JP2659568B2 - クロトン属植物の不定芽およびその幼苗ならびにその増殖法 - Google Patents

クロトン属植物の不定芽およびその幼苗ならびにその増殖法

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JP2659568B2 JP63259131A JP25913188A JP2659568B2 JP 2659568 B2 JP2659568 B2 JP 2659568B2 JP 63259131 A JP63259131 A JP 63259131A JP 25913188 A JP25913188 A JP 25913188A JP 2659568 B2 JP2659568 B2 JP 2659568B2
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  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

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【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、プラウノトールを含有し優良形質を備えた
クロトン属植物の不定芽および幼苗ならびにそれらの大
量増殖法に関するものである。
クロトン属植物、特にタイ国産のプラウノイ[Plau−
noi:学名、クロトン・スブリラーツス・キュルツ(Crot
on sublyratus Kurz)またはクロトン・ユーフラ・ロク
シバーグ(Croton joufra Roxb.)]、プラウヤイ[Pla
u−yai:学名、クロトン・オブロンギフォリウス・ロク
シバーグ(Croton oblongifolius Roxb.)]、及びプラ
ウルア[Plauluat:学名、クロトン・ハッチンソニアヌ
ス・ホセウス(Croton hutchinsonianus Hosseus)]等
は、下記の構造式を有するプラウノトールと呼ばれるジ
テルペン化合物を含有し、これら植物からプラウノトー
ルを抽出製剤した医薬は粘膜防御性潰瘍治療剤(特公昭
58−20933)として市販されている。
従来の技術 上記原料植物は、根分け、挿し木等によって増殖、栽
培されているが、野生種を母株とするため品質の一定し
た株を一定期間内に大量に増殖させることは困難であっ
た。そこで本発明者らはプラウノトールを含有するクロ
トン属植物のクローン増殖法のひとつとして茎頂培養法
を見出した(特願昭63−97287)。
しかしながら、茎頂培養法は茎頂の滅菌に困難な点が
あった。また、根分け、挿し水、茎頂培養とも、利用し
得る器官に限りがあった。
近年、植物バイオテクノロジーの手法を用いて不定芽
を作出し、幼苗の大量増殖を行なうことが、例えばクリ
プトメリア(Cryptomeria)属(日林誌,68,389−392,
(1986))、ポンシラス(Poncirus)属およびシトラス
(Citrus)属(組織培養,13,288−291,(1987))等の
植物において試みられている。
そして、この方法によれば、作出された不定芽は発
根、馴化等の苗化培養を行なうことにより幼苗を経て植
物体に再生することが可能である。したがって、不定芽
を形成し、さらにはそのものを苗化培養する条件を見出
すことにより、ある一定期間内に大量の幼苗を取得する
ことが可能となる。
しかしながら、クロトン属植物においては不定芽を形
成する方法、およびその不定芽より幼苗を大量に増殖す
る方法が確立されていなかった。
発明が解決しようとする課題 クロトン属植物において幼苗を大量に増殖しようとす
る場合、滅菌が容易であり、茎頂培養に比べ大量に利用
し得る本葉、子葉、または子葉由来カルスから不定芽を
形成し、更にその不定芽より幼苗を大量に増殖する方法
が必要である。
また一方、より優れた形質を保持する植物体を育種す
るためには、通常の育種法に加えて、突然変異処理、細
胞融合、遺伝子導入等の手法を応用あるいは併用する必
要が生ずる。これらの手法は一般にカルス培養を経由す
る。したがって、新たな形質を獲得した植物体を育成す
るためにはカルスより不定芽を形成させる必要がある。
更に、本葉、子葉、または子葉由来カルスから不定芽
を形成させた後に、該不定芽より発根、馴化を経て、ま
