JP2021072852A - 誘導肝細胞およびそれらの使用 - Google Patents

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Yuta Lee
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Abstract

【課題】肝臓関連の疾患を処置する方法を提供する。【解決手段】インビトロで誘導肝細胞に分化するように栄養膜幹（ＴＳ）細胞を誘導する方法であって、栄養膜幹細胞を馴化培地と接触させて、栄養膜幹細胞の誘導肝細胞への分化を誘導することを含み、該馴化培地は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ステロイド、およびサイトカインを含む、方法である。【選択図】図１２−１

Description

関連出願
相互参照
[0001]本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１４年１１月２６日付けで出願された米国仮出願第６２／０８５，１８５号の利益を主張する。
参照による組み入れ
[0002]本明細書で開示される全ての公報、特許、および特許出願は、それぞれ個々の公報、特許、または特許出願が具体的かつ個々に参照により組み入れられるように提示されるのと同じ程度に参照により組み入れられる。本明細書で開示される用語および組み入れられた参考文献に記載の用語との間に矛盾が生じる場合には、本明細書に記載の用語が優先される。
[0003]多くの形態の１つにおいて、インビトロで誘導肝細胞に分化するように栄養膜幹（ＴＳ）細胞を誘導する方法であって、栄養膜幹細胞を馴化培地と接触させて（例えば、十分な時間にわたり）、栄養膜幹細胞の誘導肝細胞への分化を誘導することを含み、馴化培地は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ステロイド、およびサイトカインを含む、上記方法が本明細書で開示される。一部の実施態様において、インビトロで誘導肝細胞に分化するように栄養膜幹（ＴＳ）細胞を誘導する方法であって、（ａ）栄養膜幹細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ステロイド、およびサイトカインを含む馴化培地中で接触させること；および（ｂ）細胞を、十分な時間にわたりインキュベートして、栄養膜幹細胞の誘導肝細胞への分化を誘導することを含む、上記方法が本明細書で開示される。一部の実施態様において、本方法は、馴化培地にステロイドおよびサイトカインを添加する前に、栄養膜幹細胞をＦＧＦと接触させることをさらに含む。一部の実施態様において、馴化培地にステロイドおよびサイトカインを添加する前に、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２０時間、または少なくとも２４時間、栄養膜幹細胞をＦＧＦと接触させる。一部の実施態様において、本方法は、栄養膜幹細胞を、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、または少なくとも７日インキュベートすることをさらに含む。一部の実施態様において、ステロイドおよびサイトカインは、同時または逐次的に馴化培地に添加される。
[0004]一部の実施態様において、本明細書に記載の誘導肝細胞は、肝臓前駆細胞である。一部の実施態様において、ＦＧＦは、ＴＳ細胞において、ｍｉＲＮＡ−１２４ａをアップレギュレートする。一部の実施態様において、ｍｉＲＮＡ−１２４ａの上昇したレベルは、ＴＳ細胞において胚体内胚葉（ＤＥ）の特定化を開始させる。一部の実施態様において、ＤＥの特定化は、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＳＲＹ−ボックス１７（ＳＯＸ１７）、グースコイド（ＧＳＣ）、またはホメオドメインタンパク質ＭＩＸＬ１を含むバイオマーカーと関連する。一部の実施態様において、ＤＥの特定化は、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、およびＧＳＣの上昇した発現レベルに関連する。一部の実施態様において、上昇した発現レベルは、増加したタンパク質発現レベルである。一部の実施態様において、ＤＥの特定化は、ＭＩＸＬ１の減少した発現レベルに関連する。一部の実施態様において、減少した発現レベルは、減少したタンパク質発現レベルである。一部の実施態様において、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、およびＧＳＣの上昇したタンパク質発現レベルならびにＭＩＸＬ１の減少したタンパク質発現レベルは、ＤＥの特定化を受けていない等価なＴＳ細胞におけるＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＧＳＣ、およびＭＩＸＬ１のタンパク質発現レベルと比較したレベルである。一部の実施態様において、ＤＥの特定化は
さらに、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４の上昇した発現レベルに関連する。一部の実施態様において、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４の上昇した発現レベルは、タンパク質発現の増加したレベルである。一部の実施態様において、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４の上昇した発現レベルは、遺伝子発現の増加したレベルである。一部の実施態様において、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４の上昇した発現レベルは、ＤＥの特定化を受けていない等価なＴＳ細胞におけるＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４の発現レベルと比較したレベルである。一部の実施態様において、本明細書に記載の方法により誘導された分化は、４つの段階：原始線条から胚体内胚葉（ＤＥ）への段階、肝臓特異的な内胚葉の段階、肝芽細胞の段階、ならびに胎児および成体の肝細胞の段階の１つまたはそれより多くを含む。一部の実施態様において、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＨＨＥＸ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＢＳＥＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ４α、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーは、４つの段階の１つまたはそれより多くで発現される。一部の実施態様において、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＨＨＥＸ、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーは、原始線条からＤＥへの段階で発現される。一部の実施態様において、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、および／またはＨＨＥＸの発現レベルは、原始線条からＤＥへの段階で、原始線条からＤＥへの段階の前のレベルと比べて増加する。一部の実施態様において、増加した発現レベルは、遺伝子発現の増加したレベルである。一部の実施態様において、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７および／またはＨＨＥＸの発現レベルは、原始線条からＤＥへの段階の前のレベルより約１倍〜約１０，０００倍高く増加する。一部の実施態様において、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７および／またはＨＨＥＸの発現レベルは、原始線条からＤＥへの段階の前のレベルより約１０倍〜約１０００倍高く増加する。一部の実施態様において、ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＣＹＰ７Ａ１、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーは、肝臓特異的な内胚葉の段階で発現される。一部の実施態様において、ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＣＹＰ７Ａ１の発現レベルは、肝臓特異的な内胚葉の段階で、肝臓特異的な内胚葉の段階の前のレベルと比べて増加する。一部の実施態様において、増加した発現レベルは、遺伝子発現の増加したレベルである。一部の実施態様において、ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＣＹＰ７Ａ１の発現レベルは、肝臓特異的な内胚葉の段階の前のレベルより約１倍〜約１０００倍高く増加する。一部の実施態様において、ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＣＹＰ７Ａ１の発現レベルは、肝臓特異的な内胚葉の段階の前のレベルより約１０倍〜約１００倍高く増加する。一部の実施態様において、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＢＳＥＰ、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーは、肝芽細胞の段階で発現される。一部の実施態様において、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＢＳＥＰの発現レベルは、肝芽細胞の段階で、肝芽細胞の段階の前のレベルと比べて増加する。一部の実施態様において、増加した発現レベルは、遺伝子発現の増加したレベルである。一部の実施態様において、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＢＳＥＰの発現レベルは、肝芽細胞の段階の前のレベルより約１倍〜約１０００倍高く増加する。一部の実施態様において、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＢＳＥＰの発現レベルは、肝芽細胞の段階の前のレベルより約１０倍〜約１００倍高く増加する。一部の実施態様において、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ４α、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーは、胎児および成体の肝細胞様細胞の段階で発現される。一部の実施態様において、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、
Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、および／またはＨＮＦ４αの発現レベルは、胎児および成体の肝細胞様細胞の段階で、胎児および成体の肝細胞様細胞の段階の前のレベルと比べて増加する。一部の実施態様において、増加した発現レベルは、遺伝子発現の増加したレベルである。一部の実施態様において、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、および／またはＨＮＦ４αの発現レベルは、胎児および成体の肝細胞の段階の前のレベルより約１０倍〜約１０００倍高く増加する。一部の実施態様において、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、および／またはＨＮＦ４αの発現レベルは、胎児および成体の肝細胞の段階の前のレベルより少なくとも１００倍高く増加する。
[0005]一部の実施態様において、本明細書に記載の栄養膜幹細胞は、ヒト栄養膜幹細胞である。一部の実施態様において、ステロイドは、デキサメタゾンである。一部の実施態様において、サイトカインは、オンコスタチンＭである。一部の実施態様において、オンコスタチンＭは、ヒトオンコスタチンＭである。一部の実施態様において、ヒトオンコスタチンＭは、組換えヒトオンコスタチンＭである。一部の実施態様において、馴化培地は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）をさらに含む。一部の実施態様において、ＢＭＰは、約１〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。一部の実施態様において、ＢＭＰは、約１〜５０ｎｇ／ｍｌ、例えば、約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。一部の実施態様において、ＢＭＰは、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、またはＢＭＰ１５である。一部の実施態様において、ＢＭＰは、ＢＭＰ４である。一部の実施態様において、馴化培地は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をさらに含む。一部の実施態様において、ＨＧＦは、約０．１〜５０ｎｇ／ｍｌまたは約０．１〜２５ｎｇ／ｍｌ、例えば、約５ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
[0006]一部の実施態様において、本明細書で開示される肝細胞は、免疫特権を有する。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、ＴＧＦβ１を発現する。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中でＴＧＦβ１、フィブロネクチン、およびコラーゲンＩＶを発現する。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、ＨＬＡ−Ｇを発現する。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、ＨＬＡ−Ｇおよびｓｔｅｍ−１２１を発現する。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を動員する。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、３次元構造の組織を形成する。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、クラスター化または集合化する。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、三日月形の細胞塊を形成する。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、末梢の区画および中央の区画を含む。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、末梢の区画中において基底膜を超えてＥＣＭに沿って不規則に分布する。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、中央の区画中において基底から中央領域に向かって分布する。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、ＴＧＦβ１、ＨＬＡ−Ｇ、ｓｔｅｍ １２１、Ｃ−ｋｉｔ、ＣＫ１９、ＣＫ１８、ＡＬＢ、α−ＡＦＰ、ベータトロフィン、ＡＤＨ１、ＡＰＯＦ、ＣＰＳ１、ＧＡＴＡ４、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ６、ＡＳＧＲ１、ＣＸＣＲ４、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、Ｃｘ３２、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、ＴＧＦβ１、ＨＬＡ−Ｇ、ｓｔｅｍ １２１、Ｃ−ｋｉｔ、ベータトロフィン、ＡＤＨ１、ＡＰＯＦ、ＣＰＳ１、ＣＹＰ２Ｂ６、ＡＳＧＲ１、ＣＸＣＲ４、Ｃｘ３２、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、ＣＰＳ１、ＣＹＰ２Ｂ６、およびそれらの組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する。
[0007]一形態において、本明細書で開示されるいずれかの方法によって生産された誘導
肝細胞が本明細書において提供される。別の形態において、栄養膜幹細胞から誘導された、単離された誘導肝細胞が本明細書において提供される。別の形態において、栄養膜幹細胞から誘導された、単離された肝細胞が本明細書において提供される。一部の実施態様において、肝細胞は、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、表面抗原分類４（ＣＤ４）、フォークヘッドボックスＰ３（Ｆｏｘｐ３）、ヒト細胞質マーカーのｓｔｅｍ １２１（ｓｔｅｍ １２１）、マスト／幹細胞増殖因子受容体Ｃ−ｋｉｔ（Ｃ−ｋｉｔ）、ベータトロフィン、アポリポタンパク質Ｆ（ＡＰＯＦ）、アルコールデヒドロゲナーゼ−１（ＡＤＨ１）、カルバモイルリン酸シンターゼ１（ＣＰＳ１）、ＧＡＴＡ転写因子４（ＧＡＴＡ４）、シトクロムＰ４５０ファミリー１のサブファミリーＡのポリペプチド１（ＣＹＰ１Ａ１）、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ６（ＣＹＰ２Ｂ６）、アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）、胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）、多剤耐性タンパク質−２（ＭＲＰ２）、コネクシン３２（ＣＸ３２）、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＳＲＹ−ボックス１７（ＳＯＸ１７）、ヘキソサミニダーゼＡアルファポリペプチド（ＨＥＸＡ）、造血系で発現されるホメオボックス（ＨＨＥＸ）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、アルブミン（ＡＬＢ）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）、シトクロムＰ４５０ ７Ａ１（ＣＹＰ７Ａ１）、グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）、セルピンペプチダーゼ阻害剤クレードＡ（アルファ−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン）メンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、ＡＴＰ結合カセットのサブファミリーＣ（ＡＢＣＣ２）、ＣＣＡＡＴ−エンハンサー結合タンパク質ベータ（Ｃ／ＥＢＰβ）、肝細胞核因子１−アルファ（ＨＮＦ１α）、肝細胞核因子４−アルファ（ＨＮＦ４α）、アルファ−１−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、サイトケラチン８（ＣＫ８）、ミトコンドリアのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ２（ＰＣＫ２）、グリコーゲンシンターゼ２（ＧＹＳ２）、肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）、アルコールデヒドロゲナーゼ１Ｃ（クラスＩ）ガンマポリペプチド（ＡＤＨ１Ｃ）、シトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、プロスペロホメオボックス１（ＰＲＯＸ１）、トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ２）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、およびサイトケラチン１９（ＣＫ１９）からなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーを発現する。
[0008]一部の実施態様において、本明細書に記載の肝細胞は、肝臓前駆細胞である。一部の実施態様において、ＦＧＦは、ＴＳ細胞において、ｍｉＲＮＡ−１２４ａをアップレギュレートする。一部の実施態様において、ｍｉＲＮＡ−１２４ａの上昇したレベルは、ＴＳ細胞において胚体内胚葉（ＤＥ）の特定化を開始させる。一部の実施態様において、ＤＥの特定化は、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＳＲＹ−ボックス１７（ＳＯＸ１７）、グースコイド（ＧＳＣ）、またはホメオドメインタンパク質ＭＩＸＬ１を含むバイオマーカーと関連する。一部の実施態様において、ＤＥの特定化は、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、およびＧＳＣの上昇した発現レベルに関連する。一部の実施態様において、上昇した発現レベルは、増加したタンパク質発現レベルである。一部の実施態様において、ＤＥの特定化は、ＭＩＸＬ１の減少した発現レベルに関連する。一部の実施態様において、減少した発現レベルは、減少したタンパク質発現レベルである。一部の実施態様において、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、およびＧＳＣの上昇したタンパク質発現レベルならびにＭＩＸＬ１の減少したタンパク質発現レベルは、ＤＥの特定化を受けていない等価なＴＳ細胞におけるＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＧＳＣ、およびＭＩＸＬ１のタンパク質発現レベルと比較したレベルである。一部の実施態様において、ＤＥの特定化はさらに、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４の上昇した発現レベルに関連する。一部の実施態様において、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４の上昇した発現レベルは、タンパク質発現の増加したレベルである。一部の実施態様において、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４の上昇した発現レベルは、遺伝子発現の増加したレベルである。一部の実施態様において、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４の上昇した発現レベルは、ＤＥ
の特定化を受けていない等価なＴＳ細胞におけるＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４の発現レベルと比較したレベルである。一部の実施態様において、本明細書で開示される肝細胞は、４つの段階：原始線条から胚体内胚葉（ＤＥ）への段階、肝臓特異的な内胚葉の段階、肝芽細胞の段階、ならびに胎児および成体の肝細胞の段階のうち１つにある。一部の実施態様において、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＨＨＥＸ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＢＳＥＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ４α、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーは、４つの段階の１つまたはそれより多くで発現される。一部の実施態様において、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＨＨＥＸ、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーは、原始線条からＤＥへの段階で発現される。一部の実施態様において、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、および／またはＨＨＥＸの発現レベルは、原始線条からＤＥへの段階で、原始線条からＤＥへの段階の前のレベルと比べて増加する。一部の実施態様において、増加した発現レベルは、遺伝子発現の増加したレベルである。一部の実施態様において、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７および／またはＨＨＥＸの発現レベルは、原始線条からＤＥへの段階の前のレベルより約１倍〜約１０，０００倍高く増加する。一部の実施態様において、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７および／またはＨＨＥＸの発現レベルは、原始線条からＤＥへの段階の前のレベルより約１０倍〜約１０００倍高く増加する。一部の実施態様において、ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＣＹＰ７Ａ１、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーは、肝臓特異的な内胚葉の段階で発現される。一部の実施態様において、ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＣＹＰ７Ａ１の発現レベルは、肝臓特異的な内胚葉の段階で、肝臓特異的な内胚葉の段階の前のレベルと比べて増加する。一部の実施態様において、増加した発現レベルは、遺伝子発現の増加したレベルである。一部の実施態様において、ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＣＹＰ７Ａ１の発現レベルは、肝臓特異的な内胚葉の段階の前のレベルより約１倍〜約１０００倍高く増加する。一部の実施態様において、ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＣＹＰ７Ａ１の発現レベルは、肝臓特異的な内胚葉の段階の前のレベルより約１０倍〜約１００倍高く増加する。一部の実施態様において、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーは、肝芽細胞の段階で発現される。一部の実施態様において、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＢＳＥＰの発現レベルは、肝芽細胞の段階で、肝芽細胞の段階の前のレベルと比べて増加する。一部の実施態様において、増加した発現レベルは、遺伝子発現の増加したレベルである。一部の実施態様において、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＢＳＥＰの発現レベルは、肝芽細胞の段階の前のレベルより約１倍〜約１０００倍高く増加する。一部の実施態様において、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＢＳＥＰの発現レベルは、肝芽細胞の段階の前のレベルより約１０倍〜約１００倍高く増加する。一部の実施態様において、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ４α、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーは、胎児および成体の肝細胞様細胞の段階で発現される。一部の実施態様において、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、および／またはＨＮＦ４αの発現レベルは、胎児および成体の肝細胞様細胞の段階で、胎児および成体の肝細胞様細胞の段階の前のレベルと比べて増加する。一部の実施態様において、増加した発現レベルは、遺伝子発現の増加したレベルである。一部の実施態様において、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、および
／またはＨＮＦ４αの発現レベルは、胎児および成体の肝細胞の段階の前のレベルより約１０倍〜約１０００倍高く増加する。一部の実施態様において、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、および／またはＨＮＦ４αの発現レベルは、胎児および成体の肝細胞の段階の前のレベルより少なくとも１００倍高く増加する。一部の実施態様において、栄養膜幹細胞は、ヒト栄養膜幹細胞である。
[0009]一部の実施態様において、本明細書に記載の肝細胞は、免疫特権を有する。一部の実施態様において、肝細胞は、ＴＧＦβ１を発現する。一部の実施態様において、肝細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中でＴＧＦβ１、フィブロネクチン、およびコラーゲンＩＶを発現する。一部の実施態様において、肝細胞は、ＨＬＡ−Ｇを発現する。一部の実施態様において、肝細胞は、ＨＬＡ−Ｇ および ｓｔｅｍ−１２１を発現する。一部の実施態様において、肝細胞は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を動員する。一部の実施態様において、肝細胞は、３次元構造の組織を形成する。一部の実施態様において、肝細胞は、クラスター化または集合化する。一部の実施態様において、肝細胞は、三日月形の細胞塊を形成する。一部の実施態様において、肝細胞は、末梢の区画および中央の区画を含む。一部の実施態様において、肝細胞は、末梢の区画中において基底膜を超えてＥＣＭに沿って不規則に分布する。一部の実施態様において、肝細胞は、中央の区画中において基底から中央領域に向かって分布する。一部の実施態様において、肝細胞は、ＴＧＦβ１、ＨＬＡ−Ｇ、ｓｔｅｍ １２１、Ｃ−ｋｉｔ、ＣＫ１９、ＣＫ１８、ＡＬＢ、α−ＡＦＰ、ベータトロフィン、ＡＤＨ１、ＡＰＯＦ、ＣＰＳ１、ＧＡＴＡ４、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ６、ＡＳＧＲ１、ＣＸＣＲ４、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、Ｃｘ３２、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する。一部の実施態様において、肝細胞は、ＴＧＦβ１、ＨＬＡ−Ｇ、ｓｔｅｍ １２１、Ｃ−ｋｉｔ、ベータトロフィン、ＡＤＨ１、ＡＰＯＦ、ＣＰＳ１、ＣＹＰ２Ｂ６、ＡＳＧＲ１、ＣＸＣＲ４、Ｃｘ３２、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する。一部の実施態様において、肝細胞は、ＣＰＳ１、ＣＹＰ２Ｂ６、およびそれらの組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する。一部の実施態様において、肝細胞は、ｓｔｅｍ １２１、Ｃ−ｋｉｔ、ＣＫ１９、ＣＫ１８、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する。一部の実施態様において、肝細胞は、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ベータトロフィン、ＡＤＨ１、ＡＰＯＦ、ＣＰＳ１、ＧＡＴＡ４、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ６、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する。一部の実施態様において、肝細胞は、ＡＳＧＲ１、ＣＸＣＲ４、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、Ｃｘ３２、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する。
[0010]また、状態の処置または予防で使用するための治療的化合物をスクリーニングする方法であって、本明細書で開示される単離された肝細胞を、治療的化合物と接触させること；および単離された肝細胞中のバイオマーカーの発現レベルを検出することを含む、上記方法も本明細書で開示される。一部の実施態様において、単離された肝細胞中のバイオマーカーの発現レベルは、治療的化合物と接触させていない等価な単離された肝細胞と比較して増加する。一部の実施態様において、単離された肝細胞中のバイオマーカーの発現レベルは、治療的化合物と接触させていない等価な単離された肝細胞と比較して減少する。一部の実施態様において、発現レベルは、遺伝子発現レベルである。一部の実施態様において、バイオマーカーは、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、またはＣＹＰ７Ａ１を含む。一部の実施態様において、治療的化合物は、小分子薬物、ペプチド、またはタンパク質である。一部の実施態様において、治療的化合物は、合成化学薬物である。一部の実施態様において、状態は、肝不全である。一部の実施態様において、状態は、肝臓関連の疾患または障害
である。一部の実施態様において、肝臓関連の疾患または障害は、アラジール症候群、アルファ１抗トリプシン欠乏症、自己免疫肝炎、良性肝腫瘍、胆道閉鎖、硬変症、嚢胞性肝疾患、アルコール関連の肝疾患および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を包含する脂肪性肝疾患、ガラクトース血症、胆石、ギルバート症候群、ヘモクロマトーシス、肝嚢胞、肝臓がん、妊娠中の肝疾患（任意選択で、妊娠性急性脂肪肝、妊娠中の肝内胆汁うっ滞、子癇前症、またはＨＥＬＬＰ症候群（溶血、肝臓検査値の上昇、低い血小板数））、新生児肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、ポルフィリン症、ライ症候群、サルコイドーシス、中毒性肝炎、糖原病１型、チロシン血症、ウイルス性肝炎、ウィルソン病、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
[0011]一形態において、本明細書で開示されるいずれかの肝細胞を含む組成物（例えば、医薬組成物）が本明細書で開示される。
[0012]別の形態において、本明細書に記載の単離された肝細胞を、対象に（例えば、対象の肝臓に）肝細胞を植え付けるのに有効な量で含む医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における状態を処置する方法が本明細書で開示される。一部の実施態様において、肝細胞は、医薬的に許容される担体中で投与される。一部の実施態様において、医薬的に許容される担体は、リン酸緩衝塩類溶液を含む。一部の実施態様において、肝細胞は、１ｍｌ当たり約１×１０６から約１００×１０６個の細胞、１ｍｌ当たり約１×１０６から約２５０×１０６個の細胞、１ｍｌ当たり約１×１０６から約５００×１０６個の細胞、または１ｍｌ当たり約１０×１０６から約４０×１０６個の細胞を含有する懸濁液中で投与される。一部の実施態様において、肝細胞は、約１〜５ｍｌ、約１〜１０ｍｌ、約１〜５０ｍｌ、約１〜１００ｍｌ、または約１０〜１５０ｍｌの体積で投与される。一部の実施態様において、対象は、ヒトである。一部の実施態様において、投与は、注射、例えば、静脈注射を含む。一部の実施態様において、注射は、肝静脈になされる。一部の実施態様において、注射は、肝臓動脈になされる。一部の実施態様において、状態は、肝臓関連の疾患または障害である。一部の実施態様において、状態は、肝不全である。一部の実施態様において、肝臓関連の疾患または障害は、アラジール症候群、アルファ１抗トリプシン欠乏症、自己免疫肝炎、良性肝腫瘍、胆道閉鎖、硬変症、嚢胞性肝疾患、アルコール関連の肝疾患および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を包含する脂肪性肝疾患、ガラクトース血症、胆石、ギルバート症候群、ヘモクロマトーシス、肝嚢胞、肝臓がん、妊娠中の肝疾患（任意選択で、妊娠性急性脂肪肝、妊娠中の肝内胆汁うっ滞、子癇前症、またはＨＥＬＬＰ症候群（溶血、肝臓検査値の上昇、低い血小板数））、新生児肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、ポルフィリン症、ライ症候群、サルコイドーシス、中毒性肝炎、糖原病１型、チロシン血症、ウイルス性肝炎、ウィルソン病、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
[0013]別の形態において、治療用タンパク質を生産するための本明細書に記載の肝細胞を含む組成物の使用が本明細書で開示される。一部の実施態様において、治療用タンパク質は、主要な血漿タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、可溶性血漿フィブロネクチン、α−フェトプロテイン、Ｃ反応性タンパク質、および数種のグロブリン；血流遮断および線維素溶解に関与するタンパク質、例えば凝血カスケードに関与する凝血因子、α２−マクログロブリン、α１−アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＳ、プロテインＣ、プラスミノゲン、α２−抗プラスミン、および補体成分３；担体タンパク質、例えばアルブミン、セルロプラスミン、トランスコルチン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ＩＧＦ結合タンパク質、主要な尿タンパク質、レチノール結合タンパク質、性ホルモン結合グロブリン、トランスチレチン、トランスフェリン、およびビタミンＤ結合タンパク質；ホルモン、例えばインスリン様増殖因子１、トロンボポエチン、ヘプシジン、およびベータトロフィン；プロホルモン、例えばアンギオテンシノゲン；またはアポリポタンパク質を含む。
[0014]また、肝再生のための、本明細書に記載の肝細胞を含む組成物の使用も本明細書で開示される。一部の実施態様において、肝再生は、エクスビボにおける肝再生である。一部の実施態様において、エクスビボにおける肝再生は、バイオプリンティング方法である。一部の実施態様において、バイオプリンティング方法は、３次元バイオプリンティング方法である。
[0015]一形態において、バイオプリンティングのための、本明細書に記載の肝細胞を含む組成物の使用が本明細書で開示される。一部の実施態様において、バイオプリンティングは、３次元バイオプリンティングである。
[0016]また、組織足場の生成のための、本明細書に記載の肝細胞の使用も本明細書で開示される。一部の実施態様において、組織足場は、３次元の組織足場である。
[0017]一形態において、遺伝子治療のための、本明細書に記載の肝細胞を含む組成物の使用が本明細書で開示される。一部の実施態様において、遺伝子治療は、エクスビボにおける遺伝子治療である。
[0018]別の形態において、本明細書に記載の肝細胞から生成した人工組織が本明細書で開示される。一部の実施態様において、組織は、３次元である。一部の実施態様において、組織において血管新生が起こる。
[0019]また、本明細書に記載の肝細胞から生成した人工臓器も本明細書で開示される。
[0020]一部の実施態様において、本明細書で開示される肝細胞、組織、または臓器は、ＡＦＰ、ＡＬＢ、アルファ−１−アンチトリプシン、グルコース、またはグリコーゲンを生産する。一部の実施態様において、肝細胞、組織、または臓器は、脂質、コレステロール、または炭水化物を代謝する。一部の実施態様において、肝細胞、組織、または臓器は、調合薬または有毒物質を代謝する。一部の実施態様において、肝細胞、組織、または臓器は、アンモニアまたは胆汁酸を取り込む。
[0021]一部の実施態様において、本明細書に記載の肝細胞は、初代肝細胞に匹敵する表現型の（例えば、免疫表現型の）特性を有する。一部の実施態様において、本明細書に記載の肝細胞は、初代肝細胞に匹敵する形態学的な特性を有する。一部の実施態様において、本明細書に記載の肝細胞は、初代肝細胞に匹敵する機能特性を有する。
[0022]一部の実施態様において、本明細書で開示される肝細胞、組織、または臓器は、脂肪酸、トリグリセリド、コレステロール、胆汁酸塩、またはリン脂質の合成；外因性または内因性化合物（例えば、薬物、防虫剤、ステロイド、アンモニア、重金属、または毒素）の解毒、改変、および排出；炭水化物の代謝；タンパク質（例えば、血清アルブミン、フィブリノーゲン、リポタンパク質、アポタンパク質、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体、または糖タンパク質）の合成；タンパク質の貯蔵；または胆汁の形成もしくは分泌のうち１つまたはそれより多くの機能を有する。一部の場合において、肝細胞は、肝臓前駆細胞（例えば、肝細胞様細胞）もしくは幹細胞から誘導肝細胞；肝幹細胞；または初代肝細胞（例えば、新たに単離されたかまたは肝臓から得られた無培養の低温保存肝細胞であるかまたはそれに匹敵する）であってもよい。
[0023]一部の実施態様において、子宮外妊娠における細胞塊（ectopic pregnancy mass）（例えば、卵管）から誘導された栄養膜幹細胞が本明細書で開示される。一部の実施態様において、本明細書に記載の栄養膜幹細胞を単離する方法は、子宮外妊娠における細胞塊（例えば、卵管）から栄養膜の絨毛を得る工程；栄養膜の絨毛から細胞を収集する工程；および培養培地中で収集された細胞を培養して、単離された栄養膜幹細胞を得る工程を含む。一部の実施態様において、本方法は、栄養膜の絨毛を細かく切断することをさらに
含む。一部の実施態様において、本方法は、栄養膜の絨毛を酵素で処理することをさらに含む。一部の実施態様において、ヒト栄養膜幹細胞は、細胞に突然変異が導入されるように遺伝子改変されている。一部の実施態様において、妊娠における細胞塊は、破裂させない方式で得られる。一部の実施態様において、妊娠における細胞塊は、７または８週以下の在胎期間におけるものである。一部の実施態様において、培養培地は、フィーダー層非含有である。一部の実施態様において、本方法は、培養培地中で胚様体（embryonic body：ＥＢ）を形成する工程；ＥＢを酵素で処理する工程；および酵素処理したＥＢから細胞を収集して、単離されたヒト栄養膜幹細胞を得る工程をさらに含む。
