JPH11500015A

JPH11500015A - テロメラーゼ活性の検出方法

Info

Publication number: JPH11500015A
Application number: JP9520172A
Authority: JP
Inventors: エンリッヒ，トマス; レインク，ヘルマン; ハインツペーター，マティアス; カール，ゲルリント
Original assignee: ベーリンガーマンハイムゲーエムベーハー
Priority date: 1995-11-28
Filing date: 1996-11-27
Publication date: 1999-01-06
Anticipated expiration: 2016-11-27
Also published as: NO980699D0; KR19990071706A; AU710326B2; CN1202935A; NZ322938A; WO1997020069A1; US6221584B1; MX9802306A; DE59606675D1; JP3289056B2; DE19644302A1; EP0863999B1; EP0863999A1; ATE200108T1; IL124409A0; AU2623197A; CA2237823A1; NO980699L

Abstract

(57)【要約】本発明は、(a)試験すべきサンプルを用意し、(b)テロメラーゼ基質としての第１プライマーおよびヌクレオシド三リン酸を加え、この反応混合物をテロメラーゼによるプライマー伸長が起こる条件下でインキュベートし、(c)テロメラーゼにより産生された伸長産物の増幅を行い、(d)工程(c)で得られた増幅産物を固相上に固定し、そして(e)固定した増幅産物を定性的および／または定量的に検出する、各工程を含んでなるテロメラーゼ活性の検出方法に関する。さらに、本発明はこの方法を実施するための試薬キットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】テロメラーゼ活性の検出方法本発明は、テロメラーゼ活性の検出方法並びにそれに適した試薬に関するものである。テロメア（末端小粒）は染色体の末端にある特殊な構造で、真核生物の場合には繰り返された一定のヌクレオチド配列（反復配列）が蓄積した構造、例えばヒトでは配列 TTAGGG が繰り返された構造から成っている。体細胞では、各細胞の複製が必然的にテロメア末端の短縮化と結び付いており、ひとたびテロメアがある長さ以下に減少すると、テロメアは最終的にその細胞を死に至らせる。対照的に、ウイルスで形質転換または不死化した細胞はテロメアの長さの短縮化を示さない。それはこれらの細胞中の、テロメラーゼと称される内因性リボヌクレオタンパク質の活性によるためであり、テロメラーゼは逆転写酵素の反応と類似した反応でテロメア短縮化を逆行させることができる。これまでの知見によれば、テロメラーゼの発現は腫瘍細胞、生殖細胞および不死化細胞に限られているので、このタンパク質は腫瘍の診断にとって非常に有望なパラメーターであり、また、腫瘍を治療するための標的でもある（例えば、Gr eider，1994，Curr．Oppin．Gen．Dev．4，203-211; Counterら，1994，Proc．N atl．Acad．Sci．USA 91，2900-2904; および Hiyamaら，1995，Nature Med．1 ，249-255を参照のこと）。これらの文献に記載されたテロメラーゼ活性の検出方法はすべて、この酵素活性のin vitro検出に基づくものである。現在のところ、このタンパク質の配列は不明であるので、このヒト酵素を免疫学的に検出することは可能でない。テトラヒメナ由来のテロメラーゼの配列が最近になって解析されたにすぎない(Collins ら，1995，Cell 81，677-686)。文献に記載された検出方法では、２つの原理的方法に差異がある。第１の方法はプライマーとして利用されるテロメア配列由来の合成オリゴヌクレオチドを土台とするものである。このプライマーをサンプル（例えば、テロメラーゼを含有する細胞抽出物）に未標識ジデオキシヌクレオチドおよび放射標識デオキシヌクレオチドとともに添加すると、このプライマーがテロメラーゼにより特異的に伸長されて、このプロセス中に合成産物が放射標識される。続いて、反応混合物をゲル電気泳動で分離し、Ｘ線フィルムに露出した後で現像すると、バンドのパターンが可視化される(Morin，1989，Cell 59，521-529; Nilssonら，1993，Oncog ene 9，3043-3048)。他の検出方法では、最初にテロメラーゼ特異的伸長産物が生産される。しかし、この産物は後続のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅され、同時に放射性デオキシヌクレオチドの添加により標識される。この標識ＰＣＲ産物がゲル電気泳動により検出される(Kimら，1994，Science 266，2011-2015)。ＷＯ 95/13381 に記載されるテロメラーゼ活性の検出方法では、試験すべき細胞抽出物を、テロメア反復配列を含まないプライマーと接触させるが、その際テロメラーゼはテロメア反復配列の付着により該プライマーの伸長を触媒することができる。続いて第２プライマーを添加して増幅工程が実施される。最後に、得られた増幅産物のゲル電気泳動分離によりテロメラーゼ活性が検出される。しかしながら、現技術水準のこれら検出方法はいくつかの欠点を抱えている。すなわち、増幅工程を行わない検出方法は、10⁶〜10⁷個の細胞を含有する量の抽出物を使用する必要があるので、ルーチンに使用するには感度が低すぎるのである。したがって、この方法は少量しか入手できない原発性の腫瘍材料の検査には適していない。さらに、ゲルの露出時間もやはり低感度ゆえに２〜７日間にわたる。増幅工程を含む検出方法はこの難点を持ち合わせない。というのは、１回の試験につき約10⁵細胞当量（cell equivalents）をルーチンに使用することができ、10³細胞当量を再現可能に検出できるからである。しかし、この方法でもゲルの露出時間はまだ１日以上である(Kimら，1994，前掲; Chadeneauら，1995，C ancer Res．55，2533-2536)。文献に記載された検出方法はいずれも、満足のゆく結果を得るために、放射標識基で伸長産物またはＰＣＲ産物を標識しなければならないという欠点がある。このことは、長い露出時間および望ましくない放射性廃棄物の形成に帰結する。その上、反応混合物のゲル電気泳動分離と、これに続くＸ線フィルムの露出・現像は非常に煩雑な仕事である。さらに、前記方法はどれも高サンプル処理量を可能とせず、また、自動化に適していない。自動化は例えばルーチン分析やエフェクタースクリーニングにぜひとも必要とされるのである。かくして、本発明の課題は、現技術水準の方法の諸欠点を少なくとも一部取り除くことであった。この課題は以下のようなテロメラーゼ活性の検出方法により達成される。すなわち、この検出方法は、 (a)試験すべきサンプルを用意し、 (b)テロメラーゼ基質としての第１プライマーおよびヌクレオシド三リン酸を添加し、この反応混合物をテロメラーゼによるプライマー伸長が起こる条件下でインキュベートし、 (c)テロメラーゼにより生産された伸長産物の増幅を行い、 (d)工程(c)で得られた増幅産物を固相上に固定化し、そして (e)固定化した増幅産物を定性的および／または定量的に検出する、各工程を含むことを特徴とする。驚いたことに、テロメラーゼ反応の特異性は増幅産物を固定化することにより保持されること、すなわち、陽性シグナルは再現可能にテロメラーゼ活性によるものとみなし得ることが判明した。