JP3040451B2 - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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- JP3040451B2 JP3040451B2 JP2291725A JP29172590A JP3040451B2 JP 3040451 B2 JP3040451 B2 JP 3040451B2 JP 2291725 A JP2291725 A JP 2291725A JP 29172590 A JP29172590 A JP 29172590A JP 3040451 B2 JP3040451 B2 JP 3040451B2
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- antibody
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はマウスのインターロイキン２（以下、IL−２
という）レセプターβ鎖を認識するモノクローナル抗体
に関する。
という）レセプターβ鎖を認識するモノクローナル抗体
に関する。
［従来の技術］ Ｔリンパ球の主要な増殖因子であるIL−２は、細胞表
面に存在する特異的レセプターに結合することによって
機能する。このIL−２レセプターを構成するポリペプチ
ド鎖には、少なくとも２種類（α鎖、β鎖）のものが存
在する。IL−２レセプターには親和性の異なる３種類の
ものが存在するが、低親和性のレセプターはα鎖のみか
ら、中親和性レセプターはβ鎖のみから、高親和性レセ
プターはα鎖、β鎖の複合体により形成される。
面に存在する特異的レセプターに結合することによって
機能する。このIL−２レセプターを構成するポリペプチ
ド鎖には、少なくとも２種類（α鎖、β鎖）のものが存
在する。IL−２レセプターには親和性の異なる３種類の
ものが存在するが、低親和性のレセプターはα鎖のみか
ら、中親和性レセプターはβ鎖のみから、高親和性レセ
プターはα鎖、β鎖の複合体により形成される。
この２種類のポリペプチド鎖のうち、IL−２のシグナ
ル伝達に直接的に関与するのはβ鎖である。本発明者ら
は、ヒトIL−２レセプターβ鎖を認識するモノクローナ
ル抗体の作製をするとともに、これを用いてヒトβ鎖を
コードするcDNAの単離に成功した［Tsudo,M.,Kitamura,
F.,Miyasaka,M:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86巻、1982−1
986頁（1989）;Hatakeyama,M.,Tsudo,M.,Minamoto,S.,K
ono,T.,Doi,T.,Miyata,T.,Miyasaka,M.,Taniguchi,T.;S
cience,244巻、551−556頁（1989）］。
ル伝達に直接的に関与するのはβ鎖である。本発明者ら
は、ヒトIL−２レセプターβ鎖を認識するモノクローナ
ル抗体の作製をするとともに、これを用いてヒトβ鎖を
コードするcDNAの単離に成功した［Tsudo,M.,Kitamura,
F.,Miyasaka,M:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86巻、1982−1
986頁（1989）;Hatakeyama,M.,Tsudo,M.,Minamoto,S.,K
ono,T.,Doi,T.,Miyata,T.,Miyasaka,M.,Taniguchi,T.;S
cience,244巻、551−556頁（1989）］。
一方、マウスIL−２レセプターβ鎖に反応するモノク
ローナル抗体は、まだ知られていない。
ローナル抗体は、まだ知られていない。
［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は、マウスのIL−２レセプターβ鎖を認
識するモノクローナル抗体を提供することにある。
識するモノクローナル抗体を提供することにある。
［問題を解決するための手段］ 本発明者らは、このような問題を解決すべく研究を行
った結果、前述のヒトIL−２レセプターβ鎖のcDNAを用
いてクロスハイブリド化することにより、マウスIL−２
レセプターβ鎖をコードするcDNAの単離に成功した［Ko
no,T.,Doi,T.,Yamada,G.,Hatakeyama,M.,Minamoto,S.,T