図１Ａ〜Ｃ。[0024]図１Ａ〜１Ｆは、ＤＥ系統の免疫反応性マーカーを例示する。図１Ａ〜１Ｄは、ｈＴＳ細胞における対照と比較した、４時間のｂＦＧＦ誘導におけるＦＯＸＡ２およびＳＯＸ１７（図１Ａ）、ＧＳＣ（図１Ｂ）、およびＭＩＸＬ１（図１Ｃ）を検出するための免疫細胞化学を示す。図１Ｄは、ｂＦＧＦ誘導の最初の８時間におけるＧＳＣ、ブラキュリ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ１７、およびＦＯＸＡ２などのＤＥ関連の転写因子の経時的なウェスタンブロットを示す。エラーバーは、平均の標準偏差（ＳＤ）を示す。Ｎ＝３、＊：ｐ＜０．０５を統計的に有意とする。図１Ｅは、誘導後４日目におけるＡＦＰおよびアルブミン（上のパネル）ならびにＡＢＣＣ２およびＢＳＥＰ（下のパネル）を示す肝細胞関連の共局在を示す。図１Ｆは、ｈＴＳ細胞におけるウェスタンブロッティングアッセイによる様々な肝細胞特異的なマーカーを示す肝細胞様細胞分化のための２段階レジメンを示す。α−チューブリンはローディング対照である。 図１Ｄ。説明は図１−１の説明を参照。 図１Ｅ。説明は図１−１の説明を参照。 図１Ｆ。説明は図１−１の説明を参照。 [0025]図２Ａ〜２Ｍは、ＤＥの特定化に関する調節分子メカニズムを例示する。図２Ａは、ＣＲＥＢ１がｍｉＲ−１２４ａのｍＲＮＡのプロモーターにおける３つの部位を標的化することを同定するｍｉＲ−１２４ａ分析（ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ）を表す。コンセンサスｍｉＲ−１２４ａの結合部位の略図（上のパネル）。Ｃ：抗体なしの対照。エラーバーは、３回反復のＳＤを示す。図２Ｂは、ＣＲＥＢ１のノックダウンが、ｂＦＧＦによって誘導されたｍｉＲ−１２４ａ発現を低減することを免疫ブロッティングアッセイによって例示する。エラーバーは、３回反復のＳＤを示す。＊：ｐ＜０．０５。図２Ｃは、８時間の誘導中における蛍光体（ｐ）−ＣＲＥＢ１およびｍｉＲＮＡ−１２４ａのｂＦＧＦによって誘導された発現をｑＰＣＲアッセイにより示す。エラーバーは、４つの複製のＳＤを示す。図２Ｄは、ｍｉＲ−１２４ａが、プロモーターの２つの部位を標的化することを介してＳｍａｄ４発現を抑制することをルシフェラーゼレポーターアッセイによって同定するＳｍａｄ４のＣｈＩＰ−ｑＰＣＲを示す。コンセンサスｍｉＲ−１２４ａの結合部位の略図（上のパネル）。空のベクターは対照である；ｐＳｍａｄ４はＳｍａｄ４プラスミドを表し、エラーバーは、３回反復のＳＤを示す。＊：ｐ＜０．０５。図２Ｅは、ＤＥ関連の転写因子の発現への、ｂＦＧＦ、ｍｉＲ−１２４ａ、および抗ｍｉＲ−１２４ａ抗体の作用をウェスタンブロットによって示す。β−アクチンをローディング対照として使用した。図２Ｆは、ｓｈＲＮＡを使用したＳｍａｄ４のノックダウンがＳｍａｄ４およびＭＩＸＬ１の発現を抑制することをウェスタンブロットによってを示す。β−アクチンをローディング対照として使用した。図２Ｇおよび図２Ｈは、４時間の誘導におけるルシフェラーゼレポーターアッセイによって、ｍｉＲ−１２４ａにより阻害性ＧＳＫ３βを同定するＣｈＩＰ−ｑＰＣＲアッセイを示し（図２Ｇ）、一方でｑＰＣＲアッセイは、β−カテニンによって阻害性ＦＯＸＡ２を示した（図２Ｈ）。コンセンサスｍｉＲ−１２４ａの結合部位の略図（Ｇ、上のパネル）。空のベクターは対照である；ｐＧＳＫ３βはＧＳＫ３βプラスミドを表し、エラーバーは、３回反復のＳＤを示す。＊：ｐ＜０．０５。図２Ｉは、ルシフェラーゼレポーターアッセイによって、ｍｉＲ−１２４ａにより阻害性ＣＤＸ２を同定するＣｈＩＰ−ｑＰＣＲアッセイを示す。コンセンサスｍｉＲ−１２４ａの結合部位の略図（上のパネル）。空のベクターは対照である；ｐＣＤＸ２はＣＤＸ２プラスミドを表し、エラーバーは、３回反復のＳＤを示す。＊：ｐ＜０．０５。図２Ｊは、ｈＴＳ細胞での４時間のｂＦＧＦ誘導におけるＣＤＸ２とＯＣＴ４との相互の阻害メカニズムを解明したイメージングを示す。図２Ｋは、ＤＥ分化中における多能性転写因子ＣＤＸ２およびＯＣＴ４（上のパネル）ならびにＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２（下のパネル）のタイムラインにおけるウェスタンブロットを示す。エラーバーは、３回反復のＳＤを示す。＊：ｐ＜０．０５。図２Ｌは、ＳＯＸ１７遺伝子のプロモーターの２つの部位におけるＯＣＴ４の結合を同定するＣｈＩＰ−ｑＰＣＲアッセイを示す。エラーバーは、３回反復のＳＤを示す。図２Ｍは、ｈＴＳ細胞のＤＥ系統への分化におけるｂＦＧＦ誘導の概略図を示す。 図２Ａの説明と同じ。 図２Ａの説明と同じ。 図２Ａの説明と同じ。 図２Ａの説明と同じ。 図２Ａの説明と同じ。 図２Ａの説明と同じ。 図２Ａの説明と同じ。 図２Ａの説明と同じ。 図２Ａの説明と同じ。 図２Ａの説明と同じ。 図２Ａの説明と同じ。 図２Ａの説明と同じ。 [0026]図３Ａ〜３Ｃは、肝細胞様細胞の形態形成を例示する。図３Ａは、誘導の６〜８日目に板状の組織構造を形成する、分化における細胞の形態学的変化を示す。図３Ｂは、以下の基礎構造：大きい細胞質／細胞核の比率、多量のミトコンドリア（ｍ）、ゴルジ装置（Ｇｉ）、よく組織化された小胞体（ＲＥＲ）、毛細胆管の内腔（Ｃｎ）を形成するための接着複合体（白色の矢印）、残りの細胞外空間からの空間を密封する接着複合体（二重の矢印）、細胞質における層状の内包物、およびデスモソーム結合（矢印）を明らかにした電子顕微鏡写真を示す。図３Ｃは、肝臓の板状の組織の免疫組織化学を示し、肝細胞の免疫反応性細胞膜マーカー：ＣＸＣＲ４、ＣＸ３２、ＢＳＥＰ、およびＭＲＰ２（ＡＢＣＣ２）ならびに細胞質マーカー：ベータトロフィン、ＨＮＦ４α、アルブミン、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｂ６、ＡＰＯＦ、ＣＰＳ１、およびＡＤＨ１を示す。 図３Ａの説明と同じ。 図３Ａの説明と同じ。 [0027]図４Ａ〜４Ｄは、分化した肝細胞様細胞の肝機能を例示する。図４Ａは、自動分析器（日立７０８０；東京、日本）によって測定された、分化した肝細胞様細胞（４日）の、アルブミンおよび尿素などの培地中におけるタンパク質分泌能力の提示を示す。エラーバーは、３回反復のＳＤを示す。＊＊：ｐ＜０．０１。図４Ｂおよび図４Ｃは、ＬＤＬの取り込みアッセイを示し、免疫反応性ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ、中央のパネル）およびＬＤＬの染色（左のパネル）（図４Ｂ）、ならびに分化した肝細胞様細胞における脂肪滴を示すオイル−Ｏ−レッド試験（図４Ｃ）を例示する。図４Ｄは、グリコーゲン貯蔵試験を示し、それにおいて細胞中のグリコーゲンの存在は、肝細胞様細胞（左の３つのパネル）および肝臓の板状の組織（右のパネル）における、グリコーゲンを消化するためのジアスターゼによって証明された（上のパネル）、および蛍光ＰＡＳ染色によって確認された（下のパネル）過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色によって同定される。 図４Ａの説明と同じ。 図４Ａの説明と同じ。 図４Ａの説明と同じ。 [0028]図５Ａ〜５Ｉは、分化した肝細胞様細胞における様々なＣＹＰ４５０酵素活性を例示する。フェーズＩ〜ＩＩのＣＹＰ４５０酵素活性は、ＣＹＰ１Ａ２（図５Ａ）、ＣＹＰ２Ｂ６（図５Ｂ）、ＣＹＰ２Ｃ８（図５Ｃ）、ＣＹＰ２Ｃ９（図５Ｄ）、ＣＹＰ２Ｃ１９（図５Ｅ）、ＣＹＰ２Ｄ６（図５Ｆ）、ＣＹＰ２Ｅ１（図５Ｇ）、ＣＹＰ３Ａ４（図５Ｈ）、およびＣＹＰ７Ａ１（図５Ｉ）を包含する薬物−薬物相互作用および解毒試験（誘導物質、阻害剤）によって推測される。使用された誘導物質および阻害剤はそれぞれ、（リファンピン、Ｒｉｆおよびシプロフロキサシン、Ｃｉｐ）、（フェノバルビタール、ｐｈｅｎおよびＣｉｐ）、（Ｒｉｆおよびゲムフィプロジル、Ｇｅｍ）、（ＲｉｆおよびＧｅｍ）、（Ｒｉｆおよびチクロピジン、Ｔｉｃｏ）、（誘導物質単独としてＲｉｆ）、（誘導物質単独としてＲｉｆ）、（Ｒｉｆ、およびイトラコナゾール、Ｉｔｒａ）、ならびに（ＴＨＡ、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノンおよびＣＤＣＡ、ケノデオキシコール酸）である。ｈＴＳはｈＴＳ細胞を表し、ｈＴＨＬはヒト栄養膜から誘導された肝細胞様細胞を表し；Ｈｕｈ７はヒト肝癌Ｈｕｈ７細胞を表す。 図５Ａの説明と同じ。 図５Ａの説明と同じ。 図５Ａの説明と同じ。 図５Ａの説明と同じ。 図５Ａの説明と同じ。 図５Ａの説明と同じ。 図５Ａの説明と同じ。 図５Ａの説明と同じ。 [0029]図６は、肝細胞分化の異なる段階におけるバイオマーカーの発現（例えばｍＲＮＡ）を示す表を例示する。 [0030]図７は、ＴｉｓｓｕｅＦＡＸ分析によるＤＥ形成の細胞プロセスを例示する。ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を使用して、ＭＩＸＬ１のアップレギュレーション（黒色）によって表されるｈＴＳ細胞の内中胚葉への分化を誘導した。その後、内中胚葉は、約４時間の誘導で、ＭＩＸＬ１のダウンレギュレーション（灰色）を表すＤＥ系統に分化した。ｎは、計数された細胞の総数を表す。 [0031]図８は、本明細書で説明されるバイオマーカーの発現レベルの分析を例示する。図８Ａは、ＦＧＦＲ阻害剤（ＰＤ１６６８６６）が、ｂＦＧＦによって誘導されたＰＩ３Ｋをブロックすることを例示し、β−アクチンはローディング対照である。図８Ｂは、ＰＩ３ＫのｓｉＲＮＡは、ＰＩ３Ｋおよびｐ−ＡＫＴの発現を阻害することを例示する。非特異的なｓｈＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を対照として使用した。β−アクチンを、ローディング対照として使用した。図８Ｃは、ＡＫＴサブユニットに対するｓｉＲＮＡは、ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＣＲＥＢ１のｂＦＧＦによって誘導された発現を阻害することを示す。非特異的なｓｈＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を対照として使用した。β−アクチンを、ローディング対照として使用した。図８Ｄは、ＩＰアッセイによれば、ＡＫＴは、ＣＲＥＢ１と直接的に相互作用することを示す。 図８Ａの説明と同じ。 図８Ａの説明と同じ。 図８Ａの説明と同じ。 [0032]図９は、ｈＴＳ細胞におけるｑＰＣＲ分析による誘導後の肝臓の発達に関連する３１種の遺伝子の遺伝学的変動のプロファイルを例示する。 図９Ａの説明と同じ。 図９Ａの説明と同じ。 図９Ａの説明と同じ。 図９Ａの説明と同じ。 図９Ａの説明と同じ。 [0033]図１０Ａ〜１０Ｄおよび１０ＡＳ〜１０ＦＳは、ＤＥ形成中の免疫反応性マーカーを例示する。（１０Ａ）最初の誘導（８時間）における原始線条およびＤＥマーカーの代表的なマーカーの経時的なウェスタンブロット分析。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。＊：ｐ＜０．０５を統計的に有意とする。（１０Ｂ）４時間のｂＦＧＦ誘導における、Ｆｏｘａ２およびＳｏｘ１７（左のパネル）、Ｇｓｃ（中央のパネル）、およびＭｉｘｌ１（右のパネル）の免疫細胞化学。（１０Ｃ）ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲによる、ｍｉＲ−１２４ａにおけるプロモーターの３つの部位での標的化において、ＣＲＥＢ１がそのレベルを増加させることの同定（上のパネル）。Ｃ：対照として。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。＊：ｐ＜０．０５を統計的に有意とする。（１０Ｄ）ｂＦＧＦは、ｑＰＣＲアッセイによれば、蛍光体（ｐ）−ＣＲＥＢ１とｍｉＲＮＡ−１２４ａとの平行な発現を誘導する。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝４を表す。＊：ｐ＜０．０５を統計的に有意とする。（１０ＡＳ）シフトは、ＴｉｓｓｕｅＦＡＸ分析による誘導４時間以内の細胞におけるＭｉｘｌ１強度を意味する。ブランク領域は対照として、青色の領域は内中胚葉段階として、赤色の領域はＤＥ段階としてである。（１０ＢＳ）ウェスタンブロッティングによれば、ＦＧＦＲ阻害剤（ＰＤ１６６８６６）は、ｂＦＧＦによって誘導されたＰＩ３Ｋをブロックする。β−アクチンをローディング対照として使用した。（１０ＣＳ）ＰＩ３ＫのｓｉＲＮＡは、ＰＩ３Ｋおよびｐ−Ａｋｔの発現を阻害する。非特異的なｓｈＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を、対照として使用した。β−アクチンをローディング対照として使用した。（１０ＤＳ）Ａｋｔサブユニットに対するｓｉＲＮＡは、ｐ−Ａｋｔおよびｐ−ＣＲＥＢ１のｂＦＧＦによって誘導された発現を阻害する。非特異的なｓｈＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を、対照として使用した。β−アクチンをローディング対照として使用した。（１０ＥＳ）Ａｋｔは、ＩＰアッセイによれば、ＣＲＥＢ１に直接的に相互作用する。（１０ＦＳ）ｂＦＧＦによって誘導されたｍｉＲ−１２４ａは、ＣＲＥＢ１のｓｈＲＮＡを使用することによって阻害される。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。＊：ｐ＜０．０５を統計的に有意とする。 図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０ＡＳ。説明は図１０−１を参照。 図１０ＢＳ、図１０ＣＳ、図１０ＤＳ、図１０ＥＳ、図１０ＦＳ。説明は図１０−１を参照。 [0034]図１１Ａ〜１１Ｉおよび１１ＡＳ〜１１ＣＳは、ＤＥの特定化に関する分子メカニズムを例示する。（１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ）遺伝子のプロモーターを標的化することによりＳｍａｄ４プラスミド（ｐＳｍａｄ４）（Ａ）、ｐＧＳＫ３β（Ｂ）、およびｐＣｄｘ２（Ｃ）の発現を抑制するｍｉＲ−１２４ａのルシフェラーゼレポーターアッセイ（上のパネル）。空のベクター：対照。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。＊：ｐ＜０．０５を統計的に有意とする。（１１Ｄ）ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲアッセイによれば、β−カテニンは、経時的にＦｏｘａ２遺伝子におけるプロモーターの領域（−２．１ｋｂ）に結合する。エラーバーは、３回反復のＳＤを示す。（１１Ｅ）ＣｈＩＰアッセイによれば、Ｆｏｘａ２は、ベータトロフィンのプロモーターを標的化し、１２時間の誘導でベータトロフィンの生産を示す（矢印）。インプット：陽性対照としての全細胞。陰性対照としてのＩｇＧ。（１１Ｆ）ウェスタンブロット分析による、４時間のｂＦＧＦ誘導におけるｍｉＲ−１２４ａおよび抗ｍｉＲ−１２４ａ抗体に応答する様々な転写因子の発現。β−アクチン：ローディング対照。（１１Ｇ）免疫細胞化学的な４時間のｂＦＧＦ誘導におけるＣｄｘ２（緑色）とＯｃｔ４（赤色）との相互の阻害機能。（１１Ｈ）ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲアッセイによれば、Ｏｃｔ４は、ｂＦＧＦ誘導２時間でＳｏｘ１７遺伝子におけるプロモーターの２つの領域（−１および−１．８ｋｂ）に結合する。エラーバーは、３回反復のＳＤを示す。（１１Ｉ）ｈＴＳ細胞のＤＥ分化における分子レギュレーションの概略図。（１１ＡＳ）免疫ブロッティングアッセイによれば、Ｓｍａｄ４のｓｈＲＮＡは、Ｍｉｘｌ１の発現を阻害する。（１１ＢＳ）ＤＥ形成中における経時的なＯｃｔ４、Ｃｄｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２の発現。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。＊：ｐ＜０．０５。（１１ＣＳ）肝細胞様細胞において、免疫反応性のアルブミン（ＡＢＬ）およびＡＦＰが発現される。 図１１Ｅ、図１１Ｆ、図１１Ｇ。説明は図１１−１を参照。 図１１Ｈ、図１１Ｉ、図１１ＡＳ、図１１ＢＳ。説明は図１１−１を参照。 [0035]図１２Ａ〜１２Ｄおよび１２ＡＳは、肝細胞様細胞の生物学的な特徴を例示する。（１２Ａ）三日月形の細胞塊のＨ＆Ｅ染色（左のパネル、挿入図）。多数のクラスター化した細胞は、豊富な小さい胚性前駆細胞様の縮合核を含む細胞を含有する外側の周辺層で不規則に分布していた（右下）。柱状の木のようなＥＣＭが、周辺層から中央領域に放射状に広がる肝細胞様細胞の内層に沿って存在する（右上）。（１２Ｂ）ＣＣｌ４による損傷を受けた肝臓組織における肝細胞様細胞であり、免疫反応性ｓｔｅｍ−１２１陽性細胞（左上）、Ｃ−ｋｉｔ陽性細胞（右上、矢印）、ＣＫ１９（左下、矢印）、およびＣＫ１８（右下、矢印）を示す。（１２Ｃ）組織学的に三日月形の細胞塊で観察された肝臓発達中における様々な特異的な免疫反応性マーカー。細胞表面マーカーが、小さい挿入図で見られる肝細胞の多角形の形状を作り出す。（１２Ｄ）代表的な電子顕微鏡写真であり、上の顕微鏡写真に、大きい細胞質／細胞核の比率、多量のミトコンドリア（ｍ）、小胞体（ｒｅｒ）、脂質滴、ディッセ腔（ＳＤ）、細胞外マトリックス（ｅｃｍ）、細胞核（ｎ）、および洞様血管、左下の顕微鏡写真に、ロゼット形成を伴うグリコーゲン（ｇｌｙ）貯蔵（赤色の丸）を示し、右下の顕微鏡写真は、毛細胆管の内腔（ｂｃ）および接着複合体（上の）および密着結合（下）を示す。（１２ＡＳ）ｈＴＳ細胞の分化中における肝細胞様細胞への経時的な形態学的変化。 図１２Ｄ、図１２ＡＳ、図１２ＢＳ。説明は図１２−１を参照。 [0036]図１３Ａ〜１３Ｂおよび１３ＡＳは、肝細胞様細胞培養培地におけるセクレトミクス（secretomics）を例示する。（１３Ａ）細胞培養前（対照として、左のパネル）および５日の細胞培養後（右のパネル）の培養培地のプロテオーム分析であり、タンパク質の新しい形成が解明される（番号４１３と指定、丸）。（１３Ｂ）誘導前（上のパネル）および５日間の誘導後の、ｈＴＳ細胞で発現された非免疫反応性ＴＧＦβ１、コラーゲンＩＶ（ＣＯＬ４）、およびフィブロネクチン（ＦＮ）であり、それらの共発現は、３Ｄ構造で肝細胞様細胞間の柱状のＥＣＭとして分布する（下のパネル）。（１３ＡＳ）マスコット（Mascot）ＭＳ／ＭＳイオンサーチシステム分析２０１５１００１＿ＬｉＰ＿４１３、トランスフォーミング増殖因子ベータによって誘導されたタンパク質ｉｇ−ｈ３前駆体［ヒト］。 図１３ＡＳ。説明は図１３−１を参照。 [0037]図１４Ａ〜１４Ｅは、肝細胞様細胞の機能的な特徴を例示する。（１４Ａ）自動分析器（日立７０８０；東京、日本）によれば、肝細胞様細胞は、アルブミン（左）および尿素（右；１日間の５ｍＭ塩化アンモニウムの刺激により）を培養された培地に分泌する。エラーバーは、３回反復のＳＤを示す。＊＊：ｐ＜０．０１。（１４Ｂ）ＬＤＬの取り込みアッセイは、細胞中の免疫反応性ＬＤＬ（赤色、左）、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ、緑色、中央）、およびそれらの統合された画像（右）を示す。（１４Ｃ）オイル−Ｏ−レッド試験は、細胞中の脂肪滴（赤色）を示す。（１４Ｄ）グリコーゲン貯蔵試験は、ジアスターゼ処理を使用した過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色によって（上のパネル）、さらには蛍光ＰＡＳ染色によっても（下のパネル）、グリコーゲンの存在（ピンク色および赤色）を同定する。（１４Ｅ）ｑＰＣＲ分析による、２４時間の処理における肝細胞様細胞中の誘導物質（緑色）および阻害剤（ピンク色）に応答する様々なフェーズＩ〜ＩＩのＣＹＰ４５０酵素活性。略語：Ｒｉｆ、リファンピン；Ｃｉｐ、シプロフロキサシン；Ｉｔｒａ、イトラコナゾール；Ｐｈｅｎ、フェノバルビタール；Ｇｅｍ、ゲムフィプロジル；ＴＨＡ、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン；ＣＤＣＡ、ケノデオキシコール酸；およびＴｉｃｏ、チクロピジン。 図１４Ａの説明と同じ。 図１４Ａの説明と同じ。 図１４Ａの説明と同じ。 図１４Ａの説明と同じ。 [0038]図１５Ａ〜１５Ｆは、肝細胞様細胞による静脈内移植の応答性を例示する。（１５Ａ）ＡＳＴおよびＡＬＴの血清レベルは、経時的に、細胞療法グループ（ＣＣｌ４＋細胞；ｎ＝８）において、対照グループ（ＣＣｌ４のみ；ｎ＝８）より高い。データは、平均±標準誤差、ｎ＝を表す。スチューデント検定：＊：ｐ＜０．０１。（１５Ｂ）ｈＴＳ細胞（上）および肝臓組織中に存在する肝細胞様細胞（下）における免疫反応性ｓｔｅｍ−１２１の発現。（１５Ｃ）ＣＣｌ４による損傷を受けた肝臓組織中のＳｔｅｍ−１２１陽性肝細胞であり、細胞変性の特徴を表す（挿入図）。ＰＴは門脈三管を表す。（１５Ｄ）埋め込まれた肝細胞様細胞における免疫反応性のＳｔｅｍ−１２１およびＨＬＡ−Ｇの共発現。バーのスケール：２０μｍ。（１５Ｅ、１５Ｆ）ＣＣｌ４による損傷を受けた肝細胞の免疫細胞化学における免疫反応性ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞（１５Ｅ）および中心静脈の免疫組織化学周辺の免疫反応性ＣＤ４＋細胞（赤色）（１５Ｆ）の分布。 図１５Ａの説明と同じ。 図１５Ａの説明と同じ。 図１５Ａの説明と同じ。 図１５Ａの説明と同じ。 図１５Ａの説明と同じ。
[0039] 本明細書で開示されるのは、栄養膜幹細胞から誘導肝細胞を生成するための、
方法、組成物、細胞、製造プロセス、およびキットである。一部の実施態様において、インビトロで誘導肝細胞に分化するように栄養膜幹（ＴＳ）細胞を誘導する方法であって、（ａ）栄養膜幹細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ステロイド、およびサイトカインを含む馴化培地中で接触させること；および（ｂ）細胞を十分な時間にわたりインキュベートして、栄養膜幹細胞の誘導肝細胞への分化を誘導することを含む、上記方法が、本明細書で説明される。
[0040]また、栄養膜幹細胞から誘導された、単離された誘導肝細胞であって、該単離された誘導肝細胞は、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＳＲＹ−ボックス１７（ＳＯＸ１７）、ヘキソサミニダーゼＡ（アルファポリペプチド）（ＨＨＥＸ）、胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、アルブミン（ＡＬＢ）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）、シトクロムＰ４５０ ７Ａ１（ＣＹＰ７Ａ１）、グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）、セルピンペプチダーゼ阻害剤クレードＡ（アルファ−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン）のメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、ＡＴＰ結合カセットのサブファミリーＣ（ＡＢＣＣ２）、ＣＣＡＡＴ−エンハンサー結合タンパク質ベータ（Ｃ／ＥＢＰβ）、肝細胞核因子１−アルファ（ＨＮＦ１α）、肝細胞核因子４−アルファ（ＨＮＦ４α）、アルファ−１−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ケラチン８（ＫＲＴ８）、ミトコンドリアのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ２（ＰＣＫ２）、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ６（ＣＹＰ２Ｂ６）、グリコーゲンシンターゼ２（ＧＹＳ２）、肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）、ミトコンドリアのカルバモイルリン酸シンターゼ１（ＣＰＳ１）、アルコールデヒドロゲナーゼ１Ｃ（クラスＩ）ガンマポリペプチド（ＡＤＨ１Ｃ）、コネクシン３２（ＣＸ３２）、シトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、プロスペロホメオボックス１（ＰＲＯＸ１）、トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ２）、アポリポタンパク質Ｆ（ＡＰＯＦ）、ケラチン１８（ＫＲＴ１８）、ケラチン１９（ＫＲＴ１９）、または第１９染色体のオープンリーディングフレーム８０（アンジオポエチン様タンパク質８、肝細胞癌関連遺伝子ＴＤ２６、リパシン（ｌｉｐａｓｉｎ））（ベータトロフィン）を含む１つまたはそれより多くのバイオマーカーの発現の上昇したレベルを含む、上記肝細胞も本明細書で説明される。
[0041]さらに、疾患または障害の処置または予防で使用するための化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）本明細書に記載の単離された誘導肝細胞を化合物と接触させること；および（ｂ）単離された誘導肝細胞におけるバイオマーカーの発現レベルを検出することを含む、上記方法が本明細書で説明される。
[0042]加えて、本明細書で開示される単離された誘導肝細胞を含む組成物（例えば医薬組成物）、本明細書で開示される単離された誘導肝細胞を含む組成物（例えば医薬組成物）を生成するための製造プロセス、および本明細書で開示される単離された誘導肝細胞または本明細書で開示される単離された誘導肝細胞を含む組成物を用いて疾患または障害（例えば肝臓関連の疾患または障害）を処置する方法が本明細書で説明される。
[0043]一部の形態において、肝臓発達における初代肝細胞に類似した分子的、遺伝学的、および生物学的な特徴を提示する、子宮外妊娠から誘導されたヒト栄養膜（ｈＴＳ）幹細胞からの肝細胞様細胞の高効率の生成が本明細書で開示される。一部の実施態様において、分化中に胚体内胚葉形成を制御するマイクロＲＮＡ−１２４ａのメカニズムが本明細書で開示される。一部の実施態様において、肝細胞様細胞は、細胞培養中で３Ｄの肝臓の板状の構造を構築して、ＨＬＡ−Ｇを発現し、ＴＧＦβ１を分泌することにより、静脈内への埋め込み後に免疫寛容のために肝臓組織中でＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を維持することができる。一部の実施態様において、本明細書に記載の細胞は、ＣＣｌ４によって誘導された急性肝不全のラットモデルにおいて、肝再生を助け、促進する。一部の実施態様において、本明細書に記載のｈＴＳ細胞から誘導された肝細胞様細胞は、緊急時の肝不全管理または再生医療において適用することができる。一部の実施態様において、１週間以内（例えば、４〜６日）のｈＴＳ細胞の機能的な肝細胞への効率的な２段階の分化が本明細書で開示される。一部の実施態様において、ｍｉＲ−１２４ａは、肝形成中のＤＥ形成を制御する。一部の実施態様において、肝細胞様細胞は、初代肝細胞を模擬した生物学的機能を有する３Ｄの組織構造を構築することが本明細書で開示される。一部の実施態様において、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は単独で、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）−１２４ａの活性化を誘導し、結果として初期分化におけるＤＥの特定化を制御する。一部の実施態様において、ある特定の条件下で、ＤＥは、肝臓内胚葉、それに続いて肝芽細胞を生じさせ、最終的に、初代ヒト肝細胞に類似した遺伝学的、分子的および生物学的な特徴を有する胎児／成体の肝細胞様細胞に分化する。
[0044]一部の形態において、ラット動物モデルにおいて、肝細胞様細胞の静脈内注入は、ＣＣｌ４による損傷を受けた肝臓組織にホーミングし、肝再生を促進することができることが本明細書で開示される。一部の実施態様において、ｈＴＳ細胞とその誘導肝細胞様細胞の両方は、ＨＬＡ−Ｇを発現して、移植後に免疫寛容を獲得することができることが本明細書で開示される。一部の実施態様において、ホーミングした肝細胞様細胞は、ＴＧＦβ１を分泌して、フィブロネクチンおよびコラーゲンの形成を介した傷害後の新しいＥＣＭの構築を助けることが本明細書で開示される。一部の実施態様において、肝細胞様細胞によって分泌されたＴＧＦβ１は、骨髄の線維細胞の肝臓への移動を引き起こし、肝再生のために肝臓星細胞を活性化し、免疫寛容のために肝臓組織中でＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を維持する。
[0045]一部の形態において、肝細胞様細胞は、インビトロで３次元（３Ｄ）の組織構造を構築することができ、このような細胞の静脈内注入は、肝臓のホーミングを引き起こし、肝臓を損傷から保護する。一部の実施態様において、本明細書で使用される組織培養培地組成物は、およそ血清および培養培地を含む。一部の実施態様において、培養培地は、合成卵管培地（Synthetic Oviductal Fluid、ＳＯＦ）、改変イーグル培地（ＭＥＭ）、
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１２、ＩＭＤＭ、アルファ培地、またはマッコイ培地である。一部の実施態様において、血清は、同種血清、自己血清、または異種血清である。一部の実施態様において、ｈＴＳ細胞は、ＤＥ形成（例えば、８時間）後に、線維芽細胞増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ）、ステロイド（例えば、デキサメタゾン）、サイトカイン（例えば、オンコスタチンＭ）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ４）、および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の組合せを用いて培養される。一
部の実施態様において、結果得られた細胞は、分散した線維芽細胞様の細胞を形成する。一部の実施態様において、結果得られた細胞は次第に集合化して、三日月形の細胞塊を形成する。一部の実施態様において、２つの別個の末梢および中央の区画は、３次元（３Ｄ）の組織構造を構築する。一部の実施態様において、末梢部分において、多数のクラスター化した小細胞は、基底膜を超えて細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に不規則に分布する。一部の実施態様において、細胞は、偏心的に配置されていることが多い縮合核、ならびに胚性幹／前駆細胞に類似した好酸性細胞質中に豊富な顆粒および小胞を有する。一部の実施態様において、中央の部分において、多くの独立した柱状のＥＣＭは、両側における細胞の内層により、基底領域から中央領域に向かって分布する。これらの細胞は、豊富な好酸性細胞質を含有し、単一の円形の細胞核中に、肝細胞の表現型を模擬する１または２つの中心的な核小体と共にクロマチンを分散させている。一部の実施態様において、ヒト肝臓における肝細胞板に類似した数個の二核細胞が形成され得る。
[0046]一部の実施態様において、本明細書に記載の肝細胞または肝細胞様細胞は、ｉ）ヒト細胞に関するヒト細胞質マーカーのｓｔｅｍ １２１（商標）、肝臓固有の幹細胞に関するマスト／幹細胞増殖因子受容体Ｃ−ｋｉｔ、胆管細胞に関するＣＫ１９、および肝細胞に関するＣＫ１８；ならびにｉｉ）免疫組織化学的に肝細胞に関する細胞質中の、アルブミン（ＡＬＢ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ベータトロフィン、ＡＤＨ１、ＡＰＯＦ、ＣＰＳ１、ＧＡＴＡ４、ＣＹＰ１Ａ１、およびＣＹＰ２Ｂ６である特異的なマーカーを提示する。一部の実施態様において、ＡＳＧＲ１、ＣＸＣＲ４、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、およびＣｘ３２を包含する表面マーカーのサブセットは、初代ヒト肝細胞に類似した多角形の細胞形状、例えば、大きい細胞質対細胞核の比率、多量のミトコンドリア、よく組織化された小胞体、密着結合、多数の脂質小胞、グリコーゲン貯蔵、接着複合体を含む毛細胆管の拡張した内腔、および多重ＥＣＭなどの初代肝細胞に類似した微細構造を構築する。
[0047]細胞培養された培地中の９つの新たにアップレギュレートされた分泌タンパク質のなかでも、重要なことに、タンパク質（番号４１３）は、マスコットＭＳ／ＭＳイオンサーチシステム（ＥＳＩ−ＱＵＡＤ−ＴＯＦ、ブルカーインパクトＨＤ（Bruker Impact HD）、マトリックスサイエンス（Matrix Science）、米国）によって、ペプチド配列の４６％がマッチしたことにより、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）によって誘導されたタンパク質ｉｇ−ｈ３前駆体（ＴＧＦβ１）であることを予測する。ＴＧＦβ１は、主要な線維形成誘導性の多機能なサイトカインである、自己分泌およびパラ分泌方式の両方として作用し、肝臓星細胞（ＨＳＣ）におけるフィブロネクチンおよびコラーゲン形成を強化する。一部の実施態様において、ＴＧＦβ１は、ＥＣＭ中で発現される。一部の実施態様において、ＴＧＦβ１、フィブロネクチン、およびコラーゲンＩＶは、ＥＣＭ中で共発現される。一部の実施態様において、ＴＧＦβ１、フィブロネクチン、およびコラーゲンＩＶは、肝細胞板における肝細胞の増殖および分化を支えることができる肝細胞様細胞の３Ｄの組織構造中で、ＥＣＭの足場を少なくとも部分的に構成する。
[0048]一部の形態において、肝細胞様細胞は、原始線条、ＤＥ形成、肝臓内胚葉、肝芽細胞、および最終的に肝細胞様細胞を包含する一連の細胞プロセスを介して、多能性ｈＴＳ細胞から効率的に生成することができる。原始線条分化の開始は、最初の誘導（例えば、３０分）時に、ＧＳＣ、ブラキュリ、およびＭｉｘｌ１のアップレギュレーションによって検証することができる。即座に減少したＭｉｘｌ１は、内中胚葉前駆細胞の内胚葉への潜在性に影響を与える可能性がある。さらに、Ｓｏｘ７を発現する細胞は、胚体外の内胚葉には元々存在するがＤＥ系統には存在しない可能性がある。発達が進行するにつれて、Ｓｏｘ１７およびＦｏｘａ２の明らかなアップレギュレーションに加えてＭｉｘｌ１のダウンレギュレーションは、ＤＥの形成を定義することができ、ここでＯｃｔ４は、多能性の維持において、ｈＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から誘導されたＤＥにおけるＮａｎｏｇ
とは異なる主要な役割を果たす。
[0049]一部の形態において、ｍｉＲ−１２４ａの一過性の上昇は、典型的には３’ＵＴＲ中の標的化されたｍＲＮＡへの結合を介して複数の遺伝子発現を転写後に負に調節して、ＤＥの特定化を制御することができる。初期の肝臓分化において、機能的にサイレンシングされたｍｉＲ−１２４ａが存在する可能性がある。その場合、４時間の誘導でピークに達した後にダウンレギュレートされたｍｉＲ−１２４ａは、原腸胚形成で細胞移動が始まり、ｈＥＳ細胞において３つの胚性胚葉が形成される場合のシナリオとの類似性を有する。
[0050]一部の形態において、ＤＥの特定化後の肝臓系統の分化開始は、ｂＦＧＦ、デキサメタゾン、オンコスタチンＭ、ＢＭＰ４、およびＨＧＦの組合せによって達成することができる。段階依存的な遺伝子プロファイルは、肝臓特異的な内胚葉における関与する工程を示す可能性がある（表３、第２列）。例えば、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の発現は、肝臓内胚葉の最初の分化を示唆し、Ｃ／ＥＢＰβとＨｎｆ４αの両方は、尿素回路における最初の肝臓特異的な活性を制御する。α−１−アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１）の発現は、細胞を損傷から保護し、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ４、およびＣＹＰ２Ｂ６などの酵素の代謝活性を促進することができる。これらの事実は、肝臓内胚葉は、初期分化においてコレステロール、薬物、および毒素の代謝が可能であることを表す。Ｓｏｘ１７は、ジンクフィンガータンパク質２０２（ＺＦＰ２０２）を直接誘導して、マスターとなる肝臓遺伝子レギュレーターＨｎｆ４αを抑制することから、Ｓｏｘ１７の離脱は、ＤＥ段階の後におけるＨｎｆ４α発現の開始を促進し、順に、肝細胞の細胞運命を制御する肝臓前駆細胞の特定化を特徴付けた。持続的なＦｏｘａ２は、アルブミン、ＡＦＰ、ミトコンドリアタンパク質ＴＡＴ、およびベータトロフィンの結果として起こる発現に関与する可能性があるが、ベータトロフィン発現は、初期の肝臓分化におけるβ細胞の増殖および脂質代謝の促進における初期の能力を反映する。
[0051]一部の形態において、分化が進むにつれ、ＰＲＯＸ１、Ｇ６ＰＣ、Ｈｎｆ１α、ＡＢＣＣ２、およびＴＤＯ２、加えてＣＫ８、ＣＫ１８、およびＣＫ１９などのサイトケラチンなどの多数の肝臓マーカーが出現し始める。例えばＰＲＯＸ１は、肝芽細胞の移動に必要であり、肝芽細胞においてそれが除去されると、欠陥のある肝細胞特定化を引き起こし、胆管細胞の関与を促進する。ＣＫ８は、ＣＫ１８と重合して上皮の細胞骨格の要素を形成する中間体フィラメントタンパク質であり、プラスミノゲン受容体として作用する。２日から４日の分化の間における肝芽細胞は、それぞれ胆管上皮細胞および肝細胞への分化における二分化能を模擬した、胆管細胞マーカーＣＫ１９ならびに肝臓前駆細胞マーカーＣＫ８およびＣＫ１８を発現することができる（表３）。Ｆｏｘａ２、Ｈｎｆ１α、Ｈｎｆ４α、およびＨｎｆ６などの肝細胞で豊富な転写因子クラスターの発現は、実質性の肝芽細胞を肝細胞に方向付け、肝細胞の成熟を促進する肝芽細胞分化の重大時点に相当する可能性がある。代謝に関して、肝胆汁排出輸送体ＭＲＰ２（ＡＢＣＣ２）および肝臓のギャップジャンクションタンパク質Ｃｘ３２の発現は、細胞膜を通過する様々な分子の輸送を容易にすることができる。しかしながら、ＨＨＥＸのアップレギュレーションは、肝芽細胞における造血能力の存在を意味する可能性がある。
[0052]一部の形態において、埋め込まれたｈＴＳ細胞から誘導された肝細胞様細胞は、静脈内移植後に対象の肝臓に到達するように生存することができる。一部の実施態様において、本明細書に記載の細胞は、ホーミング本能を有する。一部の実施態様において、これらの細胞は、非古典的ＨＬＡクラスＩ分子であるＨＬＡ−Ｇを発現することができ、ＨＬＡ−Ｇは、膜結合するかまたは可溶化されると、異なる免疫細胞タイプ（ＮＫ、Ｔ、Ｂ、単球／樹状細胞）に強く作用して、免疫細胞の表面で発現される阻害性受容体との相互作用を介して先天免疫と適応免疫の両方を阻害する。加えて、これらの肝細胞様細胞は、
着床後にＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞集団を動員することができ、これは、炎症促進性Ｔ細胞の阻害および調節性を有するＴ細胞の誘導による免疫抑制環境の生成に寄与する。一部の実施態様において、ｈＴＳ細胞から誘導された肝細胞様細胞は、免疫特権を有する。
[0053]一部の形態において、肝細胞または肝細胞様細胞を対象に移植するための組成物および方法が本明細書において提供される。一部の実施態様において、対象に、ｈＴＳ細胞によって誘導された肝細胞が注射される（例えば、静脈内、筋肉内、経皮、内視鏡的逆行性注射、または腹腔内に）。一部の実施態様において、対象は、移植前に免疫抑制剤で処置されない。一部の実施態様において、本方法は、免疫抑制剤、例えば、ＦＫ−５０６、シクロスポリン、またはＧＡＤ６５抗体で患者を処置することをさらに含む。
特定の用語
[0054]別段の指定がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、特許請求された主題が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、単に例示的および説明的なものであり、特許請求されたいかなる主題も限定しないことが理解されると予想される。本出願において、単数形の使用は、別段の規定がない限り複数形を包含する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」お
よび「その（the）」は、文章中に明らかな別段の指示がない限り複数形の指示対象を包
含することに留意すべきである。本出願において、「または」の使用は、別段の指定がない限り「および／または」を意味する。さらに、用語「包含すること」、加えて他の形態、例えば「包含する（include）」、「包含する（includes）」、および「包含された」
の使用は、非限定的である。
[0055]本明細書で使用される場合、範囲および量は、「およその（約）」特定の値または範囲、例えば参照された数値の±１５％として表すことができる。約は、正確な量も包含する。したがって「約５μＬ」は、「約５μＬ」に加えて「５μＬ」も意味する。一般的に、用語「約」は、実験誤差以内と予測される量を包含する。
[0056]本明細書で使用される章の見出しは、単に系統化する目的のためであり、説明される主題を限定するものとして解釈されないものとする。
概説
[0057]肝臓は、解毒、タンパク質合成、タンパク質の貯蔵、および消化に必要な生化学的成分の生産などの機能のダイナミックレンジを有する。肝臓は、２つの主要なタイプの細胞、実質および非実質細胞を含む。実質細胞は、肝臓体積の約８０％を占め、肝細胞とも称される。非実質細胞は、肝臓体積の約６．５％に寄与するが、肝臓細胞の総数の約４０％を構成する。一部の場合において、非実質細胞は、洞様血管の肝内皮細胞、クッパー細胞、および肝臓星細胞を含む。
肝細胞
[0058]肝細胞、または実質細胞は、肝臓の機能に関与する。一部の場合において、肝細胞は、タンパク質合成、タンパク質の貯蔵、コレステロール、胆汁酸塩およびリン脂質の合成、胆汁の形成および分泌、炭水化物の代謝、ならびに外因性および内因性物質の解毒、改変、および排出に関与する。
[0059]一部の場合において、肝細胞から合成されるタンパク質としては、主要な血漿タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、可溶性血漿フィブロネクチン、α−フェトプロテイン、Ｃ反応性タンパク質、および数々のグロブリン；血流遮断および線維素溶解に関与するタンパク質、例えば凝血カスケードに関与する凝血因子、α２−マクログロブリン、
α１−アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＳ、プロテインＣ、プラスミノゲン、α２−抗プラスミン、および補体成分３；担体タンパク質、例えばアルブミン、セルロプラスミン、トランスコルチン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ＩＧＦ結合タンパク質、主要な尿タンパク質、レチノール結合タンパク質、性ホルモン結合グロブリン、トランスチレチン、トランスフェリン、およびビタミンＤ結合タンパク質；ホルモン、例えばインスリン様増殖因子１、トロンボポエチン、ヘプシジン、およびベータトロフィン；プロホルモン、例えばアンギオテンシノゲン；ならびにアポリポタンパク質が挙げられる。
[0060]炭水化物の形成、分解、および相互変換に加えて、一部の場合において、炭水化物の代謝はまた、糖新生、グリコーゲン分解、および糖生成も含む。糖新生は、特定のアミノ酸、乳酸塩またはグリセロールからグルコースを合成することである。グリコーゲン分解は、グリコーゲンを分解してグルコースにすることである。糖生成は、グルコースからグリコーゲンを形成することである。
[0061]一部の場合において、肝細胞内の脂質代謝は、コレステロール合成および脂質生成、トリグリセリドまたは脂肪の生産を包含する。
[0062]一部のケースにおいて、組織損傷または組織損失などの傷害の後、肝細胞は、再び細胞周期に入り、増殖と、それに続く損傷部分、例えば障害を受けたまたは失われた組織の再生をもたらすことができる。一部の場合において、肝臓組織除去後、残りの肝細胞は、少なくとも１回、２回、３回、またはそれより多くのＤＮＡ合成を経て、失われた組織質量の再生をもたらす。
[0063]一部の実施態様において、肝細胞は、製薬調査に利用される。一部の実施態様において、これらの調査は、薬物代謝、酵素誘導、肝毒性、肝細胞再生、および移植を包含する。
[0064]肝細胞という用語は、脂肪酸、トリグリセリド、コレステロール、胆汁酸塩、またはリン脂質の合成；外因性または内因性化合物（例えば、薬物、防虫剤、ステロイド、アンモニア、重金属、または毒素）の解毒、改変、および排出；炭水化物の代謝；タンパク質（例えば、血清アルブミン、フィブリノーゲン、リポタンパク質、アポタンパク質、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体、または糖タンパク質）の合成；タンパク質の貯蔵；または胆汁の形成もしくは分泌のうち１つまたはそれより多くの機能を有する肝細胞または肝臓前駆細胞を指す。一部の場合において、肝細胞は、肝臓前駆細胞（例えば、肝細胞様細胞）もしくは幹細胞から誘導された肝細胞；肝幹細胞；または初代肝細胞（例えば、新たに単離されたかまたは肝臓から得られた無培養の低温保存肝細胞であるかまたはそれに匹敵する）であってもよい。
[0065]一部の実施態様において、肝幹細胞は、肝実質の約０．５％〜２．５％を構成する小さい上皮細胞接着分子を発現する（ＥｐＣＡＭを発現する）細胞である。一部の実施態様において、肝細胞としては、これらに限定されないが、胚幹細胞、成体幹細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、単為発生幹細胞、または栄養膜幹細胞が挙げられる。一部の実施態様において、幹細胞は、ヒト幹細胞である。一部の実施態様において、幹細胞は、栄養膜幹細胞である。一部の実施態様において、栄養膜幹細胞は、ヒト栄養膜幹細胞である。一部の実施態様において、ヒト栄養膜幹細胞は、子宮外妊娠から誘導されたヒト栄養膜幹細胞である。一部の場合において、幹細胞から誘導された肝細胞は、誘導肝細胞とも称される。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、ヒト栄養膜幹細胞から誘導される。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、子宮外妊娠から誘導されたヒト栄養膜幹細胞から誘導される。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、肝細胞への分化プロセスを経た栄養膜幹細胞、および分化した栄養膜幹細胞を含む。一部の実施態様において、肝細胞への
分化プロセスを経た栄養膜幹細胞は、未成熟の誘導肝細胞とも称される。一部の実施態様において、分化した栄養膜幹細胞は、成熟した誘導肝細胞とも称される。
[0066]一部の実施態様において、誘導肝細胞は、初代肝細胞と同様に機能する。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、初代肝細胞によって提示される細胞機能を含む。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、例えば、初代肝細胞で観察される、タンパク質合成、タンパク質の貯蔵、コレステロール、胆汁酸塩およびリン脂質の合成、胆汁の形成および分泌、炭水化物の代謝、ならびに外因性および内因性物質の解毒、改変、および排出などの細胞機能に参加する。一部の実施態様において、本明細書に記載の肝細胞は、ＡＳＧＲ１、ＣＸＣＲ４、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、およびＣｘ３２を包含する表面マーカーのサブセットを発現し、初代ヒト肝細胞に類似した多角形の細胞形状、例えば、大きい細胞質対細胞核の比率、多量のミトコンドリア、よく組織化された小胞体、密着結合、多数の脂質小胞、グリコーゲン貯蔵、接着複合体を含む毛細胆管の拡張した内腔、および多重ＥＣＭなどの初代肝細胞に類似した微細構造を構築する。
[0067]一部の場合において、誘導肝細胞から合成されるタンパク質としては、主要な血漿タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、可溶性血漿フィブロネクチン、α−フェトプロテイン、Ｃ反応性タンパク質、および数々のグロブリン；血流遮断および線維素溶解に関与するタンパク質、例えば凝血カスケードに関与する凝血因子、α２−マクログロブリン、α１−アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＳ、プロテインＣ、プラスミノゲン、α２−抗プラスミン、および補体成分３；担体タンパク質、例えばアルブミン、セルロプラスミン、トランスコルチン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ＩＧＦ結合タンパク質、主要な尿タンパク質、レチノール結合タンパク質、性ホルモン結合グロブリン、トランスチレチン、トランスフェリン、およびビタミンＤ結合タンパク質；ホルモン、例えばインスリン様増殖因子１、トロンボポエチン、ヘプシジン、およびベータトロフィン；プロホルモン、例えばアンギオテンシノゲン；ならびにアポリポタンパク質が挙げられる。
[0068]一部の実施態様において、炭水化物の形成、分解、および相互変換などの炭水化物の代謝、糖新生、グリコーゲン分解、糖生成、コレステロール合成および脂質生成を包含する脂質代謝、トリグリセリドまたは脂肪の生産が、誘導肝細胞で観察される。
[0069]一部の実施態様において、誘導肝細胞は、初代肝細胞と類似する微細構造、または細胞構成を含む。一部の場合において、これは、透過型電子顕微鏡画像に基づく比較を介して達成される。
[0070]一部の実施態様において、誘導肝細胞は、薬物代謝、酵素誘導、肝毒性、肝細胞再生、および移植などの製薬調査に利用される。一部の場合において、ＴＳ細胞は、哺乳類ＴＳ細胞である。例示的な哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、フェレット、コウモリ、カンガルー、アザラシ、イルカ、およびヒトが挙げられる。一部の実施態様において、ＴＳ細胞は、ヒトＴＳ（ｈＴＳ）細胞である。
栄養膜幹細胞（ｈＴＳ細胞）
[0071]栄養膜幹細胞（ＴＳ細胞）は、分化した胎盤細胞の前駆体である。一部の場合において、ＴＳ細胞は、胚盤胞の極栄養外胚葉（ＴＥ）または胚体外外胚葉（ＥｘＥ）細胞から誘導される。一部のケースにおいて、ＴＳは、未分化の状況ではインビトロで不確定な増殖が可能であり、インビトロにおける潜在的な多系統分化能を維持することが可能である。
[0072]一部の場合において、ＴＳ細胞は、ファロピウス管から得られる。ファロピウス管は、受精部位であり、子宮外妊娠の一般的な部位であり、そこで、内部細胞塊（ＩＣＭ）と栄養外胚葉との区別などの生物学的な事象、および主要な後成的変化を伴う全能性から多能性へのスイッチが起こる。一部の場合において、これらの観察は、ファロピウス管が、着床前期に胚盤胞関連の幹細胞を回収するためのニッシェ様の貯蔵部位であることの裏付けを提供する。胚盤胞は、初期段階の着床前胚であり、続いて胎芽を形成するＩＣＭ、および栄養膜と呼ばれ、胎盤になる外層を含む。
[0073]一部の実施態様において、ＴＳ細胞は、例えば肝細胞などの前駆細胞の生成に使用される幹細胞である。一部の実施態様において、ＴＳ細胞は、子宮外妊娠から誘導される。一部の実施態様において、ＴＳ細胞は、ヒトＴＳ細胞である。一実施態様において、子宮外妊娠から誘導されるヒトＴＳ細胞は、ヒト胎芽の破壊を含まない。別の実施態様において、子宮外妊娠から誘導されるヒトＴＳ細胞は、生存可能なヒト胎芽の破壊を含まない。別の実施態様において、ヒトＴＳ細胞は、生存可能ではない子宮外妊娠に関連する栄養膜組織から誘導される。別の実施態様において、子宮外妊娠は、保存が不可能である。別の実施態様において、子宮外妊娠は、生存可能なヒト胎芽を生じないと予想される。別の実施態様において、子宮外妊娠は、母親の生命を脅かす。別の実施態様において、子宮外妊娠は、卵管、腹部、卵巣または頸管である。