それゆえ、現技術水準の方法が必要としている反応混合物のゲル電気泳動分離が不要となる。加えて、かなりの高感度が達成される。ある種の試験フォーマットでは、現技術水準の方法の感度と比べて増加した感度を本発明の方法により達成することさえも可能である。さらに、本発明の方法では非放射標識を使用することが可能であり、かつ好ましい。このことは放射性物質を取り扱うときに遭遇するさまざまな困難を排除する。こうした利点により、本発明の方法は自動検出装置でのルーチン使用に非常によく適合する。本発明による方法は、反応産物の分離を必要とせずに、増幅したテロメラーゼ伸長産物の検出を可能とする。このことは、どのような増幅混合物もテロメラーゼ伸長産物のほかにプライマーの二量体や反復配列などの非特異的副産物を含有することを考慮すると、単純に予測されたことではない。反復配列に対する捕獲または検出プローブを用いる試験では、これらの非特異的産物も検出されると予想されるにちがいない。さらに、内部スタンダードを加えるときは、これが常に同時検出されると予測されるはずである。ところが、意外にも、適切なハイブリダイゼーション条件を選択することにより、そして場合により、プライマー配列に相補的な未標識オリゴヌクレオチドを添加することにより、分離工程を行わずに、テロメラーゼ伸長産物の高度に特異的な検出が達成されることがわかった。テロメラーゼ活性は標識基を用いて、特に非放射性の標識基を用いて検出することが好ましい。非放射性標識基として、あらゆる公知の標識基を使用することができ、例えば免疫反応性基（例：検出用の抗体と反応し得るヌクレオチド類似体またはハプテン）、酵素（例：ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、蛍光もしくは発光基（例：電気化学発光基）、またはＮＭＲ活性標識基や電子濃密基のような他の検出基がある。免疫反応性基、例えばヌクレオチド類似体（例：Br-dUTP のようなハロゲン誘導体化ヌクレオチドまたはCH₃-dCTPのような１個以上のＣ原子を含む有機基で誘導体化されたヌクレオチド）またはハプテン（例：ジゴキシゲニン、ジゴキシン、フルオレセインなど）、発光基、例えば発光金属錯体（例：ルテニウム錯体）、および蛍光基（例：フルオレセイン）が好適である。一方で、非放射性標識基を増幅産物に直接組み入れることが可能である。これは例えば標識ヌクレオチドおよび／または標識プライマーを用いることで達成できる。他方、例えば、適当な標識用プローブ、すなわち、それ自体が１個または数個の標識基をもちかつ増幅産物と特異的にハイブリダイズするプローブを用いることにより、間接的に増幅産物を標識することもできる。例えばオリゴヌクレオチドおよび／または核酸類似体が標識用プローブとして使用される。このプローブは固定化工程の前および／または後に増幅産物とハイブリダイズさせることができる。本発明の方法の工程(a)は試験すべきサンプルを用意することである。このサンプルは好ましくは細胞抽出物、特にヒト細胞由来の抽出物である。しかし、細胞抽出物は酵母やテトラヒメナのような他の真核生物に由来するものでもよい。 0.01〜５重量％の非イオンおよび／または両性イオン界面活性剤を含有する緩衝液中で細胞を溶解して細胞抽出物を得ることが好ましい。他方、凍結と融解を任意に繰り返すことでサンプルを溶解してもよい。次いで、好ましくは、細胞残留物のような不溶性成分を遠心および／または濾過により除去し、上清を回収する。良好な結果は10²〜10⁵細胞当量に相当する抽出物の量を用いたときに得られる。ほんの１〜10細胞当量を使用するときでさえ、特異的シグナルが依然として得られる。試験すべきサンプルが組織、例えば腫瘍組織であるときは、10〜1000 n gの組織を試験に供することが好ましい。本発明の方法の工程(b)は、テロメラーゼ基質として適した一本鎖プライマーをサンプルに添加し、得られる反応混合物を、テロメラーゼによるプライマー伸長が起こる条件下でインキュベートすることを含んでなる。プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーの長さは好ましくは10〜50ヌクレオチド、特に好ましくは12〜30ヌクレオチドである。この方法では、一方で、テロメア反復配列を含まない第１プライマーを使用し得る。この種のプライマーの好適な例は、Morinら，1991，Nature 353，454-456 に記載され、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するプライマーP1である。さらに、驚いたことに、レトロウイルスＬＴＲ配列の5'領域、例えばＨＩＶのＬＴＲ配列の5'領域に由来するプライマーも適していることが判明した。このようなプライマーの一例は配列番号２で表される。一本鎖プライマーとは別に、3'突出部をもつ二本鎖プライマーを使ってもよい。他方、テロメア反復配列を含有する第１プライマー、例えば配列番号３で表されるヌクレオチド配列をもつプライマーP1-Teloを用いることもできる。非放射性の標識基を用いる場合は、未標識ヌクレオシド三リン酸だけが第１プライマーに結合できるように伸長工程(b)を実施することが好ましい。その理由は、テロメラーゼの基質として使用される反応混合物中に非放射標識ヌクレオシド三リン酸が存在すると、結果的にあまり効率のよくないプライマー伸長となるテロメラーゼ活性の部分的阻害が見られるからである。それにもかかわらず、本発明のある実施態様では、プライマー伸長の間に非放射性の標識基を導入することも可能である。しかしながら、後続の増幅工程(c)まで伸長産物中に非放射性の標識基を導入しないことが好ましい。これは例えば非放射標識ＣＴＰ（テロメア反復配列の成分ではない）を用いることにより行われる。その場合は、区画化を行う必要がない「ワンポット反応」としてこの反応を実施することができる。他方、非放射標識ヌクレオシド三リン酸を反応の後期に反応混合物と接触させることができる。これは例えば区画化により達成され、その場合は非放射標識ヌクレオシド三リン酸が除去可能なバリアー（例えば、より高温で溶融するワックス層）により反応混合物から伸長工程(b)の間に分離される。もちろん、この反応体を逐次添加することも可能である。さらに、伸長工程(b)の後にテロメラーゼにより生産された伸長産物の更なる鋳型非依存的延長を行うことが好ましい場合がある。この延長は酵素反応により行うことが有利であり、例えばターミナルトランスフェラーゼを用いたポリアデニル化により、またはＤＮＡリガーゼを用いた短いＤＮＡ断片のライゲーションにより、ヌクレオチドを結合させることができる。本発明の方法の工程(c)は、テロメラーゼにより生産された伸長産物の増幅である。本発明の方法にとって、増幅工程のタイプは決定的なものではない。一般的には、核酸を重合し得る適当な酵素、例えば核酸ポリメラーゼまたは核酸リガーゼを添加して増幅を行う。耐熱性の酵素を使って、数サイクルの増幅を行うことが好ましい。増幅には２つのプライマーを用いることが好ましく、テロメラーゼ基質を第１プライマーとして使用し、適当な相補プライマーを第２プライマーとして使用することができる。増幅産物は酵素触媒、例えば鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼにより第１および第２プライマーにヌクレオチドを結合させることで形成される。第２プライマーは配列番号４で表されるプライマーP2のようにテロメア反復配列とハイブリダイズできることが好ましい。テロメア反復配列に相補的でない領域をその5'末端に含む、いわゆるアンカープライマーをこのために使用することが有利である。