JP2019519623A - 光活性巨大分子及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、水溶性光活性巨大分子に共役された結合剤を使用することによって試料中の検体を検出するための水溶性光活性巨大分子複合体及び方法を提供する。本発明は、試料中の検体を検出するための方法であって、検体の含有が疑われる試料を提供することと、水溶性共役ポリマーに連結された結合剤を含む、共役ポリマー複合体を提供することと、を含む、方法を提供する。結合剤は、検体と相互作用することができる。ポリマーを励起することができる光源が試料に適用され、共役ポリマー複合体から放出された光が検出される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年４月１５日に出願された、米国仮特許出願第６２／３２３，４４４号に対する優先権を主張し、その内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、試料中の検体を検出するための複合体及び方法に関する。

水溶性蛍光ポリマーは、リアルタイムで監視することが可能なシグナルを生成することによって様々な生物学的用途で使用されることができ、生物学的な標的及び事象を検出するための単純かつ短時間の方法を提供することができる。

染料の明るさは、消光係数（ε、特定波長で吸収された光の量の尺度）及び蛍光量子収率（Φ、一重項励起状態から放射の形態で放出された光の尺度）からの全体的な寄与である。クマリン、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン、スクアラインなどの報告された有機紫色染料の多くは単一分子であり、４０５ｎｍにおいて１０，０００〜７０，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１の範囲内の比較的に小さい消光係数を示す。複数の発色団を有する分子は、様々な発色団からの全体的な寄与に起因してより大きいε値を呈することが明らかになっている。単一分子が複数の発色団を含有する、デンドリマー骨格鎖及びポリマー骨格鎖のアプローチに基づいた様々な報告が存在する。

しかしながら、これまでに報告されたポリマー染料の多くは疎水性の高いものであり、発光ダイオード、太陽電池などの材料用途に使用されている。このため、多くのポリマー染料は、溶解性、明るさ、及びスペクトルの広がりが貧弱であることから、水性条件下において有用ではない。ほんの少数の報告のみが、４０５ｎｍ及び３５５ｎｍレーザーで励起可能である生物学的用途のための水溶性蛍光ポリマーを扱っている。したがって、検体の検出用も含めて、生物学的用途のための水溶性ポリマー染料の集積を拡大するために、新規なポリマーコアの識別が必要とされる。

本発明は、試料中の検体を検出するための従来技術の複合体及び方法のこれらの及び他の不利益に対処する。

本発明は、全般的には、結合剤に共役された蛍光ポリマーを含む複合体を使用して試料中の検体を検出するための新規な水溶性蛍光ポリマー及び方法を提供する。

第１の実施形態では、本発明は、式Ｉの構造を有する水溶性蛍光ポリマーであって、

式中、
各Ｘは、Ｃ及びＳｉからなる群から独立して選択され、
各Ｙは、結合、ＣＲ^１Ｒ^２、及びＳｉＲ^１Ｒ^２からなる群から独立して選択され、
Ｙが結合のとき、Ｘは両方の環に直接結合され、
各Ｒ^１は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、及び

からなる群から独立して選択され、
各Ｒ^２は、Ｈ、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、（ヘテロ）アリールオキシ、アリール、（ヘテロ）アリールアミノ、ＰＥＧ、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、及び

からなる群から独立して選択され、
各Ｒ^３は、Ｈ、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、（ヘテロ）アリールオキシ、アリール、（ヘテロ）アリールアミノ、及びＰＥＧからなる群から独立して選択され、
各Ｚは、Ｃ、Ｏ、及びＮからなる群から独立して選択され、
各Ｑは、結合、ＮＨ、ＮＲ^４、及びＣＨ_２からなる群から独立して選択され、
各Ｍは、独立して、ポリマーバンドギャップを変更することができる電子豊富なリンカーユニットであり、かつ、ポリマー主鎖に沿って均一に又は不規則に分布し、かつ、

からなる群からそれぞれ独立して選択され、
式中、
各Ｒ^４は、１０ｍｇ／ｍＬを超えての水中での可溶性を付与することができる非イオン性側鎖であり、かつ、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、各ｘ’は独立して０〜２０の整数であり、各ｙ’は独立して０〜５０の整数である（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３、及びＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基からなる群からそれぞれ独立して選択され、
それぞれの任意追加のリンカーＬは、ポリマー主鎖に沿って均一に又は不規則に分布したアリール又はヘテロアリール（hetroaryl）基であり、かつ、別の基質、受容体染料、分子又は結合剤への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、及びこれらの保護された基からなる群から選択される官能基で終端された１つ以上のペンダント鎖で置換され、
各Ｇ^１及びＧ^２は、水素、ハロゲン、アルキン、任意追加的に置換されたアリール、任意追加的に置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフレート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、リン酸塩、ボロン酸置換アリール、ボロン酸エステル置換アリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、任意追加的に置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、任意追加的に置換されたフルオレン、基質又は結合剤への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、及びこれらの保護された基から選択される官能基で終端された１つ以上のペンダント鎖で置換されたアリール又はヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、
ａ、ｃ、及びｄは、構造内のそれぞれのユニットのモル％を定義し、これらのユニットはそれぞれ、均一に又は不規則に繰り返されることができ、ａは１０〜１００％のモル％であり、ｃは０〜９０％のモル％であり、各ｄは０〜２５％のモル％であり、
各ｂは、独立して０又は１であり、
ｍは、１〜約１０，０００の整数であり、
各ｎは、独立して１〜２０の整数である、水溶性蛍光ポリマーを提供する。

いくつかの事例では、ポリマーは式ＩＩの構造を有する

。

いくつかの事例では、ポリマーは式ＩＩＩの構造を有し、

式中、各ｆは独立して０〜５０の整数であり、各Ｒ^５は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、及びＣ_１〜Ｃ_１２アルコキシからなる群から独立して選択される。

いくつかの事例では、ポリマーは式ＩＶの構造を有する

。

いくつかの事例では、ポリマーは式Ｖの構造を有する

。

いくつかの事例では、ポリマーはコポリマーであり、かつ、式ＶＩの構造を有し、

式中、ｇ及びａは共に、１０〜１００％のモル％である。

いくつかの事例では、ポリマーはコポリマーであり、かつ、式ＶＩＩの構造を有し、

式中、各ｇ及びａは共に、１０〜１００％のモル％であり、各ｆは独立して０〜５０の整数であり、各Ｒ^５は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、及びＣ_１〜Ｃ_１２アルコキシからなる群から独立して選択される。

いくつかの事例では、ポリマーは、式ＶＩＩＩの構造を有するコポリマーである

。

いくつかの事例では、ポリマーはコポリマーであり、かつ、式ＩＸの構造を有する

。

いくつかの実施形態では、Ｌは、

からなる群からそれぞれ独立して選択され、
式中、
各Ｒ^６は、１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、又は（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｆＯＣＨ_３で任意追加的に置換されたＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨＣＯＯ−ｔ−ブチル、（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、（ＣＨ_２）_ｎＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（Ｃ_３〜Ｃ_１２）シクロアルキル、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｆ、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｆＯＣＨ_３、Ｎ−マレイミド、ハロゲン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２（ヘテロ）アリール、Ｃ_１〜Ｃ_１２（ヘテロ）アリールアミノ、及びベンジルからなる群から独立して選択され、
各ｆは、独立して０〜５０の整数であり、
各ｎは、独立して１〜２０の整数である。

いくつかの実施形態では、Ｇ^１及びＧ^２は、任意追加的に置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、任意追加的に置換されたフルオレン、官能基で終端された１つ以上のペンダント鎖で置換されたアリール、及び官能基で終端された１つ以上のペンダント鎖で置換されたヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択される。

いくつかの実施形態では、Ｇ^１及びＧ^２は、

からなる群からそれぞれ独立して選択され、
式中、
各Ｒ^６は、１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、又は（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｆＯＣＨ_３で任意追加的に置換されたＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨＣＯＯ−ｔ−ブチル、（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、（ＣＨ_２）_ｎＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（Ｃ_３〜Ｃ_１２）シクロアルキル、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｆ、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｆＯＣＨ_３、Ｎ−マレイミド、ハロゲン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２（ヘテロ）アリール、Ｃ_１〜Ｃ_１２（ヘテロ）アリールアミノ、及びベンジルからなる群から独立して選択され、
各ｆは、独立して０〜５０の整数であり、
各ｎは、独立して１〜２０の整数である。

いくつかの実施形態では、本発明は、試料中の検体を検出するための方法であって、
検体の含有が疑われる試料を提供することと、
式Ｉの構造を有する水溶性ポリマーに共役された結合剤と前記試料を接触させることであって、

式中、
各Ｘは、Ｃ及びＳｉからなる群から独立して選択され、
各Ｙは、結合、ＣＲ^１Ｒ^２、及びＳｉＲ^１Ｒ^２からなる群から独立して選択され、
Ｙが結合のとき、Ｘは両方の環に直接結合され、
各Ｒ^１は、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、及び

