KR19990071706A - 텔로머라아제 활성을 검출하는 방법 - Google Patents

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헤르만 라잉
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로셰 디아그노스틱스 게엠베하
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Abstract

본 발명은
(a) 시험하려는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 텔로머라아제 기질로서 적합한 제 1 프라이머 및 누클레오시드 트리포스페이트를 첨가하고, 반응 혼합물을 텔로머라아제에 의해 프라이머 연장이 발생될 수 있는 조건하에서 인큐베이션시키는 단계;
(c) 텔로머라아제에 의해 생성된 연장 생성물의 증폭을 수행하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 생성된 증폭 생성물을 고체상에 고정시키는 단계; 및
(e) 고정된 증폭 생성물을 검출하거나 정량적으로 측정하는 단계를 포함하여 텔로머라아제 활성을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 청구된 공정을 수행하기 위한 시약 킷에 관한 것이다.

Description

텔로머라아제 활성을 검출하는 방법
기술 분야
본 발명은 텔로머라아제 활성을 검출하는 방법 및 이에 적합한 시약에 관한 것이다.
배경 기술
텔로머라아제는 염색체 말단에서 특이적인 구조이며, 진핵성 유기체의 경우에, 이들은 사람에 있어서 예를 들어 서열: TTAGGG을 함유하는 누적된 반복 한정 누클레오티드 서열(반복)로 구성된다. 체세포에 있어서, 각각의 복제된 세포는 말단소립 말단의 단축화를 필연적으로 야기시키며, 일단 말단소립이 특정 길이 이하로 떨어지게 되면 결국에는 세포사를 유발시킨다.
이와는 대조적으로, 바이러스 형질전환된 또는 불멸화된 세포는 이들 세포의 말단소립 길이의 감소를 나타내지 않는다. 이러한 이유는 텔로머라아제로 나타내어지는 이들 세포에서의 내생 리보핵산단백질의 활성 때문이며, 이로 인해 역전사 효소와 유사한 반응에 있어 말단소립 단축화가 저지될 수 있다.
이전의 연구에 따르면, 텔로머라아제의 발현이 종양 세포, 생식세포 및 불멸화 세포에만 국한되므로, 이러한 단백질은 종양 진단용으로 매우 유망한 파라미터이며, 또한 종양 치료를 위한 목표이다[비교참고문헌: the review articles by Greider, 1994, Curr. Oppin. Gen. Dev. 4, 203-211; Counter et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2900-2904 and Hiyama et al., 1995, Nature Med. 1, 249-255].
텔로머라아제 활성을 검출하기 위한 문헌에 기술된 방법은 모두 효소 활성의 체외 검출을 기초로 하고 있다. 현재, 단백질 서열이 아직은 공지되어 있지 않기 때문에 사람의 효소를 면역학적으로 검출하는 것은 불가능하다. 단지 테트라히메나(tetrahymena)로부터 텔로머라아제 서열만이 최근에 문헌[Collins et al., 1995, Cell 81, 677-686]에 기술되었다.
문헌에 기술된 검출 방법에서, 두 가지 근본 방법 사이에서 구별된다. 첫 번째 방법은 프라이머로 사용되는 말단소립 서열로부터 유도된 합성 누클레오티드를 기본으로 하고 있다. 이러한 프라이머는 비표지 디데옥시누클레오티드 및 방사성 표지 데옥시누클레오티드와 함께 샘플, 예를 들어, 프라이머가 말단소립에 의해 특이적으로 연장되고 합성 생성물이 이러한 방식으로 방사 표지되는 말단소립을 함유하는 세포 추출물에 가해진다. 반응 혼합물은 이어서 겔 전기영동에 의해 분리되며, 밴드의 형태는 X-선 필름의 노출 후 현상에 의해 가시화된다[참고문헌: Morin, 1989, Cell 59, 521-529; Nilsson et al., 1993, Oncogene 9, 3043-3048].
텔로머라아제 특이적 신장 생성물은 그 밖의 검출 방법에서도 또한 처음에 생성된다. 그러나, 상기 생성물은 후속의 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에서 증폭되며, 동시에 방사성 데옥시누클레오티드의 첨가에 의해 표지된다. 표지된 PCR 생성물은 겔 전기영동에 의해 검출된다[참고문헌: Kim et al., 1994, Science 266, 2011-2015].
WO 95/13381호에는 시험하려는 세포 추출물이 텔로머라아제가 말단소립 반복 서열을 부착시킴으로써 프라이머의 신장을 촉진할 수 있는 말단소립 반복 서열을 함유하는 프라이머와 접촉되는 텔로머라아제 활성을 검출하기 위한 방법이 기술되어 있다. 계속적으로, 제 2 프라이머의 첨가로 증폭 단계가 수행된다. 마지막으로, 생성된 증폭 생성물의 겔 전기영동 분리에 의해 텔로머라아제 활성이 검출된다.
그러나, 당해기술분야에 속하는 이들 검출 방법은 몇 가지 장점을 갖는다. 이와 같이 증폭 단계 부재 검출 방법의 민감도는 106내지 107세포를 함유하는 추출물의 양이 사용되어야 하기 때문에 경로 적용에는 지나칠 정도로 작다. 따라서, 이러한 방법은 단지 소량으로 효력이 있는 1차 종양 물질을 조사하는데 사용될 수 없다. 또한, 겔의 노출 시간은 또한 낮은 민감도로 인하여 2일 내지 7일의 범위 내에 있다. 증폭 단계를 포함하는 검출 방법은 시험할 때마다 단지 105세포 당량이 통상적으로 사용되어야 하므로 이러한 단점을 갖지 않으며 103세포 당량이 재현성있게 검출될 수 있다. 그러나, 겔의 노출 시간은 이러한 방법으로는 또한 여전히 적어도 하루일 것이다[참고문헌: Kim et al., 1994, Supra; Chadeneau et al., 1995, Cancer Res. 55, 2533-2536].
상기 문헌에 기술된 검출 방법 둘 모두는 만족할 만한 결과를 수득하기 위해서는 신장된 생성물 또는 PCR 생성물의 표지화가 방사성 표지화 그룹으로 달성되어야 한다는 단점을 갖는다. 이로 인해 장기간의 노출 시간 및 바람직하지 않은 방사성 폐기물이 형성된다. 더욱이, 반응 혼합물의 겔 전기영동 분리 후, X-선 필름의 노출 및 현상은 매우 노동 집약적이다. 게다가, 상기 방법 중의 어떠한 방법도 높은 샘플 작업처리량을 허용하지 않는다. 이들은 예를 들어 경로 분석 또는 효과기 스크리닝에 필요한 자동화에 적합하지 않다.
발명의 상세한 설명
이와 같이, 본 발명의 목적은 당해기술분야의 방법의 단점을 적어도 부분적으로 제거하는 데에 있었다. 이와 같은 목적은
(a) 시험하려는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 텔로머라아제 기질로서 적합한 제 1 프라이머 및 누클레오시드 트리포스페이트를 첨가하고, 반응 혼합물을 텔로머라아제에 의해 프라이머 연장이 발생될 수 있는 조건하에서 인큐베이션시키는 단계;
(c) 텔로머라아제에 의해 생성된 연장 생성물의 증폭을 수행하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 생성된 증폭 생성물을 고체상에 고정시키는 단계; 및
(e) 고정된 증폭 생성물을 정량적으로 및/또는 정성적으로 검출하는 단계를 포함함을 특징으로 하여 텔로머라아제 활성을 검출하는 방법에 의해 달성된다.
놀랍게도, 증폭 생성물을 고정시킴으로써 텔로머라아제 반응의 특이도가 보유됨, 즉, 양성 신호가 텔로머라아제 활성 때문이라는 것이 밝혀졌다. 따라서, 당해기술분야에 의해 필요로 되는 반응 혼합물의 겔 전기영동 분리가 초유동적이다. 게다가, 매우 높은 민감도가 달성된다. 특정의 시험 형태에서는 종래기술의 방법과 비교되는 본 발명에 따른 방법에 의해 민감도에서의 이득을 달성하는 것이 심지어 가능하다. 또한, 비방사성 표지의 사용은 방사성 물질을 취급할 때 발생되는 곤란을 피하는 본 발명에 따른 방법에서 가능하며 바람직하다. 본 발명에 따른 방법은 이들 장점에 의해 자동화된 검출 장치에서의 통상의 적용에 매우 적합하게 된다.