たは多芽形成、発根、馴化を経て幼苗を大量に増殖させ
る必要性も生ずる。
本発明者らは、クロトン属植物について鋭意研究した
結果、本葉切片、子葉切片また子葉由来カルスより不定
芽を形成した。併せて該不定芽より発根、馴化を経て、
または多芽形成、発根、馴化を経て幼苗を育成すること
に成功し、本発明を完成した。
課題を解決するための手段 本発明の増殖法は、プラウノトールを含有するクロト
ン属植物の本葉または発芽後の子葉を培養し、直接不定
芽を形成させ、または子葉由来カルスから不定芽を形成
させて、次に発根、馴化を経て、または多芽形成、発
根、馴化を経て幼苗の育成を行なうものである。
本発明の方法を実施するに際しては、クロトン属植物
の本波または種子を播種して得られた発芽直後の子葉を
材料として用いる。また、使用される不定芽形成培地、
カルス誘導培地、多芽形成培地、発根培地としては、例
えば、MS培地、B5培地等の植物組織培養に通常使用され
る基本培地、または培養段階により、これらの培地の組
成を常法により適宜変更したものを用いることができ
る。
更に、全ての培養は全期間にわたり光照射下、本植物
の生育し得る温度条件内において行なうが、好ましくは
照度2000〜8000ルクス、温度25〜30℃の条件下で実施す
る。
本発明を実施するに当たって、採取した本葉または子
葉は、例えばツイーン20、エタノール、次亜塩素酸ソー
ダ等の滅菌剤の希釈液で滅菌し、滅菌水で洗浄する。滅
菌した本葉および子葉は不定芽形成培地に移植、培養す
ることによって不定芽が形成される。また、子葉をカル
ス誘導培地で培養することにより、カルスが誘導され、
このカルスを不定芽形成培地に移植、培養することによ
っても不定芽が形成される。
本葉切片、および子葉切片からの不定芽の形成、なら
びに子葉切片よりの子葉カルスの誘導、培養、次いで子
葉由来カルスからの不定芽の形成は、例えば下記に示し
た方法を用いて行なう。
不定芽形成は、好ましくは植物ホルモンの存在下で静
置培養を行なう。使用される植物ホルモンとしては、例
えば、サイトカイニン類としてカイネチン、6−ベンジ
ルアミノプリン(以下BAPと略す)、ゼアチン、2−イ
ソペンテニルアデニンなど、ジベレリン類としてジベレ
リン酸(以下GA3と略す)など、オーキシン類としてイ
ドール酢酸(以下IAAと略す)、インドール酪酸、β−
ナフタレン酢酸(以下NAAと略す)などをあげることが
できる。その使用量は材料、培地の種類などによって異
なる。
本葉切片よりの不定芽形成には、植物ホルモンとして
例えばNAA0.002〜0.2ppm、BAP2〜10ppmを含む基本固形
培置を用いて静置培養を行なう。
子葉切片よりの不定芽形成には、植物ホルモンとして
例えばNAA0.2〜5ppm、BAP0.2〜5ppmを含む基本固形培地
を用いて静置培養を行なう。
子葉由来カルスよりの不定芽形成には、植物ホルモン
として例えばNAA0.5〜4ppm、BAP0.2〜4ppmを含む基本培
地、または植物ホルモンとして例えばBAP0.1〜2ppmとGA
30.005〜0.5ppmを含む基本固形培地を用いて静置培養を
行なう。
子葉切片よりのカルス誘導および培養は、好ましくは
植物ホルモンの存在下、例えばオーキシン類のNAA0.2〜
5ppm、サイトカイニン類のBAP0.2〜2ppmを含む基本固形
培地を用いて静置培養を行なう。このようにして得られ
た子葉由来カルスは、上記の子葉由来カルスよりの不定
芽形成に用いられる。
以上によって取得された不定芽より、発根、馴化を経
て、または多芽形成、発根、馴化を経て幼苗の増殖を行
なう。
多芽形成は、サイトカイニン類0.1〜5ppmとジベリレ
リン類0.005〜0.1ppmを含有する西岡らの固形培地(Pla
nta medica 48,124−128,(1983))に、取得された不
定芽を移植して静置培養を行なう。サイトカイニン類と
してはカイネチン、BAP、ゼアチン、2−イソペンテニ
ルアデニンなどが用いられる。ジベレリン類としては、
GA3などが用いられる。
そして形成された側芽を2〜3週間ごとにメスとピン
セットを用いて切り取り、同じ培地内の空いてる場所に
植え込む。植え込む場所が無くなれば、同一組成の別の
場所に植え継ぐことも可能である。
次に発根は培地を用いて行なう。発根培地には、寒
天、ジェランガム等のゲル化剤も使用しうるが、繊維素
材に液体培地を含浸させて用いるのが好ましい。繊維素