sudo,M.,Miyasaka,M.,Miyata,T.,Taniguchi,T.;Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,87巻、1806−1810頁（1990）］。さら
に、このcDNAを遺伝子導入することにより、マウスIL−
２レセプターβ鎖を高率に発現する細胞株を作成した。
そして、これを免疫原として用いることにより、マウス
のIL−２レセプターβ鎖に対するモノクローナル抗体を
得るに至った。
った結果、前述のヒトIL−２レセプターβ鎖のcDNAを用
いてクロスハイブリド化することにより、マウスIL−２
レセプターβ鎖をコードするcDNAの単離に成功した［Ko
no,T.,Doi,T.,Yamada,G.,Hatakeyama,M.,Minamoto,S.,T
sudo,M.,Miyasaka,M.,Miyata,T.,Taniguchi,T.;Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,87巻、1806−1810頁（1990）］。さら
に、このcDNAを遺伝子導入することにより、マウスIL−
２レセプターβ鎖を高率に発現する細胞株を作成した。
そして、これを免疫原として用いることにより、マウス
のIL−２レセプターβ鎖に対するモノクローナル抗体を
得るに至った。
すなわち本発明は、マウスのIL−２レセプターβ鎖を
認識するモノクローナル抗体に関する。
認識するモノクローナル抗体に関する。
なお、本発明のモノクローナル抗体は、下記の性質を
有しているものが好ましい。
有しているものが好ましい。
（Ａ）マウスインターロイキン２レセプターβ鎖を特異
的に認識する。
的に認識する。
（Ｂ）マウスインターロイキン２レセプターα鎖には反
応しない。
応しない。
（Ｃ）インターロイキン２とマウスインターロイキン２
レセプターβ鎖との結合を特異的に阻害する。
レセプターβ鎖との結合を特異的に阻害する。
（Ｄ）高親和性のマウスインターロイキン２レセプター
へのインターロイキン２の結合を阻害する。
へのインターロイキン２の結合を阻害する。
（Ｅ）低親和性のマウスインターロイキン２レセプター
へのインターロイキン２の結合を阻害しない。
へのインターロイキン２の結合を阻害しない。
（Ｆ）インターロイキン２によるC57BL/6マウス脾臓細
胞の増殖を抑制するが、コンカナバリンＡによる前記細
胞の増殖には実質的に影響を与えない。
胞の増殖を抑制するが、コンカナバリンＡによる前記細
胞の増殖には実質的に影響を与えない。
本発明のモノクローナル抗体は、次のようにして作製
することができる。
することができる。
まず、マウスIL−２レセプターβ鎖のcDNAを含むプラ
スミドから、制限酵素を用いて該cDNAの断片を切り出
す。これをpBluescript SKベクターの制限部位に挿入
し、プラスミドSK−mIL−2Rβを作成する。これを制限
酵素で処理して、ポリリンカー部位の一部を含むcDNA断
片を得る。これを改良BCMGNeoベクターの制限部位に挿
入して、マウスIL−２レセプターβ鎖のcDNAを挿入した
発現ベクターBCMGSmIL−2Rβを得る。
スミドから、制限酵素を用いて該cDNAの断片を切り出
す。これをpBluescript SKベクターの制限部位に挿入
し、プラスミドSK−mIL−2Rβを作成する。これを制限
酵素で処理して、ポリリンカー部位の一部を含むcDNA断
片を得る。これを改良BCMGNeoベクターの制限部位に挿
入して、マウスIL−２レセプターβ鎖のcDNAを挿入した
発現ベクターBCMGSmIL−2Rβを得る。
このようにして得られた該発現ベクターを、ラットα
鎖を発現するＴ細胞株に遺伝子導入する。その方法とし
ては、電気穿孔法、プロトプラスト融合法などが例示さ
れる。そして、G418薬剤耐性株を選択した後、cDNA導入
細胞株のマウスβ鎖の発現を検索し、それが明らかに認
められる遺伝子導入細胞株を得る。
鎖を発現するＴ細胞株に遺伝子導入する。その方法とし
ては、電気穿孔法、プロトプラスト融合法などが例示さ
れる。そして、G418薬剤耐性株を選択した後、cDNA導入
細胞株のマウスβ鎖の発現を検索し、それが明らかに認
められる遺伝子導入細胞株を得る。
上記の細胞株をラットに皮下注射して、免疫を生ぜし
める。こうして得られた免疫ラットのリンパ節細胞とマ
ウスのミエローマ細胞とを細胞融合させて、ハイブリド