본 발명에 따른 검출 방법에 의해 반응 생성물을 분리할 필요가 없으면서 증폭된 텔로머라아제 신장 생성물의 특정 검출이 가능해진다. 이것은 모든 증폭 혼합물이 텔로머라아제 신장 생성물에 추가하여 예를 들어 프라이머 이합체, 반복 서열과 같은 비특이적 부산물을 또한 함유하기 때문에 단순하게 예측될 수는 없었다. 이와 같이, 이들 비특이적 생성물은 반복 서열로 유도된 포착 또는 검출 프로브를 사용하여 시험에서 또한 검출될 것이라고 예측되어야 한다. 또한, 내부 표준 물질이 추가될 때, 이것은 항상 함께 검출될 것으로 예기되었다. 그러나, 놀랍게도 적합한 혼성의 선택 및, 임의로, 프라이머 서열에 상보적인 비표지된 올리고누클레오티드의 부가에 의해, 분리 단계 없이도 텔로머라아제 신장 생성물의 높은 특이적 검출이 달성된다.
텔로머라아제 활성은 특별한 비방사성 표지화 그룹에서 표지화 그룹을 사용함으로써 검출되는 것이 바람직하다. 공지된 모든 표지화 그룹은 비방사성 표지화 그룹, 예를 들어, 면역학적으로 방사성 그룹, 예를 들어, 검출 항체 및 페록시다아제, 갈락토시다아제 또는 알칼리성 포스파타아제와 같은 효소, 형광 또는 발광 그룹 예를 들어 전기화학발광 그룹 또는 NMR-활성 표지화 그룹 또는 전자 밀집 그룹과 같은 그 밖의 검출 그룹과 반응할 수 있는 누클레오티드 유사체 또는 합텐으로서 사용될 수 있다.
면역학적 반응성 그룹으로는 누클레오티드, 예를 들어 Br-dUTP와 같은 할로겐 유도체화된 누클레오티드 또는 CH3-dCTP와 같은 1개 이상의 C 원자를 함유하는 유기 잔기로 유도체화된 누클레오티드, 또는 합텐 예를 들어 디곡시게닌, 디곡신, 플루오레세인 등, 발광성 금속 착물 예를 들어 루테늄 착물과 같은 발광 그룹 및 플루오레세인과 같은 형광 그룹이 바람직하다.
한편으로는, 비방사성 표지화 그룹은 증폭 생성물에 직접 혼입될 수 있다. 이러한 혼입은 예를 들어 표지된 누클레오티드 및/또는 표지된 프라이머를 사용함으로써 달성될 수 있다. 다른 한편으로는, 증폭 생성물은 적합한 표지 프로브, 즉, 하나 또는 수개의 표지화 그룹을 그 자체로 함유하고 증폭 생성물과 특이적으로 혼성될 수 있는 프로브를 사용함으로써 또한 간접적으로 표지될 수 있다. 올리고누클레오티드 및/또는 핵산 유사체는 예를 들어 표지화 프로브로서 사용될 수 있다. 상기 프로브는 고정화 단계 이전 및/또는 이후에 증폭 생성물에 혼성될 수 있다.
본 발명에 따른 방법 중 단계 (a)는 시험하려는 샘플을 제공하는 단계를 포함한다. 이러한 샘플은 세포 추출물, 특히 사람 세포로부터의 추출물이 바람직하다. 그러나, 세포 추출물은 효모 또는 테트라히메나과 같은 그 밖의 진행성 유기체로부터 유도될 수 있다. 세포 추출물은 0.01 내지 5중량%의 비이온성 및/또는 쌍성 이온 세제를 함유하는 완충액중에 세포를 용해시킴으로써 바람직하게 생성된다. 다른 한편으로는, 상기 샘플은 임의로 반복된 해동/냉동에 의해 또한 용해될 수 있다. 계속해서, 세포 잔기와 같은 불용성 성분은 원심분리 및/또는 여과에 의해 바람직하게 제거되고, 상청액은 수집된다. 102내지 105세포 당량에 해당하는 질이 우수한 추출물로 양호한 결과가 수득된다. 심지어 단지 1 내지 10의 세포 당량만이 사용되는 경우에도, 특정 신호가 여전히 수득된다. 시험하려는 샘플이 조직, 예를 들어 종양 조직인 경우에는, 10 내지 1000ng 조직이 한 시험에 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법 중의 단계 (d)는 샘플에 대한 텔로머라아제 기질로서 적합한 단일 가닥의 프라이머의 첨가 및 텔로머라아제에 의한 프라이머 신장이 발생되는 조건하에서 생성된 반응 혼합물의 인큐베이션 단계를 포함한다. 상기 프라이머는 바람직하게는 올리고데옥시리보누클레오티드이다. 상기 프라이머의 길이는 바람직하게는 10 내지 20 누클레오티드이고, 보다 바람직하게는 12 내지 30 누클레오티드이다. 이러한 방법에서, 본 발명자는 한편으로는 말단소립 반복 서열이 없는 제 1 프라이머를 사용할 수 있다. 그러한 프라이머의 바람직한 예는 서열번호 1에 나타낸 누클레오티드 서열을 갖는 문헌[Morin et al., (1991), Nature 353, 454-456]에 기술된 프라이머 P1이다. 또한, 놀랍게도 레트로바이러스 LTR 서열의 5' 영역, 예를 들어, HIV의 LTR 서열의 5' 영역으로부터 유도되는 프라이머가 또한 적합하다는 것이 밝혀졌다. 그러한 프라이머의 예는 서열 번호 2에 나타내어 있다. 단일 가닥 프라이머는 별문제로 하고, 3' 돌출부를 갖는 이중 가닥 프라이머가 또한 사용될 수 있다.
다른 한편으로는, 말단소립 반복 서열을 함유하는 제 1 프라이머, 예를 들어, 서열번호 3에 나타낸 누클레오티드 서열을 갖는 프라이머 P1-텔로(Telo)를 또한 사용할 수 있다.
비방사성 표지화 그룹이 사용되는 경우에, 단지 비표지된 누클레오티드 트리포스페이트가 제 1 프라이머에 부착될 수 있도록 신장 단계(b)가 수행되는 것이 바람직하다. 이러한 이유는 비방사성 표지된 누클레오시드 트리포스페이트가 텔로머라아제에 의해 기질로서 사용될 수 있는 반응 혼합물 중에 존재하는 경우, 다소 덜 효과적으로 프라이머가 신장되게 하는 텔로머라아제 활성의 부분적인 억제가 발견되었다는 것이다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 특정 구체예에서, 프라이머 신장 동안에 비방사성 표지화 그룹을 혼입시키는 것이 또한 가능하다.
그러나, 비방사성 표지화 그룹은 연속적인 증폭 단계 (c)까지 생성물 중으로 도입되지 않는 것이 바람직하다. 이것은 예를 들어 (말단소립 반복 서열의 성분이 아닌) 비방사성적으로 표지된 CTR을 사용함으로써 달성될 수 있다. 이러한 경우에, 반응은 구획화 없이 "1-용기(pot) 반응"으로서 수행될 수 있다. 다른 한편으로는, 비방사성 표지 누클레오시드 트리포스페이트는 나중에 반응 혼합물과 접촉할 수 있다. 이것은 예를 들어 비방사성 표지된 누클레오시드 트리포스페이트가 제거 가능한 배리어, 예를 들어 고온에서 용융될 수 있는 왁스층에 의해 반응 혼합물로부터 신장 단계(b) 동안에 분리되는 구획화에 의해 달성될 수 있다. 다른 한편으로는, 반응물을 연속적으로 첨가하는 것이 또한 물론 가능하다.
또한, 연장 단계 (b) 이후에, 텔로머라아제에 의해 생성된 연장 생성물의 추가의 템플레이트 의존성 신장화를 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 신장화는 효소 반응에 의해, 예를 들어 누클레오티드를 부착시킴으로써, 예를 들어 말단 트랜스퍼라아제를 사용하는 폴리아데닐화 또는 DNA 리가아제에 의한 짧은 DNA 단편의 결찰에 의해 바람직하게 달성된다.
본 발명에 따른 방법 중 단계(c)는 텔로머라아제에 의해 생성된 연장 생성물의 증폭화를 포함한다. 증폭 단계의 유형은 본 발명에 따른 방법에는 중요하지 않다. 증폭 단계는 핵산, 예를 들어 핵산 폴리머라아제 또는 핵산 리가아제를 중합시킬 수 있는 적합한 효소를 부가함으로써 전형적으로 달성된다. 열안정성 효소를 사용하여 수개의 사이클에서 증폭시키는 것이 바람직하다.