アンカープライマーは次のような利点を有する。すなわち、もとの鋳型より長い増幅産物が形成されないこと、および反復配列を含むプライマーを用いるとき反復配列を同様に含むにちがいないプライマーの二量体が伸長されないことである。アンカープライマーとしては、その5'末端に少なくとも４ヌクレオチド長、特に少なくとも５ヌクレオチド長の延長部（反復配列を含まない）をもつものを使用することが特に好ましい。この配列領域の長さは好ましくは４〜 20ヌクレオチドである。5'末端にＧＣに富む配列をもつアンカープライマーが最も好ましいものである。一般的に、テロメア反復配列に相補的な配列およびその 5'側に該反復配列を含まない延長部を有するオリゴヌクレオチドまたは核酸類似体（好ましくは長さが10〜50ヌクレオチド）が、テロメラーゼ活性の検出方法で用いるプライマーとして適している。5'側に６ヌクレオチド長のアンカー配列をもつ適当なアンカープライマーの一例は、配列番号５で表されるプライマーTE-A CTである。特に好ましいアンカープライマーは、配列番号１３で表されるプライマーTE-3.2である。このプライマーおよび同様のプライマー（TE-3.2に対して最大３ヌクレオチドが3'末端で欠失しているもの）を用いるとき特に良好な試験結果が得られる。酵素としては、ポリメラーゼの失活なしに多数の増幅サイクルを行うことができる耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを使うことが好ましい。特に好適な増幅法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法である。伸長後に、例えばターミナルトランスフェラーゼによる更なる延長を行う場合は、後続の増幅工程(c)のために、延長により伸長産物に結合される配列部分に相補的な第２プライマーを用いることができる。その例は配列番号６で表されるプライマーP3である。また、当業者に公知の他の方法で増幅を行うこともできる。すなわち、鋳型依存性ＤＮＡリガーゼによりこの反応を触媒させてもよく、その場合は、ＤＮＡリガーゼを用いてプライマーにオリゴデオキシリボヌクレオチドを結合させることで、増幅産物が形成される。ＤＮＡリガーゼとしては耐熱性のＤＮＡリガーゼが好ましく、特にリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）法を用いて反応を行うことが有利である。本発明の方法の工程(d)は、固相上への増幅産物の固定化を含んでなる。固相として、例えば反応容器の壁面を利用することができる。あるいはまた、粒状の固相も使用できる。固相はマイクロタイタープレート、微量反応容器、膜、マイクロチップ、バイオコアシステム、および磁気を帯びていてもよい微小ビーズから選択するのが好ましい。この固定化工程は多くの時間の節約につながり、現技術水準の方法と比べてそれほど骨の折れる作業ではない。さらに、この固定化工程は高いサンプル処理量並びに、例えばルーチン分析やエフェクターのスクリーニングのための、自動化を可能にする。原理的に、増幅産物は公知のどのような方法（例えば、吸着結合）を用いて固相に固定させてもよい。しかし、特異的相互作用（例えば、アンカー基による）により固定化を行うことが好ましい。適当なアンカー基の例は、固相に結合した抗体と反応する免疫反応性基、または固定した結合相手に対して高親和性結合能を有する他の基である。アンカー基の好ましい例は、アビジンまたはストレプトアビジンをコーティングした固相に高親和性でもって結合できるビオチンである。高サンプル数の場合は、例えば Savoyskyら(Nucleic Acids Res．24(1996)，1 175-1176)により記載された固定化法を採用することができ、この方法では、増幅反応において固定化基としてビオチンを含有する増幅産物が形成されるようにビオチン化したテロメラーゼ伸長プライマーが使用される。増幅中に同時に[Me-³ H]TTP が導入される。ビオチン化し、[³H]標識した増幅産物はストレプトアビジンをコーティングした蛍光微粒子上に固定化される。この固定化は[³H]から放出されたβ量子と蛍光微粒子との相互作用に基づくシンチレーション測定により検出される。増幅産物へのアンカー基の導入は本発明の方法のいろいろな段階で行うことができる。例えば、アンカー基（例：ビオチン基）をすでに含有する１または複数のプライマーを使用できる。また、例えばターミナルトランスフェラーゼまたはＤＮＡリガーゼを用いて、つまり増幅工程(c)において、一次伸長産物を延長する際にビオチン化ヌクレオチドを導入してもよい。しかしながら、本発明の好ましい実施態様では、増幅産物それ自体がアンカー基を含有する必要はまったくない。固相への定着(anchoring)は、例えば、１個または数個のアンカー基を担持しかつ反応条件下で増幅産物と安定にハイブリダイズできる捕捉プローブを加えることで達成できる。適当な捕捉プローブの例は、テロメア反復配列またはそれに相補的な配列および１個以上のアンカー基（例：ビオチン基）を含有するオリゴヌクレオチドである。捕捉プローブとしては、その5'末端に１個のアンカー基を含むものが特に好適である。例えば、配列番号７で表される、5'ビオチン基を含むオリゴヌクレオチドＰ４が捕捉プローブとして用いられる。他方、捕捉プローブとして核酸類似体、例えばペプチド核酸も使用される(Nie lsenら，1991，Science 254，1497-1500およびDueholmら，1994，J．Org．Chem ．59，5767-5773)。ペプチド核酸は側基としてヌクレオ塩基を含有する酸アミド結合で連結されたバックボーンをもつ。本発明方法の特定の実施態様では、捕捉プローブとして、または標識プローブとしても、ペプチド核酸を用いることが有利である。本発明の方法の工程(e)は、増幅産物の定性的および／または定量的検出を含んでなる。この検出は増幅産物中に含まれる標識基により、または増幅産物に結合された標識プローブにより公知の方法で達成される。自動測定装置を使って非放射性の標識基により検出することが好ましい。比色分析法および／または分光分析法で、例えば基質の酵素的変換により、または化学発光もしくは蛍光により標識基を検出する測定装置が有利である。好ましくは、増幅したテロメラーゼ伸長産物の特異的検出を非特異的副産物の存在下でさえも可能にする条件下で検出を行う。そのために、かかる特異的検出を可能にするハイブリダイゼーション条件を選択し、かつ／また、プライマー配列に相補的な未標識オリゴヌクレオチドもしくは核酸類似体（競合物質）を混合物に添加する。その結果これらの配列領域がマスクされ、捕捉または検出プローブが増幅産物の内部配列と特異的にハイブリダイズするようになる。適切なハイブリダイゼーション条件の例は37℃およびホルムアミド不含緩衝液またはホルムアミド含有緩衝液（例えば、マレイン酸緩衝液中の5xSSC，10%ホルムアミド，0.1%サルコシル，0.02% SDS，1% ブロッキング試薬）である。適当な未標識競合物質の例は配列番号１４および１５で表されるオリゴヌクレオチドである。試験手順のいくつかの好ましい具体例を以下に述べる。バージョン１：テロメラーゼ基質として、テロメアに特異的な反復配列を含まないプライマー、例えば配列番号１または２で表される配列をもつプライマーを使用する。あるいはまた、反復配列を含有するプライマー、例えばP1-Telo（配列番号３）も使用できる。このプライマーを伸長工程(b)において未標識のヌクレオシド三リン酸d ATP，dGTP およびdTTPとともに使用する。次に、テロメラーゼにより生産された伸長産物を工程(c)で増幅させる。