ーマを作成する。HAT培地により細胞融合株を選択した
後、培養上澄中のマウスIL−２レセプターβ鎖に対する
抗体活性を検索し、抗マウスβ鎖抗体を産出するハイブ
リドーマを得る。これを限界希釈法によりクローニング
した後、マウスの腹腔内に移植し、該抗体を含む腹水を
得る。この腹水により、アフィニティークロマトグラフ
ィーによって抗体を精製する。
める。こうして得られた免疫ラットのリンパ節細胞とマ
ウスのミエローマ細胞とを細胞融合させて、ハイブリド
ーマを作成する。HAT培地により細胞融合株を選択した
後、培養上澄中のマウスIL−２レセプターβ鎖に対する
抗体活性を検索し、抗マウスβ鎖抗体を産出するハイブ
リドーマを得る。これを限界希釈法によりクローニング
した後、マウスの腹腔内に移植し、該抗体を含む腹水を
得る。この腹水により、アフィニティークロマトグラフ
ィーによって抗体を精製する。
［発明の効果］ 本発明によって、マウスのIL−２レセプターβ鎖を認
識するモノクローナル抗体を得た。
識するモノクローナル抗体を得た。
このことによって、移植、自己免疫疾患などの実験モ
デルにおけるIL−2/IL−２レセプター系の関与について
も解析が可能になった。
デルにおけるIL−2/IL−２レセプター系の関与について
も解析が可能になった。
［実施例］ 以下、本発明を実施例によって説明する。本発明は実
施例によって限定されるものではない。
施例によって限定されるものではない。
（１）細胞株 HTLV−１感染ラットＴ細胞株TART−１（北海道大学医
学部・吉木博士より供与を受けた）、マウスリンパ腫EL
−４及び5.1.2は、10％の牛胎児血清（FCS）を加えたRP
MI1640培地を用いて維持した。マウスIL−２依存性Ｔ細
胞株CTLL−２及びHT−２、BALB/cマウス胎児肝由来IL−
２依存性細胞株LFD−14（自治医大・湊博士より供与を
受けた）は、１−5nMの濃度のIL−２を含む10％のFCSを
加えたRPMI1640培地を用いて継代維持した。
学部・吉木博士より供与を受けた）、マウスリンパ腫EL
−４及び5.1.2は、10％の牛胎児血清（FCS）を加えたRP
MI1640培地を用いて維持した。マウスIL−２依存性Ｔ細
胞株CTLL−２及びHT−２、BALB/cマウス胎児肝由来IL−
２依存性細胞株LFD−14（自治医大・湊博士より供与を
受けた）は、１−5nMの濃度のIL−２を含む10％のFCSを
加えたRPMI1640培地を用いて継代維持した。
（２）マウスIL−２レセプターβ鎖cDNAを挿入した発現
ベクターの作成 マウスIL−２レセプターβ鎖のcDNAを含むプラスミド
pMIL−2Rβ−36から、制限酵素EcoR I、BamH Iを用いる
ことにより、β鎖cDNA断片を切り出した。このcDNA断片
は1.7kbの長さを有し、β鎖蛋白のコーディング領域の
全域を含んでいた。これをpBluescript SKベクター（S
tratagene）のEccR I、BamH I制限部位に挿入し、プラ
スミドSK−mIL−2Rβを作成した。このプラスミドを制
限酵素、Xho I、Not Iで処理することにより、pBluescr
ipt SKのポリリンカー部位の一部を含む約1.7kbのcDNA
断片を得た。
ベクターの作成 マウスIL−２レセプターβ鎖のcDNAを含むプラスミド
pMIL−2Rβ−36から、制限酵素EcoR I、BamH Iを用いる
ことにより、β鎖cDNA断片を切り出した。このcDNA断片
は1.7kbの長さを有し、β鎖蛋白のコーディング領域の
全域を含んでいた。これをpBluescript SKベクター（S
tratagene）のEccR I、BamH I制限部位に挿入し、プラ
スミドSK−mIL−2Rβを作成した。このプラスミドを制
限酵素、Xho I、Not Iで処理することにより、pBluescr
ipt SKのポリリンカー部位の一部を含む約1.7kbのcDNA
断片を得た。
これを改良BCMGNeoベクターのXho I、Not I制限部位
に挿入することにより、遺伝子導入細胞株を作成するた
めのプラスミドBCMGSmIL−2Rβを得た。この発現ベクタ
ーは、サイトメガロウイルスのプロモーターと、ネオマ
イシン耐性遺伝子とを有していた。
に挿入することにより、遺伝子導入細胞株を作成するた
めのプラスミドBCMGSmIL−2Rβを得た。この発現ベクタ
ーは、サイトメガロウイルスのプロモーターと、ネオマ
イシン耐性遺伝子とを有していた。
