JP3289056B2 - テロメラーゼ活性の検出方法 - Google Patents

テロメラーゼ活性の検出方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、テロメラーゼ活性の検出方法並びにそれに
適した試薬に関するものである。
テロメア（末端小粒）は染色体の末端にある特殊な構
造で、真核生物の場合には繰り返された一定のヌクレオ
チド配列（反復配列）が蓄積した構造、例えばヒトでは
配列TTAGGGが繰り返された構造から成っている。体細胞
では、核細胞の複製が必然的にテロメア末端の短縮化と
結び付いており、ひとたびテロメアがある長さ以下に減
少すると、テロメアは最終的にその細胞を死に至らせ
る。
対照的に、ウイルスで形質転換または不死化した細胞
はテロメアの長さの短縮化を示さない。それはこれらの
細胞中の、テロメラーゼと称される内因性リボヌクレオ
タンパク質の活性によるためであり、テロメラーゼは逆
転写酵素の反応と類似した反応でテロメア短縮化を逆行
させることができる。
これまでの知見によれば、テロメラーゼの発現は腫瘍
細胞、生殖細胞および不死化細胞に限られているので、
このタンパク質は腫瘍の診断にとって非常に有望なパラ
メーターであり、また、腫瘍を治療するための標的でも
ある（例えば、Creider,1994,Curr.Oppin.Gen.Dev.4,20
3−211;Counterら,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,29
00−2904;およびHiyamaら,1995,Nature Med.1,249−255
を参照のこと）。
これらの文献に記載されたテロメラーゼ活性の検出方
法はすべて、この酵素活性のin vitro検出に基づくもの
である。現在のところ、このタンパク質の配列は不明で
あるので、このヒト酵素を免疫学的に検出することは可
能でない。テトラヒメナ由来のテロメラーゼの配列が最
近になって解析されたにすぎない（Collinsら,1995,Cel
l 81,677−686）。
文献に記載された検出方法では、２つの原理的方法に
差異がある。第１の方法はプライマーとして利用される
テロメア配列由来の合成オリゴヌクレオチドを土台とす
るものである。このプライマーをサンプル（例えば、テ
ロメラーゼを含有する細胞抽出物）に未標識ジデオキシ
ヌクレオチドおよび放射標識デオキシヌクレオチドとと
もに添加すると、このプライマーがテロメラーゼにより
特異的に伸長されて、このプロセス中に合成産物が放射
標識される。続いて、反応混合物をゲル電気泳動で分離
し、Ｘ線フィルムに露出した後で現像すると、バンドの
パターンが可視化される（Morin,1989,Cell 59,521−52
9;Nilssonら,1993,Oncogene 9,3043−3048）。
他の検出方法では、最初にテロメラーゼ特異的伸長産
物が生産される。しかし、この産物は後続のポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR）で増幅され、同時に放射性デオキシ
ヌクレオチドの添加により標識される。この標識PCR産
物がゲル電気泳動により検出される（Kimら,1994,Scien
ce 266,2011−2015）。
WO 95/13381に記載されるテロメラーゼ活性の検出方
法では、試験すべき細胞抽出物を、テロメア反復配列を
含まないプライマーと接触させるが、その際テロメラー
ゼはテロメア反復配列の付着により該プライマーの伸長
を触媒することができる。続いて第２プライマーを添加
して増幅工程が実施される。最後に、得られた増幅産物
のゲル電気泳動分離によりテロメラーゼ活性が検出され
る。
しかしながら、現技術水準のこれら検出方法はいくつ
かの欠点を抱えている。すなわち、増幅工程を行わない
検出方法は、106〜107個の細胞を含有する量の抽出物を
使用する必要があるので、ルーチンに使用するには感度
が低すぎるのである。したがって、この方法は少量しか
入手できない原発性の腫瘍材料の検査には適していな
い。さらに、ゲルの露出時間もやはり低感度ゆえに２〜
７日間にわたる。増幅工程を含む検出方法はこの難点を
持ち合わせない。というのは、１回の試験につき約105
細胞当量（cell equivalents）をルーチンに使用するこ
とができ、103細胞当量を再現可能に検出できるからで
ある。しかし、この方法でもゲルの露出時間はまだ１日
以上である（Kimら,1994,前掲;Chadeneauら,1995,Cance
r Res.55,2533−2536）。
文献に記載された検出方法はいずれも、満足のゆく結
果を得るために、放射標識基で伸長産物またはPCR産物
を標識しなければならないという欠点がある。このこと
は、長い露出時間および望ましくない放射性廃棄物の形
成に帰結する。その上、反応混合物のゲル電気泳動分離
と、これに続くＸ線フィルムの露出・現像は非常に煩雑
な仕事である。
さらに、前記方法はどれも高サンプル処理量を可能と
せず、また、自動化に適していない。自動化は例えばル
ーチン分析やエフェクタースクリーニングにぜひとも必
要とされるのである。
かくして、本発明の課題は、現技術水準の方法の諸欠
点を少なくとも一部取り除くことであった。この課題は
以下のようなテロメラーゼ活性の検出方法により達成さ
れる。すなわち、この検出方法は、 （ａ）試験すべきサンプルを用意し、 （ｂ）テロメラーゼ基質としての第１プライマーおよび
ヌクレオシド三リン酸を添加し、この反応混合物をテロ
メラーゼによるプライマー伸長が起こる条件下でインキ
ュベートし、 （ｃ）テロメラーゼにより産生された伸長産物の増幅を
行い、 （ｄ）工程（ｃ）で得られた増幅産物を固相上に固定
し、そして （ｅ）固定した増幅産物を定性的および／または定量的
に検出する、 各工程を含むことを特徴とする。
驚いたことに、テロメラーゼ反応の特異性は増幅産物
を固定化することにより保持されること、すなわち、陽
性シグナルは再現可能にテロメラーゼ活性によるものと
みなし得ることが判明した。それゆえ、現技術水準の方
法が必要としている反応混合物のゲル電気泳動分離が不
要となる。加えて、かなりの高感度が達成される。ある
種の試験フォーマットでは、現技術水準の方法の感度と
比べて増加した感度を本発明の方法により達成すること
さえも可能である。さらに、本発明の方法では非放射標