増幅反応に必要な成分は、それらが伸長反応を妨害しないという条件で、工程(b)の反応混合物中にすでに存在していてもよい。その他の成分は同一の反応容器内に区画化された形で、例えば溶融可能なワックス層の下に存在する。工程(c)の反応混合物は、工程(b)ですでに存在する成分に加えて、ヒトテロメア反復配列に相補的な配列を含む第２プライマー（例えば、配列番号４で表される配列をもつプライマーP2または配列番号５で表される配列をもつプライマーTE -ACT）、アンカー基をもつヌクレオシド三リン酸（例えば、ビオチン化dUTP）少なくとも１種、非放射標識ヌクレオシド三リン酸（例えば、Br-dUTP，Br-dCTP， CH₃-dCTP，DIG-dUTPまたはDIG-dCTP）少なくとも１種、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Taq-ポリメラーゼ）を含有する。工程(d)に従う増幅産物の固定化は、ストレプトアビジンとウシ血清アルブミンとの複合体をコーティングしてあるマイクロタイタープレート上で行う。続いて、標識基（例えば、Br-dU，Br-dC，CH₃-dCまたはDIG）に対する抗体または抗体フラグメントと酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）からなる複合体の助けをかりて増幅産物を検出する。バージョン２：バージョン１とは別に、工程(b)で生産されたテロメラーゼ伸長産物を、ターミナルトランスフェラーゼと１種以上のヌクレオチド、例えばdATPを用いて延長する。この場合の増幅を行うには、オリゴ-dＴプライマー（例えば、配列番号６で表される配列をもつプライマーP3）および標識ヌクレオチドと未標識ヌクレオチド（バージョン１参照）を添加する。そして、この増幅産物を上記のように検出する。このバージョンは、追加の標識基（増幅産物につき約50〜100個の標識基）を導入することが可能であるので、感度の増加といった利点を提供する。短いテロメア産物にとってこれは特に重要である。さらに、この実験手順ではテロメラーゼ触媒による全長伸長産物がもっぱら増幅される。なぜならば、伸長産物内の反復配列とのハイブリダイゼーションが該プライマーの選択により排除されるからである。このことも標識基の密度の増加へとつながる。また、バージョン１および２において、ビオチン化ヌクレオシド三リン酸を導入する代わりに、ビオチン化第１および／または第２プライマーを用いることにより増幅産物を固定させてもよい。こうしたプライマーは例えばその5'末端でビオチン化される。バージョン３：バージョン１および２とは対照的に、標識基のみを含み固相アンカー基を含まない増幅産物が生産される。したがって、このバージョンでは、ＰＣＲ中に非放射標識ヌクレオチドを添加することによりＤＮＡの単一標識化のみを行う。固定化を行うには、増幅産物を変性し、その後ビオチン化捕捉プローブ、例えば配列番号７で表されるヌクレオチド配列をもつオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。すべてのバージョンにおいて、ワックスによる区画化を行わない逐次試験法が可能である。あらゆる試験法の最大持続時間は約10時間で、せいぜい６〜８時間とすることが好ましい。本発明方法のバージョン１〜３の模式図を図１に示してある。バージョン４：テロメラーゼ基質、例えばプライマーP1またはビオチン化プライマーP1のテロメラーゼ触媒による伸長反応をバージョン１と同様に行う。続いて、第２プライマー、例えばプライマーTE-ACTを添加して伸長産物を増幅する。この増幅は標識ヌクレオチドの不在下で行う。それゆえ、工程(b)の間は区画化が必要でない。増幅後、増幅産物をバージョン３と同様に変性し、(i)ビオチン化プライマーを使用するときは標識プローブ、例えばＤＩＧ基を含むオリゴヌクレオチド、または(ii)非ビオチン化プライマーを使用するときは標識プローブおよびビオチン化捕捉プローブとハイブリダイズさせる。検出はバージョン１に記載したように行う。さらに、本発明方法の好ましい実施態様では、所定量の増幅スタンダード（標準物質）を加えることにより増幅反応を標準化することができる。このような増幅スタンダードを構築するには、例えば、クローニングベクターにテロメラーゼ伸長産物をクローニングした後で組換え法により第１プライマーに対応する配列の3'側にテロメラーゼ伸長産物中に含まれない任意のＤＮＡ配列を挿入する。次に、この構築物の所定量を増幅反応の混合物に添加し、第１および第２プライマーを用いてテロメラーゼ伸長産物と一緒に増幅する。その後、増幅混合物のアリコートを第１捕捉プローブを用いて分析し、別のアリコートを第２捕捉プローブを用いて分析する。第１捕捉プローブはテロメラーゼ伸長産物からの増幅産物の検出だけでなく添加したスタンダードからの増幅産物の検出をも可能にし、一方、第２捕捉プローブはスタンダードから誘導された増幅産物のみの検出を可能にする。最後に、標準値に基づいた測定値の標準化により、試験サンプル中のテロメラーゼ活性の定量的計算が可能になる。２個または数個の異なる標識基を使用する場合で、それらが並行に検出され得るように選択されている場合は、同一の反応容器中でいくつかの検出、例えばテロメラーゼ伸長産物の検出とスタンダードの検出を逐次行うことが可能である。すなわち、２つの別個のアリコートを検査する必要がない。本発明方法の更なる利点は、テロメラーゼ伸長産物を例えばゲル電気泳動後にイムノブロットで検出するとき、テロメラーゼ伸長産物のバンドの外側に位置づけられるバンドをもたらすスタンダードを使用できることである。これにより定量化が向上する。あるいはまた、捕捉プローブをそれぞれに応じて選択するのであれば、第１捕捉プローブを用いてスタンダードから得られる増幅産物のみを固定化し、第２捕捉プローブを用いてテロメラーゼ伸長産物から誘導された増幅産物のみを固定化することが可能である。適当な増幅スタンダードの例を配列番号８および図５に示してある。配列番号８で表される増幅スタンダードの検出に特に適している捕捉プローブの例は、配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドＰ５である。図５に示したスタンダードの検出は、例えば配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドTE-CATを用いて行うことができる。本発明の更なる主題は、 (a)テロメラーゼ基質としてのプライマー、 (b)ヌクレオシド三リン酸、 (c)テロメラーゼ伸長産物の増幅用試薬、 (d)標識基、 (e)固相アンカー基、および (f)固相、を含んでなるテロメラーゼ活性を検出するための試薬キットである。標識基は非放射性の標識基が好ましく、適切に標識されたヌクレオシド三リン酸および／または標識されたプライマーの形で存在し得る。また、標識基は試験条件下で増幅産物とハイブリダイズする１以上の標識プローブ上に担持されていてもよい。固相アンカー基としてはビオチンが好ましく、その固相にはストレプトアビジンおよび／またはアビジンがコーティングされる。固相はマイクロタイタープレート、微量反応容器、膜、マイクロチップ、バイオコアシステム、および場合により磁気を帯びた微小ビーズから選択するのが好ましい。固相アンカー基は、一方では、適切に修飾されたヌクレオシド三リン酸の形で、すなわちプライマー上に存在することができる。他方、固相アンカー基は増幅産物とハイブリダイズする捕捉プローブ上に存在してもよい。