（３）マウスIL−２レセプターβ鎖cDNA導入細胞株の作
製 （２）で得られた発現ベクターBCMGSmIL−2Rβを、ラ
ットα鎖を発現するＴ細胞株TART−１に電気穿孔法で遺
伝子導入した。G418を加えて、ネオマイシン耐性株を選
択した後、マウスβ鎖を発現するcDNA導入細胞株を、次
の２つの方法によって検索した。
製 （２）で得られた発現ベクターBCMGSmIL−2Rβを、ラ
ットα鎖を発現するＴ細胞株TART−１に電気穿孔法で遺
伝子導入した。G418を加えて、ネオマイシン耐性株を選
択した後、マウスβ鎖を発現するcDNA導入細胞株を、次
の２つの方法によって検索した。
１）高親和性IL−２受容体の発現 ２）マウスβ鎖cDNAをプローブとしたRNAドットプロッ
ト法 すなわち前者では、高親和性（125I標識ヒトIL−２の
終濃度62.5pM）、及び低親和性（125I標識IL−２の終濃
度2nM）の条件下でIL−２の結合試験を行い、両条件に
おける結合量を比較した。また後者ではcDNA導入株の細
胞質内RNAを調製し、ナイロン膜に固相化した後、32P標
識したマウスβ鎖cDNAと結合するRNAの存在を検索し
た。以上の方法により、マウスβ鎖の発現が明らかに認
められる遺伝子導入細胞株（TART−ｍβ）を得た。
ト法 すなわち前者では、高親和性（125I標識ヒトIL−２の
終濃度62.5pM）、及び低親和性（125I標識IL−２の終濃
度2nM）の条件下でIL−２の結合試験を行い、両条件に
おける結合量を比較した。また後者ではcDNA導入株の細
胞質内RNAを調製し、ナイロン膜に固相化した後、32P標
識したマウスβ鎖cDNAと結合するRNAの存在を検索し
た。以上の方法により、マウスβ鎖の発現が明らかに認
められる遺伝子導入細胞株（TART−ｍβ）を得た。
（４）モノクローナル抗体の作製 雌Sprague−Dawleyラットを、1.2〜２×107のTART−
ｍβを１週間間隔で５回、後肢足蹠に注射することによ
って免疫した。最終免疫の３日後に、ポリエチレングリ
コール4000（メルク社）を用いて、常法により、膝窩リ
ンパ節細胞とマウスのミエローマ細胞PAIとを細胞融合
させ、ハイブリドーマを作製した。HAT培地を用いて細
胞融合株を選択した後、ハイブリドーマ培養上澄中のマ
ウスIL−２レセプターβ鎖に対する抗体活性を、次の２
つを指標に検索し、抗マウスβ鎖抗体（TM−β１、ラッ
トIgG 2b）を産出するハイブリドーマを得た。（該TM−
β１産生ハイブリドーマは、工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第11780号として寄託されてい
る。） １）LFD−14に対するIL−２の結合阻害試験 ２）TART−ｍβに対する反応性 これを限界希釈法で２回クローニングした後、BALB/c
ヌードマウス腹腔内に移植し、TM−β１を含む腹水を得
た。TM−β１抗体はマウス腹水より、プロテインＡをリ
ガンドとするアフィニティークロマトグラフィー（MAPS
−IIキット、バイオラッド社）によって精製した。
ｍβを１週間間隔で５回、後肢足蹠に注射することによ
って免疫した。最終免疫の３日後に、ポリエチレングリ
コール4000（メルク社）を用いて、常法により、膝窩リ
ンパ節細胞とマウスのミエローマ細胞PAIとを細胞融合
させ、ハイブリドーマを作製した。HAT培地を用いて細
胞融合株を選択した後、ハイブリドーマ培養上澄中のマ
ウスIL−２レセプターβ鎖に対する抗体活性を、次の２
つを指標に検索し、抗マウスβ鎖抗体（TM−β１、ラッ
トIgG 2b）を産出するハイブリドーマを得た。（該TM−
β１産生ハイブリドーマは、工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第11780号として寄託されてい
る。） １）LFD−14に対するIL−２の結合阻害試験 ２）TART−ｍβに対する反応性 これを限界希釈法で２回クローニングした後、BALB/c
ヌードマウス腹腔内に移植し、TM−β１を含む腹水を得
た。TM−β１抗体はマウス腹水より、プロテインＡをリ
ガンドとするアフィニティークロマトグラフィー（MAPS
−IIキット、バイオラッド社）によって精製した。
（５）IL−２結合試験 種々の細胞に対するIL−２結合試験は、Tsudoらの方
法［Tsudo,M.,Karasuyama,H.,Kitamura,F.,Nagasaka,