識を使用することが可能であり、かつ好ましい。このこ
とは放射性物質を取り扱うときに遭遇するさまざまな困
難を排除する。こうした利点により、本発明の方法は自
動検出装置でのルーチン使用に非常によく適合する。
本発明による方法は、反応産物の分離を必要とせず
に、増幅したテロメラーゼ伸長産物の検出を可能とす
る。このことは、どのような増幅混合物もテロメラーゼ
伸長産物のほかにプライマーの二量体や反復配列などの
非特異的副産物を含有することを考慮すると、単純に予
測されたことではない。反復配列に対する捕獲または検
出プローブを用いる試験では、これらの非特異的産物も
検出されると予想されるにちがいない。さらに、内部ス
タンダードを加えるときは、これが常に同時検出される
と予想されるはずである。ところが、意外にも、適切な
ハイブリダイゼーション条件を選択することにより、そ
して場合により、プライマー配列に相補的な未標識オリ
ゴヌクレオチドを添加することにより、分離工程を行わ
ずに、テロメラーゼ伸長産物の高度に特異的な検出が達
成されることがわかった。
テロメラーゼ活性は標識基を用いて、特に非放射性の
標識基を用いて検出することが好ましい。非放射性標識
基として、あらゆる公知の標識基を使用することがで
き、例えば免疫反応性基（例：検出用の抗体と反応し得
るヌクレオチド類似体またはハプテン）、酵素（例：ペ
ルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼ）、蛍光もしくは発光基（例：電気化学発光
基）、またはNMR活性標識基や電子濃密基のような他の
検出基がある。
免疫反応性基、例えばヌクレオチド類似体（例:Br−d
UTPのようなハロゲン誘導体化ヌクレオチドまたはCH3−
dCTPのような１個以上のＣ原子を含む有機基で誘導体化
されたヌクレオチド）またはハプテン（例：ジゴキシゲ
ニン、ジゴキシン、フルオレセインなど）、発光基、例
えば発光金属錯体（例：ルテニウム錯体）、および蛍光
基（例：フルオレセイン）が好適である。
一方で、非放射性標識基を増幅産物に直接組み入れる
ことが可能である。これは例えば標識ヌクレオチドおよ
び／または標識プライマーを用いることで達成できる。
他方、例えば、適当な標識用プローブ、すなわち、それ
自体が１個または数個の標識基をもちかつ増幅産物と特
異的にハイブリダイズするプローブを用いることによ
り、間接的に増幅産物を標識することもできる。例えば
オリゴヌクレオチドおよび／または核酸類似体が標識用
プローブとして使用される。このプローブは固定化工程
の前および／または後に増幅産物とハイブリダイズさせ
ることができる。
本発明の方法の工程（ａ）は試験すべきサンプルを用
意することである。このサンプルは好ましくは細胞抽出
物、特にヒト細胞由来の抽出物である。しかし、細胞抽
出物は酵母やテトラヒメナのような他の真核生物に由来
するものでもよい。0.01〜５重量％の非イオンおよび／
または両性イオン界面活性剤を含有する緩衝液中で細胞
を溶解して細胞抽出物を得ることが好ましい。他方、凍
結と融解を任意に繰り返すことでサンプルを溶解しても
よい。次いで、好ましくは、細胞残留物のような不溶性
成分を遠心および／または濾過により除去し、上清を回
収する。良好な結果は102〜105細胞当量に相当する抽出
物の量を用いたときに得られる。ほんの１〜10細胞当量
を使用するときでさえ、特異的シグナルが依然として得
られる。試験すべきサンプルが組織、例えば腫瘍組織で
あるときは、10〜1000ngの組織を試験に供することが好
ましい。
本発明の方法の工程（ｂ）は、テロメラーゼ基質とし
て適した一本鎖プライマーをサンプルに添加し、得られ
る反応混合物を、テロメラーゼによるプライマー伸長が
起こる条件下でインキュベートすることを含んでなる。
プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドであるこ
とが好ましい。プライマーの長さは好ましくは10〜50ヌ
クレオチド、特に好ましくは12〜30ヌクレオチドであ
る。この方法では、一方で、テロメア反復配列を含まな
い第１プライマーを使用し得る。この種のプライマーの
好適な例は、Morinら,1991,Nature 353,454−456に記載
され、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有する
プライマーP1である。さらに、驚いたことに、レトロウ
イルスLTR配列の5'領域、例えばHIVのLTR配列の5'領域
に由来するプライマーも適していることが判明した。こ
のようなプライマーの一例は配列番号２で表される。一
本鎖プライマーとは別に、3'突出部をもつ二本鎖プライ
マーを使ってもよい。
他方、テロメア反復配列を含有する第１プライマー、
例えば配列番号３で表されるヌクレオチド配列をもつプ
ライマーP1−Teloを用いることもできる。
非放射性の標識基を用いる場合は、未標識ヌクレオシ
ド三リン酸だけが第１プライマーに結合できるように伸
長工程（ｂ）を実施することが好ましい。その理由は、
テロメラーゼの基質として使用される反応混合物中に非
放射標識ヌクレオシド三リン酸が存在すると、結果的に
あまり効率のよくないプライマー伸長となるテロメラー
ゼ活性の部分的阻害が見られるからである。それにもか
かわらず、本発明のある実施態様では、プライマー伸長
の間に非放射性の標識基を導入することも可能である。
しかしながら、後続の増幅工程（ｃ）まで伸長産物中
に非放射性の標識基を導入しないことが好ましい。これ
は例えば非放射標識CTP（テロメア反復配列の成分では
ない）を用いることにより行われる。その場合は、区画
化を行う必要がない「ワンポット反応」としてこの反応
を実施することができる。他方、非放射標識ヌクレオシ
ド三リン酸を反応の後期に反応混合物と接触させること
ができる。これは例えば区画化により達成され、その場
合は非放射標識ヌクレオシド三リン酸が除去可能なバリ
アー（例えば、より高温で溶融するワックス層）により
反応混合物から伸長工程（ｂ）の間に分離される。もち
ろん、この反応体を逐次添加することも可能である。
さらに、伸長工程（ｂ）の後にテロメラーゼにより生
産された伸長産物の更なる鋳型非依存的延長を行うこと
が好ましい場合がある。この延長は酵素反応により行う
ことが有利であり、例えばターミナルトランスフェラー
