CN102666855A - 用于多能性基质细胞的神经元分化的方法、系统和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的一些实施方式包括通过微小RNA的应用而在体外或体内选择性诱导多能性基质细胞的神经元分化的方法、系统和组合物，该微小RNA包括但不限于miRNA-124、miRNA-137和/或miRNA-9*，这些miRNA的表达产物、以及含有这些miRNA的功能元件的分子和组合物。本发明的一些实施方式还包括这样的诱导的细胞用于治疗哺乳动物损伤和疾病的治疗给药和用途，包括但不限于，可能在其它方面导致细胞或系统功能降低的神经系统损伤或疾病。

Description

用于多能性基质细胞的神经元分化的方法、系统和组合物
技术领域
本发明的一些实施方式涉及用于治疗哺乳动物神经系统损伤和疾病的细胞类型的诱导和应用，但不限于此。
背景技术
某些神经系统损伤、影响中枢或周围神经系统的自身免疫性疾病、以及神经退行性疾病的特征在于特定细胞的损失、或存在神经细胞的功能异常，这些会引起患者出现不同的神经病学体征和症状以及可能不可逆转的神经功能丧失。仅作为一个实例，一些患有中风、脊椎损伤或其它神经损伤和变性的患者经受功能细胞类型的损失，或如帕金森氏症和阿尔茨海默氏症这样的反过来导致系统功能的丧失或异常的神经病症。目前，用于治疗和修复这样的细胞和系统功能的治疗选择是有限的。因此，仍然需要方法、系统和组合物来促进其它治疗，包括致力于替换缺失或受损的神经系统细胞、组织和功能的疗法。
发明内容
本发明的一些实施方式包括通过微小RNA(microRNA)的应用而在体外或体内选择性地诱导多能性基质细胞的神经元分化的方法、系统和组合物，包括但不限于miRNA-124、miRNA-137和/或miRNA-9*，这些miRNA的表达产物，和含有这些miRNA的功能元件(functional elements)的分子和组合物，但本发明并不局限于本文所描述的那些实施方式，且不存在具体放弃。本发明的一些实施方式也包含这样的诱导细胞的治疗给予和应用以治疗哺乳动物损伤和疾病，包括但不限于，可能在其它方面导致细胞或系统功能降低的神经系统损伤或疾病。
附图说明
现在将参照附图仅通过举例方式描述本发明的一些实施方式，对其它实施方式不存在具体的放弃，在附图中：
图1显示用生长因子处理或用对照miRNA和miRAN-124或miRNA-137转染3、5和9天的MSC的亮场图像(明场像，bright fieldimage)。
图2是显示miRAN-124、miRNA-137和miRNA-9*在MSC中诱导神经元标记的数据表示。
图3显示用测试的miRNA转染细胞或由DMEM处理后的蛋白质印迹结果。
图4显示用对照miRNA、miRAN-124或miRNA-137转染(动物)脂肪和脐带来源的MSC(cord derived MSC)的结果。
具体实施方式
本发明的一些实施方式包括通过微小RNA(microRNA)(“miRNA”或“miR”)的应用而在体外或体内选择性诱导多能性基质细胞(“MSC”)的神经元分化的方法、系统和组合物，包括但不限于，miRNA-124和/或miRNA-137、和/或miRNA-9*，这些miRNA的表达产物，以及含有这些miRNA的功能元件的分子和组合物，但本发明并不局限于本文所描述的那些实施方式，且对任何实施方式不存在具体放弃。本发明的一些实施方式也包含这样的经诱导的细胞用于治疗治疗哺乳动物损伤和疾病的治疗给药和用途，包括但不限于，可能在其它方面导致细胞或系统功能降低的神经系统损伤或疾病。在一些实施方式中，分化的MSC的这种诱导，和/或所产生的细胞，可以通过给予所述患者治疗有效量的感兴趣的miRNA、或由这样的miRNA诱导的分化MSC，而用于治疗患者体内的细胞、组织或器官损伤。
我们已经出乎意料地发现某些miRNA能够诱导受试者中MSC的长期神经元分化用于基于细胞疗法的用途，这些受试者呈现神经系统损伤和疾病，包括但不限于，神经退行性紊乱和脊髓损伤。这样的受试者可以包括哺乳动物，包括但不限于人。因此，我们已经发现这样的miRNA以及所产生的经诱导的MSC的新应用，除了其它可能的用途，它们能够减少或减轻哺乳动物中某些神经系统损伤或疾病的影响。
本发明的一些实施方式包括通过miRNA-124、miRNA-137、和/或miRNA-9*的应用和表达而诱导MSC的神经元分化的方法、系统、和/或组合物，但不限于此。MSC是典型地以非常低的浓度(10000个有核细胞中约1个)典型地存在于成年骨髓中的中胚层来源的细胞(mesoderm-derived cells)。MSC能够分化产生细胞，如骨髓基质、血管、脂肪、骨骼和软骨。这些细胞可能也具有分化为神经元\或神经胶质-样细胞的潜能，这取决于环境信号。此外，这些细胞可能被进一步诱导表达或通过与生长因子和激素的不同组合进行培养而保持特定神经元或神经胶质表型。
在实验动物模型中以及最近在试验性临床实验中，MSC已经显示出在各种神经疾病和功能异常中发挥治疗作用。它们的作用主要归因于免疫抑制和神经保护功能。在实验性自身免疫性脑炎(“EAE”)中，多发性硬化症(“MS”)的动物模型，用骨髓来源的MSC处理小鼠引起了疾病表现的显著抑制。一些研究证明，除了自身免疫调节降低之外，这些细胞的神经分化还在诸如缺血性脑的各种实例中增强了它们的治疗作用。
在我们的研究中，我们检测了三种神经元-相关性miRNA，即miRNA-124、miRNA-137和miRNA-9*对人MSC分化的影响。这些miRNA没有在MSC中正常表达。我们发现miRNA-124、miRNA-137或miRNA-9*的表达诱导了MSC的神经元分化，正如细胞形态学以及βIII-微管蛋白和MAP2的表达提高所指示的。miRNA-124、miRNA-137和miRNA-9*引起酪氨酸羟化酶的增加，这暗示着MSC向多巴胺能表型的分化。miRNA124前体(前体miRNA124，pre-miRNA124)的靶标之一是抑制大量神经元基因的转录因子REST。我们的结果显示神经元-相关性miRNA可以诱导MSC的长期神经元分化，用于在神经退行性和神经炎性紊乱以及脊髓损伤中基于细胞疗法的用途。与通过生长因子处理而诱导的瞬时分化(transient differentiation)相比，miRNA的用途优于现有方法的一个优点在于：能够在将引起长期神经元分化的MSC中稳定地表达miRNA前体。就这点而论，容易获得患者自己的骨髓来源的MSC、以及大量富集和扩增MSC的可行性表明：这样的细胞的神经元分化能够用作自体神经干细胞，其可用于治疗大量与神经元缺乏或受损有关的获得性或先天性神经性紊乱。仅作为一个实例，MSC能够由通过吸脂去除的脂肪进行制备，以及由脐带血(cord blood)或胎盘进行制备，但不限于此。MSC降低的免疫原性可以促进现成的(off the shelf)或者来自匹配或部分错配家族成员的异体神经元的使用，而用于治疗(仅作为非限制性实例)由必需酶(essential enzymes)或其它必需产物(essential products)的先天性缺失而引起的病症。