Y.,Tanaka,T.,Miyasaka,M.;J.Immunol.,143巻、4039−4
043頁（1989）］に従った。すなわち、50μの細胞浮
遊液に25μの検体と125I標識IL−２希釈液25μを加
え、氷浴上で１時間反応させた。反応液を200μの80
％ジブチルフタル酸−20％オリーブ油に重層し、10,000
rpmで1.5分遠心することによって非結合IL−２を分離
し、細胞に結合した放射活性をガンマカウンターで測定
した。ヒト組替えIL−２（武田薬品工業株式会社により
供与を受けた）はエンザイモビーズ（バイオラッド社）
を用いて放射性ヨウ素標識した。その比活性は60,000〜
100,000cpm/ngであった。また受容体とIL−２の解離定
数及び細胞あたりの受容体の発現数は、スキャッチャー
ド解析によって算定した。
法［Tsudo,M.,Karasuyama,H.,Kitamura,F.,Nagasaka,
Y.,Tanaka,T.,Miyasaka,M.;J.Immunol.,143巻、4039−4
043頁（1989）］に従った。すなわち、50μの細胞浮
遊液に25μの検体と125I標識IL−２希釈液25μを加
え、氷浴上で１時間反応させた。反応液を200μの80
％ジブチルフタル酸−20％オリーブ油に重層し、10,000
rpmで1.5分遠心することによって非結合IL−２を分離
し、細胞に結合した放射活性をガンマカウンターで測定
した。ヒト組替えIL−２（武田薬品工業株式会社により
供与を受けた）はエンザイモビーズ（バイオラッド社）
を用いて放射性ヨウ素標識した。その比活性は60,000〜
100,000cpm/ngであった。また受容体とIL−２の解離定
数及び細胞あたりの受容体の発現数は、スキャッチャー
ド解析によって算定した。
（６）IL−２の化学架橋試験 IL−２の化学架橋試験は、Tsudoらの方法（前出の文
献を参照）に従って、高親和性（125I標識IL−２の終濃
度200pM）及び低親和性（125I標識IL−２の終濃度2nM）
の結合条件で検討を行った。すなわち、100μ中に１
×107の細胞を含むリン酸緩衝液（PBS）に50μの検体
と50μの125I標識IL−２を加え、氷上で１時間反応さ
せた。これに８μの50mMスベリン酸ジスクシンイミジ
ル（ピアス社）を加え、室温で15分間反応させた。500
μの1mM EDTA、140mM NaClを含む10mM Tris緩衝液（p
H7.4）を加えて反応を終了させ、PBSで洗浄した後に、
細胞を溶解緩衝液（１％NP−40、2mMフェニルメチルス
ルホニルフルオリド、150mM NaClを含む10Mm Tris緩衝
液（pH7.4））で可溶化し、IL−２受容体−125I標識IL
−２複合体を得た。これをドデシル硫酸ナトリウム／ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）によって
解析した。
献を参照）に従って、高親和性（125I標識IL−２の終濃
度200pM）及び低親和性（125I標識IL−２の終濃度2nM）
の結合条件で検討を行った。すなわち、100μ中に１
×107の細胞を含むリン酸緩衝液（PBS）に50μの検体
と50μの125I標識IL−２を加え、氷上で１時間反応さ
せた。これに８μの50mMスベリン酸ジスクシンイミジ
ル（ピアス社）を加え、室温で15分間反応させた。500
μの1mM EDTA、140mM NaClを含む10mM Tris緩衝液（p
H7.4）を加えて反応を終了させ、PBSで洗浄した後に、
細胞を溶解緩衝液（１％NP−40、2mMフェニルメチルス
ルホニルフルオリド、150mM NaClを含む10Mm Tris緩衝
液（pH7.4））で可溶化し、IL−２受容体−125I標識IL
−２複合体を得た。これをドデシル硫酸ナトリウム／ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）によって
解析した。
（７）免疫蛍光染色 培養細胞の免疫蛍光染色は、以下の方法で行った。す
なわち、１×106個の細胞にTM−β１抗体を加え、氷浴
上で30分反応させた後、遠心洗浄した。次に第二抗体と
してフルオレセインイソチオシアネート（FITC）で標識
したウサギ抗ラットイムノグロブリン抗体を加え、氷浴
上で30分反応させた後、遠心洗浄した。細胞はフローサ
イトメーター（エピックスCS）で解析した。対照として
は第二抗体のみを加えたものを用いた。
なわち、１×106個の細胞にTM−β１抗体を加え、氷浴