からなる群から独立して選択され、
各Ｒ^２は、Ｈ、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、（ヘテロ）アリールオキシ、アリール、（ヘテロ）アリールアミノ、ＰＥＧ、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、及び

からなる群から独立して選択され、
各Ｒ^３は、Ｈ、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、（ヘテロ）アリールオキシ、アリール、（ヘテロ）アリールアミノ、及びＰＥＧからなる群から独立して選択され、
各Ｚは、Ｃ、Ｏ、及びＮからなる群から独立して選択され、
各Ｑは、結合、ＮＨ、ＮＲ^４、及びＣＨ_２からなる群から独立して選択され、
各Ｍは、独立して、ポリマーバンドギャップを変更することができる電子豊富なリンカーユニットであり、かつ、ポリマー主鎖に沿って均一に又は不規則に分布し、かつ、

からなる群からそれぞれ独立して選択され、
式中、
各Ｒ^４は、１０ｍｇ／ｍＬを超えての水中での可溶性を付与することができる非イオン性側鎖であり、かつ、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、各ｘ’は独立して０〜２０の整数であり、各ｙ’は独立して０〜５０の整数である（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３、及びＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基からなる群からそれぞれ独立して選択され、
それぞれの任意追加のリンカーＬは、ポリマー主鎖に沿って均一に又は不規則に分布したアリール又はヘテロアリール基であり、かつ、別の基質、受容体染料、分子又は結合剤への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、及びこれらの保護された基からなる群から選択される官能基で終端された１つ以上のペンダント鎖で置換され、
Ｇ^１及びＧ^２は、水素、ハロゲン、アルキン、任意追加的に置換されたアリール、任意追加的に置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフレート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、リン酸塩、ボロン酸置換アリール、ボロン酸エステル置換アリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、任意追加的に置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、任意追加的に置換されたフルオレン、基質又は結合剤への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、及びこれらの保護された基から選択される官能基で終端された１つ以上のペンダント鎖で置換されたアリール又はヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、
ａ、ｃ、及びｄは、構造内のそれぞれのユニットのモル％を定義し、これらのユニットはそれぞれ、均一に又は不規則に繰り返されることができ、ａは１０〜１００％のモル％であり、ｃは０〜９０％のモル％であり、
各ｄは０〜２５％のモル％であり、
各ｂは、独立して０又は１であり、
ｍは、１〜約１０，０００の整数であり、
各ｎは、独立して１〜２０の整数である、ことと、を含み、
結合剤は、検体又は標的関連生体分子と相互作用することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、方法は、ポリマーを励起することができる光源を試料に適用することと、光が共役ポリマー複合体から放出されているかどうかを検出することと、を更に含む。

いくつかの実施形態では、結合剤は、タンパク質、ペプチド、親和性リガンド、抗体、抗体フラグメント、糖、脂質、核酸又はアプタマーである。いくつかの実施形態では、結合剤は抗体である。

いくつかの実施形態では、方法は、フローサイトメトリー用に構成されている。いくつかの実施形態では、結合剤は基質に結合される。いくつかの実施形態では、検体は、細胞表面上で発現されたタンパク質である。

いくつかの実施形態では、方法は、イムノアッセイとして構成されている。いくつかの実施形態では、方法は、追加の検体を同時に検出するための追加の結合剤を提供することを更に含む。

フルオレン（ＦＦ）、ジヒドロフェナントレン（ＤＤ）及びフルオレン−ＤＨＰ（ＤＦ）ポリマーの蛍光発光スペクトルの比較を示す。

ＦＦポリマーとＤＤポリマーの両方の吸収スペクトルを示す。グラフは３９０及び４１０ｎｍにおいてＤＤポリマー（黒色の曲線）の吸収を示しているが、ＦＦ（灰色の曲線）ポリマーはおよそ４０１ｎｍで最大を示している。試料は、異なる濃度下で測定された。

新しいポリマーで標識された抗ヒトＣＤ４及びＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅで標識されたＣＤ４により染色された溶解全血のフローサイトメトリー解析を示す。ポリマー染料の陽性シグナル強度は、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅよりもほぼ５倍大きかった。

本発明のポリマーが、抗体などに共役されたとき、吸収、蛍光、明るさ、分子量、多分散性、染料対タンパク質比の一定の物理的及び化学的特性を有することを示す。これらのパラメーターの好ましい範囲が、この表に示されている。

タンデムポリマーの励起及び発光スペクトルを示す。励起はポリマーの最大（４０５ｎｍ）で行われ、発光は骨格鎖に取り付けられた様々な受容体染料から観測された。染料１−ＦＩＴＣ、染料２−Ｃｙ３Ｂ、染料３−Ｃｙ５５。

Ｉ．概要
本発明は、結合剤に共役された蛍光ポリマーを含む複合体を使用して試料中の検体を検出するための新規な水溶性蛍光ポリマー及び方法を提供する。本発明の水溶性共役ポリマーは、他の染料と比較して有意に増加した明るさを実証する。
ＩＩ．定義

本明細書で使用される略語は、化学生物学分野の範囲内でのそれらの従来の意味を有する。

本明細書で使用するとき、「アンモニウム」という用語は、式ＮＨＲ_３ ^＋を有するカチオンを指し、各Ｒ基は、独立して、水素又は置換若しくは非置換のアルキル、アリール、アラルキル、若しくはアルコキシ基である。好ましくは、Ｒ基のそれぞれは水素である。

本明細書で使用するとき、「オリゴエーテル」は、エーテル官能性を有する構造反復ユニットを含有するオリゴマーを意味すると理解される。本明細書で使用するとき、「オリゴマー」は、同じ又は異なる式の１つ以上の識別可能な構造反復ユニットを含有する分子を意味すると理解される。

「スルホネート官能基」又は「スルホネート」という用語は、本明細書で使用するとき、遊離スルホネートアニオン（−Ｓ（＝Ｏ）_２Ｏ−）とその塩類の両方を指す。したがって、スルホネートという用語は、ナトリウム、リチウム、カリウム及びアンモニウムスルホネートなどのスルホネート塩類を包含する。

本明細書で使用するときの「スルホネート」という用語は、式−ＳＯ_２ＮＲ−の基を指し、Ｒは水素、アルキル又はアリールである。

本明細書で使用するときの「アルキル」という用語は、指定された炭素原子数を有する直線状又は分岐状の飽和脂肪族ラジカルを指す。例えば、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。他のアルキル基としては、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルキルは、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、３〜４、３〜５、３〜６、４〜５、４〜６及び５〜６の任意の数の炭素を含むことができる。アルキル基は、典型的には一価であるが、アルキル基が２つの部分を共に連結する場合など、二価であってもよい。

本明細書で使用するときの「シクロアルキル」という用語は、３〜１２個の環原子を含有する飽和若しくは部分飽和の一環式、縮合二環式若しくは架橋多環式の環集合体、又は例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンチル、及びシクロペンチルを含む、原子の数が指定された一環式の環を指す。二環式及び多環式の環としては、例えば、ノルボルナン、デカヒドロナフタレン及びアダマンタンが挙げられる。例えば、Ｃ_３〜８シクロアルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンチル、シクロペンチル、及びノルボルナンが挙げられる。

本明細書で使用するときの「ハロアルキル」という用語は、一部又は全ての水素原子がハロゲン原子に置換されている、上に定義したアルキルを指す。ハロゲン（ハロ）は、好ましくは塩化又はフッ化を表すが、臭化又はヨウ化であってもよい。例えば、ハロアルキルとしては、トリフルオロメチル、フルオロメチル（flouromethyl）、１，２，３，４，５−ペンタフルオロ−フェニルなどが挙げられる。「ペルフルオロ」という用語は、フッ素で置換された少なくとも２つの利用可能な水素を有する化合物又はラジカルを定義する。例えば、ペルフルオロフェニルは、１，２，３，４，５−ペルフルオロフェニルを指し、ペルフルオロメタンは、１，１，１−トリフルオロメチルを指し、ペルフルオロメトキシは、１，１，１−トリフルオロメトキシを指す。

本明細書で使用するとき、「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を指す。

本明細書で使用するときの「アルコキシ」という用語は、アルキル基を取り付け点に接続する酸素原子を有する、上に定義したアルキル基を指す。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソ−プロポキシ、ブトキシ、２−ブトキシ、イソ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどが挙げられる。アルコキシ基は、本明細書内に記載の様々な置換基で更に置換されることができる。例えば、アルコキシ基は、ハロゲンで置換されて「ハロ−アルコキシ」基を形成することができる。

本明細書で使用するときの「アルケン」という用語は、少なくとも１つの二重結合を有する、直鎖又は分岐状のいずれかの炭化水素を指す。アルケン基の例としては、ビニル、プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブテニル、ブタジエニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、イソペンテニル、１，３−ペンタジエニル、１，４−ペンタジエニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、１，３−ヘキサジエニル、１，４−ヘキサジエニル、１，５−ヘキサジエニル、２，４−ヘキサジエニル、又は１，３，５−ヘキサトリエニルが挙げられるが、これらに限定されない。アルケン基は、典型的には一価であるが、アルケン基が２つの部分を共に連結する場合など、二価であってもよい。