(本发明)不限于仅在本文中明确公开的实施方式，且不存在对任何实施方式的具体放弃，本发明的一些实施方式包括：
1.MSC的神经元分化，其是通过培养或其它暴露于miRNA，包括但不限于，miRNA124和/或miRNA137、和/或miRNA-9*。
2.用这样的miRNA对MSC的转染；
3.将在体外诱导神经元分化的MSC给予患有神经系统损伤或疾病的受试者；和/或
4.将用这样的miRNA转染的MSC给予患有神经系统损伤或疾病的受试者。
在一些实施方式中，随着MSC向神经元的可再现的转分化(reproducible transdifferentiation)，MSC的治疗用途能够在体外或体内获得和扩展，从而包括(仅作为某些实例)：对脑血管疾病、脊髓损伤的治疗，对神经退行性紊乱如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(“ALS”)、多发性硬化症(“MS”)以及相关的运动神经元疾病的治疗，但不限于此。正在进行的临床研究已经表明MSC鞘内注射和静脉输注能够部分地改善MS患者中疾病的临床表现，且使ALS患者达到较轻程度。这样的临床研究提供了以下证据，即MSC鞘内注射和静脉输注都是安全的过程，因为被处理的患者中没有一个产生任何严重的副作用。因此，用MSC的细胞疗法预示性地代表用于治疗大量神经紊乱的一个重要途径，其中，特别地，MSC能够被诱导为神经元或少突细胞和/或能够诱导局部存在的干细胞神经发生的分泌因子。
实施例
提供本发明的一些实施方式的以下实施例，但并不是要将本发明限于仅在此处描述的那些实施方式且不存在对任何实施方式的具体放弃。
微小RNA
微小RNA(“miRNA”)代表一类内源性、小的(作为一些非限制性的实例，19-23个核苷酸)非编码RNA，其通过RNA干扰(“RNAi”)途径起作用而影响转录后基因沉默。miRNA基于互补靶向特定基因的mRNA，且介导mRNA断裂(完全互补(perfect complementarity))或翻译阻抑(translation repression)(部分互补)。miRNA已经被证实在发育中起重要作用，且可以作为用于建立或保持决定细胞命运的特定表达谱的基本的基因调控元件而起作用。
MSC的操纵性(manipulating)神经元分化可能涉及在分化过程中协调基因表达程序的调控途径。分化通常需要细胞的mRNA和蛋白质构成的改变。一类基因调控分子是微小RNA，一个小的(小分子的)RNA的亚类，其被认为使用RNA干扰途径中的元件(elements)在转录后下调蛋白编码基因的表达。miRNA可能在细胞分化中起重要作用，因为它们被预测同时单独调控数百个靶基因。
方法
为了确定miRNA-124、miRNA-137和miRNA-9*对MSC分化的影响，我们在4-12段(passages)中采用这些细胞的三种不同制剂。将MSC细胞涂布于DMEM+10％FCS上24hr，然后用所述三种miRNA的成熟序列的双链RNA寡核苷酸和阴性对照寡核苷酸转染。所使用的miRNA如下：
Dharmacon模拟产物：
MI0000443/MIMAT0000422-人
选定的前体/成熟
成熟：
hsa-miR-124[MIMAT0000422]
前体：
hsa-miR-124-1[MI0000443]
有机体：
人
成熟序列：
UAAGGCACGCGGUGAAUGCC(SEQ ID NO.1)
MI0000454/MIMAT0000429-人
选定的前体/成熟
成熟：
hsa-miR-137[MIMAT0000429]
前体：
hsa-miR-137[MI0000454]
有机体：
人
成熟序列：
UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG(SEQ ID NO.2)
miRNA 9*序列：
AUAAAGCUAGAUAACCGAAAGU(SEQ ID NO.3)
miRNA 9模拟
UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA(SEQ ID NO.4)
3天后，将细胞转移到补充有B27的神经基质培养基(NeurobasalMedium，NB)中。细胞形态每24小时监测一次，且在转染5、7和9天后通过免疫荧光染色、蛋白质印迹分析或实时PCR对神经元标记进行分析。作为神经元分化诱导的阳性对照，我们使用通过Shh、FGF8和bFGF的组合刺激的细胞。
结果
miRNA-124、miRNA-137、和miRNA-9*促进MSC的神经元分化。图1是代表产生相似结果的六个单独实验的图示。如图1所显示的，用miRNA-137、miRNA-124或miRNA-9*对细胞的转染在转染72小时后就已经减少细胞增殖且诱导细胞中形态分化。用miRNA-137对MSC的转染诱导了快速和稳健的形态变化，且所述细胞获得了有致密细胞体(compactcell bodies)的典型神经元表型和有静脉曲张的长突起(elongatedprocesses)。miRNA-124-转染的细胞在细胞增殖以及随后产生若干细胞类型方面显示出强烈的下降；有长突起的伸长细胞(elongated cell)、具有多个较短突起的小细胞和扁平的星状细胞。对照miRNA转染的细胞与对照未处理的细胞类似。有趣地，miRNA-137的作用比GF的作用更快速且更强烈。约90％miRNA-137转染的细胞显示神经元形态。
miRNA-124、miRNA-137和miRNA-9*增加MSC中神经元标记的表达。为了进一步检测miRNA-124、miRNA-137和miRNA-9*对神经元分化的影响，我们检测了神经干细胞标记、巢蛋白(nestin)、星形细胞标记GFAP和神经元标记βIII-微管蛋白以及酪氨酸羟化酶的表达。细胞用合适的miRNA转染或用DMEM或神经基质培养基+B27处理。5天后，巢蛋白mRNA的表达使用实时PCR测定，且巢蛋白、GFAP、βIII-微管蛋白和酪氨酸羟化酶的表达在处理9天后通过蛋白质印迹分析检测。结果表示为产生相似结果的五个不同实验。图2显示转染5天后，如实时PCR测定的，巢蛋白mRNA大量增加。相反，用不同的miRNA转染9天后，我们发现βIII-微管蛋白的表达增加，然而没有观察到巢蛋白或GFAP的表达。此外，我们发现miRNA-137和miRNA-9*诱导酪氨酸羟化酶表达的大量增加，然而在miRNA-124转染的细胞中观察到较小的增加。在对照miRNA转染的细胞中，所有这些标记物的表达不存在的或者可忽略不计。