[0074]正常な胚盤胞の発達中に、ＩＣＭの接触それ自体またはその誘導された拡散可能な「誘導物質」は、極栄養外胚葉における高速の細胞増殖を引き起こして、胚盤胞段階全体にわたり細胞の壁側の領域への動きをもたらし、栄養外胚葉のＩＣＭからの区別の後でさえも継続することができる。ＩＣＭを覆う壁側の栄養外胚葉細胞は、ＩＣＭの「細胞記憶」を保持することができる。埋め込みの開始時に、ＩＣＭとは逆の壁側の細胞は、子宮内膜からの機械的な制約のために分割をやめる。しかしながら、ファロピウス管内に胎芽が配置される子宮外妊娠において、ファロピウス管中に制約は存在しないため、極栄養外胚葉細胞の分割の継続が起こり、停滞した胚盤胞中で胚体外外胚葉（ＥｘＥ）を形成する。一部の場合において、ＥｘＥによって誘導されたＴＳ細胞は、増殖状況で最大２０日間存在する。そのようなものとして、臨床的介入が起こるまで、細胞プロセスは、着床前胚中に不確定な多数のｈＴＳ細胞を生産することができ、このような細胞は、ＩＣＭからの細胞記憶を保持することができる。
[0075]一部の場合において、ＴＳ細胞は、ＩＣＭの特異的な遺伝子（例えばＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＦＧＦ４）および栄養外胚葉の特異的な遺伝子（例えばＣＤＸ２、Ｆｇｆｒ−２、Ｅｏｍｅｓ、ＢＭＰ４）を有し、３つの一次胚葉、中胚葉、外胚葉、および内胚葉の要素を発現する。一部の場合において、ＴＳ細胞は、胚性幹（例えばヒト胚性幹）細胞関連の表面マーカー、例えば特異的な段階の胚性抗原（ＳＳＥＡ）−１、−３および−４、ならびに間充織幹細胞関連のマーカー（ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＫ７およびビメンチン）を発現する。他の例において、造血幹細胞マーカー（ＣＤ３４、ＣＤ４５、α６−インテグリン、Ｅ−カドヘリン、およびＬ−セレクチン）は、発現されない。
誘導肝細胞の調製方法
[0076]ある特定の実施態様において、インビトロで誘導肝細胞に分化するように栄養膜幹（ＴＳ）細胞を誘導する方法であって、栄養膜幹細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ステロイド、およびサイトカインを含む馴化培地中で接触させること；および細胞を十分な時間にわたりインキュベートして、栄養膜幹細胞の誘導肝細胞への分化を誘導することを含む、上記方法が本明細書で開示される。一部の実施態様において、ＴＳ細胞は、ヒトＴＳ（ｈＴＳ）細胞である。一部の実施態様において、ＦＧＦ、ステロイド、およびサイトカインは、ヒトＦＧＦ、ヒトステロイド、およびヒトサイトカインである。
[0077]一部の実施態様において、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、血管新生、創傷治癒、胚発生、および細胞増殖および分化プロセスに関与する増殖因子のファミリーである。一部の場合において、ＦＧＦは、ヘパリン結合タンパク質であり、ヘパリン硫酸プロテオグリカンと相互作用する。一部の場合において、ＦＧＦファミリーの２２種のメンバーがある。例示的なＦＧＦとしては、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２（また、塩基性ＦＧＦまたはｂＦＧＦまたはＦＧＦ−βとしても公知）、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１５／１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、およびＦＧＦ２３が挙げられる。一部の実施態様において、線維芽細胞増殖因子は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、また、ＦＧＦ２またはＦＧＦ−βとしても公知）である。一部の実施態様において、ｂＦＧＦは、ヒトｂＦＧＦである。一部の実施態様において、ヒトｂＦＧＦは、組換えヒトｂＦＧＦ、またはそれらのフラグメントである。
[0078]一部の実施態様において、ＦＧＦは、約０．００１から約５０００ｎｇ／ｍＬの間、約０．０１から約５００ｎｇ／ｍＬの間、約０．１から約１００ｎｇ／ｍＬの間、または約１から約５０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で、培養された培地に導入される。
[0079]一部の場合において、ＦＧＦは、少なくとも０．００１、０．０１、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い濃度で、培養された培地に導入される。一部の実施態様において、ＦＧＦは、最大で０．００１、０．０１、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより低い濃度で、培養された培地に導入される。
[0080]一部の実施態様において、ｂＦＧＦは、約０．００１から約５０００ｎｇ／ｍＬの間の、約０．０１から約５００ｎｇ／ｍＬの間、約０．１から約１００ｎｇ／ｍＬの間、または約１から約５０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で、培養された培地に導入される。
[0081]一部の場合において、ＦＧＦは、少なくとも０．００１、０．０１、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い濃度で、培養された培地に導入される。一部の実施態様において、ｂＦＧＦは、最大で０．００１、０．０１、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより低い濃度で、培養された培地に導入される。
[0082]一部の実施態様において、線維芽細胞増殖因子を、ｈＴＳ細胞を含む培養された培地に導入して、ｈＴＳ細胞分化事象を開始させる。一部の実施態様において、線維芽細胞増殖因子は、ｂＦＧＦである。一部の実施態様において、ステロイドおよびサイトカインは、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）の添加後に、培養された培地に導入される。
[0083]一部の実施態様において、ステロイドは、ストレス応答、免疫応答、炎症のレギュレーション、炭水化物の代謝、タンパク質の異化、血液の電解質レベル、および挙動などの多様な生理学的プロセスに関与する化学物質である。一部の場合において、ステロイ
ドはまた、ステロイドホルモン、例えばグルココルチコイド、鉱質コルチコイド、アンドロゲン、エストロゲン、およびプロゲストーゲンも包含する。一部の実施態様において、ステロイドとしては、これらに限定されないが、ヒドロコルチゾンタイプ、例えばヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、チクソコルトールピバル酸エステル、ブレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、およびプレドニゾン；アセトニド、例えばトリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンアルコール、モメタゾン、アムシノニド、ブデソニド、デソニド、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、およびハルシノニド；ベタメタゾンタイプ、例えばベタメタゾン、リン酸ベタメタゾンナトリウム、デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、およびフルオコルトロン；ハロゲン化された、例えばヒドロコルチゾン−１７−吉草酸エステル、ハロメタゾン、ジプロピオン酸アルクロメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、プレドニカルベート、クロベタゾン−１７−酪酸エステル、クロベタゾール−１７−プロピオン酸エステル、カプロン酸フルオコルトロン、ピバル酸フルオコルトロン、および酢酸フルプレドニデン；不安定性のプロドラッグエステル、例えばヒドロコルチゾン−１７−酪酸エステル、ヒドロコルチゾン−１７−アセポン酸エステル、ヒドロコルチゾン−１７−ブテプレート、シクレソニド、およびプレドニカルベートが挙げられる。一部の実施態様において、ステロイドは、天然に誘導されるステロイドまたは化学的に改変されたステロイドである。一部の実施態様において、ステロイドは、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ブレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンアルコール、またはヒドロコルチゾンである。一部の実施態様において、ステロイドは、デキサメタゾンである。本明細書で使用される場合、用語「デキサメタゾン」は、デキサメタゾンおよびその誘導体を指す。一部の実施態様において、デキサメタゾンは、ｈＴＳ細胞が肝臓系統に分化するように方向付けるために利用される。一部の実施態様において、デキサメタゾンは、ｈＴＳ細胞が肝臓系統に分化するように方向付けるために、別の薬剤と組み合わせて利用される。一部の実施態様において、別の薬剤は、サイトカインである。
[0084]一部の実施態様において、ステロイドは、約０．００１から約１００μＭの間、約０．００５から約５μＭの間、約０．０１から約１μＭの間、または約０．０５から約０．５μＭの間の濃度で、培養された培地に導入される。
[0085]一部の場合において、ステロイドは、少なくとも０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０μＭ、またはそれより高い濃度で、培養された培地に導入される。一部の実施態様において、ステロイドは、最大で０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０μＭ、またはそれより低い濃度で、培養された培地に導入される。
[0086]一部の実施態様において、デキサメタゾンは、約０．００１から約１００μＭの間、約０．００５から約５μＭの間、約０．０１から約１μＭの間、または約０．０５から約０．５μＭの間の濃度で、培養された培地に導入される。
[0087]一部の実施態様において、デキサメタゾンは、少なくとも０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０
．８、０．９、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０μＭ、またはそれより高い濃度で、培養された培地に導入される。一部の実施態様において、デキサメタゾンは、最大で０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０μＭ、またはそれより低い濃度で、培養された培地に導入される。
[0088]一部の実施態様において、サイトカインは、細胞のシグナル伝達に関与する約５〜２０ｄＫａの低分子量タンパク質のカテゴリーである。一部の場合において、サイトカインとしては、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、および腫瘍壊死因子が挙げられる。ケモカインは、細胞の移動をガイドする化学誘引物質としての役割を果たすことができ、４つのサブファミリー：ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３Ｃ、およびＸＣに分類することができる。例示的なケモカインとしては、ＣＣサブファミリーからのケモカイン：ＣＣＬ１、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９（またはＣＣＬ１０）、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、およびＣＣＬ２８；ＣＸＣサブファミリーからのケモカイン：ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、およびＣＸＣＬ１７；ＸＣサブファミリーからのケモカイン：ＸＣＬ１およびＸＣＬ２；およびＣＸ３Ｃサブファミリーからのケモカイン：ＣＸ３ＣＬ１が挙げられる。
[0089]インターフェロン（ＩＦＮ）は、Ｉ型インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、およびＩＦＮ−ω）、ＩＩ型インターフェロン（例えばＩＦＮ−γ）、およびＩＩＩ型インターフェロンを含む。一部の実施態様において、ＩＦＮ−αは、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、およびＩＦＮＡ２１を包含する約１３種のサブタイプにさらに分類される。
[0090]インターロイキンは、白血球（leukocyte）または白血球（white blood cell）
によって発現され、それらはＴおよびＢリンパ球ならびに造血細胞の発生および分化を促進する。例示的なインターロイキンとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、およびＩＬ−３６が挙げられる。
[0091]腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、アポトーシスを調節するサイトカインのグループである。一部の場合において、ＴＮＦファミリー内の約１９種のメンバーがあり、これらに限定されないが、ＴＮＦα、リンフォトキシン−アルファ（ＬＴ−アルファ）、リンフォトキシン−ベータ（ＬＴ−ベータ）、Ｔ細胞抗原ｇｐ３９（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＦＡＳＬ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を包含する。
[0092]一部の実施態様において、デキサメタゾンは、ｈＴＳ細胞が肝臓系統に分化するように方向付けるために、サイトカインと組み合わせて利用される。一部の場合において
、サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、または腫瘍壊死因子である。一部の場合において、サイトカインは、インターロイキンである。一部の実施態様において、デキサメタゾンは、ｈＴＳ細胞が肝臓系統に分化するように方向付けるために、インターロイキンと組み合わせて利用される。一部の実施態様において、インターロイキンは、ＩＬ−６である。一部の場合において、ＩＬ−６はさらに、Ｇｐ１３０受容体サブユニットを介したその相互作用に基づいて追加のサイトカインにグループ分けされる。一部の場合において、ＩＬ−６グループの追加のメンバーは、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ＩＬ−１１、毛様体神経向性因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）、カルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）、および白血病抑制因子（ＬＩＦ）を包含する。一部の実施態様において、デキサメタゾンは、ｈＴＳ細胞が肝臓系統に分化するように方向付けるために、ＩＬ−６と組み合わせて利用される。一部の実施態様において、デキサメタゾンは、ｈＴＳ細胞が肝臓系統に分化するように方向付けるために、ＩＬ−６グループのメンバーと組み合わせて利用される。一部の実施態様において、デキサメタゾンは、ｈＴＳ細胞が肝臓系統に分化するように方向付けるために、ＯＳＭ、ＩＬ−１１、ＣＮＴＦ、ＣＴ−１、ＣＬＣ、またはＬＩＦと組み合わせて利用される。一部の実施態様において、デキサメタゾンは、ｈＴＳ細胞が肝臓系統に分化するように方向付けるために、ＯＳＭと組み合わせて利用される。一部の実施態様において、サイトカインのＩＬ−６グループは、ヒトＩＬ−６サイトカインまたはそれらのフラグメントである。一部の実施態様において、ＯＳＭは、ヒトＯＳＭである。一部の実施態様において、ヒトＯＳＭは、組換えヒトＯＳＭ、またはそれらのフラグメントである。
[0093]一部の実施態様において、サイトカインは、約０．００１から約５０００ｎｇ／ｍＬの間、約０．０１から約５００ｎｇ／ｍＬの間、約０．１から約１００ｎｇ／ｍＬの間、または約１から約５０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で、培養された培地に導入される。
[0094]一部の実施態様において、サイトカインは、少なくとも０．０１、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い濃度で、培養された培地に導入される。一部の実施態様において、サイトカインは、最大で０．０１、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより低い濃度で、培養された培地に導入される。
[0095]一部の実施態様において、ＯＳＭは、約０．００１から約５０００ｎｇ／ｍＬの間、約０．０１から約５００ｎｇ／ｍＬの間、約０．１から約１００ｎｇ／ｍＬの間、または約１から約５０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で、培養された培地に導入される。
[0096]一部の実施態様において、ＯＳＭは、少なくとも０．０１、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い濃度で、培養された培地に導入される。一部の実施態様において、ＯＳＭは、最大で０．０１、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより低い濃度で、培養された培地に導入される。
[0097]一部の実施態様において、線維芽細胞増殖因子（例えばｂＦＧＦ）は、ｈＴＳ細
胞中のバイオマーカーの発現を調節する。一部の実施態様において、バイオマーカーは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）である。一部の実施態様において、バイオマーカーは、ｍｉＲＮＡ−１２４ａである。一部の実施態様において、線維芽細胞増殖因子は、ｂＦＧＦである。一部の実施態様において、ｂＦＧＦは、ｍｉＲＮＡ−１２４ａをアップレギュレートするかまたは活性化する。一部の実施態様において、ｂＦＧＦは、ｍｉＲＮＡ−１２４ａをダウンレギュレートする。
[0098]一部の実施態様において、ｂＦＧＦで処理した栄養膜幹細胞におけるｍｉＲＮＡ−１２４ａの発現レベルは、未処理の栄養膜幹細胞におけるｍｉＲＮＡ−１２４ａの発現レベルと比較される。一部の実施態様において、ｍｉＲＮＡ−１２４ａの発現レベルは、ｂＦＧＦで処理した栄養膜幹細胞において、未処理の栄養膜幹細胞におけるｍｉＲＮＡ−１２４ａの発現レベルと比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００倍であるか、またはそれより高い。一部の実施態様において、ｍｉＲＮＡ−１２４ａの発現レベルは、ｂＦＧＦで処理した栄養膜幹細胞において、未処理の栄養膜幹細胞におけるｍｉＲＮＡ−１２４ａの発現レベルと比べて、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００分の１であるか、またはそれより低い。
[0099]一部の実施態様において、ｍｉＲＮＡ−１２４ａの活性化またはアップレギュレーションは、栄養膜幹細胞において胚体内胚葉（ＤＥ）の特定化を開始させる。一部の実施態様において、ＤＥの特定化は、約０．１から約９６時間の間、約０．５から約３６時間の間、約１から約２４時間の間、約２から約１８時間の間、約４から約１２時間の間、または約６から約１０時間の間に起こる。
[00100]一部の実施態様において、ＤＥの特定化は、ｂＦＧＦで誘導した後、少なくと
も０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６、４８、７２時間、またはそれを超える時間で起こる。一部の実施態様において、ＤＥの特定化は、ｂＦＧＦで誘導した後、最大で０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６、４８、７２時間、またはそれ未満の時間で起こる。一部の実施態様において、ＤＥの特定化は、ｂＦＧＦで誘導した後、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８時間で起こる。一部の実施態様において、ＤＥの特定化は、ｂＦＧＦで誘導した後、約６、７、８、９、または１０時間で起こる。
[00101]一部の実施態様において、ＤＥの特定化は、バイオマーカーのセットに関連す
る。一部の実施態様において、バイオマーカーとしては、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＳＲＹ−ボックス１７（ＳＯＸ１７）、グースコイド（ＧＳＣ）、ホメオドメインタンパク質ＭＩＸＬ１、ＳＲＹ−ボックス２（ＳＯＸ２）、転写因子ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４が挙げられる。一部の実施態様において、ＤＥの特定化は、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＳＲＹ−ボックス１７（ＳＯＸ１７）、グースコイド（ＧＳＣ）、ホメオドメインタンパク質ＭＩＸＬ１、ＳＲＹ−ボックス２（ＳＯＸ２）、転写因子ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４から選択されるバイオマーカーの上昇した発現によって特徴付けられる。一部の実施態様において、ＤＥの特定化は、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＳＲＹ−ボックス１７（ＳＯＸ１７）、グースコイド（ＧＳＣ）、ＳＲＹ−ボックス２（ＳＯＸ２）、転写因子ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４から選択されるバイオマーカーの上昇した発現によって特徴付けられる。一部の実施態様において、ＤＥの特定化は、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＳＲＹ−ボックス１７（ＳＯＸ１７）、グースコイド（ＧＳＣ）、ホメ
オドメインタンパク質ＭＩＸＬ１、ＳＲＹ−ボックス２（ＳＯＸ２）、転写因子ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４から選択されるバイオマーカーの発現の減少によって特徴付けられる。一部の実施態様において、ＤＥの特定化は、ホメオドメインタンパク質ＭＩＸＬ１の発現の減少によって特徴付けられる。
[00102]一部の実施態様において、ｂＦＧＦによって誘導された栄養膜幹細胞における
ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４の発現レベルは、誘導されていない栄養膜幹細胞におけるＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４の発現レベルと比較される。一部の実施態様において、上昇した発現レベルは、増加したタンパク質発現レベルである。一部の実施態様において、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４のタンパク質発現レベルは、未処理の栄養膜幹細胞におけるＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４のタンパク質発現レベルの、約１から約２０，０００倍、約２から約１０００倍、または約１０から約１００倍高い。一部の実施態様において、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４のタンパク質発現レベルは、ｂＦＧＦで処理した栄養膜幹細胞において、未処理の栄養膜幹細胞におけるＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４のタンパク質発現レベルと比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、１０，０００倍であるか、またはそれより高い。一部の実施態様において、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４のタンパク質発現レベルは、ｂＦＧＦで処理した栄養膜幹細胞において、未処理の栄養膜幹細胞におけるＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４のタンパク質発現レベルと比べて最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、１０，０００分の１であるか、またはそれより低い。
[00103]一部の実施態様において、上昇した発現レベルは、増加した遺伝子発現レベル
である。一部の実施態様において、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４遺伝子発現レベルは、未処理の栄養膜幹細胞におけるＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４遺伝子発現レベルより、約１から約２０，０００倍、約２から約１０００倍、または約１０から約１００倍高い。一部の実施態様において、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４遺伝子発現レベルは、ｂＦＧＦで処理した栄養膜幹細胞において、未処理の栄養膜幹細胞におけるＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４遺伝子発現レベルと比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、１０，０００倍であるか、またはそれより高い。一部の実施態様において、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４遺伝子発現レベルは、ｂＦＧＦで処理した栄養膜幹細胞において、未処理の栄養膜幹細胞におけるＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４遺伝子発現レベルと比べて最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、１０，０００分の１であるか、またはそれより低い。
[00104]一部の実施態様において、ステロイドおよびサイトカインのカクテルが、ＤＥ
分化を肝臓系統に方向付けるのに利用される。一部の実施態様において、カクテルは、デキサメタゾンおよびオンコスタチンＭを含み、ＤＥ分化を肝臓系統に方向付けるのに利用される。一部の実施態様において、カクテルは、ｂＦＧＦの添加の前に、その後に、またはそれと同時に、ｈＴＳ細胞を含む培養された培地に導入される。一部の実施態様におい
て、カクテルは、約０．５から約９６時間の間、約１から約４８時間の間、約２から約３６時間の間、約３から約２４時間の間、約４から約１２時間の間、または約６から約１０時間の間に、ｈＴＳ細胞を含む培養された培地に導入される。
[00105]一部の実施態様において、カクテルは、ｂＦＧＦの添加後の、少なくとも０．
５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６、４８、６０、７２時間、またはそれを超える時間に、ｈＴＳ細胞を含む培養された培地に導入される。一部の実施態様において、カクテルは、ｂＦＧＦの添加後の、最大で０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６、４８、６０、７２時間、またはそれ未満の時間に、ｈＴＳ細胞を含む培養された培地に導入される。一部の実施態様において、カクテルは、ｂＦＧＦの添加後の、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８時間に、ｈＴＳ細胞を含む培養された培地に導入される。一部の実施態様において、カクテルは、ｂＦＧＦの添加後の、約６、７、８、９、１０、１１、または１２時間に、ｈＴＳ細胞を含む培養された培地に導入される。
[00106]一部の実施態様において、ｈＴＳ細胞は、ｂＦＧＦ、デキサメタゾンおよびオ
ンコスタチンＭを含む培養された培地中で、約０．５から約１００日の間、約１から約５０日の間、約２から約３０日の間、約３から約１５日の間、または約４から約１２日の間インキュベートされる。
[00107]一部の実施態様において、ｈＴＳ細胞は、ｂＦＧＦ、デキサメタゾンおよびオ
ンコスタチンＭを含む培養された培地中で、少なくとも０．５１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日またはそれより長くインキュベートされる。一部の実施態様において、ｈＴＳ細胞は、ｂＦＧＦ、デキサメタゾンおよびオンコスタチンＭを含む培養された培地中で、最大で０．５１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日またはそれ未満でインキュベートされる。
[00108]一部の実施態様において、栄養膜幹細胞は、肝細胞様細胞発達の４つの段階に
分類される。一部の実施態様において、４つの段階は、原始線条からＤＥへの段階、肝臓特異的な内胚葉、肝芽細胞の段階、ならびに胎児および成体の肝細胞様細胞の段階を包含する。一部の実施態様において、４つの段階のそれぞれは、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＳＲＹ−ボックス１７（ＳＯＸ１７）、ヘキソサミニダーゼＡ（アルファポリペプチド）（ＨＨＥＸ）、胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、アルブミン（ＡＬＢ）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）、シトクロムＰ４５０ ７Ａ１（ＣＹＰ７Ａ１）、グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）、セルピンペプチダーゼ阻害剤クレードＡ（アルファ−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン）のメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、ＡＴＰ結合カセットのサブファミリーＣ（ＡＢＣＣ２）、ＣＣＡＡＴ−エンハンサー結合タンパク質ベータ（Ｃ／ＥＢＰβ）、肝細胞核因子１−アルファ（ＨＮＦ１α）、肝細胞核因子４−アルファ（ＨＮＦ４α）、アルファ−１−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ケラチン８（ＫＲＴ８）、ミトコンドリアのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ２（ＰＣＫ２）、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ６（ＣＹＰ２Ｂ６）、グリコーゲンシンターゼ２（ＧＹＳ２）、肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）、ミトコンドリアのカルバモイルリン酸シンターゼ１（ＣＰＳ１）、アルコールデヒドロゲナーゼ１Ｃ（クラスＩ）ガンマポリペプチド（ＡＤＨ１Ｃ）、コネクシン３２（ＣＸ３２）、シトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、プロスペロホメオボックス１（ＰＲＯＸ１）、トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ２）、アポリポタンパク質Ｆ（ＡＰＯＦ）、ケラチン１８（ＫＲＴ１８）、ケラチン１９（ＫＲＴ１９）、または第１９染色体の
オープンリーディングフレーム８０（アンジオポエチン様タンパク質８、肝細胞癌関連遺伝子ＴＤ２６、リパシン）（ベータトロフィン）を含むバイオマーカーのセットに関連する。一部の実施態様において、４つの段階のそれぞれは、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＨＨＥＸ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＢＳＥＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、またはＨＮＦ４αを含むバイオマーカーのセットに関連する。
[00109]一部の場合において、原始線条からＤＥへの段階は、ｈＴＳ細胞が、肝臓分化
段階に入っていないかまたは肝臓分化段階に入ろうとしている段階である。一部の実施態様において、原始線条からＤＥへの段階におけるｈＴＳ細胞は、ＤＥの特定化を受ける。ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）で誘導した後の一部の場合において、ｈＴＳ細胞は、約０．１から約２４時間の間、約０．５から約１８時間の間、または約１から約１２時間の間、原始線条からＤＥへの段階のままである。ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）で誘導した後の一部の場合において、ｈＴＳ細胞は、最大で０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０時間またはそれ未満の時間、原始線条からＤＥへの段階のままである。ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）で誘導した後の一部の場合において、ｈＴＳ細胞は、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０時間またはそれより長い時間、原始線条からＤＥへの段階のままである。
[00110]一部の場合において、原始線条からＤＥへの段階におけるｈＴＳ細胞は、ＣＸ
ＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、Ｇ６ＰＣ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ４α、ＡＦＰ、ＫＲＴ８、ＰＣＫ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＹＳ２、ＨＮＦ６、ＣＰＳ１、ＡＤＨ１Ｃ、ＣＸ３２、ＣＹＰ３Ａ４、ＰＲＯＸ１、ＴＤＯ２、ＡＰＯＦ、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ１９、およびベータトロフィンから選択されるバイオマーカーのセットで特徴付けられる。一部の実施態様において、原始線条からＤＥへの段階は、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７およびＨＨＥＸから選択されるバイオマーカーのセットに関連する。
[00111]一部の実施態様において、原始線条からＤＥへの段階は、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸ
Ａ２、ＳＯＸ１７およびＨＨＥＸの上昇した発現レベルに関連する。一部の実施態様において、上昇した発現レベルは、増加したタンパク質発現レベルまたは増加した遺伝子発現レベルである。一部の実施態様において、上昇した発現レベルは、増加した遺伝子発現レベルである。一部の実施態様において、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７およびＨＨＥＸの上昇した遺伝子発現レベルは、原始線条からＤＥへの段階に入っていない同等の栄養膜幹細胞におけるＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７およびＨＨＥＸの遺伝子発現レベルと比べたものである。一部の実施態様において、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７およびＨＨＥＸの上昇した遺伝子発現レベルは、約０．１から約１０，０００、約１から約５０００、または約２から約１０００倍である。一部の実施態様において、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７およびＨＨＥＸの上昇した遺伝子発現レベルは、原始線条からＤＥへの段階に入っていない同等のｈＴＳ細胞におけるＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７およびＨＨＥＸの遺伝子発現レベルと比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、５０００倍であるか、またはそれより高い。一部の実施態様において、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７およびＨＨＥＸの遺伝子発現レベルは、原始線条からＤＥへの段階に入っていない同等のｈＴＳ細胞におけるＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７およびＨＨＥＸの遺伝子発現レベルと比べて、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、５０００分の１であるか、またはそれより低い。
[00112]一部の場合において、肝臓特異的な内胚葉は、肝臓の特定化後における上皮細
胞の第１の出現を特徴付ける。一部の実施態様において、肝臓特異的な内胚葉の段階は、
ステロイド（例えばデキサメタゾン）およびサイトカイン（例えばオンコスタチンＭ）のカクテルの添加により開始される。一部の場合において、ステロイド（例えばデキサメタゾン）およびサイトカイン（例えばオンコスタチンＭ）のカクテルは、約１から約４８時間の間、約２から約２４時間の間、約３から約１８時間の間、または約４から約１２時間の間に、培養された培地に添加される。一部の場合において、ステロイド（例えばデキサメタゾン）およびサイトカイン（例えばオンコスタチンＭ）のカクテルは、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）で誘導した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６時間、またはそれを超える時間で培養された培地に添加される。一部の場合において、ステロイド（例えばデキサメタゾン）およびサイトカイン（例えばオンコスタチンＭ）のカクテルは、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）で誘導した後、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６時間、またはそれ未満の時間で、培養された培地に添加される。
[00113]ステロイド（例えばデキサメタゾン）およびサイトカイン（例えばオンコスタ
チンＭ）のカクテルで誘導した後の一部のケースにおいて、ｈＴＳ細胞は、約１から約７２時間の間、約２から約３６時間の間、約３から約２４時間の間、または約４から約１２時間の間、肝臓特異的な内胚葉の段階のままである。ステロイド（例えばデキサメタゾン）およびサイトカイン（例えばオンコスタチンＭ）のカクテルで誘導した後の一部のケースにおいて、ｈＴＳ細胞は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６時間、またはそれを超える時間、肝臓特異的な内胚葉の段階のままである。ステロイド（例えばデキサメタゾン）およびサイトカイン（例えばオンコスタチンＭ）のカクテルで誘導した後の一部のケースにおいて、ｈＴＳ細胞は、最大で６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６時間、またはそれ未満の時間、肝臓特異的な内胚葉の段階のままである。
[00114]一部の場合において、肝臓特異的な内胚葉の段階におけるｈＴＳ細胞は、ＣＸ
ＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、Ｇ６ＰＣ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ４α、ＡＦＰ、ＫＲＴ８、ＰＣＫ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＹＳ２、ＨＮＦ６、ＣＰＳ１、ＡＤＨ１Ｃ、ＣＸ３２、ＣＹＰ３Ａ４、ＰＲＯＸ１、ＴＤＯ２、ＡＰＯＦ、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ１９、およびベータトロフィンから選択されるバイオマーカーのセットで特徴付けられる。一部の実施態様において、肝臓特異的な内胚葉は、ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、およびＣＹＰ７Ａ１から選択されるバイオマーカーのセットに関連する。
[00115]一部の実施態様において、肝臓特異的な内胚葉は、ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬ
Ｂ、ＴＡＴ、およびＣＹＰ７Ａ１の上昇した発現レベルに関連する。一部の実施態様において、上昇した発現レベルは、増加したタンパク質発現レベルまたは増加した遺伝子発現レベルである。一部の実施態様において、上昇した発現レベルは、増加した遺伝子発現レベルである。一部の実施態様において、ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、およびＣＹＰ７Ａ１の上昇した遺伝子発現レベルは、肝臓特異的な内胚葉の段階に入っていない同等の栄養膜幹細胞におけるＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、およびＣＹＰ７Ａ１の遺伝子発現レベルと比べたものである。一部の実施態様において、ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、およびＣＹＰ７Ａ１の遺伝子発現レベルは、約１から約１０，０００倍の間、約２から約１０００倍の間、または約２から約１００倍の間である。一部の実施態様において、ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、およびＣＹＰ７Ａ１の遺伝子発現レベルは、肝臓特異的な内胚葉の段階に入っていない同等の栄養膜幹細胞におけるＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、およびＣＹＰ７Ａ１の遺伝子発現レベルと比べて、少なく
とも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、５０００倍であるか、またはそれより高い。一部の実施態様において、ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、およびＣＹＰ７Ａ１の遺伝子発現レベルは、肝臓特異的な内胚葉の段階に入っていない同等の栄養膜幹細胞におけるＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、およびＣＹＰ７Ａ１における遺伝子発現レベルと比べて、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、５０００分の１であるか、またはそれより低い。
[00116]一部の実施態様において、ｈＴＳ細胞は、ステロイド（例えばデキサメタゾン
）およびサイトカイン（例えばオンコスタチンＭ）のカクテルを添加した後、約１から約３６時間、約３から約２４時間、または約６から約１２時間に、肝芽細胞の段階に入る。一部の実施態様において、ｈＴＳ細胞は、ステロイド（例えばデキサメタゾン）およびサイトカイン（例えばオンコスタチンＭ）のカクテルを添加した後、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間に、肝芽細胞の段階に入る。
[00117]一部の実施態様において、ｈＴＳ細胞は、約１から約３０日の間、約２から約
１２日の間、または約３から約７日の間、肝芽細胞の段階のままである。一部の実施態様において、ｈＴＳ細胞は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８日またはそれ未満、肝芽細胞の段階のままである。一部の実施態様において、ｈＴＳ細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８日またはそれより長く、肝芽細胞の段階のままである。
[00118]一部の場合において、肝芽細胞の段階におけるｈＴＳ細胞は、ＣＸＣＲ４、Ｆ
ＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、Ｇ６ＰＣ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ４α、ＡＦＰ、ＫＲＴ８、ＰＣＫ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＹＳ２、ＨＮＦ６、ＣＰＳ１、ＡＤＨ１Ｃ、ＣＸ３２、ＣＹＰ３Ａ４、ＰＲＯＸ１、ＴＤＯ２、ＡＰＯＦ、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ１９、およびベータトロフィンから選択されるバイオマーカーのセットで特徴付けられる。一部の実施態様において、肝芽細胞の段階は、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、およびＢＳＥＰから選択されるバイオマーカーのセットに関連する。
[00119]一部の実施態様において、肝芽細胞の段階は、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹ
Ｐ７Ａ１、およびＢＳＥＰの上昇した発現レベルに関連する。一部の実施態様において、上昇した発現レベルは、増加したタンパク質発現レベルまたは増加した遺伝子発現レベルである。一部の実施態様において、上昇した発現レベルは、増加した遺伝子発現レベルである。一部の実施態様において、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、およびＢＳＥＰの上昇した遺伝子発現レベルは、肝芽細胞の段階に入っていない同等のｈＴＳ細胞におけるＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、およびＢＳＥＰの遺伝子発現レベルと比べたものである。一部の実施態様において、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、およびＢＳＥＰの遺伝子発現レベルは、約１から約１０，０００倍の間、約２から約１０００倍の間、または約２から約１００倍の間である。
[00120]一部の実施態様において、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、およびＢ