材としては脱脂綿やガラス繊維等も用いうるが、好適に
はセラミックファイバーを用いるのがよい。
なお、発根培地にゲル化剤を使用した場合にも、発根
を生じることがあるが、繊維素材を用いた培地に比べ
て、発根率は低い。
セラミックファイバーは特開昭62−175170号公報に公
知であり、シリカ・アルミナ系ファイバーが好ましい。
このものは液体培地と反応せず、親水性であり、かさ密
度が0.005〜0.3g/cm3であって、空隙率が大きく、生存
率、シュートの成長度、発根率が上昇する。
液体培地は、基本培地にIAA、インドール酪酸、NAAの
ようなオーキシン類を含有するものを用い、不定芽形成
または多芽形成によって得られたシュートを一本ずつ移
植する。約4週間後には発根する。
馴化は、湿度を徐々に下げ、光量を徐々に上げること
により行なう。
以上によって培養、増殖した幼苗は、品質検査、鉢上
げ後、農場栽培用の苗として提供される。
以下、実施例として、本葉切片より不定芽形成、子葉
切片および子葉カルスよりの不定芽形成、不定芽よりの
発根、不定芽よりの多芽形成および発根、および馴化、
鉢上げについて記載するが、本発明は、これに限定され
るものではない。
(実施例1) 本葉切片よりの不定芽形成 クロトン・スブリラーツス・キュルツの本葉を、70%
エタノール水溶液に5分間浸漬し、さらに次亜塩素酸ソ
ーダ水溶液(塩素濃度0.5%)に20分間浸漬して滅菌処
理を行なった。次いで滅菌水で3回洗浄した後、約3mm
平方の大きさに切断して外植片とし、不定芽形成培地に
置床した。結果を第1表に示す。
不定芽形成培地としては、シュークロース2%を含む
MS培地(pH5.8,ジェランガム0.2%)に第1表に示した
組合せのホルモン(NAAとBAP)を加えたものを用いた。
培養条件は、昼:30℃、約7000ルクス、16時間、夜:25
℃、暗黒下8時間とし、2.5か月間培養した。その結
果、置床した切片の1〜4割に不定芽が形成され、1つ
の切片から1〜5本の不定芽が得られた。
(実施例2) 子葉カルスの誘導 クロトン・スブリラーツス・キュルツの種子をよく洗
浄し、滅菌水で湿潤したセラミックファイバー(バイオ
ファイバーBD2,新日鐵化学株式会社製)上に播種し、
昼:25℃、2000ルクス、12時間、夜:25℃、暗黒下、12時
間の条件下で発芽させた。発芽種子の子葉を切り取り、
滅菌後カルス誘導培地に置床した。滅菌は次亜塩素酸ソ
ーダ水溶液(塩素濃度2%)を用いて、よく撹拌しなが
ら1分間行ない、直ちに滅菌水で2回洗浄した。
カルス誘導培地は、MS培地(pH5.8,シュークロス1
%,ジェランガム0.2%含有)にNAA2ppm、BAP2ppmを添
加したものを用いた。
カルス誘導の培養は昼:30℃、8000ルクス、14時間、
夜:25℃、暗黒下10時間の条件のもとに行なった。子葉
切り口にカルスが誘導された。
その結果、1〜3週間後に子葉カルスが形成された。
(実施例3) 子葉切片よりの不定芽形成 カルスの誘導された子葉13個をそのまま1か月培養し
たところ、そのうちの2個の子葉より不定芽の形成が観
察された。
(実施例4) 子葉由来カルスよりの不定芽形成 不定芽の形成されなかった11個の子葉由来カルスを5
群に分け、カルス部分よりの不定芽の再分化を試みた。
不定芽形成培地としては、シュークロース1%を含む
MS培地(pH5.8,ジェランガム0.2%,もしくは0.8%)に
第2表に示した組合せのホルモン(NAAとBAPの組合せ、
もしくはBAPとGA3の組合せ)を加えたものを用いた。第
2表において、Ggumはジェランガムの濃度(%)を表わ
す。NAA、BAP、GA3はそれぞれの植物ホルモンの濃度(p
pm)を表わす。また結果の分母は検体数を、分子は不定
芽の分化したカルス数をそれぞれ表わす。
この結果、2群と3群において不定芽形成率が高く、
1つのカルスよりそれぞれ1〜3本の不定芽が形成され
た。
(実施例5) 不定芽よりの発根 実施例1で得られた不定芽を、次の3種の発根培地に
20本ずつ移植した。
培地A:培地支持体として5gのバイオファイバーBD2に、
0.005ppmのIAAを添加したMS液体培地(シュークロース
1%含有)50mlを含浸させたもの 培地B:培地支持体としてジェランガム0.2%を含有するM
S固形培地(IAA0.005ppm,シュークロース1%含有) 培地C:培地支持体として寒天0.8%を含有するMS固形培
