CN110291095B - 腺苷类似物及其在调节昼夜节律钟中的应用 - Google Patents

腺苷类似物及其在调节昼夜节律钟中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一类核苷类似物化合物、和包含该类化合物和喷司他丁的组合物，它们在调节昼夜节律、优选昼夜节律相移中的应用，以及通过该类化合物或所述组合物调节昼夜节律、优选昼夜节律相移的方法。

Description

腺苷类似物及其在调节昼夜节律钟中的应用
发明背景
在现代社会中，人们频繁在一次旅行中穿越多个时区，从而遭受众所周知的“时差”。世界旅游组织(World Tourism Organization)(UNWTO)估算，全世界每年有超过2亿的跨洲旅行者。对他们来说，最痛苦的不适是人类日常节律生理的完全反相改变(也就是大约12小时昼夜差异)。例如，从北京飞往纽约市、或从伦敦飞往夏威夷群岛的人们发现他们的身体需要一周以上才能适应目的地时间。此外，据报道在美国贡献了六分之一劳动力的轮班工作者(例如护士和卡车司机)在适应他们的工作时间表中经常体验严重的“睡眠-觉醒”相位改变。这些令人郁闷的的行为改变可在短期导致疲劳和不安，以及长期导致精神/身体障碍。
我们的内源钟表被认为管控每日的“睡眠-觉醒”循环。三个参数被用于描述振荡的一般过程：周期，幅度，和相位(Dunlap，1999)。大多数以前的昼夜节律振荡研究都集中在生物钟周期上，因为它通常被认为是三个参数中最稳固的(即，对环境因素的干扰有适应性)并且被认为与所述生物钟的核心调节直接相关(Takahashi等人，2008b)。只有少数研究集中于昼夜节律振荡的幅度，但值得注意的是，至少有两项研究提示了Clock/dClk蛋白在幅度调节中的活性(Allada等人，2003；He等人，2015)。对所述生物钟相位的研究甚至更少，生物钟相位对环境干扰非常敏感；实际上，目前的观点认为相位相关的现象难以通过实验可靠地再现(Chen等人，2018)。尽管如此，已经认识到，相位对于所述生物钟而言实际上可能与周期或幅度同样重要，即使不是更重要，因为相位限定了昼夜节律转录的“去/不去(go/no-go)”时刻，并确定了生物钟振荡开始的时点。
发明内容
在本申请中，我们使用了一种新的具有严格标准的化学筛选策略来监测生物钟相位表型，并成功地鉴定了一组使生物钟相移的小分子。具体地，我们研究了腺苷类似物及其相关化合物对人类细胞中昼夜节律钟的调节。意外地，我们发现这些化合物，如果适时施用的话，可以完全逆转生物钟相位的过程，导致昼夜节律振荡的12小时时差。结构-活性关系(SAR)研究与腺苷脱氨酶特异性抑制剂喷司他丁的预处理相结合，将这些化合物的工作浓度改进到纳摩尔范围，使它们可以临床使用。此外，这些化合物能够穿透血脑屏障(BBB)，证明了第一种有效生物钟调节剂化合物进入外周将足以引起行为效应。此前发现的生物钟药物，包括Longdaysin(CK1抑制剂，PLoS Biol 2010)、KL001系列(CRY1/2稳定剂，Science2012)和OPC-21268/SSR-149415(V1a/b拮抗剂，Science 2013)，要么对行为无效，要么需要脑室内(ICV)注射到大脑中以促进BBB穿透，从而妨碍了它们在临床中实际应用于行为重新安排。据我们所知，我们的药物是第一种不需要注射到脑中才能发挥作用的生物钟药物。
在一个方面，本发明公开了下式I、II和III的化合物：
Figure BDA0002139269340000021
其中R1-R18彼此独立地优选是含有1-8个碳原子的未取代或取代的直链或支链烃残基、氢、羟基、烷基、烯基、炔基、亚烷基、卤代烷基、环烷基、烷氧基、烷硫基、芳基、芳氧基、芳硫基、杂环基、杂环基氨基、卤素、烷基氨基、二烷基氨基、氨基氧化物、烷基羟基氨基、叠氮化物、硝基、氰基和异氰基、烷基羰基、环烷基羰基、芳基羰基、杂环基羰基、烷基乙烯基、烯丙基、羧基、烷硫基、酰胺、酯、膦酸酯、环烷基膦酸酯、环烷基膦酰胺、磺酸酯、环烷基磺酸酯或杂环基磺酸酯，其中烷基、烯基、炔基、亚烷基、卤代烷基、环烷基、烷氧基和烷硫基分别是C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C2-C8亚烷基、卤代烷基(C1-C8)、环烷基(C1-C8)、烷氧基(C1-C8)和烷硫基(C1-C8)。例如，R1-R13可以是芳基甲基、芳基乙基、芳基丙基、芳基丁基、杂芳基甲基、杂芳基乙基、杂芳基丙基、杂芳基丁基，特别是R1-R13可以是苯基、苯基甲基、1-甲基-2-苯基乙基、1-苯基丙基、2-苯基丙基、3-苯基丙基、苯基丁基、苯基戊基、苯基己基或1-苄基-1-甲基乙基。R1-R13可以是氟、氯、溴、碘、氟甲氧基、氯甲氧基、溴甲氧基、氟乙氧基、氯乙氧基、溴乙氧基、氨基甲氧基、氨基乙氧基、氨基丙氧基、或其它杂原子例如O、S、P、Si和Se。R1-R13可以是-OR'、-OC(O)R'、-NR'R"、-SR'、-R'、-CN、-NO2、-CO2R'、-CONR'R"、-C(O)R'、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR"CO2R'、-NR'-C(O)NR"R'"、-NR'-SO2NR"R'"、-NH-C(NH2)＝NH、-NR'C(NH2)＝NH、-NH-C(NH2)＝NR'、-OP(O)(OH)2、-OP(O)(OR')2、-OP(O)(OR')(OR")、-OP(O)R'(OR")、-OP(O)R'R"、-OP(OH)2、-OP(OR')2、-OP(OR')(OR")、-OPR'R"、-OPR'(OR")、-OS(O)R'、-OS(O)(OR')、-OSO2R'、-OSO2(OR')、-OSO2NR'R"、-S(O)R'、-S(O)(OR')、-SO2R'、-SO2(OR')、-SO2NR'R"、-NR"SO2R、-OSi(R')3、-OSi(OR')3、-Si(OR')3、-Si(OR')(OR")(OR'")、-OSi(OR')(OR")(OR'")、-N3、-CH(Ph)2、全氟(C1-C4)烷氧基-或全氟(C1-C4)烷基-，数量范围从零到芳环系上的开放化合价总数；并且其中R'、R"和R'"独立地选自氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基，(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基和(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。
R1-R18也可以是通过未取代或取代的聚碳、聚醚、聚烷基氨基、酰胺、酯、膦酸酯、聚膦酸酯、膦酰胺、聚膦酸酯、聚膦酰胺、磺酸酯、亚磺酸酯、磺酸、聚磺酸酯、聚亚磺酸酯、聚磺酸接头彼此连接的环状形式。优选地，接头是聚醚、环氧化物、酰胺、酯、膦酸酯、聚膦酸酯、膦酰胺、聚膦酸酯、聚膦酰胺。
在特定实施方式中：
-R1是α-或β-氢、羟基、烷基、烯基、炔基、亚烷基、卤代烷基、环烷基、烷氧基、烷硫基、芳基、芳氧基、芳硫基、杂环基、杂环基氨基、环氧化物、烷基环氧化物、烷基氨基、二烷基氨基，其中烷基、烯基、炔基、亚烷基、卤代烷基、环烷基、烷氧基和烷硫基分别是C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C2-C8亚烷基、卤代烷基(C1-C8)、环烷基(C1-C8)、烷氧基(C1-C8)和烷硫基(C1-C8)。
R2-R18独立地是氢、氧(＝O)、羟基、烷基、烯基、炔基、亚烷基、卤代烷基、环烷基、烷氧基、烷硫基、芳基、芳氧基、芳硫基、杂环基、杂环基氨基、环氧化物、烷基环氧化物、烷基氨基、二烷基氨基，其中烷基、烯基、炔基、亚烷基、卤代烷基、环烷基、烷氧基和烷硫基分别是C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C2-C8亚烷基、卤代烷基(C1-C8)、环烷基(C1-C8)、烷氧基(C1-C8)和烷硫基(C1-C8)。
X1-X8是彼此独立地是选自氧(O)、硫(S)、硒(-Se-)的杂原子、饱和或不饱和的、取代或未取代的氮(＝N-，-NH-，-NR14-)、以及化合价数量范围从0至碳环基-或杂环基-环系上指示的原子的开放化合价总数的烃残基。例如，X1-X8可以独立地是-O-、-S-、＝N-、-NH-、-CH2-、＝CH-、-CHR-、＝CR-、-CRR’-或-CR-。在此，对R的定义等于上面对R2-R18的定义。
X2-X8的环系是取代或未取代的、饱和或不饱和的5-稠合的6-元碳环或杂环环系，优选取代或未取代的嘌呤、茚、环五吡啶、环五哒嗪、环五三嗪、环五四嗪、吲哚、吡咯并吡啶、吡咯并哒嗪、吡咯并三嗪、吡咯并四嗪、吲唑、吡唑并吡啶、吡唑并哒嗪、吡唑并三嗪、吡唑并四嗪、苯并咪唑、咪唑并吡啶、咪唑并哒嗪、咪唑并三嗪、咪唑并四嗪、苯并三唑、三唑并吡啶、三唑并哒嗪、三唑并三嗪、三唑并四嗪、苯并咪唑-2-酮。
在盐形式之外，本发明还提供了前药形式的化合物。本文所述化合物的前药是在生理或医疗条件下经历化学变化以提供本发明化合物的那些化合物。另外，前体药物可以通过化学或生化方法在离体环境中转化为本发明的化合物。例如，前药当被置于具有合适的酶或化学试剂的透皮贴剂储库中时，可以缓慢转化为本发明的化合物。前药经常是有用的，因为在一些情况下，它们可能比母体药物更容易施用。例如，它们可以通过口服施用比母体药物更具生物利用度。前药也可在药理学组合物中具有比母体药物改善的溶解度。多种多样的前药衍生物是本领域已知的，例如依赖于前药的水解分裂或氧化激活的那些。前药的一个非限制性例子将是本发明的化合物，其作为酯(“前药”)施用，但随后代谢水解成羧酸，即活性实体。另外的例子包括本发明化合物的肽基衍生物。
本发明的化合物也可在构成这样的化合物的一个或多个原子处含有非天然比例的原子同位素。例如，所述化合物可以用放射性同位素例如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)放射性标记。本发明化合物的所有同位素变体，例如氘(2H)、碳-13(13C)，无论是否具有放射性，都意欲包括在本发明的范围内。
在另一个方面，本发明公开了下式I的化合物：
Figure BDA0002139269340000051
其中：R1是H；R2和R3独立地是H、OH、氧代生物素(OBiotin)、OAc、OTBS、F、Cl、Br、I、或＝O，或者R2和R3独立地不存在；R4和R5独立地是H、OH、F、Cl、Br、I、＝O、氧代生物素或N3；或者R2/R3和R4/R5与它们所连接的碳一起形成环氧乙烷；R6和R7独立地是H、CH2-OH、CH2-N3、CH2-氧代生物素、CH2-AcO、CH2-OTBS、CO2Me、三磷酸化的亚甲基、1,2-二羟基乙烷、四丁基一磷酸铵、1-羟基丙-2-炔-1-基、或二氮杂伞花烃；R8是H、＝S、＝O、NH-CH3、F、Cl、Br、I、-O-CH3、或氘；R9不存在，或者R9是H、CH3、F、Cl、Br或I；R10是H、-CH3、F、Cl、Br、I、NH2、NH-CH3、NH-NH2、＝O、NHBn、生物素酰胺、间羟基苯胺、氨基环丙烷、氨基环丁烷、氨基环戊烷、氨基环己烷、OMe或辛酰胺；R11不存在，或者R11是H、F、Cl、Br、或I；R12不存在，或者R12是H、NH2、F、Cl、Br、I、OMe、4-甲酰胺取代的吡唑；R13不存在或R13是H、O-CH3或Ome；以及
X1是O、N或C；X2是N或C；X3是C；X4是C或N；X5是C或N；X6是C或N；X7是C或N；以及X8是C或N。
在另一个方面，本发明公开了下式II的化合物：
Figure BDA0002139269340000061
其中R1是H；R2是H或OH；R3是H或OH；R4是H或OH；R5是H或OH；R6是H或OH；R7是H或OH；R8是H；R9是H；R10是H、F、Cl、Br、或I；R11不存在或R11是H；R12是CH3、NH2、NH-CH3或OMe；R13不存在或R13是H；R14是H；R15不存在或R15是H；并且
X1是O；X2是N；X3是C；X4是C或N；X5是C；X6是N；X7是C；以及X8是C或N。
在另一个方面，本发明公开了下式III的化合物
Figure BDA0002139269340000062
其中R16是四氢呋喃或叔丁基；R17是CH2-甲基苄基；以及R18是NH2或氨基苄基；以及
X2是N；X3是C或N；X4是C或N；X5是C；X6是N；X7是C；以及X8是N。
优选地，本发明公开了下式I的化合物：
Figure BDA0002139269340000071
其中：R1是H；R2和R3独立地是H、OH、氧代生物素、OAc、OTBS、F、Cl、Br、I、或＝O，或者R2和R3独立地不存在；R4和R5独立地是H、OH、F、Cl、Br、I、＝O、或氧代生物素；或者R2/R3和R4/R5与它们所连接的碳一起形成环氧乙烷；R6和R7独立地是H、CH2-OH、CH2-N3、CH2-氧代生物素、CO2Me、三磷酸化的亚甲基、1,2-二羟基乙烷、四丁基一磷酸铵、1-羟基丙-2-炔-1-基或二氮杂伞花烃；或者R4/R5的羟基和R6/R7的甲基羟基与它们所连接的碳一起形成环磷酸内酯；R8是H、＝S、＝O、NH-CH3、F、Cl、Br、I、-O-CH3、或氘；R9不存在，或者R9是H、CH3、F、Cl、Br、或I；R10是H、-CH3、F、Cl、Br、I、NH2、NH-NH2、＝O、NHBn、生物素酰胺、间羟基苯胺、氨基环丙烷或辛酰胺；R11不存在，或者R11是H、F、Cl、Br或I；R12不存在，或者R12是H、NH2、F、Cl、Br、I、OMe、4-甲酰胺取代的吡唑；R13不存在或者R13是H、O-CH3或Ome；以及
X1是O、N或C；X2是N或C；X3是C；X4是C或N；X5是C或N；X6是C或N；X7是C或N；以及X8是C或N。
优选地，本发明公开了选自下面的化合物：
表1
Figure BDA0002139269340000072
Figure BDA0002139269340000081
Figure BDA0002139269340000091
Figure BDA0002139269340000101
Figure BDA0002139269340000111
Figure BDA0002139269340000121
Figure BDA0002139269340000131
Figure BDA0002139269340000141
Figure BDA0002139269340000151
Figure BDA0002139269340000161
Figure BDA0002139269340000171
优选地，本发明公开了选自下面的化合物：
表2
Figure BDA0002139269340000172
Figure BDA0002139269340000181
Figure BDA0002139269340000191
Figure BDA0002139269340000201
Figure BDA0002139269340000211
优选地，本发明公开了选自下面的化合物：
表3：
Figure BDA0002139269340000221
Figure BDA0002139269340000231
Figure BDA0002139269340000241
在另一个方面，本发明公开了一种组合物，其包含如上定义的式I、II或III的核苷类似物化合物或其盐(可药用盐)和喷司他丁。
优选地，所述组合物由虫草素和喷司他丁组成；所述组合物由下列化合物之一和喷司他丁组成：
Figure BDA0002139269340000242
喷司他丁是一种脱氨酶抑制剂。本领域技术人员可根据需要选择其它脱氨酶抑制剂。
在另一个方面，本发明公开了下式的前药：
Figure BDA0002139269340000251
优选地，所述前药选自：
Figure BDA0002139269340000252
在另一个方面，本发明公开了下式的修饰化合物：
Figure BDA0002139269340000253
优选地，所述修饰化合物选自：
Figure BDA0002139269340000254
在另一个方面，本发明公开了一种用于调节昼夜节律、优选用于昼夜节律相移的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的如上定义的式I、式II或式III的核苷类似物化合物或其盐(可药用盐)。
优选地，所述化合物在Per2-Luc峰时施用，但不在谷时施用。
在另一个方面，本发明公开了一种用于调节昼夜节律、优选用于昼夜节律相移的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含如上定义的式I、式II或式III的核苷类似物化合物或其盐(可药用盐)和喷司他丁。
优选地，所述组合物由虫草素和喷司他丁组成；所述组合物由下列化合物之一和喷司他丁组成：
Figure BDA0002139269340000261
优选地，所述组合物在Per2-Luc峰时施用，但不在谷时施用。
喷司他丁是一种脱氨酶抑制剂。本领域技术人员可根据需要选择其它脱氨酶抑制剂。
在另一个方面，本发明公开了一种用于调节昼夜节律、优选用于昼夜节律相移的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的下式的前药：
Figure BDA0002139269340000271
优选地，所述前药选自：
Figure BDA0002139269340000272
在另一个方面，本发明公开了一种用于调节昼夜节律、优选用于昼夜节律相移的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的下式的修饰化合物：
Figure BDA0002139269340000273
优选地，所述修饰化合物选自：
Figure BDA0002139269340000274
Figure BDA0002139269340000281
