KR20230113837A - 광활성 거대분자 및 그의 용도 - Google Patents

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아룬쿠마르 이스워런
세르게이 굴닉
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베크만 컬터, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 수용성 광활성 거대분자에 접합된 결합제를 사용함으로써 샘플에서 분석물을 검출하기 위한 수용성 광활성 거대분자 복합체 및 방법을 제공한다.

Description

광활성 거대분자 및 그의 용도{PHOTOACTIVE MACROMOLECULES AND USES THEREOF}
관련 출원과의 상호참조
본 출원은 미국 가출원 제62/323,444호 (2016년 4월 15일자로 출원됨)에 대한 우선권을 주장하며, 이의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 샘플에서 분석물을 검출하기 위한 복합체 및 방법에 관한 것이다.
실시간으로 모니터링될 수 있는 신호를 생성함으로써 수용성 형광 중합체가 다양한 생물학적 응용에 사용될 수 있으며, 이는 생물학적 표적 및 사건을 검출하기 위한 간단하고 신속한 방법을 제공할 수 있다.
염료의 밝기는 흡광 계수(extinction coefficient) (ε, 특정 파장에서 흡수되는 광량의 측정치) 및 형광 양자 수율 (Φ, 일중항 여기 상태로부터 방사 형태로 방출되는 광의 측정치)로부터의 전체 기여이다. 쿠마린, BODIPY, 시아닌, 스쿠아라인 등과 같은 보고된 유기 바이올렛 염료의 대부분은 단일 분자이며, 405 nm에서 10,000 내지 70,000 M-1cm-1 범위의 비교적 낮은 흡광 계수를 나타낸다. 다수의 발색단을 갖는 분자들은 상이한 발색단들로부터의 전체 기여로 인해 더 높은 ε 값을 나타내는 것으로 밝혀져 있다. 단일 분자가 다수의 발색단을 함유하는 수지상 및 중합체 골격 접근법에 대한 다양한 보고가 있다.
그러나, 이미 보고된 중합체 염료의 다수는 고도로 소수성이고, 발광 다이오드, 태양 전지 등과 같은 재료 응용에 사용된다. 결과적으로, 많은 중합체 염료는 불량한 용해도, 밝기, 및 스펙트럼의 확대로 인해 수성 조건 하에서 유용하지 않다. 단지 몇몇 보고가 생물학적 응용을 위한 수용성 형광 중합체에 대해 다루는데, 이들은 405 nm 및 355 nm 레이저에 의해 여기가능하다. 따라서, 분석물 검출용을 포함한 생물학적 응용을 위한 수용성 중합체 염료의 보유를 확대하기 위하여 신규한 중합체 코어에 대한 확인이 필요하다.
본 발명은 샘플에서 분석물을 검출하기 위한 종래 기술 복합체 및 방법의 이들 및 다른 불리한 점에 대처한다.
본 발명은 대체로 샘플에서 분석물을 검출하기 위한 신규한 수용성 형광 중합체 및 방법을 제공하는데, 이는 결합제에 접합된 형광 중합체를 포함하는 복합체를 사용한다.
제1 실시 형태에서, 본 발명은 화학식 I의 구조를 갖는 수용성 형광 중합체를 제공한다:
(I)
(상기 식에서,
각각의 X는 독립적으로 C 및 Si로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 Y는 독립적으로 결합, CR1R2, 및 SiR1R2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y가 결합일 때, X는 두 고리 모두에 직접 결합되고;
각각의 R1은 독립적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 암모늄 알킬 염, 암모늄 알킬옥시 염, 암모늄 올리고에테르 염, 설포네이트 알킬 염, 설포네이트 알콕시 염, 설포네이트 올리고에테르 염, 설폰아미도 올리고에테르, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R2는 독립적으로 H, 알킬, 알켄, 알킨, 사이클로알킬, 할로알킬, 알콕시, (헤테로)아릴옥시, 아릴, (헤테로)아릴아미노, PEG, 암모늄 알킬 염, 암모늄 알킬옥시 염, 암모늄 올리고에테르 염, 설포네이트 알킬 염, 설포네이트 알콕시 염, 설포네이트 올리고에테르 염, 설폰아미도 올리고에테르, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R3은 독립적으로 H, 알킬, 알켄, 알킨, 사이클로알킬, 할로알킬, 알콕시, (헤테로)아릴옥시, 아릴, (헤테로)아릴아미노, 및 PEG로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 Z는 독립적으로 C, O, 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 Q는 독립적으로 결합, NH, NR4, 및 CH2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 M은 독립적으로 중합체 밴드 갭(band gap)을 변경시킬 수 있는 전자 풍부 링커 단위(electron rich linker unit)이고, 중합체 주쇄를 따라 균일하게 또는 랜덤하게 분포되고, 각각 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
, , , , , , , , , , , , , , , , 및 ;
상기 식에서,
각각의 R4는 10 mg/mL인 경우 과량으로 물 중에서 용해성을 부여할 수 있는 비이온성 측기(side group)이고, 각각 독립적으로 할로겐, 하이드록실, C1-C12 알킬, C2-C12 알켄, C2-C12 알킨, C3-C12 사이클로알킬, C1-C12 할로알킬, C1-C12 알콕시, C2-C18 (헤테로)아릴옥시, C2-C18 (헤테로)아릴아미노, (CH2)x'(OCH2-CH2)y'OCH3 (여기서, 각각의 x'은 독립적으로 0 내지 20의 정수이고; 각각의 y'은 독립적으로 0 내지 50의 정수임), 및 C2-C18 (헤테로)아릴 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 선택적인 링커 L은 중합체 주쇄를 따라 균일하게 또는 랜덤하게 분포된 아릴 또는 헤테로아릴 기이고, 아민, 카르바메이트, 카르복실산, 카르복실레이트, 말레이미드, 활성화된 에스테르, N-하이드록시석신이미딜, 하이드라진, 하이드라지드, 하이드라존, 아지드, 알킨, 알데하이드, 티올, 및 다른 기질, 억셉터 염료, 분자 또는 결합제에 대한 접합을 위한 이들의 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용기로 말단화된 하나 이상의 펜던트 사슬로 치환되고;
각각의 G1 및 G2는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 알킨, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 할로겐 치환된 아릴, 실릴, 다이아조늄 염, 트라이플레이트, 아세틸옥시, 아지드, 설포네이트, 포스페이트, 보론산 치환된 아릴, 보론산 에스테르 치환된 아릴, 보론산 에스테르, 보론산, 선택적으로 치환된 다이하이드로페난트렌 (DHP), 선택적으로 치환된 플루오렌, 아민, 카르바메이트, 카르복실산, 카르복실레이트, 말레이미드, 활성화된 에스테르, N-하이드록시석신이미딜, 하이드라진, 하이드라지드, 하이드라존, 아지드, 알킨, 알데하이드, 티올, 및 기질 또는 결합제에 대한 접합을 위한 이들의 보호기로부터 선택되는 작용기로 말단화된 하나 이상의 펜던트 사슬로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
a, c, 및 d는, 각각이 균일하게 또는 랜덤하게 반복될 수 있는 상기 구조 내의 각각의 단위의 몰%를 정의하며, a는 10 내지 100%의 몰%이고, c는 0 내지 90%의 몰%이고, 각각의 d는 0 내지 25%의 몰%이고;
각각의 b는 독립적으로 0 또는 1이고;
m은 1 내지 약 10,000의 정수이고;
각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수임).