地(IAA0.005ppm,シュークロース1%含有) 培養条件は、昼:30℃、約7000ルクス、16時間、夜:25
℃、暗黒下8時間とし、2か月間培養した。その結果、
培地Aにおいて3本の不定芽に発根が生じた。培地B及
び培地Cにおいては発根は生じなかった。
(実施例6) 不定芽よりの多芽形成及び発根 実施例4で得られた不定芽を多芽形成培地に移植し
た。多芽形成培地は、MS培地(シュークロース1%,ジ
ェランガム0.8%含有)にBAP1ppmとGA30.05ppmを添加し
たものを用いた。培養条件は、昼:30℃、夜7000ルク
ス、14時間、夜:25℃,暗黒下10時間とした。植え継ぎ
は2週間ごとに行なった。
この結果、8週間後に1本の不定芽より多芽形成を経
て、13〜20本のシュートが得られた。
次に、多芽形成によって得られたシュートを発根培地
に移植した。発根培地は、培地支持体としてバイオファ
イバーBD2を5gに、0.02ppmのIAAを添加したMS液体培地
(シュークロース1%含有)50mlを含浸させたものを用
いた。培養条件は、多芽形成の条件と同一の条件下で行
なった。この結果4週間後に20本のシュートのうち3本
が発根した。
(実施例7) 馴化、鉢上げ 実施例5及び6で発根した約3cmの幼苗は、湿度を徐
々に下げ、光量を徐々に上げることにより馴化した後、
鉢上げを行なった。プラウノトール生産能は、不定芽形
成、多芽形成、発根、鉢上げのいずれの段階においても
保持されていることをガスクロマトグラフィにより確認
した。
発明の効果 本発明により、プラウノトール等を含有するクロトン
属植物を大量に栽培することが可能になり、従来に比べ
て大量のプラウノトールを生産することが期待できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 森本 博幸 栃木県塩谷郡喜連川町大字早乙女字申塚 3377 麒麟麦酒株式会社植物開発研究所 内 (56)参考文献 特開 昭63−44816(JP,A) 特開 昭63−44813(JP,A) 高水準種苗関係技術開発委員会編「組 織培養技術の今後の発展方向−育種及び 種苗の大量増殖への実用化−」日本種苗 協会 S59.3月発行 P.14−17 田中隆荘編集「クローン植物大量生産 の実際技術」シーエムシー、1985.12. 25 第1刷発行 P.25−28 佐藤亨、日林誌、Vol.68,no. 9 P.389−392 (1986)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】プラウノトールを含有するクロトン属植物
    の本葉切片、子葉切片または植物体カルスから不定芽を
    作出する方法において、植物ホルモンとしてサイトカイ
    ニン類とジベレリン類の組合せを含有する不定芽形成培
    地を用いることを特徴とする方法。
  2. 【請求項2】プラウノトールを含有するクロトン属植物
    の不定芽より、多芽形成、発根、馴化を経て幼苗を増殖
    する方法において、植物ホルモンとしてサイトカイニン
    類とジベレリン類の組合せを含有する多芽形成培地を用
    いることを特徴とする方法。
JP63259131A 1988-10-14 1988-10-14 クロトン属植物の不定芽およびその幼苗ならびにその増殖法 Expired - Lifetime JP2659568B2 (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6344813A (ja) * 1986-08-12 1988-02-25 株式会社小松製作所 養液培養装置
JPS6344816A (ja) * 1986-08-12 1988-02-25 株式会社小松製作所 組織培養装置

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
佐藤亨、日林誌、Vol.68,no.9 P.389−392 (1986)
田中隆荘編集「クローン植物大量生産の実際技術」シーエムシー、1985.12.25 第1刷発行 P.25−28
高水準種苗関係技術開発委員会編「組織培養技術の今後の発展方向−育種及び種苗の大量増殖への実用化−」日本種苗協会 S59.3月発行 P.14−17

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