ＳＥＰの遺伝子発現レベルは、肝芽細胞の段階に入っていない同等のｈＴＳ細胞におけるＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、およびＢＳＥＰの遺伝子発現レベルと比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００倍であるか、またはそれより高い。一部の実施態様において、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、およびＢＳＥＰの遺伝子発現レベルは、肝芽細胞の段階に入っていない同等のｈＴＳ細胞におけるＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、およびＢＳＥＰの遺伝子発現レベルと比べて、最大
で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００分の１であるか、またはそれより低い。
[00121]一部の場合において、ｈＴＳ細胞は、ステロイド（例えばデキサメタゾン）お
よびサイトカイン（例えばオンコスタチンＭ）のカクテルを添加した後、約１から約２０日の間、約２から約１０日の間、または約３から約６日の間に、胎児および成体の肝細胞様の段階に入る。一部の場合において、ｈＴＳ細胞は、ステロイド（例えばデキサメタゾン）およびサイトカイン（例えばオンコスタチンＭ）のカクテルを添加した後、約１、２、３、４、５、または６日に、胎児および成体の肝細胞様の段階に入る。
[00122]一部の実施態様において、ｈＴＳ細胞は、約１から約１００日の間、約２から
約５０日の間、約３から約３０日の間、約４から約１２日の間、または約６から約１０日の間、胎児および成体の肝細胞様の段階のままである。一部の実施態様において、ｈＴＳ細胞は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、６０日またはそれ未満、胎児および成体の肝細胞様の段階のままである。一部の実施態様において、ｈＴＳ細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、６０日またはそれより長く、胎児および成体の肝細胞様の段階のままである。
[00123]一部の場合において、胎児および成体の肝細胞様の段階におけるｈＴＳ細胞は
、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、Ｇ６ＰＣ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ４α、ＡＦＰ、ＫＲＴ８、ＰＣＫ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＹＳ２、ＨＮＦ６、ＣＰＳ１、ＡＤＨ１Ｃ、ＣＸ３２、ＣＹＰ３Ａ４、ＰＲＯＸ１、ＴＤＯ２、ＡＰＯＦ、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ１９、およびベータトロフィンから選択されるバイオマーカーのセットで特徴付けられる。一部の実施態様において、胎児および成体の肝細胞様細胞の段階は、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、およびＨＮＦ４αから選択されるバイオマーカーのセットに関連する。
[00124]一部の実施態様において、胎児および成体の肝細胞様細胞の段階は、ＨＨＥＸ
、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、およびＨＮＦ４αの上昇した発現レベルに関連する。一部の実施態様において、上昇した発現レベルは、増加したタンパク質発現レベルまたは増加した遺伝子発現レベルである。一部の実施態様において、上昇した発現レベルは、増加した遺伝子発現レベルである。一部の実施態様において、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、およびＨＮＦ４αの上昇した遺伝子発現レベルは、胎児および成体の肝細胞様細胞の段階に入っていない同等のｈＴＳ細胞におけるＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、およびＨＮＦ４αの遺伝子発現レベルと比べたものである。一部の実施態様において、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、およびＨＮＦ４αの遺伝子発現レベルは、約１から約１０，０００倍の間、約２から約５０００倍の間、または約２から約１０００倍の間である。
[00125]一部の実施態様において、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、Ｓ
ＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、およびＨＮＦ４αの遺伝子発現レベルは、胎児および成体の肝細胞様細胞の段階に入っていない同等のｈＴＳ細胞におけるＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６
ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、およびＨＮＦ４αの遺伝子発現レベルと比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、５０００倍であるか、またはそれより高い。一部の実施態様において、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、およびＨＮＦ４αの遺伝子発現レベルは、胎児および成体の肝細胞様細胞の段階に入っていない同等のｈＴＳ細胞におけるＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、およびＨＮＦ４αの遺伝子発現レベルと比べて、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、５０００分の１であるか、またはそれより低い。
[00126]一部の実施態様において、胎児および成体の肝細胞様細胞の段階における細胞
は、誘導肝細胞に成熟する。一部の実施態様において、胎児および成体の肝細胞様細胞の段階における細胞は、誘導肝細胞である。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、それ以上分化しない。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、最終分化した段階に到達する。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、最大で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００世代またはそれより長く、安定な細胞として維持される。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、最大で７日、１０日、１４日、２１日、３０日、６０日、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年間、２年間、またはそれより長く、安定な細胞として維持される。
使用方法
[00127]ある特定の実施態様において、１つまたはそれより多くの使用のために誘導肝細
胞を利用する方法が本明細書で説明される。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、疾患または障害の処置または予防で使用するための化合物をスクリーニングするのに利用される。一部の実施態様において、スクリーニングプロセスは、化合物、酵素誘導、および毒性研究の１つまたはそれより多くを含む。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、肝臓傷害、例えば肝臓関連の疾患または障害による肝臓組織の損傷または損失の処置のために投与される。他の実施態様において、誘導肝細胞は、治療用タンパク質（例えばホルモン）、サイトカイン、コレステロール、炭水化物、胆汁、またはそれらの組合せを生産するために利用される。他の実施態様において、誘導肝細胞は、肝再生のために利用される。追加の実施態様において、誘導肝細胞は、遺伝子治療のための源として利用される。
化合物をスクリーニングするための誘導肝細胞
[00128]一部の実施態様において、誘導肝細胞は、疾患または障害の処置または予防で使
用するための化合物をスクリーニングするのに利用される。一部の実施態様において、本方法は、単離された誘導肝細胞を化合物と接触させることを含む。一部の実施態様において、本方法は、単離された初代肝細胞を化合物と接触させることを含む。他の実施態様において、本方法は、誘導肝細胞における少なくとも１つのバイオマーカー（例えば遺伝子、転写またはタンパク質）の活性における変化を検出することをさらに含む。他の実施態様において、本方法は、初代肝細胞における少なくとも１つのバイオマーカー（例えば遺伝子、転写またはタンパク質）のレベルにおける変化を検出することをさらに含む。一部の実施態様において、少なくとも１つのバイオマーカーのレベルにおける変化は、少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現レベルにおける変化である。一部の実施態様において、バイオマーカーは、シトクロムＰ４５０スーパーファミリーのメンバーを含む。一部の実施態様において、バイオマーカーは、シトクロムＰ４５０ファミリー：ＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３、ＣＹＰ４、ＣＹＰ５、ＣＹＰ７、ＣＹＰ８、ＣＹＰ１１、ＣＹＰ１７、ＣＹＰ１９、ＣＹＰ２０、ＣＹＰ２１、ＣＹＰ２４、ＣＹＰ２６、ＣＹＰ２７、ＣＹＰ３９、ＣＹＰ４６、ＣＹＰ５１、およびそれら各々のサブファミリーのメンバーを含む
。一部の実施態様において、バイオマーカーは、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、またはＣＹＰ７Ａ１を含む。
[00129]一部の実施態様において、化合物（例えば薬物）は、肝臓を介して代謝される
。一部の場合において、化合物（例えば薬物）を代謝するための肝臓の一次メカニズムは、酵素のＰ４５０シトクロム系である。一部の場合において、化合物を代謝する速度が急速すぎると、化合物の効能を減少させる可能性がある。代替として、化合物を代謝する速度が遅すぎると、宿主細胞中に毒性を蓄積させる可能性がある。それゆえに一部の場合において、化合物の代謝が評価され、例えばその毒性が評価される。
[00130]一部の場合において、化合物は、酵素のシトクロムＰ４５０ファミリーのメン
バーに対する誘導物質または阻害剤として作用する。一部のケースにおいて、化合物は、酵素のシトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーに対する誘導物質である。一部の場合において、誘導物質は、酵素のシトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーなどの酵素の発現を開始させるかまたはそのレベルを強化する。一部の場合において、誘導物質は、酵素のシトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーの遺伝子発現を開始させるかまたはそのレベルを強化する。一部の場合において、誘導物質は、酵素のシトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーのタンパク質発現を開始させるかまたはそのレベルを強化する。一部のケースにおいて、化合物は、酵素のシトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーに対する阻害剤である。一部の場合において、阻害剤は、酵素のシトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーなどの酵素の発現を阻害するか、そのレベルを低減させるか、またはそれに干渉する。一部の場合において、阻害剤は、酵素のシトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーの遺伝子発現を阻害するか、そのレベルを低減させるか、またはそれに干渉する。一部の場合において、阻害剤は、酵素のシトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーのタンパク質発現を阻害するか、そのレベルを低減させるか、またはそれに干渉する。一部の場合において、酵素のシトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーなどの酵素の発現レベルは、酵素の対照発現レベルと比較される。一部の実施態様において、酵素の対照発現レベルは、化合物により誘導されていない酵素の発現レベルである。
[00131]単離された誘導肝細胞を化合物と接触させた後の一部の場合において、シトク
ロムＰ４５０スーパーファミリーのメンバーの遺伝子発現における変化が、検出される。一部のケースにおいて、化合物と接触させた単離された誘導肝細胞からのシトクロムＰ４５０スーパーファミリーのメンバーからのバイオマーカーの遺伝子発現レベルは、化合物と接触させていない同等の単離された誘導肝細胞のシトクロムＰ４５０スーパーファミリーからのバイオマーカーの遺伝子発現レベルと比較されるか、または初代肝細胞と比較される。
[00132]単離された誘導肝細胞を化合物と接触させた後の一部の場合において、シトク
ロムＰ４５０ファミリー：ＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３、ＣＹＰ４、ＣＹＰ５、ＣＹＰ７、ＣＹＰ８、ＣＹＰ１１、ＣＹＰ１７、ＣＹＰ１９、ＣＹＰ２０、ＣＹＰ２１、ＣＹＰ２４、ＣＹＰ２６、ＣＹＰ２７、ＣＹＰ３９、ＣＹＰ４６、ＣＹＰ５１、およびそれら各々のサブファミリーのメンバーから選択されるバイオマーカーの遺伝子発現レベルにおける変化が、検出される。一部のケースにおいて、化合物と接触させた単離された誘導肝細胞からの、シトクロムＰ４５０ファミリー：ＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３、ＣＹＰ４、ＣＹＰ５、ＣＹＰ７、ＣＹＰ８、ＣＹＰ１１、ＣＹＰ１７、ＣＹＰ１９、ＣＹＰ２０、ＣＹＰ２１、ＣＹＰ２４、ＣＹＰ２６、ＣＹＰ２７、ＣＹＰ３９、ＣＹＰ４６、ＣＹＰ５１、およびそれら各々のサブファミリーのメンバーからのバイオマーカーの遺伝子発現レベルは、化合物と接触させていない同等の単離された誘導肝細胞のシトクロムＰ４５０ファミリー：ＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３、ＣＹＰ４、ＣＹＰ５、ＣＹＰ７、ＣＹＰ８、Ｃ
ＹＰ１１、ＣＹＰ１７、ＣＹＰ１９、ＣＹＰ２０、ＣＹＰ２１、ＣＹＰ２４、ＣＹＰ２６、ＣＹＰ２７、ＣＹＰ３９、ＣＹＰ４６、ＣＹＰ５１、およびそれら各々のサブファミリーのメンバーからのバイオマーカーの遺伝子発現レベルと比較されるか、または初代肝細胞と比較される。
[00133]単離された誘導肝細胞を化合物と接触させた後の一部の場合において、ＣＹＰ
１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、およびＣＹＰ７Ａ１から選択されるバイオマーカーの遺伝子発現レベルにおける変化が、検出される。一部のケースにおいて、化合物と接触させた単離された誘導肝細胞からのＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、およびＣＹＰ７Ａ１から選択されるバイオマーカーの遺伝子発現レベルは、化合物と接触させていない同等の単離された誘導肝細胞のＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、およびＣＹＰ７Ａ１から選択されるバイオマーカーの遺伝子発現レベルと比較されるか、または初代肝細胞と比較される。
[00134]一実施態様において、細胞において変化を誘導する能力に関して化合物をスク
リーニングする方法が本明細書において提供される。一実施態様において、本方法は、単離された誘導肝細胞を化合物と接触させることを含む。別の実施態様において、本方法は、単離された初代肝細胞を化合物と接触させることを含む。別の実施態様において、本方法は、例えば再生中における誘導肝細胞の変化（例えば増殖）の誘導を検出することをさらに含む。別の実施態様において、本方法は、例えば再生中における初代肝細胞の変化（例えば増殖）の誘導を検出することをさらに含む。
[00135]細胞の細胞毒性または調節に関して化合物をスクリーニングする方法であって
、誘導肝細胞を化合物と接触させることを含む、上記方法も、本明細書において提供される。別の実施態様において、本方法は、化合物との接触に起因する細胞におけるあらゆる表現型または代謝の変化を決定すること、およびその変化を、細胞毒性または細胞の機能または生化学における他のあらゆる変化と関係付けることをさらに含む。別の実施態様において、医薬品、毒素、または可能性のある分化の調節因子のスクリーニングが促進される。これらの物質（例えば、医薬品、毒素、または可能性のある調節因子）は、培養培地に添加することができる。
[00136]本明細書において提供される一実施態様は、増殖因子、分化因子、および医薬
品をスクリーニングする方法を説明する。一実施態様において、誘導肝細胞または初代肝細胞は、培養中の誘導肝細胞または初代肝細胞の特徴に影響を与える因子（例えば小分子薬物、ペプチド、ポリヌクレオチドなど）または条件（例えば培養条件または操作）に関してスクリーニングするために使用される。一実施態様において、このシステムは、試験化合物によるフィーダー細胞の変動によって引き起こされる副次的な作用によって複雑化しないという利点を有する。別の実施態様において、増殖に影響を及ぼす物質が試験される。別の実施態様において、培養物から馴化培地を引き出し、より単純な培地で交換する。別の実施態様において、馴化培地の要素を置き換えるための候補である可溶性因子の異なるカクテルで、異なるウェルを処理する。処理された細胞が維持され、馴化培地の場合と同様に最適に、十分な方式で増殖した場合、各混合物の効能が決定される。可能性のある分化因子または条件は、試験プロトコールに従って細胞を処理すること、次いで処置された細胞が、特定の系統の分化細胞の機能的なまたは表現型の特徴を発生させるかどうかを決定することによって試験することができる。
[00137]一実施態様において、誘導肝細胞または初代肝細胞は、細胞分化の可能性のあ
る調節因子をスクリーニングするのに使用される。例えば、細胞分化の調節因子をスクリ
ーニングするための１つのアッセイにおいて、誘導肝細胞または初代肝細胞は、状況が必要とする場合、血清非含有で、または調節因子の存在下で培養することができ、分化に対する作用を検出することができる。別の実施態様において、本明細書で説明されるスクリーニング方法は、細胞の発達に関連する状態を研究し、可能性のある治療的または矯正的な薬物または状態の調節因子に関してスクリーニングするのに使用することができる。例えば、一実施態様において、誘導肝細胞または初代肝細胞の発達は、疾患または状態を有する細胞の発達と比較される。
[00138]一実施態様において、遺伝子およびタンパク質発現などのバイオマーカーは、
誘導肝細胞または初代肝細胞から得られた異なる細胞集団間で比較され、増殖の過程でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた因子を同定して特徴付けるのに使用され、影響を受けた遺伝子のヌクレオチドコピーを生産することができる。
[00139]一実施態様において、フィーダー非含有の誘導肝細胞または初代肝細胞培養物
も、薬物調査で医薬化合物を試験することために使用することができる。候補医薬化合物の活性の評価は、一般的に、誘導肝細胞または初代肝細胞を候補化合物と組み合わせること、結果得られたあらゆる変化を決定すること、次いで化合物の作用を観察された変化と関係付けることを含む。別の実施態様において、スクリーニングは、例えば、化合物が特定の細胞型に対して薬理作用を有するように設計されるためになされるか、または化合物が他の場合では予期せぬ副作用を有するように設計されるためになされるかのいずれかである。別の実施態様において、２つまたはそれより多くの薬物は、可能性のある薬物−薬物相互作用を検出するために、組み合わせて（同時または逐次的にのいずれかで細胞と組み合わせることによって）試験される。別の実施態様において、化合物は、最初に起こり得る毒性に関してスクリーニングされる。別の実施態様において、細胞傷害性は、細胞生存率、生存、形態学、特定のマーカー、受容体または酵素の発現または放出、ＤＮＡの合成または修復に対する作用によって決定される。
[00140]用語「処置すること」、「処置」、および同種のものは、本明細書では、望ま
しい薬理学的および／または生理学的な作用を得ることを意味するものとして使用される。一部の実施態様において、個体（例えば、肝臓関連の疾患または障害に罹っている疑いのある、および／または遺伝学的に罹りやすい個体）は、本明細書で説明される誘導肝細胞の調製物で予防的に処置され、このような予防的処置は、肝臓関連の疾患もしくは障害またはそれらの徴候もしくは症状を完全または部分的に予防する。一部の実施態様において、個体は、治療的に処置され（例えば、個体が肝臓関連の疾患または障害に罹っている場合）、このような治療的処置は、疾患または障害に関して部分的または完全な治癒をもたらすか、および／または疾患または障害に起因する有害作用を逆転させるか、および／または疾患または障害を安定化させるか、および／または疾患または障害の進行を遅延させるか、および／または疾患または障害の寛解をもたらす。
[00141]処置が必要な領域への誘導肝細胞の投与（例えば、移植）は、例えば、これら
に限定されないが、注射による外科手術中の局所注入、カテーテル、またはインプラントによって達成され、前記インプラントは、多孔質、非多孔質、またはゲル状の材料で作製され、膜、例えばシラスティック（sialastic）膜、または繊維などが挙げられる。
[00142]哺乳動物に組成物を「移植すること」は、当業界で確立されたあらゆる方法に
よって哺乳動物の体に組成物を導入することを指す。導入される組成物は、「移植物」であり、哺乳動物は、「レシピエント」である。移植物およびレシピエントは、同系、同種または異種であってもよい。さらに、移植物は、自家移植であってもよい。
[00143]「有効量」は、意図する目的を達成するのに十分な治療剤の量である。例えば
、誘導肝細胞の有効量は、場合によって、初代肝細胞数の増加をもたらすのに十分な量である。肝臓関連の疾患または障害を処置または緩和するための組成物の有効量は、肝臓関連の疾患または障害の症状を低減または除去するのに十分な組成物の量である。所与の治療剤の有効量は、薬剤の性質、投与経路、治療剤を受ける動物のサイズおよび種、ならびに投与目的などの要因に応じて様々であると予想される。
[00144]一実施態様において、遺伝子改変された誘導肝細胞が本明細書においてさらに
提供される。操作は、細胞の様々な特性を改変し、例えば、特定の環境条件に細胞をより適合させるかまたは耐性にし、および／またはそれからの１つまたはそれより多くの特定の物質の生産を誘導するものであり、この物質は、例えば細胞の生存率を改善することができる。このような遺伝子変化は、移植での使用に細胞をより好適にするために、例えば、レシピエントからのそれらの拒絶反応を回避するために実行することができる（遺伝子治療手順の総論については、Anderson、Science、256：808；Mulligan、Science、926；Miller、Nature、357：455；Van Brunt、Biotechnology、6（10）：1149；およびYuら、Gene Therapy、1：13を参照）。
[00145]「ベクター」は、適切な宿主細胞に導入されると本明細書で説明される前駆細
胞の改変を引き起こす、組換えＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクト、例えばプラスミド、ファージ、組換えウイルス、または他のベクターを指す。適切な発現ベクターは、当業界において通常の技術を有するものに周知であり、真核および／または原核細胞で複製可能なもの、およびエピソームのままであるもの、または宿主細胞ゲノムに統合されるものが挙げられる。
[00146]ベクターの構築は、例えば、Sambrookら、1989で説明されるような技術を使用
して達成される。一実施態様において、単離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、プラスミドを生成するのに望ましい形態に、切断され、適合させ、再びライゲートされる。必要に応じて、構築されたプラスミドにおいて正しい配列を確認するための分析は、あらゆる好適な方法を使用して実行される。発現ベクターを構築する、インビトロでの転写物を調製する、宿主細胞にＤＮＡを導入する、および遺伝子の発現および機能を評価するための分析を実行するための好適な方法は、公知である。遺伝子の存在、増幅、および／または発現は、例えば、本明細書で提供される配列をベースとし得る適切に標識されたプローブを使用した、従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションによってサンプル中で直接的に測定される。
[00147]本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」、「形質転換」、およ
び同種のものなどの用語は、核酸が細胞または生物に機能的な形態で移行することを示すことが意図される。このような用語は、核酸を細胞に移行させる様々な手段を包含し、ＣａＰ０４を用いたトランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス形質導入、リポフェクション、リポソームを使用する送達、および／または他の運搬手段を包含する。
疾患または障害を処置するための誘導肝細胞
[00148]一部の実施態様において、誘導肝細胞は、肝臓傷害の処置のために投与される。
一部の実施態様において、肝臓傷害は、宿主への傷害などの外的要因、例えば個体への傷害による、または外科手術による、肝臓組織の損傷または損失を包含する。一部の実施態様において、肝臓傷害は、肝臓関連の疾患または障害による肝臓組織の損傷または損失を包含する。一部の実施態様において、肝臓関連の疾患または障害は、急性肝不全などの急性肝疾患もしくは障害であるか、または硬変症などの慢性肝疾患もしくは障害である。一部の実施態様において、肝臓関連の疾患または障害は、遺伝因子、化学物質または病原体
の感染に起因する。
[00149]例示的な肝臓関連の疾患または障害としては、これらに限定されないが、アラ
ジール症候群、アルファ１抗トリプシン欠乏症、自己免疫肝炎、良性肝腫瘍、胆道閉鎖、硬変症、嚢胞性肝疾患、アルコール関連の肝疾患および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を包含する脂肪性肝疾患、ガラクトース血症、胆石、ギルバート症候群、ヘモクロマトーシス、肝嚢胞、肝臓がん、妊娠中の肝疾患（例えば妊娠性急性脂肪肝、妊娠中の肝内胆汁うっ滞、子癇前症、またはＨＥＬＬＰ症候群（溶血、肝臓検査値の上昇、低い血小板数））、新生児肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、ポルフィリン症、ライ症候群、サルコイドーシス、中毒性肝炎、糖原病１型、チロシン血症、ウイルス性肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、およびウィルソン病が挙げられる。
[00150]一部の実施態様において、誘導肝細胞は、急性肝疾患または障害の処置のため
に投与される。他の実施態様において、誘導肝細胞は、慢性肝疾患または障害の処置のために投与される。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、アラジール症候群、アルファ１抗トリプシン欠乏症、自己免疫肝炎、良性肝腫瘍、胆道閉鎖、硬変症、嚢胞性肝疾患、アルコール関連の肝疾患および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を包含する脂肪性肝疾患、ガラクトース血症、胆石、ギルバート症候群、ヘモクロマトーシス、肝嚢胞、肝臓がん、妊娠中の肝疾患（例えば妊娠性急性脂肪肝、妊娠中の肝内胆汁うっ滞、子癇前症、またはＨＥＬＬＰ症候群（溶血、肝臓検査値の上昇、低い血小板数））、新生児肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、ポルフィリン症、ライ症候群、サルコイドーシス、中毒性肝炎、糖原病１型、チロシン血症、ウイルス性肝炎Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、ウィルソン病、またはそれらの組合せの処置のために投与される。
[00151]一部の実施態様において、誘導肝細胞は、肝臓関連の疾患または障害の処置の
ための追加の治療剤と組み合わせて投与される。一部の実施態様において、追加の治療剤としては、これらに限定されないが、クルクミン、レスベラトロール、サリドマイド、コレスチラミン（クエストラン）、タクロリムス（ＰＲＯＧＲＡＦ）、ウルソジオール（アクティゴール）、インターフェロン、ループ利尿薬などの利尿薬、および肝臓移植が挙げられる。
[00152]一部の実施態様において、肝臓に対して毒性の化学物質は、化学物質によって
誘導された肝疾患を引き起こす。一部の実施態様において、肝臓に対して毒性の化学物質としては、薬物；消費可能なもの、例えばアルコール、食品添加剤、または保存剤；ならびに化学的および環境的な毒素が挙げられる。一部の場合において、肝臓傷害を引き起こす薬物としては、これらに限定されないが、アセトアミノフェン、アロプリノール、アナボリックステロイド、ダナゾール、ダントロレン、イミプラミン、イソニアジド、メトトレキセート、メチルドパ、ニコチン酸、ニトロフラントイン、フェノチアジン、フェニトイン、サリチル酸塩、スタチン、テルビナフィンＨＣｌ、チアベンダゾール、トロトラスト、トルブタミド、クロルプロマジン／バルプロ酸、およびクロルプロパミド／エリスロマイシンが挙げられる。
[00153]一部の実施態様において、病原体の感染は、肝臓関連の疾患または障害を誘導
する。一部の実施態様において、病原体は、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫である。一部の実施態様において、病原体は、ウイルスである。一部の実施態様において、ウイルス感染は、肝臓関連の疾患または障害を誘導する。
[00154]一部の実施態様において、ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス
である。一部の場合において、ＤＮＡウイルスは、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡウイルス、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡウイルス、またはｓｓおよびｄｓＤＮＡ領域の両方を含有するＤＮＡウ
イルスである。一部のケースにおいて、ＲＮＡウイルスは、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡウイルスまたは二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡウイルスである。時には、ｓｓＲＮＡウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスまたはマイナス鎖ＲＮＡウイルスにさらに分類される。
[00155]一部の場合において、ｄｓＤＮＡウイルスは、以下の科：ミオウイルス科（Myoviridae）、ポドウイルス科（Podoviridae）、シホウイルス科（Siphoviridae）、アロヘルペスウイルス科（Alloherpesviridae）、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、マラコヘルペスウイルス科（Malacoherpesviridae）、リポスリクスウイルス科（Lipothrixviridae）、ルディウイルス科（Rudiviridae）、アデノウイルス科（Adenoviridae）、アムプラウイルス科（Ampullaviridae）、アスコウイルス科（Ascoviridae）、アスファウイ
ルス科（Asfaviridae）、バキュロウイルス科（Baculoviridae）、ビカウダウイルス科（Bicaudaviridae）、クラバウイルス科（Clavaviridae）、コルチコウイルス科（Corticoviridae）、フセロウイルス科（Fuselloviridae）、グロブロウイルス科（Globuloviridae）、グッタウイルス科（Guttaviridae）、ヒトロサウイルス科（Hytrosaviridae）、イリドウイルス科（Iridoviridae）、マルセイユウイルス科（Marseilleviridae）、ミミウイルス科（Mimiviridae）、ニマウイルス科（Nimaviridae）、パンドラウイルス科（Pandoraviridae）、パピローマウイルス科（Papillomaviridae）、フィコドナウイルス科（Phycodnaviridae）、プラズマウイルス科（Plasmaviridae）、ポリドナウイルス科（Polydnaviruses）、ポリオーマウイルス科（Polyomaviridae）、ポックスウイルス科（Poxviridae）、スファエロリポウイルス科（Sphaerolipoviridae）、およびテクティウイルス科（Tectiviridae）に由来する。
[00156]一部の場合において、ｓｓＤＮＡウイルスは、以下の科：アネロウイルス科（Anelloviridae）、バシラリオドナウイルス科（Bacillariodnaviridae）、ビドナウイルス科（Bidnaviridae）、サーコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、ジェミニウイルス科（Geminiviridae）、イノウイルス科（Inoviridae）、ミクロウイルス科（Microviridae）、ナノウイルス科（Nanoviridae）、パルボウイルス科（Parvoviridae）、およびスピラウイルス科（Spiraviridae）に由来する。
[00157]一部の場合において、ｓｓおよびｄｓＤＮＡ領域の両方を含有するＤＮＡウイ
ルスは、プレオリポウイルス（pleolipoviruses）属に由来する。一部のケースにおいて
、プレオリポウイルスとしては、ハロアーキュラ・ヒスパニカ（Haloarcula hispanica）多形性ウイルス１、ハロゲオメトリクム属（Halogeometricum）多形性ウイルス１、ハロ
ラブラム属（Halorubrum）多形性ウイルス１、ハロラブラム属多形性ウイルス２、ハロラブラム属多形性ウイルス３、およびハロラブラム属多形性ウイルス６が挙げられる。
[00158]一部の場合において、ｄｓＲＮＡウイルスは、以下の科：ビルナウイルス科（Birnaviridae）、クリソウイルス科（Chrysoviridae）、シストウイルス科（Cystoviridae）、エンドルナウイルス科（Endornaviridae）、ハイポウイルス科（Hypoviridae）、メ
ガビルナウイルス科（Megavirnaviridae）、パルティティウイルス科（Partitiviridae）、ピコビルナウイルス科（Picobirnaviridae）、レオウイルス科（Reoviridae）、ロタウイルス科（Rotavirus）およびトティウイルス科（Totiviridae）に由来する。
[00159]一部のケースにおいて、プラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスは、以下の科：アルファ
フレキシウイルス科（Alphaflexiviridae）、アルファテトラウイルス科（Alphatetraviridae）、アルベルナウイルス科（Alvernaviridae）、アルテリウイルス科（Arteriviridae）、アストロウイルス科（Astroviridae）、バルナウイルス科（Barnaviridae）、ベー
タフレキシウイルス科（Betaflexiviridae）、プロモウイルス科（Bromoviridae）、カリチウイルス科（Caliciviridae）、カルモテトラウイルス科（Carmotetraviridae）、クロステロウイルス科（Closteroviridae）、コロナウイルス科（Coronaviridae）、ジシスト
ロウイルス科（Dicistroviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）、ガンマフレキ
シウイルス科（Gammaflexiviridae）、イフラウイルス科（Iflaviridae）、レヴィウイルス科（Leviviridae）、ルテオウイルス科（Luteoviridae）、マルナウイルス科（Marnaviridae）、メソニウイルス科（Mesoniviridae）、ナルナウイルス科（Narnaviridae）、ノダウイルス科（Nodaviridae）、ペルムトテトラウイルス科（Permutotetraviridae）、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、ポチウイルス科（Potyviridae）、ロニウイルス
科（Roniviridae）、セコウイルス科（Secoviridae）、トガウイルス科（Togaviridae）
、トンブスウイルス科（Tombusviridae）、ティモウイルス科（Tymoviridae）、および
ビルガウイルス科（Virgaviridae）に由来する。
[00160]時には、マイナス鎖ｓｓＲＮＡウイルスは、以下の科：ボルナウイルス科（Bornaviridae）、フィロウイルス科（Filoviridae）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、ニアミウイルス科（Nyamiviridae）、アレナウイルス科（Arenaviridae）、ブニヤウイルス科（Bunyaviridae）、オフィオウイルス科（Ophioviridae）、およびオルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）に由来する。
[00161]例示的なウイルスとしては、これらに限定されないが、エーベルソン白血病ウ
イルス、エーベルソンマウス白血病ウイルス、エーベルソンウイルス、急性喉頭気管支炎ウイルス、アデレードリバーウイルス、アデノ関連ウイルス群、アデノウイルス、アフリカ馬疫ウイルス、アフリカ豚コレラウイルス、ＡＩＤＳウイルス、アリューシャンミンク症パルボウイルス、アルファレトロウイルス、アルファウイルス、ＡＬＶ関連ウイルス、アマパリウイルス、アフタウイルス、アクアレオウイルス、アルボウイルス、アルボウイルスＣ、アルボウイルスＡ群、アルボウイルスＢ群、アレナウイルス属、アルゼンチン出血熱ウイルス、アルゼンチン出血熱ウイルス、アルテリウイルス、アストロウイルス、アテリン（Ateline）ヘルペスウイルス属、オーエスキー病ウイルス、アウラウイルス、ア
ウスダック（Ausduk）疾患ウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス、アビアデノウイルス、トリ赤芽球症ウイルス、トリ伝染性気管支炎ウイルス、トリ白血病ウイルス、トリ白血病ウイルス、トリリンパ腫症ウイルス、トリ骨髄芽球症ウイルス、トリパラミクソウイルス、トリ肺脳炎ウイルス、トリ細網内皮症ウイルス、トリ肉腫ウイルス、トリＣ型レトロウイルス属、トリヘパドナウイルス、アビポックスウイルス、Ｂウイルス、Ｂ１９ウイルス、ババンキ（Babanki）ウイルス、ヒヒヘルペスウイルス、バキュロウイル
ス、バーマフォレストウイルス、ベバルウイルス、ベリマー（Berrimah）ウイルス、ベータレトロウイルス、ビルナウイルス、ビットナーウイルス、ＢＫウイルス、ブラッククリークカナルウイルス、ブルータングウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、ボルナ病（Boma
disease）ウイルス、ヒツジボーダー病ウイルス、ボルナウイルス、ウシアルファヘルペスウイルス１、ウシアルファヘルペスウイルス２、ウシコロナウイルス、ウシ流行熱ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ウシ乳頭炎ウイルス、ウシパピローマウイルス、ウシ丘疹状梅毒疹（papular stomatitis）ウイルス、ウシパルボウイルス、ウシ合胞体ウイルス、ウシＣ型オンコウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、バギークリーク（Buggy Creek）ウイルス、弾丸型ウイルス群、ブンヤムウ
ェラウイルス超層群、ブニヤウイルス、バーキットリンパ腫ウイルス、ブワンバ熱、ＣＡウイルス、カリチウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ラクダ痘ウイルス、カナリア痘瘡ウイルス、イヌヘルペスウイルス、イヌコロナウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌヘルペスウイルス、イヌ微小ウイルス、イヌパルボウイルス、Ｃａｎｏ Ｄｅｌｇａｄｉｔｏウイルス、ヤギ関節炎ウイルス、ヤギ脳炎ウイルス、ヤギヘルペスウイルス、ヤギポックスウイルス、カルジオウイルス、テンジクネズミ科ヘルペスウイルス１、オナガザル科ヘルペスウイルス１、オナガザル亜科ヘルペスウイルス１、オナガザル亜科ヘルペスウイルス２、チャンディプラウイルス、チャングイノラウイルス、ブチナマズのウイルス、チャールビルウイルス、水痘ウイルス、チクングンヤウイルス、チンパンジーヘルペスウイルス、コイ科レオウイルス、シロザケのウイルス、球菌ウイルス、ギンザケのレ
オウイルス、媾疹ウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、コルティウイルス、コロンビアＳＫウイルス、感冒ウイルス、伝染性膿瘡（contagious eethyma）ウイルス、伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス、コロナウイルス、コリパルタウイルス、コリーザウイルス、牛痘ウイルス、コクサッキーウイルス、ＣＰＶ（細胞質多角体ウイルス）、クリケット麻痺（cricket paralysis）ウイルス、クリミア−コンゴ出血性熱ウイルス、クループ関連ウイルス、
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ウイルス、ショウジョウバエＣウイルス、アヒルＢ型肝炎ウイルス、アヒル肝炎ウイルス１、アヒル肝炎ウイルス２、デュオウイルス（duovirus）、デュベンヘイジウイルス、縮れ翅ウイルスＤＷＶ、東部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、ＥＢウイルス、エボラウイルス、エボラ様ウイルス、エコーウイルス、エコーウイルス、エコーウイルス１０、エコーウイルス２８、エコーウイルス９、エクトロメリアウイルス、ＥＥＥウイルス、ＥＩＡウイルス、ＥＩＡウイルス、脳炎ウイルス、脳心筋炎群ウイルス、脳心筋炎ウイルス、エンテロウイルス、酵素を上昇させるウイルス、酵素を上昇させるウイルス（ＬＤＨ）、流行性出血性熱ウイルス、家畜流行性出血性疾患ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ウマアルファヘルペスウイルス１、ウマアルファヘルペスウイルス４、ウマヘルペスウイルス２、ウマ流産ウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、ウマ脳症ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ウマ麻疹ウイルス、ウマ鼻肺炎ウイルス、ウマライノウイルス、ユーベナンジー（Eubenangu）ウイルス、ヨーロッパヘラジカのパピローマウイルス、ヨー
ロッパ豚のコレラウイルス、エバーグレーズウイルス、アイアッハ（Eyach）ウイルス、
ネコヘルペスウイルス１、ネコカリチウイルス、ネコ繊維肉腫ウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、ネコ白血病／肉腫ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ネコ合胞体ウイルス、フィロウイルス、フランダーズウイルス、フラビウイルス、口蹄疫ウイルス、フォートモーガン（Fort Morgan）ウイルス、フォーコーナーズ（Four Corners）ハンタウイルス、トリアデノウイルス１、鶏痘ウイルス、フレンドウイルス
、ガンマレトロウイルス、ＧＢ肝炎ウイルス、ＧＢウイルス、麻疹ウイルス、ゲタウイルス、テナガザル白血病ウイルス、腺熱ウイルス、ヤギ痘ウイルス、ゴールデンシマー（golden shinner）ウイルス、ゴノメタ（Gonometa）ウイルス、ガチョウパルボウイルス、顆粒病ウイルス、グロスウイルス、ジリスＢ型肝炎ウイルス、Ａ群アルボウイルス、グアナリトウイルス、モルモットサイトメガロウイルス、モルモットＣ型ウイルス、ハンターンウイルス、ハンタウイルス、ハマグリのレオウイルス、野兎線維腫ウイルス、ＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）、赤血球吸着ウイルス２、センダイウイルス（hemagglutinating virus of Japan）、出血熱ウイルス、ヘンドラウイルス、ヘニパウイルス、ヘパド
ナウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス群、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｆ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス、肝炎ウイルス、肝炎ウイルス（非ヒト）、肝脳脊髄炎（hepatoencephalomyelitis）レオウイルス３、ヘパトウイルス、サギＢ型肝炎ウイルス、ヘル
ペスＢウイルス、単純疱疹ウイルス、単純疱疹ウイルス１、単純疱疹ウイルス２、ヘルペスウイルス、ヘルペスウイルス７、ヘルペスウイルス−アテレス、ヘルペスウイルス−ホミニス、ヘルペスウイルス感染症、ヘルペスウイルス−サイミリ、ヘルペスウイルス−スイス、ヘルペスウイルス−バリセラエ（varicellae）、ハイランドＪウイルス、ヒラメラブドウイルス、豚コレラウイルス、ヒトアデノウイルス２、ヒトアルファヘルペスウイルス１、ヒトアルファヘルペスウイルス２、ヒトアルファヘルペスウイルス３、ヒトＢリンパ球向性ウイルス、ヒトベータヘルペスウイルス５、ヒトコロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス群、ヒトフォーミーウイルス、ヒトガンマヘルペスウイルス４、ヒトガンマヘルペスウイルス６、ヒトＡ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス１群、ヒトヘルペスウイルス２群、ヒトヘルペスウイルス３群、ヒトヘルペスウイルス４群、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス８、ヒト免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１、