일부 경우에, 상기 중합체는 화학식 II의 구조를 갖는다:
(II).
일부 경우에, 상기 중합체는 화학식 III의 구조를 갖는다:
(III)
(상기 식에서, 각각의 f는 독립적으로 0 내지 50의 정수이고, 각각의 R5는 독립적으로 H, C1-C12 알킬, C2-C12 알켄, C2-C12 알킨, C3-C12 사이클로알킬, C1-C12 할로알킬, C1-C12 알콕시, C2-C18 (헤테로)아릴옥시, C2-C18 (헤테로)아릴아미노, 및 C1-C12 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택됨).
일부 경우에, 상기 중합체는 화학식 IV의 구조를 갖는다:
(IV).
일부 경우에, 상기 중합체는 화학식 V의 구조를 갖는다:
(V).
일부 경우에, 상기 중합체는 공중합체이고, 화학식 VI의 구조를 갖는다:
(VI)
(상기 식에서, g 및 a는 총합하여 10 내지 100%의 몰%임).
일부 경우에, 상기 중합체는 공중합체이고, 화학식 VII의 구조를 갖는다:
(VII)
(상기 식에서, 각각의 g 및 a는 총합하여 10 내지 100%의 몰%이고; 각각의 f는 독립적으로 0 내지 50의 정수이고, 각각의 R5는 독립적으로 H, C1-C12 알킬, C2-C12 알켄, C2-C12 알킨, C3-C12 사이클로알킬, C1-C12 할로알킬, C1-C12 알콕시, C2-C18 (헤테로)아릴옥시, C2-C18 (헤테로)아릴아미노, 및 C1-C12 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택됨).
일부 경우에, 상기 중합체는 공중합체이고, 화학식 VIII의 구조를 갖는다:
(VIII).
일부 경우에, 상기 중합체는 공중합체이고, 화학식 IX의 구조를 갖는다:
(IX).
일부 실시 형태에서, L은 각각 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
, , , , , , , 및 ;
(상기 식에서,
각각의 R6은 독립적으로 H, OH, SH, NHCOO-t-부틸, (CH2)nCOOH, (CH2)nCOOCH3, (CH2)nNH2, (CH2)nNH-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOOH, (CH2)nNHCO-(CH2)n-CO-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOO-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOOC(CH3)3, (CH2)nNHCO(C3-C12)사이클로알킬, (CH2)nNHCO(CH2CH2O)f, (CH2)nNHCO(CH2)nCOOH, (CH2)nNHCO(CH2)nCOO(CH2)nCH3, (CH2)n(OCH2CH2)fOCH3, N-말레이미드, 할로겐, C2-C12 알켄, C2-C12 알킨, C3-C12 사이클로알킬, C1-C12 할로 알킬, C1-C12 (헤테로)아릴, C1-C12 (헤테로)아릴아미노, 및 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, C1-C12 알콕시, 또는 (OCH2CH2)fOCH3로 선택적으로 치환된 벤질로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 f는 독립적으로 0 내지 50의 정수이고;
각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수임).
일부 실시 형태에서, G1 및 G2는 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 다이하이드로페난트렌 (DHP), 선택적으로 치환된 플루오렌, 작용기로 말단화된 하나 이상의 펜던트 사슬로 치환된 아릴, 및 작용기로 말단화된 하나 이상의 펜던트 사슬로 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, G1 및 G2는 각각 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
, , , , , , , , , 및
(상기 식에서,
각각의 R6은 독립적으로 H, OH, SH, NHCOO-t-부틸, (CH2)nCOOH, (CH2)nCOOCH3, (CH2)nNH2, (CH2)nNH-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOOH, (CH2)nNHCO-(CH2)n-CO-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOO-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOOC(CH3)3, (CH2)nNHCO(C3-C12)사이클로알킬, (CH2)nNHCO(CH2CH2O)f, (CH2)nNHCO(CH2)nCOOH, (CH2)nNHCO(CH2)nCOO(CH2)nCH3, (CH2)n(OCH2CH2)fOCH3, N-말레이미드, 할로겐, C2-C12 알켄, C2-C12 알킨, C3-C12 사이클로알킬, C1-C12 할로 알킬, C1-C12 (헤테로)아릴, C1-C12 (헤테로)아릴아미노, 및 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, C1-C12 알콕시, 또는 (OCH2CH2)fOCH3로 선택적으로 치환된 벤질로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 f는 독립적으로 0 내지 50의 정수이고;
각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수임).
일부 실시 형태에서, 본 발명은 샘플에서 분석물을 검출하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은
상기 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계;
상기 샘플을 화학식 I의 구조를 갖는 수용성 중합체에 접합된 결합제와 접촉시키는 단계를 포함하며:
(I)
(상기 식에서,
각각의 X는 독립적으로 C 및 Si로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 Y는 독립적으로 결합, CR1R2, 및 SiR1R2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y가 결합일 때, X는 두 고리 모두에 직접 결합되고;
각각의 R1은 독립적으로 암모늄 알킬 염, 암모늄 알킬옥시 염, 암모늄 올리고에테르 염, 설포네이트 알킬 염, 설포네이트 알콕시 염, 설포네이트 올리고에테르 염, 설폰아미도 올리고에테르, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R2는 독립적으로 H, 알킬, 알켄, 알킨, 사이클로알킬, 할로알킬, 알콕시, (헤테로)아릴옥시, 아릴, (헤테로)아릴아미노, PEG, 암모늄 알킬 염, 암모늄 알킬옥시 염, 암모늄 올리고에테르 염, 설포네이트 알킬 염, 설포네이트 알콕시 염, 설포네이트 올리고에테르 염, 설폰아미도 올리고에테르, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R3은 독립적으로 H, 알킬, 알켄, 알킨, 사이클로알킬, 할로알킬, 알콕시, (헤테로)아릴옥시, 아릴, (헤테로)아릴아미노, 및 PEG로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 Z는 독립적으로 C, O, 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 Q는 독립적으로 결합, NH, NR4, 및 CH2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 M은 독립적으로 중합체 밴드 갭을 변경시킬 수 있는 전자 풍부 링커 단위이고, 중합체 주쇄를 따라 균일하게 또는 랜덤하게 분포되고, 각각 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
, , , , , , , , , , , , , , , , 및 ;
상기 식에서,
각각의 R4는 10 mg/mL인 경우 과량으로 물 중에서 용해성을 부여할 수 있는 비이온성 측기이고, 각각 독립적으로 할로겐, 하이드록실, C1-C12 알킬, C2-C12 알켄, C2-C12 알킨, C3-C12 사이클로알킬, C1-C12 할로알킬, C1-C12 알콕시, C2-C18 (헤테로)아릴옥시, C2-C18 (헤테로)아릴아미노, (CH2)x'(OCH2-CH2)y'OCH3 (여기서, 각각의 x'은 독립적으로 0 내지 20의 정수이고; 각각의 y'은 독립적으로 0 내지 50의 정수임), 및 C2-C18 (헤테로)아릴 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 선택적인 링커 L은 중합체 주쇄를 따라 균일하게 또는 랜덤하게 분포된 아릴 또는 헤테로아릴 기이고, 아민, 카르바메이트, 카르복실산, 카르복실레이트, 말레이미드, 활성화된 에스테르, N-하이드록시석신이미딜, 하이드라진, 하이드라지드, 하이드라존, 아지드, 알킨, 알데하이드, 티올, 및 다른 기질, 억셉터 염료, 분자 또는 결합제에 대한 접합을 위한 이들의 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용기로 말단화된 하나 이상의 펜던트 사슬로 치환되고;