두 개의 프라이머가 증폭용으로 바람직하게 사용되고, 이로써 텔로머라아제 기질이 제 1 프라이머로 사용될 수 있으며, 적합한 상보적 프라이머가 제 2 프라이머로 사용될 수 있다. 증폭 생성물은 예를 들어 누클레오티드를 제 1 및 제 2 프라이머에 부착시킴으로써 효소 촉매작용, 예를 들어 템플레이트 의존성 DNA 폴리머라아제에 의해 형성된다. 제 2 프라이머는 서열번호 4에 나타낸 프라이머 P2와 같은 말단소립 반복 서열과 바람직하게 혼성시킬 수 있다. 소위 앵커 프라이머는 5' 말단에서 말단소립 반복 서열에 상보적이지 않은 영역을 함유하는 이것에 대해 바람직하게 사용된다. 이러한 앵커 프라이머는 본래의 템플레이트 보다 더 긴 어떠한 증폭 생성물도 형성될 수 없으며, 프라이머 함유 반복 서열을 사용할 때 반복 서열을 또한 함유해야 하는 프라이머 이합체가 신장되지 않는다는 장점을 갖는다. 5' 말단에서 반복 서열이 없는 연장부를 함유하며 4개 이상 및 특히 5개 이상의 누클레오티드의 길이인 앵커 프라이머가 특히 바람직하게 사용된다. 이러한 서열 영역의 길이는 바람직하게는 4 내지 20 누클레오티드이다. 5' 말단에서 GC 부화 서열을 갖는 앵커 프라이머가 가장 바람직하다. 올리고누클레오티드 또는 핵산 유사체는 말단소립 반복 서열에 상보적인 서열을 갖는 바람직하게는 10 내지 50개의 누클레오티드의 길이이며, 이들의 5' 말단에서 반복 서열이 없는 연장부는 텔로머라아제 활성의 검출을 위한 방법에서 프라이머로서 일반적으로 적합하다. 5' 말단에서 6개의 누클레오티드의 길이의 앵커 서열을 갖는 적합한 앵커 프라이머의 예는 서열번호 5에 나타낸 프라이머 TE-ACT이다. 특히 바람직한 앵커 프라이머는 서열번호 13에 나타낸 프라이머 TE-3.2 이다. 3개의 누클레오티드까지는 TE-3.2와 비교하여 이들의 3' 말단에서 상실하는 이러한 프라이머 및 동족 프라이머를 사용하게 되면 특히 양호한 시험 결과가 수득된다.
효소는 폴리머라아제의 활성화 없이 많은 증폭 사이클을 수행하는데 사용될 수 있는 열안정성 DNA 폴리머라아제가 바람직하다. 특히 바람직한 증폭 방법은 폴리머라아제 연쇄 반응 방법(PCR)이다.
예를 들어 말단 트랜스퍼라아제에 의한 추가의 신장화가 연장 이후에 수행되는 경우에, 제 2 프라이머가 연장 생성물에 신장화에 의해 부착되는 서열 부분에 상보적인 연속 증폭 단계(c)용으로 사용될 수 있다. 이러한 예는 서열번호 6에 나타낸 프라이머 P3이다.
또한, 당업자에게 공지된 다른 방법에 의해서도 증폭이 달성될 수 있다. 이와 같이, 반응은 템플레이트 의존성 DNA 리가아제에 의해 또한 촉매화될 수 있으며, 이러한 경우에 증폭 생성물은 DNA 리가아제에 의해 올리고데옥시리보누클레오티드를 프라이머에 부착시킴으로써 형성될 수 있다. DNA 리가아제는 열안정성 DNA 리가아제가 바람직하며, 상기 방법은 리가아제 연쇄 반응(LCR) 기술에 의해 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법 중 단계 (d)는 고체상에 증폭 생성물을 고정시키는 것을 포함한다. 반응 용기의 벽은 예를 들어 고체상으로서 작용할 수 있다. 또한, 미립의 고체상이 또한 사용될 수 있다. 고체상은 미세 적정판, 미세반응 용기, 막, 마이크로칩, 생핵 시스템 및, 임의로, 자성 마이크로비드로부터 바람직하게 선택된다. 고정화 단계는 많은 시간을 절약하고, 당해기술분야의 방법과 비교하여 덜 어렵다. 또한, 예를 들어 통상의 분석 또는 작동체를 스크리닝하기 위한 높은 샘플 재료 처리량 및 자동화를 가능하게 한다.
원칙적으로는, 증폭 생성물은 공지된 어떠한 방법, 예를 들어 흡착성 결합에 의해 고체상에 고정될 수 있다. 그러나, 상기 고정화는 특정 상호작용, 예를 들어 앵커 그룹에 의해 바람직하게 달성된다. 적합한 앵커 그룹의 예는 고체상 결합된 항체와 반응할 수 있는 면역학적 반응성 그룹 또는 고정된 파트너에 높은 친화도로 결합될 수 있는 그 밖의 그룹이다. 앵커 그룹의 바람직한 예는 아비딘 또는 스트렙타비딘으로 피복된 고체상에 높은 친화도로 결합할 수 있는 비오틴이다. 문헌[Savoysky et al. Nucleic Acids Res. 24 (1996), 1175-1176]에 기술된 고정화 방법은, 예를 들어, 생성물이 고정화 그룹으로서 비오틴을 함유하는 증폭 반응에서 형성되도록 비오틴화된 텔로머라아제 연장 프라이머가 사용되는 높은 샘플 부재를 위해 사용될 수 있다. [Me-3H]TTP는 증폭 동안에 동시에 혼입된다. 비오틴화되고 [3H] 표지된 증폭 생성물은 스트렙타비딘 피복된 플루오로마이크로 입자에 고정된다. 이러한 고정화는 플루오로마이크로 입자와 [3H]에 의해 방출된 β-양자의 상호작용에 기초한 섬광 측정법에 의해 검출된다.
증폭 생성물로의 앵커 그룹의 도입은 본 발명에 따른 방법의 다양한 스테이지에서 달성될 수 있다. 이와 같이, 예를 들어 앵커 그룹(예, 비오틴 그룹)을 이미 함유하는 하나 또는 수개의 프라이머를 사용할 수 있다. 다른 한편으로는, 비오틴화된 누클레오티드는 예를 들어 말단 트랜스퍼라아제 또는 DNA 리가아제로 프라이머 연장 생성물을 신장시킴으로써 증폭 단계 (c)에서 또한 도입될 수 있다.
그러나, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 증폭 생성물 자체가 앵커 그룹을 함유하는 것은 전혀 필요하지 않다. 고체상에 대한 앵커링은, 예를 들어, 하나 또는 수개의 앵커 그룹을 함유하며, 반응 조건하에서 증폭 생성물로 안정하게 혼성될 수 있는 포획 프로브를 부가함으로써 또한 달성될 수 있다. 적합한 포획 프로브의 예는 이에 및 하나 또는 수 개의 앵커 그룹, 예를 들어 비오틴 그룹에 상보적인 말단소립 반복 서열(들)을 함유하는 올리고누클레오티드이다. 이들의 5' 말단에서 앵커 그룹을 함유하는 포획 프로브가 특히 바람직하다. 5' 비오틴 그룹을 함유하는 서열번호 7에 나타낸 올리고누클레오티드 P4는 예를 들어 포획 그룹으로서 사용될 수 있다.
다른 한편으로, 핵산 유사체는 포획 프로브, 예를 들어 펩티드성 핵산으로서 사용될 수 있다[참고문헌: Nielsen et al. (1991), Science 254, 1497-1500 및 Dueholm et al. (1994), J. Org. Chem. 59, 5767-5733]. 펩티드성 핵산은 측면 그룹으로서 누클레오바아제를 함유하는 핵산 아미드 결합에 의해 연결된 골격을 갖는다. 포획 프로브-표지화 그룹-(으)로서 펩티드성 핵산의 사용은 본 발명에 따른 방법의 특별한 구체예에서 바람직하다.
본 발명에 따른 방법 중의 단계 (e)는 증폭 생성물의 정성적 및/또는 정량적 검출을 포함한다. 상기 검출은 증폭 생성물에 함유된 표지화 그룹에 의해 또는 증폭 생성물에 결합된 표지화 프로브를 경유하여 잘 공지된 방식으로 달성된다. 상기 검출은 자동화된 측정 장치에서 비방사성 표지화 그룹을 사용하여 바람직하게 수행된다. 표지화 그룹이 비색법 및/또는 분광광도법, 예를 들어 기질의 효소 전환 또는 화학 발광 또는 형광에 의해 검출되는 측정 장치는 바람직하다.
상기 검출 방법은 심지어 비특이적 부산물의 존재하에서 조차 증폭된 텔로머라아제 연장 생성물의 특이적 검출을 가능하게 하는 조건하에서 수행되는 것이 바람직하다. 이에, 특정 검출 방법을 허용하는 혼성 조건이 선택될 수 있으며/거나, 프라이머 서열에 상보적인 비표지된 올리고누클레오티드 또는 핵산 유사체(경쟁자)가 이들 서열 영역이 마스킹되고 포획 또는 검출 프로브가 증폭 생성물의 내부 서열과 특이적으로 혼성될 수 있도록 상기 혼합물에 첨가된다. 적합한 혼성 조건의 예는 37℃ 및 포름아미드 부재 또는 포름아미드 함유 완충액(예를 들어, 5×SSC, 10% 포름아미드, 0.1% 사코실(sarkosyl), 0.02% SDS, 말레산 완충액중의 1% 블로킹화제)이다. 적합한 비표지화된 경쟁자의 예는 서열번호 14 및 15에 나타낸 올리고누클레오티드이다.