ヒト免疫不全ウイルス２、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴ細胞性白血病ウイルス、ヒトＴ細胞性白血病ウイルスＩ、ヒトＴ細胞性白血病ウイルスＩＩ、ヒトＴ細胞性白血病ウイルスＩＩＩ、ヒトＴ細胞リンパ腫ウイルスＩ、ヒトＴ細胞リンパ腫ウイルスＩＩ、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス１型、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス２型、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩＩ、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩＩＩ、イクノウイルス（Ichnovirus）、乳児胃腸炎ウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、感染性造血壊死ウイルス、伝染性膵臓壊死ウイルス、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ、インフルエンザウイルスＤ、インフルエンザウイルスｐｒ８、昆虫イリドウイルス、昆虫ウイルス、イリドウイルス、日本Ｂウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、フニンウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ケメロボウイルス、キルハム（Kilham）ラットウイルス、クラマス（Klamath）
ウイルス、コロンゴ（Kolongo）ウイルス、朝鮮出血熱ウイルス、クンバ（kumba）ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、キジラガ（Kyzylagach）ウイルス、ラクロスウイルス、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス、乳酸デヒドロゲナーゼウイルス、ラゴスコウモリウイルス、ラングールのウイルス、ラピーヌのパルボウイルス、ラッサ熱ウイルス、ラッサウイルス、潜伏性ラットウイルス、ＬＣＭウイルス、漏出性の（Leaky）ウイルス、レ
ンチウイルス、レポリポックスウイルス、白血病ウイルス、ロイコウイルス、ランピースキン病ウイルス、リンパ節症関連ウイルス、リンホクリプトウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、リンパ増殖性ウイルス群、マチュポウイルス、偽狂犬病ウイルス、哺乳類Ｂ型オンコウイルス群、哺乳類Ｂ型レトロウイルス、哺乳類Ｃ型レトロウイルス群、哺乳類Ｄ型レトロウイルス、乳がんウイルス、マプエラウイルス、マールブルグウイルス、マールブルグ様ウイルス、マソンファイザーサルウイルス、マストアデノウイルス、マヤロウイルス、ＭＥウイルス、麻疹ウイルス、メナングルウイルス、メンゴウイルス、メンゴウイルス、ミデルブルグ（Middelburg）ウイルス、ミルカー結節ウイルス、ミンク腸炎ウイルス、マウス微小ウイルス、ＭＬＶ関連ウイルス、ＭＭウイルス、モコラウイルス、モラシポックスウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、サルＢウイルス、サル痘ウイルス、モノネガウイルス目、麻疹ウイルス、マウントエルゴンコウモリウイルス、マウスサイトメガロウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、マウスＫウイルス、マウス白血病ウイルス、マウス乳がんウイルス、マウス微小ウイルス、マウス肺炎ウイルス、マウス灰白髄炎ウイルス、マウスポリオーマウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス痘ウイルス、モザンビークウイルス、ムカンボ（Mucambo）ウイルス、粘膜病ウイルス、流行性
耳下腺炎ウイルス、ネズミベータヘルペスウイルス１、ネズミサイトメガロウイルス２、マウスサイトメガロウイルス群、マウス脳脊髄炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、マウス白血病ウイルス、マウス小結節誘発ウイルス、マウスポリオーマウイルス、マウス肉腫ウイルス、ムロメガロウイスル、マリーバレー脳炎ウイルス、粘液腫ウイルス、ミクソウイルス、ミクソウイルス・マルチフォルム（Myxovirus multiforme）、ミクソウイルス・パロティティディス（Myxovirus parotitidis）、ナイロビヒツジ病ウイルス、ナイロウイ
ルス、ナニルナウイルス（Nanirnavirus）、ナリバ（Nariva）ウイルス、Ｎｄｕｍｏウイルス、ニースリング（Neethling）ウイルス、ネルソンベイ（Nelson Bay）ウイルス、向
神経性ウイルス、新世界アレナウイルス、新生児肺臓炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパウイルス、非細胞病原性ウイルス、ノーウォーク ウイルス、核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）、ニップルネック（nipple neck）ウイルス、オニョンニョンウイルス、
オケルボ（Ockelbo）ウイルス、腫瘍ウイルス、腫瘍ウイルス様粒子、オンコルナウイル
ス、オルビウイルス、オルフウイルス、オロポーシェウイルス、オルソヘパドナウイルス、オルトミクソウイル
ス、オルソポックスウイルス、オルトレオウイルス、オルンゴ、ヒツジパピローマウイルス、ヒツジカタル熱ウイルス、フクロウサルヘルペスウイルス、パリアムウイルス、パピローマウイルス、パピローマウイルス・シルビラジ（Papillomavirus sylvilagi）、パポバウイルス、パラインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイル
ス４型、パラミクソウイルス、パラポックスウイルス、パラワクシニアウイルス、パルボウイルス、パルボウイルスＢ１９、パルボウイルス群、ペスチウイルス、フレボウイルス、アザラシジステンパーウイルス、ピコドナウイルス、ピコルナウイルス、ブタサイトメガロウイルス−鳩痘ウイルス、ピリウイルス、ピクスナウイルス、マウス肺炎ウイルス、肺炎ウイルス、灰白髄炎ウイルス、ポリオウイルス、ポリドナウイルス、多角体病（polyhedral）ウイルス、ポリオーマウイルス、ポリオーマウイルス、ポリオーマウイルス・ボビス（Polyomavirus bovis）、ポリオーマウイルス・セルコピテシ（Polyomavirus cercopitheci）、ポリオーマウイルス・ホミニス２、ポリオーマウイルス・マカサエ（Polyomavirus maccacae）１、ポリオーマウイルス・ムリス（Polyomavirus muris）１、ポリオーマウイルス・ムリス２、ポリオーマウイルス・パピオニス（Polyomavirus papionis）１
、ポリオーマウイルス・パピオニス２、ポリオーマウイルス・シルビラジ、ポンジン（Pongine）ヘルペスウイルス１、ブタ伝染性下痢ウイルス、ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイ
ルス、ブタパルボウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ブタＣ型ウイルス、ポックスウイルス、ポックスウイルス、ポックスウイルス・バリオラエ（poxvirus variolae）、プ
ロスペクトヒル（Prospect Hill）ウイルス、プロウイルス、偽牛痘ウイルス、仮性狂犬
病ウイルス、オウム痘ウイルス、ウズラ痘ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、ウサギ腎臓空胞化（kidney vaculolating）ウイルス、ウサギパピローマウイルス、狂犬病ウイルス
、アライグマパルボウイルス、アライグマ痘ウイルス、ラニケットウイルス、ラットサイトメガロウイルス、ラットパルボウイルス、ラットウイルス、ローシャーウイルス、組換えワクシニアウイルス、組換えウイルス、レオウイルス、レオウイルス１、レオウイルス２、レオウイルス３、爬虫類Ｃ型ウイルス、呼吸器感染症ウイルス、呼吸系発疹ウイルス、呼吸器ウイルス、細網内皮症ウイルス、ラブドウイルス、ラブドウイルス・カルピア（Rhabdovirus carpia）、ラジノウイルス、ライノウイルス、リジディオウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ライリー（Riley）ウイルス、牛疫ウイルス、ＲＮＡ腫瘍ウイルス、
ロスリバーウイルス、ロタウイルス、麻疹（rougeole）ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、ルビウイルス、ロシア秋脳炎ウイルス、ＳＡ１１シミアンウイルス、ＳＡ２ウイルス、サビアウイルス、サギヤマ（Sagiyama）ウイルス、サイミリ（Saimirine）ヘルペスウイルス１、唾液腺ウイルス、サシチョウバエ熱ウイルス群、サ
ンジンバ（Sandjimba）ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＳＤＡＶ（唾液腺涙腺炎ウイルス
）、アザラシ痘ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ソウルウイルス、ヒツジ痘ウイルス、ショープ線維腫ウイルス、ショープ乳頭腫ウイルス、サルフォーミーウイルス、サルＡ型肝炎ウイルス、サルヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、サルパラインフルエンザウイルス、サルＴ細胞リンパ腫ウイルス、シミアンウイルス、シミアンウイルス４０、シンプレックスウイルス、シンノンブルウイルス、シンドビスウイルス、痘瘡ウイルス、南米出血熱ウイルス、スズメ痘ウイルス、スプーマウイルス、リス線維腫ウイルス、リスザルレトロウイルス、ＳＳＶ１ウイルス群、ＳＴＬＶ（サルＴリンパ球向性ウイルス）Ｉ型、ＳＴＬＶ（サルＴリンパ球向性ウイルス）ＩＩ型、ＳＴＬＶ（サルＴリンパ球向性ウイルス）ＩＩＩ型、口内炎丘疹ウイルス、下顎部（submaxillary）ウイルス、イノシシアルファヘルペスウイルス１、イノシシヘルペスウイルス２、スイポックスウイルス、沼地熱ウイルス、豚痘ウイルス、スイスマウス白血病ウイルス、ＴＡＣウイルス、タカリベ複合（Tacaribe complex）ウイルス、タカリベウイルス、キツネザル痘スウイルス、テトラポックスウイルス、テンチレオウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、タイラーウイルス、トゴトウイルス、トッタパラヤン（Thottapalayam）ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイ
ルス、ティオマン（Tioman）ウイルス、トガウイルス、トロウイルス、腫瘍ウイルス、ツパイウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、シチメンチョウ痘ウイルス、Ｃ型レトロウイルス、Ｄ型オンコウイルス、Ｄ型レトロウイルス群、潰瘍性疾患ラブドウイルス、ウナウイルス、ウークニエミウイルス群、ワクシニアウイルス、空胞ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ワリセロウイルス、天然痘（Varicola）ウイルス、天然痘メジャー（variola major）ウイルス、天然痘ウイルス、ヴァシアンギッシュ病（Vasin Gishu disease）ウイルス、ＶＥＥウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイ
ルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ベシクロウイルス、ビリュイスク（Vilyuisk）ウイルス、クサリヘビレトロウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス、ビスナマエディウイルス、ビスナウイルス、ハタネズミ痘ウイルス、ＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス）、ウォーラルウイルス、ウォリゴウイルス、疣贅ウイルス、ＷＥＥウイルス、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス、ワタロアウイルス、冬季嘔吐ウイルス、ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス、ウーリーサル肉腫ウイルス、創傷腫瘍（wound tumor）ウイルス、ＷＲＳＶウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、
ヤバウイルス、ヤタポックスウイルス、黄熱病ウイルス、およびヤグボグダノバク（Yug Bogdanovac）ウイルスが挙げられる。
[00162]一部の実施態様において、ウイルス感染は、肝臓関連の疾患または障害を誘導
する。一部の実施態様において、ウイルス感染は、肝炎感染である。一部の実施態様において、ウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｆ型肝炎ウイルス、またはＧ型肝炎ウイルスである。一部の実施態様において、肝臓関連の疾患または障害を誘導するウイルス感染は、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｆ型肝炎ウイルス、またはＧ型肝炎ウイルスによって引き起こされる。
[00163]一部の実施態様において、肝臓傷害は、肝臓内のウイルスに対する免疫応答の
結果として起こる。一部の場合において、肝臓傷害は、ウイルスが肝臓以外の組織を標的化する全身の宿主感染の一部として起こる。一次標的化が肝臓ではない例示的なウイルスとしては、ヘルペスウイルス、例えばエプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）または単純疱疹ウイルス；パルボウイルス；アデノウイルス；インフルエンザウイルス；レンチウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；および重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）関連コロナウイルスが挙げられる。一部の場合において、本明細書で説明されるウイルス感染は肝炎を引き起こす。
[00164]一部の実施態様において、病原体は、細菌である。一部の実施態様において、
細菌感染は、肝臓関連の疾患または障害を誘導する。細菌の例としては、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pyloris）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borelia burgdorferi）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophilia）、マイコバクテリウム属種（例えば、Ｍ．ツベルクローシス（M. tuberculosis）、Ｍ．アビウム（M. avium）、
Ｍ．イントラセルラレ（M. intracellulare）、Ｍ．カンサシイ（M. kansasii）、Ｍ．ゴルドネ（M. gordonae））、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、ストレプトコ
ッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌属（ビリダンス群）、ストレプトコッカス・フェカーリス（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、連鎖球菌属（嫌気性菌種）、肺炎連鎖球菌
（Streptococcus pneumoniae）、病原性カンピロバクター属種、腸球菌属種、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、コリネバクテリウム・ジフセリエ（Corynebacterium diphtheriae）、コリネバクテリウム属
種、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Erysipelothrix rhusiopathiae）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、クレブシェラ
肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasturella multocida
）、バクテロイド属種、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）
、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）、トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）、トレポネーマ・ペルテニュ（Treponema perten
ue）、レプトスピラ属、およびアクチノマイセス・イスラエリー（Actinomyces israelli）が挙げられる。
[00165]一部の実施態様において、病原体は、真菌である。一部の実施態様において、
真菌感染は、肝臓関連の疾患または障害を誘導する。真菌の例としては、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラスマ・カプスラーツム
（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、ブラストマイセス・デルマチチジス（Blastomyces dermatitidis）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）が挙
げられる。他の感染性の生物（すなわち、原生生物）としては、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）およびトキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）が挙げられる。
[00166]一部の実施態様において、病原体は、寄生虫である。一部の実施態様において
、寄生虫感染は、肝臓関連の疾患または障害を誘導する。寄生虫の例としては、肉質虫類（例えばエントアメーバ属）、鞭毛虫類（例えばジアルジア属、リーシュマニア属）、繊毛虫類（例えばバランチジウム属）、および胞子虫類（例えばプラスモジウム属、クリプトスポリジウム属）が挙げられる。
[00167]一部の実施態様において、誘導肝細胞は、欠損のある肝臓を再生するために利
用される。一部の場合において、誘導肝細胞は、肝臓傷害部位に導入される。一部のケースにおいて、誘導肝細胞は、細胞懸濁液として肝臓傷害部位に導入または移植される。他のケースにおいて、誘導肝細胞は、組織塊として肝臓傷害部位に導入または移植される。他の例において、誘導肝細胞は、欠損のある肝臓を再生するためにエクスビボで利用される。他の例において、誘導肝細胞は、肝臓傷害部位への移植の前に、エクスビボの肝臓生成のために利用される。
[00168]一部の実施態様において、誘導肝細胞は、宿主への傷害などの外的要因、例え
ば個体への傷害による、または外科手術による肝臓傷害を処置するために、医薬組成物などの組成物として調合される。
[00169]一部の実施態様において、誘導肝細胞は、肝臓関連の疾患または障害による肝
臓傷害を処置するために、医薬組成物などの組成物として調合される。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、アラジール症候群、アルファ１抗トリプシン欠乏症、自己免疫肝炎、良性肝腫瘍、胆道閉鎖、硬変症、嚢胞性肝疾患、アルコール関連の肝疾患および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を包含する脂肪性肝疾患、ガラクトース血症、胆石、ギルバート症候群、ヘモクロマトーシス、肝嚢胞、肝臓がん、妊娠中の肝疾患（例えば妊娠性急性脂肪肝、妊娠中の肝内胆汁うっ滞、子癇前症、またはＨＥＬＬＰ症候群（溶血、肝臓検査値の上昇、低い血小板数））、新生児肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、ポルフィリン症、ライ症候群、サルコイドーシス、中毒性肝炎、糖原病１型、チロシン血症、ウイルス性肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、ウィルソン病、またはそれらの組合せを処置するために、医薬組成物などの組成物として調合される。
[00170]一部の実施態様において、誘導肝細胞を含む組成物は、追加の治療剤をさらに
含む。一部の実施態様において、追加の治療剤は、肝臓関連の疾患または障害の処置のための治療剤である。一部の実施態様において、追加の治療剤としては、これらに限定されないが、クルクミン、レスベラトロール、サリドマイド、コレスチラミン（クエストラン）、タクロリムス（ＰＲＯＧＲＡＦ）、ウルソジオール（アクティゴール）、インターフェロン、ループ利尿薬などの利尿薬、および肝臓移植が挙げられる。
[00171]一部の実施態様において、誘導肝細胞を含む組成物は、肝臓を再生するために
、肝臓傷害部位で利用される。一部の実施態様において、誘導肝細胞を含む組成物は、細胞懸濁液として肝臓傷害部位に導入または移植される。一部の実施態様において、誘導肝細胞を含む組成物は、組織塊として肝臓傷害部位に導入または移植される。他の実施態様において、誘導肝細胞を含む組成物は、欠損のある肝臓を再生するためにエクスビボで利用される。他の実施態様において、誘導肝細胞を含む組成物は、肝臓傷害部位への移植の前に、エクスビボの肝臓生成のために利用される。
[00172]単離された誘導肝細胞の投与様式としては、これらに限定されないが、全身静
脈注射および意図した活性部位への直接の注射（例えば、内視鏡的逆行性注射）が挙げられる。調製物は、あらゆる便利な経路、例えば、点滴またはボーラス注射によって投与してもよいし、他の生物活性薬剤と共に投与してもよい。一部の実施態様において、投与は、全身性の局所投与である。
[00173]一部の実施態様において、誘導肝細胞を含む組成物は、ヒトなどの哺乳動物へ
の静脈内投与のための医薬組成物として調合される。一部の実施態様において、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、注射部位におけるあらゆる痛みを緩和するために局所麻酔剤も包含する。組成物を点滴で投与しようとする場合、組成物は、滅菌された医薬品グレードの水または塩類溶液を含有する点滴ボトルを用いて分配することができる。組成物が注射で投与される場合、滅菌注射用水または塩類溶液のアンプルを、投与前に成分が混合されるように提供することができる。
[00174]一部の実施態様において、好適な医薬組成物は、治療有効量の誘導肝細胞およ
び医薬的に許容される担体または賦形剤を含む。このような担体としては、これらに限定されないが、塩類溶液、緩衝塩類溶液、デキストロース、水、およびそれらの組合せが挙げられる。
[00175]一部の実施態様において、本明細書で説明される誘導肝細胞は、細胞を特定の
組織に標的化するのに好適な送達系によって、標的化された部位（例えば、肝臓の欠損した部分）に送達される。例えば、細胞は、標的化された部位での細胞の遅延放出を可能にする運搬手段中に封入される。運搬手段は、特定の組織に特異的に標的化されるように改変される。標的化された送達系の表面は、様々な方法で改変される。リポソームの標的化送達系のケースにおいて、標的化するリガンドをリポソームの二分子層との安定な会合状態で維持するために、脂質基がリポソームの脂質二重層に取り込まれる。
[00176]他の例において、コロイド分散系が使用される。コロイド分散系としては、高
分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースの系、例えば水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームなどが挙げられる。
[00177]本明細書で説明される誘導肝細胞の投与は、任意選択で、（１）注射される細
胞の量を増加または減少させること；（２）注射の回数を変化させること；または（３）細胞の送達方法を変化させることによって個体に適合させてもよい。
[00178]誘導肝細胞調製物は、レシピエントにおける細胞の生着を促進するのに有効な
量で使用される。医師の裁量で、投与は、最適な効能および薬理学的な投与が達成されるように調整される。
治療用タンパク質を生産するための誘導肝細胞
[00179]一部の実施態様において、誘導肝細胞は、治療用タンパク質（例えばホルモン）
、サイトカイン、コレステロール、炭水化物、胆汁、またはそれらの組合せを生産するた
めに利用される。一部の場合において、誘導肝細胞は、治療用タンパク質を生産するために利用される。一部の場合において、治療用タンパク質としては、全長タンパク質、それらのドメインもしくはフラグメント、またはペプチドが挙げられる。一部の場合において、タンパク質、それらのドメインもしくはフラグメント、またはペプチドは、天然および／または非天然アミノ酸残基を含有する。一部のケースにおいて、治療用タンパク質、それらのフラグメント、またはペプチドとしては、これらに限定されないが、主要な血漿タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、可溶性血漿フィブロネクチン、α−フェトプロテイン、Ｃ反応性タンパク質、および数々のグロブリン；血流遮断および線維素溶解に関与するタンパク質、例えば凝血カスケードに関与する凝血因子、α２−マクログロブリン、α１−アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＳ、プロテインＣ、プラスミノゲン、α２−抗プラスミン、および補体成分３；担体タンパク質、例えばアルブミン、セルロプラスミン、トランスコルチン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ＩＧＦ結合タンパク質、主要な尿タンパク質、レチノール結合タンパク質、性ホルモン結合グロブリン、トランスチレチン、トランスフェリン、およびビタミンＤ結合タンパク質；ホルモン、例えばインスリン様増殖因子１、トロンボポエチン、ヘプシジン、およびベータトロフィン；プロホルモン、例えばアンギオテンシノゲン；ならびにアポリポタンパク質が挙げられる。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、ホルモンまたはそれらのフラグメントを生産するために利用される。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、インスリン様増殖因子１、トロンボポエチン、ヘプシジン、ベータトロフィン、アンギオテンシノゲン、またはそれらのフラグメントを生産するために利用される。
[00180]一部の場合において、誘導肝細胞は、サイトカインを生産するために利用され
る。本明細書の他所で説明されるように、サイトカインとしては、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、および腫瘍壊死因子が挙げられる。一部の実施態様において、サイトカインは、炎症促進性サイトカインである。一部の実施態様において、サイトカインとしては、ケモカインのＣ−Ｘ−ＣおよびＣ−Ｃサブファミリー：ＣＣＬ１、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９（または ＣＣＬ１０）、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、および ＣＸＣＬ１７が挙げられる。一部の実施態様において、サイトカインとしては、増殖関連（ＧＲＯ）−アルファ、ＧＲＯ−ベータ、ＧＲＯ−ガンマ、上皮好中球活性化ペプチド−７８（ＥＮＡ−７８）、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびサイトカイン誘導好中球化学誘引物質（ＣＩＮＣ）が挙げられる。一部の場合において、誘導肝細胞は、本明細書で説明される１つまたはそれより多くのサイトカインを生産するために利用される。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、これらに限定されないが、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９（またはＣＣＬ１０）、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、増殖関連（ＧＲＯ）−アルファ、ＧＲＯ−ベータ、ＧＲＯ−ガンマ、上皮好中球活性化ペプチド−７８（ＥＮＡ−７８）、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびサイトカイン誘導好
中球化学誘引物質（ＣＩＮＣ）などのサイトカインを生産するために利用される。
[00181]一部の場合において、誘導肝細胞は、コレステロールの生産またはプロセシン
グのために利用される。本明細書で使用される場合、用語「コレステロール」は、コレステロール、その立体異性体（例えばｎａｔ−コレステロール、またはｅｎｔ−コレステロール）、天然に存在するコレステロール、遺伝子改変されたコレステロール、またはそれらのフラグメントを包含する。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、ｎａｔ−コレステロールまたはそれらのフラグメントの生産またはプロセシングのために利用される。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、ｅｎｔ−コレステロールまたはそれらのフラグメントの生産またはプロセシングのために利用される。
[00182]一部の場合において、誘導肝細胞は、炭水化物の生産またはプロセシングのた
めに利用される。一部の場合において、誘導肝細胞は、炭水化物の形成、分解または相互変換、糖新生、グリコーゲン分解、糖生成、上記で開示されたようなコレステロール合成を包含する脂質代謝、および脂質生成のために利用される。
[00183]一部の場合において、誘導肝細胞は、胆汁を生産するために利用される。
[00184]本明細書で使用される場合、アミノ酸残基は、アミノ基とカルボキシル基の両
方を含有する分子を指す場合がある。好適なアミノ酸としては、これらに限定されないが、天然に存在するアミノ酸のＤ−およびＬ−異性体の両方、加えて他の代謝経路により調製された天然に存在しないアミノ酸が挙げられる。アミノ酸という用語は、本明細書で使用される場合、これらに限定されないが、α−アミノ酸、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸類似体を包含する。
[00185]用語「α−アミノ酸」は、α−炭素と指定された炭素に結合した、アミノ基と
カルボキシル基の両方を含有する分子を指す場合がある。
[00186]用語「β−アミノ酸」は、アミノ基とカルボキシル基の両方をβ配置で含有す
る分子を指す場合がある。
[00187]「天然に存在するアミノ酸」は、天然に合成されたペプチドに一般的に見出さ
れ、１文字の略語Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶで識別される２０種のアミノ酸のいずれか１つを指す場合がある。
[00188]用語「アミノ酸類似体」は、アミノ酸に構造的に類似しており、ペプチドミメ
ティクスの大員環の形成中にアミノ酸を置換することができる分子を指す。アミノ酸類似体としては、これらに限定されないが、β−アミノ酸、およびアミノまたはカルボキシ基が、類似した反応性を有する基で置換されている（例えば、第一アミンが第二または第三アミンで置換されている、またはカルボキシ基がエステルで置換されている）アミノ酸が挙げられる。
[00189]用語「非天然アミノ酸」は、天然に合成されたペプチドに一般的に見出され、
１文字の略語Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶで識別される２０種のアミノ酸の１つではないアミノ酸を指す。非天然アミノ酸としては、これらに限定されないが、ｐ−アセチルフェニルアラニン、ｍ−アセチルフェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（２−アミノ−３−ヒドロキシエチル）フェニルアラニン、ｐ−イソプロピルチオカルボニル−フェニルアラニン、ｐ−エチルチオカルボニル−フェニルアラニン、ｏ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ−アジドフェニルアラニン、フェニルセレニジルアラニン、ｐ−ベンゾイル−ｌ−フェニルアラニン、またはｐ−ボロノフェニルアラニンが挙げられる。
肝再生のための誘導肝細胞
[00190]他の実施態様において、誘導肝細胞は、肝再生のために利用される。他の実施態
様において、誘導肝細胞は、エクスビボにおける肝再生のために利用される。一部のケースにおいて、エクスビボにおける肝再生は、エクスビボの潅流システムを利用する。一部の場合において、エクスビボの潅流システムとしては、エクスビボの潅流バイオリアクターシステム（例えば３Ｄ潅流バイオリアクターシステム）が挙げられる。一部のケースにおいて、エクスビボにおける肝再生は、バイオプリンティングシステムを利用する。一部の場合において、バイオプリンティングシステムは、３次元（３Ｄ）バイオプリンティングシステムである。一部のケースにおいて、エクスビボにおける肝再生は、３Ｄバイオプリンティングシステムを利用する。一部の実施態様において、３Ｄバイオプリンティングシステムとしては、ＯｒｇａｎｏｖｏのＮｏｖｏＧＥｎ ＭＭＸバイオプリンター、ＥｎｖｉｓｉｏｎＴＥＣのＢｉｏＰｌｏｔｔｅｒ（登録商標）、ＧｅＳｉｍｓのＢｉｏＳｃａｆｆｏｌｄｅｒ ２．１、またはｒｅｇｅｎＨｕのＢｉｏＦａｃｔｏｒｙ（登録商標）が挙げられる。一部の実施態様において、３Ｄバイオプリンティングシステムとしては、ＯｘＳｙＢｉｏによる３Ｄプリンティング技術が挙げられる。
[00191]一部の実施態様において、３Ｄバイオプリンティングシステムとしては、ＵＳ
８６９１９７４、ＵＳ８６９１２７４、ＵＳ２０１４００５２２８５、ＵＳ２０１４００１２４０７、ＵＳ２０１４００９９７０９、ＵＳ２０１４００９３９３２、ＵＳ２０１３０３０４２３３、ＵＳ２０１３０００４４６９、ＵＳ２０１３００１７５６４、ＵＳ２０１３０１６４３３９、ＵＳ２０１２００８９２３８、ＵＳ２０１１０２５０６８８、ＵＳ２００９０２０８４６６、ＥＰ２６７９６６９、ＷＯ２０１４０３９４２７、ＷＯ２０１３１８１３７５、ＷＯ２０１３０４００８７、およびＷＯ２０１２１２２１０５に記載されたシステムが挙げられる。
[00192]一部の実施態様において、誘導肝細胞は、流システム（例えばエクスビボの潅
流システム）を使用する肝再生のために利用される。一部の実施態様において、誘導肝細胞は、エクスビボの潅流バイオリアクターシステム（例えば３Ｄ潅流バイオリアクターシステム）を使用する肝再生のために利用される。一部の場合において、誘導肝細胞は、バイオプリンティングシステム（例えば３Ｄバイオプリンティングシステム）を使用する肝再生のために利用される。一部の場合において、誘導肝細胞は、ＯｒｇａｎｏｖｏのＮｏｖｏＧＥｎ ＭＭＸバイオプリンター、ＥｎｖｉｓｉｏｎＴＥＣのＢｉｏＰｌｏｔｔｅｒ（登録商標）、ＧｅＳｉｍｓのＢｉｏＳｃａｆｆｏｌｄｅｒ ２．１、または ｒｅｇｅｎＨｕのＢｉｏＦａｃｔｏｒｙ（登録商標）を使用する肝再生のために利用される。一部の場合において、誘導肝細胞は、ＯｘＳｙＢｉｏによる３Ｄプリンティング技術を使用する肝再生のために利用される。
[00193]一部のケースにおいて、誘導肝細胞は、ＵＳ８６９１９７４、ＵＳ８６９１２
７４、ＵＳ２０１４００５２２８５、ＵＳ２０１４００１２４０７、ＵＳ２０１４００９９７０９、ＵＳ２０１４００９３９３２、ＵＳ２０１３０３０４２３３、ＵＳ２０１３０００４４６９、ＵＳ２０１３００１７５６４、ＵＳ２０１３０１６４３３９、ＵＳ２０１２００８９２３８、ＵＳ２０１１０２５０６８８、ＵＳ２００９０２０８４６６、ＥＰ２６７９６６９、ＷＯ２０１４０３９４２７、ＷＯ２０１３１８１３７５、ＷＯ２０１３０４００８７、またはＷＯ２０１２１２２１０５に記載された３Ｄバイオプリンティングシステムを使用する肝再生のために利用される。
[00194]一部の場合において、誘導肝細胞は、上述した方法の１つまたはそれより多く
により組織足場を生成するために利用される。一部の場合において、組織足場は、２次元（２Ｄ）の組織足場または３次元（３Ｄ）の組織足場である。一部の場合において、組織
足場は、３Ｄ組織足場である。一部の場合において、誘導肝細胞は、３Ｄ組織足場の生成のために利用される。一部の実施態様において、３Ｄ足場は、１つまたはそれより多くの細胞外マトリックス要素、例えば、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ポリリシン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸、ヒアルロナンヒドロゲル、絹フィブロイン、キトサンまたは上記のもののいずれかの複合材料で予めコーティングされる。一部の実施態様において、細胞は、３Ｄ足場に、２Ｄ培養の場合より高い密度で植え付けられ、例えば３倍高い、または５倍高い、または１０倍高い密度で植え付けられる。一部の実施態様において、細胞は、細胞生存因子、例えばＲＯＣＫ Ｒｈｏキナーゼの阻害剤の存在下で植え付けられる。
[00195]一部の形態において、本明細書に記載の組織を生成するのに、生体適合性の基
板が使用され、例えば、細胞は、３次元の生体適合性の基板上で培養培地のもとで培養される。一部の実施態様において、生体適合性の基板は、ポリマー製の基板を含む。一部の実施態様において、生体適合性の基板は、生分解性である。一部の実施態様において、ポリマー製の基板は、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）を含む。一部の実施態様において、ポリマー製の基板は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリ−Ｄ−乳酸（ＰＤＬＡ）、ポリグリコリド、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、ポリジオキサノン、ポリグルコネート、ポリ乳酸−ポリエチレンオキシドコポリマー、変性セルロース、コラーゲン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシプロピオン酸（polyhydroxpriopionic acid）、ポリホスホエステル、ポリ（アル
ファ−ヒドロキシ酸）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、分解性ウレタン、脂肪族ポリエステルポリアクリレート、ポリメタクリレート、アシル置換酢酸セルロース、非分解性ポリウレタン、ポリスチレン、塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリビニルイミダゾール、クロロスルホン化ポリオレフィン（polyolifin）、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、テフロンＲＴＭ、ナイロンシリコン、ポリ（スチレン−ブロック−ブタジエン）、ポリノルボルネン、ヒドロゲル、金属合金およびオリゴ（ε−カプロラクトン）ジオールからなる群より選択される。一部の実施態様において、生体適合性の基板は、合成ポリマーを含む。本発明の一部の実施態様によれば、生体適合性の基板は、天然のポリマーを含む。一部の実施態様において、生分解性の基板は、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリグリコール酸、ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、腸線縫合糸、綿、セルロース、ゼラチン、デキストラン、アルギネート、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ヒアルロン酸、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリ４ヒドロキシ酪酸（Ｐ４ＨＢ）およびポリグルコン酸（ＰＧＡ）からなる群より選択される。
遺伝子治療のための源としての誘導肝細胞
[00196]追加の実施態様において、誘導肝細胞は、遺伝子治療のための源として利用され
る。一部の場合において、遺伝子治療は、エクスビボにおける遺伝子治療である。一部の場合において、誘導肝細胞は、肝臓関連の疾患または障害の遺伝子治療処置のための治療剤として利用される。一部の場合において、遺伝子治療処置は、誘導肝細胞ベースの遺伝子治療である。一部の場合において、誘導肝細胞ベースの遺伝子治療は、例えば欠損したまたは失われた遺伝子産物を置き換えること、同種移植片拒絶反応を予防すること、宿主の肝臓を生着させることなどに利用され、異種の肝細胞を生成すること、または患者特異的な肝臓の処置または再生に適合させることに役立つ。
[00197]本明細書の他所で説明されるように、肝臓関連の疾患または障害としては、ア
ラジール症候群、アルファ１抗トリプシン欠乏症、自己免疫肝炎、良性肝腫瘍、胆道閉鎖、硬変症、嚢胞性肝疾患、アルコール関連の肝疾患および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を包含する脂肪性肝疾患、ガラクトース血症、胆石、ギルバート症候群、ヘモクロマトーシス、肝嚢胞、肝臓がん、妊娠中の肝疾患（例えば妊娠性急性脂肪肝、妊娠
中の肝内胆汁うっ滞、子癇前症、またはＨＥＬＬＰ症候群（溶血、肝臓検査値の上昇、低い血小板数））、新生児肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、ポルフィリン症、ライ症候群、サルコイドーシス、中毒性肝炎、糖原病１型、チロシン血症、ウイルス性肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、およびウィルソン病が挙げられる。
[00198]一部の場合において、誘導肝細胞は、アラジール症候群、アルファ１抗トリプ
シン欠乏症、自己免疫肝炎、良性肝腫瘍、胆道閉鎖、硬変症、嚢胞性肝疾患、アルコール関連の肝疾患および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を包含する脂肪性肝疾患、ガラクトース血症、胆石、ギルバート症候群、ヘモクロマトーシス、肝嚢胞、肝臓がん、妊娠中の肝疾患（例えば妊娠性急性脂肪肝、妊娠中の肝内胆汁うっ滞、子癇前症、またはＨＥＬＬＰ症候群（溶血、肝臓検査値の上昇、低い血小板数））、新生児肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、ポルフィリン症、ライ症候群、サルコイドーシス、中毒性肝炎、糖原病１型、チロシン血症、ウイルス性肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、ウィルソン病、またはそれらの組合せの遺伝子治療処置のための治療剤として利用される。
[00199]一部の場合において、遺伝子は、ウイルス的または非ウイルス的な手段を介し
て誘導肝細胞に移行される。一部の場合において、ウイルス的手段としては、ベクター、例えばマウス白血病レトロウイルスおよびレンチウイルス、アデノ関連ウイルス、Ｔ抗原欠失ＳＶ４０ウイルス、神経向性ウイルス、例えば単純疱疹ウイルス、エピソームウイルスおよびハイブリッドウイルス、例えばアデノ関連ウイルスからのベクターが挙げられる。一部の場合において、非ウイルス的な手段としては、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、無機ナノ粒子、またはハイブリッドベクター、例えばリポソームとＨＩＶまたはインフルエンザウイルスなどの不活性化ウイルスとの組合せであるビロソームが挙げられる。一部の場合において、追加の非ウイルス的な手段としては、裸のＤＮＡの注射、エレクトロポレーション、ジーンガン、ソノポレーション、またはマグネトフェクションが挙げられる。ウイルス的または非ウイルス的な手段による遺伝子移行方法は当業界において周知であり、例えば、Guhaら、「Hepatocyte-based gene therapy」、J Hepatobillary Pancreat Surg. 8（1）：51〜57（2001）で説明されている。
[00200]遺伝子は、本明細書で使用される場合、一緒に関連された少なくとも２つのヌ
クレオチドを含有していてもよい。一部の場合において、本明細書で説明される核酸は、ホスホジエステル結合、天然の核酸、または非天然の核酸を含有していてもよい。天然の核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）の両方が挙げられ、１文字の略語Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、およびＵで識別される。例示的な非天然の核酸としては、これらに限定されないが、ジアミノプリン、イソグアニン、イソシトシン、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン、ピロール−２−カルバルデヒド、２，６−ビス（エチルチオメチル）ピリジン、ピリジン−２，６−ジカルボキシアミド、４−メチルベンズイミダゾール、２，３−ジフルオロトルエン、ｄ５ＳＩＣＳ、およびｄＮａＭが挙げられる。
診断方法
[00201]上記で説明されたバイオマーカーの発現または存在を決定するための方法は当業
界において周知であり、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、ウェスタンブロット、免疫沈降、磁気ビーズ選択、およびこれらの細胞表面マーカーのいずれかを発現する細胞の定量化によって測定することができる。バイオマーカーであるＲＮＡの発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｑｔ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、ノーザンブロット、または他の類似の技術によって測定することができる。
[00202]「発現を検出すること」または「発現レベル」を検出することは、生体サンプ