G1 및 G2는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 알킨, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 할로겐 치환된 아릴, 실릴, 다이아조늄 염, 트라이플레이트, 아세틸옥시, 아지드, 설포네이트, 포스페이트, 보론산 치환된 아릴, 보론산 에스테르 치환된 아릴, 보론산 에스테르, 보론산, 선택적으로 치환된 다이하이드로페난트렌 (DHP), 선택적으로 치환된 플루오렌, 아민, 카르바메이트, 카르복실산, 카르복실레이트, 말레이미드, 활성화된 에스테르, N-하이드록시석신이미딜, 하이드라진, 하이드라지드, 하이드라존, 아지드, 알킨, 알데하이드, 티올, 및 기질 또는 결합제에 대한 접합을 위한 이들의 보호기로부터 선택되는 작용기로 말단화된 하나 이상의 펜던트 사슬로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
a, c, 및 d는, 각각이 균일하게 또는 랜덤하게 반복될 수 있는 상기 구조 내의 각각의 단위의 몰%를 정의하며, a는 10 내지 100%의 몰%이고, c는 0 내지 90%의 몰%이고,
각각의 d는 0 내지 25%의 몰%이고;
각각의 b는 독립적으로 0 또는 1이고;
m은 1 내지 약 10,000의 정수이고;
각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수임);
상기 결합제는 상기 분석물 또는 표적-회합된 바이오분자와 상호작용할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 상기 중합체를 여기할 수 있는 광원을 상기 샘플에 인가하는 단계; 및 접합된 중합체 복합체로부터 광이 방출되는지의 여부를 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 결합제는 단백질, 펩티드, 친화성 리간드, 항체, 항체 단편, 당, 지질, 핵산 또는 압타머이다. 일부 실시 형태에서, 상기 결합제는 항체이다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 유세포측정을 위해 구성된다. 일부 실시 형태에서, 상기 결합제는 기질에 결합되어 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 분석물은 세포 표면 상에서 발현되는 단백질이다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 면역검정으로서 구성된다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 추가의 분석물을 동시에 검출하기 위한 추가의 결합제를 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
도 1은 플루오렌 (FF), 다이하이드로페난트렌 (DD) 및 플루오렌-DHP (DF) 중합체의 형광 방출 스펙트럼의 비교를 나타낸다.
도 2는 FF 중합체 및 DD 중합체 둘 모두의 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 그래프는 390 및 410 nm에서 DD 중합체 (흑색 곡선)의 흡수를 나타내는 반면, FF (회색 곡선) 중합체는 약 401 nm에서 최대값을 나타낸다. 샘플을 상이한 농도 하에서 측정하였다.
도 3은 새로운 중합체-표지 항-인간 CD4 및 퍼시픽 블루(Pacific Blue)-표지 CD4로 염색된 용해된 전혈의 유세포측정 분석을 나타낸다. 중합체 염료의 양성 신호 세기는 퍼시픽 블루보다 거의 5배 더 높았다.
도 4는 본 발명의 중합체가 흡수, 형광, 휘도, 분자량, 다분산성, 항체에 접합될 때의 염료 대 단백질 비 등의 소정의 물리적 및 화학적 특성을 가짐을 나타낸다. 이들 파라미터의 바람직한 범위는 이 표에 제시되어 있다.
도 5는 탠덤 중합체의 여기 및 방출 스펙트럼을 나타낸다. 중합체 최대값 (405 nm)에서 여기를 수행하였으며, 골격에 부착된 다양한 억셉터 염료로부터 방출이 관찰되었다. 염료 1 - FITC, 염료 2 - Cy3B, 염료 3 - Cy55.
I. 총론
본 발명은 샘플에서 분석물을 검출하기 위한 신규한 수용성 형광 중합체 및 방법을 제공하는데, 이는 결합제에 접합된 형광 중합체를 포함하는 복합체를 사용한다. 본 발명의 접합된 수용성 중합체는 다른 염료들에 비하여 유의하게 증가된 밝기를 보여준다.
II. 정의
본 명세서에 사용되는 약어는 화학 및 생물학 분야 내에서의 그들의 통상적인 의미를 갖는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "암모늄"은 화학식 NHR3 +를 갖는 양이온을 지칭하며, 여기서 각각의 R 기는 독립적으로 수소 또는 치환 또는 비치환된 알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 알콕시 기이다. 바람직하게는, 각각의 R 기는 수소이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "올리고에테르"는 에테르 작용기를 갖는 구조 반복 단위를 함유하는 올리고머를 의미하는 것으로 이해된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "올리고머"는 동일하거나 상이한 화학식의 하나 이상의 확인가능한 구조 반복 단위를 함유하는 분자를 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "설포네이트 작용기" 또는 "설포네이트"는 유리 설포네이트 음이온 (-S(=O)2O-) 및 이의 염 둘 모두를 지칭한다. 따라서, 용어 '설포네이트'는 설폰산나트륨, 설폰산리튬, 설폰산칼륨 및 설폰산암모늄과 같은 설포네이트 염을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "설폰아미도"는 화학식 -SO2NR-의 기를 지칭하며, 여기서 R은 수소, 알킬 또는 아릴이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "알킬"은 지시된 탄소 원자수를 갖는 직쇄 또는 분지형, 포화, 지방족 라디칼을 지칭한다. 예를 들어, C1-C6 알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 아이소펜틸, 헥실 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 다른 알킬 기는 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 알킬은 임의의 탄소수, 예컨대 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 3-4, 3-5, 3-6, 4-5, 4-6 및 5-6을 포함할 수 있다. 알킬 기는 전형적으로 1가이지만, 2가일 수 있는데, 이는, 예컨대 알킬 기가 2개의 모이어티(moiety)를 함께 연결할 때이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "사이클로알킬"은 3 내지 12개의 고리 원자, 또는 지시된 원자수를 함유하는 포화 또는 부분 불포화, 모노사이클릭, 융합된 바이사이클릭 또는 가교된 폴리사이클릭 고리 집합체를 지칭한다. 모노사이클릭 고리는, 예를 들어 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 및 사이클로옥틸을 포함한다. 바이사이클릭 및 폴리사이클릭 고리는, 예를 들어 노르보르난, 데카하이드로나프탈렌 및 아다만탄을 포함한다. 예를 들어, C3-8사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로옥틸, 및 노르보르난을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "할로알킬"은 상기 정의된 바와 같은 알킬 내의 수소 원자들 중 일부 또는 전부가 할로겐 원자로 치환된 것을 지칭한다. 할로겐 (할로)은 바람직하게는 클로로 또는 플루오로를 나타내지만, 또한 브로모 또는 요오도일 수 있다. 예를 들어, 할로알킬은 트라이플루오로메틸, 플루오로메틸, 1,2,3,4,5-펜타플루오로-페닐 등을 포함한다. 