在另一个方面，本发明公开了如上定义的下式I、II或III的核苷类似物化合物或其盐(可药用盐)在制造用于调节昼夜节律、优选用于昼夜节律相移的药物中的应用。
在另一个方面，本发明公开了包含如上定义的下式I、II或III的核苷类似物化合物或其盐(可药用盐)和喷司他丁的组合物在制造用于调节昼夜节律、优选用于昼夜节律相移的药物中的应用。
优选地，所述组合物由虫草素和喷司他丁组成；所述组合物由下列化合物之一和喷司他丁组成：
Figure BDA0002139269340000282
在另一个方面，本发明公开了下式的前药在制造用于调节昼夜节律、优选用于昼夜节律相移的药物中的应用。
Figure BDA0002139269340000283
优选地，所述前药选自：
Figure BDA0002139269340000291
在另一个方面，本发明公开了下式的修饰化合物在制造用于调节昼夜节律、优选用于昼夜节律相移的药物中的应用。
Figure BDA0002139269340000292
优选地，所述修饰化合物选自：
Figure BDA0002139269340000293
优选地，所述药物可用于治疗时差、轮班工作、年龄相关的睡眠障碍或昼夜节律钟相关的睡眠障碍。
本发明的化合物或本发明的组合物可与常规载体和赋形剂一起配制，所述载体和赋形剂将根据常规实践进行选择。因此，本发明的化合物或本发明的组合物可以配制成适于肠内施用、静脉内施用、口服施用或舌下施用的制剂。
药物也可以与其它药剂例如咖啡因、褪黑素、唑吡坦、艾司佐匹克隆、扎来普隆或三唑仑组合。
所述对象是遭受时差、轮班工作、年龄相关的睡眠障碍或生物钟相关的睡眠障碍或有遭受这些风险的人。
在另一个方面，本发明公开了本发明的核苷类似物在调节CDK9、从而在改变所述生物钟相位中的应用。
在另一个方面，本发明公开了RUVBL解旋酶在调节虫草素介导的Per2-dLuc诱导和生物钟相移中的应用，以及RUVBL解旋酶作为虫草素的直接靶标的应用，其中RUVBL解旋酶是本发明公开的核苷类似物化合物的靶标。RUVBL解旋酶可以是RUVBL1解旋酶或RUVBL2解旋酶。也就是说，RUVBL可以用作改变所述生物钟相位的本发明核苷类似化合物的靶标。
本发明包括本文所列举的特定实施方式的所有组合，如同每个都被单独地、不辞辛苦地列举一样。
本发明包括本文所列举的特定实施方式的所有组合。
附图简述
图1显示了腺苷样化合物虫草素重置所述生物钟相位。
图2显示了虫草素在小鼠中诱导体内Per2表达并调节生物钟相位行为。
图3显示了Ruvbl2作为改变所述生物钟相位的虫草素靶标。
图4显示了DRB对E-box基因转录的快速诱导。
图5显示了Ruvbl2直接与Bmal1和Cry1相互作用。
图6显示了虫草素破坏Cry2和RUVBL2与Per2基因座结合。
图7显示了在用戊巴比妥作为阳性对照的腹膜内(I.P.)注射后脑脊液(CSF)中的虫草素浓度。
具体实施方式
为了更好地理解本发明并显示如何实现本发明，以下仅仅作为示例来参考附图。详细地具体参考附图，要强调的是，所显示的细节仅作为示例和为了说明性讨论本发明的优选实施方式，并且是为了提供被认为最有用且容易地理解本发明原理和概念方面的内容而介绍的。
本文所用的短语“可药用盐”包括但不限于硫酸盐，柠檬酸盐，乙酸盐，草酸盐，氯化物，溴化物，碘化物，硝酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，酸式磷酸盐，乳酸盐，酸式柠檬酸盐，酒石酸盐，油酸盐，丹宁酸盐，泛酸盐，酒石酸氢盐，抗坏血酸盐，琥珀酸盐，马来酸盐，龙胆酸盐(gentisinate)，富马酸盐(fummarate)，葡萄糖酸盐，葡萄糖醛酸盐(glucaronate)，蔗糖盐，甲酸盐，苯甲酸盐，谷氨酸盐，甲烷磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐，苯磺酸盐和甲磺酸盐。
术语“治疗有效量”是指有效调节昼夜节律相位以便单独或与其他药物例如咖啡因、褪黑素、唑吡坦、艾司佐匹克隆、扎来普隆或三唑仑一起治疗时差、轮班或年龄相关的睡眠障碍的量。
本发明的组合物也可包括可药用的赋形剂。合适的赋形剂或载体和制备可施用组合物的方法是本领域技术人员已知的。
本发明提供了一类核苷类似物化合物、和包含所述化合物和喷司他丁的组合物，它们在调节昼夜节律、优选昼夜节律相移中的应用，以及通过所述化合物或所述组合物调节昼夜节律、优选昼夜节律相移的方法。
CDK9由该基因编码的蛋白质是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)家族的成员。该激酶被发现是多蛋白复合物TAK/P-TEFb的组分，其是RNA聚合酶II指导的转录的延伸因子，并通过使RNA聚合酶II的最大亚基的C末端结构域磷酸化来起作用。该蛋白与它的调节亚基细胞周期蛋白T或细胞周期蛋白K形成复合物并受其调节。
RUVBL2该基因编码细菌RuvB基因的第二人类同源物。细菌RuvB蛋白是DNA解旋酶，对于同源重组和DNA双链断裂修复是必不可少的。功能分析表明，该基因产物兼具ATP酶和DNA解旋酶活性。具有单链DNA刺激的ATP酶和ATP依赖性DNA解旋酶(5’至3’)活性；六聚化被认为是ATP水解的关键，并且环状结构中的相邻亚基有助于所述ATP酶活性。
实施例：
方法和试剂.
化学合成：除非另有说明，否则所有反应均在氮气或氩气的惰性气氛下进行。DMF、DMSO按来样使用(99.9％，特干)。除非另有说明，否则所有其他试剂均为商业购买的并按来样使用。用Bruker光谱仪记录NMR光谱。1H(400MHz)和NMR化学位移相对于内部TMS(δ＝0.00ppm)或残留的质子化(protiated)溶剂进行报告。如下介绍数据：化学位移(ppm)，多重性(s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，sept＝七重峰，m＝多重峰，br＝宽)，耦合常数J(Hz)和积分。
细胞培养，药物处理和昼夜节律振荡的实时监测：将Per2-Luc报告器U2OS细胞(D15)和Bmal1-Luc报告器U2OS细胞(C26)保持在补充有10％FBS(Gibco)和1％青霉素链霉素混合物(Gibco)的DMEM培养基(Gibco)中。对于用生物节律性光度测定仪(Lumicycle)(Actimetrics)监测的昼夜节律振荡，将细胞以106/3.5cm培养皿(Z688851-30EA)的密度接种。细胞接种后2天，将培养基更换为XM培养基(PH7.2，10mMHEPES，350mg/l碳酸氢盐，1XB27，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素，10μg/ml庆大霉素，和100μM d-荧光素)。然后用高真空油脂(Dow Corning)和显微镜盖玻片密封3.5cm培养皿，并转移到放置在培养箱(37℃)中的生物节律性光度测定仪(Lumicycle)中。对于药物处理，在指定时间快速从生物节律性光度测定仪(Lumicycle)中取出3.5cm培养皿。在将化学品加入培养基中后，将培养皿再次密封并放回到生物节律性光度测定仪(Lumicycle)中。对于用Tecan(Perkinelmer)监测的昼夜节律振荡，将细胞以0.25×4/孔的密度接种于384孔板(CLS3610-48EA)。2天后，将培养基更换为有或没有喷司他丁(5μg/ml)的有不同化学品的预混合XM培养基。然后将该板用密封膜(Sangon Biotech)密封并放入Tecan中。在Tecan光度计中于37℃收集来自细胞的数据5～7天。
生物素酰化化合物下拉，SPR分析和免疫沉淀：生物素酰化化合物与其靶蛋白之间的相互作用如下进行。收集每108个未同步的U2OS细胞，均化到2ml裂解缓冲液(25mM MOPSpH7.2，15mM EGTA，15mM MgCl2，1mM DTT，60mMβ-甘油磷酸，1mM Na3VO4，1mM NaF，1mM磷酸苯酯，完全蛋白酶抑制剂混合物(Complete Protease Inhibitor Cocktail))中，并用Diagenode bioruptor在4℃下进行30s的超声处理6次。超声处理后，添加NP-40(最终0.5％)，在冰上温育15分钟，在4℃下全速离心20分钟。将所得上清液首先与喷司他丁(终浓度为5μg/ml)一起在4℃下旋转温育2小时，然后分成4组。分别添加200pmol虫草素、200pmolDRB、和DMSO(2组，最终0.1％％)并进一步温育1小时。最后，添加200pmol生物素-虫草素或200pmol生物素-DRB并温育至少4小时。用50μl链霉亲和素琼脂糖分离生物素酰化的化合物相互作用的蛋白质。用洗涤缓冲液(50mM Tris pH7.4，250mM NaCl，5mM EDTA，5mM EGTA，0.1％NP-40，5mM NaF，完全蛋白酶抑制剂混合物(Complete Protease InhibitorCocktail))洗涤5次后，用50μl加样缓冲液煮沸链霉亲和素琼脂糖。洗脱的蛋白用Western印迹分析。使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)在室温下通过SPR技术测量虫草素对RUVBL2蛋白的结合亲和力。将RUVBL2蛋白在CM5芯片上富集在10mM乙酸钠(pH4.5)中，并通过胺偶联方法固定。所述系统用HBSP+缓冲液(pH7.4)平衡。在结合阶段，将连续稀释的化合物以10μL/min的流速注入120秒。在解离阶段，将所述缓冲液流动180秒或600秒。用BIA评价软件(GE healthcare)确定虫草素对RUVBL2蛋白的结合动力学和结合亲和力。对于共免疫沉淀，严格按照制造商的说明用lipofectamine 3000(#L3000015，Thermo Fisher)转染HEK293T细胞。将2μg或1μg质粒DNA转染到6孔板(0.4μg pCDNA3.1-FLAG-BMAL1，0.7μgpCDNA3.1-FLAG-CLOCK，0.2μg pCDNA3.1-HA-CRY1，0.1μg pGL3-P(Dbp):dluc和0.6μgpCDNA3.1-EGFP)或12孔板(分别为0.5μg pCDNA3.1-HA-RUVBL2和0.5μg pCDNA3.1-FLAG-BMAL1/CRY1/CDK9)的每个孔中。转染后48小时，添加DMSO或虫草素(100μM)并温育1小时。然后用IP裂解缓冲液(#87787，Pierce，对于6/12孔板的每个孔，500μl/300μl)收获细胞，用Diagenode bioruptor在4℃下8次超声处理30秒，在冰上温育15分钟，在4℃下全速离心10分钟，最后收集上清液作为细胞裂解液。所有裂解液用FLAG(#M20018，Abmart)或HA(#M20013，Abmart)缀合的琼脂糖在4℃下伴旋转进行免疫沉淀过夜。然后将免疫沉淀的蛋白复合物用IP裂解缓冲液洗涤3次，煮沸并用Western印迹分析。
组织培养，药物处理和昼夜节律振荡的实时监测：将8周龄雄性mPer2荧光素酶敲入小鼠以颈椎脱臼法处死。然后在无菌罩中用含有70％乙醇的棉花擦拭皮肤和颈部。对于SCN切片培养，首先用剪刀从头部取下眼球，去头并切开皮肤。然后打开头骨，除去所有骨头，直到可以看到嗅球，切断嗅球和半球之间的视神经，最后将完整的大脑收获到冰冷的HBSS中。在HBSS中通过去除小脑和嗅球来修整大脑。通过胶水将大脑粘着到样品托盘，使吻突向上并且腹面最靠近切割刀片，然后立即用冰冷的HBSS填充托盘并将托盘设置到振动切片机。将振动切片频率设置到最大值，将速度设置为中等。为了快速到达SCN区域，开始切下的较厚切片应该是500-800μm。当视神经交叉变宽时，将切片厚度减小到100μm。当两个SCN核开始出现时，用移液管收集切片并在解剖显微镜下检查切片。最后将已修整的核转移到有1.2mlxm培养基的3.5cm培养皿中的培养膜(MILLIPORE)上，去除膜上的HBSS，用高真空油脂(Dow Corning)和显微镜盖玻片密封，转移到放在(37℃)培养箱内的生物节律性光度测定仪(Lumicycle)中。对于肝切片培养，打开身体并将整个肝脏收集到冰冷的HBSS中。洗涤两次以清除血液，用剪刀沿着边缘修剪肝脏并将肝脏条收集到装有冰冷HBSS的新皿中。用2个交叉刀片从肝脏条上制作薄片。最后将肝切片转移到如前面对SCN切片培养描述的生物节律性光度测定仪(Lumicycle)中。组织切片的药物处理与对U2OS细胞的描述相同。将培养切片置于生物节律性光度测定仪(Lumicycle)光度计中再记录5～7天。用生物节律性光度测定仪(Lumicycle)分析软件提取和分析数据。
药物注射和体内成像分析：将mPer2荧光素酶敲入小鼠圈养在无菌动物设备(GermFree Animal Facility)中，在12小时明/暗光周期下，食物和水不限。将8周龄雄性mPer2荧光素酶敲入小鼠腹膜内注射15mg/kg bw CA03或DMSO。CA03首先溶解在DMSO中至浓度为200μg/μl，然后用盐水稀释至终浓度1000μg/ml用于腹膜内注射。1小时后，腹膜内注射d-荧光素(Gold Bio.)。相对荧光素酶活性在IVIS Lumina III系统上成像，并用体内成像软件(PerkinElmer)分析。然后对肝脏取样以进行进一步的RNA提取和前mRNA水平的qPCR分析。动物实验程序由北京生命科学研究所(National Institute of Biological Sciences)的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Usage Committee)(IACUC)批准。所有动物实验程序均按照北京生命科学研究所的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行。
总RNA提取和前mRNA分析：来自肝脏的总RNA在用DMSO或15mg/kg bw处理后1小时用QIAGEN Rneasy Mini Kit(74104，Qiagen)提取，然后用RNase-Free DNase Set(79254，Qiagen)消化以去除DNA残留。将500ng总RNA用PrimeScriptTM RT Master Mix(Takara，RR036A)逆转录成cDNA。为了比较前mRNA水平，来自DMSO和CA03处理的样品的等量cDNA RNA在BioRad CFX96仪器上使用SYBR Green Master Mix(Kapa Biosystems，KP-KK4601)分析。每个基因用整个基因的多个引物分析，并且扩增产物是内含子的或跨内含子–外显子连接的。仅使用具有良好熔解曲线的引物。为了定量，将DMSO处理的样品中的基因表达用作对照，通过比较性Ct方法计算CA03处理的样品中的相对基因表达。
HPLC-MASS分析CSF：8W SD大鼠从Beijing Vital River购买，在控制温度和湿度的SPF设备中单只饲养，随意获取食物和水。将动物在12小时明/暗光周期下调节节奏两周，以使小鼠的内源性生物钟与环境明暗周期同步，光强度为约50～100lux。同步后，将CA03(15mg/kg/BW，首先溶于DMSO至浓度为200μg/μl，然后用盐水稀释至终浓度为1000μg/ml)和Pro CA03(15mg/kg/BW，首先在DMSO中溶解至浓度为200μg/μl，然后用2％吐温80(在无菌水中)稀释至终浓度1000μg/ml)通过尾静脉在CT6(1pm)施用。然后将这些动物通过30％CO2和70％O2麻醉(药物注射后1分钟、5分钟或10分钟)，躺下以使头部与身体形成接近135度角。通过使用0.45mm静脉注射针从小脑延髓池收集CSF。然后将收集的CSF置于冰上，添加4倍体积的冷甲醇并涡旋2分钟，以14,000g 4℃离心15min。将含有代谢物的上清液转移到新的1.5ml试管中，然后放入-80℃1小时，然后以14,000g 4℃离心15min。最后，将每个450μl上清液收集到新的1.5ml试管中，用SpeedVac干燥并用HPLC-MASS设备进行分析。
方法：Agilent 1290-Agilent 6495QqQ，Agilent Eclipse XDB C18 column(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A：10mM乙酸铵水溶液；流动相B：MeCN；流速：0.3mL/min；梯度：5％B(0-0.5min)，5-25％B(0.5-5.00min)，25-60％B(5.00-7.00min)，60-70％B(7.00-9.00min)，70％B(9.00-11.00min)，70-5％B(11.00-11.10min)，5％B(11.10-13.00min)。
所有动物实验程序均按照北京生命科学研究所的动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行。
跑轮实验：7周龄的雄性C57Bj/6小鼠购自南京大学南京生物医药研究院(NanjingBiomedical Research Institute of Nanjing University)，从Jackson实验室引进，单只圈养在控制温度和湿度的SPF设备中的跑轮笼中，随意获取食物和水。将动物在12小时明/暗光周期下调节节奏两周，以使小鼠的内源性生物钟与环境明暗周期同步，光强度为约50～100lux。在同步之后，将明暗周期以8小时相位提前或相位延迟。在明暗周期前移的当天，将小鼠首先在CT 3禁食，然后在CT 12腹膜内注射15mg/kg bw CA03、15和30mg/kg bw pro-CA03、15和30mg/kgbw pro-CA04或DMSO，并且开灯时间(CT 0)从早上7点变为晚上11点，最后在旧明暗周期的CT 23时再次喂食并再次注射药物。将CA03和pro-CA04首先溶解在DMSO中至浓度为200μg/μl，然后用盐水稀释至终浓度1000μg/ml用于腹膜内注射。将Pro-03首先溶解在DMSO中至浓度为200μg/μl，然后用2％吐温80(在无菌水中)稀释至终浓度1000μg/ml用于腹膜内注射。在明暗周期移位延迟的当天，将小鼠首先在ZT 3禁食，然后在CT 12腹膜内注射15mg/kg bw CA03、15和30mg/kg bw pro-CA03、15和30mg/kg bw pro-CA04或DMSO，并且关灯时间(CT12)从晚上7点变为早上3点，最后在旧明暗周期的CT 23时再次喂食并再次注射药物。在10分钟箱内跑轮(Actimetrics)中记录运动活性，并使用Clocklab软件(Actimetrics)分析所获得的数据。所有动物实验程序均按照北京生命科学研究所的动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行。