本明細書で使用するときの「アルキン」という用語は、少なくとも１つの三重結合を有する、直鎖又は分岐状のいずれかの炭化水素を指す。アルキニル基の例としては、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、イソブチニル、ｓｅｃ−ブチニル、ブタジイニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、イソペンチニル、１，３−ペンタジイニル、１，４−ペンタジイニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、１，３−ヘキサジイニル、１，４−ヘキサジイニル、１，５−ヘキサジイニル、２，４−ヘキサジイニル、又は１，３，５−ヘキサトリイニルが挙げられるが、これらに限定されない。アルキニル基は、典型的には一価であるが、アルキニル基が２つの部分を共に連結する場合など、二価であってもよい。

本明細書で使用するときの「アリール」という用語は、６〜１６個の環炭素原子を含有する、一環式若しくは縮合二環式、三環式又はそれ以上の芳香環集合体を指す。例えば、アリールは、フェニル、ベンジル又はナフチル、好ましくはフェニルであってよい。「アリーレン」は、アリール基から誘導された二価のラジカルを意味する。アリール基は、アルキル、アルコキシ、アリール、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、アミノ、アミノ−アルキル、トリフルオロメチル、アルキレンジオキシ及びオキシ−Ｃ_２−Ｃ_３−アルキレンから選択される１、２又は３個のラジカルによって一、二又は三置換されることができ、これらの全ては、任意追加的に、例えば、上に定義したもの、又は１−若しくは２−ナフチル、又は１−若しくは２−フェナントレニルとして、更に置換される。アルキレンジオキシは、フェニルの２つの隣接する炭素原子に取り付けられた二価の置換体、例えば、メチレンジオキシ又はエチレンジオキシである。オキシ−Ｃ_２−Ｃ_３−アルキレンもまた、フェニルの２つの隣接する炭素原子に取り付けられた二価の置換体、例えば、オキシエチレン又はオキシプロピレンである。オキシ−Ｃ_２−Ｃ_３−アルキレン−フェニルの例は、２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イルである。

アリールとして好ましいのは、ナフチル、フェニル又はアルコキシ、フェニル、ハロゲン、アルキル若しくはトリフルオロメチルによって一置換若しくは二置換されたフェニル、とりわけ、フェニル又はアルコキシ、ハロゲン若しくはトリフルオロメチルによって一置換若しくは二置換されたフェニル、及び特にフェニルである。

本明細書で使用するときの「アリールオキシ」という用語は、Ｏ−アリール基を指し、アリールは上に定義したとおりである。アリールオキシ基は、置換されなくても、１つ又は２つの好適な置換基で置換されてもよい。「フェノキシ」という用語は、アリール部分がフェニル環であるアリールオキシ基を指す。本明細書で使用するときの「ヘテロアリールオキシ」という用語は、−Ｏ−ヘテロアリール基を意味し、ヘテロアリールは以下に定義するとおりである。「（ヘテロ）アリールオキシ」という用語は、部分がアリールオキシ基又はヘテロアリールオキシ基のいずれかであることを示すために使用される。

本明細書で使用するときの「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」という用語は、エチレングリコールモノマーユニットをベースにした生体適合性の水溶性化直鎖ポリマーの群を指す。

本明細書で使用するときの「ヘテロアリール」という用語は、５〜１６個の環原子を含有する一環式又は縮合二環式又は三環式の芳香環集合体を指し、環原子のうちの１〜４個はそれぞれへテロ原子Ｎ、Ｏ又はＳである。例えば、ヘテロアリールとしては、ピリジル、インドリル、インダゾリル、キノキサリニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、フラニル、ピロリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、又は例えばアルキル、ニトロ若しくはハロゲンによって置換された、特に一置換若しくは二置換された、任意の他のラジカルが挙げられる。ピリジルは、２−、３−又は４−ピリジル、有利には２−又は３−ピリジルを表す。チエニルは、２−又は３−チエニルを表す。キノリニルは、好ましくは２−、３−又は４−キノリニルを表す。イソキノリニルは、好ましくは１−、３−又は４−イソキノリニルを表す。ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニルは、好ましくは３−ベンゾピラニル又は３−ベンゾチオピラニルをそれぞれ表す。チアゾリルは、好ましくは２−又は４−チアゾリルを表し、最も好ましいのは４−チアゾリルである。トリアゾリルは、好ましくは１−、２−又は５−（１，２，４−トリアゾリル）である。テトラゾリルは、好ましくは５−テトラゾリルである。

好ましくは、ヘテロアリールは、ピリジル、インドリル、キノリニル、ピロリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、フラニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、オキサゾリル、インダゾリル、又は置換された、特に一置換若しくは二置換された、任意のラジカルである。

同様に、アリール基及びヘテロアリール基の置換基は様々であり、０〜芳香環系上の開いている原子価の合計数の範囲の数で、−ハロゲン、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ_２、−ＣＯ_２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ”、−Ｎ_３、−ＣＨ（Ｐｈ）_２、ペルフルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルコキシ、及びペルフルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキルから選択され、Ｒ’、Ｒ”及びＲ”’は、水素、（Ｃ_１〜Ｃ_８）アルキル及びヘテロアルキル、非置換のアリール及びヘテロアリール、（非置換アリール）−（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキル、並びに（非置換アリール）オキシ−（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキルから独立して選択される。

アリール又はヘテロアリール環の隣接する原子上にある置換基のうちの２つは、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｑ−Ｕ−の置換基で任意追加的に置き換えられてよく、Ｔ及びＵは、独立して、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ_２−又は単結合であり、ｑは０〜２の整数である。代替的に、アリール又はヘテロアリール環の隣接する原子上にある置換基のうちの２つは、式−Ａ−（ＣＨ_２）_ｒ−Ｂ−の置換基で任意追加的に置き換えられてよく、Ａ及びＢは、独立して、−ＣＨ_２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−又は単結合であり、ｒは１〜３の整数である。そのように形成された新しい環の単結合のうちの１つは、任意追加的に二重結合で置き換えられてよい。代替的に、アリール又はヘテロアリール環の隣接する原子上にある置換基のうちの２つは、式−（ＣＨ_２）_ｓ−Ｘ−（ＣＨ_２）_ｔ−の置換基で任意追加的に置き換えられてよく、ｓ及びｔは、独立して０〜３の整数であり、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、又は−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−である。−ＮＲ’−及び−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−中の置換基Ｒ’は、水素又は非置換の（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルから選択される。

本明細書で使用するときの「（ヘテロ）アリールアミノ」という用語は、アリール基（例えば、−ＮＨ−アリール）で置換されたアミンラジカルを指す。アリールアミノはまた、アミン基（例えば、−アリール−ＮＨ_２）で置換されたアリールラジカルであってもよい。アリールアミノは、置換されていても、置換されていなくてもよい。

本明細書で使用するときの「アミン」という用語は、１つ以上のアミノ基を有する、本明細書内で定義されるようなアルキル基を指す。アミノ基は、一級、二級、又は三級であり得る。アルキルアミンは、ヒドロキシ基で更に置換され得る。本発明において有用なアミンとしては、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン及びエタノールアミンが挙げられるが、これらに限定されない。アミノ基は、化合物の残り部分と共にアルキルアミンを取り付け点に連結し得る、アルキル基のオメガ位にあり得る、又はアルキル基の少なくとも２つの炭素原子を共に連結し得る。本発明において他のアルキルアミンが有用であることは、当業者なら理解するであろう。

本明細書で使用するときの「カルバメート」という用語は、構造−ＮＲ”ＣＯ_２Ｒ’を有する官能基を指し、Ｒ’及びＲ”は、水素、（Ｃ_１〜Ｃ_８）アルキル及びヘテロアルキル、非置換のアリール及びヘテロアリール、（非置換アリール）−（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキル、並びに（非置換アリール）オキシ−（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキルから独立して選択される。カルバメートの例としては、ｔ−Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、ベンジルオキシ−カルボニル、ａｌｌｏｃ、メチルカルバメート、エチルカルバメート、９−（２−ｓｕｌｆｂ）フルオレニルメチルカルバメート、９−（２，７−ジブロモ）フルオレニルメチルカルバメート、Ｔｂｆｍｏｃ、Ｃｌｉｍｏｃ、Ｂｉｍｏｃ、ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ、Ｂｓｍｏｃ、Ｔｒｏｃ、Ｔｅｏｃ、２−フェニルエチルカルバメート、Ａｄｐｏｃ、２−クロロエチルカルバメート、ｌ，ｌ−ジメチル−２−ハロエチルカルバメート、ＤＢ−ｔ−ＢＯＣ、ＴＣＢＯＣ、Ｂｐｏｃ、ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ、Ｐｙｏｃ、Ｂｎｐｅｏｃ、＿Ｖ−（２−ピバロイルアミノ）−１，１−ジメチルエチルカルバメート、ＮｐＳＳＰｅｏｃが挙げられる。

本明細書で使用するときの「カルボキシレート」という用語は、カルボン酸の共役塩基を指し、これは一般に、式ＲＣＯＯによって表されることができる。例えば、「マグネシウムカルボキシレート」は、カルボン酸のマグネシウム塩を指す。