용어 "퍼플루오로"는 적어도 2개의 이용가능한 수소가 불소로 치환된 화합물 또는 라디칼을 정의한다. 예를 들어, 퍼플루오로페닐은 1,2,3,4,5-펜타플루오로페닐을 지칭하고, 퍼플루오로메탄은 1,1,1-트라이플루오로메틸을 지칭하고, 퍼플루오로메톡시는 1,1,1-트라이플루오로메톡시를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "알콕시"는 알킬 기를 부착점에 연결하는 산소 원자를 갖는, 상기 정의된 바와 같은 알킬 기를 지칭한다. 알콕시 기는, 예를 들어 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 아이소-프로폭시, 부톡시, 2-부톡시, 아이소-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, 펜톡시, 헥속시 등을 포함한다. 알콕시 기는 본 명세서에 기재된 다양한 치환체로 추가로 치환될 수 있다. 예를 들어, 알콕시 기는 할로겐으로 치환되어 "할로-알콕시" 기를 형성할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "알켄"은 적어도 하나의 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소를 지칭한다. 알켄 기의 예에는 비닐, 프로페닐, 아이소프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 아이소부테닐, 부타다이에닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 아이소펜테닐, 1,3-펜타다이에닐, 1,4-펜타다이에닐, 1-헥세닐, 2-헥세닐, 3-헥세닐, 1,3-헥사다이에닐, 1,4-헥사다이에닐, 1,5-헥사다이에닐, 2,4-헥사다이에닐, 또는 1,3,5-헥사트라이에닐이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 알켄 기는 전형적으로 1가이지만, 2가일 수 있는데, 이는, 예컨대 알케닐 기가 2개의 모이어티를 함께 연결할 때이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "알킨"은 적어도 하나의 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소를 지칭한다. 알키닐 기의 예에는 아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 아이소부티닐, sec-부티닐, 부타다이이닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 아이소펜티닐, 1,3-펜타다이이닐, 1,4-펜타다이이닐, 1-헥시닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐, 1,3-헥사다이이닐, 1,4-헥사다이이닐, 1,5-헥사다이이닐, 2,4-헥사다이이닐, 또는 1,3,5-헥사트라이이닐이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 알키닐 기는 전형적으로 1가이지만, 2가일 수 있는데, 이는, 예컨대 알키닐 기가 2개의 모이어티를 함께 연결할 때이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "아릴"은 6 내지 16개의 고리 탄소 원자를 함유하는 모노사이클릭 또는 융합된 바이사이클릭, 트라이사이클릭 또는 그 이상의 방향족 고리 집합체를 지칭한다. 예를 들어, 아릴은 페닐, 벤질 또는 나프틸, 바람직하게는 페닐일 수 있다. "아릴렌"은 아릴 기로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 아릴 기는 알킬, 알콕시, 아릴, 하이드록시, 할로겐, 시아노, 아미노, 아미노-알킬, 트라이플루오로메틸, 알킬렌다이옥시 및 옥시-C2-C3-알킬렌으로부터 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 라디칼 - 이들 모두는, 예를 들어 상기 정의된 바와 같이, 선택적으로 추가로 치환됨 - 로 일치환, 이치환 또는 삼치환될 수 있거나; 또는 1- 또는 2-나프틸; 또는 1- 또는 2-페난트레닐일 수 있다. 알킬렌다이옥시는 페닐의 2개의 인접한 탄소 원자에 부착된 2가 치환체, 예를 들어 메틸렌다이옥시 또는 에틸렌다이옥시이다. 옥시-C2-C3-알킬렌은 또한 페닐의 2개의 인접합 탄소 원자에 부착된 2차 치환체, 예를 들어 옥시에틸렌 또는 옥시프로필렌이다. 옥시-C2-C3-알킬렌-페닐에 대한 예는 2,3-다이하이드로벤조푸란-5-일이다.
아릴로서는, 나프틸, 페닐, 또는 알콕시, 페닐, 할로겐, 알킬 또는 트라이플루오로메틸로 일치환 또는 이치환된 페닐, 특히 페닐, 또는 알콕시, 할로겐 또는 트라이플루오로메틸로 일치환 또는 이치환된 페닐, 그리고 특히 페닐이 바람직하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "아릴옥시"는 O-아릴 기를 지칭하며, 여기서 아릴은 상기 정의된 바와 같다. 아릴옥시 기는 비치환되거나, 또는 1개 또는 2개의 적합한 치환체로 치환될 수 있다. 용어 "페녹시"는 아릴옥시 기 내의 아릴 모이어티가 페닐 고리인 것을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "헤테로아릴옥시"는 -O-헤테로아릴 기를 의미하며, 여기서 헤테로아릴은 하기에 정의된 바와 같다. 용어 "(헤테로)아릴옥시"는 모이어티가 아릴옥시 또는 헤테로아릴옥시 기임을 나타내는 데 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 에틸렌 글리콜 단량체 단위를 기반으로 한 생체적합성 물-가용화(water-solubilizing) 선형 중합체의 패밀리를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "헤테로아릴"은 5 내지 16개의 고리 원자를 함유하는 모노사이클릭 또는 융합된 바이사이클릭 또는 트라이사이클릭 방향족 고리 집합체를 지칭하며, 이때 고리 원자들 중 1 내지 4개는 헤테로원자이며, 각각 N, O 또는 S이다. 예를 들어, 헤테로아릴은 피리딜, 인돌릴, 인다졸릴, 퀴녹살리닐, 퀴놀리닐, 아이소퀴놀리닐, 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 푸라닐, 피롤릴, 티아졸릴, 벤조티아졸릴, 옥사졸릴, 아이소옥사졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티에닐, 또는 예를 들어 알킬, 니트로 또는 할로겐으로 치환된, 특히 일치환 또는 이치환된 임의의 다른 라디칼을 포함한다. 피리딜은 2-, 3- 또는 4-피리딜, 유리하게는 2- 또는 3-피리딜을 나타낸다. 티에닐은 2- 또는 3-티에닐을 나타낸다. 퀴놀리닐은 바람직하게는 2-, 3- 또는 4-퀴놀리닐을 나타낸다. 아이소퀴놀리닐은 바람직하게는 1-, 3- 또는 4-아이소퀴놀리닐을 나타낸다. 벤조피라닐, 벤조티오피라닐은 각각 바람직하게는 3-벤조피라닐 또는 3-벤조티오피라닐을 나타낸다. 티아졸릴은 바람직하게는 2- 또는 4-티아졸릴, 그리고 가장 바람직하게는 4-티아졸릴을 나타낸다. 트라이아졸릴은 바람직하게는 1-, 2- 또는 5-(1,2,4-트라이아졸릴)이다. 테트라졸릴은 바람직하게는 5-테트라졸릴이다.
바람직하게는, 헤테로아릴은 피리딜, 인돌릴, 퀴놀리닐, 피롤릴, 티아졸릴, 아이소옥사졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티에닐, 푸라닐, 벤조티아졸릴, 벤조푸라닐, 아이소퀴놀리닐, 벤조티에닐, 옥사졸릴, 인다졸릴, 또는 치환된, 특히 일치환 또는 이치환된 라디칼들 중 임의의 것이다.
유사하게, 아릴 및 헤테로아릴 기에 대한 치환체는 다양하며, -할로겐, -OR', -OC(O)R', -NR'R", -SR', -R', -CN, -NO2, -CO2R', -CONR'R", -C(O)R', -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR"C(O)2R',-NR'-C(O)NR"R"', -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -N3, -CH(Ph)2, 퍼플루오로(C1-C4)알콕시, 및 퍼플루오로(C1-C4)알킬로부터 선택되며, 이들은 0 내지 방향족 고리 시스템 상의 개방 원자가의 총수 범위의 수로 존재하고; 여기서, R', R" 및 R"'은 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬 및 헤테로알킬, 비치환된 아릴 및 헤테로아릴, (비치환된 아릴)-(C1-C4)알킬, 및 (비치환된 아릴)옥시-(C1-C4)알킬로부터 선택된다.