上で30分反応させた後、遠心洗浄した。次に第二抗体と
してフルオレセインイソチオシアネート（FITC）で標識
したウサギ抗ラットイムノグロブリン抗体を加え、氷浴
上で30分反応させた後、遠心洗浄した。細胞はフローサ
イトメーター（エピックスCS）で解析した。対照として
は第二抗体のみを加えたものを用いた。
マウス脾臓細胞の二色蛍光染色は、以下の方法で行っ
た。すなわち、１×106個のC57BL/6マウス脾臓細胞に、
FITC標識した抗マウスThy 1、抗マウスCD4、抗マウスCD
8、抗マウスCD3、抗NK1.1、抗マウスイムノグロブリン
（sIg）などの各種の抗体と、ビチオン化TM−β１抗体
とを加え、氷浴上で30分反応させた後、細胞を遠心洗浄
した。次に二次試薬として、アビジン標識フィコエリス
リン（PE）を加え、氷浴上で30分反応させた後、細胞を
遠心洗浄し、同様の解析を行った。
た。すなわち、１×106個のC57BL/6マウス脾臓細胞に、
FITC標識した抗マウスThy 1、抗マウスCD4、抗マウスCD
8、抗マウスCD3、抗NK1.1、抗マウスイムノグロブリン
（sIg）などの各種の抗体と、ビチオン化TM−β１抗体
とを加え、氷浴上で30分反応させた後、細胞を遠心洗浄
した。次に二次試薬として、アビジン標識フィコエリス
リン（PE）を加え、氷浴上で30分反応させた後、細胞を
遠心洗浄し、同様の解析を行った。
（８）免疫沈降 TART−ｍβ細胞及びTART−１をグルコースオキシター
ゼ・ラクトペルオキシダーゼ法で放射性ヨウ素標識し
た。細胞を溶解緩衝液で可溶化した後、あらかじめマイ
クロタイタープレートに固相化したTM−β１抗体又は正
常ラットIgG（シグマ社）を用い、免疫沈降を行った。
回収した免疫沈降物をSDS−PAGEで解析した。
ゼ・ラクトペルオキシダーゼ法で放射性ヨウ素標識し
た。細胞を溶解緩衝液で可溶化した後、あらかじめマイ
クロタイタープレートに固相化したTM−β１抗体又は正
常ラットIgG（シグマ社）を用い、免疫沈降を行った。
回収した免疫沈降物をSDS−PAGEで解析した。
（９）コンカナバリンＡ及びIL−２による細胞増殖に及
ぼす影響 C57BL/6マウス脾臓細胞を各種濃度のTM−β１抗体又
は正常ラットIgGの存在のもとに、５μg/mlのコンカナ
バリンＡ（Con A、シグマ社）又は1nMのIL−２で刺激し
た。細胞の3H標識チミジンの取り込みを指標として、Co
n A刺激の場合は２日後に、IL−２刺激の場合は４日後
に、DNA合成を測定した。
ぼす影響 C57BL/6マウス脾臓細胞を各種濃度のTM−β１抗体又
は正常ラットIgGの存在のもとに、５μg/mlのコンカナ
バリンＡ（Con A、シグマ社）又は1nMのIL−２で刺激し
た。細胞の3H標識チミジンの取り込みを指標として、Co
n A刺激の場合は２日後に、IL−２刺激の場合は４日後
に、DNA合成を測定した。
（10）結果 フローサイトメトリーの結果、前述のようにして得ら
れたTM−β１抗体は、マウスβ鎖を発現する細胞株、す
なわちCTLL−２、HT−２及びTART−ｍβなどと反応する
ことが示された（図１）。一方、TART−１及びマウスα
鎖のみを発現する5.1.2とは反応しなかった（図１）。
マウス脾臓細胞では、その約５％がTM−β１抗体と反応
した（図２）。二重染色の結果、TM−β１抗体との反応
性は、主にCD8陽性Ｔ細胞及びNK1.1陽性NK細胞に認めら
れた（図２）。IL−２結合をスキャッチャードプロット
解析した結果、TM−β１抗体は高親和性受容体へのIL−
２結合を阻害するが、低親和性受容体へのIL−２結合に
ついては無効であった（図３）。
れたTM−β１抗体は、マウスβ鎖を発現する細胞株、す
なわちCTLL−２、HT−２及びTART−ｍβなどと反応する
ことが示された（図１）。一方、TART−１及びマウスα
鎖のみを発現する5.1.2とは反応しなかった（図１）。
マウス脾臓細胞では、その約５％がTM−β１抗体と反応
した（図２）。二重染色の結果、TM−β１抗体との反応
性は、主にCD8陽性Ｔ細胞及びNK1.1陽性NK細胞に認めら
れた（図２）。IL−２結合をスキャッチャードプロット
解析した結果、TM−β１抗体は高親和性受容体へのIL−
２結合を阻害するが、低親和性受容体へのIL−２結合に
ついては無効であった（図３）。
また、IL−２の化学架橋実験の結果、TM−β１抗体は
IL−２とIL−２レセプターβ鎖との結合を特異的に阻害
