JP2020509997A - アデノシン類似体及びその概日リズム時計調整における使用 - Google Patents

アデノシン類似体及びその概日リズム時計調整における使用 Download PDF

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チュイ、ターポン
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Abstract

本発明はヌクレオシド類似化合物、及び当該化合物及びペントスタチンを含む組成物、これらの概日リズム調節、好ましくは概日リズム位相シフトにおける使用、及び当該化合物又は前記組成物による概日リズム調節方法、好ましくは概日リズム位相シフト方法を提供する。

Description

現代社会において、一回の旅行で複数のタイムゾーンを跨ぐことがよくあるが、これにより悩ましい“時差ボケ”を患うことになる。世界観光機関（Ｗｏｒｌｄ Ｔｏｕｒｉｓｍ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＵＮＷＴＯ）の予測によれば、全世界で毎年２億人以上が大陸を跨いで旅行するという。彼らにとって最も苦痛なのは普段の生理的なリズムが完全に逆位相になることである（このため約１２時間の昼夜の差がある）。例えば、北京からニューヨークに飛ぶ場合、またはロンドンからハワイ諸島に飛ぶ人が目的地の時間に適応するには一週間以上必要となる。また、報道によれば、アメリカでは六分の一の労働者がシフトワークの仕事に従事しており（例えば看護師やトラックの運転手）、彼らは作業スケジュールに適応するためによく重度の“睡眠−覚醒”の位相変化を経験している。このような煩わしい変化は短期的には疲労と不安を招き、長期的には精神と身体に支障をきたしかねない。
我々の内生時計は毎日の“睡眠−覚醒”サイクルを管理制御していると考えられている。次の三つのパラメータが振動の一般的なプロセスを描写するのに用いられる、即ち周期、振幅、位相である（Ｄｕｎｌａｐ、１９９９）。大多数の従来の概日リズム振動研究は時計周期に集中している。なぜならば三つのパラメータの中で最も安定していると考えられており（即ち環境要素の妨害に対して弾性を有する）、且つ前記時計の核心調節と直接関連すると考えられているからである（Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、２００８ｂ）。概日リズム振動の振幅に注目している研究は少数である。但し少なくとも二つの研究がＣｌｏｃｋ／ｄＣｌｋタンパク質の振幅調節における活性を示している（Ａｌｌａｄａ等、２００３であり；Ｈｅ等、２０１５）。前記時計の位相を調べる研究は更に少ない。位相は環境妨害に対して非常に敏感である。実際、現在の観点では、位相に関する現象を実験により確実に再現するのは難しいと考えられている（Ｃｈｅｎ等、２０１８）。しかしながら、前記時計に関して言えば、位相は概日リズム転写の“ゴー／ノーゴー（ｇｏ／ｎｏ−ｇｏ）”時刻を規定し、時計振動の開始時点を確定するため、位相は実際には周期や振幅より重要でなかったとしても周期や振幅と同じくらい重要である可能性があると認識している。
本出願において、我々は厳しい基準を有する新しい化学スクリーニング方策を利用して時計位相表現型をモニタリングし、一組の時計位相シフト小分子の鑑定に成功した。特に、アデノシン類似体及びその関連化合物のヒト細胞概日リズム時計に対する調節について研究した。意外なことに、これら化合物を適時に投与すると、時計位相を完全に逆にし、概日リズム振動の１２時間の時差をもたらすことができることを発見した。構造−活性関係（ＳＡＲ）研究とアデノシンデアミナーゼ特異的阻害薬ペントスタチンの前処理を合わせ、これら化合物の作用濃度をナノモル範囲まで改善し、臨床使用を可能にした。この他、これら化合物は血液脳関門（ＢＢＢ）を透過することができ、初めての有效的な時計調節剤化合物が末梢神経に入り込んで十分な行動効果を果たすことを証明した。以前発見されたクロックドラッグとしてＬｏｎｇｄａｙｓｉｎ（ＣＫ１阻害薬、ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ２０１０）、ＫＬ００１系列（ＣＲＹ１／２安定剤、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２）及びＯＰＣ−２１２６８／ＳＳＲ−１４９４１５（Ｖ１ａ／ｂ拮抗剤、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３）があるが、行動に対して無効であったり、大脳に脳室内（ＩＣＶ）注射してＢＢＢ透過を促進する必要があったりするため、これらが臨床において実際に挙動再アレンジに使用されることは排除されていた。我々の知る限り、我々の薬物は初めて脳内注射せずに作用を発揮できるクロックドラッグである。
一つの形態において、本発明は以下の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの化合物を開示する。
式中、Ｒ１〜Ｒ１８は互いに独立して、好ましくは１〜８個の炭素原子を含有する非置換又は置換の直鎖又は分岐鎖炭化水素残留物、水素、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アリル、アリルオキシ、アリルチオ、ヘテロ環、ヘテロ環アミノ、ハロゲン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミンオキシド、アルキルヒドロキシルアミノ、アジ化物、硝酸、シアノ及びイソシアノ、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリルカルボニル、ヘテロ環カルボニル、アルキルビニル、アリル、カルボキシ、アルキルチオ、アミド、エステル、ホスホン酸エステル、シクロアルキルホスホン酸エステル、シクロアルキルホスホンアミド、スルホン酸エステル、シクロアルキルスルホン酸エステル又はヘテロ環スルホン酸エステル、但しアルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ及びアルキルチオはそれぞれＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキレン、ハロアルキル（Ｃ１〜Ｃ８）、シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ８）、アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ８）及びアルキルチオ（Ｃ１〜Ｃ８）であり、例えば、Ｒ１〜Ｒ１３はアリルメチル、アリルエチル、アリルプロピル、アリルブチル、ヘテロアリルメチル、ヘテロアリルエチル、ヘテロアリルプロピル、ヘテロアリルブチルであってもよく、特にＲ１〜Ｒ１３はフェニル、フェニルメチル、１−メチル−２−フェニルエチル、１−フェニルプロピル、２−フェニルプロピル、３−フェニルプロピル、フェニルブチル、フェニルペンチル、フェニルへキシル又は１−ベンジル−１−メチルエチルであってもよく、Ｒ１−Ｒ１３はフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、フルオロメトキシ、クロロメトキシ、ブロモメトキシ、フルオロエトキシ、クロロエトキシ、ブロモエトキシ、アミノメトキシ、アミノエトキシ、アミノプロピルオキシ、又は他のヘテロ原子であってもよく、例えばＯ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びＳｅであり、Ｒ１−Ｒ１３は−ＯＲ′、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ′、−ＮＲ′Ｒ″、−ＳＲ′、−Ｒ′、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ′、−ＣＯＮＲ′Ｒ″、−Ｃ（Ｏ）Ｒ′、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、−ＮＲ″Ｃ（Ｏ）Ｒ′、−ＮＲ″ＣＯ２Ｒ′、−ＮＲ′−Ｃ（Ｏ）ＮＲ″Ｒ′″、−ＮＲ′−ＳＯ２ＮＲ″Ｒ′″、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ′Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ′、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ′）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ′）（ＯＲ″）、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ′（ＯＲ″）、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ′Ｒ″、−ＯＰ（ＯＨ）２、−ＯＰ（ＯＲ′）２、−ＯＰ（ＯＲ′）（ＯＲ″）、−ＯＰＲ′Ｒ″、−ＯＰＲ′（ＯＲ″）、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ′、−ＯＳ（Ｏ）（ＯＲ′）、−ＯＳＯ２Ｒ′、−ＯＳＯ２（ＯＲ′）、−ＯＳＯ２ＮＲ′Ｒ″、−Ｓ（Ｏ）Ｒ′、−Ｓ（Ｏ）（ＯＲ′）、−ＳＯ２Ｒ′、−ＳＯ２（ＯＲ′）、−ＳＯ２ＮＲ′Ｒ″、−ＮＲ″ＳＯ２Ｒ、−ＯＳｉ（Ｒ′）３、−ＯＳｉ（ＯＲ′）３、−Ｓｉ（ＯＲ′）３、−Ｓｉ（ＯＲ′）（ＯＲ″）（ＯＲ′″）、−ＯＳｉ（ＯＲ′）（ＯＲ″）（ＯＲ′″）、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、ペルフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ−又はペルフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−であってもよく、数量範囲が０から芳香環系上で空いている原子価総数までであり；但しＲ′、Ｒ″及びＲ′″は独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル及びヘテロアルキル、非置換のアリル及びヘテロアリル、（非置換のアリル）−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル及び（非置換のアリル）オキシ−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルからなる群から選択される。
Ｒ１〜Ｒ１８は非置換又は置換されたポリカーボン、ポリエーテル、ポリアルキルアミノ、アミド、エステル、ホスホン酸エステル、ポリホスホン酸エステル、ホスホンアミド、ポリホスホン酸エステル、ポリホスホンアミド、スルホン酸エステル、スルフィン酸エステル、硫酸、ポリスルホン酸エステル、ポリスルフィン酸エステル、ポリ硫酸リンカーにより互いに結合される環状形式であってもよく、好ましくは、リンカーはポリエーテル、エポキシド、アミド、エステル、ホスホン酸エステル、ポリホスホン酸エステル、ホスホンアミド、ポリホスホン酸エステル、ポリホスホンアミドである。
特定の実施形態において：
−Ｒ１はα−又はβ−水素、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アリル、アリルオキシ、アリルチオ、ヘテロ環、ヘテロ環アミノ、エポキシド、アルキルエポキシド、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、但しアルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ及びアルキルチオはそれぞれＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキレン、ハロアルキル（Ｃ１〜Ｃ８）、シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ８）、アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ８）及びアルキルチオ（Ｃ１〜Ｃ８）である。
Ｒ２〜Ｒ１８は独立して水素、酸素（＝Ｏ）、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、ハロアルキル、シクロアルキル 、アルコキシ、アルキルチオ、アリル、アリルオキシ、アリルチオ、ヘテロ環、ヘテロ環アミノ、エポキシド、アルキルエポキシド、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、但しアルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、ハロアルキル、シクロアルキル 、アルコキシ及びアルキルチオはそれぞれＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキレン、ハロアルキル（Ｃ１〜Ｃ８）、シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ８）、アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ８）及びアルキルチオ（Ｃ１〜Ｃ８）である。
Ｘ１〜Ｘ８は互いに独立して酸素（Ｏ）、硫黄（Ｓ）、セレン（−Ｓｅ−）のヘテロ原子、飽和又は不飽和の、置換又は非置換の窒素（＝Ｎ−、−ＮＨ−、−ＮＲ１４−）、及び原子価数量範囲が０から炭素環−又はヘテロ環−環系上で指示される原子の空いている原子価総数までの炭化水素残留物から選択される。例えば、Ｘ１〜Ｘ８は独立して−Ｏ−、−Ｓ−、＝Ｎ−、−ＮＨ−、−ＣＨ２−、＝ＣＨ−、−ＣＨＲ−、＝ＣＲ−、−ＣＲＲ′−又は−ＣＲ−であってもよい。ここにおいて、Ｒに対する定義は上記のＲ２〜Ｒ１８に対する定義に等しい。
Ｘ２〜Ｘ８の環系は置換又は非置換の、飽和又は不飽和の５−縮合された６−元炭素環又はヘテロ環系、好ましくは置換又は非置換のプリン、インデン、シクロペンタピリジン、シクロペンタピラジン、シクロペンタトリアジン、シクロペンタテトラジン、インドール、ピロロピリジン、ピロロピリダジン、ピロロトリアジン、ピロロテトラジン、インダゾール、ピラゾロピリジン、ピラゾロピリダジン、ピラゾロトリアジン、ピラゾロテトラジン、ベンゾイミダゾール、イミダゾールピリジン、イミダゾールピリダジン、イミダゾールトリアジン、イミダゾールテトラジン、ベンゾトリアゾール、トリアゾロピリジン、トリアゾロピリダジン、トリアゾロトリアジン、トリアゾロテトラジン、ベンゾイミダゾール−２−オンである。
塩形式以外にも、本発明はプロドラッグ形式の化合物を提供する。本文に記載された化合物のプロドラッグは本発明の化合物を提供できるよう生理又は医療条件で化学変化を経た化合物である。また、プロドラッグは化学又は生物化学方法により生体外環境中で本発明の化合物に変換できる。例えば、プロドラッグを適切な酵素又は化学試薬を有する透皮パッチリザーバーに放置すると、本発明の化合物にゆっくり変換できる。プロドラッグは通常、一部の場合において親薬物よりもより容易に投与できると考えられるため有用である。例えば、これらは経口投与において親薬物よりも生物利用度が高い。プロドラッグは薬理学組成物において親薬物よりも改善された溶解度を有することができる。多種多様なプロドラッグ誘導体が当分野でよく知られており、例えばプロドラッグの加水分解又は酸化活性に頼るものである。プロドラッグの一つの非限定的な例としては、本発明の化合物であり、これはエステル（“プロドラッグ”）として投与されるが、その後、代謝的にカルボン酸に、即ち活性体に加水分解される。別の例としては本発明化合物のペプチジル誘導体がある。
本発明の化合物はこのような化合物を構成する一つの又は複数の原子部分に非天然比例の原子同位元素を含んでもよい。例えば、前記化合物は放射性同位元素、例えば三重水素（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）又は炭素−１４（１４Ｃ）で放射標識されてもよい。本発明化合物のすべての同位元素変体、例えば重水素（２Ｈ）、炭素−１３（１３Ｃ）は、放射性の有無にかかわらず、いずれも本発明の範囲内に入ると意図される。
別の形態において、本発明は以下の式Ｉの化合物を開示する。
式中、Ｒ１はＨであり；Ｒ２及びＲ３は独立してＨ、ＯＨ、オキシビオチン（ＯＢｉｏｔｉｎ）、ＯＡｃ、ＯＴＢＳ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、又は＝Ｏ、又はＲ２及びＲ３は独立して存在せず；Ｒ４及びＲ５は独立してＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、＝Ｏ、オキシビオチン又はＮ３であり；又はＲ２／Ｒ３及びＲ４／Ｒ５はこれらが接続している炭素と一緒にエポキシエタンを形成し；Ｒ６及びＲ７は独立してＨ、ＣＨ２−ＯＨ、ＣＨ２−Ｎ３、ＣＨ２−オキシビオチン、ＣＨ２−ＡｃＯ、ＣＨ２−ＯＴＢＳ、ＣＯ２Ｍｅ、三リン酸化されたメチレン、１、２−ビスヒドロキシエタン、テトラブチルアンモニウムモノホスフェート、１−ヒドロキシプロパ−２−イン−１−イル、又はジアザシメンであり；Ｒ８はＨ、＝Ｓ、＝Ｏ、ＮＨ−ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−Ｏ−ＣＨ３、又は重水素であり；Ｒ９は存在せず、又はＲ９はＨ、ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり；Ｒ１０はＨ、−ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＨ２、ＮＨ−ＣＨ３、ＮＨ−ＮＨ２、＝Ｏ、ＮＨＢｎ、ビオチンアミド、ｍ−ヒドロキシアニリン、アミノシクロプロパン、アミノシクロブタン、アミノシクロペンタン、アミノシクロヘキサン、ＯＭｅ又はオクタミドであり；Ｒ１１は存在せず、又はＲ１１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり；Ｒ１２は存在せず、又はＲ１２はＨ、ＮＨ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＭｅ、４−ホルムアミド置換されたピラゾールであり；Ｒ１３は存在せず又はＲ１３はＨ、Ｏ−ＣＨ３又はＯｍｅであり；
Ｘ１はＯ、Ｎ又はＣであり；Ｘ２はＮ又はＣであり；Ｘ３はＣであり；Ｘ４はＣ又はＮであり；Ｘ５はＣ又はＮであり；Ｘ６はＣ又はＮであり；Ｘ７はＣ又はＮであり；及びＸ８はＣ又はＮである。
別の形態において、本発明は以下の式ＩＩの化合物を開示する。
式中、Ｒ１はＨであり；Ｒ２はＨ又はＯＨであり；Ｒ３はＨ又はＯＨであり；Ｒ４はＨ又はＯＨであり；Ｒ５はＨ又はＯＨであり；Ｒ６はＨ又はＯＨであり；Ｒ７はＨ又はＯＨであり；Ｒ８はＨであり；Ｒ９はＨであり；Ｒ１０はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり；Ｒ１１は存在せず又はＲ１１はＨであり；Ｒ１２はＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨ−ＣＨ３又はＯＭｅであり；Ｒ１３は存在せず又はＲ１３はＨであり；Ｒ１４はＨであり；Ｒ１５は存在せず又はＲ１５はＨであり；且つ
Ｘ１はＯであり；Ｘ２はＮであり；Ｘ３はＣであり；Ｘ４はＣ又はＮであり；Ｘ５はＣであり；Ｘ６はＮであり；Ｘ７はＣであり；及びＸ８はＣ又はＮである。
別の形態において、本発明は以下の式ＩＩＩの化合物を開示する。
式中、Ｒ１６はテトラヒドロフラン又はｔｅｒｔ−ブチルであり；Ｒ１７はＣＨ２−メチルベンジルであり；及びＲ１８はＮＨ２又はアミノベンジルであり；及び
Ｘ２はＮであり；Ｘ３はＣ又はＮであり；Ｘ４はＣ又はＮであり；Ｘ５はＣであり；Ｘ６はＮであり；Ｘ７はＣであり；及びＸ８はＮである。
好ましくは、本発明は以下の式Ｉの化合物を開示する。
式中、Ｒ１はＨであり；Ｒ２及びＲ３は独立してＨ、ＯＨ、オキシビオチン、ＯＡｃ、ＯＴＢＳ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、又は＝Ｏ、又はＲ２及びＲ３は独立して存在せず；Ｒ４及びＲ５は独立してＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、＝Ｏ、又はオキシビオチンであり；又はＲ２／Ｒ３及びＲ４／Ｒ５はこれらが接続している炭素と一緒にエポキシエタンを形成し；Ｒ６及びＲ７は独立してＨ、ＣＨ２−ＯＨ、ＣＨ２−Ｎ３、ＣＨ２−オキシビオチン、ＣＯ２Ｍｅ、三リン酸化されたメチレン、１、２−ビスヒドロキシエタン、テトラブチルアンモニウムモノホスフェート、１−ヒドロキシプロパ−２−イン−１−イル又はジアザシメンであり；又はＲ４／Ｒ５のヒドロキシル及びＲ６／Ｒ７のメチルヒドロキシルはこれらが接続している炭素と一緒に環状フォスフェートラクトンを形成し；Ｒ８はＨ、＝Ｓ、＝Ｏ、ＮＨ−ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−Ｏ−ＣＨ３、又は重水素であり；Ｒ９は存在せず、又はＲ９はＨ、ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり；Ｒ１０はＨ、−ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＨ２、ＮＨ−ＮＨ２、＝Ｏ、ＮＨＢｎ、ビオチンアミド、ｍ−ヒドロキシアニリン、アミノシクロプロパン又はオクタミドであり；Ｒ１１は存在せず、又はＲ１１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり；Ｒ１２は存在せず、又はＲ１２はＨ、ＮＨ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＭｅ、４−ホルムアミド置換されたピラゾールであり；Ｒ１３は存在せず又はＲ１３はＨ、Ｏ−ＣＨ３又はＯｍｅであり；及び
Ｘ１はＯ、Ｎ又はＣであり；Ｘ２はＮ又はＣであり；Ｘ３はＣであり；Ｘ４はＣ又はＮであり；Ｘ５はＣ又はＮであり；Ｘ６はＣ又はＮであり；Ｘ７はＣ又はＮであり；及びＸ８はＣ又はＮである。
好ましくは、本発明は以下の群から選択される化合物を開示する。









好ましくは、本発明は以下の群から選択される化合物を開示する。




好ましくは、本発明は以下の群から選択される化合物を開示する。


別の形態において、本発明は上記に定義される式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのヌクレオシド類似化合物又はその塩（薬学的に受容可能な塩）及びペントスタチンを含有する組成物を開示する。
好ましくは、前記組成物はコルジセピン及びペントスタチンからなり；前記組成物は以下の化合物の一つ及びペントスタチンからなる。

ペントスタチンは脱アミノ酵素阻害薬である。当業者は必要に応じて他の脱アミノ酵素阻害薬を選ぶことができる。
別の形態において、本発明は以下の式のプロドラッグを開示する。
好ましくは、前記プロドラッグは以下の群から選択される。
別の形態において、本発明は以下の式の修飾化合物を開示する。
好ましくは、前記修飾化合物は以下の群から選択される。
別の形態において、本発明は、上記に定義される式Ｉ、式ＩＩ又は式ＩＩＩのヌクレオシド類似化合物又はその塩（薬学的に受容可能な塩）の治療有効量を被験者に投与することを含む概日リズム調節方法、好ましくは概日リズム位相シフト方法を開示する。
好ましくは、前記化合物はＰｅｒ２−Ｌｕｃピーク時に投与されるがトラフ時に投与されない。
別の形態において、本発明は上記に定義される式Ｉ、式ＩＩ又は式ＩＩＩのヌクレオシド類似化合物又はその塩（薬学的に受容可能な塩）及びペントスタチンを含む組成物の治療有効量を被験者に投与することを含む概日リズム調節方法、好ましくは概日リズム位相シフト方法を開示する。
好ましくは、前記組成物はコルジセピン及びペントスタチンからなり；前記組成物は以下の化合物の一つ及びペントスタチンからなる。

