ES2874129T3 - Macromoléculas fotoactivas y usos de las mismas - Google Patents

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Abstract

Un polímero fluorescente soluble en agua que tiene la estructura de Fórmula II: **(Ver fórmula)** en donde; cada X se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en C y Si; cada Y se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en un enlace, CR1R2 y SiR1R2; cuando Y es un enlace, X está unido directamente a ambos anillos; cada R1 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), sal de alquilamonio, sal de alquiloxiamonio, sal de oligoéter amonio, sal de alquilsulfonato, sal de alcoxisulfonato, sal de oligoéter sulfonato, sulfonamido oligoéter, **(Ver fórmula)** y cada R2 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo, alqueno, alquino, cicloalquilo, haloalquilo, alcoxi, (hetero)ariloxi, arilo, (hetero)arilamino, un grupo PEG, sal de alquilamonio, sal de alquiloxiamonio, sal de oligoéter amonio, sal de alquilsulfonato, sal de alcoxisulfonato, sal de oligoéter sulfonato, sulfonamido oligoéter, y **(Ver fórmula)** cada R3 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo, alqueno, alquino, cicloalquilo, haloalquilo, alcoxi, (hetero)ariloxi, arilo, (hetero)arilamino y un grupo PEG; cada Z se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en C, O y N; cada Q se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en un enlace, NH, NR4 y CH2; cada M es independientemente una unidad enlazadora rica en electrones capaz de alterar el espacio de banda del polímero y se distribuye de manera uniforme o aleatoria a lo largo de la cadena principal del polímero y cada uno se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en **(Ver fórmula)** y en donde, cada R4 es un grupo lateral no iónico capaz de impartir solubilidad en agua en exceso si es de 10 mg/ml y cada uno se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en halógeno, hidroxilo, alquilo C1-C12, alqueno C2-C12, alquino C2-C12, cicloalquilo C3-C12, haloalquilo C1-C12, alcoxi C1-C12, (hetero)ariloxi C2-C18, (hetero)arilamino C2-C18, (CH2)X'(OCH2-CH2)y 'OCH3 donde cada x' es independientemente un número entero de 0 a 20; cada y' es independientemente un número entero de 0 a 50, y un grupo (hetero)arilo C2-C18; cada enlazador L opcional es un grupo arilo o heteroarilo distribuido de manera uniforme o aleatoria a lo largo de la cadena principal del polímero y está sustituido con una o más cadenas laterales terminadas con un grupo funcional seleccionado entre el grupo que consiste en amina, carbamato, ácido carboxílico, carboxilato, maleimida, éster activado, N-hidroxisuccinimidilo, hidracina, hidrazida, hidrazona, azida, alquino, aldehído, tiol, y grupos protegidos de los mismos para la conjugación con otro sustrato, colorante aceptor, molécula o agente aglutinante; cada uno de G1 y G2 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquino, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, arilo sustituido con halógeno, sililo, sal de diazonio, triflato, acetiloxi, azida, sulfonato, fosfato, arilo sustituido con ácido borónico, arilo sustituido con éster borónico, éster borónico, ácido borónico, dihidrofenantreno (DHP) opcionalmente sustituido, fluoreno opcionalmente sustituido, arilo o heteroarilo sustituido con una o más cadenas laterales terminadas con un grupo funcional seleccionado de amina, carbamato, ácido carboxílico, carboxilato, maleimida, éster activado, N- hidroxisuccinimidilo, hidracina, hidrazida, hidrazona, azida, alquino, aldehído, tiol y grupos protegidos de los mismos para conjugarlos con un sustrato o un agente aglutinante; a, c y d definen el % en moles de cada unidad dentro de la estructura, cada una de las cuales puede repetirse de manera uniforme o aleatoria y donde a es un % en moles de 10 a 100 %, c es un % en moles de 0 a 90 %, y cada d es un % en moles de 0 a 25 %; cada b es independientemente 0 o 1; m es un número entero de 1 a 10.000; y cada n es independientemente un número entero de 1 a 20.

Description

DESCRIPCIÓN
Macromoléculas fotoactivas y usos de las mismas
Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos con n.° 62/323.444, presentada el 15 de abril de 2016.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a complejos y métodos para detectar analitos en una muestra.
Antecedentes de la invención
Los polímeros fluorescentes solubles en agua se pueden usar en una variedad de aplicaciones biológicas al generar señales que pueden monitorizarse en tiempo real y proporcionan métodos simples y rápidos para la detección de eventos y objetivos biológicos.
El brillo de un colorante es una contribución general del coeficiente de extinción (e , medida de la cantidad de luz absorbida a una longitud de onda particular) y el rendimiento cuántico de fluorescencia (O, medida de la luz emitida en forma de radiación desde su estado excitado singlete). La mayoría de los colorantes violetas orgánicos informados, como la cumarina, BODIPY, cianina, escuaraína, etc. son moléculas únicas y muestran un coeficiente de extinción relativamente bajo en el intervalo de 10.000-70.000 M 1 cm 1 a 405 nm. Se J ha demostrado que las moléculas que tienen múltiples cromóforos exhiben un valor e más alto debido a la contribución global de diferentes cromóforos. Hay varios informes sobre enfoques de cadena principal dendrimérica y polimérica donde una sola molécula contiene múltiples cromóforos.
Sin embargo, muchos de los colorantes poliméricos informados anteriormente son altamente hidrófobos y se utilizan para aplicaciones de materiales como diodos emisores de luz, células solares, etc. En consecuencia, muchos colorantes poliméricos no son útiles en condiciones acuosas debido a la escasa solubilidad, brillo y ampliación de los espectros. Solo unos pocos informes tratan de polímeros fluorescentes solubles en agua para aplicaciones biológicas que son excitables con un láser de 405 nm y 355 nm. Por lo tanto, es necesaria la identificación de nuevos núcleos poliméricos para ampliar el arsenal de colorantes poliméricos solubles en agua para aplicaciones biológicas, incluso para la detección de analitos.
La presente invención aborda estas y otras desventajas de los complejos y métodos de la técnica anterior para detectar analitos en una muestra. Se conocen polímeros fluorescentes solubles en agua para su uso en la detección de un analito por el documento WO 2011/091086.
Breve sumario de la invención
La presente invención proporciona, en general, nuevos polímeros fluorescentes solubles en agua y métodos para detectar analitos en una muestra usando complejos que comprenden los polímeros fluorescentes conjugados con agentes aglutinantes.
En una primera realización, la presente invención proporciona un polímero fluorescente soluble en agua de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la estructura de Fórmula II.
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en donde;
cada X se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en C y Si;
cada Y se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en un enlace, CR1R2 y SiR1R2;
cuando Y es un enlace, X está unido directamente a ambos anillos;
cada R1 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), sal de alquilamonio, sal de alquiloxiamonio, sal de oligoéter amonio, sal de alquilsulfonato, sal de alcoxisulfonato, sal de oligoéter sulfonato, sulfonamido oligoéter, y
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cada R2 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo, alqueno, alquino, cicloalquilo, haloalquilo, alcoxi, (hetero)ariloxi, arilo, (hetero)arilamino, PEG, sal de alquilamonio, sal de alquiloxiamonio, sal de oligoéter amonio, sal de alquilsulfonato,
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sal de alcoxisulfonato, sal de oligoéter sulfonato, sulfonamido oligoéter, y
cada R3 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo, alqueno, alquino, cicloalquilo, haloalquilo, alcoxi, (hetero)ariloxi, arilo, (hetero)arilamino y PEG;
cada Z se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en C, O y N;
cada Q se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en un enlace, NH, NR4 y CH2;
cada M es independientemente una unidad enlazadora rica en electrones capaz de alterar el espacio de banda del polímero y se distribuye de manera uniforme o aleatoria a lo largo de la cadena principal del polímero y cada uno se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en
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en donde,
cada R4 es un grupo lateral no iónico capaz de impartir solubilidad en agua en exceso si es de 10 mg/ml y cada uno se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en halógeno, hidroxilo, alquilo C1-C12, alqueno C2-C12, alquino C2-C12, cicloalquilo C3-C12, haloalquilo C1-C12, alcoxi C1-C12, (hetero)ariloxi C2-C18, (hetero)arilamino C2-C18, (CH2)X'(OCH2-CH2)y OCH3 donde cada x' es independientemente un número entero de 0 a 20; cada y' es independientemente un número entero de 0 a 50, y un grupo (hetero)arilo C2-C i 8;
cada enlazador L opcional es un grupo arilo o heteroarilo distribuido de manera uniforme o aleatoria a lo largo de la cadena principal del polímero y está sustituido con una o más cadenas laterales terminadas con un grupo funcional seleccionado entre el grupo que consiste en amina, carbamato, ácido carboxílico, carboxilato, maleimida, éster activado, N-hidroxisuccinimidilo, hidracina, hidrazida, hidrazona, azida, alquino, aldehído, tiol, y grupos protegidos de los mismos para la conjugación con otro sustrato, colorante aceptor, molécula o agente aglutinante;
cada uno de G1 y G2 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquino, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, arilo sustituido con halógeno, sililo, sal de diazonio, triflato, acetiloxi, azida, sulfonato, fosfato, arilo sustituido con ácido borónico, arilo sustituido con éster borónico, éster borónico, ácido borónico, dihidrofenantreno (DHP) opcionalmente sustituido, fluoreno opcionalmente sustituido, arilo o heteroarilo sustituido con una o más cadenas laterales terminadas con un grupo funcional seleccionado de amina, carbamato, ácido carboxílico, carboxilato, maleimida, éster activado, N-hidroxisuccinimidilo, hidracina, hidrazida, hidrazona, azida, alquino, aldehído, tiol, y grupos protegidos del mismo para conjugarlos con un sustrato o un agente aglutinante;
a, c y d, definen el % en moles de cada unidad dentro de la estructura, que puede repetirse de manera uniforme o aleatoria y donde a es un % en moles de 10 a 100 %, c es un % en moles de 0 a 90 %, y cada d es un % en moles de 0 a 25 %; cada b es independientemente 0 o 1;
m es un número entero de 1 a 10.000; y
cada n es independientemente un número entero de 1 a 20.