することが確認された（図４）。また免疫沈降の結果、
TM−β１抗体は、マウスIL−２レセプターβ鎖cDNA導入
細胞TART−ｍβより、分子量約75〜85kDaの抗原を沈降
した。これに対して、正常ラットIgG（nIgG）を用いた
場合は、沈降物は認められなかった（図５）。
IL−２とIL−２レセプターβ鎖との結合を特異的に阻害
することが確認された（図４）。また免疫沈降の結果、
TM−β１抗体は、マウスIL−２レセプターβ鎖cDNA導入
細胞TART−ｍβより、分子量約75〜85kDaの抗原を沈降
した。これに対して、正常ラットIgG（nIgG）を用いた
場合は、沈降物は認められなかった（図５）。
さらに、TM−β１抗体はIL−２による脾臓細胞の増殖
を抑制するが、ConAによる細胞増殖にはほとんど影響し
ないことがわかった（図６）。
を抑制するが、ConAによる細胞増殖にはほとんど影響し
ないことがわかった（図６）。
以上の結果から、TM−β１抗体はマウスIL−２受容体
β鎖のIL−２結合部位を認識する抗体であると結論され
た。
β鎖のIL−２結合部位を認識する抗体であると結論され
た。
図１はTM−β１抗体によって蛍光染色されるマウスIL−
２レセプターβ鎖の培養細胞における発現を、フローサ
イトメトリーで測定した結果を示す。 図２（ａ）〜（ｆ）はTM−β１抗体で認識されるマウス
IL−２レセプターβ鎖のマウス脾臓細胞における発現
を、他のリンパ球マーカーと併せて、フローサイトメト
リーで測定した結果を示す。 （ａ）：抗マウスCD3、（ｂ）：抗マウスThy 1、
（ｃ）：抗マウスCD4、（ｄ）：抗NK1.1、（ｅ）：抗マ
ウスCD8、（ｆ）：抗マウスイムノグロブリン（sIg）。 図３（ａ）、（ｂ）はTART−ｍβ及びTART−１細胞に対
する125I標識IL−２の結合試験の結果を示す。 （ａ）:TART−ｍβ、（ｂ）:TART−１ 図４はTART−ｍβ及びTART−１細胞に125I標識IL−２を
反応させ、化学架橋させた後の125I標識IL−２とIL−２
レセプターの複合体をSDS−PAGEで解析した結果を示
す。 図５はTM−β１抗体が沈降させた125I標識細胞抽出物成
分のSDS−PAGE泳動の結果を示す。 図６（ａ）、（ｂ）はIL−２（1nM）及びConA（５μm/m
l）で刺激したマウス脾臓細胞の3H標識チミジン取り込
みの測定結果を示す。 （ａ）:IL−２、（ｂ）:ConA。 記号及び番号 図1:実線……TM−β１抗体による染色結果 点線……第２抗体のみの対照 図2:1〜４……細胞の分布を示す。各抗原を発現する細
胞は、領域１に最も多く存在し、２、３、４と漸次減少
する。 図3:●‥‥TM−β１抗体（40μg/ml）存在下 ○……TM−β１抗体非存在下 図4:1〜３……TART−ｍβ ４〜６……TART−１ 1,4……TM−β１抗体、非標識IL−２とも非存在下 2,5……非標識IL−２存在下 3,6……TM−β抗体存在下 図5:1,2……TART−ｍβ 3,4……TART−１ 1,3……正常ラットIgG（nIgG）による免疫沈降物 2,4……TM−β１による免疫沈降物 図6:●……TM−β１抗体存在下 ○……対照抗体存在下
２レセプターβ鎖の培養細胞における発現を、フローサ
イトメトリーで測定した結果を示す。 図２（ａ）〜（ｆ）はTM−β１抗体で認識されるマウス
IL−２レセプターβ鎖のマウス脾臓細胞における発現
を、他のリンパ球マーカーと併せて、フローサイトメト
リーで測定した結果を示す。 （ａ）：抗マウスCD3、（ｂ）：抗マウスThy 1、
（ｃ）：抗マウスCD4、（ｄ）：抗NK1.1、（ｅ）：抗マ
ウスCD8、（ｆ）：抗マウスイムノグロブリン（sIg）。 図３（ａ）、（ｂ）はTART−ｍβ及びTART−１細胞に対
する125I標識IL−２の結合試験の結果を示す。 （ａ）:TART−ｍβ、（ｂ）:TART−１ 図４はTART−ｍβ及びTART−１細胞に125I標識IL−２を
反応させ、化学架橋させた後の125I標識IL−２とIL−２
レセプターの複合体をSDS−PAGEで解析した結果を示
す。 図５はTM−β１抗体が沈降させた125I標識細胞抽出物成
分のSDS−PAGE泳動の結果を示す。 図６（ａ）、（ｂ）はIL−２（1nM）及びConA（５μm/m
l）で刺激したマウス脾臓細胞の3H標識チミジン取り込
みの測定結果を示す。 （ａ）:IL−２、（ｂ）:ConA。 記号及び番号 図1:実線……TM−β１抗体による染色結果 点線……第２抗体のみの対照 図2:1〜４……細胞の分布を示す。各抗原を発現する細