ゼを用いたポリアデニル化により、またはDNAリガーゼ
を用いた短いDNA断片のライゲーションにより、ヌクレ
オチドを結合させることができる。
本発明の方法の工程（ｃ）は、テロメラーゼにより生
産された伸長産物の増幅である。本発明の方法にとっ
て、増幅工程のタイプは決定的なものではない。一般的
には、核酸を重合し得る適当な酵素、例えば核酸ポリメ
ラーゼまたは核酸リガーゼを添加して増幅を行う。耐熱
性の酵素を使って、数サイクルの増幅を行うことが好ま
しい。
増幅には２つのプライマーを用いることが好ましく、
テロメラーゼ基質を第１プライマーとして使用し、適当
な相補プライマーを第２プライマーとして使用すること
ができる。増幅産物は酵素触媒、例えば鋳型依存性DNA
ポリメラーゼにより第１および第２プライマーにヌクレ
オチドを結合させることで形成される。第２プライマー
は配列番号４で表されるプライマーP2のようにテロメア
反復配列とハイブリダイズできることが好ましい。テロ
メア反復配列に相補的でない領域その5'末端に含む、い
わゆるアンカープライマーをこのために使用することが
有利である。アンカープライマーは次のような利点を有
する。すなわち、もとの鋳型より長い増幅産物が形成さ
れないこと、および反復配列を含むプライマーを用いる
とき反復配列を同様に含むにちがいないプライマーの二
量体が伸長されないことである。アンカープライマーと
しては、その5'末端に少なくとも４ヌクレオチド長、特
に少なくとも５ヌクレオチド長の延長部（反復配列を含
まない）をもつものを使用することが特に好ましい。こ
の配列領域の長さは好ましくは４〜20ヌクレチドであ
る。5'末端にGCに富む配列をもつアンカープライマーが
最も好ましいものである。一般的に、テロメア反復配列
に相補的な配列およびその5'側に該反復配列を含まない
延長部を有するオリゴヌクレオチドまたは核酸類似体
（好ましくは長さが10〜50ヌクレオチド）が、テロメラ
ーゼ活性の検出方法で用いるプライマーとして適してい
る。5'側に６ヌクレオチド長のアンカー配列をもつ適当
なアンカープライマーの一例は、配列番号５で表される
プライマーTE−ACTである。特に好ましいアンカープラ
イマーは、配列番号13で表されるプライマーTE−3.2で
ある。このプライマーおよび同様のプライマー（TE−3.
2に対して最大３ヌクレオチドが3'末端で欠失している
もの）を用いるとき特に良好な試験結果が得られる。
酵素としては、ポリメラーゼの失活なしに多数の増幅
サイクルを行うことができる耐熱性のDNAポリメラーゼ
を使うことが好ましい。特に好適な増幅法はポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR）法である。
伸長後に、例えばターミナルトランスフェラーゼによ
る更なる延長を行う場合は、後続の増幅工程（ｃ）のた
めに、延長により伸長産物に結合される配列部分に相補
的な第２プライマーを用いることができる。その例は配
列番号６で表されるプライマーP3である。
また、当業者に公知の他の方法で増幅を行うこともで
きる。すなわち、鋳型依存性DNAリガーゼによりこの反
応を触媒させてもよく、その場合は、DNAリガーゼを用
いてプライマーにオリゴデオキシリボヌクレオチドを結
合させることで、増幅産物が形成される。DNAリガーゼ
としては耐熱性のDNAリガーゼが好ましく、特にリガー
ゼ連鎖反応（LCR）法を用いて反応を行うことが有利で
ある。
本発明の方法の工程（ｄ）は、固相上への増幅産物の
固定化を含んでなる。固相として、例えば反応容器の壁
面を利用することができる。あるいはまた、粒状の固相
も使用できる。固相はマイクロタイタープレート、微量
反応容器、膜、マイクロチップ、バイオコアシステム、
および磁気を帯びていてもよい微小ビーズから選択する
のが好ましい。この固定化工程は多くの時間の節約につ
ながり、現技術水準の方法と比べてそれほど骨の折れる
作業ではない。さらに、この固定化工程は高いサンプル
処理量並びに、例えばルーチン分析やエフェクターのス
クリーニングのための、自動化を可能にする。
原理的に、増幅産物は公知のどのような方法（例え
ば、吸着結合）を用いて固相に固定させてもよい。しか
し、特異的相互作用（例えば、アンカー基による）によ
り固定化を行うことが好ましい。適当なアンカー基の例
は、固相に結合した抗体と反応する免疫反応性基、また
は固定した結合相手に対して高親和性結合能を有する他
の基である。アンカー基の好ましい例は、アビジンまた
はストレプトアビジンをコーティングした固相に高親和
性でもって結合できるビオチンである。高サンプル数の
場合は、例えばSavoyskyら（Nucleic Acids Res.24（19
96）,1175−1176）により記載された固定化法を採用す
ることができる。この方法では、増幅反応において固定
化基としてビオチンを含有する増幅産物が形成されるよ
うにビオチン化したテロメラーゼ伸長プライマーが使用
される。増幅中に同時に［Me−3H］TTPが導入される。
ビオチン化し、［3H］標識した増幅産物はストレプトア
ビジンをコーティングした蛍光微粒子上に固定化され
る。この固定化は［3H］から放出されたβ量子と蛍光微
粒子との相互作用に基づくシンチレーション測定により
検出される。
増幅産物へのアンカー基の導入は本発明の方法のいろ
いろな段階で行うことができる。例えば、アンカー基
（例：ビオチン基）をすでに含有する１または複数のプ
ライマーを使用できる。また、例えばターミナルトラン
スフェラーゼまたはDNAリガーゼを用いて、つまり増幅
工程（ｃ）において、一次伸長産物を延長する際にビオ
チン化ヌクレオチドを導入してもよい。
しかしながら、本発明の好ましい実施態様では、増幅
産物それ自体がアンカー基を含有する必要はまったくな
い。固相への定着（anchoring）は、例えば、１個また
は数個のアンカー基を担持しかつ反応条件下で増幅産物
と安定にハイブリダイズできる捕捉プローブを加えるこ
とで達成できる。適当な捕捉プローブの例は、テロメア
反復配列またはそれに相補的な配列および１個以上のア
ンカー基（例：ビオチン基）を含有するオリゴヌクレオ
チドである。捕捉プローブとしては、その5'末端に１個
のアンカー基を含むものが特に好適である。例えば、配
列番号７で表される5'ビオチン基を含むオリゴヌクレオ
チドP4が捕捉プローブとして用いられる。
他方、捕捉プローブとして核酸類似体、例えばペプチ