시험 공정 중의 일부 바람직한 구체예를 이하에 기술하였다:
시험 1:
말단소립 특이적 반복 서열이 없는 프라이머는 텔로머라아제 기질, 예를 들어 서열번호 1 또는 2에 나타낸 서열을 갖는 기질로서 사용된다. 또한, 반복 서열을 함유하는 프라이머, 예를 들어 P1-텔로(서열번호 3)가 사용될 수 있다. 이러한 프라이머는 연장 단계 (b)에서 비표지된 누클레오시드 트리포스페이트 dATP, dGTP 및 dTTP와 함께 사용된다. 그런 후, 텔로머라아제에 의해 생성된 연장 생성물은 단계 (c)에서 증폭된다. 증폭에 필요한 성분은 단계 (b)에서 반응 혼합물에 이미 존재할 수 있는데, 단 이러한 경우는 이들 성분들이 연장 반응에 간섭하지 않을 때다. 나머지 성분들은 동일한 반응 용기, 예를 들어 금속 용융가능한 왁스층하에서 구획져진 형태로 존재한다.
단계 (c)에서의 반응 혼합물은, 단계 (b)에 이미 존재하는 성분 이외에, 사람의 말단소립 반복 서열에 상보적인 서열을 함유하는 제 2 프라이머, 예를 들어 서열번호 4에 나타낸 서열을 갖는 프라이머 P2 또는 서열번호 5에 나타낸 서열을 갖는 프라이머 TE-ACT, 앵커 그룹, 예를 들어 비오틴화된 dUTP를 구비한 하나 이상의 누클레오시드 트리포스페이트, 하나 이상의 비방사성 표지된 누클레오시드 트리포스페이트, 예를 들어 Br-dUTP, Br-dCTP, CH3-dCTP, DIG-dUTP 또는 DIG-dCTP, 및 열안정성 DNA 폴리머라아제, 예를 들어 태그(Tag)-폴리머라아제를 함유한다.
단계 (d)에 따른 증폭 생성물의 고정화는 스트렙타비딘과 우혈청 알부민의 콘쥬게이트로 피복된 미세 적정판상에서 수행된다. 증폭 생성물은 항체 또는 항체 단편 유도된 표지화 그룹, 예를 들어 Br-dU, Br-dC, CH3-dC 또는 DIG 및 효소, 예를 들어 페록시다아제로 구성된 콘쥬게이트의 도움으로 연속적으로 검출된다.
시험 2:
시험 1에 추가하여, 단계 (b)에서 생성된 텔로머라아제 연장 생성물은 말단 트랜스퍼라아제 및 하나 또는 수개의 누클레오티드, 예를 들어 dAPT의 도움으로 연장된다. 이러한 경우에, 증폭은 올리고-dT 프라이머, 예를 들어 서열번호 6에 나타낸 서열을 갖는 프라이머 P3 및 표지된 및 비표지된 누클레오티드를 부가함으로써 달성된다(시험 1 참조). 증폭 생성물은 상기된 바와 같이 검출된다.
이러한 설명은 표지화 그룹(증폭 생성물 당 약 50 내지 100개의 표지화 그룹)을 추가로 도입시키는 것이 가능하므로 민감도 장점을 제공한다. 이것은 짧은 말단소립 생성물로 인해 특히 중요하다. 또한, 텔로머라아제 촉매화된 온길이 연장 생성물은 연장 생성물내에서 반복 서열과의 혼성이 프라이머의 선택에 의해 차단되므로 이러한 실험 과정에서만 증폭된다. 이것은 또한 표지화 그룹의 밀도를 증가시킨다.
또한, 증폭 생성물은 비오틴화된 누클레오시드 트리포스페이트 대신에 비오틴화된 제 1 및/또는 제 2 프라이머를 사용하여 시험 1 및 2에서 고정될 수 있다. 상기 프라이머는 예를 들어 이들의 5' 말단에서 비오틴화될 수 있다.
시험 3:
시험 1 및 2와는 대조적으로, 표지화 그룹을 함유하지만 어떠한 고체상 앵커 그룹도 함유하지 않는 증폭 생성물이 생성된다. 따라서, 본 시험에서, 비방사성 표지된 누클레오티드를 부가함으로써 DNA의 단지 단일 표지화만이 PCR 동안에 수행된다. 고정화는 비오틴화된 포획 프로브, 예를 들어 서열번호 7에 나타낸 누클레오티드 서열을 갖는 올리고누클레오티드에 연속적인 혼성으로 증폭 생성물을 변성시킴으로써 달성된다.
모든 변형에서, 왁스에 의한 구획화없이 연속적인 시험 공정이 또한 가능하다. 모든 시험 공정의 최대 지속시간은 약 10시간이며, 바람직하게는 기껏해야 6 내지 8시간이다. 본 발명에 따른 방법의 시험 1-3의 개략적인 도식은 도 1에 도시되어 있다.
시험 4:
텔로머라아제 기질, 예를 들어 프라이머 P1 또는 비오틴화된 프라이머 P1의 텔로머라아제 촉매화된 연장은 시험 1과 유사하게 수행된다. 이와 같이 수행한 후에, 제 2 프라이머, 예를 들어 프라이머 TE-ACT를 첨가하면서 연장 생성물의 증폭을 수행한다. 상기 증폭은 표지된 누클레오티드의 부재시에 수행된다. 따라서, 단계 (b) 동안에 어떠한 구획화도 필요하지 않다. 증폭 후에, 증폭 생성물은 시험 3과 유사하게 변성되며, (i) 비오틴화된 프라이머를 사용할 때, 표지화 프로브, 예를 들어 DIG 그룹을 함유하는 올리고누클레오티드 또는 (ii) 비오틴화되지 않은 프라이머를 사용할 때, 표지화 프로브 및 비오틴화된 포획 프로브와 혼성된다. 검출은 시험 1에 기술된 바와 같이 수행된다.
또한, 증폭 반응은 본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예에서 소량의 증폭 표준 물질을 첨가함으로써 표준화될 수 있다.
이와 같은 증폭 표준 물질은, 예를 들어, 텔로머라아제 연장 생성물을 클로닝 벡터내로 클로닝시킨 후 재조합 기술의 도움으로 제 1 프라이머에 상응하는 서열 중의 3' 말단상에 텔로머라아제 연장 생성물에 함유되지 않은 임의의 DNA 서열을 삽입함으로써 생성될 수 있다. 그런 후, 구조물의 이러한 구조물이 증폭 동안에 혼합물에 첨가되어 제 1 및 제 2 프라이머의 도움으로 텔로머라아제 연장 생성물과 함께 증폭된다. 그런 후, 분취량의 상기 증폭 혼합물을 제 1 포획 프로브의 도움으로 분석하고, 제 2 포획 프로브의 도움으로 추가로 분석한다. 제 1 포획 프로브는 텔로머라아제 연장 생성물 및 참가된 표준 물질로부터 생성되는 증폭 생성물이 검출되게 하며, 반면에 제 2 포획 프로브는 상기 표준 물질로부터 유도된 증폭 생성물의 검출이 가능하게 한다. 그런 후, 표준 물질을 기준으로 하여 측정된 값의 표준화는 시험 샘플에서의 텔로머라아제 활성의 정량적 진술을 허용한다.
표지화 그룹이 나란하게 검출될 수 있도록 선택되어지는 둘 또는 수 개의 상이한 표지화 그룹이 사용되는 경우에, 동일한 반응 용기에서 연속적으로 수가지 검출, 예를 들어 텔로머라아제 연장 생성물 및 표준 물질의 검출을 수행하는 것이 가능한데, 이것은, 즉, 두 개의 별도 분취액을 조사하는 것이 필요하지 않다는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 방법의 추가의 장점은 겔 전기영동 후에 예를 들어 면역블롯에 의해 텔로머라아제 연장 생성물을 검출할 때 텔로머라아제 연장 생성물의 밴드 외측에 위치한 밴드를 생성시키는 표준 물질이 사용될 수 있다는 것이다. 이것은 개선된 정량화를 가능하게 한다.
또한, 포획 프로브가 그에 따라서 선택되어진 다면, 제 1 포획 프로브를 사용하는 경우에는 표준 물질로부터 생성되는 증폭 생성물을 고정시키는 것만이 가능하며, 제 2 포획 프로브를 사용하는 경우에는 텔로머라아제 연장 생성물로부터 유도된 증폭 생성물을 고정시키는 것만 가능하다.
