721A (en) | Antibody to interleukin-12 receptor | |
| US7070776B1 (en) | Methods for blocking binding of CD28 receptor to B7 | |
| Nicola et al. | Neutralizing and nonneutralizing monoclonal antibodies to the human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha-chain | |
| WO1998003551A1 (en) | Cd6 ligand | |
| JP3979008B2 (ja) | Ｇ−ｃｓｆレセプターアゴニスト抗体及びそのスクリーニング方法 | |
| EP0830373A1 (en) | Cd6 ligand | |
| AU733249B2 (en) | Methods and means for modifying complement activation | |
| Stockinger et al. | Human blood basophils synthesize interleukin-2 binding sites | |
| JP3040451B2 (ja) | モノクローナル抗体 | |
| Somoza et al. | OX48, a monoclonal antibody against a 70,000 MW rat activation antigen expressed by T cells bearing the high-affinity interleukin-2 receptor. | |
| NZ239834A (en) | Polypeptide and protein complex of gp98 cell surface glycoprotein; monoclonal antibody against it and their use |