テロメラーゼ伸長産物を増幅するための試薬は、第２プライマーおよび核酸の増幅に適した酵素（好ましくは、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ）を含むことが好ましい。特に好適な実施態様において、試薬キットは標識基および／または固相アンカー基をもちかつ増幅産物とハイブリダイズする１または複数の標識プローブおよび／または捕捉プローブを含有する。標識プローブと捕捉プローブはオリゴヌクレオチドおよび核酸類似体、特にペプチド核酸から選択するのが好ましい。所望により、この試薬キットはテロメラーゼ伸長産物をさらに延長させるための試薬、例えばターミナルトランスフェラーゼまたはＤＮＡリガーゼのような酵素を含んでいてもよい。さらに、この試薬キットは検出反応を定量化するための内部スタンダードおよび該スタンダードと増幅産物を別々に検出するための適当な試薬を含むことができる。本発明の更なる主題は、レトロウイルスのＬＴＲ配列の5'領域に由来するオリゴヌクレオチドの、テロメラーゼ基質としての使用である。このオリゴヌクレオチドはＨＩＶのＬＴＲ配列の5'領域に由来するのが好ましい。特に好ましくは、このオリゴヌクレオチドは10〜50ヌクレオチドの長さで、その3'末端に(a)配列番号２で表される配列、(b)(a)の配列と80% 以上、特に90% 以上相同である配列、または(c)(a)もしくは(b)の配列の最後の少なくとも10ヌクレオチドを含んでなる。以下の実施例、配列表および図面を用いて本発明をさらに詳しく説明する。配列番号１は、テロメラーゼ基質として適しているプライマー（P1）を示す。配列番号２は、テロメラーゼ基質として適している別のプライマー（P-LTR）を示す。配列番号３は、テロメラーゼ基質として適している別のプライマー（P1-Telo ）を示す。配列番号４は、増幅プライマー（P2）を示す。配列番号５は、増幅に適しているアンカープライマー（TE-ACT）を示す。配列番号６は、増幅に適しているオリゴ-dＴ-プライマー（P3）を示す。配列番号７は、捕捉プローブ（P4）を示す。配列番号８は、ＰＣＲによるテロメラーゼ活性の定量的測定のための増幅スタンダードを示す。配列番号９は、標準化したＰＣＲ混合物に用いる捕捉プローブ（P5）を示す。配列番号１０は、標準化したＰＣＲ混合物に用いる別の捕捉プローブ（TE-CAT ）を示す。配列番号１１および１２は、増幅スタンダードを作製するために用いる２つのプライマー（P1-STおよびTE-ACT-ST）を示す。配列番号１３は、増幅に適しているアンカープライマー（TE-3.2）を示す。配列番号１４および１５は、２つの競合オリゴヌクレオチドを示す。図１は、本発明による方法の３つの好適な実施態様を示した模式図である。図２は、マイクロタイタープレートフォーマットでの非放射能検出の結果を示した図である。図３は、本発明による試験の各種変法を示した図である。図４は、抽出物の使用量に対するテロメラーゼの検出を示した図である。図５は、増幅スタンダードを示した図である。図６は、細胞系および組織サンプル中のテロメラーゼの検出の特異性を示した図である。図７は、細胞系および組織サンプル中のテロメラーゼの検出の選択性を示した図である。実施例１．本発明方法のバージョン１によりテロメラーゼを検出するための反応混合物 48μlのテロメラーゼ／ＰＣＲ緩衝液（20mM Tris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl₂， 63mM KCl，0.05% Tween-20(w/v)，1mM EGTA，40μM dNTP(N=各10μMのA，G，C， U)，300nMのプライマーP1またはP-LTR（配列番号１または２）または P1-Telo（配列番号３），20μg/mlのT4g32タンパク質，0.1mg/mlのウシ血清アルブミン(BS A)(w/v)，2UのTaq DNA ポリメラーゼ）を、プレコートしたＰＣＲ反応容器に入れた。その後、２μlのサンプル（例えば、10⁵細胞当量からのS 100抽出物）を添加し、25℃で10〜30分インキュベートした。プレコートしたＰＣＲ反応容器は、その底部に次の成分を入れて凍結乾燥させ、その上にワックス(例えば、AmliWax，Perkin Elmer)を重層したものだった：1 00ngのプライマーP2またはTE-ACT(配列番号４または５；50μl中に223nM)，30ng のDIG-dUTP(50μl中に0.5μM)および370ngのビオチン化dUTP(50μl中に7.5μM) 。続いてＰＣＲを25サイクル（94℃で30秒; 50℃で30秒; 72℃で90秒）行った。 94℃に加熱したときワックス層が溶融し、凍結乾燥した試薬類が残りの反応混合物と接触した。ＰＣＲ後、この混合物のアリコートを、ストレプトアビジン-サーモBSA をコートしたマイクロタイタープレートに移し、37℃で30分インキュベートした。その後 200μlずつの洗浄緩衝液(150mM NaCl，15mM クエン酸Na，pH7.0)で３回洗った。次に、抗DIGペルオキシダーゼ結合体（または他の標識基を用いるときは他の適当なペルオキシダーゼ結合体）を加え、37℃で60分インキュベートした。これを再度 200μlずつの洗浄緩衝液で３回洗った。検出のために、200μl のTMB 基質試薬（100μg/mlの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン，1mM クエン酸，100mM 酢酸Na，0.01% H₂O₂）を加えた。マルチチャンネルフォトメーターを使って450nm の波長で検出した。２．本発明方法のバージョン２によりテロメラーゼを検出するための反応混合物テロメラーゼ伸長工程まではポイント１に記載したとおりに反応を行った。その後、200mM カコジル酸カリウム，5mM CoCl₂中の 2.5U/μl のターミナルトランスフェラーゼを加え、37℃で60分インキュベートした。続いて、ＰＣＲをポイント１に記載したとおりに行った。ただし、プライマー P2の代わりに配列番号６で表される配列をもつプライマーP3を使用した。増幅産物はポイント１に記載したとおりに検出した。上記方法の別法として、ビオチン化dUTPを導入する代わりにビオチン化テロメラーゼ／ＰＣＲプライマー（P1-BioまたはP1-TeloBio）を用いて増幅産物を固定化した。３．本発明方法のバージョン３によりテロメラーゼを検出するための反応混合物テロメラーゼ伸長反応をポイント１に記載したとおりに行った。プレコートしたＰＣＲ反応容器はポイント１に記載したのと同じ成分を含んでいたが、ビオチン化ヌクレオシド三リン酸は含んでいなかった。ＰＣＲをポイント１に記載したとおりに行った。ＰＣＲ後、この混合物 10μl を40μl の変性緩衝液（125mM NaOH，0.2mM EDTA）に加え、室温で10分インキュベートした。次に、450μl のハイブリダイゼーション緩衝液（62.5mM リン酸Na，pH6.5， 630mM NaCl，0.0625% BSA(w/v)および1μM のビオチン化捕捉プローブ、例えばオリゴヌクレオチドP1-BioまたはP4）を加え、この混合物 200μl を、SA-サーモBSA をコートしたマイクロタイタープレートに移した。その後これを37℃で60 分インキュベートし、続いて200μl ずつの洗浄緩衝液で３回洗った。増幅産物はポイント１に記載したとおりに検出した。本発明方法のあらゆる変法は、ワックスによる区画化を行わないで、逐次試験法を用いても実施された。すべての試験フォーマットの全持続時間は最大６時間であった。４．本発明方法のバージョン４によりテロメラーゼを検出するための反応混合物テロメラーゼ伸長工程をポイント１に記載したとおりに行った。テロメラーゼ基質として非ビオチン化およびビオチン化プライマーを用いた。