Como se identificó, el polímero tiene la estructura de Fórmula II:
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en donde, cada f es independientemente un número entero de 0 a 50 y cada R5 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C12, alqueno C2-C12, alquino C2-C12, cicloalquilo C3-C12, haloalquilo C1-C12, alcoxi C1-C12, (hetero)ariloxi C2-C18, (hetero)arilamino C2-C18 y alcoxi C1-C12.
En algunos casos, el polímero tiene la estructura de Fórmula IV:
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En algunos casos, el polímero tiene la estructura de Fórmula V:
Figure imgf000006_0002
En algunos casos, el polímero es un copolímero y tiene la estructura de Fórmula VI:
Figure imgf000006_0003
en la que g y a juntos son un % en moles de 10 a 100 %.
En algunos casos, el polímero es un copolímero y tiene la estructura de Fórmula VII:
Figure imgf000007_0001
en donde, cada g y a juntos son un % en moles de 10 a 100 %; y cada f es independientemente un número entero de 0 a 50 y cada R5 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C12, alqueno C2-C12, alquino C2-C12, cicloalquilo C3-C12, haloalquilo C1-C12, alcoxi C1-C12, (hetero)ariloxi C2-C18, (hetero)arilamino C2-C18 y alcoxi C1-C12.
En algunos casos, el polímero es un copolímero que tiene la estructura de Fórmula VIII:
Figure imgf000007_0002
En algunos casos, el polímero es un copolímero y tiene la estructura de Fórmula IX:
Figure imgf000007_0003
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en donde,
cada R6 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, OH, SH, NHCOO-f-butilo, (CH2)nCOOH, (CH2)nCOOCH3 , (CH2)nNH2 , (CH2)nNH-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOOH, (CH2)nNHCO-(CH2)n-CO-(CH2)n-CH3 , (CH2)nNHCOO-(CH2)n-CH3 , (CH2)nNHCOOC(CH3)3 , cicloalquilo (CH2)nNHCO(C3-C12), (CH2)nNHCO(CH2CH2O)f, (CH2)nNHCO (CH2)nCOOH, (CH2)nNHCO(CH2)nCOO(CH2)nCH3 , (CH2)n(OCH2CH2)fOCH3 , N-maleimida, halógeno, alqueno C2-C12, alquino C2-C12, cicloalquilo C3-C12, halo alquilo C1-C12, (hetero)arilo C1-C12, (hetero)arilamino C1-C12 y bencilo opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, hidroxilo, alcoxi C1-C12, o (OCH2CH2)fOCH3;
cada f es independientemente un número entero de 0 a 50; y
cada n es independientemente un número entero de 1 a 20.
En algunas realizaciones, cada uno de G1 y G2 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en dihidrofenantreno (DHP) opcionalmente sustituido, fluoreno opcionalmente sustituido, arilo sustituido con una o más cadenas laterales terminadas con un grupo funcional, y un heteroarilo sustituido con una o más cadenas laterales terminadas con un grupo funcional.
En algunas realizaciones, cada uno de G1 y G2 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en
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en donde,
cada R6 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, OH, SH, NHCOO-t-butilo, (CH2)nCOOH, (CH2)nCOOCH3 , (CH2)nNH2 , (CH2)nNH-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOOH, (CH2)nNHCO-(CH2)n-CO-(CH2)n-CH3 , (CH2)nNHCOO-(CH2)n-CH3 , (CH2)nNHCOOC(CH3)3 , cicloalquilo (CH2)nNHCO(C3-C12), (CH2)nNHCO(CH2CH2O)f , (CH2)nNHCO (CH2)nCOOH, (CH2)nNHCO(CH2)nCOO(CH2)nCH3 , (CH2)n(OCH2CH2)OCH3 , N-maleimida, halógeno, alqueno C2-C12, alquino C2-C12, cicloalquilo C3-C12, halo alquilo C1-C12, (hetero)arilo C1-C12, (hetero)arilamino C1-C12 y bencilo opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, hidroxilo, alcoxi C1-C12, o (OCH2CH2XOCH3;
cada f es independientemente un número entero de 0 a 50; y
cada n es independientemente un número entero de 1 a 20.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para detectar un analito en una muestra que comprende:
proporcionar una muestra que se sospecha que contiene el analito;
poner en contacto la muestra con un agente aglutinante conjugado a un polímero soluble en agua que tiene la estructura de Fórmula
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en donde;
cada X se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en C y Si;
cada Y se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en un enlace, CR1R2 y SiR1R2;
cuando Y es un enlace, X está unido directamente a ambos anillos;
cada R1 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en una sal de alquilamonio, sal de alquiloxiamonio, sal de oligoéter amonio, sal de alquilsulfonato, sal de alcoxisulfonato,
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sal de oligoéter sulfonato, sulfonamido oligoéter, y
cada R2 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo, alqueno, alquino, cicloalquilo, haloalquilo, alcoxi, (hetero)ariloxi, arilo, (hetero)arilamino, PEG, sal de alquilamonio, sal de alquiloxiamonio, sal de oligoéter amonio, alquilsulfonato
sal, sal de alcoxisulfonato, sal de oligoéter sulfonato, sulfonamido oligoéter, y
cada R3 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo, alqueno, alquino, cicloalquilo, haloalquilo, alcoxi, (hetero)ariloxi, arilo, (hetero)arilamino y PEG;
cada Z se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en C, O y N;
cada Q se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en un enlace, NH, NR4 y CH2;
cada M es independientemente una unidad enlazadora rica en electrones capaz de alterar el espacio de banda del polímero y se distribuye de manera uniforme o aleatoria a lo largo de la cadena principal del polímero y cada uno se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en
Figure imgf000011_0001
en donde,
cada R4 es un grupo lateral no iónico capaz de impartir solubilidad en agua en exceso si es de 10 mg/ml y cada uno se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en halógeno, hidroxilo, alquilo C1-C12, alqueno C2-C12, alquino C2-C12, cicloalquilo C3-C12, haloalquilo C1-C12, alcoxi C1-C12, (hetero)ariloxi C2-C18, (hetero)arilamino C2-C18, (CH2)x '(OCH2-CH2)y OCH3 donde cada x' es independientemente un número entero de 0 a 20; cada y' es independientemente un número entero de 0 a 50, y un grupo (hetero)arilo C2-C18;
cada enlazador L opcional es un grupo arilo o heteroarilo distribuido de manera uniforme o aleatoria a lo largo de la cadena principal del polímero y está sustituido con una o más cadenas laterales terminadas con un grupo funcional seleccionado entre el grupo que consiste en amina, carbamato, ácido carboxílico, carboxilato, maleimida, éster activado, N-hidroxisuccinimidilo, hidracina, hidrazida, hidrazona, azida, alquino, aldehído, tiol, y grupos protegidos de los mismos para la conjugación con otro sustrato, colorante aceptor, molécula o agente aglutinante;
cada uno de G1 y G2 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquino, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, arilo sustituido con halógeno, sililo, sal de diazonio, triflato, acetiloxi, azida, sulfonato, fosfato, arilo sustituido con ácido borónico, arilo sustituido con éster borónico, éster borónico, ácido borónico, dihidrofenantreno (DHP) opcionalmente sustituido, fluoreno opcionalmente sustituido, arilo o heteroarilo sustituido con una o más cadenas laterales terminadas con un grupo funcional seleccionado de amina, carbamato, ácido carboxílico, carboxilato, maleimida, éster activado, N-hidroxisuccinimidilo, hidracina, hidrazida, hidrazona, azida, alquino, aldehído, tiol, y grupos protegidos del mismo para conjugarlos con un sustrato o un agente aglutinante;
a, c y d definen el % en moles de cada unidad dentro de la estructura, cada una de las cuales puede repetirse de manera uniforme o aleatoria y donde a es un % en moles de 10 a 100 %, c es un % en moles de 0 a 90 %, y cada d es un % en moles de 0 a 25 %;
cada b es independientemente 0 o 1;
m es un número entero de 1 a 10.000; y
cada n es independientemente un número entero de 1 a 20; y
en donde el agente aglutinante es capaz de interactuar con el analito o una biomolécula asociada a la diana.
En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente, aplicar una fuente de luz a la muestra que pueda excitar el polímero; y detectar si se emite luz desde el complejo de polímero conjugado.
En algunas realizaciones, el agente aglutinante es una proteína, péptido, ligando de afinidad, anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, azúcar, lípido, ácido nucleico o un aptámero. En algunas realizaciones, el agente aglutinante es un anticuerpo.
En algunas realizaciones, el método está configurado para citometría de flujo. En algunas realizaciones, el aglutinante está unido a un sustrato. En algunas realizaciones, el analito es una proteína expresada en la superficie celular.
En algunas realizaciones, el método está configurado como un inmunoensayo. En algunas realizaciones, el método comprende además proporcionar agentes aglutinantes adicionales para detectar analitos adicionales simultáneamente.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una comparación de los espectros de emisión de fluorescencia de polímeros de fluoreno (FF), dihidrofenantreno (DD) y fluoreno-DHP (DF).
La Figura 2 muestra los espectros de absorción del polímero FF y del polímero DD. El gráfico muestra la absorción del polímero DD (curva negra) a 390 y 410 nm, mientras que el polímero FF (curva gris) muestra los máximos alrededor de 401 nm. Las muestras se midieron a diferentes concentraciones.
La Figura 3 muestra el análisis de citometría de flujo de sangre completa lisada teñida con los nuevos anti-CD4 humanos marcados con polímeros y CD4 marcados con azul Pacífico. La intensidad de la señal positiva de los colorantes poliméricos fue casi 5 veces mayor que la del azul Pacífico.
La Figura 4 muestra que los polímeros de la presente invención poseen ciertas características físicas y químicas de absorción, fluorescencia, brillo, peso molecular, polidispersidad, relación de colorante a proteína cuando se conjugan con un anticuerpo, etc. El intervalo preferido de estos parámetros se muestra en esta tabla.
La Figura 5 muestra los espectros de excitación y emisión de polímeros en tándem. La excitación se llevó a cabo en los máximos del polímero (405 nm) y se observaron las emisiones de los diversos colorantes aceptores unidos a la cadena principal. Colorante 1 - FITC, Colorante 2 - Cy3B, Colorante 3 - Cy55.