好ましくは、前記組成物はＰｅｒ２−Ｌｕｃピーク時に投与されるがトラフ時に投与されない。
ペントスタチンは脱アミノ酵素阻害薬である。当業者は必要に応じて他の脱アミノ酵素阻害薬を選ぶことができる。
別の形態において、本発明は以下の式のプロドラッグの治療有効量を被験者に投与することを含む概日リズム調節方法、好ましくは概日リズム位相シフト方法を開示する。
好ましくは、前記プロドラッグは以下の群から選択される。
別の形態において、本発明は以下の式の修飾化合物の治療有効量を被験者に投与することを含む概日リズム調節方法、好ましくは概日リズム位相シフト方法を開示する。
好ましくは、前記修飾化合物は以下の群から選択される。
別の形態において、本発明は上記に定義される以下の式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのヌクレオシド類似化合物又はその塩（薬学的に受容可能な塩）の概日リズム調節用薬物、好ましくは概日リズム位相シフト用薬物の製造における使用を開示する。
別の形態において、本発明は上記に定義される以下の式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのヌクレオシド類似化合物又はその塩（薬学的に受容可能な塩）及びペントスタチンを含む組成物の概日リズム調節用薬物、好ましくは概日リズム位相シフト用薬物の製造における使用を開示する。
好ましくは、前記組成物はコルジセピン及びペントスタチンからなり；前記組成物は以下の化合物の一つ及びペントスタチンからなる。
別の形態において、本発明は以下の式のプロドラッグの概日リズム調節用薬物、好ましくは概日リズム位相シフト用薬物の製造における使用を開示する。
好ましくは、前記プロドラッグは以下の群から選択される。
別の形態において、本発明は以下の式の修飾化合物の概日リズム調整用、好ましくは概日リズム位相シフト用薬物製造を開示する。
好ましくは、前記修飾化合物は以下の群から選択される。
好ましくは、前記薬物は時差、シフトワーク、年齢による睡眠障碍又は概日リズム時計に関連する睡眠障害の治療に使用可能である。
本発明の化合物又は本発明の組成物は従来のキャリア及び賦形剤と一緒に調製でき、前記キャリア及び賦形剤は通常のプラクティスに基づいて選択される。したがって、本発明の化合物又は本発明の組成物は腸内投与、静脈内投与、経口投与又は舌下投与用に調製可能である。
薬物は他の薬剤、例えばカフェイン、メラトニン、ゾルピデム、エスゾピクロン、ザレプロン又はトリアゾラムと組み合わせ可能である。
前記被験者は時差、シフトワーク、年齢による睡眠障害又は概日体内時計に関連する睡眠障害を患う人又はこれらを患うリスクのある人である。
別の形態において、本発明は本ヌクレオシド類似体のＣＤＫ９調節による前記時計位相シフトにおける使用を開示する。
別の形態において、本発明はＲＵＶＢＬヘリカーゼの、コルジセピンが仲介するＰｅｒ２−ｄＬｕｃ誘導及び時計位相シフトの仲介における使用、及びＲＵＶＢＬヘリカーゼのコルジセピンのダイレクトターゲットとしての使用であって、但しＲＵＶＢＬヘリカーゼは本発明の開示するヌクレオシド類似化合物のターゲットであることを開示する。ＲＵＶＢＬヘリカーゼはＲＵＶＢＬ１ヘリカーゼ又はＲＵＶＢＬ２ヘリカーゼであってもよい。つまりＲＵＶＢＬは前記時計位相をシフトする本発明のヌクレオシド類似化合物のターゲットとすることができる。
本発明はそれぞれが単独で、一つ一つ列挙されているかのように、本文に記載する特定の実施形態の全ての組み合わせを含む。
本発明は本文に記載する特定の実施形態の全ての組み合わせを含む。
アデノシン類似化合物コルジセピンによる時計位相リセットを示す。 アデノシン類似化合物コルジセピンによる時計位相リセットを示す。 アデノシン類似化合物コルジセピンによる時計位相リセットを示す。 アデノシン類似化合物コルジセピンによる時計位相リセットを示す。 アデノシン類似化合物コルジセピンによる時計位相リセットを示す。 アデノシン類似化合物コルジセピンによる時計位相リセットを示す。 アデノシン類似化合物コルジセピンによる時計位相リセットを示す。 アデノシン類似化合物コルジセピンによる時計位相リセットを示す。 コルジセピンのマウス体内Ｐｅｒ２発現誘導及び時計位相調節行動を示す。 コルジセピンのマウス体内Ｐｅｒ２発現誘導及び時計位相調節行動を示す。 コルジセピンのマウス体内Ｐｅｒ２発現誘導及び時計位相調節行動を示す。 コルジセピンのマウス体内Ｐｅｒ２発現誘導及び時計位相調節行動を示す。 コルジセピンのマウス体内Ｐｅｒ２発現誘導及び時計位相調節行動を示す。 前記時計位相をシフトさせるコルジセピンターゲットであるＲｕｖｂｌ２を示す。 前記時計位相をシフトさせるコルジセピンターゲットであるＲｕｖｂｌ２を示す。 前記時計位相をシフトさせるコルジセピンターゲットであるＲｕｖｂｌ２を示す。 前記時計位相をシフトさせるコルジセピンターゲットであるＲｕｖｂｌ２を示す。 前記時計位相をシフトさせるコルジセピンターゲットであるＲｕｖｂｌ２を示す。 ＤＲＢのＥ−ｂｏｘ遺伝子転写に対する急速誘導を示す。 Ｒｕｖｂｌ２のＢｍａｌ１及びＣｒｙ１との直接的な相互作用を示す。 コルジセピンがＣｒｙ２及びＲＵＶＢＬ２とＰｅｒ２遺伝子座結合を破壊することを示す。 ペントバルビタールを陽性対照として腹膜内（Ｉ．Ｐ．）注射した後の脳脊髄液（ＣＳＦ）中のコルジセピン濃度を示す。 ペントバルビタールを陽性対照として腹膜内（Ｉ．Ｐ．）注射した後の脳脊髄液（ＣＳＦ）中のコルジセピン濃度を示す。 ペントバルビタールを陽性対照として腹膜内（Ｉ．Ｐ．）注射した後の脳脊髄液（ＣＳＦ）中のコルジセピン濃度を示す。
本発明をより理解し、どのように実施するかを示せるよう、あくまでも例として図面を参照する。具体的な図面を詳細に参照する場合であっても、示されている詳細は単に例であり、本発明の好ましい実施の形態を説明検討するためものものであり、且つ最も有用で容易に本発明の原理と概念だと思われる内容を紹介するためである。
本文で用いられる用語“薬学的に受容可能な塩”とは、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、乳酸塩、酸式クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸塩（ｆｕｍｍａｒａｔｅ）、グルコン酸塩、グルクロン酸塩（ｇｌｕｃａｒｏｎａｔｅ）、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ベシル酸塩及びメシラートを含むが、これらに限られない。
用語“治療有效量”とは、単独で又は他の薬物、例えばカフェイン、メラトニン、ゾルピデム、エスゾピクロン、ザレプロン又はトリアゾラムと一緒に、時差、シフトワーク又は年齢による睡眠障害を治療するために概日リズム位相調節に有効な量を指す。
本発明の組成物は薬用可能な賦形剤も含むことができる。適切な賦形剤又はキャリア及び投与可能な組成物の調製方法は当業者によく知られている方法である。
本発明はヌクレオシド類似化合物、及び前記化合物及びペントスタチンを含む組成物、これらの概日リズム調節、好ましくは概日リズム位相シフトにおける使用、及び前記化合物又は前記組成物による概日リズムを調節方法、好ましくは概日リズム位相シフト方法を提供する。
ＣＤＫ９当該遺伝子でエンコードされたタンパク質はサイクリン依存性タンパク質キナーゼ（ＣＤＫ）ファミリーのメンバーである。当該キナーゼは多タンパク質複合体ＴＡＫ／Ｐ−ＴＥＦｂの成分が発見されており、これはＲＮＡポリメラーゼＩＩｆが導く転写伸長因子であり、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの最大のサブユニットのＣ末端ドメインをリン酸化することによって作用を起こす。当該タンパク質はその調節サブユニット細胞周期タンパク質Ｔ又は細胞周期タンパク質Ｋと複合体を形成して、その調節を受ける。
ＲＵＶＢＬ２ 当該遺伝子は細菌ＲｕｖＢ遺伝子の第二ヒトホモログをエンコードする。細菌ＲｕｖＢタンパク質はＤＮＡヘリカーゼであり、相同組換え及びＤＮＡ二重鎖切断修復にとって必要不可欠である。機能分析で明らかなように、当該遺伝子産物はＡＴＰ酵素及びＤＮＡヘリカーゼ活性を兼ね備える。一本鎖ＤＮＡにより刺激されるＡＴＰ酵素及びＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼ（５’〜３’）の活性を有する；六量体化はＡＴＰ加水分解の鍵であり、環状構造中の隣接するサブユニットは前記ＡＴＰ酵素活性を助けると考えられる。
方法と試薬
化学合成：別途説明がない限り、全ての反応はいずれもニトロゲン又はアルゴンの不活性雰囲気下で行う。ＤＭＦ、ＤＭＳＯはそのまま使用する（９９．９％、特別乾燥）。別途説明がない限り、全ての他の試薬はいずれも市販されたものをそのまま使用する。ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒスペクトロメータを使用する。１Ｈ（４００ＭＨｚ）及びＮＭＲ化学シフトは内部ＴＭＳ（δ＝０．００ｐｐｍ）又は残留したプロチウム化（ｐｒｏｔｉａｔｅｄ）溶剤に対してレポートされる。以下にデータを紹介する：化学シフト（ｐｐｍ）、多重性（ｓ＝シングルピーク、ｄ＝ダブルピーク、ｔ＝三重ピーク、ｑ＝四重ピーク、ｓｅｐｔ＝七重ピーク、ｍ＝多重ピーク、ｂｒ＝幅）、結合定数Ｊ（Ｈｚ）及び積分。
細胞培養、薬物処理及び概日リズム振動のリアルタイムモニタリング：Ｐｅｒ２−ＬｕｃレポーターＵ２ＯＳ細胞（Ｄ１５）及びＢｍａｌ１−ＬｕｃレポーターＵ２ＯＳ細胞（Ｃ２６）を１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）及び１％のペニシリンストレプトマイシン混合物（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に保持する。ｌｕｍｉｃｙｃｌｅ（Ａｃｔｉｍｅｔｒｉｃｓ）でモニタリングした概日リズム振動に対して、細胞を１０６／３．５ｃｍ培養ディッシュ（Ｚ６８８８５１−３０ＥＡ）の密度で接種する。細胞接種２日後、培地をＸＭ培地（ＰＨ７．２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３５０ｍｇ／ｌの炭素酸水素塩、１ＸＢ２７、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０ｕｇ／ｍｌのゲンタマイシン、及び１００μＭ ｄ−ルシフェリン）に交換する。その後、高真空グリース（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）及び顕微鏡カバーガラス片で３．５ｃｍ培養ディッシュを密封し、インキュベーター（３７℃）内のｌｕｍｉｃｙｃｌｅに移して放置する。薬物処理に関して、指定時間に素早くｌｕｍｉｃｙｃｌｅから３．５ｃｍ培養ディッシュを取り出す。化学品を培地に加えた後、培養ディッシュを再び密封してｌｕｍｉｃｙｃｌｅに戻す。Ｔｅｃａｎ（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）でモニタリングした概日リズム振動に関して、細胞を０．２５×４／ウェルの密度で３８４ウェルプレート（ＣＬＳ３６１０−４８ＥＡ）に接種する。２日後、培地を有又は無ペントスタチン（５μｇ／ｍｌ）の異なる化学品を有するプレミックスＸＭ培地に交換する。その後、当該プレートを密封膜（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で密封してＴｅｃａｎに入れる。Ｔｅｃａｎ光度計において３７℃で細胞からのデータを５〜７日収集する。
ビオチン化合物プルダウン、ＳＰＲ分析及び免疫沈降：ビオチン化化合物とそのターゲットタンパク質の間の相互作用は以下のように行われる。１０８個毎の非同期のＵ２ＯＳ細胞を収集し、２ｍｌの溶解バッファー（２５ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．２、１５ｍＭ ＥＧＴＡ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、６０ｍＭ β−グリセロリン酸、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭのフェニルホスフェート、ＣｏｍｐｌｅｔｅＰｒｏｔｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒＣｏｃｋｔａｉｌ）に均質し、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅｂｉｏｒｕｐｔｏｒにより４℃で３０秒の超音処理を６回行う。超音処理後、ＮＰ−４０（最終的に０．５％）を添加し、氷上で１５分インキュベートし、４℃で、２０分全速遠心分離する。得られた上澄み液を、まずペントスタチン（最終濃度は５μｇ／ｍｌ）と一緒に４℃でローテーションしながら２時間インキュベートし、その後、４組に分ける。それぞれ２００ｐｍｏｌのコルジセピン、２００ｐｍｏｌのＤＲＢ、及びＤＭＳＯ（２組、最終的に０．１％％）を添加して、さらに１時間インキュベートする。最後に、２００ｐｍｏｌのビオチン−コルジセピン又は２００ｐｍｏｌのビオチン−ＤＲＢを添加して少なくとも４時間インキュベートする。５０μｌのストレプトアビジンアガロースでビオチン化した化合物が相互作用するタンパク質を遠心分離する。洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１％ ＮＰ−４０、５ｍＭ ＮａＦ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）で５回洗浄した後、５０μｌのローディングバッファーでストレプトアビジンアガロースを煮沸する。溶出されたタンパク質をＷｅｓｔｅｒｎブロット分析する。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００器械（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて室温でＳＰＲ技術によりコルジセピンのＲＵＶＢＬ２タンパク質に対する結合親及び力を測定する。ＲＵＶＢＬ２タンパク質をＣＭ５チップ上で１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中にエンリッチさせ、アミンカップリング法により固定する。前記システムはＨＢＳＰ＋バッファー（ｐＨ７．４）で平衡させる。結合領域で、連続希釈した化合物を１０μＬ／ｍｉｎの流速で１２０秒注入する。解離領域で、前記バッファーを１８０秒又は６００秒流動させる。ＢＩＡ評価ソフトウエア（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でコルジセピンのＲＵＶＢＬ２タンパク質に対する結合動力学及び結合親及び力を確定する。共免疫沈降に関して、メーカーの説明に厳密に従ってｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（＃Ｌ３００００１５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトする。２μｇ又は１μｇのプラスミドＤＮＡを６ウェルプレート（０．４μｇ ｐＣＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ＢＭＡＬ１、０．７μｇ ｐＣＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ＣＬＯＣＫ、０．２μｇ ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＡ−ＣＲＹ１、０．１μｇ ｐＧＬ３−Ｐ（Ｄｂｐ）：ｄｌｕｃ及び０．６μｇ ｐＣＤＮＡ３．１−ＥＧＦＰ）又は１２ウェルプレート（それぞれ０．５μｇ ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＡ−ＲＵＶＢＬ２及び０．５μｇ ｐＣＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ＢＭＡＬ１／ＣＲＹ１／ＣＤＫ９）の各ウェル中にトランスフェクトする。トランスフェクト４８時間後、ＤＭＳＯ又はコルジセピン（１００μＭ）を添加して１時間インキュベートする。その後、ＩＰ溶解バッファー（＃８７７８７、Ｐｉｅｒｃｅ、６／１２ウェルプレートの各ウェルに対して、５００μｌ／３００μｌ）で細胞を収穫し、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ ｂｉｏｒｕｐｔｏｒで４℃で３０秒の超音処理を８回行い、氷上で１５分インキュベートし、４℃で、１０分全速遠心分離し、最後に上澄み液を細胞溶解液として収集する。全ての溶解液をＦＬＡＧ（＃Ｍ２００１８、Ａｂｍａｒｔ）又はＨＡ（＃Ｍ２００１３、Ａｂｍａｒｔ）共役アガロースで４℃でローテーションしながら一晩免疫沈降させる。その後、免疫沈降したタンパク質複合体をＩＰ溶解バッファーで３回洗浄し、煮沸してＷｅｓｔｅｒｎブロット分析する。
組織培養、薬物処理及び概日リズム振動のリアルタイムモニタリング：８週齢の雄ｍＰｅｒ２ルシフェラーゼノックインマウスを頸椎脱臼法で屠殺する。その後、無菌フード内で７０％のエタノールを含有するコットンで皮膚及び頸部を拭く。ＳＣＮスライス培養に関して、まずハサミで頭部から眼球を取り出し、首を切り、皮膚を切り開く。その後、頭蓋骨を開き、全ての骨を嗅球が見えるまで除き、嗅球及び半球の間の視神経を切断し、最後に完全な大脳を収穫して氷冷ＨＢＳＳに入れる。ＨＢＳＳ中で小脳及び嗅球を除いて大脳をトリムする。接着剤により大脳をサンプルトレイにくっつけ、吻側を上向きにし、腹側を切削刃に最も近づけ、その後、直ちに氷冷ＨＢＳＳでトレイを充填し、トレイをビブラトームに設置する。ビブラトーム周波数を最大値に設定し、速度を中くらいに設定する。ＳＣＮエリアに素早く達するように、切削され始めた比較的厚いスライスは５００−８００μｍとされる。視神経交叉が幅広くなったら、スライスの厚さを１００μｍまで下げる。二つのＳＣＮ核が現れ始めたら、トランスファーピペットでスライスを収集し、解剖顕微鏡でスライスを検査する。最後に、すでにトリムした核を１．２ｍｌ ｘｍ培地を有する３．５ｃｍ培養ディッシュ内の培養膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に移し、膜上のＨＢＳＳを取り除き、高真空グリース（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）及び顕微鏡カバーガラス片で密封し、（３７℃）インキュベーター内のｌｕｍｉｃｙｃｌｅに移して放置する。肝臓スライス培養に関して、体を開いて全肝臓を氷冷ＨＢＳＳ中に収集する。２回洗浄して血液をきれいに除き、ハサミで縁に沿って肝臓をトリムして、片を、氷冷ＨＢＳＳを有する新ディッシュに収集する。２つの交叉刃で片から薄片を作る。最後に肝臓スライスを前述のＳＣＮスライス培養について説明したｌｕｍｉｃｙｃｌｅに移す。組織スライスの薬物処理はＵ２ＯＳ細胞の説明と同じである。培養スライスをＬｕｍｉＣｙｃｌｅ光度計中に置いて５〜７日記録する。ＬｕｍｉＣｙｃｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウエアでデータを抽出分析する。
薬物注射及び体内イメージング分析：ｍＰｅｒ２ルシフェラーゼノックインマウスを無菌動物施設（Ｇｅｒｍ Ｆｒｅｅ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）に収容し、１２時間明／暗光周期において食物及び水は自由とする。８週齢の雄ｍＰｅｒ２ルシフェラーゼノックインマウスに１５ｍｇ／ｋｇ ｂｗ ｂｗ ＣＡ０３又はＤＭＳＯを腹膜内注射する。ＣＡ０３をまずＤＭＳＯ中に濃度２００μｇ／μｌまで溶解し、その後、塩水で最終濃度１０００μｇ／ｍｌまで希釈して腹膜内注射に用いる。１時間後、ｄ−ルシフェリン（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ．）を腹膜内注射する。ルシフェラーゼ活性に対してＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩＩシステム上でイメージングし、体内イメージングソフトウエア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で分析する。その後、肝臓をサンプリングして、さらにＲＮＡ抽出及びｍＲＮＡ前駆体レベルのｑＰＣＲ分析を行う。動物実験手順は北京国家生物科学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓａｇｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）から許可される。全ての動物実験手順はいずれも北京国家生物科学研究所の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）から許可された方法で行う。
トータルＲＮＡ抽出及びｍＲＮＡ前駆体分析：肝臓からのトータルＲＮＡをＤＭＳＯ又は１５ｍｇ／ｋｇ ｂｗで１時間処理した後、ＱＩＡＧＥＮ Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（７４１０４、Ｑｉａｇｅｎ）で抽出し、その後、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（７９２５４、Ｑｉａｇｅｎ）で消化してＤＮＡ残留を取り除く。５００ｎｇのトータルＲＮＡをＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ、ＲＲ０３６Ａ）でｃＤＮＡに逆転写する。ｍＲＮＡ前駆体レベルを比較するために、ＤＭＳＯ及びＣＡ０３処理サンプルからの等量のｃＤＮＡ ＲＮＡをＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６器械上でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＫＰ−ＫＫ４６０１）により分析する。各遺伝子を、全遺伝子を跨ぐ複数のプライマーで分析し、且つ増幅産物はイントロン又はイントロン‐エクソン接合を跨ぐものである。良好な熔解曲線を有するプライマーだけを用いる。定量化するために、ＤＭＳＯ処理したサンプル中の遺伝子発現を対照として用い、比較Ｃｔ法によりＣＡ０３処理したサンプル中の相対遺伝子発現を計算する。
ＨＰＬＣ−ＭＡＳＳによるＣＳＦ分析：８Ｗ ＳＤラットをＢｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒから購入し、温度及び湿度制御したＳＰＦ施設で個別に収容し、食物及び水は自由摂取可とする。動物を１２時間の明／暗光周期において２週間リズム調節し、これによりマウスの内因性概日体内時計と環境明暗周期を同期させ、光強度は約５０〜１００ｌｕｘとする。同期後、ＣＡ０３（１５ｍｇ／ｋｇ／ＢＷを、まずＤＭＳＯで濃度２００μｇ／μｌまで溶解し、その後、塩水で最終濃度１０００μｇ／ｍｌまで希釈する）及びＰｒｏ ＣＡ０３（１５ｍｇ／ｋｇ／ＢＷ、まずＤＭＳＯ中に濃度２００μｇ／μｌまで溶解し、その後、２％のツイン８０（無菌水中）で最終濃度１０００μｇ／ｍｌ）まで希釈し、尾静脈によりＣＴ６（１ｐｍ）にて投与する。その後、これら動物を３０％のＣＯ２及び７０％のＯ２麻醉（薬物注射後１分、５分又は１０分）で横たわらせ、これにより頭部と体を１３５度角近くにする。０．４５ｍｍの静脈注射針を用いて小脳延髄槽からＣＳＦを収集する。その後、收集したＣＳＦを氷上に置き、４倍の体積の冷メタノールを添加して２分ボルテックスし、１４，０００ｇ、４℃で１５分遠心分離する。代謝物を含む上澄み液を新しい１．５ｍｌの試験管に移し、その後−８０℃に１時間入れ、その後１４，０００ｇ、４℃で１５分遠心分離する。最後に、４５０μｌの上澄み液毎に新しい１．５ｍｌの試験管に収集し、ＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥させてＨＰＬＣ−ＭＡＳＳ施設で分析する。
方法：Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０−Ａｇｉｌｅｎｔ ６４９５ ＱｑＱ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ（２．１ｍｍ×１００ｍｍ、１．８μｍ）、流動相Ａ：１０ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液；流動相Ｂ：ＭｅＣＮ；流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ；段階：５％Ｂ（０〜０．５ｍｉｎ）、５〜２５％Ｂ（０．５〜５．００ｍｉｎ）、２５〜６０％Ｂ（５．００〜７．００ｍｉｎ）、６０〜７０％Ｂ（７．００〜９．００ｍｉｎ）、７０％Ｂ（９．００〜１１．００ｍｉｎ）、７０〜５％Ｂ（１１．００〜１１．１０ｍｉｎ）、５％Ｂ（１１．１０〜１３．００ｍｉｎ）。
全ての動物実験手順はいずれも北京国家生物科学研究所の施設動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）から許可された方法で行う。
回転輪実験：７週齢の雄Ｃ５７Ｂｊ／６マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ実験室からの紹介で、南京大学南京生物医薬研究院（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から購入し、温度及び湿度制御されたＳＰＦ施設の回転輪ケージに個別に収容し、食物及び水は自由摂取可とする。動物を１２時間明／暗光周期において２週間リズム調節し、これによりマウスの内因性概日体内時計と環境明暗周期を同期させ、光強度は約５０〜１００ｌｕｘとする。同期後、明暗周期を８時間位相前進又は後退させる。明暗周期を前にシフトする当日、マウスを、まずＣＴ３にて禁食させ、その後ＣＴ１２に、１５ｍｇ／ｋｇ ｂｗ ＣＡ０３、１５及び３０ｍｇ／ｋｇ ｂｗ ｐｒｏ−ＣＡ０３、１５及び３０ｍｇ／ｋｇ ｂｗ ｐｒｏ−ＣＡ０４又はＤＭＳＯを腹膜内注射し、且つ点灯時間（ＣＴ０）を朝７時から夜１１時に変え、最後に旧明暗周期のＣＴ２３時に再び給餌して再び薬物を注射する。ＣＡ０３及びｐｒｏ−ＣＡ０４を、まずＤＭＳＯ中に濃度２００μｇ／μｌまで溶解し、その後、塩水で最終濃度１０００μｇ／ｍｌまで希釈して腹膜内注射に用いる。Ｐｒｏ−０３を、まずＤＭＳＯ中に濃度２００μｇ／μｌまで溶解し、その後、２％のツイン８０（無菌水中）で最終濃度１０００μｇ／ｍｌまで希釈して腹膜内注射に用いる。明暗周期を後退させる当日、マウスを、まずＺＴ３で禁食させ、その後、ＣＴ１２に、１５ｍｇ／ｋｇ ｂｗ ＣＡ０３、１５及び３０ｍｇ／ｋｇ ｂｗ ｐｒｏ−ＣＡ０３、１５及び３０ｍｇ／ｋｇ ｂｗ ｐｒｏ−ＣＡ０４又はＤＭＳＯを腹膜内注射し、且つ消灯時間（ＣＴ１２）を夜７時から朝３時に変え、最後に旧明暗周期のＣＴ２３時に再び給餌して再び薬物を注射する。１０分の回転輪ケージ走行（Ａｃｔｉｍｅｔｒｉｃｓ）中に運動活性を記録し、Ｃｌｏｃｋｌａｂソフトウエア（Ａｃｔｉｍｅｔｒｉｃｓ）分析で得られたデータを用いる。全ての動物実験手順はいずれも北京国家生物科学研究所の施設動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）から許可された方法で行う。
実施例１
ヌクレオシド類似体の時計位相調節
本発明者はヒト骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞株を用いてケミカルスクリーニングを行い、哺乳動物細胞内時計位相を変える小分子を発見した。初期スクリーンにおいて、本発明者はＰｅｒ２又はＢｍａｌ１プロモーター制御下のルシフェラーゼ遺伝子を含む二つのＵ２ＯＳレポーターライン（名前はＰｅｒ２−ｄＬｕｃ又はＢｍａｌ１−ｄＬｕｃ細胞）を使用し、この２種類の細胞ラインにおいて明らかな振幅低下なしに少なくとも６時間位相変化する閾値を設定した。その結果、これら厳密な基準により大多数の再現できない偽陽性が濾過除去された。当該研究において約１０，０００個の小分子からなる機関的案内化学ライブラリーを使用した。注目すべきは、本発明者は一種の抗位相表現型を観察し、それはリアルタイムモニタリングした二つの時計遺伝子の発現パターンを完全に回復させた。当該ヒット化合物の名前はコルジセピン（即ち３′−デオキシアデノシン）であり、培地交換と一緒に使用すると、急激かつ素早くＰｅｒ２−ｄＬｕｃのコースを変えると同時に、Ｂｍａｌ１−ｄＬｕｃレポーターは１２時間後に差異を示した。本発明者は当該コースにおいて前記化合物を投与する前に時計の自由運行を許容するように設定し、これにより、このような位相変化現象が培地の変更に化合物作用が加わった組み合わせ表現型によるものだという可能性を除く。本発明者は、トラフ時ではなくＰｅｒ２−ｄＬｕｃピーク時だけ前記薬物を投与すると、前記振動が劇的な位相変化を示すことを発見した。この他、Ｂｍａｌ１−ｄＬｕｃレポーター細胞はトラフ時（ピーク部分のＰｅｒ２−ｄＬｕｃに対応）に前記薬物を投与すると位相変化を示すが、全コースにおいて１２時間後までは何の変化もなく、この時、２つのピークが現れたので、このコースを半周期反転させた。したがって、当該位相反転の一次応答はそのＰｅｒ２における変化によるもので、Ｂｍａｌ１及び他の時計遺伝子がこれに続く（図１Ａ）。
コルジセピンは概日リズム時計に対して明らかな位相依存効果を有する。即ち、Ｐｅｒ２ピーク投与時にＰｅｒ２−ｄＬｕｃは１２時間位相シフトするが、Ｐｅｒ２トラフ投与時のシフトは０時間である。重要なのは、コルジセピンをＰｅｒ２トラフ部分で投与するとＰｅｒ２−ｄＬｕｃの振幅を増やすことができ、これは概日リズム時計をより安定させる（図１Ｆ及び図１Ｇ）。
３−デアザアデノシン（ＤＡＡ）、７−デアザアデノシン（ツベルシジン）、Ｎ６−ベンジルアデノシン、５，６−ジクロロベンゾイミダゾール１−β−Ｄ−リボフラノシド（ＤＲＢ）及び修飾類似体３′−（Ｒ）−アデノシンもそれぞれ１２時間の位相変化でＰｅｒ２−ｄＬｕｃのコースを変えることができた。（図１Ｅ）
前記システムに過量の通常のアデノシンで過量投薬すると、時計のこれら類似体によって引き起こる位相シフトを完全に防いだ。これは、当該メカニズムが、原形質膜に位置するアデノシン受容体のシグナル伝達が活性化されたためである可能性は低く、細胞内の一部のアデノシンの機能に影響を与えたためであることを表す。細胞外培地内の過量の通常のアデノシンはアデノシントランスポーターを飽和にする可能性があり、これにより、これら類似体が細胞に進入して効果を発生するのを阻止するからである。アデノシントランスポーターをブロックするとコルジセピンが誘導する位相シフト及び細胞侵入は消えるが、アデノシン受容体阻害薬ではこうできない。この他、本発明者は、ペントスタチン自身は時計に全く影響しないが、アデノシンデアミナーゼ阻害薬ペントスタチンはコルジセピン、３′−（Ｒ）−アデノシン及びその他の数種のコルジセピン類似体の效力の改善を示すことができることを確認した（図１Ｃ）。以上をまとめ、これら結果はアデノシン誘導体の時計位相修正における重要な作用を示す。
本発明者はさらにコルジセピンの組織時計に対する影響を研究した。確信できるのは、このような位相シフト表現型はよくあるようである。なぜならＰｅｒ２：：ＬＵＣノックインマウスからの生体外培養のための組織外移植、例えば肝臓、はいずれも類似の結果を示した。重要なのは、時計の主要器官−視神経交叉上核（ＳＣＮ）を含む脳スライスも薬物処理に応答し、振幅が比較的低い顕著な位相シフトが生じた（図１Ｈ）。
５，６−ジクロロベンゾイミダゾール１−β−Ｄ−リボフラノシド（ＤＲＢ）、はケミカルスクリーニングから鑑定された別の種類の概日リズム位相シフト剤であり、コルジセピンと類似の位相シフト性質を有し、且つＳＣＮ及び腎臓時計の位相をシフトできる。ＡＩＤ ｄｅｇｒｏｎでＤＲＢの充分に特徴付けられたターゲットＣＤＫ９タンパク質を操作してＰｅｒ２−ｄＬｕｃ細胞中のＤＲＢの位相シフト曲線を模倣した。その結果、ＣＤＫ９が概日リズム位相調節に直接参与することを示した。新生のｓｅｑ実験を用いて、我々はＤＲＢ処理で多数の遺伝子の発現が抑制されることを発見したが、体外ではＥ−ｂｏｘ含有遺伝子だけ活性化された（図４）。
続いて、本発明者は体内でコルジセピンの時計効果を再捕捉できるか否かの確定を試みた。上記研究によりＤＲＢはＥ−ｂｏｘ遺伝子の発現を活性化できることを示したことから、我々はリアルタイムイメージングシステムを使用してノックインマウスにおけるＰｅｒ２：：Ｌｕｃ誘導を観察した。マウスはＺＴ４（ＺＴ、ツァイトゲーバー時刻；ＺＴ０点灯開始、ＺＴ１２消灯開始）時にコルジセピンを腹膜内（ｉ．ｐ．）注射した。その結果、ルシフェラーゼシグナルが薬物投与後わずか１時間以内に誘導されたことを示し、Ｐｅｒ２が誘導されたこと示した。Ｐｅｒ２遺伝子が確実に上向き調整されたのを確認するために、我々はｑＰＣＲ測定を行って全ての核心時計遺伝子を測定した。我々は大多数のＰｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｄｂｐ及びＮｒ１ｄ１を含む時計遺伝子を有するＥ−ｂｏｘはすべて上向き調節され、Ｂｍａｌ１等を有する時計遺伝子の非Ｅ−ｂｏｘ、及びハウスキーピング遺伝子は変わらない又は下向き調節されたことを発見した。新生ＲＮＡレベルを測定すると、この観察は特に正確であり、前述したＥ−ｂｏｘ遺伝子中の一次誘導応答が突出していた（図２Ｂ）。
どのタンパク質がコルジセピンの位相に対する影響を仲介可能なのかをさらに理解するために、我々は化学遺伝方法を用いてコルジセピンがＰｅｒ２−ｄＬｕｃを誘導することを仲介する遺伝子を研究した。我々は転写調節がこの事象において主要な作用を果たすと推定したので、我々は１５２９個の転写因子及び４６３個のエピジェネティクス（ｅｉｐｇｅｎｅｔｉｃ）因子を含むｓｉＲＮＡライブラリーを用いて、どの遺伝子が、コルジセピンが誘導するＰｅｒ２−ｄＬｕｃの活性化を担うのかを評価した。我々は約１７個の遺伝子をノックダウンするとコルジセピン応用によるＰｅｒ２−ｄＬｕｃに対する誘導を特異的に取り除くことができ、これはＤＮＡヘリカーゼ遺伝子、ＲＵＶＢＬ１及びＲＵＶＢＬ２を含み、ＲＵＶＢＬ２をノックダウンさせると、コルジセピン誘導の位相シフトを取り除かれることを発見した。コルジセピン及びＲＵＶＢＬタンパク質の間の物理相互作用を研究するために、我々はＵ２ＯＳ細胞溶解液中でビオチン化されたコルジセピンを用いてプルダウン測定を行った。遊離コルジセピン化合物が存在しない場合、前記ビオチン化された薬物はＲＵＶＢＬ２タンパク質をプルダウンできる；しかし遊離化合物が存在する場合、前記相互作用は競争で落ちる。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００によりコルジセピン及びＲＵＶＢＬ２タンパク質の直接的な相互作用を確認した。以上をまとめ、これらデータは、ＲＵＶＢＬヘリカーゼはコルジセピンのダイレクトターゲットであり、そのＰｅｒ２−ｄＬｕｃ誘導及び時計効果を仲介したことを証明した（図３Ｃ及びＤ）。
もう一つのヘリカーゼ遺伝子、ＦＲＨはニューロスポーラにおいて可能な核心時計成分であり｛Ｃｈｅｎｇ、２００５｝、我々は、ＲＵＶＢＬ遺伝子は哺乳動物系における時計成分でもある可能性があるか否か確定することを試みた。ＲＵＶＢＬ１又はＲＵＶＢＬ２のノックダウンは時計の中断を生じ、これらはＵ２ＯＳセルにおいて正確な時計機能が求められることを表す。我々はその後、瞬間的なルシフェラーゼ測定｛Ｓａｔｏ、２００６｝を行い、特にＣＲＹ阻害薬の存在下で、この２種類の遺伝子がどちらもＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１機能を十分に修正できることを証明した。したがって、これらヘリカーゼは時計に影響を与えることができる。通常、時計遺伝子は時計自身の反転により調節され、これは、これらの発現パターンが体内においてリズム的であることを意味する｛Ｈｕｇｈｅｓ、２００９｝。この他、我々はＲＵＶＢＬ２が既知の時計タンパク質Ｂｍａｌ１、Ｃｌｏｃｋ及びＣｒｙ１、並びに既知の転写伸長調節因子ＣＤＫ９と共免疫沈降できることを証明した。このような相互作用は少なくともＢｍａｌ１及びＲＵＶＢＬ２の間は直接的であるようである。なぜなら、これらは純化されたタンパク質レベルで相互に、特異的に互いにプルダウンできるからである（図５）。