ド核酸も使用される（Nielsenら,1991,Science 254,149
7−1500およびDueholmら,1994,J.Org.Chem.59,5767−57
73）。ペプチド核酸は側基としてヌクレオ塩基を含有す
る酸アミド結合で連結されたバックボーンをもつ。本発
明方法の特定の実施態様では、捕捉プローブとして、ま
たは標識プローブとしても、ペプチド核酸を用いること
が有利である。
本発明の方法の工程（ｅ）は、増幅産物の定性的およ
び／または定量的検出を含んでなる。この検出は増幅産
物中に含まれる標識基により、または増幅産物に結合さ
れた標識プローブにより公知の方法で達成される。自動
測定装置を使って非放射性の標識基により検出すること
が好ましい。比色分析法および／または分光分析法で、
例えば基質の酵素的変換により、または化学発光もしく
は蛍光により標識基を検出する測定装置が有利である。
好ましくは、増幅したテロメラーゼ伸長産物の特異的
検出を非特異的副産物の存在下でさえも可能にする条件
下で検出を行う。そのために、かかる特異的検出を可能
にするハイブリダイゼーション条件を選択し、かつ／ま
た、プライマー配列に相補的な未標識オリゴヌクレオチ
ドもしくは核酸類似体（競合物質）を混合物に添加す
る。その結果これらの配列領域がマスクされ、捕捉また
は検出プローブが増幅産物の内部配列と特異的にハイブ
リダイズするようになる。
適切なハイブリダイゼーション条件の例は37℃および
ホルムアミド不含緩衝液またはホルムアミド含有緩衝液
（例えば、マレイン酸緩衝液中の5xSSC,10％ホルムアミ
ド,0.1％サルコシル,0.02％ SDS,1％ブロッキング試
薬）である。適当な未標識競合物質の例は配列番号14お
よび15で表されるオリゴヌクレオチドである。
試験手順のいくつかの好ましい具体例を以下に述べ
る。
バージョン1: テロメラーゼ基質として、テロメアに特異的な反復配
列を含まないプライマー、例えば配列番号１または２で
表される配列をもつプライマーを使用する。あるいはま
た、反復配列を含有するプライマー、例えばP1−Telo
（配列番号３）も使用できる。このプライマーを伸長工
程（ｂ）において未標識のヌクレオシド三リン酸dATP,d
GTPおよびdTTPとともに使用する。次に、テロメラーゼ
により生産された伸長産物を工程（ｃ）で増幅させる。
増幅反応に必要な成分は、それらが伸長反応を妨害しな
いという条件で、工程（ｂ）の反応混合物中にすでに存
在していてもよい。その他の成分は同一の反応容器内に
区画化された形で、例えば溶融可能なワックス層の下に
存在する。
工程（ｃ）の反応混合物は、工程（ｂ）ですでに存在
する成分に加えて、ヒトテロメア反復配列に相補的な配
列を含む第２プライマー（例えば、配列番号４で表され
る配列をもつプライマーP2または配列番号５で表される
配列をもつプライマーTE−ACT）、アンカー基をもつヌ
クレオシド三リン酸（例えば、ビオチン化dUTP）少なく
とも１種、非放射標識ヌクレオシド三リン酸（例えば、
Br−dUTP,Br−dCTP,CH3−dCTP,DIG−dUTPまたはDIG−dC
TP）少なくとも１種、および耐熱性DNAポリメラーゼ
（例えば、Taq−ポリメラーゼ）を含有する。
工程（ｄ）に従う増幅産物の固定化は、ストレプトア
ビジンとウシ血清アルブミンとの複合体をコーティング
してあるマイクロタイタープレート上で行う。続いて、
標識基（例えば、Br−dU,Br−dC,CH3−dCまたはDIG）に
対する抗体または抗体フラグメントと酵素（例えば、ペ
ルオキシダーゼ）からなる複合体の助けをかりて増幅産
物を検出する。
パージョン2: バージョン１とは別に、工程（ｂ）で生産されたテロ
メラーゼ伸長産物を、ターミナルトランスフェラーゼと
１種以上のヌクレオチド、例えばdATPを用いて延長す
る。この場合の増幅を行うには、オリゴ−dTプライマー
（例えば、配列番号６で表される配列をもつプライマー
P3）および標識ヌクレオチドと未標識ヌクレオチド（バ
ージョン１参照）を添加する。そして、この増幅産物を
上記のように検出する。
このバージョンは、追加の標識基（増幅産物につき約
50〜100個の標識基）を導入することが可能であるの
で、感度の増加といった利点を提供する。短いテロメア
産物にとってこれは特に重要である。さらに、この実験
手順ではテロメラーゼ触媒による全長伸長産物がもっぱ
ら増幅される。なぜならば、伸長産物内の反復配列との
ハイブリダイゼーションが該プライマーの選択により排
除されるからである。このことも標識基の密度の増加へ
とつながる。
また、バージョン１および２において、ビオチン化ヌ
クレオシド三リン酸を導入する代わりに、ビオチン化第
１および／または第２プライマーを用いることにより増
幅産物を固定させてもよい。こうしたプライマーは例え
ばその5'末端でビオチン化される。
バージョン3: バージョン１および２とは対照的に、標識基のみを含
む固相アンカー基を含まない増幅産物が生産される。し
たがって、このバージョンでは、PCR中に非放射標識ヌ
クレオチドを添加することによりDNAの単一標識化のみ
を行う。固定化を行うには、増幅産物を変性し、その後
ビオチン化捕捉プローブ、例えば配列番号７で表される
ヌクレオチド配列をもつオリゴヌクレオチドにハイブリ
ダイズさせる。
すべてのバージョンにおいて、ワックスによる区画化
を行わない逐次試験法が可能である。あらゆる試験法の
最大持続時間は約10時間で、せいぜい６〜８時間とする
ことが好ましい。本発明方法のバージョン１〜３の模式
図を図１に示してある。
バージョン4: テロメラーゼ基質、例えばプライマーP1またはビオチ
ン化プライマーP1のテロメラーゼ触媒による伸長反応を
バージョン１と同様に行う。続いて、第２プライマー、
例えばプライマーTE−ACTを添加して伸長産物を増幅す
る。この増幅は標識ヌクレオチドの存在下で行う。それ
ゆえ、工程（ｂ）の間は区画化が必要でない。増幅後、
増幅産物をバージョン３と同様に変性し、（ｉ）ビオチ
ン化プライマーを使用するときは標識プローブ、例えば
DIG基を含むオリゴヌクレオチド、または（ii）非ビオ
チン化プライマーを使用するときは標識プローブおよび
ビオチン化捕捉プローブとハイブリダイズさせる。検出
はバージョン１に記載したように行う。
さらに、本発明方法の好ましい実施態様では、所定量
の増幅スタンダード（標準物質）を加えることにより増