ル中のバイオマーカータンパク質または遺伝子の発現レベルまたは存在を決定することと意図される。したがって、「発現を検出すること」は、バイオマーカーが、発現されない
、検出可能に発現されない、低いレベルで発現される、正常なレベルで発現される、または過剰発現されることが決定されるような例を包含する。
[00203]一部の実施態様において、本明細書で説明されるバイオマーカーの発現または
存在は、例えば、免疫組織化学技術または核酸ベースの技術、例えばインサイチュハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲを使用して、核酸レベルで決定される。一実施態様において、１つまたはそれより多くのバイオマーカーの発現または存在は、核酸増幅のための手段、核酸配列決定のための手段、核酸マイクロアレイ（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を利用する手段、または特異的に標識されたプローブを使用する」インサイチュハイブリダイゼーションのための手段によって行われる。
[00204]他の実施態様において、バイオマーカーの発現または存在の決定は、ゲル電気
泳動を介して行われる。一実施態様において、決定は、膜への移行および特異的なプローブでのハイブリダイゼーションを介して行われる。
[00205]他の実施態様において、バイオマーカーの発現または存在の決定は、画像診断
技術によって行われる。
[00206]さらに他の実施態様において、バイオマーカーの発現または存在の決定は、検
出可能な固体基板によって行われる。一実施態様において、検出可能な固体基板は、抗体で官能化した常磁性のナノ粒子である。
[00207]一部の実施態様において、バイオマーカーの発現または存在は、ＲＮＡ（例え
ばｍＲＮＡ）レベルにおいてである。一部の実施態様において、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）レベルを検出する技術としては、これらに限定されないが、サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析およびプローブアレイが挙げられる。
[00208]ｍＲＮＡレベルを検出するための方法の１つは、単離されたｍＲＮＡを、検出
される遺伝子によってコードされたｍＲＮＡにハイブリダイズする核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。核酸プローブは、例えば、全長ｃＤＮＡ、またはそれらの部分、例えば長さが少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、本明細書で説明されるバイオマーカーをコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分な部分を含む。ｍＲＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションは、バイオマーカーまたは他の目的の標的タンパク質が発現されていることを表す。
[00209]一実施態様において、ｍＲＮＡは、固体表面に固定され、例えばアガロースゲ
ル上に単離されたｍＲＮＡを泳動させることによってプローブと接触させ、ゲルからニトロセルロースなどの膜にｍＲＮＡを移行させる。代替の実施態様において、プローブは、固体表面上に固定され、ｍＲＮＡは、例えば遺伝子チップアレイでプローブと接触させる。当業者は、目的のバイオマーカーまたは他のタンパク質をコードするｍＲＮＡレベルの検出で使用するために、公知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適応させる。
[00210]サンプル中の目的のｍＲＮＡのレベルを決定するための代替方法は、例えば、
ＲＴ−ＰＣＲ（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号を参照）、リガーゼ連鎖反応（Barany（1991） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：189 193）、自家持続配列複製法（Guatelliら（1990） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：1874〜1878）、転写増幅系（Kwohら
（1989） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：1173〜1177）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Lizardiら（1988）Bio/Technology 6：1197）、ローリングサークル複製（米国特許第５,８５４,０３３号）または他のあらゆる核酸増幅方法による核酸増幅のプロセス、それに続
いて当業者周知の技術を使用する増幅された分子の検出を含む。これらの検出スキームは
、このような分子が極めて少ない数で存在する場合、核酸分子の検出に特に有用である。一部の実施態様において、バイオマーカーの発現は、定量的な蛍光原性ＲＴ−ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎ０システム）によって評価される。
[00211]目的のＲＮＡの発現レベルは、膜ブロッティング（例えば例えばノーザン、ド
ットなどのハイブリダイゼーション分析で使用されるもの）、またはマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズもしくは繊維（または結合した核酸を含むあらゆる固体支持体）を使用してモニターされる。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，７７０，７２２号、５，８７４，２１９号、５，７４４，３０５号、５，６７７，１９５号および５，４４５，９３４を参照されたい。また発現の検出は、溶液中での核酸プローブの使用も含む。
[00212]一部の実施態様において、１つまたはそれより多くのバイオマーカーの発現ま
たは存在を決定するために、マイクロアレイが使用される。核酸マイクロアレイは、膨大な数の遺伝子の発現レベルを同時に測定する１つの方法を提供する。各アレイは、固体支持体に付着させた捕獲プローブの再現可能なパターンからなる。標識されたＲＮＡまたはＤＮＡは、アレイ上の相補的プローブにハイブリダイズし、次いでアレイ上の各プローブごとのレーザースキャニングによって検出される。ハイブリダイゼーション強度が決定され、相対的な遺伝子発現レベルを表す定量的な値に変換される。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，０４０，１３８号、５，８００，９９２号および６，０２０，１３５号、６，０３３，８６０号、ならびに６，３４４，３１６号を参照されたい。サンプル中の多数のＲＮＡに関する遺伝子発現プロファイルを決定するためには、高密度のオリゴヌクレオチドアレイが特に有用である。
[00213]機械的な合成方法を使用してこれらのアレイを合成するための技術は、例えば
、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第５，３８４，２６１号で説明されている。一部の実施態様において、アレイは、実質的にあらゆる形状の表面上に製作され、または多数の表面上にも製作される。一部の実施態様において、アレイは、平面のアレイ表面である。一部の実施態様において、アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー製の表面、繊維、例えば光ファイバー、ガラスまたは他のあらゆる適切な基板上にペプチドまたは核酸を包含する。それぞれがあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，７７０，３５８号、５，７８９，１６２号、５，７０８，１５３号、６，０４０，１９３号および５，８００，９９２号を参照されたい。一部の実施態様において、アレイは、診断または全てを包括するデバイスの他の操作を可能にするような方式でパッケージ化されている。
[00214]一部の実施態様において、本明細書で説明されるバイオマーカーの発現または
存在は、例えば特異的なバイオマーカータンパク質に向けられた抗体を使用して、タンパク質レベルで決定される。これらの抗体は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、マルチプレクシング技術、免疫沈降、または免疫組織化学技術などの様々な方法で使用される。一部の実施態様において、バイオマーカーの検出は、ＥＬＩＳＡによって達成される。一部の実施態様において、バイオマーカーの検出は、電気化学発光（ＥＣＬ）電気化学発光（ＥＣＬ）によって達成される。
[00215]生体サンプル中のバイオマーカーを特異的に同定し定量するためのあらゆる手
段が予期される。したがって、一部の実施態様において、生体サンプル中の目的のバイオマーカータンパク質の発現レベルは、そのバイオマーカータンパク質と特異的に相互作用することが可能な結合タンパク質またはそれらの生物学的に活性なバリアントによって検出される。一部の実施態様において、標識された抗体、それらの結合部分、または他の結合パートナーが使用される。「標識」という言葉は、本明細書において使用される場合、
「標識された」抗体が生成されるように抗体に直接的または間接的にコンジュゲートしている検出可能な化合物または組成物を指す。一部の実施態様において、標識は、それ自身検出可能であるか（例えば、放射線同位体標識または蛍光標識）、または酵素標識のケースにおいて、基質化合物または組成物の検出可能な化学的変更を触媒する。
[00216]バイオマーカータンパク質を検出するための抗体は、元来、モノクローナルま
たはポリクローナルのいずれかであるか、または合成的に、または組換え生産される。複合体化したタンパク質の量、例えば、結合タンパク質と会合するバイオマーカータンパク質、例えばバイオマーカータンパク質に特異的に結合する抗体の量が、当業者公知の標準的なタンパク質検出手法を使用して決定される。免疫学的アッセイの設計、理論およびプロトコールの詳細な総論は、当業界における多数の教本で見出される（例えば、Ausubel
ら編（1995）Current Protocols in Molecular Biology）（Greene Publishing およびWiley-Interscience、NY））；Coliganら編（1994）Current Protocols in Immunology（John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク）を参照されたい）。
[00217]抗体を標識するのに使用されるマーカーの選択は、適用に応じて様々であると
予想される。しかしながら、マーカーの選択は、当業者であれば容易に決定することができる。これらの標識された抗体は、いずれかの目的のバイオマーカーまたはタンパク質の存在を検出するためのイムノアッセイ、加えて組織学的な適用で使用される。標識された抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかである。さらに、目的のタンパク質の検出で使用するための抗体は、本明細書の他所で説明されるような放射性原子、酵素、色素生産または蛍光性成分、または比色タグで標識される。タグ付け標識の選択はまた、望ましい検出限界にも依存すると予想される。酵素アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、典型的には、酵素タグを有する複合体と酵素基質との相互作用によって形成された色付きの生成物の検出を可能にする。検出可能な標識として役立つ放射性核種としては、例えば、１−１３１、１−１２３、１−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、およびＰｄ−１０９が挙げられる。検出可能な標識として役立つ酵素の例としては、これらに限定されないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。色素生産成分としては、これらに限定されないが、フルオレセインおよびローダミンが挙げられる。抗体は、当業界において公知の方法によってこれらの標識にコンジュゲートされる。例えば、酵素および色素生産分子は、カップリング剤、例えばジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミドなどによって、抗体にコンジュゲートされる。代替として、コンジュゲーションは、リガンド−受容体対を介して起こる。好適なリガンド−受容体対の例は、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジン、および抗体−抗原である。
[00218]ある特定の実施態様において、生体サンプル中の目的の１つまたはそれより多
くのバイオマーカーまたは他のタンパク質の発現または存在は、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫検査法（ＥＬＩＳＡ）、競合結合酵素結合免疫検査法、ドットブロット（例えば、Promega Protocols and Applications Guide、プロメガ社（Promega Corporation）（1991）を参照）、ウェスタンブロット（例えば、Sambrookら（1989）Molecular Cloning, A Laboratory Manual、3巻、18章（Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニ
ューヨーク州プレインビューを参照）、クロマトグラフィー、例えば高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、または当業界において公知の他のアッセイによって決定される。したがって、検出アッセイは、これらに限定されないが、免疫ブロッティング、免疫拡散、免疫電気泳動法、または免疫沈降などの工程を含む。
キット／製品
[00219]ある特定の実施態様において、本明細書で説明される１つまたはそれより多くの
方法および組成物と共に使用するためのキットおよび製品が本明細書で開示される。このようなキットは、例えばバイアル、チューブなどの１つまたはそれより多くの容器を受け入れるように区分けされている、キャリアー、包装、または容器を包含し、容器のそれぞれは、本明細書で説明される方法で使用される別々の要素の１つを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。一実施態様において、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成される。
[00220]本明細書において提供される製品は、包装材料を含有する。医薬品の包装材料
の例としては、これらに限定されないが、ブリスターパック、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル、ならびに選択された調合物および意図した使用様式に好適なあらゆる包装材料が挙げられる。
[00221]例えば、容器は、ｈＴＳ細胞を、任意選択で本明細書で開示されるような組成
物形態で包含する。このようなキットは、任意選択で、識別のための記載もしくはラベル、または本明細書で説明される方法におけるその使用に関する説明書を包含する。
[00222]キットは、典型的には、内容物を列挙したラベルおよび／または使用説明書、
ならびに使用説明書を含む添付文書を包含する。典型的には、説明書のセットも包含されると予想される。
[00223]一部の実施態様において、ラベルは、容器上にあるか、または容器と関連付け
られている。一実施態様において、ラベルを形成する文字、数値または他の記号が、容器それ自身に付着、成形またはエッチングされている場合、ラベルは容器上にある。同様に容器を保持する貯蔵器またはキャリアー内にラベルが、例えば添付文書として存在する場合、ラベルは容器と関連付けられている。一実施態様において、ラベルは、内容物が具体的な治療的用途に使用されるべきものであることを示すために使用される。ラベルはまた、内容物を、例えば本明細書で説明される方法で使用するための指示も表す。
[00224]これらの実施例は、単に例示的な目的のために提供され、本明細書で提供され
る特許請求の範囲を限定しないものとする。
実施例１
細胞培養および分化
[00225]未分化のｈＴＳ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＳＡＦＣバイオサイエ
ンス（SAFC Biosciences））が補充されたα−ＭＥＭ（ギブコ（Gibco））中で維持した
。２〜３日ごとに、培養物を１：３〜１：６の分割比で手動で継代した。１０％ＦＢＳ、１ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０ｍＭのニコチンアミド、および１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有する馴化α−ＭＥＭ培地によって、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中で８時間、ＤＥを分化させた。肝細胞の分化のために、培養された培地に、デキサメタゾン（０．１μＭ、シグマ（Sigma））および組換えヒトオンコスタチンＭ（１０ｎ
ｇ／ｍｌ、エクセル−バイオメディカル社（Excel-Biomedical Inc.））を添加し、追加
の４日または６日間インキュベートした。
[00226]研究は、ヒト対象研究に関する施設内倫理審査委員会および倫理委員会、高雄
医学大学病院によって承認された。インフォームドコンセントと共にｈＴＳ細胞を得た。
プラスミド
[00227]ＭｉＲ−１２４ａ前駆体および抗ｍｉＲ−１２４ａを、システムバイオサイエン
ス（System Biosciences）から購入した。簡単に言えば、ｍｉＲ−１２４ａ前駆体（６０ｐｍｏｌ）または抗ｍｉＲ−１２４ａ（６０ｐｍｏｌ）を、１２ウェルの培養皿中で、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１トランスフェクション試薬（ミルス（Mirus）、ウィスコンシン州
マディソン）を使用してｈＴＳ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後にｍｉＲ−１２４ａを定量するために、全ＲＮＡを使用した。ＰＩ３Ｋ（ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００２３３９７１およびＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００１２７７８７）、ＡＫＴ１（ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００２０５５４５）、およびＡＫＴ２（ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿０００３５０５５）を標的化する短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、シグマから購入した。ＣＲＥＢ１（ＴＲＣＮ００００００７３１０、ＴＲＣＮ００００２２６４６７およびＴＲＣＮ００００２２６４６８）、ＳＭＡＤ４（ＴＲＣＮ０００００１０３２１、ＴＲＣＮ０００００１０３２３およびＴＲＣＮ０００００４００３２）、ＡＫＴ３（ＴＲＣＮ００００００１６１５およびＴＲＣＮ００００００１６１６）、ＯＣＴ４（ＴＲＣＮ００００００４８７９およびＴＲＣＮ００００００４８８２）、ＣＤＸ２（ＴＲＣＮ０００００１３６８３およびＴＲＣＮ０００００１３６８６）、および対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈＧＦＰ；ＴＲＣＮ０００００７２１７８、ＴＲＣＮ０００００７２１７９およびＴＲＣＮ０００００７２１８３）を標的化する短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を、ナショナルＲＮＡｉコアプラットフォーム（National RNAi Core platform）、中央研究院、台湾から購入
した。２μgのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡに加えて４μlのトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションを実行した。
ウェスタンブロットおよび免疫沈降（ＩＰ）
[00228]免疫ブロッティングアッセイのために、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害
剤（ロシュ（Roche））が補充されたＲＩＰＡ溶解溶液（ミリポア（Millipore）、マサチューセッツ州ビレリカ）に細胞を回収した。ポリアクリルアミドゲル上で３０μｇの溶解産物を電気泳動した後、ＰＤＶＦ膜上へのエレクトロブロッティング（ミリポア）を実行した。ＰＢＳ中の５％無脂肪乳によって室温で（１時間）ブロックした後、一次抗体を使用することによって標的タンパク質を検出した。全ての膜を化学発光物質（ミリポア）と共にインキュベートし、撮像をＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳシステム（バイオ−ラッド（Bio-RAD））によって捕獲した。表１に使用された抗体を列挙した。ＡｌｐｈａＥａｓｅＦ
Ｃ（バージョン４．０．０）システムによってデータを分析した。ＩＰアッセイのために、ｂＦＧＦで処理したｈＴＳ細胞の細胞溶解産物を収集した。プロテインＧ−アガロース（ミリポア）と３０分インキュベートすることによって、総タンパク質（１００μｇ）を、表１に列挙された特異的な一次抗体で一晩処理した。プロテインＧ−アガロースビーズで（２時間）処理した後、サンプルをＲＩＰＡ溶解緩衝液（ミリポア）で３回洗浄し、その後、タンパク質ローディング色素を添加し、５分沸騰させた。８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってサンプルを分離し、免疫ブロッティング分析に供した。
ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびクロマチン免疫沈降（ＣＨｉＰ）−ｑＰＣＲアッセイ
[00229]ｍＲＮＡ発現のために、３連または５連のサンプルで、ＤＮＡアーゼＩによる
オンカラムでの消化（キアゲン（Qiagen）、カリフォルニア州バレンシア）と共にＴＲＩＺＯＬ試薬（インビトロジェン（Invitrogen））を使用してｈＴＳ細胞からＲＮＡを単離した。ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（バイオ−ラッド）を用いた逆転写のために、全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を使用した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を、反応１回当たりｃＤＮＡの４０分の１と４００ｎＭのフォワードおよびリバースプライマーを使用して２連で行った。比較リアルタイムＰＣＲを、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標）マスターミックス（アプライドバイオシステムズ（Applied BioSystems））を７５００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ）と共に使用して少なくとも３連で行った。全ての遺伝子をＧＡＰＤＨ発現に正規化し、ΔΔＣｔ方法を使用して未分化のｈＴＳ細胞の発現に正規化した。表２に、この研究で使用されたプライマー配列を例示する。
[00230]ｍｉＲＮＡ分析のために、２５ｎｇの全ＲＮＡを、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮ
Ａ逆転写キット（アプライドバイオシステムズ）を使用して逆転写した。ｑＰＣＲを、Ｔ
ａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（アプライドバイオシステムズ）を非テンプレート対照を包含する７５００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ）と共に使用して、ｍｉＲ−１２４ａの特異的なプライマーまたはＲＮＵ６Ｂ（アプライドバイオシステムズ）を使用して少なくとも３連で行った。Ｕ６ ｓｎＲＮＡ（ＲＮＵ６Ｂ；アプライドバイオシステムズ）を、内因性対照として利用した。
[00231]ＣｈＩＰアッセイのために、誘導中における指定された時間のｈＴＳ細胞サン
プルを最終濃度１％のホルムアルデヒドで固定した。室温で（１０分）インキュベートした後、グリシン（１２５ｍＭ）を添加することによって反応を止めた。ＣｈＩＰアッセイキット（アップステートバイオテクノロジー（Upstate Biotechnology））に付随するプ
ロトコールを使用してＣｈＩＰアッセイを実行した。十分に洗浄した後、ＣｈＩＰ処理したＤＮＡをビーズから溶出させ、ｑＰＣＲによって分析した。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
[00232]ルシフェラーゼ−３’ＵＴＲレポータープラスミドを調製するために、ｈＴＳ細
胞のゲノムＤＮＡ抽出物からの３’ＵＴＲのフラグメントを増幅した。３’ＵＴＲのＰＣＲフラグメントを、ＰｓｉＩおよびＭｆｅＩ（サーモサイエンティフィック、イリノイ州ロックフォード）を使用することによって、ｐＧＬ４．５１ベクター（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）のルシフェラーゼ遺伝子の下流にクローニングした。３’ＵＴＲレポーターコンストラクトのためのプライマーを、以下に列挙した：ＣＤＸ２の３’ＵＴＲ領域用：フォワード、５’−ａａａｔｔａｔａａｇｃｔｇｔｔｔｇｇｇｔｔｇｔｔｇｇｔｃｔ−３’およびリバース、５’−ａａａｃａａｔｔｇｃｃｃｃｃａｔａａｔｔｔｃｔｇａｃｔｇｃ−３；ＳＭＡＤ４の３’ＵＴＲ領域１用：フォワード、５’−ａａａｔｔａｔａａｃｔｃｃｃａａａｇｔｇｃｔｇｇｇａｔｔａ−３’およびリバース、５’−ａａａｃａａｔｔｇｃｔｇｃａｃｔｇｔｔｃａｃａｇｇａｇｇａ−３；ＳＭＡＤ４の３’ＵＴＲ領域２用：フォワード、５’−ａａａｔｔａｔａａｃａｇｔｔｇｔｃｃｃａｇｔｇｃｔｇｃｔａ−３’およびリバース、５’−ａａａｃａａｔｔｇａｔｇａｃｔｔｇｃｃｃａａａｇｇｔｃａｃ−３；ＧＳＫ３βの３’ＵＴＲ領域用：フォワード、５’−ａａａｔｔａｔａａｃｃｃａｃａａｃｔｇｇｇｇｔａａａａｇａ−３’およびリバース、５’−ａａａｃａａｔｔｇｃｔｇｔｇｇａａｇｇｇｇｃａａａｇａｔａ−３。
[00233]デュアルルシフェラーゼアッセイのために、ホタルルシフェラーゼレポーター
（５００ｎｇ）またはｐＧＬ４．７４で共にトランスフェクトされた３’ＵＴＲを全く含まない空のベクターおよびウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（５００ｎｇ、プロメガ）、ならびに非特異的対照であるｍｉＲＮＡ（３０ｐｍｏｌ）またはｍｉＲ−１２４ａ前駆体（３０ｐｍｏｌ；システムバイオサイエンス、カリフォルニア州マウンテンビュー）を、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＬＴ１トランスフェクション試薬（ミルスバイオ社（Mirus Bio LLC）、ウィスコンシン州マディソン）を使用して、ｈＴＳ細胞に共にトラ
ンスフェクトした（各ウェル中１．５×１０４個の細胞）。トランスフェクション（３６時間）後、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（プロメガ）およびＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０マイクロプレートルミノメーター（ベルトールドテクノロジー（（Berthold Technologies）、バートヴィルトバート、ドイツ）によってルシフェラーゼ活
性を分析した。評価のために、まずウミシイタケルシフェラーゼ値をホタルルシフェラーゼ活性に正規化し、各３’ＵＴＲレポーターの計算された活性をさらに対照ベクターに正規化した。データを平均±ＳＤ、ｎ＝８として表し、ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。細胞溶解緩衝液中で調製された全細胞抽出物を、ＣＤＸ２、ＳＭＡＤ４、ＧＳＫ３β、およびβ−アクチン抗体を用いた免疫ブロッティングに供した。
免疫蛍光染色
[00234]細胞培養を含むスライドを９５％（ｖ／ｖ）エタノール中で室温で３０分固定し
、ＰＢＳ中で３回洗浄し、０．１％（ｗｔ／ｖ）トリトンＸ−１００（シグマ）および５％（ｖ／ｖ）正常ロバ血清（ミリポア）を含有するブロッキング緩衝液ＰＢＳと共に６０分インキュベートした。一次および二次抗体をブロッキング緩衝液で希釈した。一次抗体をインキュベートした。ＰＢＳ中で特異的な一次抗体と４℃（２４時間）または 室温（２時間）インキュベートした後、適切なフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、インビトロジェン）またはアレクサフルオロ（Alexa Fluor）４８８、５９４、および６
４７（インビトロジェン）またはディライト（Dylight）４８８および５９４（バイオレ
ジェンド（BioLegend））がコンジュゲートした二次抗体を室温で（１時間）添加した。
細胞核をＤＡＰＩ染色した後（５分）、二次抗体と室温で（１時間）インキュベートし、洗浄し、サンプルを５０％グリセロールと共にマウントした。共焦点レーザー顕微鏡検査法（ＬＳＭ７００；ツァイス（Zeiss）のＺ１またはオリンパスのフルオビュー（FluoView）１０００共焦点レーザー顕微鏡）またはＴｉｓｓｕｅＦＡＸＳシステム（TissueQnostics GmbH、ウィーン、オーストリア）によって画像を捕獲した。ＴｉｓｓｕｅＱｕｅｓｔソフトウェアによってデータを分析した。
フローサイトメトリー
[00235]ＣＤＸ２、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧに対する非特異的なｓｈＲＮ
ＡまたはｓｈＲＮＡ、でトランスフェクトした後、細胞（１ｍｌ当たり５×１０６個の細胞）を、表１に列挙したように特異的な一次抗体と共に３０分インキュベートした。その後、適切な蛍光色素がコンジュゲートした一次抗体と調整される希釈率で４℃で１時間インキュベートし、サンプルを洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。サンプルを、細胞ストレーナーキャップを備えたポリスチレン製の丸底チューブ（ＢＤファルコン（BD Falcon））を
通過させた後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences）、カリフォルニア州サンノゼ）に供した。データをＣｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤバイオサイエンス）で分析した。
電子顕微鏡法
[00236]透過型電子顕微鏡法のために、ｈＴＳ細胞によって誘導された肝細胞様細胞（誘
導後の４日目における）を、３％ｗｔ／ｖｏｌホルムアルデヒド、１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルタルアルデヒドおよび２．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロースを含有する０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中、室温で（ＲＴ）１時間または４℃で一晩固定した。１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＯｓＯ４を含有するパラディの固定剤中での４℃でのオスミウム酸染色処理（２時間）の前および後に、サンプルを、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。タンニン酸で処理し、１％酢酸ウラニルで染色し、段階的な一連のエタノール溶液で脱水した後、サンプルをＴＡＢＢエポキシ樹脂（アガーサイエンティフィック社（Agar Scientific Ltd.））に埋め込んだ。超薄切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、ＪＥＭ−２０００ＥＸＩＩ透過型電子顕微鏡（JEOL、東京）を使用することによって分析した。
ＬＤＬの取り込みアッセイ
[00237]ＬＤＬの取り込みの細胞ベースのアッセイキットを製造元の説明書（ケイマンケ
ミカル社（Cayman Chem Co.）、ミシガン州アナーバー）の通りに使用することによって
、ＬＤＬの取り込みを実行した。簡単に言えば、５×１０４個の細胞を、２４ウェルプレートの各ウェル中のカバースリップに植え付けた。ｈＴＳ細胞（対照として）および分化した肝細胞様細胞（ｈＨＬＣ）を、５μｇ／ｍｌのＬＤＬ−ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）５４９プローブ処理（４時間、３７℃）の後に固定し、次いでウサギ抗ＬＤＬおよびＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体によってＬＤＬ受容体に関して染色した。核をＤＡＰＩで可視化した。蛍光顕微鏡検査法によって最終的な染色を観察した。
オイル−Ｏ−レッド試験
[00238]脂質の累積を検出するために、室温で（ＲＴ）４％パラホルムアルデヒドにより
分化細胞を固定し（２０分）、６０％イソプロパノールで５分洗浄した。新たに調製された６０％オイルレッドＯ溶液（使用前に０．２２μｍフィルターを通過させた、１００ｍｌイソプロパノール中の０．５ｇのオイルレッドＯ、シグマ）と共に室温（２０分）でインキュベートした後、細胞を６０％イソプロパノールで濯ぎ、顕微鏡観察のためにヘマトキシリンＩ（サーモサイエンティフィック）で対比染色した。
グリコーゲン貯蔵試験
[00239]グリコーゲン検出のために、４％パラホルムアルデヒドによって分化細胞を固定
した。固定したサンプルを０．４％トリトンＸ−１００により膜を透過化した。未分化の対照細胞をジアスターゼ（ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌ；シグマ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。細胞を過ヨウ素酸（０．５ｇを１００ｍｌ蒸留水中に溶解させた）と共に室温で５分インキュベートし、蒸留水で洗浄し、新鮮な調製済みのシッフ試薬と共にインキュベートし（１５分）、顕微鏡観察に供した。
アルブミンおよび尿素アッセイ
[00240]誘導前および誘導後の、ｈＴＳ細胞の培養培地中の総タンパク質、アルブミン、
および尿素の濃度を、自動分析器（日立７０８０；東京、日本）によって測定した。
統計的分析
[00241]全ての実験を３連で行い、指定通りに２回繰り返した。ウェスタンブロット、ｑ
ＰＣＲ、ルシフェラーゼレポーターアッセイ、およびフローサイトメトリーから得られたデータをスチューデントのｔ検定によって計算した。ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とみなした。
ｈＴＳ細胞からＤＥ系統への細胞プロセス
[00242]ヒト多能性幹細胞の肝細胞様細胞への分化において、ＤＥ形成は、細胞プロセス
中に同定されることが必要な第１の工程である。免疫蛍光顕微鏡によって、ｈＴＳ細胞において、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）は、８時間の誘導で効率的にＤＥを得ることが可能であり、特異的なバイオマーカー；フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）およびＳＲＹ−ボックス１７（ＳＯＸ１７）、グースコイド（ＧＳＣ）、およびホメオドメインタンパク質ＭＩＸＬ１を発現することが見出された（図１Ａ〜１Ｃ）。その後、免疫ブロッティングアッセイにより、ｂＦＧＦ誘導時における転写因子：ＧＳＣ、ブラキュリ（Ｔ）、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ１７、およびＦＯＸＡ２などのＤＥ関連マーカーの発現のタイムラインを確立した（図１Ｄ）。最初の１５分間でＭＩＸＬ１、ブラキュリ、およびＧＳＣのレベルが有意に上昇したことが見出され、これは、原始線条の遷移を示唆している。しかしながら、これらのレベルは３０分後に低下したことから、原始線条から新生の内中胚葉への移行が示される。具体的には、ＭＩＸＬ１レベルがピークから（１５分）４時間で最低点（天然のレベルより約５０％低い）まで減少し、これ以降、レベルが元のレベルに戻った。この事実は、イメージング研究（図１Ｃ）およびＴｉｓｓｕｅＦＡＸ分析（図７）によって裏付けられた。これらの結果から、ｉ）内胚葉からのＭＩＸＬ１のｍＲＮＡ発現は存在せず、中胚葉に限定されていること、およびｉｉ）ＭＩＸＬ１は原始線条で特異的に発現されるため、ＭＩＸＬ１の損失は、内中胚葉前駆細胞の内胚葉への潜在性への影響を有することから、内中胚葉からＤＥ段階に移行する細胞プロセスが示唆された。ＳＯＸ１７レベルは２時間でピークまでアップレギュレートされたが（１．５倍）、８時間でダウンレギュレートされ、一方でＦＯＸＡ２は８時間で最大レベルに（３倍）継続的にアップレギュレートされた（図１Ｄ）。しかしながら、３０分から１時間のＧＳＣのダウンレギュレーションが見られたが、それでもなお元のレベルよりわずかに高いレベルを持続した（図１Ｄ）。そのために、これらのデータから、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ
）は、８時間の誘導で、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、およびＧＳＣをアップレギュレートし、ただしＭＩＸＬ１をダウンレギュレートすることによって、ｈＴＳ細胞のＤＥ系統への分化転換を高効率の方式で誘導することを可能にすることが示唆される。そこから、ＤＥは、肺、食道、胃、および腸における上皮の内層、加えて肝臓、膵臓、および甲状腺などの内分泌腺を発生させる。
ＨＮＦ４α発現によってデキサメタゾンおよびＳＯＸ１７により促進される最終的な肝臓への分化
[00243]肝細胞核因子４（ＨＮＦ４）は、ヒト肝臓前駆細胞の特定化に必須の転写因子で
ある。デキサメタゾン（Ｄｅｘａ）はＨＮＦ４α発現を誘導することから、サイトカインであるオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）は、胎児の肝臓発達に関与する。誘導から８時間に馴化培養培地にデキサメタゾン（０．１μＭ）およびオンコスタチンＭ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加することによって、４日後に、免疫染色によって、例えば、アルブミン、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、胆汁輸送タンパク質ＭＲＰ２（ＡＢＣＣ２）、および胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）である肝臓マーカーを発現する肝細胞様細胞の分化がもたらされたことが見出された（図１Ｅ）。
[00244]その後、経時的な免疫ブロッティングアッセイから、ＦＯＸＡ２およびＳＯＸ
１７の両方は、２４時間までより高いレベルで持続され、続いて２日目に突然低下したことが解明された（図１Ｆ）。興味深いことに、ＳＯＸ１７は、内胚葉分化中にＨＮＦ４αを抑制するジンクフィンガータンパク質２０２（ＺＦＰ２０２）を直接活性化することができる。ＤＥ段階において、ピーク（２時間）後のＳＯＸ１７レベルの有意な低減（図１Ｄ）は、恐らく間接的にＨＮＦ４αへの抑制作用を低減させ、それによって、デキサメタゾンによって誘導されたＨＮＦ４α活性化を促進した。そのようなものとして、ｂＦＧＦ、デキサメタゾン、およびＳＯＸ１７離脱の組合せ的な作用は、ＨＮＦ４α発現による肝臓特異的な内胚葉の開始に寄与する。さらに、アルブミンが１２時間後に発現されたことから、肝臓内胚葉系統への分化が裏付けられる（図１Ｆ）。その結果として、活性なＨＮＦ４αは、肝細胞の形態学的および機能的な分化を制御することができ、そのため誘導の２日目に肝芽細胞の段階に入ることができる。３日目におけるＡＦＰの出現は、胎児の未成熟肝細胞の細胞プロセスを示していた。興味深いことに、ベータトロフィンのピークレベルは、３日目に出現したが、これは、それが栄養および脂質代謝のレギュレーションに関与していることを示唆している。総合すると、ｈＴＳ細胞は、１週間以内に、胚形成における初代肝細胞の細胞プロセスを模擬した肝細胞様細胞に効率的に分化することができる。実際に、これらの発見から、これまでｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞において報告されている時間がかかるプロトコールとは異なり、この２段階レジメンは、ｈＴＳ細胞から肝細胞様細胞を生成することを可能にすることが示唆される。
ＤＥの特定化におけるｍｉＲＮＡ−１２４ａの調節メカニズム
[00245]どのようにｂＦＧＦがＤＥ形成を誘導するのかの分子メカニズムの理解が、さら
なる肝臓分化に重要であり、必要である。ｂＦＧＦは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＣＲＥＢ１シグナル伝達経路をその受容体ＦＧＦＲ１を介して誘導することを可能にする（図８Ａ〜８Ｄ）。それゆえに、ｉ）ｍｉＲ−１２４ａは、ＤＥ誘導における肝細胞の対応物である膵β細胞でＦＯＸＡ２をレギュレートすることが可能であり、ｉｉ）ＣＲＥＢ１遺伝子の部位へのｍｉＲ−１２４結合は、哺乳類ＣＲＥＢ１の３’ＵＴＲで保存されているという２つの理由のために、ＣＲＥＢ１の活性化は、本発明者らが小さい非コードＲＮＡであるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）の関与に注目することを可能にした。一般的に、ｍｉＲは、翻訳の阻害および／またはＲＮＡ分解を引き起こすことによって、幹細胞分化などの様々な生物学的プロセスに関与する主要なレギュレーターとして機能する。それまで、ｍｉＲ−１２４ａ発現を促進するために、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲアッセイによって、活性なＣＲＥＢ１は、ｍｉＲ−１２４ａのｍＲＮＡのプロモーターの３つの部位を標的化できることが見出
されていた（図２Ａ）。この作用は、ｍｉＲ−１２４ａ発現を低減させたＣＲＥＢ１のノックダウンによって裏付けられ（図２Ｂ）、さらにｑＰＣＲアッセイによる平行な発現における相関によっても裏付けられた（図２Ｂ）。まとめると、これらの結果から、ｂＦＧＦは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＣＲＥＢ１シグナル伝達経路を誘導することを可能にし、順に、ＣＲＥＢ１が、ＤＥ段階中に４時間の誘導でピークに達するｍｉＲ−１２４ａ発現を促進することが示唆される。
[00246]特に、４時間の誘導における最大のｍｉＲ−１４ａと最小のＭＩＸＬ１との相
関的な発現は、本発明者らにそれらの間に関係があるのかどうかを検査する興味を引き起こした。配列分析およびルシフェラーゼレポーターアッセイによれば、ｍｉＲ−１２４ａは、２つの部位でＳｍａｄ４のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＳｍａｄ４）を標的化することができ、結果として、ルシフェラーゼレポーターアッセイ（図２Ｄ）および免疫ブロッティングアッセイ（図２Ｅ）によって証明されたようにシグナル伝達タンパク質のＳｍａｄ４生産が防止された。一貫して、ｍｉＲ−１２４の阻害性Ｓｍａｄ４はＭＩＸＬ１の抑制を引き起こし、これは、Ｓｍａｄ４のノックダウンによって裏付けられた（図２Ｆ）。これらのデータから、ＤＥ段階におけるＭＩＸＬ１のダウンレギュレーションは、ｂＦＧＦによって誘導されたｍｉＲ−１２４ａの活性化が原因であったことが説明された。さらに、ｍｉＲ−１２４ａは、他の役割を果たす可能性もあり、例えば、ｍｉＲ−１２４ａは、ルシフェラーゼレポーターアッセイによればグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）のｍＲＮＡを抑制し（図２Ｇ）、ＧＳＫ３βの生産を阻害した（図２Ｅ）。この阻害性ＧＳＫ３βは、その下流の基質であるβ−カテニンの核移行を引き起こした。細胞核において、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲアッセイによれば、β−カテニンは、ＦＯＸＡ２を生産するために、ＦＯＸＡ２遺伝子のプロモーターを標的化することができる（図２Ｈ）。そのために、ＦＯＸＡ２の発現は、ＤＥ段階における細胞分化を強調する。
ＯＣＴ４による自己再生特徴の維持
[00247]一方で、ｍｉＲ−１２４ａはまた、ＣＤＸ２のｍＲＮＡを標的化することもでき
（図２Ｉ）、その翻訳を阻害して、多能性転写因子であるＣＤＸ２のＣＤＸ２生産を低減させた（図２Ｅ）。これは、共にトランスフェクトされたｍｉＲ−１２４ａ−およびＣＤＸ２プラスミドの存在によって裏付けられる（図２Ｉ）。しかしながら、阻害性ＣＤＸ２は、ＯＣＴ４とＣＤＸ２との相互の阻害関係を介した多能性転写因子ＯＣＴ４の活性化をもたらした（図２Ｅ）。この機能は、イメージング研究（図２Ｊ）および免疫ブロッティングアッセイ（図２Ｋ）によって反映された。ＯＣＴ４活性化は、免疫ブロッティングアッセイによれば、ｍｉＲ−１２４ａとＯＣＴ４とを連結する抗ｍｉＲ−１２４ａ抗体によって阻害することができる（図２Ｅ）。８時間までの多能性転写因子ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２の両方の段階的な上昇（図２Ｋ）は、ｈＥＳ細胞における多分化能に適合するＤＥ系統の多分化能の維持における支持的役割を示唆していた。それゆえに、これらのデータは、ＯＣＴ４は主としてＤＥの自己再生特徴を維持することを示唆しており、これは、他の中核となる多分化能転写因子ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２によって裏付けられる。さらに、活性なＯＣＴ４は、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲアッセイによれば、ＳＯＸ１７のｍＲＮＡのプロモーターの２つの部位を標的化することが可能であり（図２Ｌ）、２時間でピークに達するＳＯＸ１７発現を誘導した（図１Ｃ）。ＳＯＸ１７発現は、ＤＥ識別における別の重大時点に相当する。総合すると、これらの結果から、ｈＴＳ細胞において、ｂＦＧＦ依存性のｍｉＲ−１２４ａは、ＤＥ形成を高効率の方式で誘導し（８時間）、ｈＥＳ細胞における３日の経過とは異なっていることが実証される。概略的な調節分子メカニズムは、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、およびＯＣＴ４をアップレギュレートするが、ＭＩＸＬ１をダウンレギュレートするｍｉＲ−１２４ａシグナル伝達を介したＤＥの特定化を例示し、ここでＯＣＴ４は、ＤＥ系統の自己再生の維持において主要な役割を果たす（図２Ｌ）。