实施例1
核苷类似物调节生物钟相位
本发明人使用人骨肉瘤U2OS细胞系进行化学筛选，以发现调整哺乳动物细胞内生物钟相位的小分子。在初筛中，本发明人使用带有在Per2或Bmal1启动子控制下的荧光素酶基因的两个U2OS报告系(名为Per2-dLuc或Bmal1-dLuc细胞)，并在这两种细胞系中设定了至少6小时相变而没有明显幅度降低的阈值。结果，这些严格的标准过滤掉了大多数不可再现的假阳性。在该研究中应用了由大约10,000个小分子组成的机构先导化学文库。引人注目的是，本发明人观察到一种反相位表型，其完全恢复了实时监测的两个生物钟基因的表达模式。该命中化合物，名为虫草素(即3'-脱氧腺苷)，当与培养基改变一起应用时，急剧且快速地改变Per2-dLuc的过程，同时Bmal1-dLuc报告因子在12小时后显示出差异。本发明人设定在该过程中施用所述化合物之前允许生物钟自由运行，以消除这种相变现象是由于培养基改变加上化合物作用的组合表型所致的可能性。本发明人发现，只有当在Per2-dLuc峰时而不是在谷时施加所述药物，所述振荡才能显示出剧烈的相变。此外，Bmal1-dLuc报告细胞当在谷时间(对应于峰处的Per2-dLuc)施用所述药物时显示相变，但整个过程没有发生任何变化，直到12小时后，此时出现双肩峰并因此将过程扭转了半个周期。因此，该相位翻转的初级响应是由于其在Per2中的变化，然后是Bmal1和其它生物钟基因(图1A)。
虫草素对昼夜节律钟具有明显的相位依赖效应，即当在Per2峰施加时Per2-dLuc相移12小时，而当在Per2谷施加时改变0小时。重要的是，虫草素当在Per2谷处施加时可以增加Per2-dLuc的振幅，这使得昼夜节律钟更加稳健(图1F和图1G)。
3-脱氮腺苷(DAA)、7-脱氮腺苷(杀结核菌素)、N6-苄基腺苷、5,6-二氯苯并咪唑-1-β-D-呋喃核糖苷(DRB)和修饰的类似物3'-(R)-腺苷，也各自能够以长达12小时的相变方式改变Per2-dLuc的过程。(图1E)
用过量的常规腺苷过量给药所述系统将完全阻止生物钟因这些类似物引起的相移，表明该机制不太可能是由于激活位于质膜上的腺苷受体的信号转导所致；而是由影响细胞内某些腺苷功能所致，因为细胞外培养基中过量的常规腺苷可能使腺苷转运蛋白饱和，从而阻止这些类似物进入细胞产生效应。阻断腺苷转运蛋白消除了虫草素诱导的相移和细胞进入，而腺苷受体抑制剂则不能。此外，本发明人确定腺苷脱氨酶抑制剂喷司他丁可以显着改善虫草素、3'-(R)-腺苷和其他几种虫草素类似物的效力，虽然喷司他丁本身根本不影响生物钟(图1C)。总之，这些结果揭示了腺苷衍生物在调整生物钟相位中的重要作用。
本发明人进一步研究了虫草素对组织钟的影响。令人信服的是，这种相移表型似乎是常见的，因为来自Per2::LUC敲入小鼠的用于离体培养的组织外植体，例如肝脏，都显示出相似的结果。重要的是，含有生物钟主要器官——视交叉上核(SCN)的脑切片也响应药物处理，产生振幅较低的显著相移(图1H)。
5,6-二氯苯并咪唑-1-β-D-呋喃核糖苷(DRB)，是从化学筛选中鉴定的另一种昼夜节律相移剂，具有与虫草素相比类似的相移性质，并且也可以改变SCN和肾生物钟的相位。用AID degron操纵DRB的充分表征的靶CDK9蛋白模拟了Per2-dLuc细胞中DRB的相移曲线。该结果显示CDK9直接参与昼夜节律相位调节。使用新生的seq实验，我们发现DRB处理抑制多数基因的表达，但在体外只激活含有E-box的基因(图4)。
接下来，本发明人试图确定是否可以在体内重获虫草素的生物钟效应。由于上述研究显示DRB可以激活E-box基因的表达，我们应用实时成像系统来显现观察敲入小鼠中Per2::Luc的诱导。小鼠在ZT4(ZT，定时器时间；ZT0开始开灯，ZT12开始关灯)时腹膜内(i.p.)注射虫草素。我们的结果表明荧光素酶信号早在药物施用后1小时内被诱导，表明Per2被诱导。为了确认Per2基因确实被上调，我们进行了qPCR测定以测量所有核心生物钟基因。我们发现大多数含有包括Per1、Per2、Dbp和Nr1d1的生物钟基因的E-box都被上调，而含有诸如Bmal1等的生物钟基因的非E-box、以及管家基因不变或下调。当测量新生RNA水平时，这一观察尤其正确，突出了如前提出的E-box基因中的一级诱导响应(图2B)。
为了进一步了解哪种蛋白可能介导虫草素对相位的影响，我们应用了化学遗传方法研究了介导虫草素诱导Per2-dLuc的基因。我们推断出转录调节在此事件中起主要作用，因此，我们应用了含有1529个转录因子和463个表观遗传(eipgenetic)因子的siRNA文库，并评价哪个(些)基因负责虫草素诱导的Per2-dLuc活化。我们发现，敲除约17个基因可以特异性地消除通过应用虫草素对Per2-dLuc的诱导，包括DNA解旋酶基因、RUVBL1和RUVBL2。敲除RUVBL2消除了虫草素诱导的相移。为了研究虫草素和RUVBL蛋白之间的物理相互作用，我们在U2OS细胞裂解液中使用生物素酰化的虫草素进行了下拉测定。在不存在游离虫草素化合物的情况下，所述生物素酰化的药物能够下拉RUVBL2蛋白；然而，在游离化合物存在下，所述相互作用被竞争掉。通过Biacore T200证实了虫草素和RUVBL2蛋白的直接相互作用。总之，这些数据证明RUVBL解旋酶是虫草素的直接靶标，并介导其诱导Per2-dLuc和生物钟效应(图3C&D)。
另一个解旋酶基因，FRH，是链孢霉中可能的核心生物钟组分{Cheng，2005}，我们试图确定RUVBL基因是否也可能是哺乳动物系统的生物钟组分。敲除RUVBL1或RUVBL2会导致生物钟中断，表明它们是U2OS单元中正确生物钟功能所需的。我们随后进行了瞬时荧光素酶测定{Sato，2006}，并证明这两种基因都足以调节CLOCK:BMAL1功能，特别是在CRY抑制剂存在下。因此，这些解旋酶可以影响生物钟。通常，生物钟基因可以被生物钟本身反向调节，意味着它们的表达模式在体内是节律性的{Hughes，2009}。此外，我们证明了RUVBL2可以与已知的生物钟蛋白Bmal1、Clock和Cry1以及已知的转录延伸调节因子CDK9共免疫沉淀。这种相互作用似乎至少在Bmal1和RUVBL2之间是直接的，因为它们在纯化的蛋白质水平下可以相互地和特异性地彼此下拉(图5)。
人类和小鼠昼夜节律振荡器由互锁的转录和翻译反馈环驱动。Bmal1和Clock是转录因子，并且作为包括Per和Cry在内的活性阴性臂基因转录的阳性臂。Per和Cry是转录抑制因子，反馈抑制Bmal1/Clock的转录活性，从而抑制其自身的转录。使用共免疫沉淀实验，我们表明虫草素使Bmal1和Ruvbl2/Cry复合物之间的相互作用分离，从而减少Cry抑制以及激活Bmal1/Clock转录活性。我们还通过ChIP-qPCR实验证实了这一点。虫草素处理30分钟立即释放了结合在Per2基因启动子处的Cry1/2和Ruvb12。总之，这些数据证明虫草素从Per2启动子释放了Cry/Ruvbl2抑制复合物，激活Per2转录，然后诱导昼夜节律相移(图6)。
我们测量了腹膜内(I.P.)注射后脑脊液(CSF)中的虫草素浓度。注射后15分钟内可以在CSF中检测到虫草素，这表明虫草素能够渗透到大脑中。
在标准的时差方案{Yamaguchi，2013}下，野生型C57BL/6j小鼠通常要花～10天才能适应8小时相位提前。然而，在前两天连续注射虫草素(P<0.001，n＝18/组)或前药(P<0.001，n＝3/组)，适应性显著缩短至只有4天。类似地，药物处理的小鼠更快地适应相位延迟(图2D&2E)。
通过运动活性和电生理记录评价，施用虫草素还引起睡眠表型。这被认为是适应时差的积极副作用，时差导致的睡眠问题比觉醒方面的更多。腺苷受体A1和A2A在介导睡眠中发挥重要作用，并且充分表征的A2A拮抗剂咖啡因可以完全消除这种睡意的诱导{Huang，2005}，意味着我们的药物和咖啡因使用相同的信号传导通路来调节大脑中的睡眠-觉醒平衡。然而，即使在极高剂量下，咖啡因本身也不能改变细胞内的生物钟相位，表明我们的药物的相变机制不是通过腺苷受体。这项工作提供了直接和重要的实际应用，包括使用所公开的化合物来帮助遭受时差或轮班工作的人可以使用这种药物调整生物钟相位，同时协调睡眠-觉醒模式，特别是与咖啡因摄入相结合。
图1显示了腺苷样化合物虫草素重置生物钟相位。昼夜节律钟是基于反馈环的转录，然而不同的生物钟基因含有不同的顺式元件并且可能对相同的刺激显示出不同的响应。在Per2峰处(即Per2:luc峰和Bmal1:luc谷)的虫草素(100μM)处理时，Per2:luc和Bmal1:luc显示不同的响应。虫草素在人骨肉瘤U2OS细胞中影响Per2:luc的动力学比影响Bmal1:luc更快(A)。这表明Per2是第一个响应基因，并将虫草素的效应引入TTFL并引起相移。由于与腺苷密切相似的结构和通过阻止mRNA延伸来抑制转录的潜在功能，我们测试了腺苷和其他脱氧核苷是否可以改变昼夜节律相位。结果显示，虫草素是腺苷的特异性衍生物，影响生物钟相位。虫草素，但不是常规腺苷，当在Per2:luc峰施用时，在U2OS细胞中诱导12小时相移(A)。注意，过量的腺苷抑制虫草素诱导的相位效应(A)，这表明虫草素可以利用腺苷代谢途径。因此，我们进一步测试了虫草素是否利用腺苷转运蛋白进入细胞或利用腺苷脱氨酶降解。当将100μM虫草素与腺苷转运蛋白抑制剂(10μM)或腺苷受体抑制剂(1μM 5-碘杀结核菌素)组合时，只有阻断腺苷转运蛋白抑制剂消除虫草素诱导的相移能力(B)。腺苷脱氨酶喷司他丁(5μg/ml)不影响生物钟相位，显著改善虫草素的效力(从25μM到0.18μM)(C)。与虫草素相比，当在Per2:luc峰应用时，其他修饰的核苷不能诱导相位效应(D)。除虫草素外，我们还合成并购买了几种可以使昼夜节律相移的虫草素样核苷，包括(3'R)-腺苷、3-脱氮腺苷(或DAA)、7-脱氮腺苷(或杀结核菌素)(E)。
在上述调查中，我们发现虫草素(虫草素样核苷)改变了昼夜节律相位，因此它可能看起来像昼夜节律授时剂(授时因子)。授时因子的一个突出特征是相位依赖性功能。因此，我们进一步测试了虫草素是否具有该特征。我们使用转录报告因子(Per2:luc U2OS细胞)翻译报告因子(Per2::LUC成年鼠成纤维细胞)模型来研究这一特征。将两种报告因子接种在3.5cm培养皿中，转移到生物节律性光度测定仪(Lumicycle)中，并从CT 0到CT 24每2小时用虫草素(Per2:luc U2OS细胞中100μM和Per2::LUC成年鼠成纤维细胞中25μM)处理。处理和数据分析3天后，我们在两种报告细胞中发现，虫草素显示出高度“进入时间”依赖性相变，当在CT10施加时12小时相移和在CT20施加时几乎0小时相移(F)。有趣的是，我们注意到虽然在CT20施加虫草素时有0小时相移，但振幅增加，这表明虫草素可以加强昼夜节律振荡器以及对于生物钟受损的老年人的潜在药物用途。为了测试这一点，我们在CT20用DMSO或25μM虫草素处理了基本衰弱的Per2::LUC成年鼠成纤维细胞。我们发现虫草素确实增加了振幅并维持生物钟稳健运行(G)。
我们进一步测试了虫草素是否可以改变来自Per2::LUC小鼠的离体培养物中的生物钟相位。我们选择肝脏培养切片作为外周生物钟报告器和SCN培养切片作为中央生物钟报告器。当在Per2::LUC峰处施用虫草素(100μM)时，两个报告器曲线立即下降10小时、然后逐渐反弹并显示近30小时的周期振荡，然后回到24小时周期并且DMSO处理的切片完全反相(H)。
图2显示了虫草素在小鼠中诱导体内Per2表达并调节生物钟相位行为。为了测试虫草素在体内是否起作用，我们首先通过将Per2：luc小鼠在腹膜内注射15mg/kg虫草素或DMSO后活体成像来测试荧光素酶信号水平。我们发现，与DMSO对照相比，虫草素在肝脏中诱导了大于4倍的荧光素酶信号增加(A)。该结果显示虫草素可在体内起作用并刺激Per2基因转录。我们还在肝脏中通过用qPCR测量前mRNA来再次确认核心生物钟基因的内源转录速率(B)。我们检查了RRE基因(包括Bmal1、Clock、Npas2、Cry1和Nfil3)、内参基因(包括Gapdh、Tbp和Actin)以及E-box基因(包括Per1、Per2、Dbp和Nr1d1)。我们为每个基因设计了至少2个引物。结果显示，虫草素处理抑制RRE基因和内参基因转录，但特异性活化E-box基因转录，尤其是Per2基因。先前评价虫草素的时差治愈能力，我们检测了虫草素及其前药pro-CA03是否可以穿透BBB。我们通过尾静脉注射虫草素或pro-CA03，按时间过程采样CSF，并用HPLC-MASS方法分析虫草素pro-CA03水平。结果清楚显示，尾静脉注射后，虫草素和pro-CA03立即穿透BBB并进入CSF，注射后1min达到峰浓度并逐渐降低。注意，pro-CA03比虫草素更稳定(C)。最后，我们用小鼠行为实验评价了虫草素、pro-CA03和Pro-CA04的时差治愈能力。野生型C57BL/6j小鼠通常需要～10天才能适应8小时的相位提前。令人鼓舞的是，当施用虫草素注射时，该适应时间缩短至仅4天(P<0.001，n＝18/组)(D，左图)。类似地，虫草素处理的小鼠能够显著更快地适应相位延迟测定，从DMSO处理组中的6天到虫草素处理组中的3天(P<0.001，n＝12/组)(D，右图)。Pro-CA03比对照组略微缩短了适应时间(E，左图)。Pro-CA04具有与虫草素相当的时差治愈能力，其在8相位提前后将适应时间从DMSO处理组中的10天缩短至近5天(图2E，右图)。
图3显示Ruvbl2作为改变生物钟相位的虫草素靶标：由于虫草素活化Per2:luc信号，我们使用化学-遗传学筛选方法来鉴定虫草素的可能靶蛋白。我们发现Ruvb12击倒后，消除了虫草素介导的Per2:luc诱导和相移(A)，这表明Ruvbl2介导了虫草素的Per2:luc诱导和相移功能。考虑到Ruvbl2是ATP依赖性解旋酶以及虫草素与ATP的结构相似性，Ruvbl2可能是虫草素的直接靶标。接下来我们使用生物素酰化化合物下拉和SPR实验来证实这一假设。DRB，一种众所周知的CDK9抑制剂，也可引起接近12小时的相移。为了证实DRB通过抑制CDK9诱导相移，我们将AID标签的CDK9(CDK9-AID)引入Per2:luc U2OS细胞以调节其蛋白水平。当在Per2:luc峰处用吲哚-3-乙酸突然降解CDK9蛋白时，相位改变了接近10小时(B)。这些结果显示CDK9直接调节昼夜节律相位。使用生物素-DRB作为阳性对照，我们成功地分离了CDK9，并且该结合可以与不含生物素的DRB竞争。我们怀疑，Ruvbl2可以用生物素-虫草素纯化，并且该结合也可以与不含生物素的虫草素竞争(C)。请注意，生物素-DRB可以下拉Ruvbl2并且生物素-虫草素可以下拉CDK9，这表明Ruvbl2和CDK9可能在同一复合物中。我们用SPR测定进一步证实了Ruvbl2和虫草素的直接结合。纯化的RUVBL2蛋白与虫草素分子以Kd值为约500nM结合(D)。因为Ruvbl2对于虫草素诱导Per2基因上调是必不可少的，我们接下来研究了核心生物钟蛋白和Ruvbl2之间的相互作用。使用共免疫沉淀，我们发现Ruvbl2与Bmal1、Cry1和CDK9相互作用(E)。Ruvbl2和Bmal1、或Cry1与Bmal1之间的相互作用可以被100μM虫草素解离，而Ruvb12与Cry1或CDK9之间的相互作用不会被虫草素解离(E)。总之，这些数据显示Ruvbl2是虫草素的直接靶标。虫草素通过调节Ruvbl2、Bmal1、Cry1和CDK9之间的蛋白-蛋白来诱导相移和Per2基因上调。
图4显示了DRB对E-box基因转录的快速诱导：U2OS细胞的新生前mRNA测序(新生-seq)的DRB处理时间序列分析以鉴定“一级”DRB响应基因。我们在我们的实验过程中实时监测Per2-dLuc表达并调整DRB的施用时间以与Per2-dLuc表达的峰和谷一致；然后我们在DRB施用后1、2和4小时后对培养物进行取样，并用nascent-seq进行分析(左图)。我们发现在DRB处理的细胞中表达的大多数基因的新合成mRNA的量在药物处理的第一小时内降低(蓝色)。引人注目的是，具有E-box特征的七个研究得最好的基因在DRB处理后都被上调，并且这些E-box基因中的六个(NR1D1、DBP、BHLHE41、BHLHE40、PER1和PER2，没有NR1D2)簇集成组，反映了在六个不同时间它们对治疗的响应的共性(红色)。对含有E-box基因的簇中的其他基因的检查揭示它还含有CDK9本身及其结合配偶体CCNT1。因此，也许部分抑制CDK9可能激活而不是抑制了E-box基因的转录。右图是含有E-box的生物钟基因(NR1D1和DBP)或不含有E-box的生物钟基因(BMAL1和CRY1)的UCSC基因组浏览器视图。
图5显示了Ruvbl2直接与Bmal1和Cry1相互作用：体外表达的RUVBL2蛋白可被纯BMAL1蛋白拉下。FL：全长；d2：RUVBL2蛋白的结构域2(解旋酶活性的调节结构域)缺失。
图6显示了虫草素破坏Cry2和RUVBL2与Per2基因座的结合：对PER2基因座的ChIP-qPCR分析显示，通过用DRB或虫草素处理解开了CRY2/RUVBL2的结合，而BMAL1的结合保持不变。
图7显示了在用戊巴比妥作为阳性对照的腹膜内(I.P.)注射后脑脊液(CSF)中的虫草素浓度。虫草素和戊巴比妥二者的标准浓度曲线显示在图(7A)中，图(7B)中显示了在HPLC分析中虫草素保留时间与戊巴比妥保留时间的比较。虫草素可以在注射后15分钟内在CSF中定量和定性地检测到(图7C)，这表明虫草素能够渗透到脑中。
实施例2典型化合物的合成
方法，试剂和生物活性数据.