幅反応を標準化することができる。
このような増幅スタンダードを構築するには、例え
ば、クローニングベクターにテロメラーゼ伸長産物をク
ローニングした後で組換え法により第１プライマーに対
応する配列の3'側にテロメラーゼ伸長産物中に含まれな
い任意のDNA配列を挿入する。次に、この構築物の所定
量を増幅反応の混合物に添加し、第１および第２プライ
マーを用いてテロメラーゼ伸長産物と一緒に増幅する。
その後、増幅混合物のアリコートを第１捕捉プローブを
用いて分析し、別のアリコートを第２捕捉プローブを用
いて分析する。第１捕捉プローブはテロメラーゼ伸長産
物からの増幅産物の検出だけでなく添加したスタンダー
ドからの増幅産物の検出をも可能にし、一方、第２捕捉
プローブはスタンダードから誘導された増幅産物のみの
検出を可能にする。最後に、標準値に基づいた測定値の
標準化により、試験サンプル中のテロメラーゼ活性の定
量的計算が可能になる。
２個または数個の異なる標識基を使用する場合で、そ
れらが並行に検出され得るように選択されている場合
は、同一の反応容器中でいくつかの検出、例えばテロメ
ラーゼ伸長産物の検出とスタンダードの検出を逐次行う
ことが可能である。すなわち、２つの別個のアリコート
を検査する必要がない。
本発明方法の更なる利点は、テロメラーゼ伸長産物を
例えばゲル電気泳動後にイムノブロットで検出すると
き、テロメラーゼ伸長産物のバンドの外側に位置づけら
れるバンドをもたらすスタンダードを使用できることで
ある。これにより定量化が向上する。
あるいはまた、捕捉プローブをそれぞれに応じて選択
するのであれば、第１捕捉プローブを用いてスタンダー
ドから得られる増幅産物のみを固定化し、第２捕捉プロ
ーブを用いてテロメラーゼ伸長産物から誘導された増幅
産物のみを固定化することが可能である。
適当な増幅スタンダードの例を配列番号８および図５
に示してある。配列番号８で表される増幅スタンダード
の検出に特に適している捕捉プローブの例は、配列番号
９で表されるオリゴヌクレオチドP5である。図５に示し
たスタンダードの検出は、例えば配列番号９で表される
オリゴヌクレオチドTE−CATを用いて行うことができ
る。
本発明の更なる主題は、 （ａ）テロメラーゼ基質としてのプライマー、 （ｂ）ヌクレオシド三リン酸、 （ｃ）テロメラーゼ伸長産物の増幅用試薬、 （ｄ）標識基、 （ｅ）固相アンカー基、および （ｆ）固相、 を含んでなるテロメラーゼ活性を検出するための試薬キ
ットである。
標識基は非放射性の標識基が好ましく、適切に標識さ
れたヌクレオシド三リン酸および／または標識されたプ
ライマーの形で存在し得る。また、標識基は試験条件下
で増幅産物とハイブリダイズする１以上の標識プローブ
上に担持されていてもよい。
固相アンカー基としてはビオチンが好ましく、その固
相にはストレプトアビジンおよび／またはアビジンがコ
ーティングされる。固相はマイクロタイタープレート、
微量反応容器、膜、マイクロチップ、バイオコアシステ
ム、および場合により磁気を帯びた微小ビーズから選択
するのが好ましい。
固相アンカー基は、一方では、適切に修飾されたヌク
レオシド三リン酸の形で、すなわちプライマー上に存在
することができる。他方、固相アンカー基は増幅産物と
ハイブリダイズする捕捉プローブ上に存在してもよい。
テロメラーゼ伸長産物を増幅するための試薬は、第２
プライマーおよび核酸の増幅に適した酵素（好ましく
は、耐熱性のDNAポリメラーゼ）を含むことが好まし
い。
特に好適な実施態様において、試薬キットは標識基お
よび／または固相アンカー基をもちかつ増幅産物とハイ
ブリダイズする１または複数の標識プローブおよび／ま
たは捕捉プローブを含有する。標識プローブと捕捉プロ
ーブはオリゴヌクレオチドおよび核酸類似体、特にペプ
チド核酸から選択するのが好ましい。
所望により、この試薬キットはテロメラーゼ伸長産物
をさらに延長させるための試薬、例えばターミナルトラ
ンスフェラーゼまたはDNAリガーゼのような酵素を含ん
でいてもよい。
さらに、この試薬キットは検出反応を定量化するため
の内部スタンダードおよび該スタンダードと増幅産物を
別々に検出するための適当な試薬を含むことができる。
本発明の更なる主題は、レトロウイルスのLTR配列の
5'領域に由来するオリゴヌクレオチドの、テロメラーゼ
基質としての使用である。このオリゴヌクレオチドはHI
VのLTR配列の5'領域に由来するのが好ましい。特に好ま
しくは、このオリゴヌクレオチドは10〜50ヌクレオチド
の長さで、その3'末端に（ａ）配列番号２で表される配
列、（ｂ）（ａ）の配列と80％以上、特に90％以上相同
である配列、または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の配列
の最後の少なくとも10ヌクレオチドを含んでなる。
以下の実施例は、配列表および図面を用いて本発明を
さらに詳しく説明する。
配列番号１は、テロメラーゼ基質として適しているプ
ライマー（P1）を示す。
配列番号２は、テロメラーゼ基質として適している別
のプライマー（Ｐ−LTR）を示す。
配列番号３は、テロメラーゼ基質として適している別
のプライマー（P1−Telo）を示す。
配列番号４は、増幅プライマー（P2）を示す。
配列番号５は、増幅に適しているアンカープライマー
（TE−ACT）を示す。
配列番号６は、増幅に適しているオリゴ−dT−プライ
マー（P3）を示す。
配列番号７は、捕捉プローブ（P4）を示す。
配列番号８は、PCRによるテロメラーゼ活性の定量的
測定のための増幅スタンダードを示す。
配列番号９は、標準化したPCR混合物に用いる捕捉プ
ローブ（P5）を示す。
配列番号10は、標準化したPCR混合物に用いる別の捕
捉プローブ（TE−CAT）を示す。
配列番号11および12は、増幅スタンダードを作製する
ために用いる２つのプライマー（P1−STおよびTE−ACT
−ST）を示す。
配列番号13は、増幅に適しているアンカープライマー
（TE−3.2）を示す。
配列番号14および15は、２つの競合オリゴヌクレオチ
ドを示す。
図１は、本発明による方法の３つの好適な実施態様を
示した模式図である。
図２は、マイクロタイタープレートフォーマットでの
非放射能検出の結果を示した図である。
図３は、本発明による試験の各種変法を示した図であ
る。
図４は、抽出物の使用量に対するテロメラーゼの検出
を示した図である。