Descripción detallada de la invención
I. General
La presente invención proporciona nuevos polímeros fluorescentes solubles en agua y métodos para detectar analitos en una muestra usando complejos que comprenden los polímeros fluorescentes conjugados con agentes aglutinantes. Los polímeros conjugados solubles en agua de la presente invención demuestran un brillo significativamente mayor en comparación con otros colorantes.
II. Definiciones
Las abreviaturas utilizadas en el presente documento tienen su significado convencional dentro de las técnicas química y biológica.
Como se usa en el presente documento, el término "amonio" se refiere a un catión que tiene la fórmula NHR3+ donde cada grupo R, de manera independiente, es hidrógeno o un grupo alquilo sustituido o no sustituido, arilo, aralquilo o alcoxi. Preferentemente, cada uno de los grupos R es hidrógeno.
Como se usa en el presente documento, se entiende que "oligoéter" significa un oligómero que contiene unidades estructurales repetidas que tienen una funcionalidad éter. Como se usa en el presente documento, se entiende que un "oligómero" significa una molécula que contiene una o más unidades repetidas estructurales identificables de la misma o diferente fórmula.
La expresión "grupo funcional sulfonato" o "sulfonato", como se usa en el presente documento, se refiere al anión sulfonato libre (-S (= O)2O-) y a sus sales. Por lo tanto, el término sulfonato abarca sales de sulfonato tales como sodio, litio, sulfonato de potasio y amonio.
El término "sulfonamido" como se usa en el presente documento se refiere a un grupo de fórmula -SO2NR- donde R es hidrógeno, alquilo o arilo.
El término "alquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un radical alifático lineal o ramificado, saturado, que tiene el número de átomos de carbono indicado. Por ejemplo, alquilo C1-C6 incluye, pero no se limita a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, ferc-butilo, pentilo, isopentilo, hexilo, etc. Otros grupos alquilo incluyen, aunque no de forma limitativa, heptilo, octilo, nonilo, decilo, etc. El alquilo puede incluir cualquier número de carbonos, tal como 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 3-4, 3-5, 3-6, 4-5, 4-6 y 5­ 6. El grupo alquilo es típicamente monovalente, pero puede ser divalente, como cuando el grupo alquilo enlaza dos restos.
El término "cicloalquilo" como se usa en el presente documento se refiere a un conjunto de anillo monocíclico, bicíclico condensado o policíclico con puente, saturado o parcialmente insaturado, que contiene de 3 a 12 átomos en el anillo, o el número de átomos indicado en anillos monocíclicos incluye, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y ciclooctilo. Los anillos bicíclicos y policíclicos incluyen, por ejemplo, norbornano, decahidronaftaleno y adamantano. Por ejemplo, cicloalquilo C3-8 incluye ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclooctilo y norbornano.
El término "haloalquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a alquilo como se definió anteriormente en el que algunos o todos los átomos de hidrógeno están sustituidos con átomos de halógeno. Halógeno (halo) representa preferentemente cloro o flúor, pero también puede ser bromo o yodo. Por ejemplo, haloalquilo incluye trifluorometilo, fluorometilo, 1,2,3,4,5-pentafluorofenilo, etc. El término "perfluoro" define un compuesto o radical que tiene al menos dos hidrógenos disponibles sustituidos con flúor. Por ejemplo, perfluorofenilo se refiere a 1,2,3,4,5-pentafluorofenilo, perfluorometano se refiere a 1,1,1-trifluorometilo y perfluorometoxi se refiere a 1,1,1-trifluorometoxi. Como se usa en el presente documento, el término "halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo y yodo.
El término "alcoxi" como se usa en el presente documento se refiere a un grupo alquilo, como se ha definido anteriormente, que tiene un átomo de oxígeno que conecta el grupo alquilo al punto de unión. Los grupos alcoxi incluyen, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, 2-butoxi, iso-butoxi, sec-butoxi, ferc-butoxi, pentoxi, hexoxi, etc. Los grupos alcoxi se pueden sustituir adicionalmente con una variedad de sustituyentes descritos en la presente. Por ejemplo, los grupos alcoxi se pueden sustituir con halógenos para formar un grupo "halo-alcoxi". El término "alqueno" como se usa en el presente documento se refiere a un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada, que tiene al menos un doble enlace. Los ejemplos de grupos alqueno incluyen, pero sin limitarse a, vinilo, propenilo, isopropenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutenilo, butadienilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, isopentenilo, 1,3-pentadienilo, 1,4-pentadienilo, 1-hexenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo, 1,3-hexadienilo, 1,4-hexadienilo, 1,5-hexadienilo, 2,4-hexadienilo o 1,3,5-hexatrienilo. El grupo alqueno es típicamente monovalente, pero puede ser divalente, como cuando el grupo alquenilo enlaza dos restos.
El término "alquino" como se usa en el presente documento se refiere a un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada, que tiene al menos un triple enlace. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen, pero sin limitarse a, acetilenilo, propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, isobutinilo, sec-butinilo, butadinilo, 1 -pentinilo, 2-pentinilo, isopentinilo, 1,3-pentadiinilo, 1,4-pentadiinilo, 1 -hexinilo, 2-hexinilo, 3-hexinilo, 1,3-hexadiinilo, 1,4-hexadiinilo, 1,5-hexadiinilo, 2,4-hexadiinilo o 1,3,5-hexatriinilo. El grupo alquinilo es típicamente monovalente, pero puede ser divalente, como cuando el grupo alquinilo enlaza dos restos.
El término "arilo" como se usa en el presente documento se refiere a un conjunto de anillo aromático, monocíclico o bicíclico condensado, tricíclico o mayor, que contiene de 6 a 16 átomos de carbono en el anillo. Por ejemplo, arilo puede ser fenilo, bencilo o naftilo, preferentemente fenilo. "Arileno" significa un radical divalente derivado de un grupo arilo. Los grupos arilo pueden ser mono, di- o tri-sustituidos por uno, dos o tres radicales seleccionados de alquilo, alcoxi, arilo, hidroxi, halógeno, ciano, amino, amino-alquilo, trifluorometilo, alquilendioxi y oxi-C2-C3-alquileno; todos los cuales están opcionalmente sustituidos, por ejemplo, como se define en el presente documento anteriormente; o 1- o 2-naftilo; o 1- o 2-fenantrenilo. El alquilendioxi es un sustituto divalente unido a dos átomos de carbono adyacentes de fenilo, por ejemplo, metilendioxi o etilendioxi. Oxi-C2-C3-alquileno es también un sustituyente divalente unido a dos átomos de carbono adyacentes de fenilo, por ejemplo, oxietileno u oxipropileno. Un ejemplo de oxi-C2-C3-alquilen-fenilo es 2,3-dihidrobenzofuran-5-ilo.
Como arilo, se prefiere naftilo, fenilo o fenilo mono o disustituido por alcoxi, fenilo, halógeno, alquilo o trifluorometilo, especialmente fenilo o fenil-mono o disustituido por alcoxi, halógeno o trifluorometilo, y, en particular, fenilo.
El término "ariloxi" como se usa en el presente documento se refiere a un grupo O-arilo, en donde arilo es como se definió anteriormente. Un grupo ariloxi puede estar no sustituido o sustituido con uno o dos sustituyentes adecuados. El término "fenoxi" se refiere a un grupo ariloxi en el que el resto arilo es un anillo de fenilo. El término "heteroariloxi" como se usa en el presente documento significa un grupo -O-heteroarilo, en donde heteroarilo es como se define a continuación. El término "(hetero)ariloxi" se usa para indicar que el resto es un grupo ariloxi o heteroariloxi.
Los términos "polietilenglicol" o "PEG", como se usan en el presente documento, se refieren a la familia de polímeros lineales solubilizantes en agua biocompatibles basados en la unidad de monómero de etilenglicol.
El término "heteroarilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un conjunto de anillo aromático monocíclico o bicíclico condensado o tricíclico que contiene de 5 a 16 átomos de anillo, donde de 1 a 4 de los átomos del anillo son un heteroátomo cada N, O o S. Por ejemplo, heteroarilo incluye piridilo, indolilo, indazolilo, quinoxalinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzotienilo, benzofuranilo, furanilo, pirrolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, triazolilo, tetrazolilo, pirazolilo, imidazolilo, tienilo, o cualquier otro radical sustituido, especialmente mono o disustituido, por ejemplo, alquilo, nitro o halógeno. Piridilo representa 2-, 3- o 4-piridilo, ventajosamente 2- o 3-piridilo. Tienilo representa 2- o 3-tienilo. Quinolinilo representa preferentemente 2-, 3- o 4-quinolinilo. Isoquinolinilo representa preferentemente 1-, 3- o 4-isoquinolinilo. Benzopiranilo, benzotiopiranilo representa preferentemente 3-benzopiranilo o 3-benzotiopiranilo, respectivamente. Tiazolilo representa preferentemente 2- o 4-tiazolilo, y lo más preferido, 4-tiazolilo. Triazolilo es preferentemente 1-, 2- o 5-(1,2,4-triazolilo). Tetrazolilo es preferentemente 5-tetrazolilo.
Preferentemente, heteroarilo es piridilo, indolilo, quinolinilo, pirrolilo, tiazolilo, isoxazolilo, triazolilo, tetrazolilo, pirazolilo, imidazolilo, tienilo, furanilo, benzotiazolilo, benzofuranilo, isoquinolinilo, benzotienilo, oxazolilo, indazolilo, o cualquiera de los radicales sustituidos, especialmente mono o disustituidos.
De manera similar, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo se varían y se seleccionan entre: -halógeno, -OR', -OC(O)R', -NR'R", -SR', -R', -CN, -NO2 , -CO2R', -CONR'R", -C(O)R', -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR"C(O)2R', ,-NR'-C(O)NR"R'", -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -N3 , -CH(Ph)2, perfluoro(C-i-C4)alcoxi y perfluoro(C1-C4)alquilo, en un número que va desde cero hasta el número total de valencias abiertas en el sistema de anillo aromático; y donde R', R" y R''' se seleccionan independientemente de hidrógeno, (C-i -C8)alquilo y heteroalquilo, arilo y heteroarilo no sustituidos, (arilo no sustituido)-(C1-C4)alquilo y (arilo no sustituido)oxi-(C-i-C4)alquilo.
Dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden opcionalmente reemplazarse con un sustituyente de fórmula -T-C(O)-(CH2)q-U-, en donde T y U son independientemente -NH-, -O-, -CH2- o un enlace sencillo, y q es un número entero de 0 a 2. Como alternativa, dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden opcionalmente reemplazarse con un sustituyente de fórmula -A-(CH2)r-B-, en donde A y B son independientemente -CH2-, -O-, -NH-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -SO^Nr '- o un enlace sencillo, y r es un número entero de 1 a 3. Uno de los enlaces sencillos del nuevo anillo así formado se puede sustituir opcionalmente por un doble enlace. Como alternativa, dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden opcionalmente reemplazarse con un sustituyente de fórmula -(CH2)s-X-(CH2)t-, donde s y t son independientemente números enteros de 0 a 3, y X es -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, o -S(O)2NR'-. El sustituyente R' en -NR'- y -S(O)2NR'- se selecciona de hidrógeno o (C1-C6)alquilo no sustituido.
El término "(hetero)arilamino" como se usa en el presente documento se refiere a un radical amina sustituido con un grupo arilo (por ejemplo, -NH-arilo). Un arilamino también puede ser un radical arilo sustituido con un grupo amina (por ejemplo, -aril-NH2). Los arilaminos pueden estar sustituidos o no sustituidos.
El término "amina" como se usa en el presente documento se refiere a un grupo alquilo como se define en el mismo, que tiene uno o más grupos amino. Los grupos amino pueden ser primarios, secundarios o terciarios. La alquilamina se puede sustituir adicionalmente con un grupo hidroxi. Las aminas útiles en la presente invención incluyen, pero sin limitarse a, etilamina, propilamina, isopropilamina, etilendiamina y etanolamina. El grupo amino puede enlazar la alquilamina al punto de unión con el resto del compuesto, estar en la posición omega del grupo alquilo, o enlazar entre sí al menos dos átomos de carbono del grupo alquilo. Un experto en la materia apreciará que otras alquilaminas son útiles en la presente invención.
El término "carbamato", como se usa en el presente documento, se refiere al grupo funcional que tiene la estructura -NR"CO2R', donde R' y R" se seleccionan independientemente de hidrógeno, (C1-C8)alquilo y heteroalquilo, arilo y heteroarilo no sustituidos, (arilo no sustituido)-(C1-C4)alquilo y (arilo no sustituido)oxi-(C1-C4)alquilo. Ejemplos de carbamatos incluyen t-Boc, Fmoc, benciloxicarbonilo, alloc, carbamato de metilo, carbamato de etilo, carbamato de 9-(2-sulfb)fluorenilmetilo, carbamato de 9-(2,7-dibromo)fluorenilmetilo, Tbfmoc, Climoc, Bimoc, DBD-Tmoc, Bsmoc, Troc, Teoc, carbamato de 2-feniletilo, Adpoc, carbamato de 2-cloroetilo, carbamato de 1,1 -dimetil-2-haloetilo, DB-t-BOC, TCBOC, Bpoc, t-Bumeoc, Pyoc, Bnpeoc, _V-(2-pivaloilamino)-1,1 -dimetiletil carbamato, NpSSPeoc.
El término "carboxilato" como se usa en el presente documento se refiere a la base conjugada de un ácido carboxílico, que generalmente se puede representar por la fórmula RCOO. Por ejemplo, la expresión "carboxilato de magnesio" se refiere a la sal de magnesio del ácido carboxílico.
La expresión "éster activado" como se usa en el presente documento se refiere a grupos activadores de carboxilo empleados en la química de péptidos para promover la condensación fácil de un grupo carboxilo con un grupo amino libre de un derivado de aminoácido. Las descripciones de estos grupos activadores de carboxilo se encuentran en libros de texto generales de química de péptidos; por ejemplo, K. D. Kopple, "Peptides and Amino Acids", W. A. Benjamin, Inc., Nueva York, 1966, pág. 50 - 51 y E. Schroder y K. Lubke, "The Peptides"; vol. 1, Academic Press, Nueva York, 1965, pág. 77 - 128.
Los términos "hidracina" e "hidrazida" se refieren a compuestos que contienen nitrógenos unidos por enlaces sencillos, uno de los cuales es un grupo funcional de amina primaria.
El término "aldehído" como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto químico que tiene un grupo -CHO.
El término "tiol", como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que contiene el grupo funcional compuesto por un enlace sulfuro-hidrógeno. La estructura química general del grupo funcional tiol es R-Sh , donde R representa un alquilo, alqueno, arilo u otro grupo de átomos que contenga carbono.
El término "sililo" como se usa en el presente documento se refiere a Si(Rz)3 en donde cada Rz independientemente es alquilarilo u otro grupo de átomos que contiene carbono.
La expresión "sal de diazonio" como se usa en el presente documento se refiere a un grupo de compuestos orgánicos con una estructura de R-N2+X-, en donde R puede ser cualquier residuo orgánico (por ejemplo, alquilo o arilo) y X es un anión inorgánico u orgánico (por ejemplo, halógeno).
El término "triflato" también denominado trifluorometanosulfonato, es un grupo con la fórmula CF3SO3.
La expresión "ácido borónico" como se usa en el presente documento se refiere a una estructura -B(OH)2. Los expertos en la materia reconocen que un ácido borónico puede estar presente como un éster de boronato en varias etapas de la síntesis de los desactivadores. Se pretende que el ácido borónico incluya tales ésteres. La expresión "éster borónico" o "éster de boronato" como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto químico que contiene un resto -B(Z1)(Z2), en donde Z1 y Z2 juntos forman un resto donde el átomo unido al boro en cada caso es un átomo de oxígeno. En algunas realizaciones, el resto de éster borónico es un anillo de 5 miembros. En algunas otras realizaciones, el resto de éster borónico es un anillo de 6 miembros. En algunas otras realizaciones, el resto de éster borónico es una mezcla de un anillo de 5 miembros y un anillo de 6 miembros.
III. Composiciones
POLÍMEROS
Los compuestos de la presente invención comprenden polímeros fluorescentes solubles en agua que tienen la estructura de las fórmulas II-IX. En algunas realizaciones, los polímeros de la presente invención utilizan dihidrofenantreno (DHP), fluoreno y combinaciones de monómeros de DHP y fluoreno como se muestra en la Fórmula II:
Figure imgf000016_0001
Los complejos de polímeros de la presente invención pueden contener unidades capaces de alterar el espacio de banda del polímero y se distribuyen de manera uniforme o aleatoria a lo largo de la cadena principal del polímero. Estas unidades se representan en la Fórmula II como M. Los complejos poliméricos de la presente invención también pueden contener enlazadores representados en la Fórmula II como L. Cada enlazador opcional L es un grupo arilo o heteroarilo distribuido de manera uniforme o aleatoria a lo largo de la cadena principal del polímero y está sustituido con una o más cadenas laterales terminadas con un grupo funcional seleccionado entre el grupo que consiste en amina, carbamato, ácido carboxílico, carboxilato, maleimida, éster activado, N-hidroxisuccinimidilo, hidracina, hidrazida, hidrazona, azida, alquino, aldehído, tiol y grupos protegidos de los mismos para conjugarlos con un sustrato o agente aglutinante.
Los complejos de polímeros de la presente invención también contienen unidades de terminación representadas en la Fórmula II como cada uno de G1 y G2, que se selecciona cada uno independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquino, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, arilo sustituido con halógeno, sililo, sal de diazonio, triflato, acetiloxi, azida, sulfonato, fosfato, arilo sustituido con ácido borónico, arilo sustituido con éster borónico, éster borónico, ácido borónico, dihidrofenantreno (DHP) opcionalmente sustituido, fluoreno opcionalmente sustituido, arilo o heteroarilo sustituido con una o más cadenas laterales terminadas con un grupo funcional seleccionado de amina, carbamato, ácido carboxílico, carboxilato, maleimida, éster activado, N-hidroxisuccinimidilo, hidracina, hidrazida, hidrazona, azida, alquino, aldehído, tiol y grupos protegidos de los mismos para conjugarlos con un sustrato o agente aglutinante.
Como se identificó anteriormente, los polímeros de la invención tienen la estructura de Fórmula II:
Figure imgf000017_0001
En algunos casos, el polímero tiene la estructura de Fórmula V:
Figure imgf000017_0002
En algunos casos, el polímero es un copolímero y tiene la estructura de Fórmula VI:
Figure imgf000018_0001
En algunos casos, el polímero es un copolímero y tiene la estructura de Fórmula VII:
Figure imgf000018_0002
En algunas realizaciones, el polímero tiene colorantes aceptores unidos a la cadena principal que permitirán excitar la cadena principal del polímero y controlar la emisión de los colorantes aceptores unidos a la cadena principal a través de la transferencia de energía. Los colorantes aceptores útiles en la invención incluyen FITC, CY3B, Cy55, Alexa 488, Texas red, Cy5, Cy7, Alexa 750 y 800CW. Por ejemplo, los polímeros con colorantes aceptores de la presente invención incluyen (en donde R1 unido a X es -Z-(CH2)n-SO2-QR3):
Figure imgf000018_0003
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es un coorane acepar
MONÓMEROS
Los monómeros de la presente invención incluyen monómeros basados en dihidrofenantreno (DHP) y fluoreno. Por ejemplo, los monómeros de la presente invención incluyen:
Figure imgf000019_0002
y.