아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자들 상의 치환체들 중 2개는 선택적으로 화학식 -T-C(O)-(CH2)q-U-의 치환체로 대체될 수 있으며, 여기서 T 및 U는 독립적으로 -NH-, -O-, -CH2- 또는 단일 결합이고, q는 0 내지 2의 정수이다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자들 상의 치환체들 중 2개는 선택적으로 화학식 -A-(CH2)r-B-의 치환체로 대체될 수 있으며, 여기서 A 및 B는 독립적으로 -CH2-, -O-, -NH-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- 또는 단일 결합이고, r은 1 내지 3의 정수이다. 그렇게 형성된 새로운 고리의 단일 결합들 중 하나는 선택적으로 이중 결합으로 대체될 수 있다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자들 상의 치환체들 중 2개는 선택적으로 화학식 -(CH2)s-X-(CH2)t-의 치환체로 대체될 수 있으며, 여기서 s 및 t는 독립적으로 0 내지 3의 정수이고, X는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, 또는 -S(O)2NR'-이다. -NR'- 및 -S(O)2NR'- 내의 치환체 R'은 수소 또는 비치환된 (C1-C6)알킬로부터 선택된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "(헤테로)아릴아미노"는 아릴 기로 치환된 아민 라디칼 (예를 들어, -NH-아릴)을 지칭한다. 아릴아미노는 또한 아민 기로 치환된 아릴 라디칼 (예를 들어, -아릴-NH2)일 수 있다. 아릴아미노는 치환 또는 비치환될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "아민"은 하나 이상의 아미노 기를 갖는, 본 명세서에 정의된 바와 같은 알킬 기를 지칭한다. 아미노 기는 1차, 2차 또는 3차일 수 있다. 알킬 아민은 하이드록시 기로 추가로 치환될 수 있다. 본 발명에 유용한 아민은 에틸 아민, 프로필 아민, 아이소프로필 아민, 에틸렌 다이아민 및 에탄올아민을 포함하지만 이로 한정하지 않는다. 아미노 기는 알킬 아민을 화합물의 나머지 부분과의 부착점에 연결하거나, 알킬 기의 오메가 위치에 있거나, 또는 알킬 기의 적어도 2개의 탄소 원자에서 함께 연결될 수 있다. 당업자는 다른 알킬 아민이 본 발명에 유용함을 이해할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "카르바메이트"는 구조 -NR"CO2R'을 갖는 작용기를 지칭하며, 여기서 R' 및 R"은 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬 및 헤테로알킬, 비치환된 아릴 및 헤테로아릴, (비치환된 아릴)-(C1-C4)알킬, 및 (비치환된 아릴)옥시-(C1-C4)알킬로부터 선택된다. 카르바메이트의 예에는 t-Boc, Fmoc, 벤질옥시- 카르보닐, 알록(alloc), 메틸 카르바메이트, 에틸 카르바메이트, 9-(2-설프브)플루오레닐메틸 카르바메이트, 9-(2,7-다이브로모)플루오레닐메틸 카르바메이트, Tbfmoc, Climoc, Bimoc, DBD-Tmoc, Bsmoc, Troc, Teoc, 2-페닐에틸 카르바메이트, Adpoc, 2-클로로에틸 카르바메이트, 1,1-다이메틸-2- 할로에틸 카르바메이트, DB-t-BOC, TCBOC, Bpoc, t-Bumeoc, Pyoc, Bnpeoc, V-(2- 피발로일아미노)-1,1-다이메틸에틸 카르바메이트, NpSSPeoc이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "카르복실레이트"는 카르복실산의 짝염기를 지칭하는데, 이는 일반적으로 화학식 RCOO로 나타낼 수 있다. 예를 들어, 용어 "마그네슘 카르복실레이트"는 카르복실산의 마그네슘 염을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "활성화된 에스테르"는 카르복실 기와 아미노산 유도체의 유리 아미노 기의 용이한 축합을 촉진시키기 위하여 펩티드 화학에서 사용되는 카르복실-활성화 기를 지칭한다. 이들 카르복실-활성화 기의 설명은 펩티드 화학의 일반 교재, 예를 들어 문헌[K. D. Kopple, "Peptides and Amino Acids", W. A. Benjamin, Inc., New York, 1966, pp. 50 - 51] 및 문헌[E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides"; Vol. 1, Academic Press, New York, 1965, pp. 77 - 128]에서 찾을 수 있다.
용어 "하이드라진" 및 "하이드라지드"는, 단일 결합된 질소들을 함유하며, 이들 중 하나는 1차 아민 작용기인 화합물을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "알데하이드"는 -CHO 기를 갖는 화합물을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "티올"은 황-수소 결합으로 구성된 작용기를 함유하는 화합물을 지칭한다. 티올 작용기의 일반 화학 구조는 R-SH이며, 여기서 R은 알킬, 알켄, 아릴, 또는 다른 탄소-함유 원자단을 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "실릴"은 Si(Rz)3를 지칭하며, 여기서 각각의 Rz는 독립적으로 알킬 아릴 또는 다른 탄소-함유 원자단이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "다이아조늄 염"은 구조 R-N2 +X-를 갖는 유기 화합물들의 그룹을 지칭하며, 여기서 R은 임의의 유기 잔기 (예를 들어, 알킬 또는 아릴)일 수 있으며, X는 무기 또는 유기 음이온 (예를 들어, 할로겐)이다.
트라이플루오로메탄설포네이트로도 지칭되는 용어 "트라이플레이트"는 화학식 CF3SO3를 갖는 그룹이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "보론산"은 구조 -B(OH)2를 지칭한다. 보론산은 켄처(quencher)의 합성 시에 다양한 단계에서 보로네이트 에스테르로서 존재할 수 있음이 당업자에 의해 인식된다. 보론산은 그러한 에스테를 포함하는 것으로 여겨진다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "보론산 에스테르" 또는 "보로네이트 에스테르"는 -B(Z1)(Z2) 모이어티를 함유하는 화합물을 지칭하며, 여기서 Z1 및 Z2 는 함께 모이어티를 형성하며, 여기서 각각의 경우에 붕소에 부착된 원자는 산소 원자이다. 일부 실시 형태에서, 보론산 에스테르 모이어티는 5원 고리이다. 일부 다른 실시 형태에서, 보론산 에스테르 모이어티는 6원 고리이다. 일부 다른 실시 형태에서, 보론산 에스테르 모이어티는 5원 고리 및 6원 고리의 조합이다.
III. 조성물
중합체
본 발명의 화합물은 화학식 I 내지 화학식 XIII의 구조를 갖는 수용성 형광 중합체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 중합체는 화학식 I에 나타낸 바와 같이 다이하이드로페난트렌 (DHP), 플루오렌, 및 DHP 및 플루오렌 단량체의 조합을 이용한다:
(I).