胞は、領域１に最も多く存在し、２、３、４と漸次減少
する。 図3:●‥‥TM−β１抗体（40μg/ml）存在下 ○……TM−β１抗体非存在下 図4:1〜３……TART−ｍβ ４〜６……TART−１ 1,4……TM−β１抗体、非標識IL−２とも非存在下 2,5……非標識IL−２存在下 3,6……TM−β抗体存在下 図5:1,2……TART−ｍβ 3,4……TART−１ 1,3……正常ラットIgG（nIgG）による免疫沈降物 2,4……TM−β１による免疫沈降物 図6:●……TM−β１抗体存在下 ○……対照抗体存在下
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 宮坂 昌之 東京都文京区本駒込３丁目18番22号 財 団法人東京都臨床医学総合研究所内 (72)発明者 通堂 満 京都府綴喜郡田辺町花住坂３丁目20−８ (56)参考文献 特開 平２−242695（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈ ｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ、1930年３月、 第87巻、ｐ．1806−1810 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】受託番号がFERM Ｐ−11780であるハイブ
リドーマにより産生される、マウスインターロイキン２
レセプターβ鎖を認識するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】インターロイキン２とマウスインターロイ
キン２レセプターβ鎖との結合を阻害することを特徴と
する、請求項１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】マウスインターロイキン２レセプターβ鎖
のインターロイキン２結合部位を認識することを特徴と
する、請求項１又は２記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】受託番号がFERM Ｐ−11780であるハイブ
リドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2291725A JP3040451B2 (ja) | 1990-10-31 | 1990-10-31 | モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2291725A JP3040451B2 (ja) | 1990-10-31 | 1990-10-31 | モノクローナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04169194A JPH04169194A (ja) | 1992-06-17 |
| JP3040451B2 true JP3040451B2 (ja) | 2000-05-15 |
Family
ID=17772588
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2291725A Expired - Lifetime JP3040451B2 (ja) | 1990-10-31 | 1990-10-31 | モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3040451B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2837093B2 (ja) * | 1994-04-28 | 1998-12-14 | 呉羽化学工業株式会社 | 増殖活性付与能力の測定方法 |
-
1990
- 1990-10-31 JP JP2291725A patent/JP3040451B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９３０年３月、第８７巻、ｐ．１８０６−１８１０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04169194A (ja) | 1992-06-17 |
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