バージョン１とは対照的に、プレコートした反応容器を使用しなかった。その後ＰＣＲをポイント１に記載したとおりに、しかし標識ヌクレオチドの不在下で行った。増幅反応後、ポイント３に記載したとおりに変性を行った。ビオチン化プライマーを用いるときは DIG標識した標識プローブを使用し、非ビオチン化プライマーを用いるときは DIG標識した標識プローブとビオチン化捕捉プローブを使用した。増幅産物はポイント１に記載したとおりに検出した。５．標準化した反応混合物細菌の酵素であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのコード領域からの配列領域を、プライマーP1-ST（配列番号１１）およびTE-ACT-ST（配列番号１２）を用いて増幅した。得られた 202 bp の長いＰＣＲ断片（図５）は、２つのテロメラーゼプライマーP1（配列番号１）およびTE-ACT（配列番号５）の配列により挟まれたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子由来の配列を含んでいた。テロメラーゼ伸長工程においてこのＰＣＲ産物の一定量（1〜20アトモル）を加えたが、適当なプライマーを用いると、これはまさにテロメラーゼ伸長産物として増幅された。このスタンダードの検出および定量化を、増幅中にビオチン化プライマーを加えたときは DIG標識したCAT特異的プライマーTE-CAT（配列番号１０）とハイブリダイズさせることで、また、増幅中に標識基を導入したときはビオチン化CAT 特異的捕捉プローブとハイブリダイズさせることで、行った。６．ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ用の反応混合物単一の、プレコートしてない反応容器でテロメラーゼ伸長工程と増幅を行った。そのために、ビオチン化テロメラーゼプライマー(例：P1，t-LTR またはP1-Te lo)、アンカープライマー（TE-ACTまたはTE-3.2）、未標識dNTPおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有する反応混合物に、サンプル（１×10³〜３×10³細胞当量に対応する１〜３μlの細胞抽出物、または１〜50μg の全タンパク質）または陽性対照（テロメラーゼ活性をもつことが知られている細胞の抽出物）または陰性対照（RNアーゼ処理または熱処理を施した細胞抽出物）を加えた。この反応混合物をサーモサイクラーに入れてプライマー伸長と増幅を行った。ここで、最初にプライマー伸長を25℃で10〜30分行った。次にこれを94℃で５分加熱してテロメラーゼを失活させた。続いて、ポイント１に記載したようにＰＣＲを30サイクル行い、その後72℃で10分加熱した。次に、増幅混合物のアリコートを変性し、未標識競合オリゴヌクレオチドの存在下でDIG標識した捕捉プローブとハイブリダイズさせた。得られた生成物をストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレートにビオチン基により固定させた。固定した増幅産物をポイント１に記載したとおりに検出した。あるいはまた、反応混合物をゲル電気泳動（例：未変性ポリアクリルアミドゲル）で分離し、バンドを膜に移行させてそこで可視化した。７．結果ポイント１〜３に記載した試験フォーマットを図１に例示してある。図２は、マイクロタイタープレートに固定させた後のテロメラーゼの非放射性検出を示す。50μl の混合物（プライマー：P1-Bio）につき１×10⁵細胞当量(He La抽出物)を使用した。Ａ：それぞれの場合に記載したヌクレオチド(DIG-dUTP ，フルオレセイン-dUTP，Br-dUTP)を用いてＰＣＲ工程中に標識基を導入し、ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレートで固定化を行い、適当な抗体結合体を用いて検出を行った。Ｂ：反応の特異性：テロメラーゼ活性を阻害するRNアーゼを添加したときは、どのような増幅産物も検出されなかった。図３は、いろいろな試験フォーマットでの結果を示す。Ａ：バージョン１に従う二重標識実験(DIG-dUTP/Bio-dUTP)の結果；Ｂ：ビオチン化プライマーP1( P1-Bio)を用いたバージョン１に従う単一標識実験（DIG-dUTP）；Ｃ：テロメラーゼ基質としてプライマーP1を、捕捉プローブとしてプライマーP1-Bioを用いたバージョン３に従う単一標識実験（DIG-dUTP）。図４は、抽出物の使用量に対するテロメラーゼの検出の結果を示す。バージョン１に従う単一標識実験（DIG-dUTP）をビオチン化プライマーP1-Bioを用いて行った。Ａ：試験の特異性：RNアーゼ処理または温度処理の後では増幅産物をもはや検出できなかった。Ｂ：試験の感度：１×10⁴細胞当量から出発して、この抽出物（−／＋RNアーゼ処理）をlog₁₀滴定した。次に、ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート上での検出のためにＰＣＲ混合物の5%を用いた。図４から、１〜10細胞当量がなおもバックグラウンド（抽出物なし）よりも明らかに高いシグナルをもたらすことが見てとれる。図６は、細胞系および組織サンプル中のテロメラーゼ活性の特異的検出を示す。Ａ：本発明によるテロメラーゼＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ（ポイント６）を用いて、ヒトテロメラーゼ陽性の胚腎細胞系 293およびヒトテロメラーゼ陰性の肺繊維芽細胞系 EMR90を分析した。陰性対照として、抽出物を添加しない溶解試薬（溶解試薬）、RNアーゼで処理した293細胞（＋RNアーゼ）または熱処理した293細胞（＋ΔＴ）を用いた。すべての対照からは陰性の結果が得られた。対照P1はテロメラーゼにより基質として受け入れられない合成オリゴヌクレオチドである。これらの試験はそれぞれの場合に１×I0³細胞当量に相当する抽出物量を用いてポイント６に記載したとおりに行った。Ｂ：生検により得られた原発生の腫瘍組織と正常組織においてテロメラーゼ活性を分析した。この場合は、前立腺癌と膀胱癌をそれぞれ正常な前立腺組織および膀胱組織と比較した。20μg の総タンパク質を用いてセクション（Ａ）に記載したとおりに試験を行った。図７は、本発明によるテロメラーゼＰＣＲ−ＥＬＩＳＡの感度を示す。Ａ：テロメラーゼ陽性 293細胞の抽出物を溶解試薬で連続希釈した。表示した細胞当量をポイント６に記載したように分析した。RNアーゼで処理した抽出物（＋RNアーゼ）またはRNアーゼで処理しなかった抽出物（−RNアーゼ）の結果を示す。Ｂ：溶解前に 293細胞を培地で連続希釈し、その後上記のように溶解試薬で処理した。表示した細胞数をテロメラーゼＰＣＲ−ＥＬＩＳＡで分析した。試験は上記のとおりに行った。RNアーゼで処理したサンプル（＋RNアーゼ）とRNアーゼで処理しなかったサンプル（−RNアーゼ）の結果を示す。Ｃ：膀胱癌の腫瘍組織と正常な膀胱組織から得られた抽出物の連続希釈物においてテロメラーゼ活性を測定した。表示した量の組織材料を上記のように試験した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年８月１１日【補正内容】 51．テロメア反復配列に相補的な配列と、その5'側の少なくとも４ヌクレオチド（特に４〜10ヌクレオチド）の長さの延長配列と、を含むオリゴヌクレオチドまたは核酸類似体の、テロメラーゼ活性を検出する請求項１に記載の方法におけるプライマーとしての使用。【手続補正書】【提出日】１９９８年４月１日【補正内容】請求の範囲１．