図５は、増幅スタンダードを示した図である。
図６は、細胞系および組織サンプル中のテロメラーゼ
の検出の特異性を示した図である。
図７は、細胞系および組織サンプル中のテロメラーゼ
の検出の選択性を示した図である。
実施例 1.本発明方法のバージョン１によりテロメラーゼを検出
するための反応混合物 48μｌのテロメラーゼ/PCR緩衝液（20mM Tris−HCl,p
H8.3,1.5mM MgCl2,63mM KCl,0.05％ Tween−20（w/v）,
1mM EGTA,40μM dNTP（Ｎ＝各10μＭのA,G,C,U）,300nM
のプライマーP1またはＰ−LTR（配列番号１または２）
またはP1−Telo（配列番号３）,20μg/mlのT4g32タンパ
ク質,0.1mg/mlのウシ血清アルブミン（BSA）（w/v）,2U
のTaq DNAポリメラーゼ）を、プレコートしたPCR反応容
器に入れた。その後、２μｌのサンプル（例えば、105
細胞当量からのS 100抽出物）を添加し、25℃で10〜30
分インキュベートした。
プレコートしたPCR反応容器は、その底部に次の成分
を入れて凍結乾燥させ、その上にワックス（例えば、Am
liWax,Perkin Elmer）を重層したものだった:100ngのプ
ライマーP2またはTE−ACT（配列番号４または5;50μｌ
中に223nM）,30ngのDIG−dUTP（50μｌ中に0.5μＭ）お
よび370ngのビオチン化dUTP（50μｌ中に7.5μＭ）。
続いてPCRを25サイクル（94℃で30秒;50℃で30秒;72
℃で90秒）行った。94℃に加熱したときワックス層が溶
融し、凍結乾燥した試薬類が残りの反応混合物と接触し
た。
PCR後、この混合物のアリコートを、ストレプトアビ
ジン−サーモBSAをコートしたマイクロタイタープレー
トに移し、37℃で30分インキュベートした。その後200
μｌずつの洗浄緩衝液（150mM NaCl,15mMクエン酸Na,pH
7.0）で３回洗った。
次に、抗DIGペルオキシダーゼ結合体（または他の標
識基を用いるときは他の適当なペルオキシダーゼ結合
体）を加え、37℃で60分インキュベートした。これを再
度200μｌずつの洗浄緩衝液で３回洗った。
検出のために、200μｌのTMB基質試薬（100μg/mlの
3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン,1mMクエン酸,100m
M酢酸Na,0.01％ H2O2）を加えた。マルチチャンネルフ
ォトメーターを使って450nmの波長で検出した。
2.本発明方法のバージョン２によりテロメラーゼを検出
するための反応混合物 テロメラーゼ伸長工程まではポイント１に記載したと
おりに反応を行った。その後、200mMカコジル酸カリウ
ム,5mM CoCl2中の2.5U/μｌのターミナルトランスフェ
ラーゼを加え、37℃で60分インキュベートした。
続いて、PCRをポイント１に記載したとおりに行っ
た。ただし、プライマーP2の代わりに配列番号６で表さ
れる配列をもつプライマーP3を使用した。
増幅産物はポイント１に記載したとおりに検出した。
上記方法の別法として、ビオチン化dUTPを導入する代
わりにビオチン化テロメラーゼ/PCRプライマー（P1−Bi
oまたはP1−TeloBio）を用いて増幅産物を固定化した。
3.本発明方法のバージョン３によりテロメラーゼを検出
するための反応混合物 テロメラーゼ伸長反応をポイント１に記載したとおり
に行った。プレコートしたPCR反応容器はポイント１に
記載したのと同じ成分を含んでいたが、ビオチン化ヌク
レオシド三リン酸は含んでいなかった。
PCRをポイント１に記載したとおりに行った。PCR後、
この混合物10μｌを40μｌの変性緩衝液（125mM NaOH,
0.2mM EDTA）に加え、室温で10分インキュベートした。
次に450μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（62.5m
M、リン酸Na,pH6.5,630mM NaCl,0.0625％ BSA（w/v）お
よび１μＭのビオチン化捕捉プローブ、例えばオリゴヌ
クレオチドP1−BioまたはP4）を加え、この混合物200μ
ｌを、SA−サーモBSAをコートしたマイクロタイタープ
レートに移した。その後これを37℃で60分インキュベー
トし、続いて200μｌずつの洗浄緩衝液で３回洗った。
増幅産物はポイント１に記載したとおりに検出した。
本発明方法のあらゆる変法は、ワックスによる区画化
を行わないで、逐次試験法を用いても実施された。すべ
ての試験フォーマットの全持続時間は最大６時間であっ
た。
4.本発明方法のパージョン４によりテロメラーゼを検出
するための反応混合物 テロメラーゼ伸長工程をポイント１に記載したとおり
に行った。テロメラーゼ基質として非ビオチン化および
ビオチン化プライマーを用いた。バージョン１とは対照
的に、プレコートした反応容器を使用しなかった。
その後PCRをポイント１に記載したとおりに、しかし
標識ヌクレオチドの不在下で行った。
増幅反応後、ポイント３に記載したとおりに変性を行
った。ビオチン化プライマーを用いるときはDIG標識し
た標識プローブを使用し、非ビオチン化プライマーを用
いるときはDIG標識した標識プローブとビオチン化捕捉
プローブを使用した。
増幅産物はポイント１に記載したとおりに検出した。
5.標準化した反応混合物 細菌の酵素であるクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼのコード領域からの配列領域を、プライ
マーP1−ST（配列番号11）およびTE−ACT−ST（配列番
号12）を用いて増幅した。得られた202bpの長いPCR断片
（図５）は、２つのテロメラーゼプライマーP1（配列番
号１）およびTE−ACT（配列番号５）の配列により挟ま
れたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
遺伝子由来の配列を含んでいた。
テロメラーゼ伸長工程においてこのPCR産物の一定量
（１〜20アトモル）を加えたが、適当なプライマーを用
いると、これはまさにテロメラーゼ伸長産物として増幅
された。
このスタンダードの検出および定量化を、増幅中にビ
オチン化プライマーを加えたときはDIG標識したCAT特異
的プライマーTE−CAT（配列番号10）とハイブリダイズ