化学合成：除非另有说明，否则所有反应均在氮气或氩气的惰性气氛下进行。DMF，DMSO(99.9％，特干)按来样使用。除非另有说明，否则所有其他试剂均为商业购买的并按来样使用。NMR光谱用Bruker光谱仪记录。1H(400MHz)和NMR化学位移相对于内部TMS(δ＝0.00ppm)或残留的质子化(protiated)溶剂报告。如下显示数据：化学位移(ppm)，多重性(s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，sept＝七重峰，m＝多重峰，br＝宽)，耦合常数J(Hz)和积分。
化合物的编号对应于表1中的编号。
化合物1的合成：
Figure BDA0002139269340000451
条件：i)0.2％HCl；ii)TBDPSCl，DMAP，吡啶；iii)咪唑，碘，三苯基膦，甲苯；iv)H2，Pd/C，三乙胺，乙酸乙酯，甲醇；v)乙酸，乙酸酐，浓H2SO4；vi)腺嘌呤，N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺，TMSOTf，乙腈；vii)K2CO3，甲醇，水。
步骤1：1,2-O-异亚丙基-D-呋喃木糖(中间体1)的合成[1]：
将1,2:3,5-二-O-异亚丙基-D-呋喃木糖(16.00g，69.49mmol)在0.2％HCl(200mL)中的悬液在室温下搅拌6小时，然后添加碳酸氢钠将pH值调节至8，减压蒸发溶剂，将残余物悬浮在水(150mL)中并用二氯甲烷(150mL×5)提取，经MgSO4干燥并浓缩，获得1,2-O-异亚丙基-D-呋喃木糖，为无色油状物(12.25g，收率92.69％)。质谱(ESI)m/z对C8H14O5[M+H]+191.08的计算值，实测值191.56。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)5.99(d，1H，J＝3.6Hz)，4.53(d，1H，J＝3.6Hz)，4.32-4.35(m，1H)，4.53(d，1H，J＝3.6Hz)，4.14-4.18(m，2H)，3.99-4.08(m，2H)，2.60(br s，1H)，1.73(br s，1H)，1.49(s，3H)，1.32(s，3H)。
步骤2：1,2-O-异亚丙基-5-[(叔丁基)-二苯基甲硅烷基]-D-呋喃木糖(中间体2)的合成：
在室温下向1,2-O-异亚丙基-D-呋喃木糖(12.25g，64.41mmol)在无水吡啶(250mL)中的溶液滴加TBDPSCl(20.04mL，77.29mmol)。将所述混合物加热到40℃并搅拌5h，然后添加H2O(5mL)淬灭反应，过滤所述混合物并减压浓缩滤液，将残余物悬浮在二氯甲烷(200mL)中，分别用H2O(200mL)和5％CuSO4水溶液(200mL)和盐水(200mL)洗涤，经MgSO4干燥，浓缩，残余物进行柱层析(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝9:1至1:1)，获得1,2-O-异亚丙基-5-[(叔丁基)-二苯基甲硅烷基]-D-呋喃木糖，为淡黄色油状物(23.77g，收率86.11％)。质谱(ESI)m/z对C24H32O5Si[M-H]-427.60的计算值，实测值427.75。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)7.66-7.73(m，4H)，7.39-7.45(m，6H)，6.01(d，1H，J＝3.6Hz)，4.55(d，1H，J＝3.6Hz)，4.37(m，1H)，4.10-4.13(m，2H)，4.01(d，1H，J＝3.2Hz)，1.47(s，3H)，1.33(s，3H)，1.05(s，9H)。
步骤3：3-去氧-3-碘-1,2-O-异亚丙基-5-[(叔丁基)-二苯基甲硅烷基]-D-呋喃核糖(中间体3)的合成：
将1,2-O-异亚丙基-5-[(叔丁基)-二苯基甲硅烷基]-D-呋喃木糖(23.77g，55.46mmol)在无水甲苯(500mL)中的溶液分别用咪唑(7.55g，110.92mmol)和三苯基膦(29.09g，110.9mmol)处理，之后，在0℃下分五次加碘(21.11g，83.19mmol)，然后将所述混合物加热回流过夜，并使其冷却至室温，添加30％过氧化氢(100mL)并搅拌1h时，用甲苯(100mL×2)提取所述无机溶液，收集所述有机溶液，分别用饱和碳酸氢钠(200mL)和盐水(200mL)洗涤，经MgSO4干燥，在石油醚/乙醇中重结晶以去除三苯基氧化膦，然后所述母液通过柱色谱(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝5:1)纯化，获得3-去氧-3-碘-1,2-O-异亚丙基-5-[(叔丁基)-二苯基甲硅烷基]-D-呋喃核糖，为无色油状物(20.83g，收率69.75％)。质谱(ESI)m/z对C24H31IO4Si[M+H]+的计算值539.50，实测值539.74。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)7.67-7.69(m，4H)，7.29-7.37(m，6H)，5.82(d，1H，J＝3.6Hz)，4.60(t，1H，J＝3.2Hz)，4.15-4.16(m，2H)，4.00(d，1H，J＝12.0Hz)，3.89(dd，1H，J1＝12.0Hz，J2＝1.6Hz)，1.50(s，3H)，1.33(s，3H)，1.03(s，9H)。
步骤4：3-去氧-1,2-O-异亚丙基-5-[(叔丁基)-二苯基甲硅烷基]-D-呋喃核糖(中间体4)的合成：
将3-去氧-3-碘-1,2-O-异亚丙基-5-[(叔丁基)-二苯基甲硅烷基]-D-呋喃核糖(20.83g，38.68mmol)的甲醇(180mL)和乙酸乙酯(20mL)溶液添加Pd/C(2.13g)和三乙胺(10.72mL)，将所述混合物在H2气氛下于32℃搅拌3h，然后使所述混合物冷却至室温，之后，添加硅藻土(20g)并过滤所述混合物，浓缩滤液并进行柱色谱(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝30:1)，获得3-去氧-1,2-O-异亚丙基-5-[(叔丁基)-二苯基甲硅烷基]-D-呋喃核糖(14.70g，收率92.10％)。质谱(ESI)m/z对C24H32O4Si[M+H]+的计算值413.60，实测值413.70。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)7.67-7.72(m，4H)，7.36-7.44(m，6H)，5.83(d，1H，J＝3.6Hz)，4.67-4.69(m，1H)，4.14-4.22(m，1H)，3.81(dd，1H，J1＝11.2Hz，J2＝4.0Hz)，3.75(dd，1H，J1＝11.2Hz，J2＝4.0Hz)，2.08(dd，1H，J1＝13.2Hz，J2＝4.8Hz)，1.87(ddd，1H，J1＝13.2Hz，J2＝10.4Hz，J3＝4.8Hz)，1.51(s，3H)，1.33(s，3H)，1.06(s，9H)。
步骤5：1,2,5-三-O-乙酰基-3-去氧-D-呋喃核糖(中间体5)的合成：
将3-去氧-1,2-O-异亚丙基-5-[(叔丁基)-二苯基甲硅烷基]-D-呋喃核糖(14.70g，35.63mmol)在乙酸酐(20.21mL，213.77mmol)中的溶液在0℃下滴加浓H2SO4(7.64mL，142.51mmol)，然后是乙酸(350ml)，使所述混合物温热至室温并搅拌16h，在剧烈搅拌下将所述混合物倒入冰水(500mL)中，然后用二氯甲烷(150mL×2)提取，合并有机溶液，分别用水(300mL)、饱和碳酸氢钠(300mL)、盐水(300mL)洗涤，经MgSO4干燥，浓缩并进行柱色谱(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝10:1至1:1)，获得1,2,5-三-O-乙酰基-3-去氧-D-呋喃核糖，为黄色油状物(4.80g，收率51.77％)。质谱(ESI)m/z对C11H16O7[M+H]+的计算值261.24，实测值261.70。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ(ppm)6.17(s，1H)，5.20(d，1H，J＝4.7Hz)，4.44-4.51(m，1H)，4.21(dd，1H，J1＝11.6Hz，J2＝3.6Hz)，2.10-2.13(m，2H)，2.09(s，3H)，2.08(s，3H)，2.07(s，3H)。
步骤6：2,5-二-O-乙酰基-3-去氧-β-D-呋喃核糖基-腺嘌呤(中间体6)的合成：
将腺嘌呤(66mg，0.49mmol)和1,2,5-三-O-乙酰基-3-去氧-D-呋喃核糖(128mg，0.49mmol)在无水乙腈(3mL)中的悬液添加N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(0.19mL，0.74mmol)并在室温下搅拌1h，然后添加TMSOTf(0.18mL，0.98mmol)。将所述混合物加热到80℃达3h，然后冷却至室温，添加饱和碳酸氢钠(2mL)以淬灭反应。之后，减压除去溶剂，将残余物悬浮在水(10mL)中并用二氯甲烷(10mL×3)提取，收集所述有机溶液并分别用水(30mL)和盐水(30mL)洗涤，经MgSO4干燥，并通过柱色谱纯化(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝1:0至3:7)，得到2,5-二-O-乙酰基-3-去氧-β-D-呋喃核糖基-腺嘌呤，为无色油状物(103mg，收率62.4％)。质谱(ESI)m/z对C14H17N5O5[M+H]+的计算值336.12，实测值336.42。
步骤7：3'-去氧-腺苷的合成：
将2,5-二-O-乙酰基-3-去氧-β-D-呋喃核糖基-腺嘌呤(103mg，0.31mmol)在50％甲醇水溶液(3mL)中的溶液用K2CO3(127mg，0.92mmol)处理。将所述混合物在室温下搅拌3h。真空除去溶剂，残余物通过制备型高效液相色谱纯化，得到3'-去氧-腺苷，为白色粉末(72mg，收率93％)。质谱(ESI)m/z对C10H13N5O3[M+H]+的计算值252.10，实测值252.04。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ(ppm)8.42(s，1H)，8.20(s，1H)，5.95(d，1H，J＝2.8Hz)，4.69-4.71(m，1H)，4.50-4.55(m，1H)，3.93(dd，1H，J1＝12.4Hz，J2＝2.8Hz)，3.66(dd，1H，J1＝12.4Hz，J2＝3.2Hz)，2.38(ddd，1H，J1＝13.2Hz，J2＝8.0Hz，J3＝6.0Hz)，2.03-2.09(m，1H)。
化合物2的合成：
Figure BDA0002139269340000481
条件：i)甲酸，105℃；ii)1,2,3,5-四-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖，N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺，TMSOTf，乙腈，75℃；iii)K2CO3，甲醇，H2O。
步骤1：5,6-二氯-1H-苯并[d]咪唑(中间体1)的合成[2]：
将4,5-二氯苯-1,2-二胺(1.00g，5.65mmol)的甲酸(5mL)溶液在密封管中加热到105℃达1h。所述混合物冷却至室温后，真空除去溶剂，给出粗产物，将其通过柱色谱纯化(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝10:1至5:1)，提供5,6-二氯-1H-苯并[d]咪唑，为浅棕色粉末(1.05g，收率99.1％)。质谱(ESI)m/z对C7H4Cl2N2[M+H]+的计算值185.98和187.97，实测值186.26，188.34。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ(ppm)12.73(br s，1H)，8.34(s，1H)，7.87(s，2H)。
步骤2：5,6-二氯-1-(2,3,5-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)-苯并咪唑(中间体2)的合成：
将5,6-二氯-1H-苯并[d]咪唑(600mg，3.21mmol)和1,2,3,5-四-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖(1.23g，3.85mmol)在无水乙腈(10mL)中的悬液用N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(1.16mL，4.81mmol)处理，将所述悬液在室温下搅拌2h，然后添加TMSOTf(1.16mL，6.42mmol)。将所述混合物加热到75℃达3h，然后冷却至室温。用饱和碳酸氢钠(5mL)淬灭后，所生成的溶液用二氯甲烷(10mL×3)提取，收集有机溶液并分别用水(30mL)和盐水(30mL)洗涤。所述溶液经MgSO4干燥，浓缩，残余物通过柱色谱纯化(硅胶，乙酸乙酯/甲醇＝1:0至20:1)，给出5,6-二氯-1-(2,3,5-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)-苯并咪唑，为无色油状物(670mg，收率46.9％)。质谱(ESI)m/z对C18H18Cl2N2O7[M+H]+的计算值445.05和447.05，实测值445.16和447.18。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)8.10(s，1H)，7.79(s，1H)，7.69(s，1H)，5.95(d，1H，J＝6.0Hz)，5.44(t，1H，J＝6.0Hz)，5.34(dd，1H，J1＝5.6Hz，J2＝3.6Hz)，4.38-4.42(m，2H)，4.29(dd，1H，J1＝13.2Hz，J2＝3.2Hz)，2.11(s，3H)，2.07(s，3H)，1.99(s，3H)。
步骤3：5,6-二氯-1-β-D-苯并咪唑核糖的合成：
向5,6-二氯-1-(2,3,5-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)-苯并咪唑(280mg，0.629mmol)的50％水性甲醇(4mL)溶液中缓慢添加K2CO3(434mg，3.14mmol)。将所述混合物在室温下搅拌20min。真空除去溶剂，残余物通过制备型柱色谱纯化(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝10:1至5:1)，产生5,6-二氯-1-β-D-苯并咪唑核糖，为白色粉末(125mg，收率62.3％)。质谱(ESI)m/z对C12H12Cl2N2O4[M+H]+的计算值319.02和321.01，实测值319.15和321.09。1HNMR(400MHz，d6-DMSO)δ(ppm)8.58(s，1H)，8.22(s，1H)，7.97(s，1H)，5.89(d，1H，J＝6.4Hz)，5.50(d，1H，J＝6.4Hz)，5.20-5.26(m，2H)，4.30(t，1H，J＝6.4Hz)，4.11(dd，1H，J1＝5.2Hz，J2＝3.2Hz)，3.99(dd，1H，J1＝5.6Hz，J2＝3.2Hz)，3.61-3.70(m，2H)。
化合物3的合成：
Figure BDA0002139269340000501
条件：i)CuSO4，浓H2SO4，丙酮；ii)乙酸酐，TsOH·H2O，乙酸；iii)腺嘌呤，SnCl4，乙腈；iv)K2CO3，甲醇，H2O。
步骤1：1,2:3,5-di-O-异亚丙基-D-呋喃木糖(中间体1)的合成[3]：
向D-木糖(10.00g，66.61mmol)和CuSO4(10.00g，62.66mmol)在丙酮(200ml)中的悬液滴加浓H2SO4(0.4ml)。将所述混合物在室温下搅拌16h。过滤出固体并用丙酮(50mL×3)洗涤残余物。将滤液用碳酸氢钠中和并过滤。真空除去溶剂，将残余物溶于二氯甲烷中，分别用饱和碳酸氢钠(100mL)、水(100mL)和盐水(100mL)洗涤，收集有机溶液并蒸发至干，得到1,2:3,5-二-O-异亚丙基-D-呋喃木糖，为无色油状物(13.30g，收率86.72％)。质谱(ESI)m/z对C11H18O5[M+H]+的计算值231.12，实测值231.20。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)5.99(d，1H，J＝4.0Hz)，4.53(d，1H，J＝3.6Hz)，4.33(d，1H，J＝2.0Hz)，4.14-4.18(m，2H)，4.04-4.08(m，1H)，1.49(s，3H)，1.45(s，3H)，1.38(s，3H)，1.33(s，3H)。
步骤2：1,2,3,5-四-O-乙酰基-D-呋喃木糖(中间体2)的合成：
将1,2:3,5-二-O-异亚丙基-D-呋喃木糖(12.72g，55.24mmol)的乙酸(275mL)溶液用乙酸酐(37.0mL，338mmol)和TsOH·H2O(1.26g，6.62mmol)处理。将所述混合物加热回流2h，然后倒入冰水(300mL)并用二氯甲烷(500mL×3)提取。收集有机溶液并分别用饱和碳酸氢钠(500mL)、H2O(500mL)和盐水(500mL)洗涤，经MgSO4干燥，通过柱色谱纯化(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝6:1至3:1)，提供1,2,3,5-四-O-乙酰基-D-呋喃木糖，为淡黄色油状物(11.40g，收率64.84％)。质谱(ESI)m/z对C13H18O9[M+H]+的计算值319.10，实测值319.26。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)6.10(s，1H)，5.36(dd，1H，J1＝5.6Hz，J2＝1.6Hz)，5.20(d，1H，J＝1.6Hz)，4.61-4.64(m，1H)，4.23-4.25(m，1H)，2.12(s，3H)，2.11(s，3H)，2.09(s，3H)，2.06(s，3H)。
步骤3：2,3,5-三-O-乙酰基-1-(6-氨基-嘌呤-9-基)-β-D-1-去氧-呋喃木糖(中间体3)的合成：
将1,2,3,5-四-O-乙酰基-D-呋喃木糖(2.24g，7.03mmol)和腺嘌呤(1.00g，7.40mmol)在无水乙腈(10mL)中的悬液在Ar保护下用SnCl4(1.73mL，14.8mmol)处理。将所述混合物在室温下搅拌过夜。搅拌后，用饱和碳酸氢钠(5mL)淬灭反应。真空除去溶剂，将残余物悬浮在水(20mL)中并用二氯甲烷(20mL×3)提取，收集有机溶液并分别用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤，经MgSO4干燥，并通过柱色谱进一步纯化(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝100:1至30:1)，得到2,3,5-三-O-乙酰基-1-(6-氨基-嘌呤-9-基)-β-D-1-去氧-呋喃木糖，为无色油状物(1.93g，收率69.7％)。质谱(ESI)m/z对C16H19N5O7[M+H]+的计算值394.13，实测值394.46。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ(ppm)8.49(s，1H)，8.35(s，1H)，6.20(d，1H，J＝3.2Hz)，5.76(m，1H)，5.49(dd，1H，J1＝4.8Hz，J2＝2.4Hz)，4.60(m，1H)，4.26-4.37(m，2H)，2.10(s，3H)，2.08(s，3H)，2.03(s，3H)。