Donde ambos extremos terminales de los monómeros son independientemente o ambos un átomo de halógeno, éster borónico o ácido borónico, sililo, sal de diazonio, triflato, acetiloxi, sulfonato o fosfato que pueden sufrir reacciones de polimerización catalizadas por sal de níquel o Pd. R1 es independientemente un grupo lateral capaz de impartir solubilidad en agua/tampón y cada R1 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en una sal de alquilamonio, sal de alquiloxiamonio, sal de oligoéter amonio, sal de alquilsulfonato, sal de alcoxisulfonato, sal de oligoéter sulfonato,
Figure imgf000020_0001
sulfonamido oligoéter y; cada R2 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo, alqueno, alquino, cicloalquilo, haloalquilo, alcoxi, (hetero)ariloxi, arilo, (hetero)arilamino, PEG, sal de alquilamonio, sal de alquiloxiamonio, sal de oligoéter amonio, sal de alquilsulfonato, sal de alcoxisulfonato, sal de oligoéter sulfonato,
Figure imgf000020_0002
sulfonamido oligoéter y; cada R3 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo, alqueno, alquino, cicloalquilo, haloalquilo, alcoxi, (hetero)ariloxi, arilo, (hetero)arilamino y PEG; cada Z se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en C, O y N; cada Q se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en un enlace, NH, NR4 y CH2 ,; y cada R5 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C12, alqueno C2-C12, alquino C2-C12, cicloalquilo C3-C12, haloalquilo C1-C12, alcoxi C1-C12, (hetero)ariloxi C2-C18, (hetero)arilamino C2-C18 y alcoxi C1-C12.
En algunas realizaciones, los monómeros de la presente invención también incluyen monómeros con puente. Por ejemplo, los monómeros con puente de la presente invención incluyen:
Figure imgf000020_0003
SINTESIS
Los monómeros de DHP de la presente invención se pueden preparar como se muestra a continuación.
Figure imgf000021_0001
Cromatografía CHCI3, MeOH
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Ester bromo-boromco de fluoreno Ester bromo-boromco de DHP
Por ejemplo, 2,7-dibromo-trans-9,10-dihidrofenantreno-9,10-diol (DHP-OH) se puede preparar de la siguiente manera. En un matraz cónico (2000 l), se añade aproximadamente 26 g de NaBH4 en una mezcla de agua y etanol con agitación (120 ml 780 ml). A esta solución, se añade aproximadamente 24 g de 2,7-dibromofenantreno, 9,10-diona en porciones pero rápidamente (en 5 min). La mezcla de reacción se dejó agitar durante un día. El color de la solución cambia de rojo anaranjado a amarillo pálido a blanco al final de la reacción. Se detiene la reacción y se neutraliza la mezcla de reacción con ácido HCl diluido. Después de la neutralización, se filtra el precipitado blanco y lavar con agua en exceso. El precipitado blanco así obtenido se lavó con etanol (100 ml) y metanol (100 ml) muy frío (<-15 °C).
DHP-OSO3H se puede preparar de la siguiente manera. En un matraz de fondo redondo de 2 bocas, se disolvieron DHP-OH (3,6 g) y 18C6 (500 mg) en 120 ml de THF. La solución se purgó con nitrógeno (20 min) y se añadió NaH (2 g) mientras continuaba la purga con nitrógeno. El color de la solución cambia de incolora a rosa pálido, rosa oscuro, marrón y verde oscuro en 10-15 min. En otro FR, se disolvieron 12 g de 1,3 propano sultona en 20 ml de THF y se purgó con nitrógeno. Esta solución de sultona se añadió a la solución de DHP-OH mediante un embudo de adición durante un período de 20 a 30 minutos. La reacción se agitó a TA durante 4-5 h. Se evaporaron los disolventes y se disolvió el precipitado en agua. Se añadió acetona para obtener un precipitado blanco de DPS en forma de sal disódica. Se filtró el precipitado y se redisolvió en agua (cantidad mínima), se neutralizó con HCl y se precipitó nuevamente en acetona. La precipitación repetida (2-3 veces) seguida de centrifugación da DPS como un sólido blanco.
DHP-OSO2Cl se puede preparar de la siguiente manera. Se recogieron 5 g de DHP-OSO3H en un matraz de fondo redondo y se mezclaron con 25 ml de DMF. A esto, se añadieron gota a gota unos 10 ml de SOCl2 y la mezcla se dejó agitar durante la noche. La mañana siguiente, la mezcla de reacción se vertió en 200 ml de agua y el precipitado se filtró y se secó.
DHP-sulfonamida PEG se puede preparar de la siguiente manera. Se mezcló DHP-OSO2Cl con 2,2 equivalentes de PEG amina en una mezcla de diclorometano/TEA. Después de 3 h de reacción de sonicación, el producto en bruto se extrajo en diclorometano seguido de cromatografía en columna (gel de sílice, MeOH-CHCh).
El éster diborónico de DHP-sulfonamida PEG se puede preparar de la siguiente manera. El compuesto de dibromo se mezcló con DMSO bajo nitrógeno y a este se le añadieron 3 equivalentes de bispinacolatodiboro. Los reactivos se hicieron reaccionar con 12 equivalentes de acetato de potasio y 4 equivalentes de catalizador Pd(dppf)Cl2 durante 5 horas a 80 grados. La mezcla de reacción se enfrió y se extrajo con CHCl3/agua. La capa orgánica se concentró y se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice, MeOH-CHCh).
De manera similar, los monómeros de fluoreno de la presente invención se pueden preparar como se describe a continuación. Por ejemplo, FL-OSO3H se puede preparar de la siguiente manera. En un matraz de fondo redondo de 2 bocas, se mezclaron 5 g de fluoreno en 70 de DMSO. La solución se purgó con nitrógeno (20 min) y se añadió NaOH al 50% (12 eq) mientras continuaba la purga de nitrógeno. El color de la solución cambia de incoloro a marrón oscuro. Se pesó propano sultona (3 eq) y se disolvió en DMSO. Esto se añadió gota a gota a la mezcla de reacción de fluoreno durante un período de 5 minutos. La reacción se agitó a TA durante 4-5 h. Se evaporaron los disolventes y se disolvió el precipitado en agua. Se añadió acetona para obtener un precipitado blanco de DPS en forma de sal disódica. Se filtró el precipitado y se redisolvió en agua (cantidad mínima), se neutralizó con HCl y se precipitó nuevamente en acetona. La precipitación repetida (2-3 veces) seguida de centrifugación da FL-OSO3H como sólido blanco.
FL-OSO2Cl se puede preparar de la siguiente manera. Se recogieron 5 g de FL-OSO3H en un matraz de fondo redondo y se mezclaron con 25 ml de DMF. A esto, se añadieron gota a gota unos 10 ml de SOCl2 y la mezcla se dejó agitar durante la noche. La mañana siguiente, la mezcla de reacción se vertió en 200 ml de agua y el precipitado se filtró y se secó.
FL-sulfonamida PEG se puede preparar de la siguiente manera. Se mezcló FL-OSO2Cl con 2,2 equivalentes de PEG amina en una mezcla de diclorometano/TEA. Después de 3 h de reacción de sonicación, el producto en bruto se extrajo en diclorometano seguido de cromatografía en columna (gel de sílice, MeOH-CHCh).
El éster diborónico de FL-sulfonamida PEG se puede preparar de la siguiente manera. El compuesto de dibromo se mezcló con DMSO bajo nitrógeno y a este se le añadieron 3 equivalentes de bispinacolatodiboro. Los reactivos se hicieron reaccionar con 12 equivalentes de acetato de potasio y 4 equivalentes de catalizador Pd(dppf)Cl2 durante 5 horas a 80 grados. La mezcla de reacción se enfrió y se extrajo con CHCl3/agua. La capa orgánica se concentró y se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice, MeOH-CHCh).
POLIMERIZACIÓN
Los compuestos descritos en las realizaciones anteriores se pueden preparar usando procedimientos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, los polímeros fluorescentes se pueden preparar a partir de monómeros de dihidrofenantreno (DHP) combinados con unidades enlazadoras ricas en electrones. En algunas realizaciones, los colorantes poliméricos brillantes se pueden preparar a partir de monómeros de fluoreno combinados con unidades enlazadoras ricas en electrones. En algunas realizaciones, los colorantes poliméricos brillantes se pueden preparar a partir de una combinación de monómeros de DHP y fluoreno combinados con unidades enlazadoras ricas en electrones.
Generalmente, las unidades de monómero de polimerización descritas anteriormente se pueden lograr usando técnicas de polimerización conocidas por los expertos en la materia o usando métodos conocidos en la técnica en combinación con los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, la síntesis de derivados de éster diborónico a partir de un monómero de dihaluro se puede lograr mediante el acoplamiento de Suzuki con bis(pinacolato)diboro:
Figure imgf000023_0001
De manera similar, la polimerización también se puede lograr mediante el acoplamiento de Suzuki:
Figure imgf000023_0002
Donde J1 y J2 son independientemente H, Br, B(OH)2 o un éster borónico.
Por ejemplo, la polimerización puede realizarse de la siguiente manera. En un matraz de fondo redondo se recogieron los monómeros de bromo y borónico en una mezcla (DMF-agua) y se purgaron con nitrógeno durante 10 minutos. Bajo nitrógeno, se mezclaron aproximadamente 20 equivalentes de CsF y Pd(OAc)2 al 10% y se calentaron a 80 °C. La polimerización se controló usando espectroscopía UV-Vis y cromatografía SEC. Posteriormente a la mezcla de reacción, se añadió un agente de terminación (seleccionado de G1) que contenía el grupo funcional apropiado y 3 horas más tarde se añadió el segundo agente de terminación (seleccionado de G2). Después de la reacción, la mezcla de reacción en bruto se evaporó y se pasó a través de una columna de filtración en gel para eliminar moléculas orgánicas pequeñas y oligómeros de bajo peso molecular.
UNIDADES DE TERMINACIÓN
Los enlazadores y las unidades de terminación se pueden conjugar con una cadena principal de polímero de la presente invención mediante mecanismos similares a los descritos anteriormente. Por ejemplo, se pueden usar ésteres de bromo y borónicos de unidades de terminación para unir uno o ambos extremos de un polímero. El uso de ésteres de bromo y borónicos de unidades de terminación unirá ambos extremos del polímero. El uso de solo una forma, ya sea un éster de bromo o borónico de una unidad de terminación, unirá solo aquellos extremos terminados con su respectivo complemento y para polimerizaciones simétricas se puede usar para modificar estadísticamente solo un extremo de un polímero. Para los polímeros asimétricos, este enfoque se usa para asegurar químicamente que los polímeros solo se modifican en un extremo de cadena simple. Las unidades de terminación también se pueden unir asimétricamente haciendo reaccionar primero una unidad de terminación con bromo con un polímero con extremos en Y, posteriormente, haciendo reaccionar el polímero con una unidad de terminación de éster borónico.