遺伝学的プロファイルは肝臓の発達における段階依存的な表現型と一致する
[00248]それに続いて肝臓系統へのＤＥ分化を方向付けるために、８時間でのＤＥ段階の
完了後にデキサメタゾンおよびオンコスタチンＭを添加した。ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイの利点を考慮して、経時的なプロファイルにおける肝臓の発達に関連する３１種の遺伝子の動的な発現を調査して、分化プロセスを追跡するのに使用できるｍＲＮＡフィンガープリントを特徴付けた。全体として、各遺伝子の遺伝学的プロファイルは、６日の誘導中に４〜５個のピークを有する類似のパターンを有することが解明された。マウスモデルにおける肝臓発達の細胞プロセスに基づいて、ｂＦＧＦならびにデキサメタゾンおよびオンコスタチンＭのカクテルで処理されたｈＴＳ細胞を、それらの遺伝学的発現プロファイルに基づいて、細胞プロセスの４つの段階：原始線条からＤＥ（＜８時間）、肝臓特異的な内胚葉系統（８時間から１日目）、肝芽細胞（２〜４日目）、および胎児および成体の肝細胞様細胞（４日目以降）（図９Ａ〜９Ｆ）に分類した。
[00249]それゆえに、これらの結果から、ｉ）原始線条からＤＥの段階において、優勢
に発現された４つの遺伝子（＞１０倍から１，０００倍）は、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、およびＨＨＥＸを包含すること；ｉｉ）肝臓特異的な内胚葉において、優勢に発現された６つの遺伝子（１０倍から１００倍の間）は、肝芽形成および脂質代謝のためのＳＯＸ１７、サイロキシンおよびレチノール結合タンパク質ＴＴＲ、タンパク質キャリアーアルブミン（ＡＬＢ）、チロシン異化酵素ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および胆汁酸生合成酵素ＣＹＰ７Ａ１を包含すること；ｉｉｉ）肝芽細胞の段階において、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および胆汁酸塩排出ポンプＢＳＥＰを包含する優勢に発現される（１０倍から１００倍の間）６種の遺伝子が存在したこと；およびｉｖ）胎児および成体の肝細胞様細胞の段階において、ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、グルコースホメオスタシス酵素Ｇ６ＰＣ、肝胆汁排出輸送体ＭＲＰ２（ＡＢＣＣ２）、免疫および正常マクロファージレギュレーターＣ／ＥＢＰβ、ならびに数々の肝臓遺伝子レギュレーター、例えばＨＮＦ４αおよびＨＮＦ１αを包含する顕著に発現される（１００倍を超える）１１種の遺伝子が存在したことが解明された。さらに、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の発現は、胎児段階（４日目および５日目）で出現したが、成体肝細胞様細胞の段階から５日目に低減した（図６）。
肝臓の板状の構成は肝細胞の署名の提示である
[00250]肝臓において、肝細胞板系は、グリソン鞘で繋がった鞘で取り囲まれた胆管およ
び血管で構成される独特な組織構造を構成する。分化中のｈＴＳ細胞によって誘導された肝細胞様細胞の形態学的な変化を特徴付けるために、細胞形態が、小葉状の形状を形成する傾向に伴い最初の線維芽細胞様の形状からより長い紡錐状の形状に変化したことが見出され、これは、２日目および３日目における中央領域に位置する多数の多角形の細胞で示される（図３Ａ）。しかしながら、４日目後、細胞が集合化して、板状の細胞塊を形成する可能性があり、この現象は、培養される最初の細胞数に依存する。次いで細胞塊をさらなる検査に供した。
[00251]組織学的には、細胞の配置のほとんどが、１つの細胞または２つの細胞の厚さ
の好酸性細胞質のようであり、板状の組織を形成する。しかしながら、細胞が一緒に集合化して、細胞塊を形成する可能性がある（図３Ａ）。免疫組織化学的には、これらの細胞は、細胞質内区画においてアルブミン、ＡＦＰ、ベータトロフィン、ＨＮＦ４α、ＡＰＯＦ、ＣＰＳ１、ＡＤＨ１、およびＣＹＰ２Ｂ６に関して免疫蛍光染色を提示し、一方でＣＸＣＲ４、ＣＸ３２、ＭＲＰ２、およびＢＳＥＰを包含する細胞膜マーカーのサブセットは、細胞を初代肝細胞に類似した多角形の形状にした（図３Ｂ）。電子顕微鏡法により、初代肝細胞に類似した超微細構造、例えば、大きい細胞質対細胞核の比率、多量のミトコンドリア、よく組織化された小胞体、デスモソーム結合、無傷のゴルジ装置、具体的には胆管の拡張した内腔および接着複合体が示された（図３Ｃ）。さらに、免疫細胞蛍光イメージングから、ＡＦＰおよびアルブミンに加えてＡＢＣＣ２（ＭＲＰ２）およびＢＳＥＰ
の共局在が解明された（図１Ｅ）。これにより、これらの肝細胞様細胞は、初代肝細胞に似た細胞要素または基礎構造のいずれかの肝臓の特徴を有することが実証された。
肝細胞様細胞はインビトロおよびインビボで初代肝細胞として機能する
[00252]肝臓は、アルブミン合成、尿素生成、糖生成、および解毒などの代謝における多
くの特異的な機能に関与する最も重要な臓器である。これらの肝細胞様細胞が初代肝細胞と同様に機能することができるかどうかを検査するために、細胞におけるアルブミンおよび尿素の分泌能力を調査した。４日目の誘導における培養培地を回収して、ＥＬＩＳＡ分析に供した。その結果から、アルブミンおよび尿素のレベルの両方が有意に増加したことが解明され、これは、培養培地中で分泌されるアルブミンおよび尿素を生産するそれらの性能を示唆している（図４Ａ）。次に、グリコーゲン貯蔵試験から、細胞相または肝臓の板状の組織のいずれかにおいて、ジアスターゼ消化処理後、過ヨウ素酸シッフ染色（ＰＡＳ）染色が陽性であることが解明された（図４Ｂ）。この作用は、免疫細胞化学および免疫組織化学の両方に関するＰＡＳ蛍光発光によってさらに確認された（図４Ｂ）。加えて、ＬＤＬの取り込みアッセイから、細胞のＬＤＬの取り込みの能力が、４日目の誘導の未成熟の肝細胞において開始されたことが解明された（図４Ｃ）。オイル−Ｏ−レッド染色から脂質滴の存在が解明され、これは、何らかの形でのある程度の脂肪生成が起こったことを示唆している（図４Ｄ）。さらに、ｑＰＣＲ分析により、標的としてシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素を使用することによって、肝細胞様細胞がインビトロで薬物の代謝および解毒の能力を有するかどうかを検査した。その結果から、肝細胞様細胞は、特定の薬物の代謝に対応して、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、およびＣＹＰ７Ａ１の活性を有意に示すことが解明され（図５Ａ〜５Ｉ）、これは、これらの肝細胞様細胞は、初代肝細胞と同様に薬物のスクリーニングおよび発見に使用することができることを示唆している。例えば、肝臓の酵素誘導物質であるリファンピンは、ＣＹＰ３Ａ４活性を促進して、薬物の代謝率を増加させることができ、ＣＹＰ３Ａ４の阻害は、臨床条件で広く使用されてきた薬物−薬物相互作用（ＤＤＩ）の主な原因である。さらに、フロルアセロフェノン（phloracetophenone）（２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン、ＴＨＡ）は、高コレステロール血
症のハムスターにおいて、ＣＹＰ７Ａ１活性およびｍＲＮＡ発現の両方を促進して、血漿コレステロールおよびトリグリセリドの両方を低減するものであり、ＴＨＡは、ＣＹＰ７Ａ１のｍＲＮＡ発現におけるケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）の阻害性レギュレーションに拮抗するものであることが示されている。それにより、肝細胞様細胞において、リファンピン（refampin）によって誘導されたＣＹＰ３Ａ４は、その阻害剤であるイトラコナゾールによって低減させることができ（図５Ｈ）、一方でＴＨＡによって誘導されたＣＹＰ７Ａ１のｍＲＮＡの上昇は、ＣＤＣＡによって低減されたことが示された（図５Ｉ）。薬理学的な視点から、例えば、胆汁酸結合樹脂は、上昇した血漿中の低密度リポタンパク質コレステロール濃度の処理のために指定されるが、樹脂療法は有害である。それゆえに、血漿コレステロールを低下させるためのＣＹＰ７Ａ１のレギュレーションにアプローチし、革新的な薬理学的介入のための焦点としてＣＹＰ７Ａ１の位置の確認をベースとすることによって、新しい薬物が設計されてきた。
ｈＴＳ細胞において塩基性ＦＧＦはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＣＲＥＢ１シグナル伝達経路の活性化を誘導した
[00253]ｈＴＳ細胞を、馴化培地中、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理したところ、免
疫ブロッティングアッセイによれば、ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）阻害剤ＰＤ１６６８６６は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）のｂＦＧＦによって誘導された活性化をブロックできることが示され（図８Ａ）、これは、阻害作用が細胞膜におけるＦＧＦＲを介していたことを示唆している。結果として、下流エフェクターであるＡＫＴがリン酸化されたことが、ＰＩ３ＫのｓｉＲＮＡを使用することによって証明された（図８Ｂ）。どのプロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ）サブユニットが活性化されたかを明確にす
るために、３つのＡＫＴサブユニット：ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、およびＡＫＴ３に対して特異的なｓｉＲＮＡを免疫ブロッティングアッセイによって検査した。その結果から、ＡＫＴ１のみがリン酸化され、その下流エフェクターであるｃＡＭＰ反応エレメント結合タンパク質１（ＣＲＥＢ１）が活性化されたことが示された（図８Ｃ）。この機能は、免疫沈降（ＩＰ）アッセイによってさらに確認された（図８Ｄ）。総合すると、これは、ｂＦＧＦは、４時間の誘導でＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ１／ＣＲＥＢ１シグナル伝達経路の活性化を誘導することを表す。
実施例２
実験手順
細胞培養および分化
[00254]この研究は、ヒト対象研究に関する施設内倫理審査委員会および倫理委員会によ
って承認された（ＫＭＵＨＩＲＢ−２０１４００７１）。上述したようにインフォームドコンセントと共にｈＴＳ細胞を得て（Leeら、2012、PLoS ONE 7、e52491）、５％ＣＯ２
を含有する加湿した空気中、３７℃で、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＳＡＦＣバイオサイエンス）が補充されたα−ＭＥＭ（ギブコ）培地中で維持した。ＤＥ分化のために、実験的研究に従って、１０％ＦＢＳ、２−メルカプトエタノール（１ｍＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、およびｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する馴化α−ＭＥＭ培地によって８時間、細胞を培養した（データ示さず）。８時間でのＤＥ形成後の肝細胞分化のために、細胞培養を、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（０．１μＭ、シグマ）、組換えヒトオンコスタチンＭ（１０ｎｇ／ｍｌ、エクセル−バイオメディカル社（Excel-Biomedical Inc.））、ＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍｌ）、およびＨＧＦ（５
ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地に変更した。指定されたアッセイのために４〜７日に細胞を回収した。系統の段階依存的な分化の決定は、肝臓発達における肝細胞関連マーカーに依存する。
動物実験
[00255]成体雄スプラーグ−ドーリーラット（３００〜３５０ｇ）を、１２時間の明／１
２時間の暗サイクルで、食物および水の無制限給餌で飼育した。実証研究は、高雄医学大学（Kaohsiung Medical University）の施設内動物倫理委員会（Institutional Animal Ethical Committee、ＩＡＥＣ）によって承認された（ＩＡＣＵＣ−９６００９）。実験のために、ラットを、抱水クロラール２５％（５００ｍｇ／ｋｇ）の腹膜内注射で麻酔した。ラットを、２つのグループ：対照としての偽操作のグループ（ｎ＝８）と残りの研究グループ（ｎ＝８）に分割した。実験前に静脈内の血液（０．５ｍｌ）をベースラインとして得て、１２時間後、両方のグループにＣＣｌ４（１ｍｌ／ｋｇ：トウモロコシ油中１：１ｖ／ｖ）を腹腔内注射した。即座に、研究グループに、ｈＴＳ細胞から誘導された肝細胞（培養培地２００μｌ当たり１×１０６個の細胞）を尾静脈から注射し、偽操作のグループにＰＢＳ溶液のみを与えた。ベースライン時、細胞注射時、２４時間、４８時間、および７２時間に血清サンプルを採取し、肝機能試験、すなわち、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴまたは以前はＳＧＯＴと呼ばれる）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴまたは以前はＳＧＰＴと呼ばれる）、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、血清ビリルビンで処理した。４日目に全てのラットを殺し、組織病理学的研究のために肝臓および肺を得た。
ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）−ｑＰＣＲ、およびｍＲＮＡマイクロアレイ
[00256]上述したように方法を実行した（Leeら、2012、PLoS ONE7、e52491）。ｍＲＮＡ
発現のために、３連または５連のサンプルで、ＤＮＡアーゼＩによるオンカラムでの消化（キアゲン、カリフォルニア州バレンシア）と共にＴＲＩＺＯＬ試薬（インビトロジェン）を製造元の説明書に従って使用してｈＴＳ細胞からＲＮＡを単離した。ｉＳｃｒｉｐｔ
ｃＤＮＡ合成キット（バイオ−ラッド）を用いた逆転写のために、全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を使用した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を、反応１回当たりｃＤＮＡの４０分の１と４００ｎＭのフォワードおよびリバースプライマーを使用して２連で行った。比較リアルタイムＰＣＲを、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標）マスターミックス（アプライドバイオシステムズ）を７５００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ）と共に使用して少なくとも３連で行った。全ての遺伝子をＧＡＰＤＨ発現に正規化し、別段の指定がない限りΔΔＣｔ方法を使用して未分化のｈＴＳ細胞の発現に正規化した。この研究で使用されたプライマー配列は、表５に見出すことができる。
[00257]ｍｉＲＮＡ分析のために、２５ｎｇの全ＲＮＡを、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮ
Ａ逆転写キット（アプライドバイオシステムズ）を使用して逆転写した。ｑＰＣＲを、ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（アプライドバイオシステムズ）を非テンプレート対照を包含する７５００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ）と共に使用して、ｍｉＲ−１２４ａの特異的なプライマーまたはＲＮＵ６Ｂ（アプライドバイオシステムズ）を使用して少なくとも３連で行った。Ｕ６ ｓｎＲＮＡ（ＲＮＵ６Ｂ；アプライドバイオシステムズ）を、内因性対照として利用した。
[00258]ＣｈＩＰアッセイのために、誘導中における指定された時間のｈＴＳ細胞サン
プルを最終濃度１％のホルムアルデヒドで固定した。室温で（１０分）インキュベートした後、グリシン（１２５ｍＭ）を添加することによって反応を止めた。ＣｈＩＰアッセイキット（アップステートバイオテクノロジー）に付随するプロトコールを使用してＣｈＩＰアッセイを実行した。十分に洗浄した後、ＣｈＩＰ処理したＤＮＡをビーズから溶出させ、ｑＰＣＲによって分析した。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
[00259]ルシフェラーゼ−３’ＵＴＲレポータープラスミドを調製するために、ｈＴＳ細
胞のゲノムＤＮＡ抽出物からの３’ＵＴＲのフラグメントを増幅した。３’ＵＴＲのＰＣＲフラグメントを、ＰｓｉＩおよびＭｆｅＩ（サーモサイエンティフィック、イリノイ州ロックフォード）を使用することによって、ｐＧＬ４．５１ベクター（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）のルシフェラーゼ遺伝子の下流にクローニングした。３’ＵＴＲレポーターコンストラクトのためのプライマーを、以下に列挙した。
[00260]Ｃｄｘ２の３’ＵＴＲ領域用：
フォワード、５’−ａａａｔｔａｔａａｇｃｔｇｔｔｔｇｇｇｔｔｇｔｔｇｇｔｃｔ−３’および
リバース、５’−ａａａｃａａｔｔｇｃｃｃｃｃａｔａａｔｔｔｃｔｇａｃｔｇｃ−３。
[00261]Ｓｍａｄ４の３’ＵＴＲ領域１用：
フォワード、５’−ａａａｔｔａｔａａｃｔｃｃｃａａａｇｔｇｃｔｇｇｇａｔｔａ−３’および
リバース、５’−ａａａｃａａｔｔｇｃｔｇｃａｃｔｇｔｔｃａｃａｇｇａｇｇａ−３。
[00262]Ｓｍａｄ４の３’ＵＴＲ領域２用：
フォワード、５’−ａａａｔｔａｔａａｃａｇｔｔｇｔｃｃｃａｇｔｇｃｔｇｃｔａ−３’および
リバース、５’−ａａａｃａａｔｔｇａｔｇａｃｔｔｇｃｃｃａａａｇｇｔｃａｃ−３。
[00263]ＧＳＫ３βの３’ＵＴＲ領域用：
フォワード、５’−ａａａｔｔａｔａａｃｃｃａｃａａｃｔｇｇｇｇｔａａａａｇａ−３
’および
リバース、５’−ａａａｃａａｔｔｇｃｔｇｔｇｇａａｇｇｇｇｃａａａｇａｔａ−３。
[00264]デュアルルシフェラーゼアッセイのために、ホタルルシフェラーゼレポーター
（５００ｎｇ）またはｐＧＬ４．７４で共にトランスフェクトされた３’ＵＴＲを全く含まない空のベクターおよびウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（５００ｎｇ、プロメガ）、ならびに非特異的対照であるｍｉＲＮＡ（３０ｐｍｏｌ）またはｍｉＲ−１２４ａ前駆体（３０ｐｍｏｌ；システムバイオサイエンス、カリフォルニア州マウンテンビュー）を、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＬＴ１トランスフェクション試薬（ミルスバイオ社、ウィスコンシン州マディソン）を使用して、ｈＴＳ細胞に共にトランスフェクトした（各ウェル中１．５×１０４個の細胞）。トランスフェクション（３６時間）後、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（プロメガ）およびＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０マイクロプレートルミノメーター（ベルトールドテクノロジー、バートヴィルトバート、ドイツ）によってルシフェラーゼ活性を分析した。評価のために、まずウミシイタケルシフェラーゼ値をホタルルシフェラーゼ活性に正規化し、各３’ＵＴＲレポーターの計算された活性をさらに対照ベクターに正規化した。データを平均±ＳＤ、ｎ＝８として表し、ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。細胞溶解緩衝液中で調製された全細胞抽出物を、Ｃｄｘ２、Ｓｍａｄ４、ＧＳＫ３β、およびβ−アクチン抗体を用いた免疫ブロッティングに供した。
プラスミド
[00265]ｍｉＲ−１２４ａ前駆体および抗ｍｉＲ−１２４ａを、システムバイオサイエン
スから購入した。簡単に言えば、ｍｉＲ−１２４ａ前駆体（６０ｐｍｏｌ）または抗ｍｉＲ−１２４ａ（６０ｐｍｏｌ）を、１２ウェルの培養皿中で、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１トランスフェクション試薬（ミルス、ウィスコンシン州マディソン）を使用してｈＴＳ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後にｍｉＲ−１２４ａを定量するために、全ＲＮＡを使用した。ＰＩ３Ｋ（ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００２３３９７１およびＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００１２７７８７）、Ａｋｔ１（ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００２０５５４５）、およびＡｋｔ２（ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿０００３５０５５）を標的化する短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、シグマから購入した。ＣＲＥＢ１（ＴＲＣＮ００００００７３１０、ＴＲＣＮ００００２２６４６７およびＴＲＣＮ００００２２６４６８）、Ｓｍａｄ４（ＴＲＣＮ０００００１０３２１、ＴＲＣＮ０００００１０３２３およびＴＲＣＮ０００００４００３２）、Ａｋｔ３（ＴＲＣＮ００００００１６１５およびＴＲＣＮ００００００１６１６）、Ｏｃｔ４（ＴＲＣＮ００００００４８７９およびＴＲＣＮ００００００４８８２）、Ｃｄｘ２（ＴＲＣＮ０００００１３６８３およびＴＲＣＮ０００００１３６８６）、および対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈＧＦＰ；ＴＲＣＮ０００００７２１７８、ＴＲＣＮ０００００７２１７９およびＴＲＣＮ０００００７２１８３）を標的化する短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を、ナショナルＲＮＡｉコアプラットフォーム、中央研究院、台湾から購入した。２μｇのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡに加えて４μｌのトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションを実行した。
ＬＤＬの取り込みアッセイ
[00266]ＬＤＬの取り込みの細胞ベースのアッセイキットを製造元の説明書（ケイマンケ
ミカル社、ミシガン州アナーバー）の通りに使用することによって、ＬＤＬの取り込みを実行した。簡単に言えば、５×１０４個の細胞を、２４ウェルプレートの各ウェル中のカバースリップに植え付けた。ｈＴＳ細胞（対照として）および分化した肝細胞様細胞（ｈＨＬＣ）を、５μｇ／ｍｌのＬＤＬ−ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）５４９プローブ処理（４時間、３７℃）の後に固定し、次いでウサギ抗ＬＤＬおよびＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体によってＬＤＬ受容体に関して染色した。核をＤＡＰＩで可視化した。蛍光顕微鏡検査法によって最終的な染色を観察した。
オイル−Ｏ−レッド試験
[00267]脂質の累積を検出するために、室温で４％パラホルムアルデヒドにより分化細胞
を固定し（２０分）、６０％イソプロパノールで５分洗浄した。新たに調製された６０％オイルレッドＯ溶液（使用前に０．２２μｍフィルターを通過させた、１００ｍｌイソプロパノール中の０．５ｇのオイルレッドＯ、シグマ）と共に室温（２０分）でインキュベートした後、細胞を６０％イソプロパノールで濯ぎ、顕微鏡観察のためにヘマトキシリンＩ（サーモサイエンティフィック）で対比染色した。
グリコーゲン貯蔵試験
[00268]グリコーゲン検出のために、４％パラホルムアルデヒドによって分化細胞を固定
した。固定したサンプルを０．４％トリトンＸ−１００により膜を透過化した。未分化の対照細胞をジアスターゼ（ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌ；シグマ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。細胞を過ヨウ素酸（０．５ｇを１００ｍｌ蒸留水中に溶解させた）と共に室温で５分インキュベートし、蒸留水で洗浄し、新鮮な調製済みのシッフ試薬と共にインキュベートし（１５分）、顕微鏡観察に供した。
生化学パラメーター試験
[00269]アルブミン、尿素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、およ
びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を包含する全ての肝機能の生化学パラメーターを、自動分析器（日立７０８０、日本）を使用することによって測定した。
機能的なシトクロムｐ４５０のアッセイ
[00270]ｈＴＳ細胞によって誘導された肝細胞様細胞におけるＣＹＰ酵素による誘導活性
を試験するために、細胞を試薬で２４時間処理し、例えば、ＣＹＰ１Ａ２試験の場合、リファンピシン（２５μＭ）／リファンピシン＋シプロフロキサシン（１μＭ）を使用し、ＣＹＰ２Ｂ６試験の場合、フェノバルビタール（１００μＭ）／フェノバルビタール＋クロピドグレル（２５μＭ）によって、ＣＹＰ３Ａ４の場合、リファンピシン（２５μＭ）／リファンピシン＋イトラコナゾール（２５μＭ）によって、ＣＹＰ７Ａ１の場合、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡ、１μＭ）／ＴＨＡ＋ＣＤＣＡ（２５μＭ）によって、ＣＹＰ２Ｃ８およびＣＹＰ２Ｃ９の場合、リファンピシン（２５μＭ）／リファンピシン＋ゲムフィプロジル（２５μＭ）によって、ＣＹＰ２Ｃ１９の場合、リファンピシン（２５μＭ）／リファンピシン＋チクロピジン（２５μＭ）によって処理された。陽性対照としてＨｕｈ−７細胞を使用した。
免疫細胞化学および免疫組織化学
[00271]上述したようにして方法を実行した（Leeら、2012、PLoS ONE 7、e52491）。簡単に言えば、細胞培養を含むスライドを９５％（ｖ／ｖ）エタノール中で室温で３０分固定し、ＰＢＳ中で３回洗浄し、０．１％（ｗｔ／ｖ）トリトンＸ−１００（シグマ）および５％（ｖ／ｖ）正常ロバ血清（ミリポア）を含有するブロッキング緩衝液ＰＢＳと共に６０分インキュベートした。一次および二次抗体をブロッキング緩衝液で希釈した。一次抗体をインキュベートした。ＰＢＳ中で特異的な一次抗体と４℃（２４時間）または室温（２時間）インキュベートした後、適切なフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、インビトロジェン）またはアレクサフルオロ４８８、５９４、および６４７（インビトロジェン）またはディライト４８８および５９４（バイオレジェンド）がコンジュゲートした二次抗体を室温で（１時間）添加した。細胞核をＤＡＰＩ染色した後（５分）、二次抗体と室温で（１時間）インキュベートし、洗浄し、サンプルを５０％グリセロールと共にマウントした。共焦点レーザー顕微鏡検査法（ＬＳＭ７００；ツァイスのＺ１またはオリンパスのフルオビュー１０００共焦点レーザー顕微鏡）またはＴｉｓｓｕｅＦＡＸＳシステム（TissueQnostics GmbH、ウィーン、オーストリア）によって画像を捕獲した。Ｔｉ
ｓｓｕｅＱｕｅｓｔソフトウェアによってデータを分析した。
電子顕微鏡法
[00272]透過型電子顕微鏡法のために、上述したようにして方法を実行した（Leeら、2012、PLoS ONE 7、e52491）。簡単に言えば、ｈＴＳ細胞によって誘導された肝細胞様細胞（誘導から４日目における）を、３％ｗｔ／ｖｏｌホルムアルデヒド、１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルタルアルデヒドおよび２．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロースを含有する０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中、室温で１時間または４℃で一晩固定した。１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＯｓＯ４を含有するパラディの固定剤中での４℃でのオスミウム酸染色処理（２時間）の前および後に、サンプルを、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。タンニン酸で処理し、１％酢酸ウラニルで染色し、段階的な一連のエタノール溶液で脱水した後、サンプルをＴＡＢＢエポキシ樹脂（アガーサイエンティフィック社）に埋め込んだ。超薄切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、ＪＥＭ−２０００ＥＸＩＩ透過型電子顕微鏡（JEOL、東京）を使用することによって分析した。
免疫ブロッティングおよび免疫沈降（ＩＰ）
[00273] 上述したようにして方法を実行した（Leeら、2012、PLoS ONE 7、e52491）。免
疫ブロッティングアッセイのために、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（ロシュ）が補充されたＲＩＰＡ溶解溶液（ミリポア、マサチューセッツ州ビレリカ）に細胞を回収した。ポリアクリルアミドゲル上で３０μｇの溶解産物を電気泳動した後、ＰＤＶＦ膜上へのエレクトロブロッティング（ミリポア）を実行した。ＰＢＳ中の５％無脂肪乳によって室温で（１時間）ブロックした後、一次抗体を使用することによって標的タンパク質を検出した。全ての膜を化学発光物質（ミリポア）と共にインキュベートし、撮像をＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳシステム（バイオ−ラッド）によって捕獲した。表４に使用された抗体を列挙した。ＡｌｐｈａＥａｓｅＦＣ（バージョン４．０．０）システムによってデータを分析した。ＩＰアッセイのために、ｂＦＧＦで処理したｈＴＳ細胞の細胞溶解産物を収集した。プロテインＧ−アガロース（ミリポア）と３０分インキュベートすることによって、総タンパク質（１００μｇ）を、表４に列挙された特異的な一次抗体で一晩処理した。プロテインＧ−アガロースビーズで（２時間）処理した後、サンプルをＲＩＰＡ溶解緩衝液（ミリポア）で３回洗浄し、その後、タンパク質ローディング色素を添加し、５分沸騰させた。８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってサンプルを分離し、免疫ブロッティング分析に供した。
２次元ゲル電気泳動（２ＤＥ）のためのサンプル調製
[00274]２つのサンプル：細胞培養培地（５日、研究グループとして）および純粋な培養
培地（対照グループとして）を得た。サンプルを上述したように調製した（Chouら、2015）。簡単に言えば、サンプル（０．１ｍｌ）を、１１％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ、ｗ／ｖ）および２０ｍＭのＤＴＴを含有する氷冷したアセトン１ｍｌと共に−２０℃で３０分インキュベートした。遠心分離後（１２，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）、タンパク質のペレットを２０ｍＭのＤＴＴを含有する冷たいアセトン１ｍｌで２回洗浄し、続いて空気乾燥してアセトンを除去した。次いで、適切な水分補給のための緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、０．５％ＩＰＧ緩衝液、２０ｍＭのＤＴＴ）を添加し、濃縮したサンプルをブラッドフォード方法によって測定した。２ＤＥ分析のために、合計１５０μｇのタンパク質を、５Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、３％ｗ／ｖＣＨＡＰＳ、３〜１０の非線形のｐＨを有する１％の固定されたｐＨ勾配物質（ＩＰＧ）、１００ｍＭのＤｅＳｔｒｅａｋ試薬、および微量のブロモフェノールブルーを含有する緩衝液と共にインキュベートした。一連の処理プロセス後、サンプルを、Ｅｔｔａｎ ＩＰＧｐｈｏｒカップローディング（アマシャムバイオサイエンス（Amersham Biosciences））を使用して、ＩＰＧストリップの陽極付近にカップローディングし、製造元のプロトコールに従ってＩＥＦパラメ
ーターを使用してタンパク質の分画を達成した。第１次元の電気泳動の後、等電点分画用ＩＰＧストリップを１％ｗ／ｖＤＴＴを含有する調整した平衡緩衝液中で振盪し（１５分）、続いて２．５％ｗ／ｖヨードアセトアミドを含有する同じ溶液中で振盪した（１５分）。ストリップを１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）の上部に移した。第２次元の分離を一定の７５Ｖ（３０分）および１００Ｖ（１６時間）によって実行した。２ＤＥゲルを銀染色し、タイフーン（Typhoon）９４１０スキャナー（アマシャムバイ
オサイエンス）で検出し、スポットを比較し、イメージマスター（Image Master）２Ｄ白金システム（アマシャムバイオサイエンス）を使用することによって定量した。
タンパク質の同定および定量のためのエレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型タンデム質量分析（ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ）
[00275]観察された２Ｄゲルタンパク質を同定するために、サンプルをトリプシンによっ
て消化し、続いて上述したように（Chouら、2015）、ナノフロー液体クロマトグラフィーおよびウォーターズ−マイクロマス（Waters-Micromass）のタンパク質同定用ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ（ウォーターズ（Waters）、英国マンチェスター）で処理した。対応するピークのリストを得るために、前駆体のそれぞれ個々のフラグメントのＭＳ／ＭＳスペクトルをマスリンクス（MassLynx）４．０ソフトウェア（マンチェスター、英国）によって加工し、ピークのリストのファイルを社内のタンパク質同定のためのマスコットサーバーにアップロードした。
統計的分析
[00276]全ての実験を３連で行い、指定通りに２回繰り返した。ウェスタンブロット、ｑ
ＰＣＲ、ルシフェラーゼレポーターアッセイ、およびフローサイトメトリーから得られたデータをスチューデントのｔ検定によって計算した。ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とみなした。動物実験において、対応のあるＡＮＯＶＡ検定を統計学的に使用した。ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とみなした。
結果
１）ｈＴＳ細胞においてｂＦＧＦ単独はＤＥ分化を誘導する
[00277]幹細胞から肝臓系統への経路は、特にＤＥ形成において必要かつ必須の工程を包
含する進行性の一連の細胞プロセスで構成される。ｈＴＳ細胞を最初にｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理し、免疫ブロッティングアッセイによってＤＥ関連マーカーのレベルを経時的に測定した。その結果から、誘導の最初の１５分で、グースコイド（Ｇｓｃ）、ブラキュリ（Ｔ）、ホメオドメインタンパク質Ｍｉｘｌ１（Ｍｉｘｌ１）、ＳＲＹ−ボックス１７（Ｓｏｘ１７）、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（Ｆｏｘａ２、またＨｎｆ３βとしても公知）、および原始内胚葉マーカーＳｏｘ７などの転写因子が有意にアップレギュレートされ、３０分から１時間の間でピークに達したことが示された（図１０Ａ）。これらのデータから、ｈＴＳ細胞から新生の内中胚葉への迅速な遷移が、初期胚発生における肝臓発達に適合する原始線条段階を媒介することが示される。これ以降、Ｓｏｘ１７レベルは４時間まで継続的に上昇し、低下した。その一方でＦｏｘａ２およびブラキュリは８時間まで上昇したが、Ｓｏｘ７発現は誘導の１５分後に始まったばかりであった。特に、Ｍｉｘｌ１の強度はピーク（１５分）から４時間で最低点までダウンレギュレートされ（天然のものより約５０％低い）、８時間で元のレベルに戻ったことがＴｉｓｓｕｅＦＡＸ分析によって測定された（図１０ＡＳ）。それらの発現における変化は、免疫蛍光イメージングによっても実証された（図１０Ｂ）。これらの結果から、ｂＦＧＦは単独で、胚性肝臓発達を模擬した、原始線条および内中胚葉を介したｈＴＳ細胞のＤＥ段階への急速な分化を可能にすることが示される。
２）ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＣＲＥＢ１シグナル伝達経路はＭｉＲ−１２４ａ発現を促進する
[00278]ｂＦＧＦは、ｈＴＳ細胞において、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＣＲＥＢ１シグナル伝達
経路を、その受容体ＦＧＦＲ１を介して誘導することが可能であった。ｈＴＳ細胞を、馴化培地中のｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）阻害剤ＰＤ１６６８６６は、免疫ブロッティングアッセイによれば、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）のｂＦＧＦによって誘導された活性化をブロックすることができ（図１０ＢＳ）、これは、阻害作用が細胞膜におけるＦＧＦＲを介していたことを示唆している。結果として、下流エフェクターであるＡＫＴがリン酸化されたことが、ＰＩ３ＫのｓｉＲＮＡを使用することによって証明された（図１０ＣＳ）。どのプロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ）サブユニットが活性化されたかを明確にするために、３つのＡＫＴサブユニット：ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、およびＡＫＴ３に対して特異的なｓｉＲＮＡを免疫ブロッティングアッセイによって検査した。その結果から、ＡＫＴ１のみがリン酸化され、その下流エフェクターであるｃＡＭＰ反応エレメント結合タンパク質１（ＣＲＥＢ１）が活性化されたことが示された（図１０ＤＳ）。この機能は、免疫沈降（ＩＰ）アッセイによってさらに確認された（図１０ＥＳ）。総合すると、これは、ｂＦＧＦは、４時間の誘導でＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ１／ＣＲＥＢ１シグナル伝達経路の活性化を誘導することを表す。
[00279]小さい非コードＲＮＡであるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）−１２４は、腹部の前
腸内胚葉の誘導体である膵β細胞において、Ｆｏｘａ２発現に関与する。その後、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲアッセイによれば、細胞核において、活性化されたＣＲＥＢ１は、ｍｉＲ−１２４ａのプロモーターの３つの部位に直接標的化されて、４時間の誘導でｍｉＲ−１２４ａ発現を誘導し（図１０Ｃ）、ＣＲＥＢ１のノックダウンはその発現を低減した（図１０ＦＳ）。ｑＰＣＲ分析によれば、経時的なＣＲＥＢ１およびｍｉＲ−１２４の発現は、平行な相関を示した（図１０Ｄ）。これらの結果から、ｂＦＧＦによって誘導されたＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＣＲＥＢ１シグナル伝達経路は、ｈＴＳ細胞の初期分化においてｍｉＲ−１２４ａを時空的にアップレギュレートすることを可能にすることが示される。
３）ＭｉＲ−１２４ａはＤＥの特定化を方向付ける
[00280]肝形成に関連する数々の遺伝子をスクリーニングし、ルシフェラーゼレポーター
アッセイを構築し、それによってデカペンタプレジック相同体４（Ｓｍａｄ４）（図１１Ａ）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）（図１１Ｂ）、およびホメオボックス転写因子Ｃｄｘ２（図１１Ｃ）に対するマザーを包含する数々のシグナル伝達タンパク質を測定した。ｍｉＲ−１２４ａの阻害機能は、ｉ）Ｓｍａｄ４メッセンジャーＲＮＡ（Ｓｍａｄ４ｍＲＮＡ）のプロモーターを標的化して、Ｓｍａｄ４生産を防ぐこと（図１１Ａ、下）を包含する。その結果として、阻害性Ｓｍａｄ４は、Ｍｉｘｌ１の抑制を引き起こし、これは、Ｓｍａｄ４のノックダウンによって検証された（図１１ＡＳ）。このメカニズムは、ＤＥ段階におけるＭｉｘｌ１のダウンレギュレーション（図１０Ａ）および原腸胚形成中における移動性の細胞運命の遷移を説明した。ｉｉ）ＧＳＫ３βのｍＲＮＡのプロモーターを標的化して、その翻訳を阻害し（図１１Ｂ、下）、それによって、下流の基質であるカドヘリン関連タンパク質β−１（β−カテニン）の核移行を引き起こす。細胞核において、β−カテニンは、Ｆｏｘａ２遺伝子のプロモーターを標的化して、ＤＥ段階における分化を強調するＦｏｘａ２を生産した（図１１Ｄ）。興味深いことに、この増加したＦｏｘａ２は順に、ベータトロフィンタンパク質発現をコードするｃ１９ｏｒｆ８０遺伝子の転写を誘導した（図１１Ｅ）。ベータトロフィンは、肝臓で生産されるホルモンであり、膵臓のβ細胞の増殖を制御する。ｉｉｉ）ｃａｕｄａｌ関連ホメオボックス転写物Ｃｄｘ２のｍＲＮＡを標的化して、その多能性転写因子Ｃｄｘ２への翻訳を阻害する（図１１Ｃ、下）。全てのこれらの分子的事象は、４時間の誘導で起こり、これは、免疫ブロッティングアッセイでｍｉＲ−１２４ａおよび抗ｍｉＲ−１２４ａ抗体を使用することによって確認された（図１１Ｆ）。
[00281]その後、減少したＣｄｘ２は、免疫蛍光イメージング研究によれば、多能性転
写因子Ｏｃｔ４のアップレギュレーションを促進した（図１１Ｇ）。Ｏｃｔ４の過剰発現はさらに、免疫ブロッティングアッセイによれば、抗ｍｉＲ−１２４ａ抗体を使用したｍｉＲ−１２４ａのノックダウンによって検証された（図１１Ｆ）。このＣｄｘ２とＯｃｔ４との相互の阻害関係は、免疫ブロッティングアッセイによって証明される（図１１ＢＳ、上）。さらに、８時間の誘導における多分化能転写因子Ｎａｎｏｇの有意な段階的上昇が観察された（図２ＢＳ、下）。これらの結果から、Ｏｃｔ４は、ＤＥ系統の多能性特徴を維持することにおいて主要な役割を果たし、一方でＮａｎｏｇは、ｈＥＳ細胞の場合と一致して支持的な役割を果たすことが示唆された。重要なことに、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲアッセイによれば、活性化されたＯｃｔ４は順に、Ｓｏｘ１７遺伝子のプロモーターを標的化し、Ｓｏｘ１７発現を促進した（図１１Ｈ）（図１０Ａ）。Ｓｏｘ１７の発現は、ＤＥ分化における別の重大時点に相当していた。まとめると、図１１Ｉは、ｂＦＧＦ誘導がｈＴＳ細胞においてｍｉＲ−１２４ａを媒介するＤＥ形成を開始させた調節分子メカニズムを説明する概略図である。
４）３Ｄの組織構造における肝細胞様細胞の生成
[00282]その後、ＤＥ形成（８時間）後に、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾ
ン（Ｄｅｘａ；０．１μＭ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ；１０ｎｇ／ｍｌ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４；２０ｎｇ／ｍｌ）、および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；５ｎｇ／ｍｌ）の組合せを用いて細胞を培養した。意外なことに、細胞形態は、培養中の植え付け密度に応じて、分散した線維芽細胞様の細胞のように見えるか、または次第に集合化して、三日月形の細胞塊を形成する可能性がある（図１２Ａ、挿入図および図１２ＡＳ）。細胞塊の組織学的な検査から、３次元（３Ｄ）の組織構造を構築する２つの別個の末梢および中央の区画が解明された。末梢部分において、多数のクラスター化した小細胞が、基底膜を超えて細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に不規則に分布していた。細胞は、偏心的に配置されていることが多い縮合核、ならびに未発達の幹／前駆細胞に類似した好酸性細胞質中に豊富な顆粒および小胞を有していた（図１２ＡＳ）。中央の部分において、多くの独立した柱状のＥＣＭは、両側における細胞の内層により、基底領域から中央領域に向かって分布していた（図１２Ａ）。これらの細胞は、豊富な好酸性細胞質を含有しており、単一の円形の細胞核中に、肝細胞の表現型を模擬する１または２つの中心的な核小体と共にクロマチンを分散させていた。数個の二核細胞を観察することができた。この特徴は、ヒト肝臓における肝細胞板として公知の特徴に類似している。
[00283]免疫細胞化学的に、これらの肝細胞様細胞は、特異的なマーカー：ｉ）ヒト細
胞の場合、ヒト細胞質マーカーのｓｔｅｍ １２１（商標）、肝臓固有の幹細胞の場合、マスト／幹細胞増殖因子受容体Ｃ−ｋｉｔ、胆管細胞の場合、ＣＫ１９、および肝細胞の場合、ＣＫ１８（図１２Ｂ）；ならびにｉｉ）免疫組織化学的に肝細胞の細胞質において、アルブミン（ＡＬＢ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ベータトロフィン、ＡＤＨ１、ＡＰＯＦ、ＣＰＳ１、ＧＡＴＡ４、ＣＹＰ１Ａ１、およびＣＹＰ２Ｂ６（図１２Ｃ、および図１２ＣＳ）を提示した。その一方で、ＡＳＧＲ１、ＣＸＣＲ４、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、およびＣｘ３２を包含する表面マーカーのサブセットは、初代ヒト肝細胞に類似した多角形の細胞形状を構築した（図１２Ｃ）。さらに、電子顕微鏡法は、大きい細胞質対細胞核の比率、多量のミトコンドリア、よく組織化された小胞体、密着結合、多数の脂質小胞、グリコーゲン貯蔵、接着複合体を含む毛細胆管の拡張した内腔、および多重ＥＣＭなどの初代肝細胞に類似した微細構造を解明した（図１２Ｄ）。
５）ＴＧＦβ１は、肝臓ＥＣＭにおけるフィブロネクチンおよびコラーゲンＩＶ足場の形成に寄与する