テロメラーゼ活性を検出する方法であって、 (a)試験すべきサンプルを用意し、 (b)テロメラーゼ基質としての第１プライマーおよびヌクレオシド三リン酸を加え、この反応混合物をテロメラーゼによるプライマー伸長が起こる条件下でインキュベートし、 (c)テロメラーゼにより産生された伸長産物の増幅を行い、 (d)工程(c)で得られた増幅産物を固相上に固定し、そして (e)固定した増幅産物を定性的および／または定量的に検出する、各工程を含んでなる方法。２．増幅産物を非放射性の標識基により検出する、請求項１に記載の方法。３．非放射性の標識基が免疫反応性基、発光基および蛍光基から選択される、請求項１または２に記載の方法。４．増幅産物を標識基の取り込みにより直接的に標識する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。５．増幅産物を標識プローブとのハイブリダイゼーションにより間接的に標識する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。６．固相がマイクロタイタープレート、微量反応容器、膜、マイクロチップ、バイオコアシステムおよび磁気を帯びていてもよい微小ビーズから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。７．ＰＣＲまたはＬＣＲにより増幅を行う、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。８．テロメアの反復配列を含まない第１プライマーを用いる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。９．レトロウイルスＬＴＲ配列の5'領域に由来する第１プライマーを用いる、請求項８に記載の方法。 10．ＨＩＶのＬＴＲ配列の5'領域に由来する第１プライマーを用いる、請求項９に記載の方法。 11．テロメアの反復配列を含む第１プライマーを用いる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。 12．増幅において、テロメア反復配列に相補的でない領域を5'末端に含む第２プライマーを用いる、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。 13．伸長工程(b)の後に伸長産物の更なる鋳型非依存性延長を行う、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。 14．未標識のヌクレオシド三リン酸のみが第１プライマーに結合されるような様式で伸長工程(b)を行う、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。 15．固相への固定化をアンカー基を介して行い、特に増幅工程(c)の間に、アンカー基を含むプライマーを用いることにより、かつ／またはアンカー基を含むヌクレオシド三リン酸を用いることにより、該アンカー基を増幅産物に導入する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。 16．固相への固定化をアンカー基を介して行い、該アンカー基は増幅産物とハイブリダイズする捕捉プローブ中に含まれている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。 17．増幅産物の定量的検出を可能とする内部スタンダードを増幅反応に添加する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。 18．前記反応をワンポット反応として行う、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。 19．増幅産物の固定化および／または検出を、増幅副産物を分離せずに、テロメラーゼ伸長産物の特異的検出を可能とする条件下で行う、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。 20．テロメラーゼ活性を検出するための試薬キットであって、 (a)テロメラーゼ基質としてのプライマー、 (b)ヌクレオシド三リン酸、 (c)テロメラーゼ伸長産物の増幅用試薬、 (d)標識基、 (e)固相アンカー基、および (f)固相、を含んでなる試薬キット。 21．固相がマイクロタイタープレート、微量反応容器、膜、マイクロチップ、バイオコアシステムおよび磁気を帯びていてもよい微小ビーズから選択される、請求項２０に記載の試薬キット。 22．レトロウイルスのＬＴＲ−２配列の5'領域に由来するオリゴヌクレオチドの、テロメラーゼ基質としての使用。 23．10〜50ヌクレオチドの長さを有し、その3'末端に(a)配列番号２で表される配列、(b)この配列に80% 以上相同である配列、または(c)(a)もしくは(b)の配列の最後の少なくとも10ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド。 24．テロメア反復配列に相補的な配列と、その5'側の少なくとも４ヌクレオチド（特に４〜10ヌクレオチド）の長さの延長配列と、を含むオリゴヌクレオチドまたは核酸類似体の、テロメラーゼ活性を検出する請求項１に記載の方法におけるプライマーとしての使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＵＳ (72)発明者レインク，ヘルマンドイツ連邦共和国ディー−83673 ビクル，ベネディクトンヴァントシュトラーセ 11 (72)発明者ハインツペーター，マティアスドイツ連邦共和国ディー−80689 ミュンヘン，バウテラーシュトラーセ 19 (72)発明者カール，ゲルリントドイツ連邦共和国ディー−82467 ゲルミシュ−パルテンカーチェン，バトカッセ 12

Claims

【特許請求の範囲】１．テロメラーゼ活性を検出する方法であって、 (a)試験すべきサンプルを用意し、 (b)テロメラーゼ基質としての第１プライマーおよびヌクレオシド三リン酸を加え、この反応混合物をテロメラーゼによるプライマー伸長が起こる条件下でインキュベートし、 (c)テロメラーゼにより産生された伸長産物の増幅を行い、 (d)工程(c)で得られた増幅産物を固相上に固定し、そして (e)固定した増幅産物を定性的および／または定量的に検出する、各工程を含んでなる方法。２．増幅産物を非放射性の標識基により検出する、請求項１に記載の方法。３．非放射性の標識基が免疫反応性基、発光基および蛍光基から選択される、請求項１または２に記載の方法。４．増幅産物を標識基の取り込みにより直接的に標識する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。５．増幅産物を標識プローブとのハイブリダイゼーションにより間接的に標識する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。６．増幅産物を吸着相互作用により固相上に固定する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。７．増幅産物をアンカー基を介して固相上に固定する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。８．アンカー基としてビオチンを用いて、アビジンまたはストレプトアビジンをコートした固相を用いる、請求項７に記載の方法。９．