本明細書で使用するときの「活性化エステル」という用語は、アミノ酸誘導体の遊離アミノ基とカルボキシル基の容易な縮合を促進するために使用されるカルボキシル活性化基を指す。これらのカルボキシル活性化基の説明は、ペプチド化学の一般の教科書、例えば、Ｋ．Ｄ．Ｋｏｐｐｌｅ，「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ」，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６６，ｐｐ．５０〜５１及びＥ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋ．Ｌｕｂｋｅ，「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；Ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６５，ｐｐ．７７〜１２８に見出される。

「ヒドラジン」及び「ヒドラジド」という用語は、単結合された窒素を含有する化合物を指し、これらの窒素の一方は一級アミン官能基である。

本明細書で使用するときの「アルデヒド」という用語は、−ＣＨＯ基を有する化学化合物を指す。

本明細書で使用するときの「チオール」という用語は、イオウ−水素結合からなる官能基を含有する化合物を指す。チオール官能基の一般化学構造はＲ−ＳＨであり、式中、Ｒは、アルキル、アルケン、アリール、又は他の炭素含有原子団を表す。

本明細書で使用するときの「シリル」という用語は、Ｓｉ（Ｒ^ｚ）_３を指し、式中、各Ｒ^ｚは、独立して、アルキルアリール又は他の炭素含有原子団である。

本明細書で使用するときの「ジアゾニウム塩」という用語は、構造Ｒ−Ｎ_２ ^＋Ｘ⁻を有する有機化合物の基を指し、式中、Ｒは任意の有機残基（例えば、アルキル又はアリール）であり得、Ｘは無機又は有機アニオン（例えば、ハロゲン）である。

「トリフレート」という用語はまた、トリフルオロメタンスルホネートとも称され、式ＣＦ_３ＳＯ_３を有する基である。

本明細書で使用するときの「ボロン酸」という用語は、構造−Ｂ（ＯＨ）_２を指す。消光剤の合成における様々な段階においてボロン酸がボロネートエステルとして存在し得ることは、当業者によって理解される。ボロン酸は、このようなエステルを含むものであることが意図されている。本明細書で使用するときの「ボロン酸エステル」又は「ボロネートエステル」という用語は、−Ｂ（Ｚ^１）（Ｚ^２）部分を含有する化学化合物を指し、式中、Ｚ^１及びＺ^２は共に、それぞれの事例においてホウ素に取り付けられた原子が酸素原子である部分を形成する。いくつかの実施形態では、ボロン酸エステル部分は５員環である。いくつかの他の実施形態では、ボロン酸エステル部分は６員環である。いくつかの他の実施形態では、ボロン酸エステル部分は、５員環と６員環の混合である。
ＩＩＩ．組成物
ポリマー

本発明の化合物は、式Ｉ〜ＸＩＩＩの構造を有する水溶性蛍光ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリマーは、式Ｉに示されているように、ジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、フルオレン、並びにＤＨＰ及びフルオレンモノマーの組み合わせを利用する

。

本発明のポリマー複合体は、ポリマーバンドギャップを変更することができるユニットを含有し得、ポリマー主鎖に沿って均一に又は不規則に分布している。これらのユニットは、式Ｉ中にＭとして表されている。本発明のポリマー複合体はまた、式Ｉ中にＬとして表されているリンカーも含有し得る。それぞれの任意追加のリンカーＬは、ポリマー主鎖に沿って均一に又は不規則に分布したアリール又はヘテロアリール基であり、かつ、基質又は結合剤への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、及びこれらの保護された基からなる群から選択される官能基で終端された１つ以上のペンダント鎖で置換されている。

本発明のポリマー複合体はまた、式Ｉ中にそれぞれＧ^１及びＧ^２として表されている末端保護ユニットも含有し、これらのユニットは、水素、ハロゲン、アルキン、任意追加的に置換されたアリール、任意追加的に置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフレート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、リン酸塩、ボロン酸置換アリール、ボロン酸エステル置換アリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、任意追加的に置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、任意追加的に置換されたフルオレン、基質又は結合剤への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、及びこれらの保護された基から選択される官能基で終端された１つ以上のペンダント鎖で置換されたアリール又はヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択される。

いくつかの事例では、ポリマーは式ＩＩの構造を有する

。

いくつかの事例では、ポリマーは式ＩＶの構造を有する

。

いくつかの事例では、ポリマーは式Ｖの構造を有する

。

いくつかの事例では、ポリマーはコポリマーであり、式ＶＩの構造を有する

。

いくつかの事例では、ポリマーはコポリマーであり、式ＶＩＩの構造を有する

。

いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリマー骨格鎖を励起し、エネルギー伝達による骨格鎖に取り付けられた受容体染料の発光を監視することを可能にする、骨格鎖に取り付けられた受容体染料を有する。本発明において有用な受容体染料としては、ＦＩＴＣ、ＣＹ３Ｂ、Ｃｙ５５、Ａｌｅｘａ ４８８、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、Ｃｙ５、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ ７５０、及び８００ＣＷが挙げられる。例えば、本発明の受容体染料を有するポリマーとしては、

が挙げられる。
モノマー

本発明のモノマーは、ジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）モノマー及びフルオレン系モノマーを含む。例えば、本発明のモノマーとしては、

が挙げられる。
これらのモノマーの両末端は、独立して又は両方とも、Ｐｄ又はニッケル塩触媒重合反応を起こすことができるハロゲン原子、ボロン酸エステル若しくはボロン酸、シリル、ジアゾニウム塩、トリフレート、アセチルオキシ、スルホネート、又はリン酸塩である。Ｒ^１は独立して、水／緩衝液中での可溶性を付与することができる側鎖であり、各Ｒ^１は、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、及び

からなる群から独立して選択され、各Ｒ^２は、Ｈ、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、（ヘテロ）アリールオキシ、アリール、（ヘテロ）アリールアミノ、ＰＥＧ、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、及び

からなる群から独立して選択され、各Ｒ^３は、Ｈ、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、（ヘテロ）アリールオキシ、アリール、（ヘテロ）アリールアミノ、及びＰＥＧからなる群から独立して選択され、各Ｚは、Ｃ、Ｏ、及びＮからなる群から独立して選択され、各Ｑは、結合、ＮＨ、ＮＲ^４及びＣＨ_２からなる群から独立して選択され、各Ｒ^５は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、及びＣ_１〜Ｃ_１２アルコキシからなる群から独立して選択される。

いくつかの実施形態では、本発明のモノマーはまた、架橋モノマーも含む。例えば、本発明の架橋モノマーとしては、

が挙げられる。
合成

本発明のＤＨＰモノマーは、以下に示すように作製することができる。

例えば、２，７−ジブロモ−トランス−９，１０−ジヒドロフェナントレン−９，１０−ジオール（ＤＨＰ−ＯＨ）は、以下のように調製することができる。三角フラスコ（２０００Ｌ）内で、約２６ｇのＮａＢＨ_４を撹拌中の水−エタノール混合物（１２０ｍＬ＋７８０ｍＬ）に添加する。この溶液に、約２４ｇの２，７−ジブロモフェナントレン，９，１０−ジオンを少しずつだが短時間で（５分で）添加する。反応混合物は１日撹拌した。溶液の色は、反応の終わりまでに橙赤色から淡黄色、白色へと変化する。反応を停止させ、反応混合物を希塩酸で中和する。中和後、白色の沈殿物を濾過し、過剰な水で洗浄する。結果として得られた白色の沈殿物は、非常に冷たい（＜−１５℃）エタノール（１００ｍＬ）及びメタノール（１００ｍＬ）で洗浄された。

ＤＨＰ−ＯＳＯ_３Ｈは、以下のように調製することができる。２口丸底フラスコ内で、ＤＨＰ−ＯＨ（３．６ｇ）及び１８Ｃ６（５００）を１２０ｍＬのＴＨＦ中に溶解させた。溶液を窒素でパージし（２０分）、窒素パージを続けながらＮａＨ（２ｇ）を添加した。溶液の色は、１０〜１５分で無色から薄い桃色、濃い桃色、茶色及び濃い緑色へと変化する。別のＲＢ内で、１２ｇの１，３プロパンスルトンを２０ｍＬのＴＨＦ中に溶解させ、窒素パージした。このスルトン溶液を滴下ロートによって２０〜３０分間にわたってＤＨＰ−ＯＨ溶液に添加した。反応物は室温で４〜５時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、沈殿物を水中に溶解させた。アセトンを添加して、ＤＰＳの白色の沈殿物をジナトリウム塩の形態で得た。沈殿物を濾過し、水（最小限の量）中に再溶解させ、ＨＣｌで中和し、再びアセトン内で沈殿させた。沈殿の繰り返し（２〜３回）の後に続く遠心分離により、白色の固体としてＤＰＳが得られる。