ヒト及びマウスの概日リズム振動子はインターロックした転写及び翻訳フィードバックループにより駆動される。Ｂｍａｌ１及びＣｌｏｃｋは転写因子であり、且つＰｅｒ及びＣｒｙを含む活性陰性アーム遺伝子転写の陽性アームとされる。Ｐｅｒ及びＣｒｙは転写抑制体であり、Ｂｍａｌ１／Ｃｌｏｃｋの転写活性をフィードバック抑制し、これにより、それ自身の転写が抑制される。共免疫沈降実験により、コルジセピンがＢｍａｌ１及びＲｕｖｂｌ２／Ｃｒｙ複合体の間の相互作用を切り離すことによりＣｒｙ抑制が解除され、Ｂｍａｌ１／ Ｃｌｏｃｋ転写活性が活性化されることが示された。我々はさらにＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ実験によりこの点を証明した。コルジセピンを３０分処理して、すぐにＰｅｒ２遺伝子プロモーター部分で結合しているＣｒｙ１／２及びＲｕｖｂ１２を解放した。以上をまとめ、これらデータにより、コルジセピンがＰｅｒ２プロモーターからＣｒｙ／Ｒｕｖｂｌ２抑制複合体を解放し、Ｐｅｒ２転写を活性化し、その後、概日リズム位相シフトを誘導することが証明された（図６）。
我々は腹膜内（Ｉ．Ｐ．）注射後の脳脊髄液（ＣＳＦ）中のコルジセピン濃度を測定した。注射後１５分以内にＣＳＦ中でコルジセピンを検出できた。これはコルジセピンが大脳に浸透できることを表す。
標準的な時差方案｛Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、２０１３｝の下、野生型Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスが８時間の位相前進に適応するには通常１０日は必要である。しかし前２日にコルジセピン（Ｐ＜０．００１、ｎ＝１８／組）又はプロドラッグ（Ｐ＜０．００１、ｎ＝３／組）を連続注射すると、適応性が４日まで顕著に短縮された。同様に薬物処理されたマウスは位相後退により快く適応できた（図２Ｄ及び２Ｅ）。
運動活性及び電気生理学的記録評価により、コルジセピン投与は睡眠表現型ももたらす。これは時差適応のポジティブな副作用だと考えられる。時差による睡眠問題は覚醒よりも多い。アデノシン受容体Ａ１及びＡ２Ａｈｓは睡眠仲介において重要作用を発揮し、且つ充分に特徴付けられたＡ２Ａ拮抗剤カフェインはこのような眠気の誘導を完全に取り除くことができ｛Ｈｕａｎｇ、２００５｝、これは我々の薬物及びカフェインが同じシグナル伝達経路により大脳中の睡眠−覚醒バランスを調節することを意味する。しかし極めて高い量であっても、カフェイン自身は細胞内の時計位相を変えることはできず、これは我々の薬物の位相変化メカニズムがアデノシン受容体によるものではないことを表す。この研究は直接的で重要な実際の応用を供し、使用により開示される化合物を含め、時差を患う人又はシフトワークの人がこの種の薬物を用いることにより時計位相を調節し、睡眠−覚醒パターンを調整し、特にカフェイン摂取と合わせて調整するのを補助する。
図１はアデノシン類似化合物コルジセピンによる時計位相リセットを示す。概日リズム時計はフィードバックループに基づき転写されるが、異なる時計遺伝子は異なるシスエレメントを含み、且つ同じ刺激に対して異なる応答を示す可能性がある。Ｐｅｒ２ピーク部分で（即ちＰｅｒ２：ｌｕｃピーク及びＢｍａｌ１：ｌｕｃトラフ）のコルジセピン（１００μＭ）処理時に、Ｐｅｒ２：ｌｕｃ及びＢｍａｌ１：ｌｕｃは異なる応答を示す。コルジセピンのヒト骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞においてＰｅｒ２：ｌｕｃに影響する動力学はＢｍａｌ１：ｌｕｃに影響するよりも早い（Ａ）。これは、Ｐｅｒ２は一つ目の応答遺伝子であり、コルジセピンの効果をＴＴＦＬに引き入れて位相シフトを起こすことを表す。アデノシンと極めて似ている構造及びｍＲＮＡ伸長を阻止することにより転写の潜在機能が抑制されるため、我々はアデノシン及び他のデオキシヌクレオシドが概日リズム位相を変えられるか否かをテストした。その結果、コルジセピンはアデノシンの特異的誘導体であり、時計位相に影響することが分かった。通常のアデノシンではなく、コルジセピンがＰｅｒ２：ｌｕｃピークで投与されると、Ｕ２ＯＳ細胞中で１２時間の位相シフトを誘導する（Ａ）。注意すべきは、過量のアデノシンはコルジセピンが誘導する位相効果を抑制する（Ａ）。これはコルジセピンがアデノシン代謝経路を利用できることを表す。したがって、我々は更に、コルジセピンがアデノシントランスポーターを利用して細胞に進入できるか又はアデノシンデアミナーゼを利用して分解できるかをテストした。１００μＭのコルジセピンとアデノシントランスポーター阻害薬（１０μＭ）又はアデノシン受容体阻害薬（１μＭ の５−ヨウ素ツベルシジン）を組み合わせると、遮断アデノシントランスポーター阻害薬だけがコルジセピンが誘導する位相シフト能力を取り除いた（Ｂ）。アデノシンデアミナーゼペントスタチン（５μｇ／ｍｌ）は時計位相に影響せず、コルジセピンの效力を顕著に改善した（２５μＭから０．１８μＭ）（Ｃ）。コルジセピンに比べ、Ｐｅｒ２：ｌｕｃピーク応用時、他の修飾ヌクレオシドは位相効果を誘導できない（Ｄ）。コルジセピン以外、我々はさらに数種の概日リズム位相をシフトできるコルジセピン類似ヌクレオシドを購入合成し、これには（３′Ｒ）−アデノシン、３−デアザアデノシン（又はＤＡＡ）、７−デアザアデノシン（又はツベルシジン）（Ｅ）を含む。
上記調査において、我々はコルジセピン（コルジセピン類似ヌクレオシド）が概日リズム位相をシフトしたことを発見した、したがって、これは概日リズム同調剤（同調因子）のように見える。同調因子の一つの突出した特徴は位相依存性機能である。したがって、我々は更にコルジセピンがこの特徴を有するか否かをテストした。我々は転写レポーター（Ｐｅｒ２：ｌｕｃ Ｕ２ＯＳ細胞）を用いて翻訳レポーター（Ｐｅｒ２：：ＬＵＣ成年マウス線維芽細胞）モデルによりこの特徴を研究した。２種類のレポーターを３．５ｃｍ培養ディッシュに接種し、ｌｕｍｉｃｙｃｌｅに移し、ＣＴ０からＣＴ２４まで２時間毎にコルジセピン（Ｐｅｒ２：ｌｕｃ Ｕ２ＯＳ細胞中１００μＭ及びＰｅｒ２：：ＬＵＣ成年マウス線維芽細胞中２５μＭ）で処理する。処理及びデータ分析３日後、我々は２種類のレポーター細胞において、コルジセピンが高い“進入時間”依存性位相変化を示し、ＣＴ１０にて投与した時の１２時間の位相シフト及びＣＴ２０にて投与した時のほぼ０時間の位相シフトを発見した（Ｆ）。興味深いのは、ＣＴ２０にてコルジセピンを投与した時は０時間の位相シフトであるが振幅は増加しており、これはコルジセピンが概日リズム振動子及び時計が衰弱した老人に対する潜在的薬物用途が高められたこと表す。この点をテストするために、我々はＣＴ２０にてＤＭＳＯ又は２５μＭのコルジセピンを用いて、ほぼ衰えたＰｅｒ２：：ＬＵＣ成年マウス線維芽細胞を処理した。我々はコルジセピンが確かに振幅を増やし、時計の安定運行を維持したことを発見した（Ｇ）。
我々は更に、コルジセピンがＰｅｒ２：：ＬＵＣマウスの体外培養物からの時計位相を変えられるか否かをテストした。我々は肝臓培養スライス片を末梢時計レポーターとし、ＳＣＮ培養スライス片を中央時計レポーターとすることを選択した。Ｐｅｒ２：：ＬＵＣピーク部分でコルジセピン（１００μＭ）を投与すると、二つのレポーター曲線が直ちに１０時間下降し、その後、次第に反発し、３０時間近い振動周期を示し、その後、２４時間周期に戻り、且つＤＭＳＯ処理したスライスは完全に位相が逆になった（Ｈ）。
図２はコルジセピンのマウス体内Ｐｅｒ２発現誘導及び時計位相調節行動を示す。コルジセピンが体内で作用を起こすか否かをテストするために、我々はまず、Ｐｅｒ２：ｌｕｃマウスに対して１５ｍｇ／ｋｇのコルジセピン又はＤＭＳＯを腹膜内注射し、その後、ライブイメージングによりルシフェラーゼシグナルレベルをテストした。我々は、ＤＭＳＯ対照と比べ、コルジセピンが肝臓中で４倍以上増のルシフェラーゼシグナル誘導を発見した（Ａ）。当該結果は、コルジセピンが体内で作用を起こし、Ｐｅｒ２遺伝子転写を刺激できることを示す。我々は更に、肝臓においてｑＰＣＲでｍＲＮＡ前駆体を測定し、核心時計遺伝子の内因転写速度を確認した（Ｂ）。我々はＲＲＥ遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｃｌｏｃｋ、Ｎｐａｓ２、Ｃｒｙ１及びＮｆｉｌ３を含む）、内部制御遺伝子（Ｇａｐｄｈ、Ｔｂｐ及びＡｃｔｉｎを含む）及びＥ−ｂｏｘ遺伝子（Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｄｂｐ及びＮｒ１ｄ１を含む）を検査した。我々は各遺伝子に少なくとも２個のプライマーを設計した。その結果、コルジセピン処理でＲＲＥ遺伝子及び内部制御遺伝子転写が抑制されたが、Ｅ−ｂｏｘ遺伝子、特に、Ｐｅｒ２遺伝子の転写が特異的に活性化された。前にコルジセピンの時差治癒能力が評価されたが、我々はコルジセピン及びそのプロドラッグＢＡ−ＣＡ０３がＢＢＢを透過できるか否かを測定した。我々はコルジセピン又はｐｒｏ−ＣＡ０３を尾静脈注射し、時間どおりにＣＳＦサンプリングを行い、ＨＰＬＣ−ＭＡＳＳ法でコルジセピンｐｒｏ−ＣＡ０３レベルを分析した。結果から明らかなように、尾静脈注射後、コルジセピン及びｐｒｏ−ＣＡ０３は直ちにＢＢＢを透過してＣＳＦに進入し、注射後１分でピーク濃度に達し、次第に低下した。注意すべきは、ｐｒｏ−ＣＡ０３はコルジセピンよりも安定している（Ｃ）。最後に、我々はマウス行為実験によりコルジセピン、ｐｒｏ−ＣＡ０３及びＰｒｏ−ＣＡ０４の時差治愈能力を評価した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスが８時間の位相前進に適応するには通常１０日は必要である。喜ばしいことに、コルジセピンを投与注射すると、この適応時間は４日に短縮された（Ｐ＜０．００１、ｎ＝１８／組）（Ｄ、左図）。同様に、コルジセピン処理されたマウスは位相後退にはより早く適応でき、ＤＭＳＯ処理組中の６日からコルジセピン処理組中の３日になった（Ｐ＜０．００１、ｎ＝１２／組）（Ｄ、右図）。Ｐｒｏ−ＣＡ０３は対照組に比べ適応時間がやや短縮された（Ｅ、左図）。Ｐｒｏ−ＣＡ０４はコルジセピンに相当する時差治愈能力を有し、８位相の前進後、適応時間はＤＭＳＯ処理組中の１０日から５日近くまで短縮された（図２Ｅ、右図）。
図３は時計位相をシフトさせるコルジセピンターゲットであるＲｕｖｂｌ２を示す：コルジセピンによりＰｅｒ２：ｌｕｃシグナルが活性化されることから、我々は化学−遺伝学スクリーン方法によりコルジセピンの可能なターゲットタンパク質を鑑定する。Ｒｕｖｂ１２のノックダウン後、コルジセピンが仲介するＰｅｒ２：ｌｕｃ誘導及び位相シフトが取り除かれたことを発見した（Ａ）。これはＲｕｖｂｌ２がコルジセピンのＰｅｒ２：ｌｕｃ誘導及び位相シフト機能を仲介したことを表す。Ｒｕｖｂｌ２がＡＴＰ依存性ヘリカーゼであり、コルジセピンとＡＴＰ構造の類似性を考慮し、Ｒｕｖｂｌ２はおそらくコルジセピンの直接的なターゲットである。続いて、我々はビオチン化された化合物のプルダウンとＳＰＲ実験によりこの仮説を証明した。ＤＲＢは周知のＣＤＫ９阻害薬であり、１２時間近い位相シフトを起こすことができる。ＤＲＢがＣＤＫ９抑制により位相シフトを誘導することを証明するために、我々はＡＩＤタグのＣＤＫ９（ＣＤＫ９−ＡＩＤ）をＰｅｒ２：ｌｕｃ Ｕ２ＯＳ細胞に導入して、そのタンパク質レベルを調節した。Ｐｅｒ２：ｌｕｃピーク部分で突然インドール−３−酢酸でＣＤＫ９タンパク質を分解すると、位相シフトが１０時間近くシフトした（Ｂ）。これらの結果は、ＣＤＫ９が直接、概日リズム位相を調節することを示している。ビオチン−ＤＲＢを陽性対照とし、我々はＣＤＫ９を分離するのに成功し、この結合はビオチンを含有しないＤＲＢと競争できる。我々はＲｕｖｂｌ２がビオチン−コルジセピンで純化でき、この結合もビオチンを含有しないコルジセピンと競争できると疑った（Ｃ）。注意すべきは、ビオチン−ＤＲＢはＲｕｖｂｌ２をプルダウンでき、ビオチン−コルジセピンはＣＤＫ９をプルダウンできる。これはＲｕｖｂｌ２及びＣＤＫ９が同一複合体中にある可能性があることを表す。我々はＳＰＲ測定で更にＲｕｖｂｌ２及びコルジセピンの直接結合を証明した。純化したＲＵＶＢＬ２タンパク質とコルジセピン分子をＫｄ値約５００ｎＭで結合した（Ｄ）。Ｒｕｖｂｌ２はコルジセピンのＰｅｒ２遺伝子誘導の上向き調整に対して必要不可欠であることから、我々は引き続き核心時計タンパク質とＲｕｖｂｌ２の間の相互作用を研究した。共免疫沈降を用いて、Ｒｕｖｂｌ２とＢｍａｌ１、Ｃｒｙ１及びＣＤＫ９の相互作用を発見した（Ｅ）。Ｒｕｖｂｌ２とＢｍａｌ１、又はＣｒｙ１とＢｍａｌ１の間の相互作用は１００μＭのコルジセピンにより分離できるが、Ｒｕｖｂ１２とＣｒｙ１又はＣＤＫ９の間の相互作用はコルジセピンにより分離できない（Ｅ）。以上をまとめ、これらデータはＲｕｖｂｌ２がコルジセピンのダイレクトターゲットであることを示す。コルジセピンはＲｕｖｂｌ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ１及びＣＤＫ９の間のタンパク質−タンパク質を調節することにより位相シフトを誘導し、Ｐｅｒ２遺伝子を上向き調節した。
図４はＤＲＢのＥ−ｂｏｘ遺伝子転写に対する急速誘導を示す：Ｕ２ＯＳ細胞の新生ｍＲＮＡ前駆体シーケンシング（ｎａｓｃｅｎｔ−ｓｅｑ）のＤＲＢ処理時間序列分析により“一次”ＤＲＢ応答遺伝子を鑑定する。我々は実験過程においてＰｅｒ２−ｄＬｕｃ発現をリアルタイムモニタリングしてＤＲＢの投与時間を調製し、Ｐｅｒ２−ｄＬｕｃ発現のピーク及びトラフと一致させた；その後、ＤＲＢ投与の１、２、４時間後に培養物をサンプリングし、ｎａｓｃｅｎｔ−ｓｅｑで分析した（左図）。我々はＤＲＢ処理した細胞中に発現した大多数の遺伝子の新合成ｍＲＮＡ量が薬物処理の第一時間内において低下することを発見した（青色）。注目すべきは、Ｅ−ｂｏｘ特徴を有する最もよく研究されている７つの遺伝子をＤＲＢ処理後にいずれも上向き調節し、且つこれらＥ−ｂｏｘ遺伝子中の６つのクラスター形成組（ＮＲ１Ｄ１、ＤＢＰ、ＢＨＬＨＥ４１、ＢＨＬＨＥ４０、ＰＥＲ１及びＰＥＲ２、ＮＲ１Ｄはない）は６つの異なる時点における治療に対する応答の共通性を反映している（赤色）。Ｅ−ｂｏｘ遺伝子を含むクラスターにおける他の遺伝子の検査に対して、さらにＣＤＫ９自身及びその結合パートナーＣＣＮＴ１を含むことを示した。したがって、おそらく一部のＣＤＫ９抑制はＥ−ｂｏｘ遺伝子の転写を制御したのではなく、刺激した可能性がある。右側のｎａｐｅｌは（ＮＲ１Ｄ１及びＤＢＰ）時計遺伝子を含有するＥ−ｂｏｘ又は（ＢＭＡＬ１及びＣＲＹ１）時計遺伝子を含有する非Ｅ−ｂｏｘのＵＣＳＣ遺伝子組のブラウザビューである。
図５はＲｕｖｂｌ２のＢｍａｌ１及びＣｒｙ１との直接的な相互作用を示す：体外発現したＲＵＶＢＬ２タンパク質は純ＢＭＡＬ１タンパク質によりプルダウンされる。ＦＬ：全長；ｄ２：ＲＵＶＢＬ２タンパク質のドメイン２（ヘリカーゼ活性の調節ドメイン）欠失。
図６はコルジセピンがＣｒｙ２及びＲＵＶＢＬ２とＰｅｒ２遺伝子座結合を破壊することを示す：ＰＥＲ２遺伝子座に対するＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ分析は、ＤＲＢ又はコルジセピン処理によりＣＲＹ２／ＲＵＶＢＬ２の結合を解放するが、ＢＭＡＬ１の結合は変わらないままであることを示した。
図７はペントバルビタールを陽性対照として腹膜内（Ｉ．Ｐ．）注射した後の脳脊髄液（ＣＳＦ）中のコルジセピン濃度を示す。コルジセピン及びペントバルビタールの両者の基準濃度曲線は図（７Ａ）に示される。図（７Ｂ）はＨＰＬＣ分析におけるコルジセピン保留時間とペントバルビタール保留時間の比較を示す。コルジセピンは注射後１５分以内にＣＳＦ中において定量かつ定性的に検出された（図７Ｃ）。これはコルジセピンが脳内に浸透できることを表す。
実施例２ 典型化合物の合成
方法、試薬及び生物活性データ
化学合成：別途説明がない限り、全ての反応はいずれもニトロゲン又はアルゴンの不活性雰囲気下で行われる。別途説明がない限り、全ての他の試薬はいずれも市販されたものをそのまま使用する。ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒスペクトロメータで使用する。１Ｈ（４００ＭＨｚ）及びＮＭＲ化学シフトは内部ＴＭＳ（δ＝０．００ｐｐｍ）又は残留したプロチウム化（ｐｒｏｔｉａｔｅｄ）溶剤に対してレポートする。以下にデータを紹介する：化学シフト（ｐｐｍ）、多重性（ｓ＝シングルピーク、ｄ＝ダブルピーク、ｔ＝三重ピーク、ｑ＝四重ピーク、ｓｅｐｔ＝七重ピーク、ｍ＝多重ピーク、ｂｒ＝幅）、結合定数Ｊ（Ｈｚ）及び積分。
化合物の番号は表１中の番号に対応する。
条件：ｉ）０．２％のＨＣｌ；ｉｉ）ＴＢＤＰＳＣｌ、ＤＭＡＰ、ピリジン；ｉｉｉ）イミダゾール、ヨウ素、トリフェニルホスフィン、トルエン；ｉｖ）Ｈ２、Ｐｄ／Ｃ、トリエチルアミン、酢酸エチル、メタノール；ｖ）酢酸、無水酢酸、ｃｏｎｃ．Ｈ２ＳＯ４；ｖｉ）アデニン、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド、ＴＭＳＯＴｆ、アセトニトリル；ｖｉｉ）Ｋ２ＣＯ３、メタノール、水。
ステップ１：１，２−Ｏ−イソプロピリデンＤ−キシロフラノース（中間体１）の合成［１］：
０．２％のＨＣｌ（２００ｍＬ）中の１，２：３，５−ジ−Ｏ−イソプロピリデンＤ−キシロフラノース（１６．００ｇ、６９．４９ｍｍｏｌ）懸濁液を室温で６時間撹拌し、その後、炭酸水素ナトリウムを添加してｐＨ値を８に調節し、溶剤を減圧蒸発させ、残基を水（１５０ｍＬ）に懸濁してジクロロメタン（１５０ｍＬ×５）で抽出し、ＭｇＳＯ４乾燥し、濃縮し、１，２−Ｏ−イソプロピリデンＤ−キシロフラノース、無色油状物（１２．２５ｇ、収率９２．６９％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ８Ｈ１４Ｏ５［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は１９１．０８、実測値は１９１．５６。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）５．９９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、４．５３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、４．３２−４．３５（ｍ、１Ｈ）、４．５３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、４．１４−４．１８（ｍ、２Ｈ）、３．９９−４．０８（ｍ、２Ｈ）、２．６０（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、１．７３（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、１．４９（ｓ、３Ｈ）、１．３２（ｓ、３Ｈ）。
ステップ２：１，２−Ｏ−イソプロピリデン５−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−ジフェニルシリル］−Ｄ−キシロフラノース（中間体２）の合成：
室温で、無水ピリジン（２５０ｍＬ）中の１，２−Ｏ−イソプロピリデンＤ−キシロフラノース（１２．２５ｇ、６４．４１ｍｍｏｌ）溶液にＴＢＤＰＳＣｌ（２０．０４ｍＬ、７７．２９ｍｍｏｌ）を滴加する。前記混合物を４０℃まで加熱して５時間撹拌し、その後、Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）を添加して反応を終わらせ、前記混合物を濾過し、濾過液を減圧濃縮し、残基をジクロロメタン（２００ｍＬ）中に懸濁させ、それぞれＨ２Ｏ（２００ｍＬ）及び５％のＣｕＳＯ４水溶液（２００ｍＬ）及び塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、濃縮し、残基をカラムクロマトグラフィーにかけ（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝９：１〜１：１）、１，２−Ｏ−イソプロピリデン５−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−ジフェニルシリル］−Ｄ−キシロフラノースを得る、淡黄色油状物（２３．７７ｇ、収率８６．１１％）である。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ２４Ｈ３２Ｏ５Ｓｉ［Ｍ−Ｈ］−に対する計算値は４２７．６０、実測値は４２７．７５。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）７．６６−７．７３（ｍ、４Ｈ）、７．３９−７．４５（ｍ、６Ｈ）、６．０１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、４．５５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、４．３７（ｍ、１Ｈ）、４．１０−４．１３（ｍ、２Ｈ）、４．０１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．２Ｈｚ）、１．４７（ｓ、３Ｈ）、１．３３（ｓ、３Ｈ）、１．０５（ｓ、９Ｈ）。
ステップ３：３−デオキシ−３−ヨウ素−１，２−Ｏ−イソプロピリデン５−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−ジフェニルシリル］−Ｄ−リボフラノース（中間体３）の合成：
無水トルエン（５００ｍＬ）中の１，２−Ｏ−イソプロピリデン５−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−ジフェニルシリル］−Ｄ−キシロフラノース（２３．７７ｇ、５５．４６ｍｍｏｌ）溶液を、それぞれイミダゾール（７．５５ｇ、１１０．９２ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（２９．０９ｇ、１１０．９ｍｍｏｌ）で処理した後、０℃で五回に分けてヨウ素（２１．１１ｇ、８３．１９ｍｍｏｌ）を加え、その後、前記混合物を加熱し、一晩還流し、室温まで冷却し、３０％の過酸素化水素（１００ｍＬ）を添加して１時間撹拌し、トルエン（１００ｍＬ×２）で前記無機溶液を抽出し、前記有機溶液を収集し、それぞれ飽和炭酸水素ナトリウム（２００ｍＬ）及び塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、石油エーテル／エタノール中で再結晶させてトリフェニルホスフィンオキシドを放出し、その後、前記母液をカラムクロマトグラフィーで純化し（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝５：１）、３−デオキシ−３−ヨウ素−１，２−Ｏ−イソプロピリデン５−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−ジフェニルシリル］−Ｄ−リボフラノース、無色油状物（２０．８３ｇ、収率６９．７５％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ２４Ｈ３１ＩＯ４Ｓｉ［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は５３９．５０、実測値は５３９．７４。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）７．６７−７．６９（ｍ、４Ｈ）、７．２９−７．３７（ｍ、６Ｈ）、５．８２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、４．６０（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝３．２Ｈｚ）、４．１５−４．１６（ｍ、２Ｈ）、４．００（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１２．０Ｈｚ）、３．８９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．０ Ｈｚ、Ｊ２＝１．６Ｈｚ）、１．５０（ｓ、３Ｈ）、１．３３（ｓ、３Ｈ）、１．０３（ｓ、９Ｈ）。
ステップ４：３−デオキシ−１，２−Ｏ−イソプロピリデン５−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−ジフェニルシリル］−Ｄ−リボフラノース（中間体４）の合成：
メタノール（１８０ｍＬ）及び酢酸エチル（２０ｍＬ）中の３−デオキシ−３−ヨウ素−１，２−Ｏ−イソプロピリデン５−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−ジフェニルシリル］−Ｄ−リボフラノース（２０．８３ｇ、３８．６８ｍｍｏｌ）溶液にＰｄ／Ｃ（２．１３ｇ）及びトリエチルアミン（１０．７２ｍＬ）を添加し、前記混合物をＨ２雰囲気下で、３２℃で３時間撹拌し、その後、前記混合物を室温まで冷却した後、硅藻土（２０ｇ）を添加して前記混合物を濾過し、濾過液を濃縮してカラムクロマトグラフィーにかけ（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝３０：１）、３−デオキシ−１，２−Ｏ−イソプロピリデン５−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−ジフェニルシリル］−Ｄ−リボフラノース（１４．７０ｇ、収率９２．１０％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ２４Ｈ３２Ｏ４Ｓｉ［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は４１３．６０、実測値は４１３．７０。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）７．６７−７．７２（ｍ、４Ｈ）、７．３６−７．４４（ｍ、６Ｈ）、５．８３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、４．６７−４．６９（ｍ、１Ｈ）、４．１４−４．２２（ｍ、１Ｈ）、３．８１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１１．２Ｈｚ、Ｊ２＝４．０Ｈｚ）、３．７５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１１．２Ｈｚ、Ｊ２＝４．０Ｈｚ）、２．０８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１３．２Ｈｚ、Ｊ２＝４．８Ｈｚ）、１．８７（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１３．２Ｈｚ、Ｊ２＝１０．４Ｈｚ、Ｊ３＝４．８Ｈｚ）、１．５１（ｓ、３Ｈ）、１．３３（ｓ、３Ｈ）、１．０６（ｓ、９Ｈ）。
ステップ５：１，２，５−トリ−Ｏ−アセチル−３−デオキシ−Ｄ−リボフラノース（中間体５）の合成：
無水酢酸（２０．２１ｍＬ、２１３．７７ｍｍｏｌ）中の３−デオキシ−１，２−Ｏ−イソプロピリデン５−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−ジフェニルシリル］−Ｄ−リボフラノース（１４．７０ｇ、３５．６３ｍｍｏｌ）溶液に０℃でｃｏｎｃ．Ｈ２ＳＯ４（７．６４ｍＬ、１４２．５１ｍｍｏｌ）を滴加し、その後、酢酸（３５０ｍｌ）を滴加し、前記混合物を室温まで温め、１６時間撹拌し、激しい撹拌下で前記混合物を氷水（５００ｍＬ）に入れ、その後、ジクロロメタン（１５０ｍＬ×２）で抽出し、有機溶液を合成し、それぞれ水（３００ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（３００ｍＬ）、塩水（３００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、濃縮してカラムクロマトグラフィーにかけ（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝１０：１〜１：１）、１、２、５−トリ−Ｏ−アセチル−３−デオキシ−Ｄ−リボフラノース、黄色油状物（４．８０ｇ、収率５１．７７％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１１Ｈ１６Ｏ７［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は２６１．２４、実測値は２６１．７０。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）６．１７（ｓ、１Ｈ）、５．２０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．７Ｈｚ）、４．４４−４．５１（ｍ、１Ｈ）、４．２１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１１．６Ｈｚ、Ｊ２＝３．６Ｈｚ）、２．１０−２．１３（ｍ、２Ｈ）、２．０９（ｓ、３Ｈ）、２．０８（ｓ、３Ｈ）、２．０７（ｓ、３Ｈ）。
ステップ６：２，５−ジ−Ｏ−アセチル−３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル−アデニン （中間体６）の合成：
無水アセトニトリル（３ｍＬ）中のアデニン（６６ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）及び１，２，５−トリ−Ｏ−アセチル−３−デオキシ−Ｄ−リボフラノース（１２８ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）懸濁液にＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（０．１９ｍＬ、０．７４ｍｍｏｌ）を添加して室温で１時間撹拌し、その後、ＴＭＳＯＴｆ（０．１８ｍＬ、０．９８ｍｍｏｌ）を添加する。前記混合物を８０℃まで３時間加熱し、その後、室温まで冷却し、飽和炭酸水素ナトリウム（２ｍＬ）を添加して反応を終わらせる。その後、溶剤を減圧除去し、残基を水（１０ｍＬ）中に懸濁させてジクロロメタン（１０ｍＬ×３）で抽出し、前記有機溶液を収集し、それぞれ水（３０ｍＬ）及び塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、カラムクロマトグラフィーで純化し（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝１：０〜３：７）、２，５−ジ−Ｏ−アセチル−３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル−アデニン、無色油状物（１０３ｍｇ、収率６２．４％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１４Ｈ１７Ｎ５Ｏ５［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は３３６．１２、実測値は３３６．４２。
ステップ７：３′−デオキシ−アデノシンの合成：
５０％のメタノール水溶液（３ｍＬ）中の２，５−ジ−Ｏ−アセチル−３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル−アデニン（１０３ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）溶液をＫ２ＣＯ３（１２７ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）で処理する。前記混合物を室温で３時間撹拌する。真空で溶剤を除去し、残基は分取高速液体クロマトグラフィーで純化し、３′−デオキシ−アデノシン、白色粉末（７２ｍｇ、収率９３％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１０Ｈ１３Ｎ５Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は２５２．１０、実測値は２５２．０４。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）８．４２（ｓ、１Ｈ）、８．２０（ｓ、１Ｈ）、５．９５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．８Ｈｚ）、４．６９−４．７１（ｍ、１Ｈ）、４．５０−４．５５（ｍ、１Ｈ）、３．９３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．４Ｈｚ、Ｊ２＝２．８Ｈｚ）、３．６６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．４Ｈｚ、Ｊ２＝３．２Ｈｚ）、２．３８（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１３．２Ｈｚ、Ｊ２＝８．０Ｈｚ、Ｊ３＝６．０Ｈｚ）、２．０３−２．０９（ｍ、１Ｈ）。
条件：ｉ）ギ酸、１０５℃；ｉｉ）１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノース、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド、ＴＭＳＯＴｆ、アセトニトリル、７５℃；ｉｉｉ）Ｋ２ＣＯ３、メタノール、Ｈ２Ｏ。
ステップ１：５，６−ジクロロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール （中間体１）の合成［２］：
ギ酸（５ｍＬ）中の４，５−ジクロロベンゼン−１，２−ジアミン（１．００ｇ、５．６５ｍｍｏｌ）溶液を密封管中で１時間１０５℃まで加熱する。前記混合物を室温まで冷却した後、真空で溶剤を除去し、粗生成物を得て、カラムクロマトグラフィーで純化し（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール＝１０：１〜５：１）、５，６−ジクロロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール、淡褐色粉末（１．０５ｇ、収率９９．１％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ７Ｈ４Ｃｌ２Ｎ２［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は１８５．９８及び１８７．９７、実測値は１８６．２６、１８８．３４。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）１２．７３（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、８．３４（ｓ、１Ｈ）、７．８７（ｓ、２Ｈ）。
ステップ２：５，６−ジクロロ−１−（２，３，５−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−ベンゾイミダゾール（中間体２）の合成：
無水アセトニトリル（１０ｍＬ）中の５，６−ジクロロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール（６００ｍｇ、３．２１ｍｍｏｌ）及び１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノース（１．２３ｇ、３．８５ｍｍｏｌ）懸濁液をＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（１．１６ｍＬ、４．８１ｍｍｏｌ）で処理し、前記懸濁液を室温で２時間撹拌し、その後、ＴＭＳＯＴｆ（１．１６ｍＬ、６．４２ｍｍｏｌ）を添加する。前記混合物を３時間７５℃まで加熱し、その後、室温まで冷却する。飽和炭酸水素ナトリウム（５ｍＬ）で反応を終わらせた後、生成された溶液をジクロロメタン（１０ｍＬ×３）で抽出し、有機溶液を収集し、それぞれ水（３０ｍＬ）及び塩水（３０ｍＬ）で洗浄する。前記溶液をＭｇＳＯ４乾燥し、濃縮し、残基をカラムクロマトグラフィーで純化し（シリカゲル、酢酸エチル／メタノール＝１：０〜２０：１）、５，６−ジクロロ−１−（２，３，５−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−ベンゾイミダゾール、無色油状物（６７０ｍｇ、収率４６．９％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１８Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ７［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は４４５．０５及び４４７．０５、実測値は４４５．１６及び４４７．１８。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）８．１０（ｓ、１Ｈ）、７．７９（ｓ、１Ｈ）、７．６９（ｓ、１Ｈ）、５．９５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、５．４４（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、５．３４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝５．６Ｈｚ、Ｊ２＝３．６Ｈｚ）、４．３８−４．４２（ｍ、２Ｈ）、４．２９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１３．２Ｈｚ、Ｊ２＝３．２Ｈｚ）、２．１１（ｓ、３Ｈ）、２．０７（ｓ、３Ｈ）、１．９９（ｓ、３Ｈ）。