본 발명의 중합체 복합체는 중합체 밴드 갭을 변경시킬 수 있는 단위를 함유할 수 있으며, 상기 단위는 중합체 주쇄를 따라 균일하게 또는 랜덤하게 분포된다. 이들 단위는 화학식 I에서 M으로 나타낸다. 본 발명의 중합체 복합체는 또한 화학식 I에서 L로 나타낸 링커를 함유할 수 있다. 각각의 선택적인 링커 L은 중합체 주쇄를 따라 균일하게 또는 랜덤하게 분포된 아릴 또는 헤테로아릴 기이고, 아민, 카르바메이트, 카르복실산, 카르복실레이트, 말레이미드, 활성화된 에스테르, N-하이드록시석신이미딜, 하이드라진, 하이드라지드, 하이드라존, 아지드, 알킨, 알데하이드, 티올, 및 기질 또는 결합제에 대한 접합을 위한 이들의 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용기로 말단화된 하나 이상의 펜던트 사슬로 치환된다.
본 발명의 중합체 복합체는 또한 화학식 I에서 각각의 G1 및 G2로 나타낸 캡핑(capping) 단위를 함유하며, 이들은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 알킨, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 할로겐 치환된 아릴, 실릴, 다이아조늄 염, 트라이플레이트, 아세틸옥시, 아지드, 설포네이트, 포스페이트, 보론산 치환된 아릴, 보론산 에스테르 치환된 아릴, 보론산 에스테르, 보론산, 선택적으로 치환된 다이하이드로페난트렌 (DHP), 선택적으로 치환된 플루오렌, 아민, 카르바메이트, 카르복실산, 카르복실레이트, 말레이미드, 활성화된 에스테르, N-하이드록시석신이미딜, 하이드라진, 하이드라지드, 하이드라존, 아지드, 알킨, 알데하이드, 티올, 및 기질 또는 결합제에 대한 접합을 위한 이들의 보호기로부터 선택되는 작용기로 말단화된 하나 이상의 펜던트 사슬로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 경우에, 상기 중합체는 화학식 II의 구조를 갖는다:
(II).
일부 경우에, 상기 중합체는 화학식 IV의 구조를 갖는다:
(IV).
일부 경우에, 상기 중합체는 화학식 V의 구조를 갖는다:
(V).
일부 경우에, 상기 중합체는 공중합체이고, 화학식 VI의 구조를 갖는다:
(VI).
일부 경우에, 상기 중합체는 공중합체이고, 화학식 VII의 구조를 갖는다:
(VII).
일부 실시 형태에서, 중합체는 골격에 부착된 억셉터 염료를 가지며, 이는 중합체 골격을 여기하고 에너지 전달을 통해 골격에 부착된 억셉터 염료의 방출을 모니터링해서 볼 수 있게 할 것이다. 본 발명에 유용한 억셉터 염료는 FITC, CY3B, Cy55, Alexa 488, 텍사스 레드, Cy5, Cy7, Alexa 750, 및 800CW를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 억셉터 염료를 갖는 중합체는 하기를 포함한다:
및
.
단량체
본 발명의 단량체는 다이하이드로페난트렌 (DHP) 및 플루오렌 기반 단량체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 단량체는 하기를 포함한다:
, , , , 및 .
단량체의 양쪽 말단 기가 독립적으로 또는 둘 모두 할로겐 원자인 경우, 보론산 에스테르 또는 보론산, 실릴, 다이아조늄 염, 트라이플레이트, 아세틸옥시, 설포네이트, 또는 포스페이트는 Pd 또는 니켈 염 촉매 중합 반응을 거칠 수 있다. R1은 독립적으로, 물/완충액 중에서 용해성을 부여할 수 있는 측기이며, 각각의 R1은 독립적으로 암모늄 알킬 염, 암모늄 알킬옥시 염, 암모늄 올리고에테르 염, 설포네이트 알킬 염, 설포네이트 알콕시 염, 설포네이트 올리고에테르 염, 설폰아미도 올리고에테르, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고; 각각의 R2는 독립적으로 H, 알킬, 알켄, 알킨, 사이클로알킬, 할로알킬, 알콕시, (헤테로)아릴옥시, 아릴, (헤테로)아릴아미노, PEG, 암모늄 알킬 염, 암모늄 알킬옥시 염, 암모늄 올리고에테르 염, 설포네이트 알킬 염, 설포네이트 알콕시 염, 설포네이트 올리고에테르 염, 설폰아미도 올리고에테르, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고; 각각의 R3은 독립적으로 H, 알킬, 알켄, 알킨, 사이클로알킬, 할로알킬, 알콕시, (헤테로)아릴옥시, 아릴, (헤테로)아릴아미노, 및 PEG로 이루어진 군으로부터 선택되고; 각각의 Z는 독립적으로 C, O, 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 각각의 Q는 독립적으로 결합, NH, NR4 및 CH2로 이루어진 군으로부터 선택되고; 각각의 R5는 독립적으로 H, C1-C12 알킬, C2-C12 알켄, C2-C12 알킨, C3-C12 사이클로알킬, C1-C12 할로알킬, C1-C12 알콕시, C2-C18 (헤테로)아릴옥시, C2-C18 (헤테로)아릴아미노, 및 C1-C12 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 단량체는 또한 가교된 단량체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 가교된 단량체는 하기를 포함한다:
, , 및 .
합성
본 발명의 DHP 단량체는 하기에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다.
예를 들어, 2,7-다이브로모-트랜스-9,10-다이하이드로페난트렌-9,10-다이올 (DHP-OH)은 하기와 같이 제조될 수 있다. 삼각 플라스크 (2000 L) 내에서, 약 26 g의 NaBH4를 교반 중인 물-에탄올 혼합물 (120 mL + 780 mL) 내로 첨가하였다. 이 용액에, 약 24 g의 2,7-다이브로모페난트렌-9,10-다이온을 일부씩 그러나 신속하게 (5분 내에) 첨가하였다. 반응 혼합물을 1일 동안 교반되게 하였다. 용액의 색이 다홍색(orange red)에서 담황색으로 그리고 반응의 종료 시점까지 백색으로 변한다. 반응을 정지하고, 반응 혼합물을 묽은 염산으로 중화시켰다. 중화 후에, 백색 침전물을 여과하고 과량의 물로 세척하였다. 이렇게 수득된 백색 침전물을 매우 차가운 (-15oC 미만) 에탄올 (100 mL) 및 메탄올 (100 mL)로 세척하였다.
DHP-OSO3H는 하기와 같이 제조될 수 있다. 2구 둥근바닥 플라스크 내에서, DHP-OH (3.6 g) 및 18C6 (500 mg)을 120 mL의 THF 중에 용해시켰다. 용액을 질소 (20분)로 퍼지하고, 질소 퍼지를 계속하면서 NaH (2 g)를 첨가하였다. 용액의 색이 10 내지 15분 후에 무색에서 연분홍색, 진분홍색, 갈색 및 암록색으로 변한다. 다른 RB 내에서, 12 g의 1,3 프로판 설톤을 20 mL의 THF 중에 용해시키고, 질소 퍼지하였다. 이 설톤 용액을 20 내지 30분의 기간에 걸쳐 첨가 깔때기에 의해 DHP-OH 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 4 내지 5시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 침전물을 물 중에 용해시켰다. 아세톤을 첨가하여 이나트륨 염 형태로 DPS의 백색 침전물을 얻었다. 침전물을 여과하고, 물 (소량) 중에 재용해시키고, HCl로 중화시키고, 다시 아세톤 중에 침전시켰다. 반복된 침전 (2 내지 3회) 후에 원심분리하여, 백색 고체로서 DPS를 얻는다.