적합한 증폭 표준 물질의 예는 서열번호 8 및 도 5에 도시되어 있다. 서열번호 8에 나타낸 증폭 표준 물질의 검출에 특이적으로 적합한 포획 프로브의 예는 서열번호 9에 나타낸 올리고누클레오티드 P5이다. 도 5에 도시된 표준 검출법은 서열번호 9에 나타낸 올리고누클레오티드 TE-CAT를 사용하여 수행될 수 있다.
그러나, 본 발명의 추가의 대상 물질은
(a) 텔로머라아제 기질로서 적합한 프라이머,
(b) 누클레오시드 트리포스페이트,
(c) 텔로머라아제 연장 생성물의 증폭용 제제,
(d) 표지화 그룹,
(e) 고체상 앵커 그룹 및
(f) 고체상을 포함하는 텔로머라아제 활성을 검출하기 위한 시약 킷이다.
표지화 그룹은 바람직하게는 비방사성 표지화 그룹이며, 적합하게 표지된 누클레오시드 트리포스페이트 및/또는 표지된 프라이머의 형태로 존재할 수 있다. 다른 한편으로는, 표지화 그룹은 시험 조건하에서 증폭 생성물과 혼성되는 하나 또는 수 개의 표지화 프로브상에 또한 존재할 수도 있다.
고체상 앵커 그룹은 바람직하게는 비오틴이며, 고체상은 스트렙타비딘 및 또는 아비딘으로 피복될 수 있다. 고체상은 미세 적정판, 미세반응 용기, 막, 마이크로칩, 생핵 시스템 및, 임의로, 자성 마이크로비드로부터 바람직하게 선택된다.
고체상 앵커 그룹은 한편으로는 적합하게 변형된 누클레오시드 트리포스페이트의 형태로 또는 프라이머상에 존재할 수 있다. 다른 한편으로는, 고체상은 증폭 생성물과 혼성되는 포획 프로브상에 또한 존재할 수 있다.
텔로머라아제 연장 생성물의 증폭을 수행시키기 위한 제제는 제 2 프라이머를 포함하는 것이 바람직하며, 핵산을 증폭시키는데 적합한 효소는 열안정성 DNA 폴리머라아제를 포함하는 것이 바람직하다.
특히 바람직한 구체예에서, 시약 킷은 표지화 및/또는 고체상 앵커 그룹을 갖는 하나 또는 수개의 표지화 및/또는 포획 프로브를 함유하며, 증폭 생성물과 폰성된다. 표지화 및 포획 프로브는 올리고누클레오티드 및 핵산 유사체, 특히 펩티드성 핵산으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
바람직한 시약 킷은 텔로머라아제 연장 생성물, 예를 들어 말단 트랜스퍼라아제 또는 DNA 리가아제와 같은 효소의 추가 신장화를 위한 제제를 또한 포함할 수 있다.
더욱이, 시약 킷은 검출 반응의 수량화를 위한 내부 표준 물질 및 표준 물질 및 증폭 생성물의 별도의 검출을 위한 적합한 제제를 또한 함유할 수 있다.
그러나, 본 발명의 추가의 대상 물질은 텔로머라아제 기질로서 레트로바이러스의 LTR 서열의 5' 영역으로부터 올리고누클레오티드의 용도이다. 올리고누클레오티드는 HIV의 LTR 서열의 5' 영역으로부터 바람직하게 유도되며, 올리고누클레오티드는 특히 바람직하게는 10 내지 50개의 올리고누클레오티드의 길이를 가지며, 3' 말단에서 (a) 서열번호 2에 나타낸 서열, (b) 80% 이상, 특히 90% 이상의 동족체인 서열 또는 (c) (a) 또는 (b)에 따른 서열의 10개 이상의 최종 누클레오티드를 포함한다.
본 발명은 이하의 실시예, 서열 프로토콜 및 도면에 의해 추가로 설명된다.
서열번호 1은 텔로머라아제 기질로서 적합한 프라이머(P1)를 나타내는 서열표이다.
서열번호 2는 텔로머라아제 기질로서 적합한 추가의 프라이머(P-LTR)를 나타내는 서열표이다.
서열번호 3은 텔로머라아제 기질로서 적합한 추가의 프라이머(P1-텔로(Telo))를 도시하고 있고,
서열번호 4는 증폭 프라이머(P2)를 나타내는 서열표이다.
서열번호 5는 증폭용으로 적합한 앵커 프라이머(TE-ACT)를 나타내는 서열표이다.
서열번호 6은 증폭용으로 적합한 올리고-dT-프라이머(P3)를 나타내는 서열표이다.
서열번호 7은 포획 프로브(P4)를 나타내는 서열표이다.
서열번호 8은 PCR에 의해 텔로머라아제 활성의 정량적인 결정을 위한 증포 표준 물질을 나타내는 서열표이다.
서열번호 9는 표준화된 PCR 혼합물용으로 사용된 포획 프로브(P5)를 나타내는 서열표이다.
서열번호 10은 표준화된 PCR 혼합물용의 추가 포획 프로브(TE-ACT)를 나타내는 서열표이다.
서열번호 11 및 12는 증폭 표준 물질을 생성시키는데 사용된 두 개의 프라이머(P1-ST 및 TE-ACT-ST)를 나타내는 서열표이다.
서열번호 13은 증폭에 적합한 앵커 프라이머(TE-3.2)를 나타내는 서열표이다.
서열번호 14 및 15는 두 개의 경쟁자 올리고누클레오티드를 나타내는 서열표이다.
도 1은 본 발명에 따른 방법의 세 개의 바람직한 구체예를 개략적으로 도시하는 도면이다.
도 2는 미세 적정판 형태의 텔로머라아제의 비방사성 검출의 결과를 도시하는 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 다양한 시험 변형의 다이아그램을 도시하는 도면이다.
도 4는 사용된 추출물의 양과 관련하여 텔로머라아제의 검출을 도시하는 도면이다.
도 5는 증폭 표준 물질을 도시하는 도면이다.
도 6은 세포주 및 샘플 조직에서의 텔로머라아제의 검출의 특이도를 도시하는 도면이다.
도 7은 세포주 및 샘플 조직에서 텔로머라아제의 민감도를 도시하는 도면이다.
실시예
1. 본 발명에 따른 방법의 시험 1에 따른 텔로머라아제 검출용 반응 혼합물:
48㎕ 텔로머라아제/PCR 완충액(20mM Tris-HCl, pH 8.3; 1.5mM MgCl2, 63mM KCl, 0.05% 트윈(Tween)-20, 0.05% 트윈-20 (w/v); 1mM EGTA, 40μM dNTP (A, G, C, U 각각 N= 10μM), 30nM 프라이머 P1 또는 P-LTR(서열번호 1 또는 2) 또는 P1-텔로(Telo)(서열번호 3), 20㎍/ml 태그(Tag) DNA 폴리머라아제)를 사전 피복된 PCR 반응 용기내에 위치시켰다. 그런 후, 2㎕의 샘플(예를 들어, 105세포 당량으로부터의 S 100 추출물)을 첨가하고 25℃에서 10 내지 30분 동안 인큐베이션시켰다.
사전 피복된 PCR 반응 용기는 바닥에서 동결건조시킨 다음 성분을 함유하였으며, 그 위에 왁스층(예를 들어, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)사의 암리왁스(AmliWax))을 부었다: 100ng 프라이머 P2 또는 TE_ACT (서열번호 4 또는 5; 50㎕중의 223nM), 30ng DIG-dUTP (50㎕중 0.5μM) 및 370ng 비오틴화된 dUTP (50㎕중 7.5μM).
계속해서, 25 사이클로 PCR(94℃에서 30초; 50℃에서 30초, 72℃에서 90초)을 수행하였다. 94℃로 가열되었을 때, 용융된 왁스층 및 동결건조된 시약을 잔류 반응 혼합물과 접촉시켰다.
PCR 후에, 상기 혼합물의 분취액을 스트렙타비딘-써모-BSA로 피복시킨 미세 적정판으로 옮기고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 그런 후, 매번 200㎕ 세척 완충액(150mM NaCl, 15mM Na-시트레이트, pH 7.0)으로 세 번 세척하였다.
앤티-DIG 페록시다아제 콘쥬게이트(또는, 또 다른 표지화 그룹을 사용할 때 또 다른 적합한 페록시다아제 콘쥬게이트)를 첨가하고 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 그런 후, 매번 200㎕ 세척 완충액으로 재차 세 번 세척하였다.
검출을 위해, 200㎕ TMB 기질 시약(100㎍/㎖ 3,3', 5,5'-테트라메틸벤지딘, 1mM 시트르산, 100mM Na 아세테이트, 0.01% H2O2)을 첨가하였다. 450nm 파장에서 다중채널 광도계내에서 검출을 수행하였다.