ステップ３：５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボベンズイミダゾールの合成：
５０％のメタノール水溶液（４ｍＬ）中の５，６−ジクロロ−１−（２，３，５−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−ベンゾイミダゾール（２８０ｍｇ、０．６２９ｍｍｏｌ）溶液にゆっくりとＫ２ＣＯ３（４３４ｍｇ、３．１４ｍｍｏｌ）を添加する。前記混合物を室温で２０分撹拌する。真空で溶剤を除去し、残基を分取カラムクロマトグラフィーで純化し（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール＝１０：１〜５：１）、５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボベンズイミダゾール、白色粉末（１２５ｍｇ、収率６２．３％）を生成する。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１２Ｈ１２Ｃｌ２Ｎ２Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は３１９．０２及び３２１．０１、実測値は３１９．１５及び３２１．０９。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）８．５８（ｓ、１Ｈ）、８．２２（ｓ、１Ｈ）、７．９７（ｓ、１Ｈ）、５．８９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、５．５０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、５．２０−５．２６（ｍ、２Ｈ）、４．３０（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、４．１１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝５．２Ｈｚ、Ｊ２＝３．２Ｈｚ）、３．９９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝５．６Ｈｚ、Ｊ２＝３．２Ｈｚ）、３．６１−３．７０（ｍ、２Ｈ）。
条件：ｉ）ＣｕＳＯ４、ｃｏｎｃ．Ｈ２ＳＯ４、アセトン；ｉｉ）無水酢酸、ＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ、酢酸；ｉｉｉ）アデニン、ＳｎＣｌ４、アセトニトリ；ｉｖ）Ｋ２ＣＯ３、メタノール、Ｈ２Ｏ。
ステップ１：１，２：３，５−ジ−Ｏ−イソプロピリデンＤ−キシロフラノース（中間体１）の合成［３］：
アセトン（２００ｍｌ）中のＤ−キシロース（１０．００ｇ、６６．６１ｍｍｏｌ）及びＣｕＳＯ４（１０．００ｇ、６２．６６ｍｍｏｌ）懸濁液にｃｏｎｃ．Ｈ２ＳＯ４（０．４ｍｌ）を滴加する。前記混合物を室温で１６時間撹拌する。固体が濾過されアセトン（５０ｍＬ×３）で残基を洗浄する。濾過液を炭酸水素ナトリウムで中和し濾過する。真空で溶剤を除去し、残基をジクロロメタン中に溶かし、それぞれ飽和炭酸水素ナトリウム（１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）及び塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、有機溶液を収集し、乾燥するまで蒸発させ、１，２：３，５−ジ−Ｏ−イソプロピリデンＤ−キシロフラノース、無色油状物（１３．３０ｇ、収率８６．７２％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１１Ｈ１８Ｏ５［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は２３１．１２、実測値は２３１．２０。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）５．９９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．０Ｈｚ）、４．５３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、４．３３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、４．１４−４．１８（ｍ、２Ｈ）、４．０４−４．０８（ｍ、１Ｈ）、１．４９（ｓ、３Ｈ）、１．４５（ｓ、３Ｈ）、１．３８（ｓ、３Ｈ）、１．３３（ｓ、３Ｈ）。
ステップ２：１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−キシロフラノース （中間体２）の合成：
酢酸（２７５ｍＬ）中の１，２：３，５−ジ−Ｏ−イソプロピリデンＤ−キシロフラノース（１２．７２ｇ、５５．２４ｍｍｏｌ）溶液を無水酢酸（３７．０ｍＬ、３３８ｍｍｏｌ）及びＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（１．２６ｇ、６．６２ｍｍｏｌ）で処理する。前記混合物を加熱して２時間還流させ、その後、氷水（３００ｍＬ）に入れてジクロロメタン（５００ｍＬ×３）で抽出する。有機溶液を収集し、それぞれ飽和炭酸水素ナトリウム（５００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（５００ｍＬ）及び塩水（５００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、カラムクロマトグラフィーで純化し（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝６：１〜３：１）、１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−キシロフラノース、淡黄色油状物（１１．４０ｇ、収率６４．８４％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１３Ｈ１８Ｏ９［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は３１９．１０、実測値は３１９．２６。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）６．１０（ｓ、１Ｈ）、５．３６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝５．６Ｈｚ、Ｊ２＝１．６Ｈｚ）、５．２０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１．６Ｈｚ）、４．６１−４．６４（ｍ、１Ｈ）、４．２３−４．２５（ｍ、１Ｈ）、２．１２（ｓ、３Ｈ）、２．１１（ｓ、３Ｈ）、２．０９（ｓ、３Ｈ）、２．０６（ｓ、３Ｈ）。
ステップ３：２，３，５−トリ−Ｏ−アセチル−１−（６−アミノ−プリン−９−イル）−β−Ｄ−１−デオキシ−キシロフラノース（中間体３）の合成：
無水アセトニトリル（１０ｍＬ）中の１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−キシロフラノース（２．２４ｇ、７．０３ｍｍｏｌ）及びアデニン（１．００ｇ、７．４０ｍｍｏｌ）懸濁液をＡｒ保護下でＳｎＣｌ４（１．７３ｍＬ、１４．８ｍｍｏｌ）で処理する。前記混合物を室温で一晩撹拌する。撹拌後、飽和炭酸水素ナトリウム（５ｍＬ）で反応を終わらせる。真空で溶剤を除去し、残基を水（２０ｍＬ）中に懸濁してジクロロメタン（２０ｍＬ×３）で抽出し、有機溶液を収集し、それぞれ水（５０ｍＬ）及び塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、カラムクロマトグラフィーで更に純化し（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール＝１００：１〜３０：１）、２，３，５−トリ−Ｏ−アセチル−１−（６−アミノ−プリン−９−イル）−β−Ｄ−１−デオキシ−キシロフラノース、無色油状物（１．９３ｇ、収率６９．７％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１６Ｈ１９Ｎ５Ｏ７［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は３９４．１３、実測値は３９４．４６。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）８．４９（ｓ、１Ｈ）、８．３５（ｓ、１Ｈ）、６．２０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．２Ｈｚ）、５．７６（ｍ、１Ｈ）、５．４９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝４．８Ｈｚ、Ｊ２＝２．４Ｈｚ）、４．６０（ｍ、１Ｈ）、４．２６−４．３７（ｍ、２Ｈ）、２．１０（ｓ、３Ｈ）、２．０８（ｓ、３Ｈ）、２．０３（ｓ、３Ｈ）。
ステップ４：９−（β−Ｄ−キシロフラノシル）−アデニンの合成：
５０％のメタノール水溶液（１０ｍＬ）中の２，３，５−トリ−Ｏ−アセチル−１−（６−アミノ−プリン−９−イル）−β−Ｄ−１−デオキシ−キシロフラノース（０．９５ｇ、２．４２ｍｍｏｌ）溶液をＫ２ＣＯ３（１．３４ｇ、９．６６ｍｍｏｌ）で処理する。前記混合物を室温で２０分撹拌する。真空で溶剤を除去し、残基をカラムクロマトグラフィーで純化し（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール＝１０：１〜５：１）、９−（β−Ｄ−キシロフラノシル）−アデニン、白色粉末（４４８ｍｇ、収率６９．４％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１０Ｈ１３Ｎ５Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は２６８．１０、実測値は２６８．３２。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）８．２６（ｓ、１Ｈ）、８．１５（ｓ、１Ｈ）、７．３１（ｂｒ ｓ、２Ｈ）、５．８４−５．８７（ｍ、３Ｈ）、４．７６（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）、４．３１（ｓ、１Ｈ）、４．１３−４．１７（ｍ、１Ｈ）、４．０３（ｓ、１Ｈ）、３．７３−３．７８（ｍ、１Ｈ）、３．６３−３．６８（ｍ、１Ｈ）。
条件：ｉ）シクロプロピルアミン、イソプロパノール、１２０℃；ｉｉ）１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−キシロフラノース、ＳｎＣｌ４、アセトニトリル；ｉｉｉ）Ｋ２ＣＯ３、メタノール、Ｈ２Ｏ。
ステップ１：６−（シクロプロピルアミノ）−９Ｈ−プリン（中間体１）の合成［４］
イソプロパノール（２ｍＬ）中の６−クロロ−９Ｈ−プリン（１００ｍｇ、０．６４７ｍｍｏｌ）及びシクロプロピルアミン（０．１８ｍｌ、２．６ｍｍｏｌ）懸濁液を１２０℃で２時間加熱し、その後、前記混合物を室温まで冷却し、エタノールで再結晶し、６−（シクロプロピルアミノ）−９Ｈ−プリン、白色粉末（１０２ｍｇ、収率９０．０％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ８Ｈ９Ｎ５［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は１７６．０９、実測値は１７６．３４。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）１１．５１（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、８．２２、（ｓ、１Ｈ）、８．１５（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、８．１０（ｓ、１Ｈ）、３．０２（ｍ、１Ｈ）、０．７２（ｍ、２Ｈ）、０．６１（ｍ、２Ｈ）。
ステップ２及び３を化合物３の最後の二つのステップに基づいて合成し、９−（β−Ｄ−キシロフラノシル）−Ｎ６−シクロプロピルアデニン、白色粉末を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１３Ｈ１７Ｎ５Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は３０８．１３、実測値は３０８．２２。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）８．３１（ｓ、１Ｈ）、８．２９（ｓ、１Ｈ）、５．９７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１．６Ｈｚ）、４．４５（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、４．３１−４．３５（ｍ、１Ｈ）、４．１９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝４．０Ｈｚ、Ｊ２＝２．０Ｈｚ）、３．９６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．０Ｈｚ、Ｊ２＝４．４Ｈｚ）、３．９０（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．０Ｈｚ、Ｊ２＝６．０Ｈｚ）、１．９４−２．１０（ｍ、１Ｈ）、０．８７−０．９２（ｍ、２Ｈ）、０．６３−０．６７（ｍ、２Ｈ）。
条件：ｉ）１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−キシロフラノース、ＳｎＣｌ４、アセトニトリル；ｉｉ）Ｋ２ＣＯ３、メタノール、Ｈ２Ｏ。
化合物５は化合物３の最後に二つのステップで合成し、白色粉末を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１１Ｈ１１Ｃｌ２Ｎ３Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は３２０．０１及び３２２．０１、実測値は３１９．８９及び３２１．９４。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）８．６９（ｓ、１Ｈ）、７．５０（ｓ、１Ｈ）、６．１３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１．２Ｈｚ）、４．４４（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝１．６Ｈｚ）、４．３９−４．４３（ｍ、１Ｈ）、４．２２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝３．６Ｈｚ、Ｊ２＝１．６Ｈｚ）、４．００（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１０．０Ｈｚ、Ｊ２＝３．２Ｈｚ）、３．９６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１０．０Ｈｚ、Ｊ２＝４．０Ｈｚ）。
条件：ｉ）無水酢酸、ＤＭＡＰ、ピリジン；ｉｉ）４−アミノ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、ＳｎＣｌ４、アセトニトリル；ｉｉｉ）Ｋ２ＣＯ３、メタノール、Ｈ２Ｏ。
ステップ１：１，２，３，４−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−キシロピラノー（中間体１）の合成：
ピリジン（１５ｍＬ）中のＤ−キシロース（１．００ｇ、６．６６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（１６３ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）溶液に無水酢酸（５．０ｍＬ、５３ｍｍｏｌ）を添加する。生成された溶液を室温で１６時間撹拌し、その後、飽和炭酸水素ナトリウム（２０ｍＬ）を添加して反応を終わらせた後、溶剤を減圧蒸発させ残基を水（４０ｍＬ）中に懸濁させ、ジクロロメタン（４０ｍＬ×３）で抽出し、有機溶液を収集し、それぞれ飽和炭酸水素ナトリウム（４０ｍＬ）、水（４０ｍＬ）及び塩水（４０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、カラムクロマトグラフィーで純化し（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝５：１）、１，２，３，４−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−キシロピラノー、無色油状物（１．３３ｇ、収率６２．３％）を得た。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１３Ｈ１８Ｏ９［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は３１９．１０、実測値は３１９．４２。
ステップ２：２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−１−（４−アミノ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−β−Ｄ−１−デオキシ−キシロピラノー（中間体２）の合成：
無水アセトニトリル（３ｍＬ）中の１，２，３，４−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−キシロピラノー（１０７ｍｇ、０．３３６ｍｍｏｌ）及び４−アミノ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（４５ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）懸濁液をアルゴン保護下でＳｎＣｌ４（０．０８０ｍＬ、０．６７ｍｍｏｌ）で処理し、生成された溶液を室温で一晩撹拌し、その後、飽和炭酸水素ナトリウム（３ｍＬ）で反応を終わらせる。溶剤を減圧除去し、残基をジクロロメタン（５ｍＬ×３）で抽出し、有機溶液を収集し、それぞれ水（５ｍＬ）及び塩水（５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、カラムクロマトグラフィーで純化し（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール＝５０：１）、２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−１−（４−アミノ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−β−Ｄ−１−デオキシ−キシロピラノー、無色油状物（８７ｍｇ、収率６６％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１７Ｈ２０Ｎ４Ｏ７［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は３９２．１３、実測値は３９２．０１。
ステップ３：１−（４−アミノ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−β−Ｄ−１−デオキシ−キシロピラノーの合成：
５０％のメタノール水溶液（２ｍＬ）中の２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−１−（４−アミノ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−β−Ｄ−１−デオキシ−キシロピラノー（８７ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）溶液をＫ２ＣＯ３（１２３ｍｇ、０．８８７ｍｍｏｌ）で処理する。前記混合物を室温で２０分撹拌する。真空で溶剤を除去し、残基をカラムクロマトグラフィーで純化し（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール＝１０：１）、１−（４−アミノ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−β−Ｄ−１−デオキシ−キシロピラノー（４９ｍｇ、収率８３％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１１Ｈ１４Ｎ４Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は２６６．１０、実測値は２６６．０３。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）８．３２（ｓ、１Ｈ）、７．２２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．８Ｈｚ）、６．６２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．８Ｈｚ）、５．７３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．６Ｈｚ）、４．０７（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１１．２Ｈｚ、Ｊ２＝５．６Ｈｚ）、４．０１（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝９．２Ｈｚ）、３．８０（ｍ、１Ｈ）、３．５３−３．５７（ｍ、２Ｈ）。
条件：ｉ）１、２，３、５−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−キシロフラノース、ＳｎＣｌ４、アセトニトリル；ｉｉ）Ｋ２ＣＯ３、メタノール、Ｈ２Ｏ。
化合物７を化合物３の最後の二つのステップに基づき合成し、白色粉末を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１１Ｈ１１Ｃｌ２Ｎ３Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は３１９．０２及び３２１．０２、実測値は３１９．２９及び３２１．３１。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）８．４９（ｓ、１Ｈ）、８．０３（ｓ、１Ｈ）、７．８１（ｓ、１Ｈ）、５．８９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、４．３６−４．４０（ｍ、１Ｈ）、４．３３（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、４．２３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝４．０Ｈｚ、Ｊ２＝２．０Ｈｚ）、３．９３−４．００（ｍ、２Ｈ）。
条件：ｉ）Ｄ−（＋）−ビオチン、ＥＤＣ、ＤＭＡＰ、ＤＭＦ．
ステップ１：５′−Ｏ−ビオチニル−３′−デオキシ−アデノシンの合成：
無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中の３′−デオキシ−アデノシン（２５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）及びＤ−（＋）−ビオチン（４８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）溶液をそれぞれＤＭＡＰ（２５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（３９ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）で処理し、前記混合物を室温で２時間撹拌する。溶剤を減圧除去し、残基をジクロロメタン（２ｍＬ×３）で抽出し、有機溶液を収集し、それぞれＨ２Ｏ（４ｍＬ）及び塩水（４ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、分取ＨＰＬＣで更に純化し、５′−Ｏ−ビオチニル−３′−デオキシ−アデノシン、白色粉末（１２ｍｇ、収率２５％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ２０Ｈ２７Ｎ７Ｏ５Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は４７８．１８、実測値は４７８．４１。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）８．２７（ｓ、１Ｈ）、８．２２（ｓ、１Ｈ）、６．０１（ｓ、１Ｈ）、４．６８−４．７２（ｍ、１Ｈ）、４．４５−４．４８（ｍ、１Ｈ）、４．３６−４．３８（ｍ、２Ｈ）、４．２６−４．２９（ｍ、１Ｈ）、３．１１−３．１５（ｍ、１Ｈ）、２．８８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．８Ｈｚ、Ｊ２＝４．８Ｈｚ）、２．６７−２．７０（ｍ、２Ｈ）、２．３９−２．４１（ｍ、１Ｈ）、２．３３（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、２．２８（ｓ、１Ｈ）、２．０８−２．１２（ｍ、１Ｈ）、１．５８−１．７１（ｍ、３Ｈ）、１．３８−１．４２（ｍ、２Ｈ）。
条件：ｉ）ＴＢＤＰＳＣｌ、ピリジン；ｉｉ）Ｄ−（＋）−ビオチン、ＥＤＣ、ＤＭＡＰ、ＤＭＦであり；ｉｉｉ）ＴＢＡＦ、ＴＨＦ。
ステップ１：３′−デオキシ−５′−Ｏ−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−ジフェニルシリル］−アデノシン（中間体１）の合成：
無水ピリジン（３ｍＬ）中の３′−デオキシ−アデノシン（１０５ｍｇ、０．４１８ｍｍｏｌ）溶液をＴＢＤＰＳＣｌ（０．２２ｍＬ、０．８３６ｍｍｏｌ）で処理し、４０℃で６時間撹拌し、その後、Ｈ２Ｏ（３ｍＬ）を添加して反応を終わらせた後、溶剤を除去し、残基をジクロロメタン（５ｍＬ×３）で抽出し、有機溶液を収集し、それぞれＨ２Ｏ（２０ｍＬ）及び塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、カラムクロマトグラフィーで純化し（ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｅｔｈｅｒ／ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝３：１）、３′−デオキシ−５′−Ｏ−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−ジフェニルシリル］−アデノシン、白色粉末（１７４ｍｇ、収率８５．０％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ２６Ｈ３１Ｎ５Ｏ３Ｓｉ［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は４９０．２２、実測値は４９０．５３。
ステップ２：２′−Ｏ−ビオチニル−３′−デオキシ−５′−Ｏ−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−ジフェニルシリル］−アデノシン（中間体２）の合成：
無水ＤＭＦ（４ｍＬ）中の３′−デオキシ−５′−Ｏ−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−ジフェニルシリル］−アデノシン（１７４ｍｇ、０．３５５ｍｍｏｌ）及びＤ−（＋）−ビオチン（１００ｍｇ、０．４０８ｍｍｏｌ）溶液をそれぞれＤＭＡＰ（２５ｍｇ、０．２０４ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（１５７ｍｇ、０．８１７ｍｍｏｌ）で処理し、混合物を室温で２時間撹拌する。溶剤を減圧除去し、残基をジクロロメタン（５ｍＬ×３）で抽出し、有機溶液を収集し、それぞれＨ２Ｏ（１５ｍＬ）及び塩水（１５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、更に、カラムクロマトグラフィーで純化し（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール＝３０：１〜１５：１）、２′−Ｏ−ビオチニル−３′−デオキシ−５′−Ｏ−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−ジフェニルシリル］−アデノシン、白色粉末（２０３ｍｇ、収率７９．８％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ３６Ｈ４５Ｎ７Ｏ５ＳＳｉ［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は７１６．３０、実測値は７１６．０２。
ステップ３：２′−Ｏ−ビオチニル−３′−デオキシ−アデノシンの合成：
無水ＴＨＦ（２．５ｍＬ）中の２′−Ｏ−ビオチニル−３′−デオキシ−５′−Ｏ−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−ジフェニルシリル］−アデノシン（２０３ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ）溶液をＴＢＡＦ（１４６ｍｇ、０．５５９ｍｍｏｌ）で処理し、生成された溶液を室温で１時間撹拌し、その後、真空で溶剤を除去し、残基をＤＭＳＯ／メタノール中で再結晶し、２′−Ｏ−ビオチニル−３′−デオキシ−アデノシン、白色粉末（９５．７ｍｇ、収率７０．７％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ２０Ｈ２７Ｎ７Ｏ５Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は４７８．１８、実測値は４７８．０５。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）８．３４（ｓ、１Ｈ）、８．１４（ｓ、１Ｈ）、７．３３（ｓ、２Ｈ）、６．４３（ｓ、１Ｈ）、６．３７（ｓ、１Ｈ）、６．０６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１．６Ｈｚ）、５．６２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、５．１５（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）、４．２９−４．３３（ｍ、２Ｈ）、３．６５−３．６８（ｍ、１Ｈ）、３．５０−３．５３（ｍ、１Ｈ）、３．０６−３．１１（ｍ、１Ｈ）、２．８２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．４Ｈｚ、Ｊ２＝４．８Ｈｚ）、２．５４−２．５９（ｍ、２Ｈ）、２．３７（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、２．１１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．８Ｈｚ、Ｊ２＝４．８Ｈｚ）、１．４１−１．６１（ｍ、４Ｈ）、１．３０−１．３５（ｍ、２Ｈ）。
条件：ｉ）ＴＢＳＣｌ、イミダゾール、ＤＭＦ；ｉｉ）Ｄ−（＋）−ビオチン、ＥＤＣ、ＨＯＢｔ、ＤＭＦ；ｉｉｉ）ＴＢＡＦ、ＴＨＦ。
ステップ１：９−［２、５−ビス−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン（中間体１）の合成：
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の３′−デオキシ−アデノシン（６７ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）溶液にイミダゾール（９１ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）及びＴＢＳＣｌ（９６ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を添加し、生成された混合物を室温で一晩撹した後、溶剤を減圧蒸発させ、残基を飽和炭酸水素ナトリウム（３ｍＬ）中に懸濁し、ジクロロメタン（３ｍＬ×３）で抽出し、有機溶液を収集し、水（５ｍＬ）及び塩水（５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、クロマトグラフィーで更に純化し（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝３：１）、９−［２、５−ビス−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン、無色油状物（５２ｍｇ、収率４１％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ２２Ｈ４１Ｎ５Ｏ３Ｓｉ２［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は４８０．２７、実測値は４８０．１２。
ステップ２：９−［２、５−ビス−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−Ｎ６−ビオチニル−アデニン（中間体２）の合成：
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の９−［２，５−ビス−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン（５２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）溶液にＥＤＣ（３１ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（２２ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加し、前記混合物を室温で３０分撹拌し、その後、Ｄ−（＋）−ビオチン（２６ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加し、生成された溶液を室温で４時間再び撹拌し、溶剤を減圧蒸発させ、残基を水（３ｍＬ）中に懸濁し、ジクロロメタン（３ｍＬ×３）で抽出し、有機溶液を収集し、飽和炭酸水素ナトリウム（３ｍＬ）、水（３ｍＬ）及び塩水（３ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、クロマトグラフィーで純化し（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝３：１）、９−［２，５−ビス−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−Ｎ６−ビオチニル−アデニン、無色油状物（３８ｍｇ、収率５０％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ３２Ｈ５５Ｎ７Ｏ５ＳＳｉ２［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は７０６．３５、実測値は７０６．１４。