固相がマイクロタイタープレート、微量反応容器、膜、マイクロチップ、バイオコアシステムおよび磁気を帯びていてもよい微小ビーズから選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。 10．酵素の添加により増幅反応を行う、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。 11．耐熱性の酵素を用いる、請求項１０に記載の方法。 12．酵素として核酸ポリメラーゼまたは核酸リガーゼを用いる、請求項１０または１１に記載の方法。 13．増幅のために２つのプライマーを用いる、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。 14．ＰＣＲまたはＬＣＲにより増幅を行う、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。 15．テロメアの反復配列を含まない第１プライマーを用いる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。 16．レトロウイルスＬＴＲ配列の5'領域に由来する第１プライマーを用いる、請求項１５に記載の方法。 17．第１プライマーがＨＩＶのＬＴＲ配列の5'領域に由来する、請求項１６に記載の方法。 18．テロメアの反復配列を含む第１プライマーを用いる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。 19．増幅において、5'末端にテロメア反復配列に相補的でない領域を含む第２プライマーを用いる、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。 20．第２プライマーがその5'末端に少なくとも４ヌクレオチド長の延長部を有する、請求項１９に記載の方法。 21．第２プライマーがその5'末端にＧＣに富む延長部を有する、請求項２０に記載の方法。 22．伸長工程(b)の後に伸長産物の更なる鋳型非依存性延長を行う、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。 23．伸長産物を酵素的に延長する、請求項２２に記載の方法。 24．ターミナルトランスフェラーゼにより延長する、請求項２３に記載の方法。 25．増幅工程において、延長により伸長産物に結合された配列部分とのハイブリダイゼーションを可能とする第２プライマーを用いる、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。 26．未標識のヌクレオシド三リン酸のみが第１プライマーに結合されるような様式で伸長工程(b)を行う、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。 27．固相への固定化をアンカー基を介して行い、特に増幅工程(c)の間に、アンカー基を含むプライマーを用いることにより、かつ／またはアンカー基を含むヌクレオシド三リン酸を用いることにより、該アンカー基を増幅産物に導入する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。 28．固相への固定化をアンカー基を介して行い、該アンカー基は増幅産物とハイブリダイズする捕捉プローブ中に含まれている、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。 29．増幅産物の定量的検出を可能とする内部スタンダードを増幅反応に添加する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。 30．前記の反応を「ワンポット反応」として行う、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。 31．増幅産物の固定化および／または検出を、増幅副産物を分離せずに、テロメラーゼ伸長産物の特異的検出を可能とする条件下で行う、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。 32．適当なハイブリダイゼーション条件を選択することで、特異的検出を可能とする、請求項３１に記載の方法。 33．プライマー配列に相補的な未標識のオリゴヌクレオチドまたは核酸類似体を加えることで、特異的検出を可能とする、請求項３１または３２に記載の方法。 34．テロメラーゼ活性を検出するための試薬キットであって、 (a)テロメラーゼ基質としてのプライマー、 (b)ヌクレオシド三リン酸、 (c)テロメラーゼ伸長産物の増幅用試薬、 (d)標識基、 (e)固相アンカー基、および (f)固相、を含んでなる試薬キット。 35．標識基が非放射性の標識基である、請求項３４に記載の試薬キット。 36．固相アンカー基がビオチンであり、固相にはストレプトアビジンおよび／またはアビジンをコートしてある、請求項３４または３５に記載の試薬キット。 37．固相がマイクロタイタープレート、微量反応容器、膜、マイクロチップ、バイオコアシステムおよび磁気を帯びていてもよい微小ビーズから選択される、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の試薬キット。 38．標識基がヌクレオシド三リン酸上に存在する、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の試薬キット。 39．標識基がプライマー上に存在する、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の試薬キット。 40．標識基が増幅産物とハイブリダイズする標識プローブ上に存在する、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の試薬キット。 41．固相アンカー基がヌクレオシド三リン酸上に存在する、請求項３４〜４０のいずれか１項に記載の試薬キット。 42．固相アンカー基がプライマー上に存在する、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の試薬キット。 43．固相アンカー基が増幅産物とハイブリダイズする捕捉プローブ上に存在する、請求項３４〜４２のいずれか１項に記載の試薬キット。 44．標識プローブまたは捕捉プローブがオリゴヌクレオチドおよび核酸類似体から選択される、請求項４０または４３に記載の試薬キット。 45．標識プローブまたは捕捉プローブがペプチド核酸である、請求項４４に記載の試薬キット。 46．テロメラーゼ伸長産物をさらに延長するための試薬をさらに含む、請求項３４〜４５のいずれか１項に記載の試薬キット。 47．検出反応を定量化するための内部スタンダードをさらに含む、請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の試薬キット。 48．レトロウイルスのＬＴＲ−２配列の5'領域に由来するオリゴヌクレオチドの、テロメラーゼ基質としての使用。 49．前記オリゴヌクレオチドがＨＩＶのＬＴＲ配列の5'領域に由来する、請求項４８に記載の使用。 50．10〜50ヌクレオチドの長さを有し、その3'末端に(a)配列番号２で表される配列、(b)これに80％以上相同である配列、または(c)(a)もしくは(b)の配列の最後の少なくとも10ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド。 51．テロメア反復配列に相補的な配列と、その5'側の少なくとも４ヌクレオチド（特に４〜10ヌクレオチド）の長さの延長配列と、を含むオリゴヌクレオチドまたは核酸類似体の、テロメラーゼ活性を検出する方法におけるプライマーとしての使用。