2. 본 발명에 따른 방법의 시험 2에 따른 텔로머라아제 검출용 반응 혼합물:
텔로머라아제 연장 단계까지는 포인트 1하에 기술된 바와 같이 반응을 수행하였다. 그런 후, 2.5U/㎕ 말단 트랜스퍼라아제를 200mM K 카코딜레이트, 5mM CoCl2중에 첨가하고, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다.
계속해서, 포인트 1하에 기술된 바와 같이 PCR을 수행하였다. 프라이머 P2 대신에 서열번호 6에 나타낸 서열을 갖는 프라이머 P3을 사용하였다.
증폭 생성물을 포인트 1하에 기술된 바와 같이 검출하였다.
상기에서 기술된 방법에 대한 대안으로서, 증폭 생성물을 비오틴화된 dUTP를 혼입시키는 대신에 비오틴화된 텔로머라아제/PCR 프라이머(P1-바이오(Bio) 또는 P1.텔로바이오)를 사용함으로써 또한 고정시켰다.
3. 본 발명에 따른 방법의 시험 3에 따른 텔로머라아제 검출용 반응 혼합물:
포인트 1하에 기술된 바와 같이 텔로머라아제 연장을 수행하였다. 사전 피복된 PCR 반응 용기는 포인트 1하에 기술된 바와 같은 성분을 함유하였지만, 어떠한 비오틴화된 누클레오시드 트리포스페이트도 함유하지 않았다.
포인트 1하에 기술된 바와 같이 PCR을 수행하였다. PCR을 수행한 후에, 10㎕의 상기 혼합물을 40㎕의 변성 완충액(125mM NaOH, 0.2mM EDTA)에 첨가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션시켰다.
그런 후, 450㎕ 혼성 완충액(62.5 mM Na 포스페이트, pH 6.5, 630mM NaCl, 0.0625% BSA (w/v) 및 1μM 비오틴화된 포획 프로브, 예를 들어 올리고누클레오티드 P1-바이오 또는 P4)을 첨가하고, 혼합물 200㎕를 SA-써모-BSA로 피복시킨 미세 적정판으로 옮겼다. 그런 후, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시킨 후, 매번 200㎕ 세척 완충액으로 세 번 세척하였다.
증폭 생성물을 포인트 1하에 기술된 바와 같이 검출하였다.
왁스에 의한 구획화없이 연속적인 시험 공정을 사용하여 본 발명에 따른 방법의 모든 변형을 또한 수행하였다. 모든 시험 형태의 전체 지속 시간은 최대 6시간 이었다.
4. 본 발명에 따른 방법의 시험 4에 따른 텔로머라아제 검출용 반응 혼합물:
포인트 1하에 기술된 바와 같이 텔로머라아제 연장 단계를 수행하였다. 텔로머라아제 기질로서 비오틴화되지 않은 프라이머 및 비오틴화된 프라이머를 사용하였다. 시험 1과는 대조적으로 사전 피복된 반응 용기를 사용하지 않았다.
표지된 누클레오티드 부재하에 포인트 1하에 기술된 바와 같이 연속적인 PCR을 수행하였다.
증폭후에, 포인트 3하에 기술된 바와 같이 변성을 수행하였다. 비오틴화된 프라이머를 사용한 경우에는 DIG 표지된 표지화 프로브를 사용하였고, 비오틴화되지 않은 프라이머를 사용한 경우에는 DIG 표지된 표지화 프로브 및 비오틴화된 포획 프로브를 사용하였다.
증폭 생성물을 포인트 1하에 기술된 바와 같이 검출하였다.
5. 표준화된 반응 혼합물:
프라이머 P1-ST(서열번호 11) 및 TE-ACT-ST(서열번호 12)의 도움으로 세균성 효소 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제의 코딩 영역으로부터 서열 영역을 증폭시켰다. 생성된 202 Bp 기다란 PCR 단편(도 5 참조)은 두 개의 텔로머라아제 프라이머 P1(서열번호 1) 및 TE-ACT(서열번호 5)의 서열 측면에 위치한 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제 유전자로부터 서열을 함유하였다.
텔로머라아제 연장 단계에서, 적합한 프라이머를 사용한 경우에 단지 텔로머라아제 연장 생성물로서 증폭시킨 이러한 PCR 생성물의 규정량(1-20attomol)을 첨가하였다.
증폭 동안 비오틴화된 프라이머를 첨가한 경우에 DIG 표지된 CAT 특이적 프라이머 TE-CAT(서열번호 10)를 혼성시킴으로써, 또는 증폭 동안 표지화 그룹을 혼입시킨 경우 비오틴화된 CAT 특이적 포획 프로브와 혼성시킴으로써 표준 물질의 검출 및 정량을 수행하였다.
6. 반응 혼합물 PCR-일라이자(ELISA)
단일의 사전에 피복되지 않은 반응 용기중에서 텔로머라아제 연장 단계 및 증폭 단계를 수행하였다.
이에, 샘플(1×103내지 3×103세포 당량에 상응하는 1-3㎕ 세포 추출물 또는 1-50㎍의 총 단백질) 또는 양성적 대조군(공지된 텔로머라아제 활성을 갖는 세포로부터의 추출물) 또는 음성적 대조군(RNase 처리된 또는 열처리된 세포 추출물)을 비온틴화된 텔로머라아제 프라이머(예를 들어, P1, t-LTR 또는 P1-텔로), 앵커 프라이머(TE-ACT 또는 TE-3.2), 비표지된 dNTP 및 열안정성 DNA 폴리머라아제를 함유한 반응 혼합물에 첨가하였다.
반응 혼합물을 써모사이클러중에 위치시켜서 조합된 프라이머 신장/증폭을 수행하였다. 25℃에서 10-30분 동안 프라이머 신장을 여기에서 먼저 수행하였다. 그런 후, 5분 동안 가열하여 94℃가 되게 하여 텔로머라아제를 비활성화시켰다. 이어서, 포인트 1하에 기술된 바와 같이 30 사이클로 PCR을 수행한 후 10분 동안 가열하여 72℃가 되게 하였다.
그런 후, 증폭 혼합물의 분취액을 변성시키고, 비표지된 경쟁자 올리고누클레오티드의 존재하에 DIG 표지된 포획 프로브와 혼성시켰다. 생성된 생성물을 비오틴 그룹을 사용하여 스트렙타비딘 피복된 미세 적정판에 고정시켰다.
포인트 1하에 기술된 바와 같이 고정된 증폭 생성물을 검출하였다. 또한, 겔 전기영동(예를 들어, 비변성 폴리아크릴아미드 겔)에 의해 반응 혼합물을 분리하고, 밴드를 막으로 옮겨서 거기에서 가시화시켰다.
7. 결과:
포인트 1 내지 3하에 기술된 시험 형태는 도 1에 도식화되어 있다.
도 2는 미세 적정판상에서의 고정화 후에 텔로머라아제의 비방사성 검출량을 나타내고 있다. 1×105세포 당량(힐러 추출물)을 50㎕ 혼합물(프라이머: P1-바이오(Bio))에 대하여 사용하였다. A: 표지화 그룹을 각 경우에 누클레오티드(DIG-dUTP, 플루오레세인-dUTP, Br-dUTP)를 사용하여 PCR 단계 동안에 도입시키고 스트렙타비딘 피복된 미세 적정판에서 고정화를 수행하고 적합한 항체 콘쥬게이트로 검출을 수행하였다. B: 반응의 특이도: 텔로머라아제 활성을 억제하는 RNase를 첨가한 경우, 어떠한 증폭 생성물을 검출하는 것이 가능하지 않았다.
도 3은 다양한 시험 형태를 사용한 결과를 나타내고 있다. A는 시험 1에 따른 이중 표지화 실험(DIG-dUTP/바이오-dUTP)의 결과이고; B는 시험 1에 따른 비오틴화된 프라이머 P1(P1-바이오)을 사용한 단일 표지화 실험(DIG-dUTP)의 결과이고; C는 텔로머라아제 기질로서 프라이머 P1을 사용하고 시험 3에 따른 포획 프로브로서 프라이머 P1-바이오를 사용한 단일 표지화 실험(DIG-dUTP)의 결과이다.
도 4는 사용된 추출물의 양과 관련하여 텔로머라아제의 검출을 나타내고 있다. 비오틴화된 프라이머 P1-바이오를 사용하여 시험 1에 따른 단일 표지화 실험(DIG-dUTP)을 수행하였다. A는 시험의 특이도이다. RNase 또는 온도 처리후에 증폭 생성물은 더 이상 검출되지 않았다. B는 1×104세포 당량으로 출발하여 사용된 추출물(-/+ RNase 처리)을 log10적정한 시험의 민감도이다. 스트렙타비딘 피복된 미세 적정판상에서 검출하기 위해 5%의 PCR 혼합물을 연속적으로 사용하였다. 1-10 세포 당량이 바탕위에(없이) 명백한 신호를 여전히 생성시킨다는 것을 도 4를 통해 알 수 있다.