ＤＨＰ−ＯＳＯ_２Ｃｌは、以下のように調製することができる。５ｇのＤＨＰ−ＯＳＯ_３Ｈを丸底フラスコ内に入れ、２５ｍＬのＤＭＦと混合した。これに約１０ｍＬのＳＯＣｌ_２を滴下添加し、混合物を一晩撹拌した。翌朝、反応混合物を２００ｍＬの水中に注ぎ、沈殿物を濾過し、乾燥させた。

ＤＨＰ−スルホンアミドＰＥＧは、以下のように調製することができる。ＤＨＰ−ＯＳＯ_２Ｃｌをジクロロメタン／ＴＥＡ混合中の２．２当量のＰＥＧアミンと混合した。３時間の超音波処理反応後、ジクロロメタン中で粗生成物を抽出し、続いてカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ_３）を行った。

ＤＨＰ−スルホンアミドＰＥＧのジボロン酸エステルは、以下のように調製することができる。ジブロモ化合物を窒素下でＤＭＳＯと混合し、これに３当量のビスピナコラトジボロンを添加した。試薬を１２当量の酢酸カリウム及び４当量のＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２触媒と８０度で５時間反応させた。反応混合物を冷まし、ＣＨＣｌ３／水で抽出した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ_３）によって有機層を濃縮し、精製した。

同様に、本発明のフルオレンモノマーは、以下に記載するように作製することができる。例えば、ＦＬ−ＯＳＯ_３Ｈは、以下のように調製することができる。２口丸底フラスコ内で、５ｇのフルオレンを７０のＤＭＳＯと混合した。溶液を窒素でパージし（２０分）、窒素パージを続けながら５０％ＮａＯＨ（１２当量）を添加した。溶液の色は、無色から濃い茶色に変化する。プロパンスルトン（３当量）を計量し、ＤＭＳＯ中に溶解させた。これをフルオレン反応混合物に５分間にわたって滴下添加した。反応物は室温で４〜５時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、沈殿物を水中に溶解させた。アセトンを添加して、ＤＰＳの白色の沈殿物をジナトリウム塩の形態で得た。沈殿物を濾過し、水（最小限の量）中に再溶解させ、ＨＣｌで中和し、再びアセトン内で沈殿させた。沈殿の繰り返し（２〜３回）の後に続く遠心分離により、白色の固体としてＦＬ−ＯＳＯ_３Ｈが得られる。

ＦＬ−ＯＳＯ_２Ｃｌは、以下のように調製することができる。５ｇのＦＬ−ＯＳＯ_３Ｈを丸底フラスコ内に入れ、２５ｍＬのＤＭＦと混合した。これに約１０ｍＬのＳＯＣｌ_２を滴下添加し、混合物を一晩撹拌した。翌朝、反応混合物を２００ｍＬの水中に注ぎ、沈殿物を濾過し、乾燥させた。

ＦＬ−スルホンアミドＰＥＧは、以下のように調製することができる。ＦＬ−ＯＳＯ_２Ｃｌをジクロロメタン／ＴＥＡ混合中の２．２当量のＰＥＧアミンと混合した。３時間の超音波処理反応後、ジクロロメタン中で粗生成物を抽出し、続いてカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ_３）を行った。

ＦＬ−スルホンアミドＰＥＧのジボロン酸エステルは、以下のように調製することができる。ジブロモ化合物を窒素下でＤＭＳＯと混合し、これに３当量のビスピナコラトジボロンを添加した。試薬を１２当量の酢酸カリウム及び４当量のＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２触媒と８０度で５時間反応させた。反応混合物を冷まし、ＣＨＣｌ_３／水で抽出した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ_３）によって有機層を濃縮し、精製した。
重合

上述の実施形態に記載の化合物は、当該技術分野において既知の手順を使用して作製されてよい。いくつかの実施形態では、蛍光ポリマーは、電子豊富なリンカーユニットと結合されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）モノマーから作製することができる。いくつかの実施形態では、明るいポリマー染料は、電子豊富なリンカーユニットと結合されたフルオレンモノマーから作製することができる。いくつかの実施形態では、明るいポリマー染料は、電子豊富なリンカーユニットと結合されたＤＨＰ及びフルオレンモノマーの組み合わせから作製することができる。

一般に、上述の重合モノマーユニットは、本明細書に記載の方法と組み合わせて、当業者にとって既知の重合技術を使用して又は当該技術分野において既知の方法を使用して達成することができる。例えば、ジハライドモノマーからのジボロン酸エステル誘導体の合成は、ビス（ピナコラート）ジボロンとの鈴木カップリングによって達成することができる。

同様に、重合もまた、鈴木カップリングによって達成することができる。

Ｊ^１及びＪ^２は、独立して、Ｈ、Ｂｒ、Ｂ（ＯＨ）_２、又はボロン酸エステルである。

例えば、重合は以下のように進行することができる。丸底フラスコ内で、ブロモモノマーとボロン酸モノマーの両方を（ＤＭＦ−水）混合中に入れ、窒素で１０分間パージした。窒素下において、約２０当量のＣｓＦ及び１０％のＰｄ（ＯＡｃ）２を混合し、８０℃で加熱した。ＵＶ−Ｖｉｓ分光法及びＳＥＣクロマトグラフィーを使用して重合を監視した。その後、反応混合物に、適当な官能基を含有する（Ｇ１から選択された）末端保護剤を添加し、その３時間後に、（Ｇ２から選択された）第２の末端保護剤を添加した。反応後、粗反応混合物を蒸発させ、ゲル濾過カラムに通して、小有機分子及び低ＭＷオリゴマーを除去した。
末端保護ユニット

リンカー及び末端保護ユニットは、前述したように類似のメカニズムによって本発明のポリマー骨格鎖に共役させることができる。例えば、末端保護ユニットのブロモエステル及びボロン酸エステルは、ポリマーの一方又は両方の端部を付加するために使用することができる。末端保護ユニットのブロモエステル及びボロン酸エステルの両方を利用することは、ポリマーの両端部を付加することになる。一方の形態のみ、すなわち、末端保護ユニットのブロモエステル又はボロン酸エステルのいずれか、を利用することは、その対応の補体で終端された端部のみを付加することになり、これは、対称性を有する重合の場合、ポリマーの一方の端部のみを統計的に修正するために使用することができる。非対称のポリマーの場合、このアプローチは、ポリマーが単鎖末端でのみ修正されることを化学的に確実にするために使用される。末端保護ユニットはまた、最初にブロモ末端保護ユニットを、Ｙ端部を有するポリマーと反応させ、続いてポリマーをボロン酸エステル末端保護ユニットと反応させることによって、非対称的に付加されることもできる。

例えば、本発明の末端保護剤は、以下に示すように作製することができる。

結合剤

本発明の「結合剤」は、標的検体に特異的に結合できる任意の分子又は分子の複合体であり得る。本発明の結合剤としては、例えば、タンパク質、小有機分子、炭水化物（多糖類を含む）、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、親和性リガンド、抗体、抗体フラグメント、アプタマーなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、結合剤は、抗体又はそのフラグメントである。本発明のコンテキストにおける特異的結合は、異種集団の存在下で標的検体の存在の決定要因である結合反応を指す。このように、指定されたアッセイ条件下において、指定の結合剤は、特定のタンパク質又は特定のタンパク質のイソ型に優先的に結合し、試料中に存在する他のタンパク質又は他のイソ型に有意な量では結合しない。

結合剤が抗体である場合、それらはモノクローナル又はポリクローナル抗体であってもよい。本明細書で使用するとき、抗体という用語は、免疫グロブリン及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分を指す。このような抗体としては、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異的ポリクローナル抗体、抗体模倣、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｖ、並びにＦａｂ発現ライブラリが挙げられる。
複合体

概して、本発明の蛍光ポリマーは、本明細書に記載の方法と組み合わせて、当業者にとって既知の技術を使用して又は当該技術分野において既知の方法を使用して結合剤に共役させることができる。

例えば、ポリマーＮＨＳエステルの調製は、以下のように進行することができる。５ｍｇのポリマーを清潔なバイアルに入れ、１ｍＬの乾燥ＣＨ_３ＣＮ中に溶解させる。これに１５ｍｇのＴＳＴＵを添加し、更に２分間撹拌する。これに１００μＬのＤＩＰＥＡを添加し、パラフィルムで封止されたキャップを付けて一晩撹拌し続ける。その後、反応混合物中の有機溶媒を蒸発させ、粗ＮＨＳを約７５０μＬの１倍ＢＢＳ緩衝液（ｐＨ８．８）中に短時間のボルテックスによって溶解させ、それをＺｅｂａカラム４０Ｋ ＭＷＣＯに移す。試料を２２００ＲＰＭで２分間スピンダウンし、このポリマーＮＨＳをすぐに使用する。

ポリマーＮＨＳのＣＤ４との共役は、以下のように進行することができる。スピンダウンしたポリマーＮＨＳを１倍ＢＢＳ（〜８００μＬ）中に入れ、０．６ｍｇのＣＤ４に添加し、１００μＬの０．５Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）と混合した。素早く３０秒間ボルテックスし、コールターミキサー中で３〜４時間混合させる。