Por ejemplo, los agentes de terminación de la presente invención se pueden preparar como se muestra a continuación.
Figure imgf000024_0001
AGENTES AGLUTINANTES
Un "agente aglutinante" de la invención puede ser cualquier molécula o complejo de moléculas capaz de unirse específicamente al analito diana. Un agente aglutinante de la invención incluye, por ejemplo, proteínas, pequeñas moléculas orgánicas, carbohidratos (incluidos polisacáridos), oligonucleótidos, polinucleótidos, lípidos, ligando de afinidad, anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un aptámero y similares. En algunas realizaciones, el agente aglutinante es un anticuerpo o un fragmento del mismo. La unión específica en el contexto de la presente invención se refiere a una reacción aglutinante que es determinante de la presencia de un analito diana en presencia de una población heterogénea. Por tanto, en las condiciones de ensayo designadas, los agentes aglutinantes especificados se unen preferentemente a una proteína o isoforma particular de la proteína particular y no se unen en una cantidad significativa a otras proteínas u otras isoformas presentes en la muestra.
Cuando los agentes aglutinantes son anticuerpos, pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales. El término anticuerpo, como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina (Ig). Dichos anticuerpos incluyen, pero sin limitarse a, policlonales, monoclonales, anticuerpos policlonales monoespecíficos, miméticos de anticuerpos, quiméricos, de cadena sencilla, fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2, Fv y una biblioteca de expresión de Fab.
COMPLEJOS
En general, los polímeros fluorescentes de la presente invención se pueden conjugar con agentes aglutinantes usando técnicas conocidas por los expertos en la materia o usando métodos conocidos en la técnica en combinación con los métodos descritos en el presente documento.
Figure imgf000024_0002
Por ejemplo, la preparación del éster de polímero NHS puede realizarse de la siguiente manera. Se toman 5 mg del polímero en un vial limpio y se disuelven en 1 ml de CH3CN seco. A esto, se añaden 15 mg de TSTU y se agita durante 2 minutos más. A esto, se añaden 100 ul de DIPEA y se continúa agitando durante la noche con la terminación sellada con parafilm. Posteriormente, se evaporan los disolventes orgánicos de la mezcla de reacción. Se disuelve el NHS en bruto en aproximadamente 750 ul de tampón 1xBBS (pH 8,8) mediante un vórtice rápido y se transfiere a la columna Zeba 40K MWCO. Se centrifuga la muestra a 2200 RPM durante 2 min y se utiliza este polímero NHS inmediatamente.
La conjugación de polímero NHS con CD4 puede realizarse de la siguiente manera. Se toma el polímero NHS en 1XBBS (~ 800 uL) que se centrifugó, se añade a 0,6 mg de CD4 y se mezcla con 100 ul de tampón borato 0,5 M (pH 9,0). Se agita en el vórtex rápidamente durante 30 segundos y se deja mezclar durante 3-4 horas en la mezcla de Coulter.
La purificación del conjugado a través de la columna Histrap HP puede realizarse de la siguiente manera.
Enfoque 1: Después de la reacción en bruto, se purifica el conjugado usando una columna Histrap HP. Se carga la muestra con tampón 1XPBS y se recoge la fracción no unida. Esto se puede hacer usando 20CV de tampón. Posteriormente, se cambia el tampón para lavar la fracción unida que tiene anticuerpo conjugado y libre. Esto se puede hacer usando 1XPBS con imidazol 0,25 M funcionando para 10CV.
Enfoque 2: Columna Hitrap SP Sepharose FF. Se equilibra la columna y se carga la muestra con tampón citrato 20 mM pH 3,5 y se recoge la fracción no unida. Esto se puede hacer usando 20CV de tampón. Posteriormente, se cambia el tampón para eluir la fracción unida que tiene anticuerpo conjugado y libre. Esto se puede hacer usando tampón Tris 20 mM pH 8,5 funcionando para 20CV.
Enfoque 3: Se carga el conjugado en bruto en un sistema de filtración de flujo tangencial equipado con una membrana MWCO de 300K. El conjugado se lava usando 1XPBS hasta que el filtrado no muestre absorción a 405 nm. Posteriormente se concentra el compuesto.
La purificación del conjugado a través de la columna SEC se puede realizar de la siguiente manera. Se carga el conjugado en bruto que contiene el anticuerpo libre en la columna de exclusión de tamaño, usando 1XPBS. Se reúnen los tubos después de comprobar los espectros de absorción y se concentran en un Amicon Ultra-15 con un concentrador centrífugo MWCO de 30 KDa.
IV. Métodos de detección de un analito
VISIÓN GENERAL
La presente invención proporciona un método para detectar un analito en una muestra que comprende: proporcionar una muestra de la que se sospecha que contiene un analito; proporcionar un complejo de polímero conjugado, que comprende un agente aglutinante conjugado con un polímero conjugado soluble en agua. El agente aglutinante es capaz de interactuar con el analito. Se aplica una fuente de luz a la muestra que puede excitar el polímero y se detecta la luz emitida por el complejo de polímero conjugado. En el ensayo típico, los polímeros fluorescentes de la invención son excitables con una luz que tiene una longitud de onda entre aproximadamente 395 nm y aproximadamente 415 nm. La luz emitida está típicamente entre aproximadamente 415 nm y aproximadamente 475 nm. Como alternativa, la luz de excitación puede tener una longitud de onda entre aproximadamente 340 nm y aproximadamente 370 nm y la luz emitida está entre aproximadamente 390 nm y aproximadamente 420 nm.
MUESTRA
La muestra en los métodos de la presente invención puede ser, por ejemplo, sangre, médula ósea, células del bazo, células linfáticas, aspirados de médula ósea (o cualquier célula obtenida de la médula ósea), orina (lavado), suero, saliva, líquido cefalorraquídeo, orina, líquido amniótico, líquido intersticial, heces, moco o tejido (por ejemplo, muestras de tumores, tejido desagregado, tumor sólido desagregado). En determinadas realizaciones, la muestra es una muestra de sangre. En algunas realizaciones, la muestra de sangre es sangre completa. La sangre completa se puede obtener del sujeto usando procedimientos clínicos estándar. En algunas realizaciones, la muestra es un subconjunto de una o más células de sangre completa (por ejemplo, eritrocito, leucocito, linfocito (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B o linfocitos citolíticos naturales), fagocito, monocito, macrófago, granulocito, basófilo, neutrófilo, eosinófilo, plaquetas o cualquier célula con uno o más marcadores detectables). En algunas realizaciones, la muestra puede ser de un cultivo celular.
El sujeto puede ser un ser humano (por ejemplo, un paciente que padece una enfermedad), un mamífero comercialmente significativo, incluyendo, por ejemplo, un mono, vaca o caballo. También se pueden obtener muestras de mascotas domésticas, incluyendo, por ejemplo, un perro o un gato. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal de laboratorio utilizado como modelo animal de enfermedad o para cribado farmacológico, por ejemplo, un ratón, una rata, un conejo o conejillo de indias.
ANALITOS
Un "analito" como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia, por ejemplo, molécula, cuya abundancia/concentración se determina mediante algún procedimiento analítico. Por ejemplo, en la presente invención, un analito puede ser una proteína, péptido, ácido nucleico, lípido, carbohidrato o molécula pequeña. El analito objetivo puede ser, por ejemplo, ácidos nucleicos (ADN, ARN, ARNm, ARNt o ARNr), péptidos, polipéptidos, proteínas, lípidos, iones, monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, lipoproteínas, glucoproteínas, glicolípidos o fragmentos de los mismos. En algunas realizaciones, el analito diana es una proteína y puede ser, por ejemplo, un microfilamento estructural, microtúbulos y proteínas de filamento intermedio, marcadores específicos de orgánulos, proteasomas, proteínas transmembrana, receptores de superficie, proteínas de poro nuclear, translocasas de proteínas/péptidos, chaperonas de plegamiento de proteínas, armazones de señalización, canales iónicos y similares. La proteína puede ser una proteína activable o una proteína expresada o activada diferencialmente en células enfermas o aberrantes, incluidos, entre otros, factores de transcripción, proteínas aglutinantes y modificadoras de ADN y/o ARN, receptores nucleares de importación y exportación, reguladores de la apoptosis o supervivencia y similares.
ENSAYOS
Los sistemas de ensayo que utilizan un agente aglutinante y un marcador fluorescente para cuantificar las moléculas unidas son bien conocidos. Ejemplos de tales sistemas incluyen citómetros de flujo, citómetros de barrido, citómetros de imagen, microscopios de fluorescencia y microscopios confocales de fluorescencia.
En algunas realizaciones, la citometría de flujo se utiliza para detectar la fluorescencia. Están disponibles y son conocidos por los expertos en la materia varios dispositivos adecuados para este uso. Los ejemplos incluyen BCI Navios, Galios, citómetros de flujo Aquios y CytoFLEX.
En otras realizaciones, el ensayo es un inmunoensayo. Los ejemplos de inmunoensayos útiles en la invención incluyen, pero sin limitarse a, ensayo de fluoroluminiscencia (FLA) y similares. Los ensayos también se pueden realizar en matrices proteínicas.
Cuando los agentes aglutinantes son anticuerpos, también se pueden usar ensayos de tipo sándwich de anticuerpos o de múltiples anticuerpos. Un ensayo de tipo sándwich se refiere al uso de sucesivos eventos de reconocimiento para construir capas de varios agentes aglutinantes y elementos informadores para señalar la presencia de un analito en particular. Se describen ejemplos de ensayos de tipo sándwich en la patente de EE. UU. n.° 4.486.530 y en las referencias indicadas en la misma.
V. Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación del complejo de polímero de DHP
Figure imgf000026_0001
Método 1: En un matraz de fondo redondo se recogieron los monómeros dibromo DHP y diborónico DHP (1:1) (DMF-agua) y se purgaron con nitrógeno durante 10 minutos. Bajo nitrógeno, se mezclaron aproximadamente 20 equivalentes de CsF y de Pd(OAc)2 al 10% y se calentaron a 80 °C. La polimerización se controló usando espectroscopía UV-Vis y cromatografía SEC. Posteriormente a la mezcla de reacción, se añadió un agente de terminación (seleccionado de G1) que contenía el grupo funcional apropiado y 3 horas más tarde se añadió el segundo agente de terminación (seleccionado de G2). Después de la reacción, la mezcla de reacción en bruto se evaporó y se pasó a través de una columna de filtración en gel para eliminar moléculas orgánicas pequeñas y oligómeros de bajo peso molecular. Posteriormente, el polímero en bruto pasó a través de un sistema de filtración de flujo tangencial equipado con una membrana 100K MWCO. Se lava con etanol al 20 % hasta que disminuye la absorción del filtrado.
Método 2: Como alternativa, la polimerización se puede realizar autopolimerizando una molécula de éster bromoborónico de DHP. En un matraz de fondo redondo, se recogió una mezcla de éster bromo-borónico de DHP (DMF-agua) y se purgó con nitrógeno durante 10 minutos. Bajo nitrógeno, aproximadamente 10 equivalentes de CsF y Pd(OAc)2 al 5 % se mezclaron y calentaron a 80 °C. La polimerización se controló usando espectroscopía UV-Vis y cromatografía SEC. Posteriormente a la mezcla de reacción, se añadió un agente de terminación (seleccionado de G1) que contenía el grupo funcional apropiado y 3 horas más tarde se añadió el segundo agente de terminación (seleccionado de G2). Después de la reacción, la mezcla de reacción en bruto se evaporó y se pasó a través de una columna de filtración en gel para eliminar moléculas orgánicas pequeñas y oligómeros de bajo peso molecular. Posteriormente, el polímero en bruto pasó a través de un sistema de filtración de flujo tangencial equipado con una membrana 100K MWCO. Se lava con etanol al 20% hasta que disminuye la absorción del filtrado.
Método 3: En un matraz de fondo redondo se recogieron los monómeros dibromo dihidrofenantreno y diborónico dihidrofanantreno (1:1) y se disolvieron en una mezcla de THF-agua (4:1) que contenía 10 equivalentes de K2CO3 y Pd(PPh3)4 al 3 %. La mezcla de reacción se puso en una línea de Schlenk y se desgasificó con tres ciclos de congelación-bomba-descongelación y luego se calentó a 80 °C bajo nitrógeno con agitación vigorosa durante 18 horas. Posteriormente a la mezcla de reacción, se añadió un agente de terminación (seleccionado de G1) que contenía el grupo funcional apropiado mediante una cánula bajo exceso de presión de nitrógeno y 3 horas más tarde se añadió el segundo agente de terminación (seleccionado de G2). Después de la reacción, la mezcla de reacción en bruto se evaporó y se pasó a través de una columna de filtración en gel para eliminar moléculas orgánicas pequeñas y oligómeros de bajo peso molecular. Posteriormente, el polímero en bruto pasó a través de un sistema de filtración de flujo tangencial equipado con una membrana 100K MWCO. Se lava con etanol al 20 % hasta que disminuye la absorción del filtrado.
Método 4: Alternativamente, la polimerización se puede realizar autopolimerizando una molécula de éster bromoborónico de dihidrofenantreno. En un matraz de fondo redondo se tomó éster bromoborónico de dihidrofenantreno y se disolvió en una mezcla de THF-agua (4:1) que contenía 10 equivalentes de K2CO3 y Pd(PPh3)4 al 3 %. La mezcla de reacción se puso en una línea de Schlenk y se desgasificó con tres ciclos de congelación-bomba-descongelación y luego se calentó a 80 °C bajo nitrógeno con agitación vigorosa durante 18 horas. Posteriormente a la mezcla de reacción, se añadió un agente de terminación (seleccionado de G1) que contenía el grupo funcional apropiado mediante una cánula bajo exceso de presión de nitrógeno y 3 horas más tarde se añadió el segundo agente de terminación (seleccionado de G2). Después de la reacción, la mezcla de reacción en bruto se evaporó y se pasó a través de una columna de filtración en gel para eliminar moléculas orgánicas pequeñas y oligómeros de bajo peso molecular. Posteriormente, el polímero en bruto pasó a través de un sistema de filtración de flujo tangencial equipado con una membrana 100K MWCO. Se lava con etanol al 20 % hasta que disminuye la absorción del filtrado.
Ejemplo 2: Preparación de complejo de copolímero fluoreno-DHP
Figure imgf000027_0001
Método 1: En un matraz de fondo redondo se recogieron los monómeros dibromo DHP y diborónico fluoreno (1:1) en una mezcla (DMF-agua) y se purgaron con nitrógeno durante 10 minutos. Bajo nitrógeno, se mezclaron aproximadamente 20 equivalentes de CsF y de Pd(OAc)2 al 10 % y se calentaron a 80 °C. La polimerización se controló usando espectroscopía UV-Vis y cromatografía SEC. Posteriormente a la mezcla de reacción, se añadió un agente de terminación (seleccionado de G1) que contenía el grupo funcional apropiado y 3 horas más tarde se añadió el segundo agente de terminación (seleccionado de G2). Después de la reacción, la mezcla de reacción en bruto se evaporó y se pasó a través de una columna de filtración en gel para eliminar moléculas orgánicas pequeñas y oligómeros de bajo peso molecular. Posteriormente, el polímero en bruto pasó a través de un sistema de filtración de flujo tangencial equipado con una membrana 100K MWCO. Se lava con etanol al 20 % hasta que disminuye la absorción del filtrado.
Método 2: En un matraz de fondo redondo se recogieron los monómeros dibromo fluoreno y diborónico DHP (1:1) en una mezcla (DMF-agua) y se purgaron con nitrógeno durante 10 minutos. Bajo nitrógeno, se mezclaron aproximadamente 20 equivalentes de CsF y Pd(OAc)2 al 10 % y se calentaron a 80 °C. La polimerización se controló usando espectroscopía UV-Vis y cromatografía SEC. Posteriormente a la mezcla de reacción, se añadió un agente de terminación (seleccionado de G1) que contenía el grupo funcional apropiado y 3 horas más tarde se añadió el segundo agente de terminación (seleccionado de G2). Después de la reacción, la mezcla de reacción en bruto se evaporó y se pasó a través de una columna de filtración en gel para eliminar moléculas orgánicas pequeñas y oligómeros de bajo peso molecular. Posteriormente, el polímero en bruto pasó a través de un sistema de filtración de flujo tangencial equipado con una membrana 100K MWCO. Se lava con etanol al 20 % hasta que disminuye la absorción del filtrado.
Método 3: En un matraz de fondo redondo se recogieron los monómeros dibromo dihidrofenantreno y diborónico fluoreno (1:1) y se disolvieron en una mezcla de THF-agua (4:1) que contenía 10 equivalentes de K2CO3 y Pd(PPh3)4 al 3 %. La mezcla de reacción se puso en una línea de Schlenk y se desgasificó con tres ciclos de congelación-bomba-descongelación y luego se calentó a 80 °C bajo nitrógeno con agitación vigorosa durante 18 horas. Posteriormente a la mezcla de reacción, se añadió un agente de terminación (seleccionado de G1) que contenía el grupo funcional apropiado mediante una cánula bajo exceso de presión de nitrógeno y 3 horas más tarde se añadió el segundo agente de terminación (seleccionado de G2). Después de la reacción, la mezcla de reacción en bruto se evaporó y se pasó a través de una columna de filtración en gel para eliminar moléculas orgánicas pequeñas y oligómeros de bajo peso molecular. Posteriormente, el polímero en bruto pasó a través de un sistema de filtración de flujo tangencial equipado con una membrana 100K MWCO. Se lava con etanol al 20 % hasta que disminuye la absorción del filtrado.
Método 4: En un matraz de fondo redondo se recogieron los monómeros dibromo fluoreno y diborónico dihidrofenantreno (1:1) y se disolvieron en una mezcla de THF-agua (4:1) que contenía 10 equivalentes de K2CO3 y Pd(PPh3)4 al 3 %. La mezcla de reacción se puso en una línea de Schlenk y se desgasificó con tres ciclos de congelación-bomba-descongelación y luego se calentó a 80 °C bajo nitrógeno con agitación vigorosa durante 18 horas. Posteriormente a la mezcla de reacción, se añadió un agente de terminación (seleccionado de G1) que contenía el grupo funcional apropiado mediante una cánula bajo exceso de presión de nitrógeno y 3 horas más tarde se añadió el segundo agente de terminación (seleccionado de G2). Después de la reacción, la mezcla de reacción en bruto se evaporó y se pasó a través de una columna de filtración en gel para eliminar moléculas orgánicas pequeñas y oligómeros de bajo peso molecular. Posteriormente, el polímero en bruto pasó a través de un sistema de filtración de flujo tangencial equipado con una membrana 100K MWCO. Se lava con etanol al 20 % hasta que disminuye la absorción del filtrado.
Ejemplo 3 Comparación de espectros de emisión de fluorescencia
La comparación de espectros de emisión de fluorescencia de fluoreno (Fl-Fl), se llevaron a cabo polímeros de dihidrofenantreno (DHP-DHP) y fluoreno-DHP (DHP-Fl). Los polímeros que contienen DHP muestran una marcada diferencia en sus máximos de fluorescencia, que está a 426-428 nm, mientras que los polímeros basados en fluoreno muestran un máximo de 421 nm (Figura 1).
Ejemplo 4 Comparación de espectros de absorción
Se midieron los espectros de absorción del polímero de fluoreno (F1-F1) y del polímero de dihidrofenantreno (DHP-DHP). El gráfico muestra la absorción del polímero DHP-DHP (curva negra) a 390 y 410 nm, mientras que el polímero Fl-Fl (curva gris) muestra los máximos alrededor de 400 nm. Las muestras se midieron a diferentes concentraciones (Figura 2).