miR-9*诱导MSC中多巴胺能标记物，酪氨酸羟化酶。图3显示MSC用合适的miRNA转染或用DMEM处理后的蛋白质印迹结果。9天后，通过蛋白质印迹分析检测酪氨酸羟化酶表达。结果表示为产生相似结果的五个不同实验。在MSC中，miRNA-9*诱导多巴胺能标记物，酪氨酸羟化酶。
我们的结果证实miRNA-124、miRNA-137和miRNA-9*诱导MSC的神经元分化，尽管在我们的测试模型中分别以不同程度(进行诱导)。miRNA-137诱导更快速更稳健的效果，产生神经元细胞的同质群体(同源群体，homogenous population)。酪氨酸羟化酶在这些细胞中高水平的表达暗示这些细胞显示多巴胺能表型。
与对照miRNA-处理的细胞相比，miRNA-124也诱导神经元分化，如通过高水平的βIII-微管蛋白所测定的。在我们的研究中，这种处理引起了表达较低水平酪氨酸羟化酶的细胞的混合群体。没有处理诱导星形细胞分化，如通过GFAP表达缺失所测定的。
此外，处理5天后，两种miRNA都引起了巢蛋白表达的大量瞬时增加，表明神经干细胞样或神经元祖细胞样细胞的生成。MSC向NSC或NPC样细胞的受控分化可被进一步利用，以通过使用特定转录因子或生长因子的特定组合将这些细胞分化为不同的神经元细胞系或具有不同表型的神经元。
miRNA-124和miRNA-9*已经被报道参与神经元分化和神经突生长。相似地，有一项报道证实了miRNA137对神经胶质瘤干细胞和NSC的神经元分化的影响。然而，没有报道miRNA对MSC的神经元分化的作用，且没有示出miRNA124和miRNA137对具有特定表型的神经元生成的影响。此外，没有报道这些miRNA中的任一个可诱导具有NSC/NPC表型的细胞。
miRNA-124和miRNA-137诱导脂肪和脐带来源的MSC(cord derived MSC)中神经元分化。脂肪和脐带来源的MSC用对照miRNA、miRNA-124和miRNA-137转染，这类似于骨髓MSC(图4)。
脂肪来源的MSC的制备：脂肪来源的MSC通过从大腿或腹壁吸脂而获得。将100-200ml吸出物在可从脂肪细胞和碎片中分离MSC的特别设计的Cytori分离器中处理。所述细胞被进一步处理和保持，如对骨髓来源的MSC描述的那样。
人脐带MSC的制备：新鲜的人脐带在出生后获得(经父母同意)且在4℃在DMEM中收集。去除脐带血管且将间充质组织(华通氏胶(Wharton’s jelly))切成小块。250×g离心5min后，所述组织用无血清DMEM清洗，在37℃用胶原酶处理18h，随后在37℃用2.5％胰蛋白酶消化30min。所述经分离的MSC在与对骨髓来源的MSC所描述的相似条件下进一步分散和保持。
12天后，提取mRNA，且使用实时PCR测定b3-微管蛋白和看家基因(house keeping gene)S12的水平。
我们的结果(图4)证实miRNA-124和miRNA-137不仅在骨髓来源的MSC中还在脂肪组织和脐带血来源的细胞中诱导神经元分化。神经元标记βIII微管蛋白在miRNA处理后在这些细胞中被诱导。这些细胞来源中的每一个都具有自己的优点。骨髓来源的MSC已得到很好的特征描述，且已经成功地使用超过20年而没有致癌性。脂肪来源的MSC被较少的描述，但是能被大量获得，且脐带血细胞能够以非侵入方式容易地获得，它们不需要捐赠者和患者之间完全的基因相容性(genetic compatibility)，因而更容易得到。
含有miRNA前体和GDNF的质粒的构建。由于GDNF已牵涉多巴胺能神经元的存活，因而我们构建了在分开的启动子下与GDNF一起共表达miRNA-124前体或miRNA-137前体的质粒。
关于分步克隆(step by step cloning)GDNF于premir载体(来自SystemBiosciences的CD-511_1或PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP)，描述了测序步骤和克隆所述miRNA前体GDNF载体的程序以及克隆miRNA的程序，但并不限于仅在此处描述的实施方式，且不存在对任何实施方式的具体放弃。
人胶质细胞来源的神经营养因子(“GDNF”)模板的cDNA从Origene获得。为了将GDNF克隆至premir 124和137载体(System Biosciences)中，针对GDNF ORF的具有Xho1和Sal1限制性酶消化位点的引物设计如下：
正向：cacc ctcgag(Xho1)atg aag tta tgg gat gtc gtg gct gtc tgc(SEQID NO.5)
反向：aaa gtcgac(Sal1)tca gat aca tcc aca cct ttt agc gga atg(SEQ IDNO.6)
PCR之后，清洗GDNF DNA产物，然后用Xho1和Sal1消化，且再次清洗DNA，产生可立即进行克隆的GDNF的DNA。
通过使用以下引物将Xho1限制性位点添加到premir 124和premir137载体中：
正向：gac gcc acc atg gag agc ctc gag(Xho1)agc ggc ctg ccc gcc(SEQID NO.7)
反向：ggc ggg cag gcc gct ctc gag(Xho1)gct ctc cat ggt ggc gtc(SEQID NO.8)
GFP基因通过使用限制性酶Xho1和Sal1而从premir 124和137载体中去除，然后清洗所述载体。
GDNF与premir 124和137载体的连接(ligation)。将连接的质粒转入One Shot Top 10化学感受态细胞中。用小量抽提法(mini prep)处理后，通过培养克隆而选择具有premir 124和137的质粒。
通过使用Xho1和Sal1消化质粒从而检测GDNF的插入。然后测序所述质粒。miR-124和137的序列以及premir载体的骨架(backbone)：
MiR-124：