させることで、また、増幅中に標識基を導入したときは
ビオチン化CAT特異的捕捉プローブとハイブリダイズさ
せることで、行った。
6.PCR−ELISA用の反応混合物 単一の、プレコートしていない反応容器でテロメラー
ゼ伸長工程と増幅を行った。
そのために、ビオチン化テロメラーゼプライマー
（例:P1,t−LTRまたはP1−Telo）、アンカープライマー
（TE−ACTまたはTE−3.2）、未標識dNTPおよび耐熱性DN
Aポリメラーゼを含有する反応混合物に、サンプル（１
×103〜３×103細胞当量に対応する１〜３μｌの細胞抽
出物、または１〜50μｇの全タンパク質）または陽性対
照（テロメラーゼ活性をもつことが知られている細胞の
抽出物）または陰性対照（RNアーゼ処理または熱処理を
施した細胞抽出物）を加えた。
この反応混合物をサーモサイクラーに入れてプライマ
ー伸長と増幅を行った。ここで、最初にプライマー伸長
を25℃で10〜30分行った。次にこれを94℃で５分加熱し
てテロメラーゼを失活させた。続いて、ポイント１に記
載したようにPCRを30サイクル行い、その後72℃で10分
加熱した。
次に、増幅混合物のアリコートを変性し、未標識競合
オリゴヌクレオチドの存在下でDIG標識した捕捉プロー
ブとハイブリダイズさせた。得られた生成物をストレプ
トアビジンをコートしたマイクロタイタープレートにビ
オチン基により固定させた。
固定した増幅産物をポイント１に記載したとおりに検
出した。あるいはまた、反応混合物をゲル電気泳動
（例：未変性ポリアクリルアミドゲル）で分離し、バン
ドを膜に移行させてそこで可視化した。
7.結果 ポイント１〜３に記載した試験フォーマットを図１に
例示してある。
図２は、マイクロタイタープレートに固定させた後の
テロメラーゼの非放射性検出を示す。50μｌの混合物
（プライマー:P1−Bio）につき１×105細胞当量（HeLa
抽出物）を使用した。A:それぞれの場合に記載したヌク
レオチド（DIG−dUTP,フルオレセイン−dUTP,Br−dUT
P）を用いてPCR工程中に標識基を導入し、ストレプトア
ビジンをコートしたマイクロタイタープレートで固定化
を行い、適当な抗体結合体を用いて検出を行った。B:反
応の特異性：テロメラーゼ活性を阻害するRNアーゼを添
加したときは、どのような増幅産物も検出されなかっ
た。
図３は、いろいろな試験フォーマットでの結果を示
す。A:バージョン１に従う二重標識実験（DIG−dUTP/Bi
o/dUTP）の結果;B:ビオチン化プライマーP1（P1−Bio）
を用いたバージョン１に従う単一標識実験（DIG−dUT
P）;C:テロメラーゼ基質としてプライマーP1を、捕捉プ
ローブとしてプライマーP1−Bioを用いたバージョン３
に従う単一標識実験（DIG−dUTP）。
図４は、抽出物の使用量に対するテロメラーゼの検出
の結果を示す。バージョン１に従う単一標識実験（DIG
−dUTP）をビオチン化プライマーP1−Bioを用いて行っ
た。A:試験の特異性:RNアーゼ処理または温度処理の後
では増幅産物をもはや検出できなかった。B:試験の感
度:1×104細胞当量から出発して、この抽出物（−／＋R
Nアーゼ処理）をlog10滴定した。次に、ストレプトアビ
ジンをコートしたマイクロタイタープレート上での検出
のためにPCR混合物の５％を用いた。図４から、１〜10
細胞当量がなおもバックグラウンド（抽出物なし）より
も明らかに高いシグナルをもたらすことが見てとれる。
図６は、細胞系および組織サンプル中のテロメラーゼ
活性の特異的検出を示す。A:本発明によるテロメラーゼ
PCR−ELISA（ポイント６）を用いて、ヒトテロメラーゼ
陽性の胚腎細胞系293およびヒトテロメラーゼ陰性の肺
繊維芽細胞系EMR90を分析した。陰性対照として、抽出
物を添加しない溶解試薬（溶解試薬）、RNアーゼで処理
した293細胞（＋RNアーゼ）または熱処理した293細胞
（＋ΔＴ）を用いた。すべての対照からの陰性の結果が
得られた。対照P1はテロメラーゼにより基質として受け
入れられない合成オリゴヌクレオチドである。これらの
試験はそれぞれの場合に１×103細胞当量に相当する抽
出物量を用いてポイント６に記載したとおりに行った。
B:生検により得られた原発生の腫瘍組織と正常組織にお
いてテロメラーゼ活性を分析した。この場合は、前立腺
癌と膀胱癌をそれぞれ正常な前立腺組織および膀胱組織
と比較した。20μｇの総タンパク質を用いてセクション
（Ａ）に記載したとおりに試験を行った。
図７は、本発明によるテロメラーゼPCR−ELISAの感度
を示す。A:テロメラーゼ陽性293細胞の抽出物を溶解試
薬で連続希釈した。表示した細胞当量をポイント６に記
載したように分析した。RNアーゼで処理した抽出物（＋
RNアーゼ）またはRNアーゼで処理しなかった抽出物（−
RNアーゼ）の結果を示す。B:溶解前に293細胞を培地で
連続希釈し、その後上記のように溶解試薬で処理した。
表示した細胞数をテロメラーゼPCR−ELISAで分析した。
試験は上記のとおりに行った。RNアーゼで処理したサン
プル（＋RNアーゼ）とRNアーゼで処理しなかったサンプ
ル（−RNアーゼ）の結果を示す。C:膀胱癌の腫瘍組織と
正常な膀胱組織から得られた抽出物の連続希釈物におい
てテロメラーゼ活性を測定した。表示した量の組織材料
を上記のように試験した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レインク，ヘルマン ドイツ連邦共和国 ディー−83673 ビ クル，ベネディクトンヴァントシュトラ ーセ 11 (72)発明者 ハインツペーター，マティアス ドイツ連邦共和国 ディー−80689 ミ ュンヘン，バウテラーシュトラーセ 19 (72)発明者 カール，ゲルリント ドイツ連邦共和国 ディー−82467 ゲ ルミシュ−パルテンカーチェン，バトカ ッセ 12 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (24)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】テロメラーゼ活性を検出する方法であっ
    て、 （ａ） 試験すべきサンプルを用意し、 （ｂ） テロメラーゼ基質としての第１プライマーおよ
    びヌクレオシド三リン酸を加え、この反応混合物をテロ