도 6은 세포주 및 조직 샘플에서의 텔로머라아제 활성의 특이적 검출을 나타내고 있다. A는 사람의 텔로머라아제 양성적 배아 신장 세포주 293 및 사람 텔로머라아제 음성적 폐 섬유아세포주 EMR90을 본 발명에 따른 텔로머라아제 PCR-일라이자(포인트 6)에 의해 분석하였다. 추출물이 없는 용해 시약(용해 시약), RNase로 처리된 293 세포 또는 열처리된 293 세포(+ΔT)를 음성적 대조군으로 사용하였다. 모든 대조군은 음성적인 결과를 주었다. 대조군 P1은 기질로서 텔로머라아제에 의해 받아들여지지 않은 합성 올리고누클레오티드이다. 각 경우마다 1×103세포 당량에 상응하는 추출물 양을 사용하여 포인트 6하에 기술된 바와 같이 시험을 수행하였다. B는 정상 조직 및 생검에 의해 수득된 일차 종양 조직에서 텔로머라아제 활성을 분석한 것이다. 이러한 경우에, 전립선 암종 및 방광 암종을 정상의 전립선 및 방광 조직과 비교하였다. 20㎍의 총단백질을 사용하여 섹션(A)에서 기술된 바와 같이 상기 시험을 수행하였다.
도 7은 본 발명에 따른 텔로머라아제 PCR-일라이자의 민감도를 나타내고 있다. A: 텔로머라아제 양성적 293 세포의 추출물을 용해 시약으로 연속적으로 희석시켰다. 기재된 세포 당량을 포인트 6하에 기술된 바와 같이 분석하였다. 결과는 RNase 처리된 추출물(+RNase) 또는 RNase로 처리하지 않은 추출물(-RNase)에 대하여 기재하였다. B: 293 세포를 용해 전에 배양 배지에서 연속적으로 희석시킨 후, 상기된 바와 같이 용해 시약으로 처리하였다. 기재된 세포의 수는 텔로머라아제 PCR-일라이자에서 분석된 것이다. 시험은 상기된 바와 같이 수행되었다. 결과는 RNase로 처리하지 않은 샘플(-RNase) 뿐만 아니라 RNase로 처리한 샘플에 대하여 기재하였다. C: 텔로머라아제 활성은 방광암 조직과 정상 조직으로부터 수득된 연속적으로 희석된 추출물에서 측정되었다. 기재된 양의 조직 물질은 상기된 바와 같이 처리되었다.
(1) 일반적 사항
(i) 출원인:
(A) 성명: 뵈링거 만하임 게엠베하
(B) 거리: 잔트호퍼 슈트라쎄 116
(C) 도시: 만하임
(E) 국가: 독일
(F) 우편 번호: 68298
(ii) 발명의 명칭: 텔로머라아제 활성을 검출하는 방법
(iii) 서열의 수: 15개
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 작업 시스템: PC-DOS / MS-DOS
(D)소프트웨어: Patentin Release #1.0, 버전 # 1.30(EPA)
(2) 서열 번호 1에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 18 염기쌍
(B) 서열의 형: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :1:
(2) 서열번호 2에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 32 염기쌍
(B) 서열의 형: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :2:
(2) 서열 번호 3에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 18 염기쌍
(B) 서열의 형: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :3:
(2) 서열 번호 4에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 24 염기쌍
(B) 서열의 형: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ii) 서열의 종류: protein
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :4:
(2) 서열 번호 5에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 24 염기쌍
(B) 서열의 형: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :5:
(2) 서열 번호 6에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 19 염기쌍
(B) 서열의 형: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :6:
(2) 서열 번호 7에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 24 염기쌍
(B) 서열의 형: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :7:
(2) 서열 번호 8에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 64 염기쌍
(B) 서열의 형: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :8:
(2) 서열 번호 9에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 22 염기쌍
(B) 서열의 형: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :9:
(2) 서열 번호 10에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 21 염기쌍
(B) 서열의 형: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :10:
(2) 서열 번호 11에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 36 염기쌍
(B) 서열의 형: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :11:
(2) 서열 번호 12에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 44 염기쌍
(B) 서열의 형: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :12:
(2) 서열 번호 13에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 30 염기쌍
(B) 서열의 형: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :13:
(2) 서열 번호 14에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 18 염기쌍
(B) 서열의 형: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 불명
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :14:
(2) 서열 번호 15에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 18 염기쌍
(B) 서열의 형: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :15:

Claims (51)

  1. (a) 시험하려는 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 텔로머라아제 기질로서 적합한 제 1 프라이머 및 누클레오시드 트리포스페이트를 첨가하고, 반응 혼합물을 텔로머라아제에 의해 프라이머 연장이 발생될 수 있는 조건하에서 인큐베이션시키는 단계;
    (c) 텔로머라아제에 의해 생성된 연장 생성물의 증폭을 수행하는 단계;
    (d) 단계 (c)에서 생성된 증폭 생성물을 고체상에 고정시키는 단계; 및
    (e) 고정화된 생성물을 정량적으로 및/또는 정성적으로 검출하는 단계를 포함하여, 텔로머라아제 활성을 검출하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 증폭 생성물이 비방사성 표지화 그룹을 통해 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 비방사성 표지화 그룹이 면역학적 반응성 그룹, 발광 그룹 및 형광 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭 생성물이 표지화 그룹의 혼입에 의해 직접 표지화됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭 생성물이 표지화 프로브와의 혼성에 의해 간접적으로 표지화됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭 생성물의 고정화가 흡착성 상호작용에 의해 고체상에서 달성됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체상에 대한 고정화가 앵커 그룹을 통해 달성됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 비오틴이 앵커 그룹으로 사용되고, 아비딘 또는 스트렙타비딘 피복된 고체상이 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체상이 미세 적정판, 미세반응 용기, 막, 마이크로칩, 생핵 시스템 및, 임의로, 자성 마이크로비드로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭이 효소의 첨가에 의해 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 열안정성 효소가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 핵산 폴리머라아제 또는 핵산 리가아제가 효소로 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10항 내지 제 12항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭용으로 두 개의 프라이머가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10항 내지 제 13항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭이 PCR 또는 LCR에 의해 달성됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 있어서, 말단소립 반복 서열이 없는 제 1 프라이머가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  16. 레트로바이러스 LTR 서열의 5' 영역으로부터 유도되는 제 1 프라이머가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, HIV의 LTR 서열의 5' 영역으로부터 유도되는 제 1 프라이머가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중의 어느 한 항에 있어서, 말단소립 반복 서열을 함유하는 제 1 프라이머가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 13항 내지 제 18항 중의 어느 한 항에 있어서, 말단소립 반복 서열에 상보적이지 않은 영역을 5' 말단에서 함유하는 제 2 프라이머가 증폭 단계에서 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 제 2 프라이머가 4개 이상의 누클레오티드의 길이를 갖는 연장부를 5' 말단에서 가짐을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 제 2 프라이머가 GC 부화 연장부를 5' 말단에서 가짐을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 있어서, 연장 생성물의 추가의 템플레이트 의존성 신장화가 연장 단계 (b) 이후에 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 연장 생성물이 효소적으로 신장됨을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 신장화가 말단 트랜스퍼라아제로 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 22항 내지 제 24항 중의 어느 한 항에 있어서, 신장화에 의해 생성된 연장 생성물에 부착된 서열 부분과 혼성될 수 있는 제 2 프라이머가 증폭 단계에서 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중의 어느 한 항에 있어서, 연장 단계 (b)가 비표지된 누클레오시드 트리포스페이트만이 제 1 프라이머에 부착될 수 있는 방식으로 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1항 내지 제 26항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체상에 대한 고정화가 앵커 그룹을 함유하는 프라이머 및/또는 앵커 그룹을 함유하는 누클레오시드 트리포스페이트를 사용함으로써 특히 증폭 단계 (c) 동안에 증폭 생성물내로 도입되는 앵커 그룹을 통해 달성됨을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1항 내지 제 27항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체상에 대한 고정화가 증폭 생성물과 혼성되는 포획 프로브내에 함유된 앵커 그룹을 통해 달성됨을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1항 내지 제 28항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭 생성물의 정량 검출을 가능하게 하는 내부 표준 물질이 증폭 단계에서 첨가됨을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1항 내지 제 29항 중의 어느 한 항에 있어서, 반응이 "1-포트(pot) 반응"으로 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 1항 내지 제 30항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭 생성물의 고정화 및/또는 검출이 증폭 부산물을 분리시키지 않으면서 텔로머라아제 연장 생성물의 특이적 검출을 가능하게 하는 조건하에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 특이적 검출이 적합한 혼성 조건을 선택함으로써 가능하게 됨을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 31항 또는 제 32항에 있어서, 특이적 검출이 프라이머 서열에 상보적인 비표지된 올리고누클레오티드 또는 핵산 유사체를 첨가함으로써 가능하게 됨을 특징으로 하는 방법.