GAACAAAGAGCCTTTGGAAGACGTCGCTGTTATCTCATTGTCTGTGTGATTGGGGGAGCTGCGGCGGGGAGGATGCTGTGGTCCCTTCCTCCGGCGTTCCCCACCCCCATCCCTCTCCCCGCTGTCAGTGCGCACGCACACGCGCCGCTTTTTATTTCTTTTTCCTGGTTTTCTTATTCCATCTTCTACCCACCCCTCTTCCTTTCTTTCACCTTTCCTTCCTTCCTTCCTCCTTTCCTTCCTCAGGAGAAAGGCCTCTCTCTCCGTGTTCACAGCGGACCTTGATTTAAATGTCCATACAATTAAGGCACGCGGTGAATGCCAAGAATGGGGCTGGCTGAGCACCGTGGGTCGGCGAGGGCCCGCCAAGGAAGGAGCGACCGACCGAGCCAGGCGCCCTCCGCAGACCTCCGCGCAGCGGCCGCGGGCGCGAGGGGAGGGGTCTGGAGCTCCCTCCGGCTGCCTGTCCCGCACCGGAGCCCGTGGGGTGGGGAGGTGTGCAGCCTGTGACAGACAGGGGCTTAGAGATGC(SEQ ID NO.9)
MiR-137：
CAGCACTCTTCTGTGTTAAGTATTTGATTTTGTGATTTGTCTTTCAGAATTGGAAATAGAGCGGCCATTTGGATTTGGGCAGGAAGCAGCCGAGCACAGCTTTGGATCCTTCTTTAGGGAAATCGAGTTATGGATTTATGGTCCCGGTCAAGCTCAGCCCATCCCCAGGCAGGGGCGGGCTCAGCGAGCAGCAAGAGTTCTGGTGGCGGCGGCGGCGGCAGTAGCAGCGGCAGCGGTAGCAGCGGCAGCGGTAGCAGCGGCAGCGGCAGCTTGGTCCTCTGACTCTCTTCGGTGACGGGTATTCTTGGGTGGATAATACGGATTACGTTGTTATTGCTTAAGAATACGCGTAGTCGAGGAGAGTACCAGCGGCAGGGGGGCAGCGGCCGCCCTCCCCAGCCCACCAGCTGGCCACTAAACGCCCGTGGTTGCCAAGGTAGCACTTTCTTGTTCTTTTCATTTCCTCGGGTGTTTTCGCACTGGTTCCACCGGAAAGGCTGTGCGCTGCGCCTCTGGTGACCAGGACTGGA(SEQ ID NO.10)
所附为骨架载体(CD-511_1)的序列：
位点(LOCUS)  CD511B_1_pCDH_CMV_7544bp ds-DNA环形16-DEC-2008：
定义
登录号
版本
来源
有机体
注释
注释        ApEinfo：甲基化：1
特征        位点/修饰(Qualifiers)
尚未归类的特征(misc_feature)2315..2764
    /标记＝EF1启动子
    /ApEinfo_fwd颜色＝蓝绿色
    /ApEinfo_rev颜色＝绿色
尚未归类的特征   2765..2789
    /标记＝EF1启动子(1)
    /ApEinfo_标记＝EF1启动子
    /ApEinfo_fwd颜色＝蓝绿色
    /ApEinfo_rev颜色＝绿色
尚未归类的特征  2874..3629
    /标记＝copGFP
    /ApEinfo_fwd颜色＝#00ff00
    /ApEinfo_rev颜色＝绿色
尚未归类的特征  3639..4229
    /标记＝WPRE
    /ApEinfo_fwd颜色＝蓝绿色
    /ApEinfo_rev颜色＝绿色
尚未归类的特征  2790..2860
    /标记＝EF1 启动子(2)
    /ApEinfo_标记＝EF1启动子
    /ApEinfo_fwd颜色＝蓝绿色
    /ApEinfo_rev颜色＝绿色
尚未归类的特征  2765..2789
    /标记＝EFfwd引物
    /ApEinfo_fwd颜色＝#ff80ff
    /ApEinfo_rev颜色＝绿色
尚未归类的特征  1922..2183
    /标记＝CMV
    /ApEinfo_fwd颜色＝#ff80ff
    /ApEinfo_rev颜色＝绿色
尚未归类的特征  2272..2314
    /标记＝MCS
    /ApEinfo_fwd颜色＝#80ff00
    /ApEinfo_rev颜色＝绿色
尚未归类的特征  2205..2271
    /标记＝CMV(1)
    /ApEinfo_标记＝CMV
    /ApEinfo_fwd颜色＝#ff80ff
    /ApEinfo_rev颜色＝绿色
尚未归类的特征  2184..2204
    /标记＝DAB 90正向引物
    /ApEinfo_fwd颜色＝蓝绿色
    /ApEinfo_rev颜色＝绿色
源
1    acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca
61   acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta
121  cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga
181  attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc
241  tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta
301  agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact
361  ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg
421  cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct
481  tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt
541  gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag
601  aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt
661  aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt
721  agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg
781  atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag
841  gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag
901  taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg
961  acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag
1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag
1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc
1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga
1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc
1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg
1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata
1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa
1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga
1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa
1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat
1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt
1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg
1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggttaacttt
1801 taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa agaatagtag acataatagc
1861 aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca aaaattcaaa attttatcga
1921 tactagtatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac
1981 gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga
2041 tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg
2101 ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg
2161 caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac
2221 cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag attctagagc
2281 tagcgaattc gaatttaaat ggatccgcgg ccgcaaggat ctgcgatcgc tccggtgccc
2341 gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca
2401 attgaacggg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact
2461 ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga
2521 acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca gaacacagct gaagcttcga ggggctcgca
2581 tctctccttc acgcgcccgc cgccctacct gaggccgcca tccacgccgg ttgagtcgcg
2641 ttctgccgcc tcccgcctgt ggtgcctcct gaactgcgtc cgccgtctag gtaagtttaa
2701 agctcaggtc gagaccgggc ctttgtccgg cgctcccttg gagcctacct agactcagcc
2761 ggctctccac gctttgcctg accctgcttg ctcaactcta cgtctttgtt tcgttttctg
2821 ttctgcgccg ttacagatcc aagctgtgac cggcgcctac gctagacgcc accatggaga
2881 gcgacgagag cggcctgccc gccatggaga tcgagtgccg catcaccggc accctgaacg
2941 gcgtggagtt cgagctggtg ggcggcggag agggcacccc caagcagggc cgcatgacca
3001 acaagatgaa gagcaccaaa ggcgccctga ccttcagccc ctacctgctg agccacgtga
3061 tgggctacgg cttctaccac ttcggcacct accccagcgg ctacgagaac cccttcctgc
3121 acgccatcaa caacggcggc tacaccaaca cccgcatcga gaagtacgag gacggcggcg
3181 tgctgcacgt gagcttcagc taccgctacg aggccggccg cgtgatcggc gacttcaagg
3241 tggtgggcac cggcttcccc gaggacagcg tgatcttcac cgacaagatc atccgcagca