步骤4：9-(β-D-呋喃木糖基)-腺嘌呤的合成：
将2,3,5-三-O-乙酰基-1-(6-氨基-嘌呤-9-基)-β-D-1-去氧-呋喃木糖(0.95g，2.42mmol)的50％水性甲醇(10mL)溶液用K2CO3(1.34g，9.66mmol)处理。将所述混合物在室温下搅拌20min。真空除去溶剂，将残余物通过柱色谱纯化(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝10:1至5:1)，获得9-(β-D-呋喃木糖基)-腺嘌呤，为白色粉末(448mg，收率69.4％)。质谱(ESI)m/z对C10H13N5O4[M+H]+的计算值268.10，实测值268.32。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ(ppm)8.26(s，1H)，8.15(s，1H)，7.31(br s，2H)，5.84-5.87(m，3H)，4.76(t，1H，J＝5.6Hz)，4.31(s，1H)，4.13-4.17(m，1H)，4.03(s，1H)，3.73-3.78(m，1H)，3.63-3.68(m，1H)。
化合物4的合成：
Figure BDA0002139269340000521
条件：i)环丙胺，异丙醇，120℃；ii)1,2,3,5-四-O-乙酰基-D-呋喃木糖，SnCl4，乙腈；iii)K2CO3，甲醇，H2O。
步骤1：6-(环丙胺基)-9H-嘌呤(中间体1)的合成[4]
将6-氯-9H-嘌呤(100mg，0.647mmol)和环丙胺(0.18ml，2.6mmol)在异丙醇(2mL)中的悬液在120℃下加热2h，然后将所述混合物冷却至室温并用乙醇重结晶以获得6-(环丙胺基)-9H-嘌呤，为白色粉末(102mg，收率90.0％)。质谱(ESI)m/z对C8H9N5[M+H]+的计算值176.09，实测值176.34。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ(ppm)11.51(br s，1H)，8.22，(s，1H)，8.15(br s，1H)，8.10(s，1H)，3.02(m，1H)，0.72(m，2H)，0.61(m，2H)。
步骤2和3根据化合物3的最后两个步骤进行，并获得9-(β-D-呋喃木糖基)-N6-环丙基-腺嘌呤，为白色粉末。质谱(ESI)m/z对C13H17N5O4[M+H]+的计算值308.13，实测值308.22。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ(ppm)8.31(s，1H)，8.29(s，1H)，5.97(d，1H，J＝1.6Hz)，4.45(t，1H，J＝2.0Hz)，4.31-4.35(m，1H)，4.19(dd，1H，J1＝4.0Hz，J2＝2.0Hz)，3.96(dd，1H，J1＝12.0Hz，J2＝4.4Hz)，3.90(dd，1H，J1＝12.0Hz，J2＝6.0Hz)，1.94-2.10(m，1H)，0.87-0.92(m，2H)，0.63-0.67(m，2H)。
化合物5的合成：
Figure BDA0002139269340000531
条件：i)1,2,3,5-四-O-乙酰基-D-呋喃木糖，SnCl4，乙腈；ii)K2CO3，甲醇，H2O。
化合物5根据化合物3的最后两个步骤合成，获得白色粉末。质谱(ESI)m/z对C11H11Cl2N3O4[M+H]+的计算值320.01和322.01，实测值319.89和321.94。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ(ppm)8.69(s，1H)，7.50(s，1H)，6.13(d，1H，J＝1.2Hz)，4.44(t，1H，J＝1.6Hz)，4.39-4.43(m，1H)，4.22(dd，1H，J1＝3.6Hz，J2＝1.6Hz)，4.00(dd，1H，J1＝10.0Hz，J2＝3.2Hz)，3.96(dd，1H，J1＝10.0Hz，J2＝4.0Hz)。
化合物6的合成：
Figure BDA0002139269340000532
条件：i)乙酸酐，DMAP，吡啶；ii)4-氨基-吡咯并[2,3-d]嘧啶，SnCl4，乙腈；iii)K2CO3，甲醇，H2O。
步骤1：1,2,3,4-四-O-乙酰基-D-吡喃木糖(中间体1)的合成：
向D-木糖(1.00g，6.66mmol)和DMAP(163mg，1.33mmol)在吡啶(15mL)中的溶液滴加乙酸酐(5.0mL，53mmol)。将所生成的溶液在室温下搅拌16h，然后添加饱和碳酸氢钠(20mL)以淬灭反应，之后，减压蒸发溶剂并将残余物悬浮在水(40mL)中并用二氯甲烷(40mL×3)提取，收集有机溶液，分别用饱和碳酸氢钠(40mL)、水(40mL)和盐水(40mL)洗涤，经MgSO4干燥，通过柱色谱纯化(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝5:1)，得到1,2,3,4-四-O-乙酰基-D-吡喃木糖，为无色油状物(1.33g，收率62.3％)。质谱(ESI)m/z对C13H18O9[M+H]+的计算值319.10，实测值319.42。
步骤2：2,3,4-三-O-乙酰基-1-(4-氨基-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-β-D-1-去氧-吡喃木糖(中间体2)的合成：
将1,2,3,4-四-O-乙酰基-D-吡喃木糖(107mg，0.336mmol)和4-氨基-吡咯并[2,3-d]嘧啶(45mg，0.34mmol)在无水乙腈(3mL)中的悬液在氩气保护下用SnCl4(0.080mL，0.67mmol)处理，所生成的溶液在室温下搅拌过夜，然后用饱和碳酸氢钠(3mL)淬灭。减压除去溶剂，残余物用二氯甲烷(5mL×3)提取，收集有机溶液并分别用水(5mL)和盐水(5mL)洗涤，经MgSO4干燥，通过柱色谱纯化(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝50:1)，获得2,3,4-三-O-乙酰基-1-(4-氨基-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-β-D-1-去氧-吡喃木糖，为无色油状物(87mg，收率66％)。质谱(ESI)m/z对C17H20N4O7[M+H]+的计算值392.13，实测值392.01。
步骤3：1-(4-氨基-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-β-D-1-去氧-吡喃木糖的合成：
将2,3,4-三-O-乙酰基-1-(4-氨基-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-β-D-1-去氧-吡喃木糖(87mg，0.22mmol)在50％甲醇水溶液(2mL)中的溶液用K2CO3(123mg，0.887mmol)处理。将所述混合物在室温下搅拌20min。真空除去溶剂，将残余物通过柱色谱纯化(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝10:1)，得到1-(4-氨基-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-β-D-1-去氧-吡喃木糖(49mg，收率83％)。质谱(ESI)m/z对C11H14N4O4[M+H]+的计算值266.10，实测值266.03。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ(ppm)8.32(s，1H)，7.22(d，1H，J＝2.8Hz)，6.62(d，1H，J＝2.8Hz)，5.73(d，1H，J＝9.6Hz)，4.07(dd，1H，J1＝11.2Hz，J2＝5.6Hz)，4.01(t，1H，J＝9.2Hz)，3.80(m，1H)，3.53-3.57(m，2H)。
化合物7的合成：
Figure BDA0002139269340000551
条件：i)1,2,3,5-四-O-乙酰基-D-呋喃木糖，SnCl4，乙腈；ii)K2CO3，甲醇，H2O
化合物7根据化合物3的最后两个步骤合成，获得白色粉末。质谱(ESI)m/z对C11H11Cl2N3O4[M+H]+的计算值319.02和321.02，实测值319.29和321.31。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ(ppm)8.49(s，1H)，8.03(s，1H)，7.81(s，1H)，5.89(d，1H，J＝2.0Hz)，4.36-4.40(m，1H)，4.33(t，1H，J＝2.0Hz)，4.23(dd，1H，J1＝4.0Hz，J2＝2.0Hz)，3.93-4.00(m，2H)。
化合物8的合成：
Figure BDA0002139269340000552
条件：i)D-(+)-生物素，EDC，DMAP，DMF.
步骤1：5'-O-生物素基-3'-去氧-腺苷的合成：
将3'-去氧-腺苷(25mg，0.10mmol)和D-(+)-生物素(48mg，0.20mmol)在无水DMF(1mL)中的溶液分别用DMAP(25mg，0.20mmol)和EDC(39mg，0.20mmol)处理，所述混合物在室温下搅拌2h。减压除去溶剂，残余物用二氯甲烷(2mL×3)提取，收集有机溶液并分别用H2O(4mL)和盐水(4mL)洗涤，经MgSO4干燥，并通过制备型HPLC进一步纯化，获得5'-O-生物素基-3'-去氧-腺苷，为白色粉末(12mg，收率25％)。质谱(ESI)m/z对C20H27N7O5S[M+H]+的计算值478.18，实测值478.41。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ(ppm)8.27(s，1H)，8.22(s，1H)，6.01(s，1H)，4.68-4.72(m，1H)，4.45-4.48(m，1H)，4.36-4.38(m，2H)，4.26-4.29(m，1H)，3.11-3.15(m，1H)，2.88(dd，1H，J1＝12.8Hz，J2＝4.8Hz)，2.67-2.70(m，2H)，2.39-2.41(m，1H)，2.33(t，2H，J＝7.2Hz)，2.28(s，1H)，2.08-2.12(m，1H)，1.58-1.71(m，3H)，1.38-1.42(m，2H)。
化合物9的合成：
Figure BDA0002139269340000561
条件：i)TBDPSCl，吡啶；ii)D-(+)-生物素，EDC，DMAP，DMF；iii)TBAF，THF。
步骤1：3'-去氧-5'-O-[(叔丁基)-二苯基甲硅烷基]-腺苷(中间体1)的合成：
将3'-去氧-腺苷(105mg，0.418mmol)在无水吡啶(3mL)中的溶液用TBDPSCl(0.22mL，0.836mmol)处理并在40℃下搅拌6h，然后添加H2O(3mL)淬灭反应，之后，除去溶剂并将残余物用二氯甲烷(5mL×3)提取，收集有机溶液并分别用H2O(20mL)和盐水(20mL)洗涤，经MgSO4干燥，通过柱色谱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝3:1)而提供3'-去氧-5'-O-[(叔丁基)-二苯基甲硅烷基]-腺苷，为白色粉末(174mg，收率85.0％)。质谱(ESI)m/z对C26H31N5O3Si[M+H]+的计算值490.22，实测值490.53。
步骤2：2'-O-生物素基-3'-去氧-5'-O-[(叔丁基)-二苯基甲硅烷基]-腺苷(中间体2)的合成：
将3'-去氧-5'-O-[(叔丁基)-二苯基甲硅烷基]-腺苷(174mg，0.355mmol)和D-(+)-生物素(100mg，0.408mmol)的无水DMF(4mL)溶液分别用DMAP(25mg，0.204mmol)和EDC(157mg，0.817mmol)处理，将混合物在室温下搅拌2h。减压除去溶剂并将残余物用二氯甲烷(5mL×3)提取，收集有机溶液并分别用H2O(15mL)和盐水(15mL)洗涤，经MgSO4干燥，并进一步通过柱色谱纯化(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝30:1至15:1)，获得2'-O-生物素基-3'-去氧-5'-O-[(叔丁基)-二苯基甲硅烷基]-腺苷，为白色粉末(203mg，收率79.8％)。质谱(ESI)m/z对C36H45N7O5SSi[M+H]+的计算值716.30，实测值716.02。
步骤3：2'-O-生物素基-3'-去氧-腺苷的合成：
将2'-O-生物素基-3'-去氧-5'-O-[(叔丁基)-二苯基甲硅烷基]-腺苷(203mg，0.284mmol)的无水THF(2.5mL)溶液用TBAF(146mg，0.559mmol)处理，将所生成的溶液在室温下搅拌1h，然后真空除去溶剂，将残余物在DMSO/甲醇中重结晶，给出2'-O-生物素基-3'-去氧-腺苷，为白色粉末(95.7mg，收率70.7％)。质谱(ESI)m/z对C20H27N7O5S[M+H]+的计算值478.18，实测值478.05。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ(ppm)8.34(s，1H)，8.14(s，1H)，7.33(s，2H)，6.43(s，1H)，6.37(s，1H)，6.06(d，1H，J＝1.6Hz)，5.62(d，1H，J＝6.4Hz)，5.15(t，1H，J＝5.6Hz)，4.29-4.33(m，2H)，3.65-3.68(m，1H)，3.50-3.53(m，1H)，3.06-3.11(m，1H)，2.82(dd，1H，J1＝12.4Hz，J2＝4.8Hz)，2.54-2.59(m，2H)，2.37(t，1H，J＝7.6Hz)，2.11(dd，1H，J1＝12.8Hz，J2＝4.8Hz)，1.41-1.61(m，4H)，1.30-1.35(m，2H)。
化合物10的合成：
Figure BDA0002139269340000571
条件：i)TBSCl，咪唑，DMF；ii)D-(+)-生物素，EDC，HOBt，DMF；iii)TBAF，THF。
步骤1：9-[2,5-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-去氧-β-D-呋喃核糖基]腺嘌呤(中间体1)的合成：
将3'-去氧-腺苷(67mg，0.26mmol)的DMF(3mL)溶液添加咪唑(91mg，1.33mmol)和TBSCl(96mg，0.64mmol)，所生成的混合物在室温下搅拌过夜，之后，减压蒸发溶剂，将残余物悬浮在饱和碳酸氢钠(3mL)中并用二氯甲烷(3mL×3)提取，收集有机溶液并用水(5mL)和盐水(5mL)洗涤，经MgSO4干燥，并通过色谱进一步纯化(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝3:1)，获得9-[2,5-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-去氧-β-D-呋喃核糖基]腺嘌呤，为无色油状物(52mg，收率41％)。质谱(ESI)m/z对C22H41N5O3Si2[M+H]+的计算值480.27，实测值480.12。
步骤2：9-[2,5-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-去氧-β-D-呋喃核糖基]-N6-生物素基-腺嘌呤(中间体2)的合成：
将9-[2,5-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-去氧-β-D-呋喃核糖基]腺嘌呤(52mg，0.11mmol)的DMF(3mL)溶液添加EDC(31mg，0.16mmol)和HOBt(22mg，0.16mmol)，所述混合物在室温下搅拌30min，然后添加D-(+)-生物素(26mg，0.11mmol)，所生成的溶液在室温下再搅拌4h，减压蒸发溶剂，将残余物悬浮在水(3mL)中并用二氯甲烷(3mL×3)提取，收集有机溶液并用饱和碳酸氢钠(3mL)、水(3mL)和盐水(3mL)洗涤，经MgSO4干燥，通过色谱纯化(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝3:1)，获得9-[2,5-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-去氧-β-D-呋喃核糖基]-N6-生物素基-腺嘌呤，为无色油状物(38mg，收率50％)。质谱(ESI)m/z对C32H55N7O5SSi2[M+H]+的计算值706.35，实测值706.14。
步骤3：3-去氧-β-D-呋喃核糖基-N6-生物素基-腺嘌呤的合成
将9-[2,5-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-去氧-β-D-呋喃核糖基]-N6-生物素基-腺嘌呤(38mg，0.054mmol)的无水THF(3mL)溶液用TBAF(28mg，0.11mmol)处理，所述混合物在室温下搅拌4h，减压除去溶剂，并将残余物进行制备型HPLC，获得3-去氧-β-D-呋喃核糖基-N6-生物素基-腺嘌呤，为白色粉末(11mg，收率43％)。质谱(ESI)m/z对C20H27N7O5S[M+H]+的计算值478.18，实测值478.51。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ(ppm)8.69(s，1H)，8.65(s，1H)，6.43(s，1H)，6.36(s，1H)，6.00(s，1H)，5.75(s，1H)，5.40(m，1H)，5.08(m，1H)，4.61(m，1H)，4.31(m，1H)，4.15(m，1H)，3.71-3.72(m，1H)，3.52(m，1H)，3.11-3.14(m，1H)，2.94(m，1H)，2.83(dd，1H，J1＝13.2Hz，J2＝4.4Hz)，2.67(m，1H)，2.51-2.57(m，2H)，2.33(m，1H)，1.59-1.71(m，2H)，1.23-1.55(m，4H)。
化合物11的合成：
Figure BDA0002139269340000591
条件：i)D-(+)-生物素，EDC，DMAP，DMF。
使用化合物8的方法用4.0eq的D-(+)-生物素、4.0eq的EDC和4.0eq的DMAP并在40℃搅拌4h，合成化合物11。获得3',5'-双-O-生物素基-3'-去氧-腺苷，为白色粉末。质谱(ESI)m/z对C30H41N9O7S2[M+H]+的计算值703.26，实测值703.08。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ(ppm)。
化合物12的合成：
Figure BDA0002139269340000592