ステップ３：３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル−Ｎ６−ビオチニル−アデニンの合成
無水ＴＨＦ（３ｍＬ）中の９−［２，５−ビス−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−Ｎ６−ビオチニル−アデニン（３８ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）溶液をＴＢＡＦ（２８ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）で処理し、前記混合物を室温で４時間撹拌し、溶剤を減圧除去し、残基を分取ＨＰＬＣにかけ、３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル−Ｎ６−ビオチニル−アデニン、白色粉末（１１ｍｇ、収率４３％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ２０Ｈ２７Ｎ７Ｏ５Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は４７８．１８、実測値は４７８．５１。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）８．６９（ｓ、１Ｈ）、８．６５（ｓ、１Ｈ）、６．４３（ｓ、１Ｈ）、６．３６（ｓ、１Ｈ）、６．００（ｓ、１Ｈ）、５．７５（ｓ、１Ｈ）、５．４０（ｍ、１Ｈ）、５．０８（ｍ、１Ｈ）、４．６１（ｍ、１Ｈ）、４．３１（ｍ、１Ｈ）、４．１５（ｍ、１Ｈ）、３．７１−３．７２（ｍ、１Ｈ）、３．５２（ｍ、１Ｈ）、３．１１−３．１４（ｍ、１Ｈ）、２．９４（ｍ、１Ｈ）、２．８３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１３．２Ｈｚ、Ｊ２＝４．４Ｈｚ）、２．６７（ｍ、１Ｈ）、２．５１−２．５７（ｍ、２Ｈ）、２．３３（ｍ、１Ｈ）、１．５９−１．７１（ｍ、２Ｈ）、１．２３−１．５５（ｍ、４Ｈ）。
条件：ｉ）Ｄ−（＋）−ビオチン、ＥＤＣ、ＤＭＡＰ、ＤＭＦ。
化合物８を用いる方法は４．０ｅｑのＤ−（＋）−ビオチン、４．０ｅｑのＥＤＣ及び４．０ｅｑのＤＭＡＰを用いて４０℃で４時間撹拌し、化合物１１を合成し、３′、５′−ビス−Ｏ−ビオチニル−３′−デオキシ−アデノシン、白色粉末を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ３０Ｈ４１Ｎ９Ｏ７Ｓ２［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は７０３．２６、実測値は７０３．０８。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）。
条件：ｉ）アセトン、ｐ−トルエンスルホン酸；ｉｉ）Ｄ−（＋）−ビオチン、ＥＤＣ、ＤＭＡＰ、ＤＭＦ；ｉｉｉ）８０％の酢酸水溶液、８０℃。
ステップ１：５，６−ジクロロ−１−（２′，３′−Ｏ−イソプロピリデンβ−Ｄ−リボフラノシル）−ベンゾイミダゾール（中間体１）の合成：
アセトン（１５ｍＬ）中の５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボベンズイミダゾール（１００ｍｇ、０．３１３ｍｍｏｌ）懸濁液をｐ−トルエンスルホン酸（１７８ｍｇ、０．９４０ｍｍｏｌ）で処理し、前記混合物を室温で２時間撹拌し、０℃で１０％のＮａ２ＣＯ３溶液（１５ｍＬ）中に入れ、真空で溶剤を蒸発させ、残基を酢酸エチル（２０ｍＬ×３）で抽出し、有機溶液を収集し、それぞれＨ２Ｏ（２０ｍＬ）及び塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、カラムクロマトグラフィーで更に純化し（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール＝２０：１）、５、６−ジクロロ−１−（２′，３′−Ｏ−イソプロピリデンβ−Ｄ−リボフラノシル）−ベンゾイミダゾール、白色粉末（６２ｍｇ、収率５５％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１５Ｈ１６Ｃｌ２Ｎ２Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は３５９．０５及び３６１．０５、実測値は３５９．２６及び３６１．１８。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）８．２６（ｓ、１Ｈ）、７．６８（ｓ、１Ｈ）、７．６２（ｓ、１Ｈ）、５．９５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．２Ｈｚ）、５．２１、（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、５．０４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝６．４Ｈｚ、Ｊ２＝２．０Ｈｚ）、４．９７（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝６．０Ｈｚ、Ｊ２＝３．２Ｈｚ）、４．５４（ｑ、１Ｈ、Ｊ＝２．４Ｈｚ）、３．９９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．０Ｈｚ、Ｊ２＝２．０Ｈｚ）、３．８６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．０Ｈｚ、Ｊ２＝２．４Ｈｚ）、１．６６（ｓ、３Ｈ）、１．４０（ｓ、３Ｈ）。
ステップ２：５，６−ジクロロ−１−（５′−Ｏ−ビオチニル−２′，３′−Ｏ−イソプロピリデンβ−Ｄ−リボフラノシル）−ベンゾイミダゾール（中間体２）の合成：
無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中の５，６−ジクロロ−１−（２′、３′−Ｏ−イソプロピリデンβ−Ｄ−リボフラノシル）−ベンゾイミダゾール（６２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）溶液にそれぞれＤＭＡＰ（１１ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（６７ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を添加し、生成された溶液を室温で２時間撹拌する。溶剤を減圧除去し、残基を酢酸エチル（５ｍＬ×３）で抽出し、有機溶液を収集し、それぞれＨ２Ｏ（５ｍＬ）及び塩水（５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、カラムクロマトグラフィーで更に純化し（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール＝２０：１）、５，６−ジクロロ−１−（５′−Ｏ−ビオチニル−２′，３′−Ｏ−イソプロピリデンβ−Ｄ−リボフラノシル）−ベンゾイミダゾール、白色粉末（７１ｍｇ、収率７０％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ２５Ｈ３０Ｃｌ２Ｎ４Ｏ６Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は５８５．１３及び５８７．１２、実測値は５８５．３２及び５８７．４７。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）８．０９（ｓ、１Ｈ）、７．９２（ｓ、１Ｈ）、７．６３（ｓ、１Ｈ）、６．２０（ｓ、１Ｈ）、５．９４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．２Ｈｚ）、５．５２（ｓ、１Ｈ）、４．９４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝６．４Ｈｚ、Ｊ２＝３．２Ｈｚ）、４．８６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝６．４Ｈｚ、Ｊ２＝３．２Ｈｚ）、４．５５（ｑ、１Ｈ、Ｊ＝３．２Ｈｚ）、４．４５−４．４７（ｍ、１Ｈ）、４．３４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．４Ｈｚ、Ｊ２＝３．２Ｈｚ）、４．３０（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．４Ｈｚ、Ｊ２＝３．６Ｈｚ）、４．２５（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝８．０Ｈｚ、Ｊ２＝４．８Ｈｚ、Ｊ３＝１．２Ｈｚ）、３．０７（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝８．０Ｈｚ、Ｊ２＝６．８Ｈｚ、Ｊ３＝４．８Ｈｚ）、２．８７（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．４Ｈｚ、Ｊ２＝４．８Ｈｚ）、２．７０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１２．４Ｈｚ）、２．２１−２．３１（ｍ、２Ｈ）、２．０３（ｓ、１Ｈ）、１．５３−１．７０（ｍ、７Ｈ）、１．３４−１．４２（ｍ、５Ｈ）。
ステップ３：５，６−ジクロロ−１−（５′−Ｏ−ビオチニル−β−Ｄ−リボフラノシル）−ベンゾイミダゾールの合成：
８０％の酢酸水溶液（５ｍＬ）中の５，６−ジクロロ−１−（５′−Ｏ−ビオチニル−２′、３′−Ｏ−イソプロピリデンβ−Ｄ−リボフラノシル）−ベンゾイミダゾール（７１ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）溶液を８０℃で一晩撹拌し、その後、溶剤を減圧除去し、残基をカラムクロマトグラフィーにかけ（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール＝４：１）、５，６−ジクロロ−１−（５′−Ｏ−ビオチニル−β−Ｄ−リボフラノシル）−ベンゾイミダゾール、白色粉末（３２ｍｇ、収率４８％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ２２Ｈ２６Ｃｌ２Ｎ４Ｏ６Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は５４５．１０及び５４７．０９、実測値は５４５．３７及び５４７．２９。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）８．４４（ｓ、１Ｈ）、７．９４（ｓ、１Ｈ）、７．８８（ｓ、１Ｈ）、５．９５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）、４．４２−４．４９（ｍ、２Ｈ）、４．３２−４．３８（ｍ、２Ｈ）、４．２１−４．２５（ｍ、２Ｈ）、３．１０（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝９．２Ｈｚ、Ｊ２＝６．０Ｈｚ、Ｊ３＝４．８Ｈｚ）、２．８６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．８Ｈｚ、Ｊ２＝５．２Ｈｚ）、２．６７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１２．８Ｈｚ）、２．３４−２．４７（ｍ、２Ｈ）、１．５６−１．７１（ｍ、４Ｈ）、１．３９−１．４３（ｍ、２Ｈ）。
条件：ｉ）Ｄ−（＋）−ビオチン、ＥＤＣ、ＤＭＡＰ、ＤＭＦ。
化合物１３−１５を化合物８の方法に基づき、４．０ｅｑのＤ−（＋）−ビオチン、４．０ｅｑのＥＤＣ及び４．０ｅｑのＤＭＡＰを用いて合成する。５′−Ｏ−ビオチニル−９−（β−Ｄ−キシロフラノシル）−アデニン、白色粉末を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ２０Ｈ２７Ｎ７Ｏ６Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は４９４．１７、実測値は４９４．２３。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）８．３４（ｓ、１Ｈ）、８．２１（ｓ、１Ｈ）、６．００（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１．６Ｈｚ）、４．４４−４．５１（ｍ、５Ｈ）、４．２６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝８．０Ｈｚ、Ｊ２＝４．４Ｈｚ）、４．２０（ｓ、１Ｈ）、３．１４−３．１６（ｍ、１Ｈ）、２．９０（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．８Ｈｚ、Ｊ２＝４．８Ｈｚ）、２．６８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１２．８Ｈｚ）、２．３８（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．５４−１．７４（ｍ、４Ｈ）、１．４２−１．４８（ｍ、２Ｈ）。２′−Ｏ−ビオチニル−９−（β−Ｄ−キシロフラノシル）−アデニン、白色粉末を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ２０Ｈ２７Ｎ７Ｏ６Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は４９４．１７、実測値は４９４．３５。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）８．３４（ｓ、１Ｈ）、８．２１（ｓ、１Ｈ）、６．０９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、５．３９（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、４．４９（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝８．０Ｈｚ、Ｊ２＝４．８Ｈｚ、Ｊ３＝０．８Ｈｚ）、４．３７（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝４．０Ｈｚ、Ｊ２＝１．６Ｈｚ）、４．２６−４．３１（ｍ、２Ｈ）、３．９６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．０Ｈｚ、Ｊ２＝４．４Ｈｚ）、３．９０（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．０Ｈｚ、Ｊ２＝６．０Ｈｚ）、３．１７−３．２２（ｍ、１Ｈ）、２．９３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．８Ｈｚ、Ｊ２＝４．８Ｈｚ）、２．７１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１２．８Ｈｚ）、２．４６（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．５８−１．７５（ｍ、４Ｈ）、１．４３−１．４９（ｍ、２Ｈ）。２′，５′−ビス−Ｏ−ビオチニル−９−（β−Ｄ−キシロフラノシル）−アデニン、白色粉末を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ３０Ｈ４１Ｎ９Ｏ８Ｓ２［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は７２０．２５、実測値は７２０．３５。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）８．３４（ｓ、１Ｈ）、８．２２（ｓ、１Ｈ）、６．１２（ｓ、１Ｈ）、５．３８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１．６Ｈｚ）、４．４５−４．５２（ｍ、４Ｈ）、４．３９（ｓ、１Ｈ）、４．２６−４．３２（ｍ、２Ｈ）、３．１４−３．２３（ｍ、２Ｈ）、２．８９−２．９６（ｍ、２Ｈ）、２．７０（ｄｄ、２Ｈ、Ｊ１＝１２．４Ｈｚ、Ｊ２＝８．０Ｈｚ）、２．４８（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、２．３７（ｄｔ、４Ｈ、Ｊ１＝１５．６Ｈｚ、Ｊ２＝８．０Ｈｚ）、１．５７−１．７７（ｍ、８Ｈ）、１．４３−１．５１（ｍ、４Ｈ）。
条件：ｉ）５，６−ジクロロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド、ＴＭＳＯＴｆ、アセトニトリル、ｉｉ）Ｋ２ＣＯ３、メタノール、水。
化合物１６を化合物１の最後の二つのステップ中の方法を用いて合成し、５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−キシロフラノシルベンゾイミダゾール、白色粉末を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１２Ｈ１２Ｃｌ２Ｎ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は３０３．１４及び３０５．１４、実測値は３０３．３４及び３０５．５１。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）８．６４（ｓ、１Ｈ）、７．９６（ｓ、１Ｈ）、７．８０（ｓ、１Ｈ）、５．９０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１．２Ｈｚ）、４．５０−４．５６（ｍ、１Ｈ）、３．９３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．４Ｈｚ、Ｊ２＝２．８Ｈｚ）、３．６９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．４Ｈｚ、Ｊ２＝３．６Ｈｚ）、２．２６−２．３３（ｍ、１Ｈ）、１．９９−２．０５（ｍ、１Ｈ）。
条件：ｉ）２−アセトキシイソブチリルブロミド、アセトニトリル、Ｈ２Ｏ。
ステップ１：９−（２，３−アンヒドロ−β−Ｄ−リボフラノシル）アデニンの合成
無水アセトニトリル（４５ｍＬ）中のアデノシン（３．００ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）懸濁液にＨ２Ｏ（０．０４ｍＬ）及び２−アセトキシイソブチリルブロミド（１．８ｍＬ、１２．４ｍｍｏｌ）を添加し、生成された混合物を室温で２時間し、酢酸エチル（３０ｍＬ）を添加し、前記混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（２５ｍＬ×２）で洗浄し、水相を酢酸エチル（１５ｍＬ×５）で再抽出し、有機溶液を合成し、ＭｇＳＯ４乾燥し、溶剤を減圧除去し、残基を無水メタノール中に溶かし、ＯＨ−樹脂を添加し、前記混合物を室温で２時間から沈澱形成するまで撹拌し、前記混合物を加熱し、上澄み溶液を得て、樹脂を濾過し、熱メタノールで洗浄し、濾過液をクロマトグラフィーで更に純化し（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール＝２０：１）、９−（２，３−アンヒドロ−β−Ｄ−リボフラノシル）アデニン、白色粉末（２．０２ｇ、収率７２．２％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１０Ｈ１１Ｎ５Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は２５０．０９、実測値は２５０．３８。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）８．３４（ｓ、１Ｈ）、８．１７（ｓ、１Ｈ）、７．３４（ｓ、２Ｈ）、６．２１（ｓ、１Ｈ）、５．０９（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝５．２Ｈｚ）、４．４５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．８Ｈｚ）、４．２２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．８Ｈｚ）、４．１８（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝５．２Ｈｚ）、３．５２−３．５８（ｍ、２Ｈ）。
化合物１８の合成：
化合物１８を参考文献６に基づき合成。
化合物１９の合成：
化合物１９を参考文献７に基づき合成。
化合物２０の合成：
化合物２０を参考文献８に基づき合成。
条件：ｉ）ａ．アセトン、ｃｏｎｃ．Ｈ２ＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ｂ．ＴＢＳＣｌ、ＤＭＡＰ、トリエチルアミン、ジクロロメタン、ｃ．ＣＣｌ４、ＨＭＰＴ、ＴＨＦ；ｉｉ）ＮａＨ、４−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、アセトニトリル；ｉｉｉ）９０％のＴＦＡ水溶液；ｉｖ）ＮＨ３、メタノール、１２０℃。
ステップ１：２，３−Ｏ−イソプロピリデン５−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−α−Ｄ−リボフラノシルクロリド（中間体１）の合成：
室温で無水アセトン（２００ｍＬ）中のＤ−リボース（１０．００ｇ、６６．６ｍｍｏｌ）溶液にｃｏｎｃ．Ｈ２ＳＯ４（０．５ｍＬ）及びＣｕＳＯ４（２１．２６ｇ、１３３ｍｍｏｌ）を添加し、生成された混合物を３７℃で４０時間撹拌し、その後、濾過し、アセトン（２０ｍＬ）で洗浄する。濾過液をＣａ（ＯＨ）２中で１５分撹拌した後、混合物を再び濾過し、濾過液を乾燥するまで減圧蒸発させ、無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）中に溶かし、トリエチルアミン（１１．１ｍＬ、７９．９ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（９７７ｍｇ、７．９９ｍｍｏｌ）で処理する。溶液を０℃まで冷却し、ジクロロメタン（４０ｍＬ）中のＴＢＳＣｌ（１２．０５ｇ、７９．９ｍｍｏｌ）溶液を滴加し、その後、混合物を室温まで温め、一晩撹拌し、減圧濃縮し、残基を水（５０ｍＬ）中に懸濁させ、ジクロロメタン（５０ｍＬ×３）で抽出し、ＭｇＳＯ４乾燥し、クロマトグラフィーで純化し（シリカゲル、ペンタン／ジエチルエーテル＝９：１）、５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル２，３−Ｏ−イソプロピリデンＤ−リボフラノース（６．７２ｇ、３１．２％ ｆｒｏｍ Ｄ−リボース、２２．１ｍｍｏｌ）を得て、無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）中に溶かし、ＣＣｌ４（２．６ｍＬ、２６．５ｍｍｏｌ）を添加し、前記溶液を撹拌し、−７８℃まで冷却し、その後、２０分の間にＨＭＰＴ（３．９ｍＬ、２２．１ｍｍｏｌ）を添加し、添加完了後、生成された溶液を−４０℃まで昇温し、２時間保持し、溶剤を減圧除去し、残基をジエチルエーテル／石油エーテル（１：１）中に懸濁させて濾過し、濾過液を蒸発させ、粗２，３−Ｏ−イソプロピリデン５−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−α−Ｄ−リボフラノシルクロリド、オレンジ色油状物を得て、アセトニトリル（２０ｍＬ）中に溶かし、直接次にステップに用いる。
ステップ２：４−クロロ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン５−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−７−（β−Ｄ−リボフラノシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（中間体２）の合成：
無水アセトニトリル（５ｍＬ）中の０℃の４−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（１００ｍｇ、０．６５１ｍｍｏｌ）溶液にＮａＨ（６０％、鉱油中、２９ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を添加し、生成された溶液を室温で３０分撹拌し、その後、アルゴン保護下で上記在ステップ１で得られた溶液（２ｍＬ）を添加し、生成された溶液を室温まで昇温し、４０時間撹拌し、前記混合物を氷水（１０ｍＬ）中に入れ、ジクロロメタン（１５ｍＬ×３）で抽出し、有機溶液を合成し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２０ｍＬ）及び塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、真空濃縮し、残基をクロマトグラフィーで純化し（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝９：１）、４−クロロ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン５−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−７−（β−Ｄ−リボフラノシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、淡黄色油状物（１５２ｍｇ、収率５３．１％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ２０Ｈ３０ＣｌＮ３Ｏ４Ｓｉ［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は４４０．１７及び４４２．１７、実測値は４４０．４３及び４４２．５１、
ステップ３：４−クロロ−７−（β−Ｄ−リボフラノシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（中間体３）の合成：
０℃で４−クロロ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン５−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−７−（β−Ｄ−リボフラノシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（１５２ｍｇ、０．３４５ｍｍｏｌ）を９０％のＴＦＡ水溶液（５ｍＬ）中に溶かし、前記溶液を室温で１時間撹拌し、その後、乾燥するまで蒸発させる。残基をメタノール（３ｍＬ）中に溶かし、乾燥するまで蒸発させ、当該過程を３回繰り返し、痕跡量のＴＦＡを除去する。残基をクロマトグラフィーで純化し（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール＝１０：１）、４−クロロ−７−（β−Ｄ−リボフラノシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、淡黄色粉末（９１ｍｇ、収率９２．２％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１１Ｈ１２ＣｌＮ３Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は２８６．０５及び２８８．０５、実測値は２８６．３８及び２８８．０９。
ステップ４：ツベルシジンの合成：
４−クロロ−７−（β−Ｄ−リボフラノシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（９１ｍｇ、０．３１９ｍｍｏｌ）を密封管中で７Ｍメタノールアンモニア（１０ｍＬ）に溶かし、一晩１２０℃まで加熱し、その後、溶液を冷却し、溶剤を減圧除去する。残基を分取ＨＰＬＣにかけ、ツベルシジン、淡黄色粉末（５２ｍｇ、収率６０．６％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１１Ｈ１４Ｎ４Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は２６７．１０、実測値は２６７．０２。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）８．０３（ｓ、１Ｈ）、７．３３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、７．０２（ｂｒ ｓ、２Ｈ）、６．５８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、５．９６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、５．３０（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、５．２５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、５．０９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．８Ｈｚ）、４．４２（ｑ、１Ｈ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、４．０５−４．０７（ｍ、１Ｈ）、３．８６−３．９２（ｍ、１Ｈ）、３．６２（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．０Ｈｚ、Ｊ２＝４．８Ｈｚ、Ｊ３＝３．６Ｈｚ）、３．５０（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．０Ｈｚ、Ｊ２＝４．８Ｈｚ、Ｊ３＝３．６Ｈｚ）。
化合物２２を化合物２１と同じ方策を用いて合成し、５−ヨウ素ツベルシジン、淡黄色粉末を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１１Ｈ１３ＩＮ４Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は３９３．００、実測値は３９３．２８。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）８．１１（ｓ、１Ｈ）、７．６６（ｓ、１Ｈ）、６．６６（ｂｒ ｓ、２Ｈ）、６．００（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、５．３１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、５．１４（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、５．１１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝５．２Ｈｚ）、４．３４（ｄｔ、１Ｈ、Ｊ１＝６．４Ｈｚ、Ｊ２＝４．８Ｈｚ）、４．０６（ｄｔ、１Ｈ、Ｊ１＝４．８Ｈｚ、Ｊ２＝３．２Ｈｚ）、３．８８（ｑ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、３．６２（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．０Ｈｚ、Ｊ２＝４．８Ｈｚ、Ｊ３＝４．０Ｈｚ）、３．５３（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．０Ｈｚ、Ｊ２＝６．０Ｈｚ、Ｊ３＝４．０Ｈｚ）。
化合物２３を化合物４の方法に基づくと共に、第一ステップ中でベンジルアミンを用い、第二ステップ中で１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−リボフラノースを用いて合成する。Ｎ６−ベンジルアデノシン、白色粉末を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１７Ｈ１９Ｎ５Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は３５８．１４、実測値は３５８．０２。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）８．４５（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、８．３７（ｓ、１Ｈ）、８．２０（ｓ、１Ｈ）、７．２９−７．３４（ｍ、４Ｈ）、７．２０（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、５．８９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、５．４３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、５．３６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝７．２Ｈｚ、Ｊ２＝４．８Ｈｚ）、５．１７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．８Ｈｚ）、４．７１（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、４．６２（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝６．４Ｈｚ、Ｊ２＝６．０Ｈｚ、Ｊ３＝４．８Ｈｚ）、４．１５（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝４．８Ｈｚ、Ｊ２＝４．４Ｈｚ、Ｊ３＝３．２Ｈｚ）、３．９７（ｄｔ、１Ｈ、Ｊ１＝３．６Ｈｚ、Ｊ２＝３．２Ｈｚ）、３．６７（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．０Ｈｚ、Ｊ２＝４．８Ｈｚ、Ｊ３＝３．２Ｈｚ）、３．５５（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝１２．０Ｈｚ、Ｊ２＝７．６Ｈｚ、Ｊ３＝３．２Ｈｚ）。
化合物２４を化合物３の方法に基づくと共に、３−デアザアデニン及び１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−リボフラノースを用いて合成する。３−デアザアデノシン、淡黄色粉末を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１１Ｈ１４Ｎ４Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は２６７．１０、実測値は２６７．４５。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）８．２９（ｓ、１Ｈ）、７．６７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）、６．９０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）、６．１１（ｂｒ ｓ、２Ｈ）、５．７５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、５．４１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、５．１６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．８Ｈｚ）、５．０５（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝５．２Ｈｚ）、４．３１−４．３３（ｍ、１Ｈ）、４．０８−４．１２（ｍ、１Ｈ）、３．９６−３．９８（ｍ、１Ｈ）、３．５７−３．６７（ｍ、２Ｈ）。