細胞培養された培地中の９つの新たにアップレギュレートされた分泌タンパク質のなかでも、重要なことに、タンパク質（番号４１３）は、マスコットＭＳ／ＭＳイオンサーチシステム（ＥＳＩ−ＱＵＡＤ−ＴＯＦ、ブルカーインパクトＨＤ、マトリックスサイエンス
、米国）によって、ペプチド配列の４６％がマッチしたことにより、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）によって誘導されたタンパク質ｉｇ−ｈ３前駆体（ＴＧＦβ１）であることを予測したことから（図１３Ａ、赤色の矢印；図１３ＡＳ）、タンパク質（番号４１３）は魅力的な標的になってきた。ＴＧＦβ１は、主要な線維形成誘導性の多機能なサイトカインである自己分泌およびパラ分泌方式の両方として作用し、肝臓星細胞（ＨＳＣ）におけるフィブロネクチンおよびコラーゲン形成を強化する。したがって、ＴＧＦβ１の存在を同定するために、免疫組織化学を使用して、ＥＣＭにおける免疫反応性ＴＧＦβ１、フィブロネクチン、およびコラーゲンＩＶの共発現を免疫組織化学によって実証した（図１３Ｂ）。これらの結果から、ＴＧＦβ１、フィブロネクチン、およびコラーゲンＩＶは、肝細胞板における肝細胞の増殖および分化を支えることができる肝細胞様細胞の３Ｄの組織構造中で、ＥＣＭの足場を少なくとも部分的に構成することが示唆される。
６）転写発現は段階依存的な肝臓分化を特徴付ける
[00284]４２種の肝臓の発達に関連する遺伝子を分析したところ、分化している細胞は、
細胞プロセス中に遺伝子発現においてオーバーラップするパターンを共有する可能性があることが示唆される。上述したように、多能性ｈＴＳ細胞からの原始線条への遷移（１５から３０分）および内中胚葉への遷移（＜１時間）において、ＧＳＣ、ブラキュリ（Ｔ）、およびＳｏｘ７の発現の上昇がＭｉｘｌ１、Ｆｏｘａ２およびＳｏｘ１７の段階的な増加と共に観察された（図１０Ａ）。Ｓｏｘ７は、主として原始線条、臓側内胚葉（visceral endoderm）、および体壁内胚葉（parietal endoderm）で発現されるがＤＥでは発現されない（Kanai-Azumaら、2002）。ＤＥ段階において（１から８時間）、ＣＸＣＲ４、Ｆ
ｏｘａ２、Ｓｏｘ１７、ＨＨＥＸ、およびＳｏｘ７などの高い転写発現の持続性が保たれ、その後低下した（表３）。細胞プロセスが肝臓内胚葉の段階に入ったとき（８時間から１日）、Ｓｏｘ１７およびＦｏｘａ２を包含する内胚葉転写因子の中核グループが順に、細胞を内胚葉系統に決定付ける遺伝子のカスケードをレギュレートした。肝臓の特定化の直後、上皮は、アルブミン、ＡＦＰ、およびＨｎｆ４αなどの肝芽遺伝子に関連する遺伝子を発現し始める。多数の肝芽細胞関連の遺伝子発現が起こり、細胞分化を二分化能の肝芽細胞に決定付けた（２日目から４日目）。そこから肝芽細胞は、胎児肝細胞（例えばＡＦＰ）、成体肝細胞（例えばＡＬＢおよびＨｎｆ４α）、および胆管上皮細胞（例えばサイトケラチン−１９）に関連する特異的な遺伝子を発現し、分化を起こして胎児／成体の肝細胞段階に到達した（＞４日目）。まとめると、これらの進行性の転写発現は、表３に列挙されたような肝臓発達における細胞プロセスと一致する。
７）肝細胞様細胞は肝機能を提示する
[00285]肝機能の保存は、多能性幹細胞から誘導された肝細胞における必須の要件である
。そのため、細胞培養培地を収集し、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）に供した。その結果から、誘導後の培地中で、アルブミン、ＮＨＣｌ４によって誘導された尿素、およびＣＣｌ４によって誘導されたＧＯＴ、ＧＰＴ、およびＡＬＰのレベルが上昇したことが実証された（図１４Ａ）。ＬＤＬの取り込みアッセイから、これらの細胞はＬＤＬの取り込み能力を有することが解明された（図１４Ｂ）。オイル−Ｏ−レッド染色から脂質滴の存在が解明され、これは、脂肪生成における能力を示唆している（図１４Ｃ）。さらに、グリコーゲン貯蔵試験から、陽性過ヨウ素酸シッフ染色（ＰＡＳ）染色が明らかになり、これは、細胞学または組織学のいずれかにおいてジアスターゼによる消化およびＰＡＳ蛍光発光試験によって裏付けられた（図１４Ｄ）。次に、ｑＰＣＲ分析から、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣｙＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、およびＣＹＰ２Ｅ１などの様々な代謝特異的な薬物に応答するシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素の能力が解明された（図１４Ｅ）。機能的には、例えば、リファンピン（refampin）によって誘導されたＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡはその阻害剤であるイトラコナゾールによって低減され、一方で２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡ）
によって誘導されたコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ａ１）のｍＲＮＡはケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）によって低減された。これらの結果から、それぞれ生体異物の酸化に加えて胆汁酸およびコレステロール代謝における能力が示唆される。
８）機能的な肝細胞様細胞は幹細胞ホーミングの特徴を有する
[00286]動物実験を、急性肝不全における臨床的なシナリオを模擬するように設計し、そ
れにより四塩化炭素（ＣＣｌ４）の腹膜内点滴をスプラギーダーレーラットに与え、続いてｈＴＳ細胞によって誘導された肝細胞様細胞を静脈注射（尾静脈）した。目標は、ラット肝臓においてこれらの異種移植片がホーミングにより生存できるかどうか、およびこれらの細胞が果たす役割は何なのかを検査することであった。０、１、２、４、および７日に血清サンプルを収集して、ＡＳＴおよびＡＬＴレベルを測定した。２、４、および７日にラットを殺して、組織病理学的研究のために肝臓サンプルを得た。生化学的研究から、血清中ＡＳＴおよびＡＬＴレベルが、時間経過にわたり細胞療法グループ（ＣＣｌ４＋細胞）において対照グループ（ＣＣｌ４のみ）より有意に高いようであったことが解明された（図１５Ａ）。この曖昧な観察を明瞭にするために、肝臓組織を病理組織学的に検査した。
[00287]インジケーターとしてヒト細胞質マーカーのｓｔｅｍ−１２１（商標）（ステ
ムセルテクノロジーズ社（Stem Cell Technologies. Inc.）、ワシントン州）を使用して、ｈＴＳ細胞における陽性免疫反応性ｓｔｅｍ−１２１発現を同定し（図１５Ｂ）、続いて埋め込みの４日後の肝臓組織におけるｓｔｅｍ−１２１陽性肝細胞様細胞の存在を確認した（図１５Ｃ）。この観察から、肝細胞様細胞の静脈内投与は、肝臓組織へのホーミングを可能にすることが示された。興味深いことに、これらのｓｔｅｍ−１２１陽性肝細胞は同様に、免疫組織化学的に変性を受けていた（図１５Ｃ）。この事実は、埋め込まれた肝細胞様細胞の変性を引き起こしたＣＣｌ４の追加の作用（２４時間の血中半減期）に起因する、細胞療法グループにおける、ＣＣｌ４のみで処理されたグループよりかなり高いＡＳＴおよびＡＬＴレベルの上昇を説明する。ｈＴＳ細胞によって誘導された肝細胞様細胞の静脈内注入は、ＣＣｌ４傷害肝臓組織に到達してそこに定着することができる。
９）肝細胞様細胞は、ＨＬＡ−ＧおよびＴＧＦβ１を発現して、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の能力を補充することによって免疫特権を有する
[00288]埋め込まれた肝細胞様細胞は、免疫組織化学的に着床から４日後に肝臓組織でｓ
ｔｅｍ−１２１およびＨＬＡ−Ｇが共発現されたことから、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）を発現したが（図１５Ｄ）、これは、免疫特権の特徴を示唆している。ＨＬＡ−Ｇは、膜結合でも可溶性でも、様々な免疫細胞のタイプ（ＮＫ、Ｔ、Ｂ、単球／樹状細胞）に強く作用して、免疫細胞表面で発現される阻害性受容体との相互作用を介して先天性および適応免疫の両方を阻害する。
[00289]さらに、肝細胞様細胞は、ＥＣＭにＴＧＦβ１を分泌することができた（図１
３Ｂ）。ＴＧＦβ１は、胸腺Ｔ細胞発達の重要なレギュレーターであり、末梢Ｔ細胞のホメオスタシス、自己抗原への寛容性、および免疫応答中のＴ細胞分化における重要なプレーヤーである。それに対し、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ調節性（Ｔｒｅｇ）細胞は免疫細胞化学的には肝臓の洞様血管中に存在しており（図１５Ｅ）、これは、埋め込まれた細胞に応答してＴｒｅｇ細胞を肝臓に動員することを示唆している。サイトカインＴＧＦβ１またはＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞による活性な免疫抑制は、末梢Ｔ細胞の寛容における重要なメカニズムを果たす役割がある。埋め込まれた肝細胞様細胞は、ＨＬＡ−ＧおよびＴＧＦβ１を発現すること、およびＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を肝臓に動員して末梢Ｔ細胞寛容を制御することによって免疫特権を有する。
Figure 2021072852
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[00290]本明細書に記載された実施例および実施態様は単に例示の目的のためであり、
当業者に示唆された様々な改変または変更が、本出願の本質および範囲ならびに添付の特許請求の範囲中に包含されるものとする。

Claims (146)

  1. インビトロで誘導肝細胞に分化するように栄養膜幹（ＴＳ）細胞を誘導する方法であって、
    栄養膜幹細胞を馴化培地と接触させて、栄養膜幹細胞の誘導肝細胞への分化を誘導すること
    を含み、該馴化培地は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ステロイド、およびサイトカインを含む、上記方法。
  2. 前記馴化培地に前記ステロイドおよび前記サイトカインを添加する前に、前記栄養膜幹細胞を前記ＦＧＦと接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記馴化培地に前記ステロイドおよび前記サイトカインを添加する前に、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２０時間、または少なくとも２４時間、前記栄養膜幹細胞を前記ＦＧＦと接触させる、請求項２に記載の方法。
  4. 前記栄養膜幹細胞を、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、または少なくとも７日インキュベートすることをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記誘導肝細胞が、肝臓前駆細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記分化が、４つの段階：原始線条から胚体内胚葉（ＤＥ）への段階、肝臓特異的な内胚葉の段階、肝芽細胞の段階、ならびに胎児および成体の肝細胞の段階
    の１つまたはそれより多くを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＨＨＥＸ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＢＳＥＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ４α、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーが、前記４つの段階の１つまたはそれより多くで発現される、請求項６に記載の方法。
  8. ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＨＨＥＸ、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーが、前記原始線条からＤＥへの段階で発現される、請求項６または７に記載の方法。
  9. ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、および／またはＨＨＥＸの発現レベルが、前記原始線条からＤＥへの段階で、前記原始線条からＤＥへの段階の前のレベルと比べて増加する、請求項８に記載の方法。
  10. 増加した前記発現レベルが、遺伝子発現の増加したレベルである、請求項９に記載の方法。
  11. ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７および／またはＨＨＥＸの前記発現レベルが、前記原始線条からＤＥへの段階の前のレベルより約１倍〜約１０，０００倍高く増加する、請求項９または１０に記載の方法。
  12. ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７および／またはＨＨＥＸの前記発現レベルが、前記原始線条からＤＥへの段階の前のレベルより約１０倍〜約１０００倍高く増加する、請
    求項９または１０に記載の方法。
  13. ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＣＹＰ７Ａ１、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーが、前記肝臓特異的な内胚葉の段階で発現される、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＣＹＰ７Ａ１の発現レベルが、前記肝臓特異的な内胚葉の段階で、前記肝臓特異的な内胚葉の段階の前のレベルと比べて増加する、請求項１３に記載の方法。
  15. 増加した前記発現レベルが、遺伝子発現の増加したレベルである、請求項１４に記載の方法。
  16. ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＣＹＰ７Ａ１の前記発現レベルが、前記肝臓特異的な内胚葉の段階の前のレベルより約１倍〜約１０００倍高く増加する、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＣＹＰ７Ａ１の前記発現レベルが、前記肝臓特異的な内胚葉の段階の前のレベルより約１０倍〜約１００倍高く増加する、請求項１４または１５に記載の方法。
  18. ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＢＳＥＰ、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーが、前記肝芽細胞の段階で発現される、請求項５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＢＳＥＰの発現レベルが、前記肝芽細胞の段階で、前記肝芽細胞の段階の前のレベルと比べて増加する、請求項１８に記載の方法。
  20. 増加した前記発現レベルが、遺伝子発現の増加したレベルである、請求項１９に記載の方法。
  21. ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＢＳＥＰの前記発現レベルが、前記肝芽細胞の段階の前のレベルより約１倍〜約１０００倍高く増加する、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＢＳＥＰの前記発現レベルが、前記肝芽細胞の段階の前のレベルより約１０倍〜約１００倍高く増加する、請求項１９または２０に記載の方法。
  23. ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ４α、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーが、前記胎児および成体の肝細胞様細胞の段階で発現される、請求項６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、および／またはＨＮＦ４αの発現レベルが、前記胎児および成体の肝細胞様細胞の段階で、前記胎児および成体の肝細胞様細胞の段階の前のレベルと比べて増加する、請求項２３に記載の方法。
  25. 増加した前記発現レベルが、遺伝子発現の増加したレベルである、請求項２４に記載の方法。
  26. ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、および／またはＨＮＦ４αの前記発現レベルが、前記胎児および成体の肝細胞の段階の前のレベルより約１０倍〜約１０００倍高く増加する、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、および／またはＨＮＦ４αの前記発現レベルが、前記胎児および成体の肝細胞の段階の前のレベルより少なくとも１００倍高く増加する、請求項２４または２５に記載の方法。
  28. 前記ＴＳ細胞が、ヒトＴＳ細胞である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記ステロイドが、デキサメタゾンである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記サイトカインが、オンコスタチンＭである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記オンコスタチンＭが、ヒトオンコスタチンＭである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ヒトオンコスタチンＭが、組換えヒトオンコスタチンＭである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記馴化培地が、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）をさらに含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記ＢＭＰが、約１〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ＢＭＰが、約１〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記ＢＭＰが、約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記ＢＭＰが、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、またはＢＭＰ１５である、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記ＢＭＰが、ＢＭＰ４である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記馴化培地が、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をさらに含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記ＨＧＦが、約０．１〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記ＨＧＦが、約０．１〜２５ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記ＨＧＦが、約５ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３９に記載の方法。
  43. 前記誘導肝細胞が、免疫特権を有する、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記誘導肝細胞が、ＴＧＦβ１を発現する、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記誘導肝細胞が、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中でＴＧＦβ１、フィブロネクチン、およびコラーゲンＩＶを発現する、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記誘導肝細胞が、ＨＬＡ−Ｇを発現する、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記誘導肝細胞が、ＨＬＡ−Ｇおよびｓｔｅｍ−１２１を発現する、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記誘導肝細胞が、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を動員する、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記誘導肝細胞が、３次元構造の組織を形成する、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記誘導肝細胞が、クラスター化または集合化する、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記誘導肝細胞が、三日月形の細胞塊を形成する、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記誘導肝細胞が、末梢の区画および中央の区画を含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記誘導肝細胞が、前記末梢の区画中において基底膜を超えてＥＣＭに沿って不規則に分布する、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記誘導肝細胞が、前記中央の区画中において基底から中央領域に向かって分布する、請求項５２または５３に記載の方法。
  55. 前記誘導肝細胞が、ＴＧＦβ１、ＨＬＡ−Ｇ、ｓｔｅｍ １２１、Ｃ−ｋｉｔ、ＣＫ１９、ＣＫ１８、ＡＬＢ、α−ＡＦＰ、ベータトロフィン、ＡＤＨ１、ＡＰＯＦ、ＣＰＳ１、ＧＡＴＡ４、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ６、ＡＳＧＲ１、ＣＸＣＲ４、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、Ｃｘ３２、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記誘導肝細胞が、ＴＧＦβ１、ＨＬＡ−Ｇ、ｓｔｅｍ １２１、Ｃ−ｋｉｔ、ベータトロフィン、ＡＤＨ１、ＡＰＯＦ、ＣＰＳ１、ＣＹＰ２Ｂ６、ＡＳＧＲ１、ＣＸＣＲ４、Ｃｘ３２、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記誘導肝細胞が、ＣＰＳ１、ＣＹＰ２Ｂ６、およびそれらの組合せからなる群より選
    択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する、請求項５６に記載の方法。
  58. 請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法によって生産された、誘導肝細胞。
  59. 栄養膜幹細胞から誘導された、単離された誘導肝細胞であって、該肝細胞は、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、表面抗原分類４（ＣＤ４）、フォークヘッドボックスＰ３（Ｆｏｘｐ３）、ヒト細胞質マーカーのｓｔｅｍ １２１（ｓｔｅｍ １２１）、マスト／幹細胞増殖因子受容体Ｃ−ｋｉｔ（Ｃ−ｋｉｔ）、ベータトロフィン、アポリポタンパク質Ｆ（ＡＰＯＦ）、アルコールデヒドロゲナーゼ−１（ＡＤＨ１）、カルバモイルリン酸シンターゼ１（ＣＰＳ１）、ＧＡＴＡ転写因子４（ＧＡＴＡ４）、シトクロムＰ４５０ファミリー１のサブファミリーＡのポリペプチド１（ＣＹＰ１Ａ１）、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ６（ＣＹＰ２Ｂ６）、アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）、胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）、多剤耐性タンパク質−２（ＭＲＰ２）、コネクシン３２（ＣＸ３２）、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＳＲＹ−ボックス１７（ＳＯＸ１７）、ヘキソサミニダーゼＡアルファポリペプチド（ＨＥＸＡ）、造血系で発現されるホメオボックス（ＨＨＥＸ）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、アルブミン（ＡＬＢ）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）、シトクロムＰ４５０ ７Ａ１（ＣＹＰ７Ａ１）、グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）、セルピンペプチダーゼ阻害剤クレードＡ（アルファ−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン）のメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、ＡＴＰ結合カセットのサブファミリーＣ（ＡＢＣＣ２）、ＣＣＡＡＴ−エンハンサー結合タンパク質ベータ（Ｃ／ＥＢＰβ）、肝細胞核因子１−アルファ（ＨＮＦ１α）、肝細胞核因子４−アルファ（ＨＮＦ４α）、アルファ−１−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、サイトケラチン８（ＣＫ８）、ミトコンドリアのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ２（ＰＣＫ２）、グリコーゲンシンターゼ２（ＧＹＳ２）、肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）、アルコールデヒドロゲナーゼ１Ｃ（クラスＩ）ガンマポリペプチド（ＡＤＨ１Ｃ）、シトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、プロスペロホメオボックス１（ＰＲＯＸ１）、トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ２）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、およびサイトケラチン１９（ＣＫ１９）からなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーを発現する、上記肝細胞。
  60. 肝臓前駆細胞である、先行するいずれもの請求項に記載の肝細胞。
  61. 前記肝細胞が、４つの段階：原始線条から胚体内胚葉（ＤＥ）への段階、肝臓特異的な内胚葉の段階、肝芽細胞の段階、ならびに胎児および成体の肝細胞の段階のうち１つにある、先行するいずれもの請求項に記載の肝細胞。
  62. ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＨＨＥＸ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＢＳＥＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ４α、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーが、前記４つの段階の１つまたはそれより多くで発現される、請求項６１に記載の肝細胞。
  63. ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＨＨＥＸ、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーが、前記原始線条からＤＥへの段階で発現される、請求項６１または６２に記載の肝細胞。
  64. ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、および／またはＨＨＥＸの発現レベルが、前記原始線条からＤＥへの段階で、前記原始線条からＤＥへの段階の前のレベルと比べて増加
    する、請求項６３に記載の肝細胞。
  65. 増加した前記発現レベルが、遺伝子発現の増加したレベルである、請求項６４に記載の肝細胞。
  66. ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７および／またはＨＨＥＸの前記発現レベルが、前記原始線条からＤＥへの段階の前のレベルより約１倍〜約１０，０００倍高く増加する、請求項６４または６５に記載の肝細胞。
  67. ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７および／またはＨＨＥＸの前記発現レベルが、前記原始線条からＤＥへの段階の前のレベルより約１０倍〜約１０００倍高く増加する、請求項６４または６５に記載の肝細胞。
  68. ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＣＹＰ７Ａ１、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーが、前記肝臓特異的な内胚葉の段階で発現される、請求項６０〜６７のいずれか一項に記載の肝細胞。
  69. ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＣＹＰ７Ａ１の発現レベルが、前記肝臓特異的な内胚葉の段階で、前記肝臓特異的な内胚葉の段階の前のレベルと比べて増加する、請求項６８に記載の肝細胞。
  70. 増加した前記発現レベルが、遺伝子発現の増加したレベルである、請求項６９に記載の肝細胞。
  71. ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＣＹＰ７Ａ１の前記発現レベルが、前記肝臓特異的な内胚葉の段階の前のレベルより約１倍〜約１０００倍高く増加する、請求項６９または７０に記載の肝細胞。
  72. ＳＯＸ１７、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＣＹＰ７Ａ１の前記発現レベルが、前記肝臓特異的な内胚葉の段階の前のレベルより約１０倍〜約１００倍高く増加する、請求項６９または７０に記載の肝細胞。
  73. ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーが、前記肝芽細胞の段階で発現される、請求項６０〜７２のいずれか一項に記載の肝細胞。
  74. ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＢＳＥＰの発現レベルが、前記肝芽細胞の段階で、前記肝芽細胞の段階の前のレベルと比べて増加する、請求項７３に記載の肝細胞。
  75. 増加した前記発現レベルが、遺伝子発現の増加したレベルである、請求項７４に記載の肝細胞。
  76. ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＢＳＥＰの前記発現レベルが、前記肝芽細胞の段階の前のレベルより約１倍〜約１０００倍高く増加する、請求項７４または７５に記載の肝細胞。
  77. ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、および／またはＢＳＥＰ
    の前記発現レベルが、前記肝芽細胞の段階の前のレベルより約１０倍〜約１００倍高く増加する、請求項７４または７５に記載の肝細胞。
  78. ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ４α、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーが、前記胎児および成体の肝細胞様細胞の段階で発現される、請求項６０〜７７のいずれか一項に記載の肝細胞。
  79. ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、および／またはＨＮＦ４αの発現レベルが、前記胎児および成体の肝細胞様細胞の段階で、前記胎児および成体の肝細胞様細胞の段階の前のレベルと比べて増加する、請求項７８に記載の肝細胞。
  80. 増加した前記発現レベルが、遺伝子発現の増加したレベルである、請求項７９に記載の肝細胞。
  81. ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、および／またはＨＮＦ４αの前記発現レベルが、前記胎児および成体の肝細胞の段階の前のレベルより約１０倍〜約１０００倍高く増加する、請求項７９または８０に記載の肝細胞。
  82. ＨＨＥＸ、ＢＳＥＰ、ＴＴＲ、ＡＬＢ、ＴＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＨＮＦ１α、および／またはＨＮＦ４αの前記発現レベルが、前記胎児および成体の肝細胞の段階の前のレベルより少なくとも１００倍高く増加する、請求項７９または８０に記載の肝細胞。
  83. 前記栄養膜幹細胞が、ヒト栄養膜幹細胞である、請求項５９〜８２のいずれか一項に記載の肝細胞。
  84. 前記肝細胞が、免疫特権を有する、請求項５９〜８３のいずれか一項に記載の肝細胞。
  85. 前記肝細胞が、ＴＧＦβ１を発現する、請求項５９〜８４のいずれか一項に記載の肝細胞。
  86. 前記肝細胞が、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中で、ＴＧＦβ１、フィブロネクチン、およびコラーゲンＩＶを発現する、請求項５９〜８５のいずれか一項に記載の肝細胞。
  87. 前記肝細胞が、ＨＬＡ−Ｇを発現する、請求項５９〜８６のいずれか一項に記載の肝細胞。
  88. 前記肝細胞が、ＨＬＡ−Ｇおよびｓｔｅｍ−１２１を発現する、請求項５９〜８７のいずれか一項に記載の肝細胞。
  89. 前記肝細胞が、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を動員する、請求項５９〜８８のいずれか一項に記載の肝細胞。
  90. 前記肝細胞が、３次元構造の組織を形成する、請求項５９〜８９のいずれか一項に記載の肝細胞。
  91. 前記肝細胞が、クラスター化または集合化する、請求項５９〜９０のいずれか一項に記
    載の肝細胞。
  92. 前記肝細胞が、三日月形の細胞塊を形成する、請求項５９〜９１のいずれか一項に記載の肝細胞。
  93. 前記肝細胞が、末梢の区画および中央の区画を含む、請求項５９〜９２のいずれか一項に記載の肝細胞。
  94. 前記肝細胞が、前記末梢の区画中において基底膜を超えてＥＣＭに沿って不規則に分布する、請求項９３に記載の肝細胞。
  95. 前記肝細胞が、前記中央の区画中において基底から中央領域に向かって分布する、請求項９３または９４に記載の肝細胞。
  96. 前記肝細胞が、ＴＧＦβ１、ＨＬＡ−Ｇ、ｓｔｅｍ １２１、Ｃ−ｋｉｔ、ＣＫ１９、ＣＫ１８、ＡＬＢ、α−ＡＦＰ、ベータトロフィン、ＡＤＨ１、ＡＰＯＦ、ＣＰＳ１、ＧＡＴＡ４、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ６、ＡＳＧＲ１、ＣＸＣＲ４、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、Ｃｘ３２、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する、請求項５９〜９５のいずれか一項に記載の肝細胞。
  97. 前記肝細胞が、ＴＧＦβ１、ＨＬＡ−Ｇ、ｓｔｅｍ １２１、Ｃ−ｋｉｔ、ベータトロフィン、ＡＤＨ１、ＡＰＯＦ、ＣＰＳ１、ＣＹＰ２Ｂ６、ＡＳＧＲ１、ＣＸＣＲ４、Ｃｘ３２、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する、請求項９６に記載の肝細胞。
  98. 前記肝細胞が、ＣＰＳ１、ＣＹＰ２Ｂ６、およびそれらの組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する、請求項９７に記載の肝細胞。
  99. 前記肝細胞が、ｓｔｅｍ １２１、Ｃ−ｋｉｔ、ＣＫ１９、ＣＫ１８、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する、請求項９６に記載の肝細胞。
  100. 前記肝細胞が、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ベータトロフィン、ＡＤＨ１、ＡＰＯＦ、ＣＰＳ１、ＧＡＴＡ４、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ６、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する、請求項９６に記載の肝細胞。
  101. 前記肝細胞が、ＡＳＧＲ１、ＣＸＣＲ４、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、Ｃｘ３２、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択される１つまたはそれより多くのマーカーを発現する、請求項９６に記載の肝細胞。
  102. 状態の処置または予防で使用するための治療的化合物をスクリーニングする方法であって、
    ａ）請求項５５〜１０１のいずれか一項に記載の単離された肝細胞を、該治療的化合物と接触させること；および
    ｂ）該単離された肝細胞中のバイオマーカーの発現レベルを検出すること
    を含む、上記方法。
  103. 前記単離された肝細胞中のバイオマーカーの前記発現レベルが、前記治療的化合物と接触させていない等価な単離された肝細胞と比較して増加する、請求項１０２に記載の方法
    。
  104. 前記単離された肝細胞中のバイオマーカーの前記発現レベルが、前記治療的化合物と接触させていない等価な単離された肝細胞と比較して減少する、請求項１０２に記載の方法。
  105. 前記発現レベルが、遺伝子発現レベルである、請求項１０２〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記バイオマーカーが、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、またはＣＹＰ７Ａ１を含む、請求項１０２〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. 前記治療的化合物が、小分子薬物、ペプチド、またはタンパク質である、請求項１０２〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. 前記治療的化合物が、合成化学薬物である、請求項１０２〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記状態が、肝不全である、請求項１０２〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記状態が、肝臓関連の疾患または障害である、請求項１０２〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
  111. 前記肝臓関連の疾患または障害が、アラジール症候群、アルファ１抗トリプシン欠乏症、自己免疫肝炎、良性肝腫瘍、胆道閉鎖、硬変症、嚢胞性肝疾患、アルコール関連の肝疾患および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を包含する脂肪性肝疾患、ガラクトース血症、胆石、ギルバート症候群、ヘモクロマトーシス、肝嚢胞、肝臓がん、妊娠中の肝疾患（任意選択で、妊娠性急性脂肪肝、妊娠中の肝内胆汁うっ滞、子癇前症、またはＨＥＬＬＰ症候群（溶血、肝臓検査値の上昇、低い血小板数））、新生児肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、ポルフィリン症、ライ症候群、サルコイドーシス、中毒性肝炎、糖原病１型、チロシン血症、ウイルス性肝炎、ウィルソン病、またはそれらのあらゆる組合せを含む、請求項１１０に記載の方法。
  112. 請求項５５〜１０１のいずれか一項に記載の単離された肝細胞を含む組成物。
  113. 請求項５５〜１０１のいずれか一項に記載の単離された肝細胞を含む医薬組成物。
  114. 請求項５５〜１０１のいずれか一項に記載の単離された肝細胞を、対象に該肝細胞を植え付けるのに有効な量で含む医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における状態を処置する方法。
  115. 前記肝細胞が、医薬的に許容される担体中で投与される、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記医薬的に許容される担体が、リン酸緩衝塩類溶液を含む、請求項１１４に記載の方法。
  117. 前記肝細胞が、１ｍｌ当たり約１０×１０６から約４０×１０６個の細胞を含有する懸濁液中で投与される、請求項１１４〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記肝細胞が、約１０ｍｌから約１５０ｍｌの体積で投与される、請求項１１４〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
  119. 前記対象が、ヒトである、請求項１１４〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記投与が、注射を含む、請求項１１４〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記注射が、静脈注射である、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記注射が、肝静脈に投与される、請求項１２０に記載の方法。
  123. 前記注射が、肝臓動脈に投与される、請求項１２０に記載の方法。
  124. 前記状態が、肝臓関連の疾患または障害である、請求項１１４〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
  125. 前記状態が、肝不全である、請求項１２４に記載の方法。
  126. 前記肝臓関連の疾患または障害が、アラジール症候群、アルファ１抗トリプシン欠乏症、自己免疫肝炎、良性肝腫瘍、胆道閉鎖、硬変症、嚢胞性肝疾患、アルコール関連の肝疾患および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を包含する脂肪性肝疾患、ガラクトース血症、胆石、ギルバート症候群、ヘモクロマトーシス、肝嚢胞、肝臓がん、妊娠中の肝疾患（任意選択で、妊娠性急性脂肪肝、妊娠中の肝内胆汁うっ滞、子癇前症、またはＨＥＬＬＰ症候群（溶血、肝臓検査値の上昇、低い血小板数））、新生児肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、ポルフィリン症、ライ症候群、サルコイドーシス、中毒性肝炎、糖原病１型、チロシン血症、ウイルス性肝炎、ウィルソン病、またはそれらのあらゆる組合せを含む、請求項１２４に記載の方法。
  127. 治療用タンパク質を生産するための、請求項５５〜１０１のいずれか一項に記載の単離された肝細胞を含む組成物の使用。
  128. 前記治療用タンパク質が、主要な血漿タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、可溶性血漿フィブロネクチン、α−フェトプロテイン、Ｃ反応性タンパク質、および数々のグロブリン；血流遮断および線維素溶解に関与するタンパク質、例えば凝血カスケードに関与する凝血因子、α２−マクログロブリン、α１−アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＳ、プロテインＣ、プラスミノゲン、α２−抗プラスミン、および補体成分３；担体タンパク質、例えばアルブミン、セルロプラスミン、トランスコルチン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ＩＧＦ結合タンパク質、主要な尿タンパク質、レチノール結合タンパク質、性ホルモン結合グロブリン、トランスチレチン、トランスフェリン、およびビタミンＤ結合タンパク質；ホルモン、例えばインスリン様増殖因子１、トロンボポエチン、ヘプシジン、およびベータトロフィン；プロホルモン、例えばアンギオテンシノゲン；またはアポリポタンパク質を含む、請求項１２７に記載の使用。
  129. 肝再生のための、請求項５５〜１０１のいずれか一項に記載の肝細胞を含む組成物の使用。
  130. 前記肝再生が、エクスビボにおける肝再生である、請求項１２９に記載の使用。
  131. 前記エクスビボにおける肝再生が、バイオプリンティング方法である、請求項１３０に記載の使用。
  132. 前記バイオプリンティング方法が、３次元バイオプリンティング方法である、請求項１３１に記載の使用。
  133. バイオプリンティングのための、請求項５５〜１０１のいずれか一項に記載の肝細胞を含む組成物の使用。
  134. 前記バイオプリンティングが、３次元バイオプリンティングである、請求項１３３に記載の使用。
  135. 組織足場の生成のための、請求項５５〜１０１のいずれか一項に記載の肝細胞の使用。
  136. 前記組織足場が、３次元の組織足場である、請求項１３５に記載の使用。
  137. 遺伝子治療のための、請求項５５〜１０１のいずれか一項に記載の肝細胞を含む組成物の使用。
  138. 前記遺伝子治療が、エクスビボにおける遺伝子治療である、請求項１３７に記載の使用。
  139. 請求項５５〜１０１のいずれか一項に記載の肝細胞から生成した人工組織。
  140. 前記組織が、３次元である、請求項１３９に記載の組織。
  141. 前記組織において血管新生が起こる、請求項１３９または１４０に記載の組織。
  142. 請求項５５〜１０１のいずれか一項に記載の肝細胞から生成した人工臓器。
  143. 前記肝細胞、組織、または臓器が、ＡＦＰ、ＡＬＢ、アルファ−１−アンチトリプシン、グルコース、またはグリコーゲンを生産する、前記請求項のいずれか一項に記載の肝細胞、組織、または臓器。
  144. 前記肝細胞、組織、または臓器が、脂質、コレステロール、または炭水化物を代謝する、前記請求項のいずれか一項に記載の肝細胞、組織、または臓器。
  145. 前記肝細胞、組織、または臓器が、医薬または有毒物質を代謝する、前記請求項のいずれか一項に記載の肝細胞、組織、または臓器。
  146. 前記肝細胞、組織、または臓器が、アンモニアまたは胆汁酸を取り込む、前記請求項のいずれか一項に記載の肝細胞、組織、または臓器。
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