条件：i)丙酮，对甲苯磺酸；ii)D-(+)-生物素，EDC，DMAP，DMF；iii)80％乙酸水溶液，80℃。
步骤1：5,6-二氯-1-(2',3'-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)-苯并咪唑(中间体1)的合成：
将5,6-二氯-1-β-D-苯并咪唑核糖(100mg，0.313mmol)在丙酮(15mL)中的悬液用对甲苯磺酸(178mg，0.940mmol)处理，所述混合物在室温下搅拌2h并在0℃下倒入10％Na2CO3溶液(15mL)中，真空蒸发溶剂，残余物用乙酸乙酯(20mL×3)提取，收集有机溶液并分别用H2O(20mL)和盐水(20mL)洗涤，经MgSO4干燥，并通过柱色谱进一步纯化(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝20:1)，提供5,6-二氯-1-(2',3'-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)-苯并咪唑，为白色粉末(62mg，收率55％)。质谱(ESI)m/z对C15H16Cl2N2O4[M+H]+的计算值359.05和361.05，实测值359.26和361.18。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)8.26(s，1H)，7.68(s，1H)，7.62(s，1H)，5.95(d，1H，J＝3.2Hz)，5.21，(br s，1H)，5.04(dd，1H，J1＝6.4Hz，J2＝2.0Hz)，4.97(dd，1H，J1＝6.0Hz，J2＝3.2Hz)，4.54(q，1H，J＝2.4Hz)，3.99(dd，1H，J1＝12.0Hz，J2＝2.0Hz)，3.86(dd，1H，J1＝12.0Hz，J2＝2.4Hz)，1.66(s，3H)，1.40(s，3H)。
步骤2：5,6-二氯-1-(5'-O-生物素基-2',3'-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)-苯并咪唑(中间体2)的合成：
将5,6-二氯-1-(2',3'-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)-苯并咪唑(62mg，0.17mmol)的无水DMF(5mL)溶液分别添加DMAP(11mg，0.086mmol)和EDC(67mg，0.35mmol)，将所生成的溶液在室温下搅拌2h。减压除去溶剂，残余物用乙酸乙酯(5mL×3)提取，收集有机溶液并分别用H2O(5mL)和盐水(5mL)洗涤，经MgSO4干燥，并通过柱色谱进一步纯化(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝20:1)，获得5,6-二氯-1-(5'-O-生物素基-2',3'-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)-苯并咪唑，为白色粉末(71mg，收率70％)。质谱(ESI)m/z对C25H30Cl2N4O6S[M+H]+的计算值585.13和587.12，实测值585.32和587.47。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)8.09(s，1H)，7.92(s，1H)，7.63(s，1H)，6.20(s，1H)，5.94(d，1H，J＝3.2Hz)，5.52(s，1H)，4.94(dd，1H，J1＝6.4Hz，J2＝3.2Hz)，4.86(dd，1H，J1＝6.4Hz，J2＝3.2Hz)，4.55(q，1H，J＝3.2Hz)，4.45-4.47(m，1H)，4.34(dd，1H，J1＝12.4Hz，J2＝3.2Hz)，4.30(dd，1H，J1＝12.4Hz，J2＝3.6Hz)，4.25(ddd，1H，J1＝8.0Hz，J2＝4.8Hz，J3＝1.2Hz)，3.07(ddd，1H，J1＝8.0Hz，J2＝6.8Hz，J3＝4.8Hz)，2.87(dd，1H，J1＝12.4Hz，J2＝4.8Hz)，2.70(d，1H，J＝12.4Hz)，2.21-2.31(m，2H)，2.03(s，1H)，1.53-1.70(m，7H)，1.34-1.42(m，5H)。
步骤3：5,6-二氯-1-(5'-O-生物素基-β-D-呋喃核糖基)-苯并咪唑的合成：
将5,6-二氯-1-(5'-O-生物素基-2',3'-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)-苯并咪唑(71mg，0.12mmol)的80％水性乙酸(5mL)溶液在80℃下搅拌过夜，然后减压除去溶剂，并将残余物进行柱色谱(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝4:1)，提供5,6-二氯-1-(5'-O-生物素基-β-D-呋喃核糖基)-苯并咪唑，为白色粉末(32mg，收率48％)。质谱(ESI)m/z对C22H26Cl2N4O6S[M+H]+的计算值545.10和547.09，实测值545.37和547.29.1H NMR(400MHz，CD3OD)δ(ppm)8.44(s，1H)，7.94(s，1H)，7.88(s，1H)，5.95(d，1H，J＝5.6Hz)，4.42-4.49(m，2H)，4.32-4.38(m，2H)，4.21-4.25(m，2H)，3.10(ddd，1H，J1＝9.2Hz，J2＝6.0Hz，J3＝4.8Hz)，2.86(dd，1H，J1＝12.8Hz，J2＝5.2Hz)，2.67(d，1H，J＝12.8Hz)，2.34-2.47(m，2H)，1.56-1.71(m，4H)，1.39-1.43(m，2H)。
化合物13-15的合成：
Figure BDA0002139269340000611
条件：i)D-(+)-生物素，EDC，DMAP，DMF。
化合物13-15根据化合物8的方法使用4.0eq的D-(+)-生物素、4.0eq的EDC和4.0eq的DMAP合成。获得5'-O-生物素基-9-(β-D-呋喃木糖基)-腺嘌呤，为白色粉末，质谱(ESI)m/z对C20H27N7O6S[M+H]+的计算值494.17，实测值494.23。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ(ppm)8.34(s，1H)，8.21(s，1H)，6.00(d，1H，J＝1.6Hz)，4.44-4.51(m，5H)，4.26(dd，1H，J1＝8.0Hz，J2＝4.4Hz)，4.20(s，1H)，3.14-3.16(m，1H)，2.90(dd，1H，J1＝12.8Hz，J2＝4.8Hz)，2.68(d，1H，J＝12.8Hz)，2.38(t，2H，J＝7.2Hz)，1.54-1.74(m，4H)，1.42-1.48(m，2H)。获得2'-O-生物素基-9-(β-D-呋喃木糖基)-腺嘌呤，为白色粉末，质谱(ESI)m/z对C20H27N7O6S[M+H]+的计算值494.17，实测值494.35。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ(ppm)8.34(s，1H)，8.21(s，1H)，6.09(d，1H，J＝2.0Hz)，5.39(t，1H，J＝2.0Hz)，4.49(ddd，1H，J1＝8.0Hz，J2＝4.8Hz，J3＝0.8Hz)，4.37(dd，1H，J1＝4.0Hz，J2＝1.6Hz)，4.26-4.31(m，2H)，3.96(dd，1H，J1＝12.0Hz，J2＝4.4Hz)，3.90(dd，1H，J1＝12.0Hz，J2＝6.0Hz)，3.17-3.22(m，1H)，2.93(dd，1H，J1＝12.8Hz，J2＝4.8Hz)，2.71(d，1H，J＝12.8Hz)，2.46(t，2H，J＝7.2Hz)，1.58-1.75(m，4H)，1.43-1.49(m，2H)。获得2',5'-双-O-生物素基-9-(β-D-呋喃木糖基)-腺嘌呤，为白色粉末，质谱(ESI)m/z对C30H41N9O8S2[M+H]+的计算值720.25，实测值720.35。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ(ppm)8.34(s，1H)，8.22(s，1H)，6.12(s，1H)，5.38(d，1H，J＝1.6Hz)，4.45-4.52(m，4H)，4.39(s，1H)，4.26-4.32(m，2H)，3.14-3.23(m，2H)，2.89-2.96(m，2H)，2.70(dd，2H，J1＝12.4Hz，J2＝8.0Hz)，2.48(t，2H，J＝7.2Hz)，2.37(dt，4H，J1＝15.6Hz，J2＝8.0Hz)，1.57-1.77(m，8H)，1.43-1.51(m，4H)。
化合物16的合成：
Figure BDA0002139269340000621
条件：i)5,6-二氯-1H-苯并[d]咪唑，N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺，TMSOTf，乙腈，ii)K2CO3，甲醇，水。
化合物16使用化合物1的最后两个步骤中的方法合成，获得5,6-二氯-1-β-D-呋喃木糖基苯并咪唑，为白色粉末。质谱(ESI)m/z对C12H12Cl2N2O3[M+H]+的计算值303.14和305.14，实测值303.34和305.51。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ(ppm)8.64(s，1H)，7.96(s，1H)，7.80(s，1H)，5.90(d，1H，J＝1.2Hz)，4.50-4.56(m，1H)，3.93(dd，1H，J1＝12.4Hz，J2＝2.8Hz)，3.69(dd，1H，J1＝12.4Hz，J2＝3.6Hz)，2.26-2.33(m，1H)，1.99-2.05(m，1H)。
化合物17的合成[5]：
Figure BDA0002139269340000622
条件：i)2-乙酰氧基异丁酰溴，乙腈，H2O。
步骤1：9-(2,3-脱水-β-D-呋喃核糖基)腺嘌呤的合成
将腺苷(3.00g，11.2mmol)在无水乙腈(45mL)中的悬液添加H2O(0.04mL)和2-乙酰氧基异丁酰溴(1.8mL，12.4mmol)，所生成的混合物在室温下搅拌2h，添加乙酸乙酯(30mL)并将所述混合物用饱和NaHCO3(25mL×2)洗涤，水相用乙酸乙酯(15mL×5)再提取，将有机溶液合并，经MgSO4干燥，减压除去溶剂，残余物溶于无水甲醇中，添加OH-树脂，将所述混合物在室温下搅拌2h直至形成沉淀，加热所述混合物，获得澄清溶液，过滤树脂并用热甲醇洗涤，滤液通过色谱进一步纯化(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝20:1)，获得9-(2,3-脱水-β-D-呋喃核糖基)腺嘌呤，为白色粉末(2.02g，收率72.2％)。质谱(ESI)m/z对C10H11N5O3[M+H]+的计算值250.09，实测值250.38。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ(ppm)8.34(s，1H)，8.17(s，1H)，7.34(s，2H)，6.21(s，1H)，5.09(t，1H，J＝5.2Hz)，4.45(d，1H，J＝2.8Hz)，4.22(d，1H，J＝2.8Hz)，4.18(t，1H，J＝5.2Hz)，3.52-3.58(m，2H)。
化合物18的合成：
根据参考文献6合成化合物18。
化合物19的合成：
根据参考文献7合成化合物19。
化合物20的合成：
根据参考文献8合成化合物20。
化合物21的合成[9]：
Figure BDA0002139269340000631
条件：i)a.丙酮，浓H2SO4，CuSO4，b.TBSCl，DMAP，三乙胺，二氯甲烷，c.CCl4，HMPT，THF；ii)NaH，4-氯-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶，乙腈；iii)90％TFA水溶液；iv)NH3，甲醇，120℃。
步骤1：2,3-O-异亚丙基-5-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-α-D-呋喃核糖基氯(中间体1)的合成：
在室温下将D-核糖(10.00g，66.6mmol)的无水丙酮(200mL)溶液添加浓H2SO4(0.5mL)和CuSO4(21.26g，133mmol)，所生成的混合物在37℃下搅拌40h，然后过滤并用丙酮(20mL)洗涤。滤液用Ca(OH)2中和并搅拌15min，之后，将混合物再次过滤，滤液减压蒸发至干，将其溶于无水二氯甲烷(20mL)中并用三乙胺(11.1mL，79.9mmol)、DMAP(977mg，7.99mmol)处理。将溶液冷却至0℃并滴加TBSCl(12.05g，79.9mmol)的二氯甲烷(40mL)溶液，然后使混合物温热至室温并搅拌过夜并减压浓缩，将残余物悬浮在水(50mL)中并用二氯甲烷(50mL×3)提取，经MgSO4干燥并通过色谱纯化(硅胶，戊烷/乙醚＝9:1)，获得5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2,3-O-异亚丙基-D-呋喃核糖(6.72g，31.2％from D-核糖，22.1mmol)，将其溶于无水THF(100mL)中并添加CCl4(2.6mL，26.5mmol)，搅拌所述溶液并冷却至-78℃，然后在20min的时间内逐滴添加HMPT(3.9mL，22.1mmol)，添加完成后将所生成的溶液升温至-40℃并保持2h，减压除去溶剂，将残余物悬浮在乙醚/石油醚(1:1)中并过滤，蒸发滤液，获得粗2,3-O-异亚丙基-5-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-α-D-呋喃核糖基氯，为橙色油状物，将其溶于无水乙腈(20mL)中并直接用于下一步。
步骤2：4-氯-2,3-O-异亚丙基-5-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-7-(β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(中间体2)的合成：
在0℃将4-氯-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(100mg，0.651mmol)的无水乙腈(5mL)溶液添加NaH(60％，在矿物油中，29mg，0.72mmol)，所生成的溶液在室温下搅拌30min，然后在氩气保护下添加上述在步骤1中获得的溶液(2mL)，将所生成的溶液升温至室温并搅拌40h，将所述混合物倒入冰水(用10mL)中并用二氯甲烷(15mL×3)提取，合并有机溶液并用饱和NH4Cl水溶液(20mL)和盐水(20mL)洗涤，经MgSO4干燥并真空浓缩，残余物通过色谱纯化(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝9:1)，获得4-氯-2,3-O-异亚丙基-5-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-7-(β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶，为淡黄色油状物(152mg，收率53.1％)。质谱(ESI)m/z对C20H30ClN3O4Si[M+H]+的计算值440.17和442.17，实测值440.43和442.51，
步骤3：4-氯-7-(β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(中间体3)的合成：
在0℃下将4-氯-2,3-O-异亚丙基-5-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-7-(β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(152mg，0.345mmol)溶于90％TFA水溶液(5mL)中，并将所述溶液在室温下搅拌1h，然后蒸发至干。残余物溶于甲醇(3mL)中并蒸发至干，并重复该过程3次以除去痕量的TFA。残余物通过色谱纯化(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝10:1)，获得4-氯-7-(β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶，为淡黄色粉末(91mg，收率92.2％)。质谱(ESI)m/z对C11H12ClN3O4[M+H]+的计算值286.05和288.05，实测值286.38和288.09。
步骤4：杀结核菌素的合成：
将4-氯-7-(β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(91mg，0.319mmol)在密封管中溶于7M甲醇氨(10mL)并加热至120℃过夜，然后使溶液冷却，减压除去溶剂。残余物进行制备型HPLC，给出杀结核菌素，为浅黄色粉末(52mg，收率60.6％)。质谱(ESI)m/z对C11H14N4O4[M+H]+的计算值267.10，实测值267.02。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ(ppm)8.03(s，1H)，7.33(d，1H，J＝3.6Hz)，7.02(br s，2H)，6.58(d，1H，J＝3.6Hz)，5.96(d，1H，J＝6.4Hz)，5.30(t，1H，J＝6.4Hz)，5.25(d，1H，J＝6.4Hz)，5.09(d，1H，J＝4.8Hz)，4.42(q，1H，J＝6.4Hz)，4.05-4.07(m，1H)，3.86-3.92(m，1H)，3.62(ddd，1H，J1＝12.0Hz，J2＝4.8Hz，J3＝3.6Hz)，3.50(ddd，1H，J1＝12.0Hz，J2＝4.8Hz，J3＝3.6Hz)。
化合物22的合成：
Figure BDA0002139269340000661
化合物22使用与化合物21相同的策略合成，获得5-碘杀结核菌素，为淡黄色粉末。质谱(ESI)m/z对C11H13IN4O4[M+H]+的计算值393.00，实测值393.28。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ(ppm)8.11(s，1H)，7.66(s，1H)，6.66(br s，2H)，6.00(d，1H，J＝6.4Hz)，5.31(d，1H，J＝6.4Hz)，5.14(t，1H，J＝6.0Hz)，5.11(d，1H，J＝5.2Hz)，4.34(dt，1H，J1＝6.4Hz，J2＝4.8Hz)，4.06(dt，1H，J1＝4.8Hz，J2＝3.2Hz)，3.88(q，1H，J＝3.6Hz)，3.62(ddd，1H，J1＝12.0Hz，J2＝4.8Hz，J3＝4.0Hz)，3.53(ddd，1H，J1＝12.0Hz，J2＝6.0Hz，J3＝4.0Hz)。
化合物23的合成：
Figure BDA0002139269340000662