化合物２５の合成：化合物２５を参考文献１０に基づき合成。
化合物２６の合成：化合物２６を参考文献１１に基づき合成。
化合物２７の合成：化合物２７を化合物２３と同じ方策で合成。
化合物２８の合成：化合物２８を化合物１と同じ方策で合成。
化合物２９の合成：化合物２９を参考文献１２に基づき合成。
化合物３０の合成：化合物３０を参考文献１０に基づき合成。
化合物３１の合成：化合物３１を化合物２５と同じ方策で合成。
化合物３２の合成：これは２−デオキシアデノシン、削除〜
化合物３３の合成：化合物３３を化合物１と同じ方策で合成。
化合物３４の合成：化合物３４を参考文献１３に基づき合成。
化合物３５の合成：化合物３５を化合物１と同じ方策で合成。
化合物３６〜３８の合成を参考文献１４に基づき合成。
化合物３９の合成：化合物３９を参考文献１５に基づき合成。
化合物４０の合成：化合物４０を化合物１０と同じ方策で合成。
化合物４１の合成：化合物４１を化合物１２と同じ方策で合成。
化合物４２の合成：化合物４２を参考文献１６に基づき合成。
化合物４３の合成：化合物４３を参考文献１７に基づき合成。
化合物４４〜４５の合成を化合物２５と同じ方策で合成。
化合物４６の合成：化合物４６を参考文献１８に基づき合成。
化合物４７の合成：化合物４７を化合物２２と同じ方策で合成。
化合物４８〜５４の合成を化合物３と同じ方策で合成。
化合物５５の合成：化合物５５を化合物６と同じ方策で合成。
化合物５６〜５９の合成を化合物３と同じ方策で合成。
化合物６０の合成：化合物６０を化合物６と同じ方策で合成。
化合物６１〜６９の合成を化合物３と同じ方策で合成。
化合物７０の合成：化合物７０を化合物１２と同じ方策で合成。
化合物７１〜７４の合成を化合物１と同じ方策で合成。
化合物７５の合成：化合物７５を化合物６と同じ方策で合成。
化合物７６の合成：化合物７６を化合物１４と同じ方策で合成。
化合物７７〜７８の合成を化合物１と同じ方策で合成。
化合物７９の合成を化合物６と同じ方策で合成。
化合物８０の合成：化合物８０を参考文献１９に基づき合成。
化合物８１〜８２の合成を化合物１と同じ方策で合成。
化合物８３〜９３の合成を化合物３と同じ方策で合成。
条件：ｉ）ＴＢＳＣｌ、イミダゾール、ＤＭＦ；ｉｉ）オクタノイルクロリド、ＥＤＣ、ＨＯＢｔ、ＤＭＦ；ｉｉｉ）ＴＢＡＦ、ＴＨＦ。
ステップ１：９−［２，５−ビス−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン（中間体１）の合成：
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の３′−デオキシ−アデノシン（６７ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）溶液にイミダゾール（９１ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）及びＴＢＳＣｌ（９６ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を添加し、生成された混合物を室温で一晩撹拌した後、溶剤を減圧蒸発させ、残基を飽和炭酸水素ナトリウム（３ｍＬ）中に懸濁させ、ジクロロメタン（３ｍＬ×３）で抽出し、有機溶液を収集し、水（５ｍＬ）及び塩水（５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、クロマトグラフィーで更に純化し（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝３：１）、９−［２，５−ビス−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン、無色油状物（５２ｍｇ、収率４１％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ２２Ｈ４１Ｎ５Ｏ３Ｓｉ２［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は４８０．２７、実測値は４８０．１２。
ステップ２：９−［２，５−ビス−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−Ｎ６−ビオチニル−アデニン（中間体２）の合成：
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の９−［２，５−ビス−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン（５２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）溶液にＥＤＣ（３１ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（２２ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加し、前記混合物を室温で３０分撹拌し、その後、オクタノイルクロリド（１８ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加し、生成された溶液を室温で再び４時間撹拌し、溶剤を減圧蒸発させ、残基を水（３ｍＬ）中に懸濁させ、ジクロロメタン（３ｍＬ×３）で抽出し、有機溶液を収集し、飽和炭酸水素ナトリウム（３ｍＬ）、水（３ｍＬ）及び塩水（３ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥し、クロマトグラフィーで純化し（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝３：１）、９−［２，５−ビス−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−Ｎ６−ビオチニル−アデニン、無色油状物（３８ｍｇ、収率５０％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ３０Ｈ５５Ｎ５Ｏ４Ｓｉ２［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は６０６．３８、実測値は６０６．１４。
ステップ３：３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル−Ｎ６−ビオチニル−アデニンの合成
無水ＴＨＦ（３ｍＬ）中の９−［２，５−ビス−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−Ｎ６−ビオチニル−アデニン（３８ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）溶液をＴＢＡＦ（２８ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）で処理し、前記混合物を室温で４時間撹拌し、溶剤を減圧除去し、残基を分取ＨＰＬＣにかけ、３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル−Ｎ６−ビオチニル−アデニン、白色粉末（１１ｍｇ、収率４３％）を得る。
質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１８Ｈ２７Ｎ７Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は３７８．１８、実測値は３７８．５１。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）１０．６２（ｂｒｓ、１Ｈ）、８．７０（ｓ、１Ｈ）、８．６４（ｓ、１Ｈ）、６．００（ｓ、１Ｈ）、５．７７（ｓ、１Ｈ）、５．１０（ｓ、１Ｈ）、４．６２（ｓ、１Ｈ）、４．３９−４．４２（ｍ、１Ｈ）、３．７４−３．７１（ｍ、１Ｈ）、３．５６−３．５３（ｍ、１Ｈ）、２．５７−２．５３（ｍ、２Ｈ）、２．２７−２．２４（ｍ、１Ｈ）、１．９５（ｍ、１Ｈ）、１．５９−１．６１（ｍ、２Ｈ）、１．２４−１．２９（ｍ、８Ｈ）、０．８３−０．８６（ｍ、３Ｈ）。
ステップ１：２，３，５−トリ−Ｏ−アセチル−１−（６−アミノ−Ｎ−オクタノイル−プリン−９−イル）−β−Ｄ−１−デオキシ−キシロフラノース（中間体１）の合成：
０℃及びＡｒ２保護下でピリジン（１０ｍｌ）中の２，３，５−トリ−Ｏ−アセチル−１−（６−アミノ−プリン−９−イル）−β−Ｄ−１−デオキシ−キシロフラノース（８１８ｍｇ、２．０８ｍｍｏｌ）溶液にオクタノイルクロリドを添加する。その後、前記混合物を室温で８時間撹拌する。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で反応を終わらせる。その後、濃縮し、クロマトグラフィーで更に純化し（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝１：１）、中間体１、無色油状物（７７１．３ｍｇ、収率：７１．３９％）を得る。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．６９（ｓ、１Ｈ）、８．３５（ｓ、１Ｈ）、８．２３（ｓ、１Ｈ）、６．２７（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．６０−５．５６（ｍ、１Ｈ）、５．５１（ｄｄ、Ｊ＝４．１、１．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．６５（ｄｔ、Ｊ＝６．５、４．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．４８−４．２９（ｍ、４Ｈ）、２．８８（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、３Ｈ）、２．１８（ｓ、３Ｈ）、２．１３（ｓ、３Ｈ）、２．１１（ｓ、３Ｈ）、１．８４−１．７２（ｍ、３Ｈ）、１．５８（ｓ、６Ｈ）、１．４９−１．１８（ｍ、１３Ｈ）、０．８８（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、４Ｈ）。
ステップ２：Ｎ−オクタノイル−９−（β−Ｄ−キシロフラノシル）−アデニン（ｐｒｏ−ＣＡ０４）の合成：
中間体１をＫ２ＣＯ３、ＭｅＯＨ及びＨ２Ｏで処理する。時間制御は副産物（ＣＡ０４）の最小化に対して非常に重要である。３０分が適切である。その後、濃縮し、クロマトグラフィーで更に純化し（シリカゲル、ジクロロメタン／ＭｅＯＨ＝３０：１）、ｐｒｏ−ＣＡ０４、白色粉末（２００ｍｇ、収率：３４．２６％）を得る。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ８．５５（ｔ、Ｊ＝１１．２Ｈｚ、２Ｈ）、６．０８（ｔ、Ｊ＝１０．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．５１−４．４６（ｍ、１Ｈ）、４．４２−４．３６（ｍ、１Ｈ）、４．２４（ｄｄ、Ｊ＝３．８、１．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．０２−３．９１（ｍ、２Ｈ）、２．６３（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．７２（ｄｔ、Ｊ＝１５．１、７．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．４６−１．２２（ｍ、８Ｈ）、０．９３−０．８１（ｍ、３Ｈ）。
化合物ＣＡ０４（ＮＱＺ−００７）の合成におけるステップ３及びステップ４で用いた方式に類似するが、溶剤をニトロメタンに替え、他の条件は同じである。化合物１５（４．１ｍｇ）、白色固体を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ８．０１（ｓ、１Ｈ）、７．１３（ｄ、Ｊ＝０．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．１６−５．０４（ｍ、１Ｈ）、４．５８−４．４７（ｍ、１Ｈ）、４．３７（ｄｄ、Ｊ＝５．３、２．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．６７（ｄｄｄ、Ｊ＝１７．５、１１．９、４．７Ｈｚ、２Ｈ）、２．２１−２．０９（ｍ、２Ｈ）。
化合物９７の合成：化合物９７を化合物３と同じ方策で合成。
化合物９８の合成：化合物９８を化合物１と同じ方策で合成。
化合物９９−１０３の合成を化合物３と同じ方策で合成。
化合物１０４の合成：化合物１０４を化合物１と同じ方策で合成。
化合物１０５の合成：化合物１０５を化合物３と同じ方策で合成。
化合物１０６の合成：化合物１０６を化合物１と同じ方策で合成。
管密封中でＭｅＯＨ中の６−クロロアデノシン（５６ｍｇ）混濁液にヒドラジン一水和物を添加する。前記混合物を５０℃まで加熱し、８時間撹拌する。前記混合物を室温まで冷却し、その後、真空濃縮し、粗残基を得て、ＭｅＯＨ中に懸濁し、室温で撹拌する。懸濁液中から分離された固体産物を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄し、真空乾燥し、化合物１１７（４６．５ｍｇ）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ８．３５（ｓ、１Ｈ）、８．２４（ｓ、１Ｈ）、５．８８（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．４３（ｓ、２Ｈ）、５．２２（ｓ、１Ｈ）、４．７６−４．４０（ｍ、３Ｈ）、４．１４（ｄｄ、Ｊ＝４．８、３．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．９６（ｑ、Ｊ＝３．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．７２−３．４８（ｍ、２Ｈ）、３．３４（ｓ、３Ｈ）。
化合物６の合成におけるステップ６で用いた方式に類似する。中間体１及び中間体２を合成し、その後、ヒドラジン一水和物で処理し、化合物１２２及び化合物１２３を得る。
化合物１０８の合成：化合物１０８を化合物３と同じ方策で合成。
化合物の合成１０９：化合物１０９を化合物１と同じ方策で合成。
化合物の合成１１０：化合物１１０を化合物６と同じ方策で合成。
化合物の合成１１１：化合物１１１を化合物３と同じ方策で合成。
化合物の合成１１４：化合物１１４を化合物３と同じ方策で合成。
３′−デオキシ−アデノシン（２０ｍｇ）をＤＭＦ（５ｍｌ）中に懸濁させ、その後それぞれＥＤＣＩ、ＤＭＡＰ及びビオチンリンカーを添加する。前記混合物を室温で８時間撹拌する。ＵＰＬＣ−ＭＳモニタリングにより、出発原料の消失後、別の当量のＥＤＣＩ及びＤＭＡＰを添加し、その後、ジアジリン（ｄｉａｚｉｒｉｎｅ）酸を加え、前記混合物を室温で再び８時間撹拌する。前記混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィーで更に純化し（シリカゲル、酢酸エチル／ＭｅＯＨ＝１０：１）及びＰＴＬＣ酢酸エチル／ＭｅＯＨ＝４：１）、化合物１２５及び１２６の混合物（１：１）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ４０Ｈ６１Ｎ１１Ｏ１１Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は９０４．４３、実測値は９０４．４８。
化合物１１７の合成：化合物１１７を化合物１１６と同じ方策で合成。
ステップ１：１，２，３，４，５−ペンタキス−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコフラノース（中間体１）の合成：
化合物５の合成におけるステップ２で用いた方式に類似する。出発原料１，２：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデンＤ−グルコフラノース（６ｇ、２３．０５ｍｍｏｌ）を無水酢酸（１７．４３ｍＬ、１８４．４１ｍｍｏｌ）及びＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（８７６．９ｍｇ、４．６１ｍｍｏｌ）で酢酸（１１５ｍＬ）中でアセチル化し、中間体１、無色油状物（６．５６ｇ、７２．９％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ６．４５（ｄ、Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．１２（ｓ、１Ｈ）、５．５４（ｄｄ、Ｊ＝４．９、２．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．４２（ｄ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．２８（ｄｄｄ、Ｊ＝７．５、５．１、２．９Ｈｚ、２Ｈ）、５．２５−５．１９（ｍ、２Ｈ）、５．１１（ｓ、１Ｈ）、４．６６−４．４４（ｍ、４Ｈ）、４．１６−４．０３（ｍ、４Ｈ）、２．１９−１．９６（ｍ、３０Ｈ）。
ステップ２及びステップ３：９−（β−Ｄ−１−デオキシ−Ｄ−グルコフラノシル）−アデニン（化合物９）の合成：
化合物６の合成におけるステップ６及びステップ７で用いた方式に類似する。中間体１（２１７ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をそれぞれグリコシル化及び加水分解し、化合物９、白色粉末（１．６ｍｇ、２ステップの総収率：０．９７％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ８．３９（ｓ、１Ｈ）、８．２３（ｓ、１Ｈ）、６．１２（ｄ、Ｊ＝１．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．７２（ｓ、１Ｈ）、４．４４（ｄｄ、Ｊ＝７．４、４．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．３１（ｄｄ、Ｊ＝４．４、１．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．７２（ｄｄｄ、Ｊ＝１２．１、９．４、２．９Ｈｚ、２Ｈ）、３．６７−３．５８（ｍ、１Ｈ）。
条件：ｉ）ＤＭＡＰ、Ａｃ２Ｏ、ピリジン；ｉｉ）０．２％ＨＣｌ；ｉｉｉ）ＮａＩＯ４、Ｈ２Ｏ；ｉｖ）エチニルマグネシウムブロミド、ＴＨＦ；ｖ）無水酢酸、ＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ、酢酸；ｖｉ）アデニン、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド、ＴＭＳＯＴｆ、アセトニトリル；ｖｉｉ）Ｋ２ＣＯ３、メタノール、水。
ステップ１：３−アセトキシル−１，２：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデンＤ−グルコフラノース（中間体１）の合成：
氷浴と共に、ピリジン（２０ｍｌ）中の１，２：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデンＤ−グルコフラノース（２ｇ、７．６８ｍｍｏｌ）溶液にＤＭＡＰ及びＡｃ２Ｏを添加する。前記混合物を室温で２時間撹拌する。前記混合物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍｌ）で反応を終わらせ、３０分撹拌する。溶剤を減圧蒸発させ、残基をＤＣＭ（３０ｍｌ）中に懸濁させる。それぞれ水及び塩水で洗浄する。有機層を収集し、ＭｇＳＯ４乾燥し、濃縮し、純粋な中間体１、黄色油状物（２．３１ｇ、収率９９％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．８７（ｄ、Ｊ＝３．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．２５（ｄ、Ｊ＝２．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．４９（ｄ、Ｊ＝３．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．２２−４．１８（ｍ、２Ｈ）、４．１２−３．９７（ｍ、２Ｈ）、２．１０（ｄ、Ｊ＝１．７Ｈｚ、３Ｈ）、１．５１（ｓ、３Ｈ）、１．４３−１．３８（ｍ、３Ｈ）、１．３３−１．３１（ｍ、３Ｈ）、１．３０（ｓ、３Ｈ）。
ステップ２：３−アセトキシル−１，２−Ｏ−イソプロピリデンＤ−グルコフラノース（中間体２）の合成：
化合物７の合成におけるステップ５で用いた方式に類似する。中間体２（３１０ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）を０．２％のＨＣｌで選択的に保護基を除き、酸性中間体２、無色油状物（１７２．０ｍｇ、収率６４．３３％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．９２−５．８１（ｍ、１Ｈ）、５．３１−５．１９（ｍ、１Ｈ）、４．５８−４．４８（ｍ、１Ｈ）、４．２２−４．１０（ｍ、１Ｈ）、３．９０−３．７６（ｍ、１Ｈ）、３．７５−３．６１（ｍ、２Ｈ）、３．３１（ｓ、１Ｈ）、２．８９−２．７２（ｍ、１Ｈ）、２．１１（ｓ、３Ｈ）、１．４９（ｓ、３Ｈ）、１．２８（ｓ、３Ｈ）。
ステップ３：３−Ｏ−アセチル−１，２−Ｏ−イソプロピリデンＤ−ｘｙｌｏ−ペントジアルド−１，４−フラノース（中間体３）の合成：
氷浴と共に、水（４ｍｌ）中の中間体２（１７２．０ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）溶液にＮａＩＯ４を添加し、混合物を室温で１．５時間撹拌し、ＥｔＯＨで反応を終わらせ、３０分撹拌し、濾過し、濾過液を濃縮し、カラムクロマトグラフィーで更に純化し（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝３：１）、中間体３、無色油状物（１２１ｍｇ、収率：７９．６８％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ９．６５（ｄ、Ｊ＝０．９Ｈｚ、１Ｈ）、６．０９（ｄ、Ｊ＝３．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．５０（ｄ、Ｊ＝３．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄｄ、Ｊ＝３．５、０．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．５９（ｄ、Ｊ＝３．５Ｈｚ、１Ｈ）、２．０５−２．０３（ｓ、３Ｈ）、１．５２（ｓ、４Ｈ）、１．３４（ｓ、３Ｈ）。
ステップ４：３−Ｏ−アセチル−１，２−イソプロピリデンＤ−ｇｌｕｃｏ−６、７−ジデオキシヘプト６−イノフラノース（中間体４）の合成：
０℃及びＡｒ保護下で、無水ＴＨＦ（５ｍｌ）中の中間体３（１１７．０ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）溶液にエチニルマグネシウムブロミド（３ｍＬ、ｎ−ヘキサン中０．５ｍ、１．５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を滴加する。その後、前記混合物を８時間撹拌する。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３ｍｌ）で反応を終わらせ、３０分撹拌する。ＤＣＭ（２０Ｘ３ｍｌ）で前記混合物を抽出し、有機層を合成し、それぞれ水及び塩水で洗浄する。ＭｇＳＯ４乾燥し、濾過する。濃縮し、カラムクロマトグラフィーで更に純化し（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝４：１）、中間体４、無色油状物（６９ｍｇ、５２．９８％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．９６（ｄｄ、Ｊ＝５．５、３．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．５７（ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．３１（ｔ、Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．５２（ｄｄ、Ｊ＝９．７、５．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．３７（ｄｄ、Ｊ＝８．２、３．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．５７−２．５３（ｍ、０．５Ｈ）、２．４７（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、０．５Ｈ）、２．１３（ｄ、Ｊ＝３．０Ｈｚ、１．５Ｈ）、２．０９（ｄ、Ｊ＝３．０Ｈｚ、１．５Ｈ）、１．５１（ｔ、Ｊ＝４．６Ｈｚ、３Ｈ）、１．３１（ｓ、３Ｈ）。参考文献Ｄｅｒｅｋ Ｈｏｒｔｏｎ、Ｊｉ−Ｈｓｉｕｎｇ Ｔｓａｉ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８ １９７７ ８９−１０８と比較し、５’構成はＲ及びＳ １４：１１である。
ステップ５：１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ｇｌｕｃｏ−６，７−ジデオキシ−ヘプト６−イノフラノース（中間体５）の合成：
化合物５の合成におけるステップ２で用いた方式に類似する。酢酸（５ｍＬ）中の中間体２（６９ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を無水酢酸（１２７ｍｍＬ、１．３５ｍｍｏｌ）及びＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（１．２４ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）でアセチル化し、中間体５、無色油状物（６４ｍｇ、６９．４％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ６．４３（ｄ、Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．０７（ｓ、１Ｈ）、５．６３（ｑ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．６１（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．５６（ｄｄ、Ｊ＝８．４、４．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．５０（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．４６（ｄｄ、Ｊ＝５．２、２．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．３２（ｄｄ、Ｊ＝６．５、４．５Ｈｚ、１Ｈ）、２．４９−２．４７（ｍ、１Ｈ）、２．４４−２．４３（ｍ、１Ｈ）、２．１３−２．０３（ｍ、２４Ｈ）。
ステップ６：２，３，５−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ｇｌｕｃｏ−６，７−ジデオキシ−ヘプト−６−イノール−１−（６−アミノ−プリン−９−イル）−β−Ｄ−１−デオキシ−フラノース（中間体６）の合成：
化合物６の合成におけるステップ６で用いた方式に類似する。無水アセトニトリル（３ｍＬ）中の中間体５をアデニン（３７．９０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（１１４．１１ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）及びＴＭＳＯＴｆ（１２４．６６ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）でグリコシル化し、中間体６、無色油状物（４４ｍｇ、５６．３８％）を得る。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚのＣ１８Ｈ１９Ｎ５Ｏ７［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値は４１８．１３、実測値は４１８．２４。
ステップ７：９−（６，７−ジデオキシ−ヘプト−６−イノール−−β−Ｄ−１−デオキシ−Ｄ−グルコフラノシル）−アデニン（化合物１１９）の合成：
化合物６の合成におけるステップ７で用いる方式に類似する。５０％のメタノール水溶液（３ｍＬ）中の中間体６をＫ２ＣＯ３（７２．８５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）で加水分解し、化合物８、白色粉末（３．２ｍｇ、１０．４２％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ８．５３（ｓ、１Ｈ）、８．２６（ｓ、１Ｈ）、６．０２（ｄ、Ｊ＝３．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．７０（ｄｄ、Ｊ＝６．８、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．５５（ｔ、Ｊ＝２．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．３９（ｄｄ、Ｊ＝６．８、４．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．３６−４．３２（ｍ、１Ｈ）、２．９３（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）。
化合物１２０〜１２１、化合物１２０〜１２１の合成を化合物１と同じ方策で合成。
化合物１２２の合成：化合物１２２を化合物３と同じ方策で合成。
ステップ１：（中間体１）の合成：
０℃及びＡｒ保護下で、ピリジン（５ｍｌ）中のＳＭ１（４０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）溶液にＴｓＣｌ（２８．５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を滴加する。その後、前記混合物を室温で１２時間撹拌する。その後、前記反応混合物を濃縮し、クロマトグラフィーで更に純化し（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝１：１）、中間体１、淡黄色固体（１６．３ｍｇ、収率：２０．６８％）を得る。
ステップ２：化合物１２３の合成：
中間体１をアンモニア溶液（ＭｅＯＨ中２．０Ｍ）で処理する。前記混合物を５０℃で８時間撹拌する。その後、濃縮し、クロマトグラフィーで更に純化し（シリカゲル、ジクロロメタン／ＭｅＯＨ＝３０：１）、ＮＱＺ−１９６、白色粉末（２．４ｍｇ、収率：２４．８９％）を得る。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ８．５７（ｓ、１Ｈ）、８．２６（ｓ、１Ｈ）、８．０５（ｓ、１Ｈ）、６．４９（ｓ、１Ｈ）、５．３４−５．３３（ｄ、Ｊ＝４Ｈｚ、１Ｈ）、５．２１−５．１９（ｍ、１Ｈ）、５．０６（ｓ、１Ｈ）、４．８３−４．７９（ｍ、１Ｈ）、４．０１−３．９９（ｍ、１Ｈ）、１．９４（ｓ、２Ｈ）。
Ｄ２Ｏ（２ｍＬ）中の９−（β−Ｄ−キシロフラノシル）−アデニン（２０ｍｇ）及び１０％Ｐｄ／Ｃ（５ｍｇ、基質の１０ｗｔ％）を密封管中、Ｈ２雰囲気で１６０℃で２４時間撹拌する。冷却後、前記反応混合物を濾過する。濾過液を真空濃縮し、重水素化ＣＡ０４、白色粉末（１７．２ｍｇ）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ５．９７（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．５０−４．４１（ｍ、１Ｈ）、４．３８−４．２９（ｍ、１Ｈ）、４．２１（ｄｄ、Ｊ＝３．９、１．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．０２−３．８５（ｍ、２Ｈ）。
上記で用いた方式に類似する。３′−デオキシ−アデノシンをＤ２Ｏ及びＰｄ／Ｃで処理し、重水素化ＣＡ０３、白色粉末（９．７ｍｇ）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ５．９８（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．８８−４．９４（ｍ、１Ｈ）、４．６１−４．４５（ｍ、１Ｈ）、３．９３（ｄｄ、Ｊ＝１２．５、２．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．６９（ｄｄ、Ｊ＝１２．５、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、２．４２−２．２９（ｍ、１Ｈ）、２．１２（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．２、６．４、３．７Ｈｚ、１Ｈ）。
実施例３ 本発明の典型化合物の活性を評価する（表４）：
我々はＳＡＲ（構造活性関係）分析に対して大量の仕事を行い、コルジセピンｎｏ位相シフト能力における效力を増やす方法を考えてみた。前記化合物を得た後、Ｄ１５細胞中において段階希釈、及び平行的にペントスタチン（アデノシンデアミナーゼ阻害薬）と結合して又はペントスタチン（アデノシンデアミナーゼ阻害薬）と結合しないで、化合物の位相シフト活性をテストした。
詳細な手順は以下のとおり：
１．細胞懸濁液を調製する：まず、成長が早いセルをトリプシン処理し、５×１０４細胞／ｍｌで１０％ＦＢＳ及び抗生素を含有するＤＭＥＭ中に再懸濁させる。その後、３８４ウェルプレートのウェル毎に５０μｌの細胞を接種する。最後にプレートをインキュベーターに戻して２日成長させ、合流させる。細胞が合流したとき、我々は合成した化学品でこれらの処理を開始した。
２．化学品の調製：まず合成した化合物をＤＭＳＯで最終濃度１００ｍＭまで希釈する。その後、各種化学品を５００μｌのペントスタチン（５μｇ／ｍｌ）又はＤＭＳＯを含有するＸＭ培地において最終濃度１００μＭまで希釈する。その後、３００μｌの化学品を含有する培地を９６ウェルプレートの第一列に移し、残りの列には予め１５０μｌのペントスタチン又はＤＭＳＯを含有するＸＭ培地を分配しておく。最後に化学品を含有した培地を２倍の段階で第一列から最後の一列まで希釈する。
３．ペントスタチンを含有する又はペントスタチンを含有しない段階希釈された化学品で細胞を処理する：３８４ウェルプレート中の細胞を取り出し、培地を化学品含有培地に交換する。最後に、各種化合物に対して、プレートを密封膜で密封し、Ｔｅｃａｎに入れる。３７℃で、Ｔｅｃａｎ光度計中で細胞からのデータを５日収集する。
４．データ分析：我々は、陰性ヒットは濃度が５００μＭの時でも概日リズム位相をシフトできないと定義し、陽性ヒットは濃度２００μＭよりも低い時、概日リズム位相シフトを有すると定義し、ペントスタチンを含有する又はペントスタチンを含有しない培地においてもこのようにする。
例えば、化学品１〜７、１６〜２４（表１中の番号参照）、ＮＱＺ−１１５、ＮＱＺ−１９３、ＮＱＺ−１９４、ＮＱＺ−１９７、ＮＱＺ−１９８は１００μＭより低い濃度のときに概日リズム時計をシフトしたので、陽性ヒットと見なされる。表１中の８〜１５のビオチン化化合物（表１中の番号参照）も陽性ヒットである。これらはｌｕｍｉｃｙｃｌｅ測定において位相シフト能力を示さないが、濃度が５００μＭの時でも３８４ウェルプレート中において、これらは約５μＭの濃度で概日リズム位相シフト能力を示した。注意すべきは、コルジセピン及びＮＱＺ−００７はペントスタチン含有培地における效力が顕著に増加したことを示し、１２時間の位相シフトを起こした濃度は２５μＭから０．２μＭまで増えた。我々は更に、一部のコルジセピン類似化合物は１００μＭの濃度下で伸長期効果を有することを発見した。これにはＮＱＺ−１６８及びＮＱＺ−１９５を含む。化学品ＮＱＺ−１６３、ＮＱＺ−１８７、ＮＱＺ−１９４、ＮＱＺ−１９８は１００μＭの濃度で増加した振幅効果を有し、Ｐｅｒ２：ｌｕｃシグナルは対照の２倍超増加した。