3301 acgccaccgt ggagcacctg caccccatgg gcgataacgt gctggtgggc agcttcgccc
3361 gcaccttcag cctgcgcgac ggcggctact acagcttcgt ggtggacagc cacatgcact
3421 tcaagagcgc catccacccc agcatcctgc agaacggggg ccccatgttc gccttccgcc
3481 gcgtggagga gctgcacagc aacaccgagc tgggcatcgt ggagtaccag cacgccttca
3541 agacccccat cgccttcgcc agatcccgcg ctcagtcgtc caattctgcc gtggacggca
3601 ccgccggacc cggctccacc ggatctcgct aagtcgacaa tcaacctctg gattacaaaa
3661 tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg
3721 ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct
3781 tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg
3841 gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt gccaccacct
3901 gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg
3961 ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg
4021 tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc
4081 tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac cttccttccc
4141 gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc
4201 ggatctccct ttgggccgcc tccccgcctg gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggca
4261 gctgtagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac tggaagggct aattcactcc
4321 caacgaaaat aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga
4381 gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct
4441 tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc
4501 agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtagta gttcatgtca tcttattatt
4561 cagtatttat aacttgcaaa gaaatgaata tcagagagtg agaggaactt gtttattgca
4621 gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt
4681 tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggctc
4741 tagctatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa
4801 ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt
4861 gaggaggctt ttttggaggc ctagactttt gcagagacgg cccaaattcg taatcatggt
4921 catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg
4981 gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt
5041 tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg
5101 gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg
5161 actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa
5221 tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc
5281 aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc
5341 ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat
5401 aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc
5461 cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct
5521 cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg
5581 aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc
5641 cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga
5701 ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa
5761 ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta
5821 gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc
5881 agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg
5941 acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga
6001 tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg
6061 agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct
6121 gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg
6181 agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc
6241 cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa
6301 ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc
6361 cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt
6421 cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc
6481 ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt
6541 tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc
6601 catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt
6661 gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata
6721 gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga
6781 tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag
6841 catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa
6901 aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt
6961 attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga
7021 aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag
7081 aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc
7141 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca
7201 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg
7261 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc
7321 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc
7381 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat
7441 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt
7501 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gctg(SEQ ID NO.11)
我们发现用这些质粒转染的MSC分泌GDNF且表达各个miRNA。因此，由分化的多巴胺能神经元分泌的GDNF预期提供存活信号至分化的细胞和内源性多巴胺能神经元。
可诱导的miRNA的构建。植入的MSC已被报道迁移至中枢神经系统的受损组织且发挥神经营养和免疫调节的作用。具体地，在帕金森病动物模型中，植入的MSC已显示为移植(engraft)入受损的纹状体(striatum)中。在一些实施方式中，但不限于此，可诱导的miRNA前体表达载体可被使用，其在所需的时间点将允许特定miRNA前体表达的诱导。因此，MSC将被特定miRNA前体转染，且其将在受损纹状体中MSC移植之前或随后的不同时间点被诱导表达。对于这样的研究，我们已采用可诱导的miRNA和染色(living color)，并采用使用Tet-on系统(Clontech)的荧光蛋白报告子(reporter)。这个系统通过启动子的添加而允许特定miRNA的诱导(仅作为实例，可通过强力霉素(doxycyline))，以及其中生成miRNA的细胞的鉴定。
概括地说，我们已经证实了miRNA124、miRNA137和miRNA-9*诱导MSC转分化为NSC/NPC以及具有特定神经元表型(miRNA137)的神经元的能力。其它的神经元miRNA，如miRNA-9和miR218，也可影响MSC的转分化和诱导神经元分化。
与通过生长因子处理而诱导的瞬时分化相比，使用miRNA124优于现有方法的一个优点是：能够在MSC中稳定地表达miRNA前体，其将引起长期的神经元分化。
我们的研究显示神经元-相关性miRNA可被用于诱导MSC的长期神经元分化，用于在神经退行性紊乱和脊髓损伤中的基于细胞的疗法中，仅作为一些实例，其可由以下所显示：
1.通过微小RNA(miRNA-124、miRNA-137和miRNA-9*)的MSC的神经元分化；
2.通过miRNA-137、miRNA-124和miRNA-9*的MSC的特异性多巴胺能分化；以及
3.通过微小RNA诱导MSC向神经干细胞样或神经祖细胞样细胞的瞬时分化。用miRNA转染提供了机会性窗口，其中，细胞能够被分化为中枢神经系统的不同细胞系(神经元、星形细胞和少突细胞)或者使用转录因子或生长因子的特定组合而分化为特定神经元表型。所述窗口能够由miRNA表达的水平或转染后特定时间点所控制。