DHP-OSO2Cl은 하기와 같이 제조될 수 있다. 5 g의 DHP-OSO3H를 둥근바닥 플라스크 내에 넣고, 25 mL의 DMF로 혼합하였다. 여기에 약 10 mL의 SOCl2를 적가하고, 혼합물을 하룻밤 동안 교반되게 하였다. 다음날 아침에, 반응 혼합물을 200 mL의 물에 붓고, 침전물을 여과하고 건조시켰다.
DHP-설폰아미드 PEG는 하기와 같이 제조될 수 있다. DHP-OSO2Cl을 다이클로로메탄/TEA 혼합물 중에서 2.2 당량의 PEG 아민과 혼합하였다. 3시간의 초음파 처리 반응 후에, 조 생성물(crude product)을 다이클로로메탄 중에 추출한 후, 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, MeOH-CHCl3)를 수행하였다.
DHP-설폰아미드 PEG의 다이보론산 에스테르는 하기와 같이 제조될 수 있다. 다이브로모 화합물을 질소 하에서 DMSO와 혼합하고, 여기에 3 당량의 비스피나콜레이토다이보론을 첨가하였다. 이들 시약을 12 당량의 포타슘 아세테이트 및 4 당량의 Pd(dppf)Cl2 촉매와 80도에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 냉각시키고, CHCl3/물로 추출하였다. 유기 층을 농축시키고, 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, MeOH-CHCl3)로 정제하였다.
유사하게, 본 발명의 플루오렌 단량체는 하기에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들어, FL-OSO3H가 하기와 같이 제조될 수 있다. 2구 둥근바닥 플라스크 내에서, 5 g의 플루오렌을 70의 DMSO와 혼합하였다. 용액을 질소 (20분)로 퍼지하고, 질소 퍼지를 계속하면서 50% NaOH (12 eq)를 첨가하였다. 용액의 색이 무색에서 암갈색으로 변한다. 프로판 설톤 (3 eq)을 칭량하고, DMSO 중에 용해시켰다. 이것을 5분의 기간에 걸쳐 플루오렌 반응 혼합물에 적가하였다. 반응물을 실온에서 4 내지 5시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 침전물을 물 중에 용해시켰다. 아세톤을 첨가하여 이나트륨 염 형태로 DPS의 백색 침전물을 얻었다. 침전물을 여과하고, 물 (소량) 중에 재용해시키고, HCl로 중화시키고, 다시 아세톤 중에 침전시켰다. 반복된 침전 (2 내지 3회) 후에 원심분리하여, 백색 고체로서 FL-OSO3H를 얻는다.
FL-OSO2Cl은 하기와 같이 제조될 수 있다. 5 g의 FL-OSO3H를 둥근바닥 플라스크 내에 넣고, 25 mL의 DMF로 혼합하였다. 여기에 약 10 mL의 SOCl2를 적가하고, 혼합물을 하룻밤 동안 교반되게 하였다. 다음날 아침에, 반응 혼합물을 200 mL의 물에 붓고, 침전물을 여과하고 건조시켰다.
FL-설폰아미드 PEG는 하기와 같이 제조될 수 있다. FL-OSO2Cl을 다이클로로메탄/TEA 혼합물 중에서 2.2 당량의 PEG 아민과 혼합하였다. 3시간의 초음파 처리 반응 후에, 조 생성물을 다이클로로메탄 중에 추출한 후, 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, MeOH-CHCl3)를 수행하였다.
FL-설폰아미드 PEG의 다이보론산 에스테르는 하기와 같이 제조될 수 있다. 다이브로모 화합물을 질소 하에서 DMSO와 혼합하고, 여기에 3 당량의 비스피나콜레이토다이보론을 첨가하였다. 이들 시약을 12 당량의 포타슘 아세테이트 및 4 당량의 Pd(dppf)Cl2 촉매와 80도에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 냉각시키고, CHCl3/물로 추출하였다. 유기 층을 농축시키고, 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, MeOH-CHCl3)로 정제하였다.
중합
상기 실시 형태에 기재된 화합물은 당업계에 알려진 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 형광 중합체는 전자 풍부 링커 단위와 배합된 다이하이드로페난트렌 (DHP) 단량체로부터 제조될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 밝은 중합체 염료는 전자 풍부 링커 단위와 배합된 플루오렌 단량체로부터 제조될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 밝은 중합체 염료는 전자 풍부 링커 단위와 배합된 DHP 및 플루오렌 단량체의 조합으로부터 제조될 수 있다.
일반적으로, 전술된 중합 단량체 단위는 당업자에게 알려진 중합 기법을 사용하여 또는 본 명세서에 기재된 방법과 조합하여 당업계에 알려진 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 다이할라이드 단량체로부터의 다이보론산 에스테르 유도체의 합성은 비스(피나콜레이토)다이보론과의 스즈키 커플링(Suzuki coupling)을 통해 달성될 수 있다:
유사하게, 중합은 또한 하기의 스즈키 커플링을 통해 달성될 수 있다:
(상기 식에서, J1 및 J2는 독립적으로 H, Br, B(OH)2, 또는 보론산 에스테르임).
예를 들어, 중합은 하기와 같이 진행될 수 있다. 둥근바닥 플라스크 내에서, 브로모 단량체 및 보로닉 단량체 둘 모두를 (DMF-물) 혼합물 중에 넣고, 10분 동안 질소로 퍼지하였다. 질소 하에서, 약 20 당량의 CsF 및 10%의 Pd(OAc)2를 혼합하고, 80℃에서 가열하였다. UV-Vis 분광법 및 SEC 크로마토그래피를 사용하여 중합을 모니터링하였다. 이후에, 반응 혼합물에, 적절한 작용기를 함유하는 캡핑제 (G1로부터 선택됨)를 첨가하고, 3시간 후에 제2 캡핑제 (G2로부터 선택됨)를 첨가하였다. 반응 후에, 조 반응 혼합물을 증발시키고, 겔 투과 컬럼에 통과시켜 작은 유기 분자 및 저 MW 올리고머를 제거하였다.
캡핑 단위
링커 및 캡핑 단위가 앞서 기재된 것과 유사한 메커니즘을 통해 본 발명의 중합체 골격에 접합될 수 있다. 예를 들어, 캡핑 단위의 브로모- 및 보론산 에스테르가 중합체의 한쪽 또는 양쪽 말단에 대한 부가에 사용될 수 있다. 캡핑 단위의 브로모- 및 보론산 에스테르 둘 모두를 이용함으로써, 중합체의 양쪽 말단에 대한 부가가 수행될 것이다. 캡핑 단위의 브로모- 또는 보론산 에스테르 중 단지 하나의 형태만을 이용함으로써, 그의 각각의 상보체로 말단화된 말단에 대해서만 부가가 수행될 것이며, 대칭 중합을 위하여, 중합체의 한쪽 말단만을 통계학적으로 개질하는 데 사용될 수 있다. 비대칭 중합체의 경우, 이러한 접근법은 중합체가 단지 단일 사슬 말단에서만 개질됨을 화학적으로 보장하는 데 사용된다. 캡핑 단위는 또한, 먼저 브로모-캡핑 단위를 Y 말단을 갖는 중합체와 반응시키고, 후속으로 보론산 에스테르 캡핑 단위를 갖는 중합체와 반응시킴으로써, 비대칭적으로 부가될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 캡핑제는 하기에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다.