Ｈｉｓｔｒａｐ ＨＰカラムによる共役体の精製は、以下のように進行することができる。アプローチ１：粗反応後、Ｈｉｓｔｒａｐ ＨＰカラムを使用して共役体を精製する。１倍ＰＢＳ緩衝液を使用して試料をロードし、非結合分画を収集する。これは、２０ＣＶの緩衝液を使用して行うことができる。その後、緩衝液を変更して共役体と遊離抗体の両方を有する非結合分画を洗浄する。これは、０．２５Ｍイミダゾールを含む１０ＣＶ流れる１倍ＰＢＳを使用して行うことができる。

アプローチ２：Ｈｉｔｒａｐ ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム。カラムを平衡化し、２０ｍＭシトレート緩衝液ｐＨ３．５を使用して試料をロードし、非結合分画を収集する。これは、２０ＣＶの緩衝液を使用して行うことができる。その後、緩衝液を変更して共役体と遊離抗体の両方を有する非結合分画を溶出させる。これは、２０ＣＶ流れる２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．５を使用して行うことができる。
アプローチ３：３００Ｋ ＭＷＣＯ膜を装備したタンジェント流濾過システムに粗共役体をロードする。共役体は、濾液が４０５ｎｍでの吸収を示さなくなるまで１倍ＰＢＳを使用して洗浄する。その後、化合物を濃縮する。

ＳＥＣカラムによる共役体の精製は、以下のように進行することができる。１倍ＰＢＳを使用して、遊離抗体を含有する粗共役体をサイズ排除カラムにロードする。吸収スペクトルをチェックした後にチューブをプールし、３０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心濃縮器を有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５で濃縮する。
ＩＶ．検体を検出する方法
概要

本発明は、試料中の検体を検出するための方法であって、検体の含有が疑われる試料を提供することと、水溶性共役ポリマーに連結された結合剤を含む、共役ポリマー複合体を提供することと、を含む、方法を提供する。結合剤は、検体と相互作用することができる。ポリマーを励起することができる光源が試料に適用され、共役ポリマー複合体から放出された光が検出される。典型的なアッセイでは、本発明の蛍光ポリマーは、約３９５ｎｍ〜約４１５ｎｍの波長を有する光で励起可能である。放出された光は、典型的には約４１５ｎｍ〜約４７５ｎｍである。代替的に、励起光は、約３４０ｎｍ〜約３７０ｎｍの波長を有することができ、放出された光は、約３９０ｎｍ〜約４２０ｎｍである。
試料

本発明の方法における試料は、例えば、血液、骨髄、脾臓細胞、リンパ節細胞、骨髄穿刺液（又は骨髄から得た任意の細胞）、尿（洗浄）、血清、唾液、脳脊髄液、尿、羊水、間質液、糞便、粘液、又は組織（例えば、腫瘍試料、分離した組織、分離した充実性腫瘍）であり得る。特定の実施形態では、試料は血液試料である。いくつかの実施形態では、血液試料は全血である。標準的な臨床手順を使用して、被験者から全血を得ることができる。いくつかの実施形態では、試料は、全血の１つ以上の細胞のサブセット（例えば赤血球、白血球、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞）、食細胞、単球、マクロファージ、顆粒球、塩基好性白血球、好中球、好酸球、血小板、又は１つ以上の検出可能なマーカーを有する任意の細胞）である。いくつかの実施形態では、試料は、細胞培養由来であり得る。

被験体は、ヒト（例えば、疾病に罹患した患者）、商業的に有意な哺乳動物、例えば、サル、ウシ、又はウマであり得る。また、試料は、例えば、イヌ又はネコを含む家庭で飼育されるペットから得ることもできる。いくつかの実施形態では、被験体は、疾患の動物モデルとして使用される又は薬物スクリーニング用の実験動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、又はモルモットである。
検体

本明細書で使用するときの「検体」は、存在量／濃度がいくつかの解析手順によって決定される物質、例えば、分子を指す。例えば、本発明では、検体は、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、炭水化物又は小分子であり得る。

標的検体は、例えば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はｒＲＮＡ）、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、イオン、モノサッカライド、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、リポタンパク質、糖タンパク質、糖脂質、又はそれらのフラグメントであってよい。いくつかの実施形態では、標的検体はタンパク質であり、例えば、構造的なマイクロフィラメント、微小管、及び中間径フィラメントタンパク質、オルガネラに特異的なマーカー、プロテアソーム、膜貫通型タンパク質、表面受容体、核膜孔タンパク質、タンパク質／ペプチドトランスロカーゼ、タンパク質フォールディングシャペロン、シグナル伝達スカフォールド、並びにイオンチャネルなどであり得る。タンパク質は、転写因子、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ結合及び修飾タンパク質、核内輸送及び核外搬出受容体、並びにアポトーシス又は生存の制御因子などが挙げられるがこれらに限定されない、活性化可能なタンパク質、又は疾病若しくは異常細胞において差次的に発現又は活性化されるタンパク質であり得る。
アッセイ

結合した分子を定量化するための結合剤及び蛍光標識を利用したアッセイシステムは、周知である。このようなシステムの例としては、フローサイトメーター、スキャニングサイトメーター、イメージングサイトメーター、蛍光顕微鏡、及び共焦点蛍光顕微鏡が挙げられる。

いくつかの実施形態では、蛍光を検出するためにフローサイトメトリーが使用される。この用途に好適な多くのデバイスが使用可能であり、当業者に既存である。例としては、ＢＣＩ Ｎａｖｉｏｓ、Ｇａｌｌｉｏｓ、Ａｑｕｉｏｓ、及びＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーターが挙げられる。

他の実施形態では、アッセイはイムノアッセイである。本発明において有用なイムノアッセイの例としては、フルオロルミネセンスアッセイ（ＦＬＡ）などが挙げられるが、これらに限定されない。アッセイはまた、タンパク質アレイ上で行うこともできる。

結合剤が抗体のとき、抗体アッセイ又は多抗体サンドイッチアッセイもまた使用することができる。サンドイッチアッセイは、様々な結合剤及び報知要素の層を構築して特定の検体の存在をシグナル伝達する連続した認識イベントの使用を指す。サンドイッチアッセイの実施例は、米国特許第４，４８６，５３０号に、及びそこに記載されている参考文献に開示されている。
Ｖ．実施例
実施例１：ＤＨＰポリマー複合体の調製

方法１：丸底フラスコ内で、ジブロモＤＨＰモノマーとジボロン酸ＤＨＰモノマーの両方（１：１）を（ＤＭＦ−水）混合中に入れ、窒素で１０分間パージした。窒素下において、約２０当量のＣｓＦ及び１０％のＰｄ（ＯＡｃ）２を混合し、８０℃で加熱した。ＵＶ−Ｖｉｓ分光法及びＳＥＣクロマトグラフィーを使用して重合を監視した。その後、反応混合物に、適当な官能基を含有する（Ｇ１から選択された）末端保護剤を添加し、その３時間後に、（Ｇ２から選択された）第２の末端保護剤を添加した。反応後、粗反応混合物を蒸発させ、ゲル濾過カラムに通して、小有機分子及び低ＭＷオリゴマーを除去した。その後、１００Ｋ ＭＷＣＯ膜を装備したタンジェント流濾過システムに粗ポリマーを通した。濾液の吸収が小さくなるまで、２０％エタノールを使用してこれを洗浄した。

方法２：代替的に、重合は、ＤＨＰ分子のブロモ−ボロン酸エステルを自己重合させることによってなされ得る。丸底フラスコ内で、ＤＨＰブロモボロン酸エステルを（ＤＭＦ−水）混合中に入れ、窒素で１０分間パージした。窒素下において、約１０当量のＣｓＦ及び５％のＰｄ（ＯＡｃ）_２を混合し、８０℃で加熱した。ＵＶ−Ｖｉｓ分光法及びＳＥＣクロマトグラフィーを使用して重合を監視した。その後、反応混合物に、適当な官能基を含有する（Ｇ１から選択された）末端保護剤を添加し、その３時間後に、（Ｇ２から選択された）第２の末端保護剤を添加した。反応後、粗反応混合物を蒸発させ、ゲル濾過カラムに通して、小有機分子及び低ＭＷオリゴマーを除去した。その後、１００Ｋ ＭＷＣＯ膜を装備したタンジェント流濾過システムに粗ポリマーを通した。濾液の吸収が小さくなるまで、２０％エタノールを使用してこれを洗浄した。

方法３：丸底フラスコ内で、ジブロモジヒドロフェナントレンモノマーとジボロン酸ジヒドロフェナントレン（dihydrophanenthrene）モノマーの両方（１：１）を、１０当量のＫ_２ＣＯ_３及び３％Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４を含有するＴＨＦ−水（４：１）混合中に入れ、溶解させた。反応混合物をＳｃｈｌｅｎｋラインに投入し、３回の凍結脱気サイクルで脱気し、次いで、１８時間にわたって激しく撹拌しながら窒素下で８０℃に加熱した。その後、反応混合物に、適当な官能基を含有する（Ｇ１から選択された）末端保護剤を過剰な窒素圧下でカニューレを介して添加し、その３時間後に、（Ｇ２から選択された）第２の末端保護剤を添加した。反応後、粗反応混合物を蒸発させ、ゲル濾過カラムに通して、小有機分子及び低ＭＷオリゴマーを除去した。その後、１００Ｋ ＭＷＣＯ膜を装備したタンジェント流濾過システムに粗ポリマーを通した。濾液の吸収が小さくなるまで、２０％エタノールを使用してこれを洗浄した。