参考文献
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５．Ｆｏｎｖｉｅｌｌｅ Ｍ．；Ｃｈｅｍａｍａ Ｍ．；Ｌｅｃｅｒｆ Ｍ．；等、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄｉｔ．、２０１０、４９（３０）、５１１５−５１１９頁
６．Ｓｚｕｅｃｏｖａ Ｌ．；Ｓｐｉｃｈａｌ Ｌ．；Ｄｏｌｅｚａｌ Ｋ．；等、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００９、１７（５）、１９３８−１９４７．頁
７．Ｂｏｏｋｓｅｒ Ｂ．Ｃ．；Ｒａｆｆａｅｌｅ Ｎ．Ｂ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００７、７２（１）、１７３−１７９頁
８．Ｌｉｎ Ｔ．Ｓ．；Ｃｈｅｎｇ Ｊ．Ｃ．；Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｋ．；等、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８５、２８（９）、１１９４−１１９８頁
９．Ｃｌａｉｒｅ Ｃ．；Ｓａｌｉｍ Ｋ．；Ｃａｒｌａ Ａ．Ｈ．Ｐ．；等、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２０１０、２１（６）、１０６２−１０６９頁
１０．Ｃ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ、Ｈ．−Ｇ．Ｇｅｎｉｅｓｅｒ、Ｍ．Ｖｅｒｏｎ ａｎｄ Ｂ．Ｊａｓｔｏｒｆｆ、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、Ｖｏｌ．６、Ｎｏ．２１、２５７１−２５７４頁、１９９６
１１．Ｌｏｕｒｉｄｏ、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ；Ｚｈａｎｇ、Ｃｈａｏ；Ｌｏｐｅｚ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ．；Ｔａｎｇ、Ｋｅｌｉａｎｇ；Ｂａｒｋｓ、Ｊｅｎｎｉｆｅｒ；Ｗａｎｇ、Ｑｉｕｌｉｎｇ；Ｗｉｌｄｍａｎ、Ｓｃｏｔｔ Ａ．；Ｓｈｏｋａｔ、Ｋｅｖａｎ Ｍ．；Ｓｉｂｌｅｙ、Ｌ． Ｄａｖｉｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１３、ｖｏｌ．５６、＃７、３０６８−３０７７頁
１２．ＷＯ２０１２１４９１９６Ａ
１３．Ｒｏｂｉｎｓ、Ｍｏｒｒｉｓ Ｊ．；Ｗｉｌｓｏｎ、Ｊｏｈｎ、Ｓ．；Ｍａｄｅｊ、Ｄａｎｕｔａ；Ｌｏｗ、Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｈ．；Ｈａｎｓｓｋｅ、Ｆｒｉｔｚ；Ｗｎｕｋ、Ｓｔａｎｉｓｌａｗ Ｆ．−Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５、ｖｏｌ． ６０、＃ ２４、７９０２−７９０８頁
１４．Ｉｋｅｈａｒａ；Ｍａｒｕｙａｍａ；Ｍｉｋｉ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９７８、ｖｏｌ． ３４、＃８、１１３３−１１３８頁
１５．Ｍａｓａｈａｒｕ Ｙｏｓｈｉｋａｗａ、Ｔｅｔｓｕｙａ Ｋａｔｏ及びＴａｄａｏ Ｔａｋｅｎｉｓｈｉ、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｊａｐａｎ、ＶＯＬ．４ ２ ３５０５−３５０８（１９６９）
１６．Ｒａｙ、Ａｄｒｉａｎ Ｓ．；Ｙａｎｇ、Ｚｈｅｎｊｕｎ；Ｃｈｕ、Ｃｈｕｎｇ Ｋ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｋａｒｅｎ Ｓ．−Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、２００２、ｖｏｌ．４６、＃３、８８７−８９１頁
１７．Ｇｌａｕｄｅｍａｎｓ、Ｃ．Ｐ．Ｊ．；Ｆｌｅｔｃｈｅｒ、Ｊｒ．、Ｈ．Ｇ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９６３、２８、３００４−３００６
１８．Ｍｉｋｈａｉｌｏｐｕｌｏ、Ｉｇｏｒ Ａ；Ｐｒｉｃｏｔａ、Ｔａｍａｒａ Ｉ；Ｓｉｖｅｔｓ、Ｇｒｉｇｏｒｉｉ Ｇ；Ａｌｔｏｎａ、Ｃｏｒｎｅｌｉｓ−Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３、ｖｏｌ．６８、＃ １５、５８９７−５９０８頁
１９．Ｒｏｂｉｎｓ；Ｎｅｓｃｈａｄｉｍｅｎｋｏ；Ｒｏ；Ｙｕａｎ；Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ；Ｗｎｕｋ−Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８、ｖｏｌ．６３、＃４、１２０５−１２１１頁
２０．Ｂｅｃｋ、Ｄ．Ｗ．等、Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ＆Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌ １９８４ ４３（３）２１９−２２４
２１．Ｃｈｅｎｇ、Ｐ．等、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００５ １９（２）２３４−２４１
２２．Ｄｅｎｔｉｎ、Ｒ．等、Ｎａｔｕｒｅ ２００７ ４４９（７１６０）３６６−３６９
２３．Ｇｏｒｙｎｉａ、Ｓ．等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１ １７６（３）２７９−２９１．
２４．Ｈｉｒｏｔａ、Ｔ．等、ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０ ８（１２）ｅ１０００５５９
２５．Ｈｉｒｏｔａ、Ｔ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２ ３３７（６０９８）１０９４−１０９７
２６．Ｈｕ、Ｚ．等Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｎｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｍｅｄ ２０１３ ２０１３８
２７．Ｈｕａｎｇ、Ｚ．−Ｌ．等、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００５ ８（７）８５８−８５９
２８．Ｈｕｇｈｅｓ、Ｍ．Ｅ．等、ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ２００９ ５（４）ｅ１０００４４２
２９．Ｈｕｇｈｅｓ、Ｍ．Ｅ．等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｈｙｔｈｍｓ ２０１０ ２５（５）３７２−３８０
３０．Ｋｏｉｋｅ、Ｎ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２ ３３８（６１０５）３４９−３５４
３１．Ｌｉｕ、Ａ．Ｃ．等、Ｃｅｌｌ ２００７ １２９（３）６０５−６１６
３２．９ ＮＩＢＳ１６−００７−１ＷＯ
３３．Ｍａｔｉａｓ、Ｐ．Ｍ．等、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１５ ２（１７）
３４．Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、Ｗ．Ｍ．ＮｅｕｒｏＲＸ ２００５ ２（１）３−１４
３５．Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、Ｗ．Ｍ．等、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １９９４ ２６８（１）１４−１８
３６．Ｐｉｚａｒｒｏ、Ａ．等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１２
３７．Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、Ｊ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ２０１３ ６（２６６）ｍｒ１
３８．Ｓａｔｏ、Ｔ．Ｋ．等、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２００６ ３８（３）３１２−３１９
３９．Ｓｈｉ、Ｇ．等、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ ２０１３ １１０（１２）４７５０−４７５５
４０．Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｊ．Ｓ．等、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ２００８ ９（１０）７６４−７７５
４１．Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｊ．Ｓ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８ ３２２（５９０３）９０９−９１２
４２．Ｗｏｏ、Ｐ．Ｗ．Ｋ．等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７４ １１（４）６４１−６４３
４３．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、Ｙ．等Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ ３４２（６１５４）８５−９０
４４．Ｙｏｏ、Ｓ．−Ｈ．等、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ ２００４ １０１（１５）５３３９−５３４６
４５．Ｚｈａｎｇ、Ｅ．Ｅ．及びＳ．Ａ．ＫａｙＮａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０１０ １１（１１）７６４−７７６
４６．Ｚｈａｎｇ、Ｅ．Ｅ．等Ｃｅｌｌ ２００９ １３９（１）１９９−２１０
４７．Ｚｈａｎｇ、Ｒ．等ＰＮＡＳ、ＵＳＡ ２０１４ １１１（４５）１６２１９−１６２２４
４８．Ｚｈａｏ、Ｚ．等Ｃｅｌｌ ２０１５ １６３（５）１０６４−１０７８