miRNA转分化MSC为未决定分化方向的祖细胞(uncommittedprogenitor cells)和不同神经元细胞亚群的能力使利用这些细胞治疗多种神经疾病成为可能，包括脊髓和周围神经损伤、出血或阻塞性病变(obstructive lesion，“CVA”)引起的对中枢神经系统的损害或者外伤性中枢或周围神经损伤。此外，转分化的MSC可以被用于由特发性自身免疫性疾病(“EAE”)引起的神经退行性疾病或者如帕金森氏症或阿尔茨海默病的疾病或者如ALS的病因不明的疾病中。此外，通过转分化的MSC对神经功能的改善也可以被用于药物引起的神经元损伤和/或毒性所造成的各种退行性疾病中。
因此，在我们的研究中，miRNA-124、miRNA-137和miRNA-9*促进MSC的神经分化，伴随形态学变化和表型标记的表达。
一些实施方式的诱导miRNA可按照良好的医疗实践给予和服用，需考虑达到靶MSC预期效果所使用的技术、个体患者的临床情况、给予的部位和方法、给予的时间安排、患者年龄、性别、体重和医生所知的其它因素。用于本文目的的“药学有效量”因此可由本领域中所知的这些考虑因素所决定。该量必须是对实现改善而有效的，包括但不限于，在体内和/或体外MSC的所需分化、降低损害和损伤、或者症状的改善或消除、以及作为适当措施被所属领域的技术人员选择的其它指标。
本发明的实施方式可以为治疗神经系统损伤和疾病扩大治疗窗口，且能够用于治疗每年在美国患这样的损伤和疾病的庞大患者人群。因此，在一些实施方式中，通过包含本发明实施方式的诱导miRNA的选择性应用，本发明包含预防、控制、或减轻哺乳动物神经系统损伤和疾病的新方法，包括但不限于，脑损伤、神经变性、或脊髓损伤。按照一些实施方式，通过一种或多种这样的miRNA的使用和/或给予而在体内或体外诱导靶细胞中的分化，用于限制这样的损伤或疾病影响的治疗中，可以实现这样的干预治疗，但不限于此。因此，一些实施方式包括通过转分化MSC的选择性应用和/或诱导而预防、控制、或减轻哺乳动物损伤(包括但不限于脑损伤)的新组合物和方法，不局限于所述主题，也不存在对主题的具体放弃。
本申请通过作者、引用、和/或通过专利号可参考各种出版物，包括但不限于，文章、报告(presentations)、和美国专利。每一篇任何这样的文献的公开内容均以其整体并入本申请中供参考。
尽管已结合上述优选和可替换实施方式对本发明进行具体示出和描述，但本领域的技术人员应理解的是，在不背离如所附权利要求中限定的本发明的精神和范围的情况下，本文描述的本发明的实施方式的各种替换方案可用于本发明的实施中。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且落在这些权利要求的范围内的方法和设备及其等同物也尤其所涵盖。本发明的描述应当被理解为包括此处所描述的元素的所有新颖性和非显而易见的组合，且对这些元素的任何新颖性和非显而易见组合，权利要求可存在于本申请或以后的申请中。上述实施方式是例示性的，且没有单一的特征或元素对于本申请或以后的申请中可被要求的所有可能组合是必不可少的。在权利要求限定其等同物的“一种”或“第一”元件时，这样的权利要求应当理解为包括一种或多种这样的元素的合并，既不要求也不排除两种或多种这样的元素。

Claims (18)

1.一种刺激来自哺乳动物的多能性基质细胞的神经元分化的方法，包括以下步骤：
提供包括微小RNA-124的组合物，以及
向哺乳动物的多能性基质细胞群给予药学有效量的所述组合物以在所述群中刺激神经元分化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。
3.一种刺激来自哺乳动物的多能性基质细胞的神经元分化的方法，包括以下步骤：
提供包括微小RNA-137的组合物，以及
向哺乳动物的多能性基质细胞群给予药学有效量的所述组合物以在所述群中刺激神经元分化。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。
5.一种刺激来自哺乳动物的多能性基质细胞的神经元分化的方法，包括以下步骤：
提供包括微小RNA-9*的组合物，以及
向哺乳动物的多能性基质细胞群给予药学有效量的所述组合物以在所述群中刺激神经元分化。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。
7.微小RNA-124在用于刺激哺乳动物的多能性基质干细胞的神经元分化的药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述哺乳动物是人。
9.微小RNA-137在用于刺激哺乳动物的间充质干细胞的神经元分化的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述哺乳动物是人。
11.微小RNA-9*在用于刺激哺乳动物的多能性基质细胞的神经元分化的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中，所述哺乳动物是人。
13.一种治疗患有神经系统损伤或疾病的哺乳动物的方法，包括以下步骤：
通过在体外使多能性基质细胞暴露于单独的或者以任意组合的微小RNA-124、微小RNA-137、或微小RNA-9*，从而刺激所述细胞的神经元分化；以及
将这样的神经元分化的细胞给予所述哺乳动物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。
15.一种治疗患有神经系统损伤或疾病的哺乳动物的方法，包括以下步骤：
在体外用单独的或者以任意组合的微小RNA-124、微小RNA-137、或微小RNA-9*转染多能性基质细胞；以及
将这样的经转染的细胞给予所述哺乳动物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。
17.一种治疗患有神经系统损伤或疾病的哺乳动物的方法，包括以下步骤：
用包括一种或多种编码单独的或者以任意组合的微小RNA-124、微小RNA-137或微小RNA-9*的核苷酸的载体来转染多能性基质细胞，其中，这样的核苷酸在所述载体中的表达可由启动子诱导，
将这样的经转染的细胞给予所述哺乳动物，以及
通过将所述启动子给予所述哺乳动物，在所述哺乳动物中诱导所述核苷酸的表达以产生微小RNA-124、微小RNA-137、或微小RNA-9*。
18.根据权利要求15所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。
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