    メラーゼによるプライマー伸長が起こる条件下でインキ
    ュベートし、 （ｃ） テロメラーゼにより産生された伸長産物の増幅
    を行い、 （ｄ） 工程（ｃ）で得られた増幅産物を固相上に固定
    し、そして （ｅ） 固定した増幅産物を定性的および／または定量
    的に検出する、 各工程を含んでなる方法。
  2. 【請求項２】増幅産物を非放射性の標識基により検出す
    る、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】非放射性の標識基が免疫反応性基、発光基
    および蛍光基から選択される、請求項１または２に記載
    の方法。
  4. 【請求項４】増幅産物を標識基の取り込みにより直接的
    に標識する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】増幅産物を標識プローブとのハイブリダイ
    ゼーションにより間接的に標識する、請求項１〜３のい
    ずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】固相がマイクロタイタープレート、微量反
    応容器、膜、マイクロチップ、バイオコアシステムおよ
    び磁気を帯びていてもよい微小ビーズから選択される、
    請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】PCRまたはLCRにより増幅を行う、請求項１
    〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】テロメアの反復配列を含まない第１プライ
    マーを用いる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】レトロウイルスLTR配列の5'領域に由来す
    る第１プライマーを用いる、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】HIVのLTR配列の5'領域に由来する第１プ
    ライマーを用いる、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】テロメアの反復配列を含む第１プライマ
    ーを用いる、請求項１〜10のいずれか１項に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】増幅において、テロメア反復配列に相補
    的でない領域を5'末端に含む第２プライマーを用いる、
    請求項７〜11のいずれか１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】伸長工程（ｂ）の後に伸長産物の更なる
    鋳型非依存性延長を行う、請求項１〜12のいずれか１項
    に記載の方法。
  14. 【請求項１４】未標識のヌクレオシド三リン酸のみが第
    １プライマーに結合されるような様式で伸長工程（ｂ）
    を行う、請求項１〜13のいずれか１項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】固相への固定化をアンカー基を介して行
    い、特に増幅工程（ｃ）の間に、アンカー基を含むプラ
    イマーを用いることにより、かつ／またはアンカー基を
    含むヌクレオシド三リン酸を用いることにより、該アン
    カー基を増幅産物に導入する、請求項１〜14のいずれか
    １項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】固相への固定化をアンカー基を介して行
    い、該アンカー基は増幅産物とハイブリダイズする捕捉
    プローブ中に含まれている、請求項１〜15のいずれか１
    項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】増幅産物の定量的検出を可能とする内部
    スタンダードを増幅反応に添加する、請求項１〜16のい
    ずれか１項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記反応をワンポット反応として行う、
    請求項１〜17のいずれか１項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】増幅産物の固定化および／または検出
    を、増幅副産物を分離せずに、テロメラーゼ伸長産物の
    特異的検出を可能とする条件下で行う、請求項１〜18の
    いずれか１項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】テロメラーゼ活性を検出するための試薬
    キットであって、 （ａ） テロメラーゼ基質としてのプライマー、 （ｂ） ヌクレオシド三リン酸、 （ｃ） テロメラーゼ伸長産物の増幅用試薬、 （ｄ） 標識基、 （ｅ） 固相アンカー基、および （ｆ） 固相、 を含んでなる試薬キット。
  21. 【請求項２１】固相がマイクロタイタープレート、微量
    反応容器、膜、マイクロチップ、バイオコアシステムお
    よび磁気を帯びていてもよい微小ビーズから選択され
    る、請求項20に記載の試薬キット。
  22. 【請求項２２】レトロウイルスのLTR−２配列の5'領域
    に由来するオリゴヌクレオチドの、請求項１に記載の方
    法におけるテロメラーゼ基質としての使用。
  23. 【請求項２３】10〜50ヌクレオチドの長さを有し、その
    3'末端に（ａ）配列番号２で表される配列、または
    （ｂ）配列番号２で表される配列の最後の少なくとも10
    ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドの、請求
    項１に記載の方法におけるテロメラーゼ基質としての使
    用。
  24. 【請求項２４】テロメア反復配列に相補的な配列と、そ
    の5'側の４−20ヌクレオチドの長さの延長配列と、を含
    むオリゴヌクレオチドまたは核酸類似体の、テロメラー
    ゼ活性を検出する請求項１に記載の方法におけるプライ
    マーとしての使用。
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