方法４：代替的に、重合は、ジヒドロフェナントレン分子のブロモ−ボロン酸エステルを自己重合させることによってなされ得る。丸底フラスコ内で、ジヒドロフェナントレンブロモボロン酸エステルを、１０当量のＫ_２ＣＯ_３及び３％Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４を含有するＴＨＦ−水（４：１）混合中に入れ、溶解させた。反応混合物をＳｃｈｌｅｎｋラインに投入し、３回の凍結脱気サイクルで脱気し、次いで、１８時間にわたって激しく撹拌しながら窒素下で８０℃に加熱した。その後、反応混合物に、適当な官能基を含有する（Ｇ１から選択された）末端保護剤を過剰な窒素圧下でカニューレを介して添加し、その３時間後に、（Ｇ２から選択された）第２の末端保護剤を添加した。反応後、粗反応混合物を蒸発させ、ゲル濾過カラムに通して、小有機分子及び低ＭＷオリゴマーを除去した。その後、１００Ｋ ＭＷＣＯ膜を装備したタンジェント流濾過システムに粗ポリマーを通した。濾液の吸収が小さくなるまで、２０％エタノールを使用してこれを洗浄した。
実施例２：フルオレン−ＤＨＰコポリマー複合体の調製

方法１：丸底フラスコ内で、ジブロモＤＨＰモノマーとジボロン酸フルオレンモノマーの両方（１：１）を（ＤＭＦ−水）混合中に入れ、窒素で１０分間パージした。窒素下において、約２０当量のＣｓＦ及び１０％のＰｄ（ＯＡｃ）２を混合し、８０℃で加熱した。ＵＶ−Ｖｉｓ分光法及びＳＥＣクロマトグラフィーを使用して重合を監視した。その後、反応混合物に、適当な官能基を含有する（Ｇ１から選択された）末端保護剤を添加し、その３時間後に、（Ｇ２から選択された）第２の末端保護剤を添加した。反応後、粗反応混合物を蒸発させ、ゲル濾過カラムに通して、小有機分子及び低ＭＷオリゴマーを除去した。その後、１００Ｋ ＭＷＣＯ膜を装備したタンジェント流濾過システムに粗ポリマーを通した。濾液の吸収が小さくなるまで、２０％エタノールを使用してこれを洗浄した。

方法２：丸底フラスコ内で、ジブロモフルオレンモノマーとジボロン酸ＤＨＰモノマーの両方（１：１）を（ＤＭＦ−水）混合中に入れ、窒素で１０分間パージした。窒素下において、約２０当量のＣｓＦ及び１０％のＰｄ（ＯＡｃ）２を混合し、８０℃で加熱した。ＵＶ−Ｖｉｓ分光法及びＳＥＣクロマトグラフィーを使用して重合を監視した。その後、反応混合物に、適当な官能基を含有する（Ｇ１から選択された）末端保護剤を添加し、その３時間後に、（Ｇ２から選択された）第２の末端保護剤を添加した。反応後、粗反応混合物を蒸発させ、ゲル濾過カラムに通して、小有機分子及び低ＭＷオリゴマーを除去した。その後、１００Ｋ ＭＷＣＯ膜を装備したタンジェント流濾過システムに粗ポリマーを通した。濾液の吸収が小さくなるまで、２０％エタノールを使用してこれを洗浄した。

方法３：丸底フラスコ内で、ジブロモジヒドロフェナントレンモノマーとジボロン酸フルオレンモノマーの両方（１：１）を、１０当量のＫ_２ＣＯ_３及び３％Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４を含有するＴＨＦ−水（４：１）混合中に入れ、溶解させた。反応混合物をＳｃｈｌｅｎｋラインに投入し、３回の凍結脱気サイクルで脱気し、次いで、１８時間にわたって激しく撹拌しながら窒素下で８０℃に加熱した。その後、反応混合物に、適当な官能基を含有する（Ｇ１から選択された）末端保護剤を過剰な窒素圧下でカニューレを介して添加し、その３時間後に、（Ｇ２から選択された）第２の末端保護剤を添加した。反応後、粗反応混合物を蒸発させ、ゲル濾過カラムに通して、小有機分子及び低ＭＷオリゴマーを除去した。その後、１００Ｋ ＭＷＣＯ膜を装備したタンジェント流濾過システムに粗ポリマーを通した。濾液の吸収が小さくなるまで、２０％エタノールを使用してこれを洗浄した。

方法４：丸底フラスコ内で、ジブロモフルオレンモノマー及びジボロン酸ジヒドロフェナントレンモノマー（１：１）を、１０当量のＫ_２ＣＯ_３及び３％Ｐｄ（ＰＰｈ３）４を含有するＴＨＦ−水（４：１）混合中に入れ、溶解させた。反応混合物をＳｃｈｌｅｎｋラインに投入し、３回の凍結脱気サイクルで脱気し、次いで、１８時間にわたって激しく撹拌しながら窒素下で８０℃に加熱した。その後、反応混合物に、適当な官能基を含有する（Ｇ１から選択された）末端保護剤を過剰な窒素圧下でカニューレを介して添加し、その３時間後に、（Ｇ２から選択された）第２の末端保護剤を添加した。反応後、粗反応混合物を蒸発させ、ゲル濾過カラムに通して、小有機分子及び低ＭＷオリゴマーを除去した。その後、１００Ｋ ＭＷＣＯ膜を装備したタンジェント流濾過システムに粗ポリマーを通した。濾液の吸収が小さくなるまで、２０％エタノールを使用してこれを洗浄した。
実施例３ 蛍光発光スペクトルの比較

フルオレン（Ｆｌ−Ｆｌ）、ジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ−ＤＨＰ）及びフルオレン−ＤＨＰ（ＤＨＰ−Ｆｌ）ポリマーの蛍光発光スペクトルの比較を行った。ＤＨＰ含有ポリマーは、４２６〜４２８ｎｍであるそれらの蛍光最大に顕著な差を示しているが、フルオレン系ポリマーは４２１ｎｍの最大を示している（図１）。
実施例４ 吸収スペクトルの比較

フルオレン（Ｆｌ−Ｆｌ）ポリマーとジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ−ＤＨＰ）ポリマーの両方の吸収スペクトルを測定した。グラフは３９０及び４１０ｎｍにおいてＤＨＰ−ＤＨＰポリマー（黒色の曲線）の吸収を示しているが、Ｆｌ−Ｆｌ（灰色の曲線）ポリマーはおよそ４００ｎｍで最大を示している。試料は、異なる濃度下で測定された（図２）。
実施例５ ＣＤ４シグナル対雑音比

新しいポリマーで標識された抗ヒトＣＤ４及びＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅで標識されたＣＤ４により染色された溶解全血のフローサイトメトリー解析を行った。ポリマー染料の陽性シグナル強度は、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅよりもほぼ５倍大きかった（図３）。
実施例６

本発明のポリマーは、抗体などに共役されたとき、吸収、蛍光、明るさ、分子量、多分散性、染料対タンパク質比の一定の物理的及び化学的特性を有することが分かった。これらのパラメーターの好ましい範囲が、図４の表に示されている。

タンデムポリマーの励起及び発光スペクトルを測定した。励起はポリマーの最大（４０５ｎｍ）で行われ、発光は骨格鎖に取り付けられた様々な受容体染料から観測された（図５）。

本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示的な目的のみのものであり、その範囲内での様々な改良又は変更は、当業者に対して示唆され、また、本出願の趣旨及び範囲内に、かつ添付された請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書に記載の全ての公開、特許、及び特許出願は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (22)

1. 式Ｉの構造を有する水溶性蛍光ポリマーであって、
   
   式中、
   各Ｘは、Ｃ及びＳｉからなる群から独立して選択され、
   各Ｙは、結合、ＣＲ^１Ｒ^２、及びＳｉＲ^１Ｒ^２からなる群から独立して選択され、
   Ｙが結合のとき、Ｘは両方の環に直接結合され、
   各Ｒ^１は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、及び
   からなる群から独立して選択され、
   各Ｒ^２は、Ｈ、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、（ヘテロ）アリールオキシ、アリール、（ヘテロ）アリールアミノ、ＰＥＧ基、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、及び
   からなる群から独立して選択され、
   各Ｒ^３は、Ｈ、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、（ヘテロ）アリールオキシ、アリール、（ヘテロ）アリールアミノ、及びＰＥＧ基からなる群から独立して選択され、
   各Ｚは、Ｃ、Ｏ、及びＮからなる群から独立して選択され、
   各Ｑは、結合、ＮＨ、ＮＲ^４、及びＣＨ_２からなる群から独立して選択され、
   各Ｍは、独立して、ポリマーバンドギャップを変更することができる電子豊富なリンカーユニットであり、かつ、ポリマー主鎖に沿って均一に又は不規則に分布し、かつ、
   