化合物23根据化合物4的方法同时在第一步骤中使用苄胺并在第二步骤中使用1,2,3,5-四-O-乙酰基-D-呋喃核糖而合成。获得N6-苄基腺苷，为白色粉末。质谱(ESI)m/z对C17H19N5O4[M+H]+的计算值358.14，实测值358.02。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ(ppm)8.45(brs，1H)，8.37(s，1H)，8.20(s，1H)，7.29-7.34(m，4H)，7.20(t，1H，J＝7.2Hz)，5.89(d，1H，J＝6.0Hz)，5.43(d，1H，J＝6.4Hz)，5.36(dd，1H，J1＝7.2Hz，J2＝4.8Hz)，5.17(d，1H，J＝4.8Hz)，4.71(br s，1H)，4.62(ddd，1H，J1＝6.4Hz，J2＝6.0Hz，J3＝4.8Hz)，4.15(ddd，1H，J1＝4.8Hz，J2＝4.4Hz，J3＝3.2Hz)，3.97(dt，1H，J1＝3.6Hz，J2＝3.2Hz)，3.67(ddd，1H，J1＝12.0Hz，J2＝4.8Hz，J3＝3.2Hz)，3.55(ddd，1H，J1＝12.0Hz，J2＝7.6Hz，J3＝3.2Hz)。
化合物24的合成：
Figure BDA0002139269340000671
化合物24根据化合物3的方法，同时使用3-脱氮腺嘌呤和1,2,3,5-四-O-乙酰基-D-呋喃核糖合成。获得3-脱氮腺苷，为浅黄色粉末。质谱(ESI)m/z对C11H14N4O4[M+H]+的计算值267.10，实测值267.45。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ(ppm)8.29(s，1H)，7.67(d，1H，J＝5.6Hz)，6.90(d，1H，J＝5.6Hz)，6.11(br s，2H)，5.75(d，1H，J＝6.0Hz)，5.41(d，1H，J＝6.4Hz)，5.16(d，1H，J＝4.8Hz)，5.05(t，1H，J＝5.2Hz)，4.31-4.33(m，1H)，4.08-4.12(m，1H)，3.96-3.98(m，1H)，3.57-3.67(m，2H)。
化合物25的合成：化合物25根据参考文献10合成。
化合物26的合成：化合物26根据参考文献11合成。
化合物27的合成：化合物27使用与化合物23相同的策略合成。
化合物28的合成：化合物28使用与化合物1相同的策略合成。
化合物29的合成：化合物29根据参考文献12合成。
化合物30的合成：化合物30根据参考文献10合成。
化合物31的合成：化合物31使用与化合物25相同的策略合成。
化合物32的合成：这是2-脱氧-腺苷，删除～
化合物33的合成：化合物33使用与化合物1相同的策略合成。
化合物34的合成：化合物34根据参考文献13合成。
化合物35的合成：化合物35使用与化合物1相同的策略合成。
化合物36-38的合成根据参考文献14合成。
化合物39的合成：化合物39根据参考文献15合成。
化合物40的合成：化合物40使用与化合物10相同的策略合成。
化合物41的合成：化合物41使用与化合物12相同的策略合成。
化合物42的合成：化合物42根据参考文献16合成。
化合物43的合成：化合物43根据参考文献17合成。
化合物44-45的合成使用与化合物25相同的策略合成。
化合物46的合成：化合物46根据参考文献18合成。
化合物47的合成：化合物47使用与化合物22相同的策略合成。
化合物48-54的合成使用与化合物3相同的策略合成。
化合物55的合成：化合物55使用与化合物6相同的策略合成。
化合物56-59的合成使用与化合物3相同的策略合成。
化合物60的合成：化合物60使用与化合物6相同的策略合成。
化合物61-69的合成使用与化合物3相同的策略合成。
化合物70的合成：化合物70使用与化合物12相同的策略合成。
化合物71-74的合成使用与化合物1相同的策略合成。
化合物75的合成：化合物75使用与化合物6相同的策略合成。
化合物76的合成：化合物76使用与化合物14相同的策略合成。
化合物77-78的合成使用与化合物1相同的策略合成。
化合物79的合成使用与化合物6相同的策略合成。
化合物80的合成：化合物80根据参考文献19合成。
化合物81-82的合成使用与化合物1相同的策略合成。
化合物83-93的合成使用与化合物3相同的策略合成。
化合物94的合成：
Figure BDA0002139269340000681
条件：i)TBSCl，咪唑，DMF；ii)辛酰氯，EDC，HOBt，DMF；iii)TBAF，THF。
步骤1：9-[2,5-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-去氧-β-D-呋喃核糖基]腺嘌呤(中间体1)的合成：
将3'-去氧-腺苷(67mg，0.26mmol)在DMF(3mL)中的溶液添加咪唑(91mg，1.33mmol)和TBSCl(96mg，0.64mmol)，所生成的混合物在室温下搅拌过夜，之后，减压蒸发溶剂，将残余物悬浮在饱和碳酸氢钠(3mL)中并用二氯甲烷(3mL×3)提取，收集有机溶液并用水(5mL)和盐水(5mL)洗涤，经MgSO4干燥，并通过色谱进一步纯化(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝3:1)，获得9-[2,5-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-去氧-β-D-呋喃核糖基]腺嘌呤，为无色油状物(52mg，收率41％)。质谱(ESI)m/z对C22H41N5O3Si2[M+H]+的计算值480.27，实测值480.12。
步骤2：9-[2,5-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-去氧-β-D-呋喃核糖基]-N6-生物素基-腺嘌呤(中间体2)的合成：
将9-[2,5-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-去氧-β-D-呋喃核糖基]腺嘌呤(52mg，0.11mmol)在DMF(3mL)中的溶液添加EDC(31mg，0.16mmol)和HOBt(22mg，0.16mmol)，所述混合物在室温下搅拌30min，然后添加辛酰氯(18mg，0.11mmol)，所生成的溶液在室温下再搅拌4h，减压蒸发溶剂，将残余物悬浮在水(3mL)中并用二氯甲烷(3mL×3)提取，收集有机溶液并用饱和碳酸氢钠(3mL)、水(3mL)和盐水(3mL)洗涤，经MgSO4干燥，通过色谱纯化(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝3:1)给出9-[2,5-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-去氧-β-D-呋喃核糖基]-N6-生物素基-腺嘌呤，为无色油状物(38mg，收率50％)。质谱(ESI)m/z对C30H55N5O4Si2[M+H]+的计算值606.38，实测值606.14。
步骤3：3-去氧-β-D-呋喃核糖基-N6-生物素基-腺嘌呤的合成
将9-[2,5-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-去氧-β-D-呋喃核糖基]-N6-生物素基-腺嘌呤(38mg，0.054mmol)的无水THF(3mL)溶液用TBAF(28mg，0.11mmol)处理，所述混合物在室温下搅拌4h，减压除去溶剂，并将残余物进行制备型HPLC，给出3-去氧-β-D-呋喃核糖基-N6-生物素基-腺嘌呤，为白色粉末(11mg，收率43％)。
质谱(ESI)m/z对C18H27N7O4[M+H]+的计算值378.18，实测值378.51。
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ(ppm)10.62(brs，1H)，8.70(s，1H)，8.64(s，1H)，6.00(s，1H)，5.77(s，1H)，5.10(s，1H)，4.62(s，1H)，4.39-4.42(m，1H)，3.74-3.71(m，1H)，3.56-3.53(m，1H)，2.57-2.53(m，2H)，2.27-2.24(m，1H)，1.95(m，1H)，1.59-1.61(m，2H)，1.24-1.29(m，8H)，0.83-0.86(m，3H)。
化合物95的合成，N-辛酰基-CA04：
Figure BDA0002139269340000701
步骤1：2,3,5-三-O-乙酰基-1-(6-氨基-N-辛酰基-嘌呤-9-基)-β-D-1-去氧-呋喃木糖(中间体1)的合成：
在0℃和Ar2保护下向2,3,5-三-O-乙酰基-1-(6-氨基-嘌呤-9-基)-β-D-1-去氧-呋喃木糖(818mg，2.08mmol)的吡啶(10ml)溶液逐滴添加辛酰氯。然后所述混合物在室温下搅拌8小时。用饱和NaHCO3水溶液淬灭。然后将其浓缩并通过色谱进一步纯化(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝1:1)，给出中间体1，为无色油状物(771.3mg，收率：71.39％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.69(s，1H)，8.35(s，1H)，8.23(s，1H)，6.27(d，J＝2.4Hz，1H)，5.60–5.56(m，1H)，5.51(dd，J＝4.1，1.8Hz，1H)，4.65(dt，J＝6.5，4.5Hz，2H)，4.48–4.29(m，4H)，2.88(t，J＝7.6Hz，3H)，2.18(s，3H)，2.13(s，3H)，2.11(s，3H)，1.84–1.72(m，3H)，1.58(s，6H)，1.49–1.18(m，13H)，0.88(t，J＝6.9Hz，4H)。
步骤2：N-辛酰基-9-(β-D-呋喃木糖基)-腺嘌呤(pro-CA04)的合成：
将中间体1用K2CO3、MeOH和H2O处理。时间控制对于副产物(CA04)的产生最小化非常重要。30分钟是合适的。然后将其浓缩并通过色谱进一步纯化(硅胶，二氯甲烷/MeOH＝30:1)，给出pro-CA04，为白色粉末(200mg，收率：34.26％)。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.55(t，J＝11.2Hz，2H)，6.08(t，J＝10.0Hz，1H)，4.51–4.46(m，1H)，4.42–4.36(m，1H)，4.24(dd，J＝3.8，1.8Hz，1H)，4.02–3.91(m，2H)，2.63(t，J＝7.5Hz，2H)，1.72(dt，J＝15.1，7.5Hz，2H)，1.46–1.22(m，8H)，0.93–0.81(m，3H)。
化合物96的合成：
Figure BDA0002139269340000711
以类似于化合物CA04(NQZ-007)的合成中步骤3和步骤4中所用的方式。溶剂用硝基甲烷代替，其他条件相同。获得化合物15(4.1mg)，为白色固体。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.01(s，1H)，7.13(d，J＝0.7Hz，1H)，5.16–5.04(m，1H)，4.58–4.47(m，1H)，4.37(dd，J＝5.3，2.7Hz，1H)，3.67(ddd，J＝17.5，11.9，4.7Hz，2H)，2.21–2.09(m，2H)。
化合物97的合成：化合物97使用与化合物3相同的策略合成。
化合物98的合成：化合物98使用与化合物1相同的策略合成。
化合物99-103的合成使用与化合物3相同的策略合成。
化合物104的合成：化合物104使用与化合物1相同的策略合成。
化合物105的合成：化合物105使用与化合物3相同的策略合成。
化合物106的合成：化合物106使用与化合物1相同的策略合成。
化合物107、112和113：二吖嗪基-腺苷，二吖嗪基-CA03，二吖嗪基-CA04的合成
Figure BDA0002139269340000721
在管密封中向6-氯腺苷(56mg)的MeOH混浊液体添加一水合肼。将所述混合物加热至50℃并搅拌8小时。使所述混合物冷却至室温，然后真空浓缩，提供粗残余物，将其悬浮于MeOH中并在室温下搅拌。将从悬浮液中分离出的固体产物过滤，用MeOH洗涤并真空干燥，获得化合物117(46.5mg)。1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.35(s，1H)，8.24(s，1H)，5.88(t，J＝6.0Hz，1H)，5.43(s，2H)，5.22(s，1H)，4.76–4.40(m，3H)，4.14(dd，J＝4.8，3.1Hz，1H)，3.96(q，J＝3.5Hz，1H)，3.72–3.48(m，2H)，3.34(s，3H)。
以类似于化合物6的合成中步骤6所用的方式，合成中间体1和中间体2，然后将它们用一水合肼处理，给出化合物122和化合物123。
化合物108的合成：化合物108使用与化合物3相同的策略合成。
化合物的合成109：化合物109使用与化合物1相同的策略合成。
化合物的合成110：化合物110使用与化合物6相同的策略合成。
化合物的合成111：化合物111使用与化合物3相同的策略合成。
化合物的合成114：化合物114使用与化合物3相同的策略合成。
化合物115和116的合成：CA03-生物素接头-双吖丙啶(diazarine)
Figure BDA0002139269340000731
将3'-去氧-腺苷(20mg)悬浮在DMF(5ml)中，然后分别添加EDCI、DMAP和生物素接头。所述混合物在室温下搅拌8小时。通过UPLC-MS监测，在起始材料消失后，添加另一当量的EDCI和DMAP，然后加入双吖丙啶(diazirine)酸，将所述混合物在室温下再搅拌8小时。浓缩所述混合物并通过柱色谱(硅胶，乙酸乙酯/MeOH＝10:1)和PTLC乙酸乙酯/MeOH＝4:1)进一步纯化，给出化合物125&126混合物(1:1)。质谱(ESI)m/z对C40H61N11O11S[M+H]+的计算值904.43，实测值904.48。
化合物117的合成：化合物117使用与化合物116相同的策略合成。
化合物118的合成：
Figure BDA0002139269340000732
步骤1：1,2,3,4,5-五-O-乙酰基-D-呋喃葡糖(中间体1)的合成：
以类似于化合物5的合成中步骤2中所用的方式，将起始材料1,2:5,6-二-O-异亚丙基-D-呋喃葡糖(6g，23.05mmol)用乙酸酐(17.43mL，184.41mmol)和TsOH·H2O(876.9mg，4.61mmol)在乙酸(115mL)中乙酰化，给出中间体1，为无色油状物(6.56g，72.9％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.45(d，J＝4.6Hz，1H)，6.12(s，1H)，5.54(dd，J＝4.9，2.9Hz，1H)，5.42(d，J＝4.8Hz，1H)，5.28(ddd，J＝7.5，5.1，2.9Hz，2H)，5.25–5.19(m，2H)，5.11(s，1H)，4.66–4.44(m，4H)，4.16–4.03(m，4H)，2.19–1.96(m，30H)。
步骤2和步骤3：9-(β-D-1-去氧-D-呋喃葡糖基)-腺嘌呤(化合物9)的合成：
以类似于化合物6的合成中步骤6和步骤7中所用的方式。将中间体1(217mg，0.55mmol)分别糖基化和水解，获得化合物9，为白色粉末(1.6mg，两步骤总收率：0.97％)1HNMR(400MHz，CD3OD)δ8.39(s，1H)，8.23(s，1H)，6.12(d，J＝1.9Hz，1H)，4.72(s，1H)，4.44(dd，J＝7.4，4.4Hz，1H)，4.31(dd，J＝4.4，1.0Hz，1H)，3.72(ddd，J＝12.1，9.4，2.9Hz，2H)，3.67–3.58(m，1H)。
化合物119的合成：
Figure BDA0002139269340000741
条件：i)DMAP，Ac2O，吡啶；ii)0.2％HCl；iii)NaIO4，H2O；iv)乙炔基溴化镁，THF；v)乙酸酐，TsOH·H2O，乙酸；vi)腺嘌呤，N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺，TMSOTf，乙腈；vii)K2CO3，甲醇，水。
步骤1：3-乙酰氧基-1,2:5,6-二-O-异亚丙基-D-呋喃葡糖(中间体1)的合成：
在冰水浴条件下，向1,2:5,6-二-O-异亚丙基-D-呋喃葡糖(2g，7.68mmol)的吡啶(20ml)溶液添加DMAP和Ac2O。所述混合物在室温下搅拌2h。将所述混合物用饱和NaHCO3水溶液(10ml)淬灭并搅拌30分钟。减压蒸发溶剂，将残余物悬浮在DCM(30ml)中。分别用水和盐水洗涤。收集有机层并用MgSO4干燥，浓缩，获得纯中间体1，为黄色油状物(2.31g，收率99％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.87(d，J＝3.7Hz，1H)，5.25(d，J＝2.8Hz，1H)，4.49(d，J＝3.7Hz，1H)，4.22-4.18(m，2H)，4.12-3.97(m，2H)，2.10(d，J＝1.7Hz，3H)，1.51(s，3H)，1.43-1.38(m，3H)，1.33-1.31(m，3H)，1.30(s，3H)。
步骤2：3-乙酰氧基-1,2-O-异亚丙基-D-呋喃葡糖(中间体2)的合成：
以类似于化合物7的合成中步骤5所用的方式，将中间体2(310mg，1.03mmol)用0.2％HCl选择性去保护基团，给出酸性中间体2，为无色油状物(172.0mg，收率64.33％)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ5.92-5.81(m，1H)，5.31-5.19(m，1H)，4.58-4.48(m，1H)，4.22-4.10(m，1H)，3.90-3.76(m，1H)，3.75-3.61(m，2H)，3.31(s，1H)，2.89-2.72(m，1H)，2.11(s，3H)，1.49(s，3H)，1.28(s，3H)。
步骤3：3-O-乙酰基-1,2-O-异亚丙基-D-木糖-戊二醛-1,4-呋喃糖(中间体3)的合成：
在冰水浴条件下，向中间体2(172.0mg，0.66mmol)的水(4ml)溶液中添加NaIO4，将混合物在室温下搅拌1.5小时，用EtOH淬灭并搅拌30分钟，过滤并浓缩滤液，通过柱色谱进一步纯化(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝3:1)，获得中间体3，为无色油状物(121mg，收率：79.68％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.65(d，J＝0.9Hz，1H)，6.09(d，J＝3.5Hz，1H)，5.50(d，J＝3.5Hz，1H)，4.73(dd，J＝3.5，0.8Hz，1H)，4.59(d，J＝3.5Hz，1H)，2.05–2.03(s，3H)，1.52(s，4H)，1.34(s，3H)。
步骤4：3-O-乙酰基-1,2-异亚丙基-D-葡糖-6,7-二去氧庚6-炔并呋喃糖(中间体4)的合成：