Ejemplo 5 Relación señal CD4 a ruido
Se llevó a cabo el análisis de citometría de flujo de sangre completa lisada teñida con el nuevo anti-CD4 humano marcado con polímeros y el CD4 marcado con azul pacífico. La intensidad de la señal positiva de los colorantes de polímeros fue casi 5 veces mayor que la del azul Pacífico (Figura 3).
Ejemplo 6
Se encontró que los polímeros de la presente invención poseen ciertas características físicas y químicas de absorción, fluorescencia, brillo, peso molecular, polidispersidad, relación de colorante a proteína cuando se conjugan con un anticuerpo, etc. Los intervalos preferidos de estos parámetros se muestran en la tabla de la Figura 4.
Se midieron los espectros de excitación y emisión de polímeros en tándem. La excitación se llevó a cabo en los máximos del polímero (405 nm) y se observaron las emisiones de los diversos colorantes aceptores unidos a la cadena principal (Figura 5).
Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritos en el presente documento tienen únicamente fines ilustrativos. El alcance de la protección se define mediante las reivindicaciones.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un polímero fluorescente soluble en agua que tiene la estructura de Fórmula II:
    Figure imgf000029_0001
    en donde;
    cada X se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en C y Si;
    cada Y se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en un enlace, CR1R2 y SiR1R2;
    cuando Y es un enlace, X está unido directamente a ambos anillos;
    cada R1 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), sal de alquilamonio, sal de alquiloxiamonio, sal de oligoéter amonio, sal de alquilsulfonato, sal de alcoxisulfonato, sal de oligoéter sulfonato, sulfonamido oligoéter,
    Figure imgf000029_0002
    cada R2 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo, alqueno, alquino, cicloalquilo, haloalquilo, alcoxi, (hetero)ariloxi, arilo, (hetero)arilamino, un grupo PEG, sal de alquilamonio, sal de alquiloxiamonio, sal de oligoéter amonio, sal de alquilsulfonato, sal de alcoxisulfonato, sal de oligoéter sulfonato, sulfonamido oligoéter, y
    Figure imgf000029_0003
    cada R3 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo, alqueno, alquino, cicloalquilo, haloalquilo, alcoxi, (hetero)ariloxi, arilo, (hetero)arilamino y un grupo PEG;
    cada Z se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en C, O y N; cada Q se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en un enlace, NH, NR4 y CH2;
    cada M es independientemente una unidad enlazadora rica en electrones capaz de alterar el espacio de banda del polímero y se distribuye de manera uniforme o aleatoria a lo largo de la cadena principal del polímero y cada uno se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en
    Figure imgf000030_0001
    en donde,
    cada R4 es un grupo lateral no iónico capaz de impartir solubilidad en agua en exceso si es de 10 mg/ml y cada uno se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en halógeno, hidroxilo, alquilo C1-C12, alqueno C2-Ci2, alquino C2-Ci2, cicloalquilo C3-Ci2, haloalquilo Ci-Ci2, alcoxi Ci-Ci2, (hetero)ariloxi C2-Ci8, (hetero)arilamino C2-Ci8, (CH2)X'(OCH2-CH2)y OCH3 donde cada x' es independientemente un número entero de 0 a 20; cada y' es independientemente un número entero de 0 a 50, y un grupo (hetero)arilo C2-Ci8;
    cada enlazador L opcional es un grupo arilo o heteroarilo distribuido de manera uniforme o aleatoria a lo largo de la cadena principal del polímero y está sustituido con una o más cadenas laterales terminadas con un grupo funcional seleccionado entre el grupo que consiste en amina, carbamato, ácido carboxílico, carboxilato, maleimida, éster activado, N-hidroxisuccinimidilo, hidracina, hidrazida, hidrazona, azida, alquino, aldehído, tiol, y grupos protegidos de los mismos para la conjugación con otro sustrato, colorante aceptor, molécula o agente aglutinante;
    cada uno de G1 y G2 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquino, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, arilo sustituido con halógeno, sililo, sal de diazonio, triflato, acetiloxi, azida, sulfonato, fosfato, arilo sustituido con ácido borónico, arilo sustituido con éster borónico, éster borónico, ácido borónico, dihidrofenantreno (DHP) opcionalmente sustituido, fluoreno opcionalmente sustituido, arilo o heteroarilo sustituido con una o más cadenas laterales terminadas con un grupo funcional seleccionado de amina, carbamato, ácido carboxílico, carboxilato, maleimida, éster activado, N-hidroxisuccinimidilo, hidracina, hidrazida, hidrazona, azida, alquino, aldehído, tiol y grupos protegidos de los mismos para conjugarlos con un sustrato o un agente aglutinante;
    a, c y d definen el % en moles de cada unidad dentro de la estructura, cada una de las cuales puede repetirse de manera uniforme o aleatoria y donde a es un % en moles de 10 a 100 %, c es un % en moles de 0 a 90 %, y cada d es un % en moles de 0 a 25 %; cada b es independientemente 0 o 1;
    m es un número entero de 1 a 10.000; y
    cada n es independientemente un número entero de 1 a 20.
    2. El polímero de la reivindicación 1, en donde el polímero tiene la estructura de Fórmula III:
    Figure imgf000031_0001
    cada f es independientemente un número entero de 0 a 50 y cada R5 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C12, alqueno C2-C12, alquino C2-C12, cicloalquilo C3-C12, haloalquilo C1-C12, alcoxi C1-C12, (hetero)ariloxi C2-C18, (hetero)arilamino C2-C18 y alcoxi C1-C12.
    3. El polímero de la reivindicación 1, en donde el polímero tiene la estructura de Fórmula IV:
    4. El polímero de la reivindicación 1, en donde el polímero tiene la estructura de Fórmula V:
    Figure imgf000032_0001
    5. El polímero de la reivindicación 1, en donde el polímero es un copolímero y tiene la estructura de Fórmula VI:
    Figure imgf000032_0002
    donde g y a juntos son un % en moles de 10 a 100 %.
    6. El polímero de la reivindicación 1, en donde el polímero es un copolímero y tiene la estructura de Fórmula VII:
    Figure imgf000032_0003
    en donde,
    cada g y a juntos son un % en moles de 10 a 100 %; y
    cada f es independientemente un número entero de 0 a 50 y cada R5 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C12, alqueno C2-C12, alquino C2-C12, cicloalquilo C3-C12, haloalquilo C1-C12, alcoxi C1-C12, (hetero)ariloxi C2-C18, (hetero)arilamino C2-C18 y alcoxi C1-C12.
    7. El polímero de la reivindicación 1, en donde el polímero es un copolímero y tiene la estructura de Fórmula VIII:
    Figure imgf000033_0001
    8. El polímero de la reivindicación 1, en donde el polímero es un copolímero y tiene la estructura de Fórmula IX:
    Figure imgf000034_0001
    en donde,
    cada R6 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, OH, SH, NHCOO-f-butilo, (CH2)nCOOH, (CH2)nCOOCH3, (CH2)nNH2, (CH2)nNH-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOOH, (CH2)nNHCO-(CH2)n-CO-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOO-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOOC(CH3)3, cicloalquilo (CH2)nNHCO(C3-C12), (CH2)nNH-CO(CH2CH2O)f, (CH2)nNHCO (CH2)nCOOH, (CH2)nNHCO(CH2)nCOO(CH2)nCH3, (CH2)n(OCH2CH2)fOCH3, N-maleimida, halógeno, alqueno C2-Ci2, alquino C2-C-|2, cicloalquilo C3-Ci2, halo alquilo C-i-C12, (hetero)arilo C-i-C12, (hetero)arilamino C1-C12 y bencilo opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, hidroxilo, alcoxi C1-C12, o (OCH2CH2)fOCH3;
    cada f es independientemente un número entero de 0 a 50; y
    cada n es independientemente un número entero de 1 a 20.
    10. El polímero de la reivindicación 1, en donde cada uno de G1 y G2 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en dihidrofenantreno (DHP) opcionalmente sustituido, fluoreno opcionalmente sustituido, arilo sustituido con una o más cadenas laterales terminadas con un grupo funcional, y un heteroarilo sustituido con una o más cadenas laterales terminadas con un grupo funcional.
    11. El polímero de la reivindicación 1, en donde cada uno de G y G se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en
    Figure imgf000035_0001
    en donde,
    cada R6 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, OH, SH, NHCOO-t-butilo, (CH2)nCOOH, (CH2)nCOOCH3, (CH2)nNH2, (CH2)nNH-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOOH, (CH2)nNHCO-(CH2)n-CO-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOO-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOOC(CH3)3, cicloalquilo (CH2)nNHCO(C3-C12), (CH2)nNH-CO(CH2CH2O)f, (CH2)nNHCO (CH2)nCOOH, (CH2)nNHCO(CH2)nCOO(CH2)nCH3, (CH2)n(OCH2CH2)fOCH3, N-maleimida, halógeno, alqueno C2-C12, alquino C2-C12, cicloalquilo C3-C12, halo alquilo C1-C12, (hetero)arilo C1-C12, (hetero)arilamino C1-C12 y bencilo opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, hidroxilo, alcoxi C1-C12, o (OCH2CH2)fOCH3;
    cada f es independientemente un número entero de 0 a 50; y
    cada n es independientemente un número entero de 1 a 20.
    12. El polímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además un agente aglutinante unido a dicho polímero, opcionalmente en donde el agente aglutinante es un anticuerpo.
    13. Un método para detectar un analito en una muestra que comprende:
    proporcionar una muestra que se sospecha que contiene el analito;
    poner en contacto la muestra con un agente aglutinante conjugado con un polímero soluble en agua como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
    14. El método de la reivindicación 13, en donde el agente aglutinante es una proteína, péptido, ligando de afinidad, anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, azúcar, lípido, ácido nucleico o un aptámero.
    15. El método de la reivindicación 14, en donde el agente aglutinante es un anticuerpo y:
    (i) el método está configurado para citometría de flujo; o
    (ii) el agente aglutinante se une a un sustrato; o
    (iii) el analito es una proteína expresada en una superficie celular; o
    (iv) el método está configurado como un inmunoensayo; o
    (v) el método comprende además proporcionar agentes aglutinantes adicionales para detectar analitos adicionales simultáneamente.
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