   からなる群からそれぞれ独立して選択され、
   式中、
   各Ｒ^４は、１０ｍｇ／ｍＬを超えての水中での可溶性を付与することができる非イオン性側鎖であり、かつ、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、各ｘ’は独立して０〜２０の整数であり、各ｙ’は独立して０〜５０の整数である（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３、及びＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基からなる群からそれぞれ独立して選択され、
   それぞれの必要に応じたリンカーＬは、ポリマー主鎖に沿って均一に又は不規則に分布したアリール又はヘテロアリール基であり、かつ、別の基質、受容体染料、分子又は結合剤への連結のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、及びこれらの保護された基からなる群から選択される官能基で終端された１つ以上のペンダント鎖で置換され、
   Ｇ^１及びＧ^２は、水素、ハロゲン、アルキン、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフレート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、リン酸塩、ボロン酸置換アリール、ボロン酸エステル置換アリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、必要に応じて置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、必要に応じて置換されたフルオレン、基質又は結合剤への連結のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、及びこれらの保護された基から選択される官能基で終端された１つ以上のペンダント鎖で置換されたアリール又はヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、
   ａ、ｃ、及びｄは、均一に又は不規則にそれぞれ繰り返され得る前記構造内のそれぞれのユニットのモル％を定義し、ａは１０〜１００％のモル％であり、ｃは０〜９０％のモル％であり、各ｄは０〜２５％のモル％であり、
   各ｂは、独立して０又は１であり、
   ｍは、１〜約１０，０００の整数であり、
   各ｎは、独立して１〜２０の整数である、水溶性蛍光ポリマー。
2. 前記ポリマーが、式ＩＩの構造を有する、請求項１に記載のポリマー
   
   。
3. 前記ポリマーが、式ＩＩＩの構造を有し、
   
   式中、
   各ｆは、独立して０〜５０の整数であり、各Ｒ^５は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、及びＣ_１〜Ｃ_１２アルコキシからなる群から独立して選択される、請求項１に記載のポリマー。
4. 前記ポリマーが、式ＩＶの構造を有する、請求項１に記載のポリマー
   
   。
5. 前記ポリマーが、式Ｖの構造を有する、請求項１に記載のポリマー
   
   。
6. 前記ポリマーが、コポリマーであり、かつ、式ＶＩの構造を有し、
   
   ｇ及びａは共に、１０〜１００％のモル％である、請求項１に記載のポリマー。
7. 前記ポリマーが、コポリマーであり、かつ、式ＶＩＩの構造を有し、
   
   式中、
   各ｇ及びａは共に、１０〜１００％のモル％であり、
   各ｆは、独立して０〜５０の整数であり、各Ｒ^５は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、及びＣ_１〜Ｃ_１２アルコキシからなる群から独立して選択される、請求項１に記載のポリマー。
8. 前記ポリマーが、コポリマーであり、かつ、式ＶＩＩＩの構造を有する、請求項１に記載のポリマー
   
   。
9. 前記ポリマーが、コポリマーであり、かつ、式ＩＸの構造を有する、請求項１に記載のポリマー
   
   。
10. Ｌが、
    
    からなる群からそれぞれ独立して選択され、
    式中、
    各Ｒ^６は、１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、又は（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｆＯＣＨ_３で必要に応じて置換されたＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨＣＯＯ−ｔ−ブチル、（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、（ＣＨ_２）_ｎＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（Ｃ_３〜Ｃ_１２）シクロアルキル、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｆ、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｆＯＣＨ_３、Ｎ−マレイミド、ハロゲン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２（ヘテロ）アリール、Ｃ_１〜Ｃ_１２（ヘテロ）アリールアミノ、及びベンジルからなる群から独立して選択され、
    各ｆは、独立して０〜５０の整数であり、
    各ｎは、独立して１〜２０の整数である、請求項１に記載のポリマー。
11. Ｇ^１及びＧ^２が、必要に応じて置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、必要に応じて置換されたフルオレン、官能基で終端された１つ以上のペンダント鎖で置換されたアリール、及び官能基で終端された１つ以上のペンダント鎖で置換されたヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択される、請求項１に記載のポリマー。
12. Ｇ^１及びＧ^２が、
    
    からなる群からそれぞれ独立して選択され、
    式中、
    各Ｒ^６は、１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、又は（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｆＯＣＨ_３で必要に応じて置換されたＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨＣＯＯ−ｔ−ブチル、（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、（ＣＨ_２）_ｎＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（Ｃ_３〜Ｃ_１２）シクロアルキル、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｆ、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｆＯＣＨ_３、Ｎ−マレイミド、ハロゲン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２（ヘテロ）アリール、Ｃ_１〜Ｃ_１２（ヘテロ）アリールアミノ、及びベンジルからなる群から独立して選択され、
    各ｆは、独立して０〜５０の整数であり、
    各ｎは、独立して１〜２０の整数である、請求項１に記載のポリマー。
13. 前記ポリマーに連結された結合剤を更に含む、請求項１に記載のポリマー。
14. 前記結合剤が抗体である、請求項１３に記載のポリマー。
15. 試料中の検体を検出するための方法であって、
    前記検体の含有が疑われる試料を提供することと、
    式Ｉの構造を有する水溶性ポリマーに連結された結合剤と前記試料を接触させることであって、
    
    式中、
    各Ｘは、Ｃ及びＳｉからなる群から独立して選択され、
    各Ｙは、結合、ＣＲ^１Ｒ^２、及びＳｉＲ^１Ｒ^２からなる群から独立して選択され、
    Ｙが結合のとき、Ｘは両方の環に直接結合され、
    各Ｒ^１は、ＰＥＧ、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、及び
    からなる群から独立して選択され、
    各Ｒ^２は、Ｈ、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、（ヘテロ）アリールオキシ、アリール、（ヘテロ）アリールアミノ、ＰＥＧ基、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、及び
    からなる群から独立して選択され、
    各Ｒ^３は、Ｈ、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、（ヘテロ）アリールオキシ、アリール、（ヘテロ）アリールアミノ、及びＰＥＧ基からなる群から独立して選択され、
    各Ｚは、Ｃ、Ｏ、及びＮからなる群から独立して選択され、
    各Ｑは、結合、ＮＨ、ＮＲ^４、及びＣＨ_２からなる群から独立して選択され、
    各Ｍは、独立して、ポリマーバンドギャップを変更することができる電子豊富なリンカーユニットであり、かつ、ポリマー主鎖に沿って均一に又は不規則に分布し、かつ、
    
    からなる群からそれぞれ独立して選択され、
    式中、
    各Ｒ^４は、１０ｍｇ／ｍＬを超えての水中での可溶性を付与することができる非イオン性側鎖であり、かつ、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、各ｘ’は独立して０〜２０の整数であり、各ｙ’は独立して０〜５０の整数である（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３、及びＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基からなる群からそれぞれ独立して選択され、
    それぞれの必要に応じたリンカーＬは、ポリマー主鎖に沿って均一に又は不規則に分布したアリール又はヘテロアリール基であり、かつ、別の基質、受容体染料、分子又は結合剤への連結のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、及びこれらの保護された基からなる群から選択される官能基で終端された１つ以上のペンダント鎖で置換され、
    Ｇ^１及びＧ^２は、水素、ハロゲン、アルキン、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフレート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、リン酸塩、ボロン酸置換アリール、ボロン酸エステル置換アリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、必要に応じて置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、必要に応じて置換されたフルオレン、基質又は結合剤への連結のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、及びこれらの保護された基から選択される官能基で終端された１つ以上のペンダント鎖で置換されたアリール又はヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、
    ａ、ｃ、及びｄは、均一に又は不規則にそれぞれ繰り返され得る前記構造内のそれぞれのユニットのモル％を定義し、ａは１０〜１００％のモル％であり、ｃは０〜９０％のモル％であり、各ｄは０〜２５％のモル％であり、
    各ｂは、独立して０又は１であり、
    ｍは、１〜約１０，０００の整数であり、
    各ｎは、独立して１〜２０の整数である、ことと、を含み、
    前記結合剤は、前記検体又は標的関連生体分子と相互作用することができる、方法。
16. 前記結合剤が、タンパク質、ペプチド、親和性リガンド、抗体、抗体フラグメント、糖、脂質、核酸又はアプタマーである、請求項１５に記載の方法。
17. 前記結合剤が抗体である、請求項１５に記載の方法。
18. 前記方法がフローサイトメトリー用に構成されている、請求項１７に記載の方法。
19. 前記結合剤が基質に結合されている、請求項１７に記載の方法。
20. 前記検体が、細胞表面上で発現されたタンパク質である、請求項１７に記載の方法。
21. 前記方法が、イムノアッセイとして構成されている、請求項１７に記載の方法。
22. 前記方法が、追加の検体を同時に検出するための追加の結合剤を提供することを更に含む、請求項１７に記載のアッセイ方法。