Claims (33)

  1. 以下の式Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩの化合物。

    式中、Ｒ１〜Ｒ１８は互いに独立して、好ましくは１〜８個の炭素原子を含有する非置換又は置換の直鎖又は分岐鎖炭化水素残留物、水素、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、ハロアルキル、シクロアルキル 、アルコキシ、アルキルチオ、アリル、アリルオキシ、アリルチオ、ヘテロ環、ヘテロ環アミノ、ハロゲン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミンオキシド、アルキルヒドロキシルアミノ、アジ化物、硝酸、シアノ及びイソシアノ、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリルカルボニル、ヘテロ環カルボニル、アルキルビニル、アリル、カルボキシ、アルキルチオ、アミド、エステル、ホスホン酸エステル、シクロアルキルホスホン酸エステル、シクロアルキルホスホンアミド、スルホン酸エステル、シクロアルキルスルホン酸エステル又はヘテロ環スルホン酸エステルであり、但しアルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ及びアルキルチオはそれぞれＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキレン、ハロアルキル（Ｃ１〜Ｃ８）、シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ８）、アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ８）及びアルキルチオ（Ｃ１〜Ｃ８）であり、例えば、Ｒ１−Ｒ１３はアリルメチル、アリルエチル、アリルプロピル、アリルブチル、ヘテロアリルメチル、ヘテロアリルエチル、ヘテロアリルプロピル、ヘテロアリルブチルであってもよく、特にＲ１−Ｒ１３はフェニル、フェニルメチル、１−メチル−２−フェニルエチル、１−フェニルプロピル、２−フェニルプロピル、３−フェニルプロピル、フェニルブチル、フェニルペンチル、フェニルへキシル又は１−ベンジル−１−メチルエチルであってもよく、Ｒ１〜Ｒ１３はフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、フルオロメトキシ、クロロメトキシ、ブロモメトキシ、フルオロエトキシ、クロロエトキシ、ブロモエトキシ、アミノメトキシ、アミノエトキシ、アミノプロピルオキシ、又は他のヘテロ原子であってもよく、例えばＯ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びＳｅであり、Ｒ１−Ｒ１３は−ＯＲ′、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ′、−ＮＲ′Ｒ″、−ＳＲ′、−Ｒ′、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ′、−ＣＯＮＲ′Ｒ″、−Ｃ（Ｏ）Ｒ′、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、−ＮＲ″Ｃ（Ｏ）Ｒ′、−ＮＲ″ＣＯ２Ｒ′、−ＮＲ′−Ｃ（Ｏ）ＮＲ″Ｒ′″、−ＮＲ′−ＳＯ２ＮＲ″Ｒ′″、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ′Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ′、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ′）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ′）（ＯＲ″）、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ′（ＯＲ″）、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ′Ｒ″、−ＯＰ（ＯＨ）２、−ＯＰ（ＯＲ′）２、−ＯＰ（ＯＲ′）（ＯＲ″）、−ＯＰＲ′Ｒ″、−ＯＰＲ′（ＯＲ″）、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ′、−ＯＳ（Ｏ）（ＯＲ′）、−ＯＳＯ２Ｒ′、−ＯＳＯ２（ＯＲ′）、−ＯＳＯ２ＮＲ′Ｒ″、−Ｓ（Ｏ）Ｒ′、−Ｓ（Ｏ）（ＯＲ′）、−ＳＯ２Ｒ′、−ＳＯ２（ＯＲ′）、−ＳＯ２ＮＲ′Ｒ″、−ＮＲ″ＳＯ２Ｒ、−ＯＳｉ（Ｒ′）３、−ＯＳｉ（ＯＲ′）３、−Ｓｉ（ＯＲ′）３、−Ｓｉ（ＯＲ′）（ＯＲ″）（ＯＲ′″）、−ＯＳｉ（ＯＲ′）（ＯＲ″）（ＯＲ′″）、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、ペルフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ−又はペルフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−であってもよく、数量範囲が０から芳香環系上の空いている原子価総数までであり；但しＲ′、Ｒ″及びＲ′″は独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル及びヘテロアルキル、非置換のアリル及びヘテロアリル、（非置換のアリル）−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル及び（非置換のアリル）オキシ−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルからなる群から選ばれ、且つ
    Ｘ１〜Ｘ８は互いに独立して酸素（Ｏ）、硫黄（Ｓ）、セレン（−Ｓｅ−）のヘテロ原子、飽和又は不飽和の、置換又は非置換の窒素（＝Ｎ−、−ＮＨ−、−ＮＲ１４−）、及び原子価数量範囲が０から炭素環−又はヘテロ環−環系上で指示される原子の空いている原子価総数までの炭化水素残留物からなる群から選択される。
  2. Ｒ１はα−又はβ−水素、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アリル、アリルオキシ、アリルチオ、ヘテロ環、ヘテロ環アミノ、エポキシド、アルキルエポキシド、アルキルアミノ、ジアルキルアミノであり、但しアルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ及びアルキルチオはそれぞれＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキレン、ハロアルキル（Ｃ１〜Ｃ８）、シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ８）、アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ８）及びアルキルチオ（Ｃ１〜Ｃ８）であり；
    Ｒ２〜Ｒ１８は独立して水素、酸素（＝Ｏ）、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アリル、アリルオキシ、アリルチオ、ヘテロ環、ヘテロ環アミノ、エポキシド、アルキルエポキシド、アルキルアミノ、ジアルキルアミノであり、但しアルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ及びアルキルチオはそれぞれＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキレン、ハロアルキル（Ｃ１〜Ｃ８）、シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ８）、アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ８）及びアルキルチオ（Ｃ１〜Ｃ８）であり；
    Ｘ１〜Ｘ８は互いに独立して酸素（Ｏ）、硫黄（Ｓ）、セレン（−Ｓｅ−）のヘテロ原子、飽和又は不飽和の、置換又は非置換の窒素（＝Ｎ−、−ＮＨ−、−ＮＲ１４−）、及び原子価数量範囲が０から炭素環−又はヘテロ環−環系上で指示される原子の空いている原子価総数までの炭化水素残留物からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｘ１〜Ｘ８は独立して−Ｏ−、−Ｓ−、＝Ｎ−、−ＮＨ−、−ＣＨ２−、＝ＣＨ−、−ＣＨＲ−、＝ＣＲ−、−ＣＲＲ′−又は−ＣＲ−である、請求項１又は２に記載の化合物で。
  4. 前記化合物は以下の式Ｉの化合物である、請求項１に記載の化合物。

    式中、Ｒ１はＨであり；Ｒ２及びＲ３は独立してＨ、ＯＨ、オキシビオチン、ＯＡｃ、ＯＴＢＳ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、又は＝Ｏであり、又はＲ２及びＲ３は独立して存在せず；Ｒ４及びＲ５は独立してＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、＝Ｏ、オキシビオチン又はＮ３であり；又はＲ２／Ｒ３及びＲ４／Ｒ５はこれらが接続している炭素と一緒にエポキシエタンを形成し；Ｒ６及びＲ７は独立してＨ、ＣＨ２−ＯＨ、ＣＨ２−Ｎ３、ＣＨ２−オキシビオチン、ＣＨ２−ＡｃＯ、ＣＨ２−ＯＴＢＳ、ＣＯ２Ｍｅ、三リン酸化されたメチレン、１、２−ビスヒドロキシエタン、テトラブチルアンモニウムモノホスフェート、１−ヒドロキシプロパ−２−イン−１−イル、又はジアザシメンであり；Ｒ８はＨ、＝Ｓ、＝Ｏ、ＮＨ−ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−Ｏ−ＣＨ３、又は重水素であり；Ｒ９は存在せず、又はＲ９はＨ、ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり；Ｒ１０はＨ、−ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＨ２、ＮＨ−ＣＨ３、ＮＨ−ＮＨ２、＝Ｏ、ＮＨＢｎ、ビオチンアミド、ｍ−ヒドロキシアニリン、アミノシクロプロパン、アミノシクロブタン、アミノシクロペンタン、アミノシクロヘキサン、ＯＭｅ又はオクタミドであり；Ｒ１１は存在せず、又はＲ１１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり；Ｒ１２は存在せず、又はＲ１２はＨ、ＮＨ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＭｅ、４−ホルムアミド置換されたピラゾールであり；Ｒ１３は存在せず又はＲ１３はＨ、Ｏ−ＣＨ３又はＯｍｅであり；
    Ｘ１はＯ、Ｎ又はＣであり；Ｘ２はＮ又はＣであり；Ｘ３はＣであり；Ｘ４はＣ又はＮであり；Ｘ５はＣ又はＮであり；Ｘ６はＣ又はＮであり；Ｘ７はＣ又はＮであり；及びＸ８はＣ又はＮである。
  5. 前記化合物は以下の式ＩＩの化合物である請求項１に記載の化合物。

    式中、Ｒ１はＨであり；Ｒ２はＨ又はＯＨであり；Ｒ３はＨ又はＯＨであり；Ｒ４はＨ又はＯＨであり；Ｒ５はＨ又はＯＨであり；Ｒ６はＨ又はＯＨであり；Ｒ７はＨ又はＯＨであり；Ｒ８はＨであり；Ｒ９はＨであり；Ｒ１０はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり；Ｒ１１は存在せず又はＲ１１はＨであり；Ｒ１２はＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨ−ＣＨ３又はＯＭｅであり；Ｒ１３は存在せず又はＲ１３はＨであり；Ｒ１４はＨであり；Ｒ１５は存在せず又はＲ１５はＨであり；且つ
    Ｘ１はＯであり；Ｘ２はＮであり；Ｘ３はＣであり；Ｘ４はＣ又はＮであり；Ｘ５はＣであり；Ｘ６はＮであり；Ｘ７はＣであり；及びＸ８はＣ又はＮである。
  6. 前記化合物は以下の式ＩＩＩの化合物である請求項１に記載の化合物。

    式中、Ｒ１６はテトラヒドロフラン又はｔｅｒｔ−ブチルであり；Ｒ１７はＣＨ２−メチルベンジルであり；及びＲ１８はＮＨ２又はアミノベンジルであり；及び
    Ｘ２はＮであり；Ｘ３はＣ又はＮであり；Ｘ４はＣ又はＮであり；Ｘ５はＣであり；Ｘ６はＮであり；Ｘ７はＣであり；及びＸ８はＮである。
  7. 前記化合物は以下の式Ｉの化合物である請求項１に記載の化合物。

    式中、Ｒ１はＨであり；Ｒ２及びＲ３は独立してＨ、ＯＨ、オキシビオチン、ＯＡｃ、ＯＴＢＳ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、又は＝Ｏであり、又はＲ２及びＲ３は独立して存在せず；Ｒ４及びＲ５は独立してＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、＝Ｏ、又はオキシビオチンであり；又はＲ２／Ｒ３及びＲ４／Ｒ５はこれらが接続している炭素と一緒にエポキシエタンを形成し；Ｒ６及びＲ７は独立してＨ、ＣＨ２−ＯＨ、ＣＨ２−Ｎ３、ＣＨ２−オキシビオチン、ＣＯ２Ｍｅ、三リン酸化されたメチレン、１、２−ビスヒドロキシエタン、テトラブチルアンモニウムモノホスフェート、１−ヒドロキシプロパ−２−イン−１−イル又はジアザシメンであり；又はＲ４／Ｒ５のヒドロキシル及びＲ６／Ｒ７のメチルヒドロキシルはこれらが接続している炭素と一緒に環状フォスフェートラクトンを形成し；Ｒ８はＨ、＝Ｓ、＝Ｏ、ＮＨ−ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−Ｏ−ＣＨ３、又は重水素であり；Ｒ９は存在せず、又はＲ９はＨ、ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり；Ｒ１０はＨ、−ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＨ２、ＮＨ−ＮＨ２、＝Ｏ、ＮＨＢｎ、ビオチンアミド、ｍ−ヒドロキシアニリン、アミノシクロプロパン又はオクタミドであり；Ｒ１１は存在せず、又はＲ１１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり；Ｒ１２は存在せず、又はＲ１２はＨ、ＮＨ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＭｅ、４−ホルムアミド置換されたピラゾールであり；Ｒ１３は存在せず又はＲ１３はＨ、Ｏ−ＣＨ３又はＯｍｅであり；且つ
    Ｘ１はＯ、Ｎ又はＣであり；Ｘ２はＮ又はＣであり；Ｘ３はＣであり；Ｘ４はＣ又はＮであり；Ｘ５はＣ又はＮであり；Ｘ６はＣ又はＮであり；Ｘ７はＣ又はＮであり；及びＸ８はＣ又はＮである。
  8. 以下の群から選択される請求項１に記載の化合物。










  9. 以下の群から選択される請求項１に記載の化合物。





  10. 以下の群から選択される請求項１に記載の化合物。


  11. 請求項１〜１０のいずれか一項に定義される式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのヌクレオシド類似化合物又はその薬学的に受容可能な塩及びペントスタチンを含有する組成物。
  12. コルジセピン及びペントスタチンからなるか、又は以下の化合物の一つ及びペントスタチンからなる、請求項1に記載の組成物。
  13. 以下の式のプロドラッグ。
  14. 以下の群から選択される請求項１３に記載のプロドラッグ。
  15. 以下の式の修飾化合物。
  16. 以下の群から選択される請求項１３に記載の修飾化合物。
  17. 請求項１〜１０のいずれか一項に定義される式Ｉ、式ＩＩ又は式ＩＩＩのヌクレオシド類似化合物又はその薬学的に受容可能な塩の治療有効量を被験者に投与することを含む、概日リズム調節方法、好ましくは概日リズム位相シフト方法。
  18. 前記化合物はＰｅｒ２−Ｌｕｃピーク時に投与されるがトラフ時に投与されない、請求項１７に記載の方法。
  19. 請求項１１又は１２に定義される組成物及びペントスタチンの治療有効量を被験者に投与することを含む、概日リズム調節方法、好ましくは概日リズム位相シフト方法。
  20. 前記組成物はＰｅｒ２−Ｌｕｃピーク時に投与されるがトラフ時に投与されない、請求項１９に記載の方法。
  21. 請求項１３又は１４に定義されるプロドラッグの治療有効量を被験者に投与することを含む、概日リズム調節方法、好ましくは概日リズム位相シフト方法。
  22. 請求項１５又は１６に定義される修飾化合物の治療有効量を被験者に投与することを含む、概日リズム調節方法、好ましくは概日リズム位相方法。
  23. 請求項１〜１０のいずれか一項に定義される化合物、又はその薬学的に受容可能な塩の概日リズム調節用薬物、好ましくは概日リズム位相シフト用薬物の製造における使用。
  24. 請求項１１又は１２に定義される組成物の概日リズム調節用薬物、好ましくは概日リズム位相シフト用薬物の製造における使用。
  25. 請求項１３又は１４に定義されるプロドラッグの概日リズム調節用薬物、好ましくは概日リズム位相シフト用薬物の製造における使用。
  26. 請求項１５又は１６に定義される修飾化合物の概日リズム調節用薬物、好ましくは概日リズム位相シフト用薬物の製造における使用。
  27. 前記薬物は時差、シフトワーク、年齢による睡眠障害、又は概日リズム時計に関連する睡眠障害の治療に使用可能である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の使用。
  28. 腸内投与、静脈内投与、経口投与又は舌下投与用に調製可能である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１１又は１２に記載の組成物。
  29. 前記薬物はカフェイン、メラトニン、ゾルピデム、エスゾピクロン、ザレプロン又はトリアゾラムからなる群より選択される薬剤と組み合わせ可能である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の使用。
  30. 前記被験者は時差、シフトワーク、年齢による睡眠障害又は概日体内時計に関連する睡眠障害を患う人又はこれらを患うリスクのある人である、請求項１７〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  31. ＣＤＫ９調節による前記時計位相シフトにおける請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物の使用。
  32. ＲＵＶＢＬヘリカーゼの、コルジセピンが仲介するＰｅｒ２−ｄＬｕｃ誘導及び時計位相シフトの仲介における使用、及びＲＵＶＢＬヘリカーゼのコルジセピンのダイレクトターゲットとしての使用であって、但しＲＵＶＢＬヘリカーゼは請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物のターゲットである。
  33. ＲＵＶＢＬヘリカーゼはＲＵＶＢＬ１ヘリカーゼ又はＲＵＶＢＬ２ヘリカーゼである、請求項３２に記載の使用。
JP2019539888A 2017-01-20 2018-01-20 アデノシン類似体及びその概日リズム時計調整における使用 Active JP7310064B2 (ja)

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