在0℃和Ar保护下向中间体3(117.0mg，0.51mmol)的无水THF(5ml)溶液中滴加乙炔基溴化镁(3mL，在正己烷中0.5m，1.52mmol，3.0equivs.)。然后将所述混合物搅拌8小时。用饱和NaHCO3水溶液(3ml)淬灭并搅拌30分钟。用DCM(20X3ml)提取所述混合物，合并有机层，分别用水和盐水洗涤。用MgSO4干燥并过滤，浓缩并通过柱色谱进一步纯化(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝4:1)，获得中间体4，为无色油状物(69mg，52.98％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.96(dd，J＝5.5，3.6Hz，1H)，5.57(dd，J＝8.8，2.2Hz，1H)，5.31(t，J＝3.3Hz，1H)，4.52(dd，J＝9.7，5.2Hz，1H)，4.37(dd，J＝8.2，3.0Hz，1H)，2.57–2.53(m，0.5H)，2.47(d，J＝2.2Hz，0.5H)，2.13(d，J＝3.0Hz，1.5H)，2.09(d，J＝3.0Hz，1.5H)，1.51(t，J＝4.6Hz，3H)，1.31(s，3H)。与参考文献Derek Horton，Ji-Hsiung Tsai，Carbohydrate Research 581977 89-108比较，5’构型是R和S 14:11。
步骤5：1,2,3,5-四-O-乙酰基-D-葡糖-6,7-二去氧-庚6-炔并呋喃糖(中间体5)的合成：
以类似于化合物5的合成中步骤2所用的方式，将中间体2(69mg，0.27mmol)在乙酸(5mL)中用乙酸酐(127mmL，1.35mmol)和TsOH·H2O(1.24mg，0.053mmol)乙酰化，给出中间体5，为无色油状物(64mg，69.4％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.43(d，J＝4.6Hz，1H)，6.07(s，1H)，5.63(q，J＝2.3Hz，1H)，5.61(d，J＝2.2Hz，1H)，5.56(dd，J＝8.4，4.9Hz，1H)，5.50(t，J＝5.1Hz，1H)，5.46(dd，J＝5.2，2.3Hz，1H)，5.32(dd，J＝6.5，4.5Hz，1H)，2.49–2.47(m，1H)，2.44–2.43(m，1H)，2.13–2.03(m，24H)。
步骤6：2,3,5-三-O-乙酰基-D-葡糖-6,7-二去氧-庚-6-炔醇-1-(6-氨基-嘌呤-9-基)-β-D-1-去氧-f呋喃糖(中间体6)的合成：
以类似于化合物6的合成中步骤6所用的方式，将中间体5在无水乙腈(3mL)中用腺嘌呤(37.90mg，0.28mmol)、N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(114.11mg，0.59mmol)和TMSOTf(124.66mg，0.98mmol)糖基化，获得中间体6，为无色油状物(44mg，56.38％)。质谱(ESI)m/z对C18H19N5O7[M+H]+的计算值418.13，实测值418.24。
步骤7：9-(6,7-二去氧-庚-6-炔醇--β-D-1-去氧-D-呋喃葡糖基)-腺嘌呤(化合物119)的合成：
以类似于化合物6的合成中步骤7所用的方式，将中间体6用K2CO3(72.85mg，0.11mmol)的50％甲醇水溶液(3mL)水解，获得化合物8，为白色粉末(3.2mg，10.42％)。1HNMR(400MHz，CD3OD)δ8.53(s，1H)，8.26(s，1H)，6.02(d，J＝3.0Hz，1H)，4.70(dd，J＝6.8，2.2Hz，1H)，4.55(t，J＝2.8Hz，1H)，4.39(dd，J＝6.8，4.5Hz，1H)，4.36–4.32(m，1H)，2.93(d，J＝2.2Hz，1H)。
化合物120-121：化合物120-121的合成使用化合物1的相同策略合成。
化合物122的合成：化合物122使用化合物3的相同策略合成。
化合物123的合成：
Figure BDA0002139269340000771
步骤1：(中间体1)的合成：
在0℃和Ar保护下向SM1(40mg，0.15mmol)的吡啶(5ml)溶液滴加TsCl(28.5mg，0.15mmol)。然后将所述混合物在室温下搅拌12h。然后浓缩所述反应混合物并通过色谱进一步纯化(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝1:1)，获得中间体1，为浅黄色固体(16.3mg，收率：20.68％)。
步骤2：化合物123的合成：
将中间体1用氨溶液(在MeOH中2.0M)处理。所述混合物在50℃下搅拌8h。然后将其浓缩并通过色谱进一步纯化(硅胶，二氯甲烷/MeOH＝30:1)，获得NQZ-196，为白色粉末(2.4mg，收率：24.89％)。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.57(s，1H)，8.26(s，1H)，8.05(s，1H)，6.49(s，1H)，5.34-5.33(d，J＝4Hz，1H)，5.21-5.19(m，1H)，5.06(s，1H)，4.83-4.79(m，1H)，4.01-3.99(m，1H)，1.94(s，2H)。
化合物124&125的合成：氘化CA04和氘化CA03
Figure BDA0002139269340000772
将在D2O(2mL)中的9-(β-D-呋喃木糖基)-腺嘌呤(20mg)和10％Pd/C(5mg，底物的10wt％)在密封管中在H2气氛下于160℃搅拌24h。冷却后，过滤所述反应混合物。将滤液真空浓缩，给出氘化CA04，为白色粉末(17.2mg)1H NMR(400MHz，CD3OD)δ5.97(d，J＝2.0Hz，1H)，4.50-4.41(m，1H)，4.38-4.29(m，1H)，4.21(dd，J＝3.9，1.9Hz，1H)，4.02-3.85(m，2H)。
以类似于上面使用的方式，将3'-去氧-腺苷用D2O和Pd/C处理，给出氘化CA03，为白色粉末(9.7mg)1H NMR(400MHz，CD3OD)δ5.98(d，J＝2.4Hz，1H)，4.88-4.94(m，1H)，4.61-4.45(m，1H)，3.93(dd，J＝12.5，2.4Hz，1H)，3.69(dd，J＝12.5，3.4Hz，1H)，2.42-2.29(m，1H)，2.12(ddd，J＝13.2，6.4，3.7Hz，1H)。
实施例3评价本发明的典型化合物的活性(表4)：
我们对SAR(结构活性关系)分析做了大量工作，设法增加虫草素在相移能力方面的效力。得到所述化合物后，我们在D15细胞中以梯度稀释并平行地与或不与喷司他丁(腺苷脱氨酶抑制剂)结合来测试化合物的相移活性。
详细程序如下：
1.制备细胞悬液：首先，我们将快速生长的细胞胰蛋白酶化，并以5×104细胞/ml重悬浮于含有10％FBS和抗生素的DMEM中。然后在384孔板的每孔中接种50μl细胞。最后将平板转移回培养箱中再生长2天以达到汇合。当细胞汇合时，我们开始用合成的化学品处理它们。
2.制备化学品：首先将合成的化合物用DMSO稀释至终浓度为100mM。然后将每种化学品在500μl含有喷司他丁(5μg/ml)或DMSO的XM培养基中稀释至终浓度100μM。然后将300μl含有化学品的培养基转移到96孔板的第一排中，其余排中预先分配了150μl含有喷司他汀或DMSO的XM培养基。最后，将含有化学品的培养基以2倍梯度从第一排稀释至最后一排。
3.用有或没有喷司他丁的梯度稀释的化学品处理细胞：取出384孔板中的细胞，并将培养基更换为含有化学品的培养基。最后，对于每种化合物，将板用密封膜密封并放入Tecan中。在37℃下在Tecan光度计中收集来自细胞的数据5天。
4.数据分析：我们定义了阴性命中为即使在浓度为500μM时也无法昼夜节律相移。我们定义了阳性命中是在含有或不含喷司他丁的培养基中，在浓度小于200μM时具有昼夜节律相移。
例如，化学品1至7、16至24(请参考表1中的编号)、NQZ-115、NQZ-193、NQZ-194、NQZ-197、NQZ-198在小于100μM的浓度下改变昼夜节律钟，其应被视为阳性命中。表1中8至15的生物素酰化化合物(请参考表1中的编号)也是阳性命中。虽然它们在生物节律性光度测定仪(生物节律性光度测定仪(Lumicycle))测定中没有显示相移能力，即使浓度为500μM时，然而在384孔板中它们在约5μM的浓度下显示出昼夜节律相移能力。注意，虫草素和NQZ-007显示在含有喷司他丁的培养基中效力显著增加，引发12小时相移的浓度从25μM增至0.2μM。我们还发现一些虫草素样化合物在100μM的浓度下具有延伸期效应，包括NQZ-168和NQZ-195。化学品NQZ-163、NQZ-187、NQZ-194、NQZ-198在100μM的浓度下具有增加的振幅效应，Per2:luc信号增加超过对照的两倍。
表4
Figure BDA0002139269340000791
Figure BDA0002139269340000801
Figure BDA0002139269340000811
Figure BDA0002139269340000821
Figure BDA0002139269340000831
Figure BDA0002139269340000841
Figure BDA0002139269340000851
Figure BDA0002139269340000861
Figure BDA0002139269340000871
Figure BDA0002139269340000881
Figure BDA0002139269340000891
Figure BDA0002139269340000901
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Claims (18)

1.一种下式I-1的化合物或其可药用盐在制备用于调节生物钟相位和/或生物钟振幅的药物中的应用，
Figure FDA0004056464160000011
其中：
R2和R3独立地是H、OH、-氧代生物素、-OAc、-OTBS、-F、-Cl、-Br、-I、或＝O，或者R2和R3独立地不存在；
R4和R5独立地是-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、＝O、-氧代生物素或-N3；或者R2/R3和R4/R5与它们所连接的碳一起形成环氧乙烷；
R6和R7独立地是-H、-CH2-OH、-CH2-N3、-CH2-氧代生物素、-CH2-AcO、-CH2-OTBS、-CO2Me、三磷酸化的亚甲基、1,2-二羟基乙烷基、四丁基一磷酸铵基、-OP(O)(OH)2、-OP(O)(OR')2、-OP(O)(OR')(OR")、-OP(O)R'(OR")、-OP(O)R'R"、-OP(OH)2、-OP(OR')2、-OP(OR')(OR")、-OPR'R"、-OPR'(OR")或1-羟基丙-2-炔-1-基；
R8是-H、＝S、＝O、-NH-CH3、-F、-Cl、-Br、-I、-O-CH3或氘；
R10是-H、-CH3、-F、-Cl、-Br、I、-NH2、-NH-CH3、-NH-NH2、＝O、-NHBn、-NR"COR'、-生物素酰胺、-间羟基苯胺、-氨基环丙烷、-氨基环丁烷、-氨基环戊烷、-氨基环己烷、-OMe或-辛酰胺；
R"和R'各自独立选自氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基和(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基；
R12是-H、-NH2、-F、-Cl、-Br、-I、-OMe或4-甲酰胺取代的吡唑基。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，R7是-CH2-氧代生物素、-CH2-AcO、-CH2-OTBS、-CO2Me、三磷酸化的亚甲基、1,2-二羟基乙烷基、四丁基一磷酸铵基、-OP(O)(OH)2、-OP(O)(OR')2、-OP(O)(OR')(OR")、-OP(O)R'(OR")、-OP(O)R'R"、-OP(OH)2、-OP(OR')2、-OP(OR')(OR")、-OPR'R"或-OPR'(OR")。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，R10是-NH-CH3、-NH-NH2、＝O、-NHBn、-NR"COR'、-生物素酰胺、-间羟基苯胺、-氨基环丙烷、-氨基环丁烷、-氨基环戊烷、-氨基环己烷或-辛酰胺。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，R2是H；
R3是H、OH、氧代生物素、OAc、OTBS、F、Cl、Br或者I。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，R4是H，R5是H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、＝O、-氧代生物素或-N3；或者R4是OH、-F、-Cl、-Br、-I、＝O、-氧代生物素或-N3，R5是H。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，R6是H；
R7是-CH2-OH、-CH2-N3、-CH2-氧代生物素、-CH2-AcO、-CH2-OTBS或-CO2Me。
7.根据权利要求1所述的应用，所述式I-1化合物选自如下化合物：
Figure FDA0004056464160000021
Figure FDA0004056464160000031
Figure FDA0004056464160000041
Figure FDA0004056464160000051
Figure FDA0004056464160000061
Figure FDA0004056464160000071
Figure FDA0004056464160000081
Figure FDA0004056464160000091
8.根据权利要求1所述的应用，所述化合物选自：
Figure FDA0004056464160000092
Figure FDA0004056464160000101
Figure FDA0004056464160000111
Figure FDA0004056464160000121
Figure FDA0004056464160000131
Figure FDA0004056464160000141
9.根据权利要求1所述的应用，所述化合物选自：
Figure FDA0004056464160000142
Figure FDA0004056464160000151
Figure FDA0004056464160000161
10.一种组合物，其包含如式I-1所示的化合物或其可药用盐和喷司他丁，
Figure FDA0004056464160000171
其中：
R2和R3独立地是H、-OH、-氧代生物素、-OAc、-OTBS、-F、-Cl、-Br、-I、或＝O，或者R2和R3独立地不存在；
R4和R5独立地是H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、＝O、-氧代生物素或N3；或者R2/R3和R4/R5与它们所连接的碳一起形成环氧乙烷；
R6和R7独立地是H、-CH2-OH、-CH2-N3、-CH2-氧代生物素、-CH2-AcO、-CH2-OTBS、-CO2Me、三磷酸化的亚甲基、1,2-二羟基乙烷、四丁基一磷酸铵、-OP(O)(OH)2、-OP(O)(OR')2、-OP(O)(OR')(OR")、-OP(O)R'(OR")、-OP(O)R'R"、-OP(OH)2、-OP(OR')2、-OP(OR')(OR")、-OPR'R"、-OPR'(OR")或1-羟基丙-2-炔-1-基；
R8是H、＝S、＝O、-NH-CH3、-F、-Cl、-Br、-I、-O-CH3、或氘；
R10是H、-CH3、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NH-CH3、-NH-NH2、＝O、-NHBn、-NR"COR'、-生物素酰胺、间羟基苯胺、-氨基环丙烷、-氨基环丁烷、-氨基环戊烷、-氨基环己烷、-OMe或辛酰胺；
R"和R'各自独立选自氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基和(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基；
R12是H、NH2、F、Cl、Br、I、OMe或4-甲酰胺取代的吡唑。
11.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于，R7是-CH2-氧代生物素、-CH2-AcO、-CH2-OTBS、-CO2Me、三磷酸化的亚甲基、1,2-二羟基乙烷基、四丁基一磷酸铵基、-OP(O)(OH)2、-OP(O)(OR')2、-OP(O)(OR')(OR")、-OP(O)R'(OR")、-OP(O)R'R"、-OP(OH)2、-OP(OR')2、-OP(OR')(OR")、-OPR'R"或-OPR'(OR")。
12.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于，R10是-NH-CH3、-NH-NH2、＝O、-NHBn、-NR"COR'、-生物素酰胺、-间羟基苯胺、-氨基环丙烷、-氨基环丁烷、-氨基环戊烷、-氨基环己烷或-辛酰胺。
13.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述化合物选自：
Figure FDA0004056464160000181
Figure FDA0004056464160000191
Figure FDA0004056464160000201
Figure FDA0004056464160000211
Figure FDA0004056464160000221
Figure FDA0004056464160000231
Figure FDA0004056464160000241
14.根据权利要求10所述的组合物，其由虫草素和喷司他丁组成；或所述组合物由下列化合物之一和喷司他丁组成：
Figure FDA0004056464160000242
Figure FDA0004056464160000251
15.一种化合物或其可药用盐，所述化合物选自如下化合物：
Figure FDA0004056464160000252
Figure FDA0004056464160000261
Figure FDA0004056464160000271
Figure FDA0004056464160000281
Figure FDA0004056464160000291
16.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物可用于治疗时差、轮班工作、年龄相关的睡眠障碍、或生物钟相关的睡眠障碍。
17.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物能够与选自咖啡因、褪黑素、唑吡坦、艾司佐匹克隆、扎来普隆或三唑仑的药剂组合。
18.权利要求10-14任一项所述的组合物在制备调节生物钟相位和/或生物钟振幅的药物中的应用。
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