  34. (a) 텔로머라아제 기질로서 적합한 프라이머,
    (b) 누클레오시드 트리포스페이트,
    (c) 텔로머라아제 연장 생성물의 증폭용 제제,
    (d) 표지화 그룹,
    (e) 고체상 앵커 그룹 및
    (f) 고체상을 포함하는 텔로머라아제 활성을 검출하기 위한 시약 킷.
  35. 제 34항에 있어서, 표지화 그룹이 비방사성 표지화 그룹임을 특징으로 하는 시약 킷.
  36. 제 34항 또는 제 35항에 있어서, 고체상 앵커 그룹이 비오틴이고, 고체상이 스트렙타비딘 및/또는 아비딘으로 피복됨을 특징으로 하는 시약 킷.
  37. 제 34항 내지 제 36항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체상이 미세 적정판, 미세반응 용기, 막, 마이크로칩, 생핵 시스템 및, 임의로, 자성 마이크로비드로부터 선택됨을 특징으로 하는 시약 킷.
  38. 제 34항 내지 제 37항 중의 어느 한 항에 있어서, 표지화 그룹이 누클레오시드 트리포스페이트상에 존재함을 특징으로 하는 시약 킷.
  39. 제 34항 내지 제 38항 중의 어느 한 항에 있어서, 표지화 그룹이 프라이머상에 존재함을 특징으로 하는 시약 킷.
  40. 제 34항 내지 제 39항 중의 어느 한 항에 있어서, 표지화 그룹이 증폭 생성물과 혼성되는 표지화 프로브상에 존재함을 특징으로 하는 시약 킷.
  41. 제 34항 내지 제 40항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체상 앵커 그룹이 누클레오시드 트리포스페이트상에 존재함을 특징으로 하는 시약 킷.
  42. 제 34항 내지 제 41항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체상 앵커 그룹이 프라이머상에 존재함을 특징으로 하는 시약 킷.
  43. 제 34항 내지 제 42항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체상 앵커 그룹이 증폭 생성물과 혼성되는 포획 프로브상에 존재함을 특징으로 하는 시약 킷.
  44. 제 40항 또는 제 43항에 있어서, 표지화 또는 포획 프로브가 올리고누클레오티드 및 핵산 유사체로부터 선택됨을 특징으로 하는 시약 킷.
  45. 제 44항에 있어서, 표지화 또는 포획 프로브가 펩티드성 핵산임을 특징으로 하는 시약 킷.
  46. 제 34항 내지 제 45항 중의 어느 한 항에 있어서, 텔로머라아제 연장 생성물의 추가 신장화용 제제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 시약 킷.
  47. 제 34항 내지 제 46항 중의 어느 한 항에 있어서, 검출 반응을 정량화하기 위한 내부 표준 물질을 추가로 포함함을 특징으로 하는 시약 킷.
  48. 레트로바이러스의 LTR-2 서열의 5' 영역으로부터의 올리고누클레오티드를 텔로머라아제 기질로서 사용하는 방법.
  49. 제 47항에 있어서, 올리고누클레오티드가 HIV의 LTR 서열의 5' 영역으로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  50. 3' 말단에서 (a) 서열번호 2에 나타낸 서열, (b) 80% 이상이 서열 (a)와 상동인 서열 또는 (c) (a) 또는 (b)에 따른 서열의 최종 10개 이상의 누클레오티드를 포함하는 10 내지 50개의 누클레오티드의 길이를 갖는 올리고누클레오티드.
  51. 텔로머라아제 활성을 검출하기 위한 방법에서 프라이머로서, 4개 이상, 특히 4 내지 10개의 누클레오티드의 길이를 갖는 말단소립 반복 서열에 상보적인 서열 및 연장 서열을 5' 말단에서 함유하는, 올리고누클레오티드 또는 핵산 유사체를 사용하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9717458D0 (en) * 1997-08-18 1997-10-22 Queen Mary & Westfield College Telomerase assay
DE19804372A1 (de) * 1998-02-04 1999-08-05 Michael W Dr Dr Dahm Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit und dazu geeignete Testkits
US6979728B2 (en) * 1998-05-04 2005-12-27 Baylor College Of Medicine Articles of manufacture and methods for array based analysis of biological molecules
CN1087033C (zh) * 1998-12-29 2002-07-03 南通医学院附属医院 测定端粒酶活性的端粒重复扩增－微孔板杂交法
US20050032060A1 (en) * 2001-08-31 2005-02-10 Shishir Shah Arrays comprising pre-labeled biological molecules and methods for making and using these arrays
EP1472340A4 (en) * 2002-02-05 2006-11-08 Rappaport Family Inst For Res STRAIN CELLS SELECTED FOR TELOMERASEPROMOTORACTIVITY, CELL-LINKED
US6916621B2 (en) * 2002-03-27 2005-07-12 Spectral Genomics, Inc. Methods for array-based comparitive binding assays
CN1732271B (zh) * 2002-11-12 2010-05-05 美国联合生物公司 检测端粒酶活性的方法和组合物
DE102004021822B3 (de) * 2004-04-30 2005-11-17 Siemens Ag Verfahren und Anordnung zur DNA-Amplifikation mittels PCR unter Einsatz von Trockenreagenzien
CN101929997B (zh) * 2008-12-26 2014-03-19 上海透景生命科技有限公司 一种提高免疫检测灵敏度的方法
CN101705277B (zh) * 2009-11-13 2012-05-23 南开大学 一类用于端粒酶活性检测的引物
WO2011106671A1 (en) 2010-02-26 2011-09-01 Geron Corporation Assay for telomerase activity
CN102260739B (zh) * 2011-06-30 2013-11-13 中国科学院长春应用化学研究所 一种端粒酶活性的检测方法
CN102851387B (zh) * 2012-09-27 2014-01-22 浙江今复康生物科技有限公司 一种hTERTmRNA的TRPCR检测试剂盒及检测方法
CN103529023B (zh) * 2013-10-11 2015-07-29 东南大学 一种端粒酶活性检测方法
KR102381695B1 (ko) 2014-06-18 2022-04-01 루미넥스 코포레이션 자기 혼합 장치 및 방법
CN104263725B (zh) * 2014-09-19 2017-03-22 上海市计量测试技术研究院 塔尖四面体dna纳米结构探针及端粒酶电化学检测
CN105154563B (zh) * 2015-09-30 2018-10-23 陕西师范大学 一种基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法
CN109266726A (zh) * 2018-09-28 2019-01-25 江苏凯强医学检验有限公司 一种在液体活检中检测端粒酶活性的方法
CN114774512B (zh) * 2022-04-15 2023-02-03 杭州圣域生物医药科技有限公司 一种地高辛标记以DNA聚合酶θ为靶点的早期药物筛选方法
ES2947987A1 (es) * 2023-03-29 2023-08-25 Univ Madrid Complutense Metodo y kit para la valoracion cuantitativa de la actividad de telomerasa

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991004753A1 (en) * 1989-10-02 1991-04-18 Cetus Corporation Conjugates of antisense oligonucleotides and therapeutic uses thereof
US5231015A (en) * 1989-10-18 1993-07-27 Eastman Kodak Company Methods of extracting nucleic acids and pcr amplification without using a proteolytic enzyme
DE4001154A1 (de) 1990-01-17 1991-07-18 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung von modifizierten nukleinsaeuren
US5654151A (en) * 1990-06-11 1997-08-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity HIV Nucleocapsid nucleic acid ligands
GB9123947D0 (en) * 1991-11-12 1992-01-02 Imp Cancer Res Tech Therapeutic compounds
WO1993011261A1 (en) * 1991-11-25 1993-06-10 Keygene N.V. A novel pcr method with a single primer for nucleic acid analysis
US5629154A (en) * 1993-11-12 1997-05-13 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5837453A (en) * 1992-05-13 1998-11-17 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5863726A (en) * 1993-11-12 1999-01-26 Geron Corporation Telomerase activity assays
DK145493D0 (da) * 1993-12-23 1993-12-23 Dako As Antistof

Also Published As

Publication number Publication date
WO1997020069A1 (de) 1997-06-05
ATE200108T1 (de) 2001-04-15
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CA2237823A1 (en) 1997-06-05
CN1202935A (zh) 1998-12-23
DE59606675D1 (de) 2001-05-03
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AU2623197A (en) 1997-06-19
IL124409A0 (en) 1998-12-06
EP0863999A1 (de) 1998-09-16
EP0863999B1 (de) 2001-03-28
AU710326B2 (en) 1999-09-16
JP3289056B2 (ja) 2002-06-04
MX9802306A (es) 1998-08-30
NO980699L (no) 1998-02-19
US6221584B1 (en) 2001-04-24
DE19644302A1 (de) 1997-06-05

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