결합제
본 발명의 "결합제"는 표적 분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 그러한 분자들의 복합체일 수 있다. 본 발명의 결합제는, 예를 들어 단백질, 작은 유기 분자, 탄수화물 (다당류를 포함함), 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 지질, 친화성 리간드, 항체, 항체 단편, 압타머 등을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 결합제는 항체 또는 이의 단편이다. 본 발명과 관련하여 특이적 결합은 이종성 집단의 존재 하에서 표적 분석물의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 검정 조건 하에서, 명시된 결합제는 특정 단백질 또는 특정 단백질의 아이소형(isoform)에 우선적으로 결합하고, 샘플 내에 존재하는 다른 단백질 또는 다른 아이소형에는 유의한 양으로 결합하지 않는다.
결합제가 항체인 경우, 이들은 단일클론 또는 다중클론 항체일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 '항체'는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 (Ig) 분자의 면역학적으로 활성인 부분을 지칭한다. 그러한 항체는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 단일특이성 다중클론 항체, 항체 모방체, 키메라, 단일쇄, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편, Fv, 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
복합체
일반적으로, 본 발명의 형광 중합체는 당업자에게 알려진 기법을 사용하여 또는 본 명세서에 기재된 방법과 조합하여 당업계에 알려진 방법을 사용하여 결합제에 접합될 수 있다.
예를 들어, 중합체 NHS 에스테르의 제조는 하기와 같이 진행될 수 있다. 청정한 바이알 내에 5 mg의 중합체를 넣고, 1 mL의 건성 CH3CN 중에 용해시킨다. 여기에, 15 mg의 TSTU를 첨가하고, 추가 2분 동안 교반한다. 여기에, 100 uL의 DIPEA를 첨가하고, 파라핀을 사용하여 뚜껑을 밀봉한 상태로 하룻밤 동안 계속 교반한다. 이후에, 반응 혼합물 중의 유기 용매를 증발 제거한다. 빠른 와동에 의해 약 750 uL의 1xBBS 완충액 (pH 8.8) 중에 조 NHS를 용해시키고, 그것을 Zeba 컬럼 40K MWCO에 옮긴다. 샘플을 2분 동안 2200 RPM으로 스핀 다운하고, 이 중합체 NHS를 즉시 사용한다.
CD4와의 중합체 NHS의 접합은 하기와 같이 진행될 수 있다. 스핀 다운된 1XBBS (약 800 uL) 중 중합체 NHS를 취하고, 0.6 mg의 CD4에 첨가하고, 100 uL의 0.5M 붕산염 완충액 (pH 9.0)과 혼합한다. 30초 동안 빠르게 와동시키고, Coulter 혼합기 내에서 3 내지 4시간 동안 혼합되게 한다.
Histrap HP 컬럼을 통한 접합체의 정제는 하기와 같이 진행될 수 있다. 접근 1: 조 반응(crude reaction) 후에, Histrap HP 컬럼을 사용하여 접합체를 정제한다. 1XPBS 완충액을 사용하여 샘플을 로딩하고, 비결합된 분획을 수집한다. 이것은 20 CV의 완충액을 사용하여 행해질 수 있다. 이후에, 완충액을 교체하여, 접합체 및 유리 항체 둘 모두를 갖는 결합된 분획을 세척한다. 이것은 10 CV를 위하여 이동하는 0.25M 이미다졸을 함유하는 1XPBS를 사용하여 행해질 수 있다.
접근 2: Hitrap SP Sepharose FF 컬럼. 컬럼을 평형화하고, 20mM 시트르산염 완충액 (pH 3.5)을 사용하여 샘플을 로딩하고, 비결합된 분획을 수집한다. 이것은 20 CV의 완충액을 사용하여 행해질 수 있다. 이후에, 완충액을 교체하여, 접합체 및 유리 항체 둘 모두를 갖는 결합된 분획을 용리한다. 이것은 20 CV를 위하여 이동하는 20mM Tris 완충액 (pH 8.5)을 사용하여 행해질 수 있다.
접근 3: 300K MWCO 막이 구비된 접선 유동 여과 시스템 내에 조 접합체를 로딩한다. 여과액이 405 nm에서 흡수를 나타내지 않을 때까지 1XPBS를 사용하여 접합체를 세척한다. 이후에, 화합물을 농축시킨다.
SEC 컬럼을 통한 접합체의 정제는 하기와 같이 진행될 수 있다. 유리 항체를 함유하는 조 접합체를 1XPBS를 사용하여 크기 배제 컬럼에 로딩한다. 흡수 스펙트럼을 확인한 후에 튜브를 풀링하고, 30KDa MWCO 원심 농축기를 갖는 Amicon Ultra-15 내에서 농축시킨다.
IV. 분석물의 검출 방법
개관
본 발명은 샘플에서 분석물을 검출하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계; 접합된 수용성 중합체에 접합된 결합제를 포함하는 접합된 중합체 복합체를 제공하는 단계를 포함한다. 결합제는 분석물과 상호작용할 수 있다. 중합체를 여기할 수 있는 광원이 샘플에 인가되고, 접합된 중합체 복합체로부터 방출되는 광이 검출된다. 전형적인 검정에서, 본 발명의 형광 중합체는 파장이 약 395 nm 내지 약 415 nm인 광에 의해 여기가능하다. 방출된 광은 전형적으로 약 415 nm 내지 약 475 nm이다. 대안적으로, 여기 광은 파장이 약 340 nm 내지 약 370 nm일 수 있으며, 방출된 광은 약 390 nm 내지 약 420 nm이다.
샘플
본 발명의 방법에서의 샘플은, 예를 들어 혈액, 골수, 비장 세포, 림프 세포, 골수 흡인액 (또는 골수로부터 획득되는 임의의 세포), 소변 (세척액), 혈청, 타액, 뇌척수액, 소변, 양수, 간질액, 대변, 점액, 또는 조직 (예를 들어, 종양 샘플, 해체된 조직, 해체된 고형 종양)일 수 있다. 소정 실시 형태에서, 샘플은 혈액 샘플이다. 일부 실시 형태에서, 혈액 샘플은 전혈이다. 전혈은 표준 임상 절차를 사용하여 대상체로부터 획득될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 전혈의 하나 이상의 세포들의 하위세트 (예를 들어, 적혈구, 백혈구, 림프구 (예를 들어, T 세포, B 세포 또는 NK 세포), 식세포, 단핵구, 대식세포, 과립구, 호염기구, 호중구, 호산구, 혈소판, 또는 하나 이상의 검출가능한 마커를 갖는 임의의 세포)이다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 세포 배양물로부터 유래될 수 있다.
대상체는 인간 (예를 들어, 질병을 앓고 있는 환자), 상업적으로 중요한 포유류 - 예를 들어, 원숭이, 소, 또는 말을 포함함 - 일 수 있다. 샘플은 또한 가정용 애완동물로부터 획득될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 개 또는 고양이가 포함된다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 질병의 동물 모델로서 사용되거나 약물 스크리닝에 사용되는 실험실용 동물, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 또는 기니 피그이다.
분석물
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "분석물"은, 풍부도(abundance)/농도가 어떠한 분석 절차에 의해 결정되는 물질, 예를 들어 분자를 지칭한다. 예를 들어, 본 발명에서, 분석물은 단백질, 펩티드, 핵산, 지질, 탄수화물 또는 소분자일 수 있다.
표적 분석물은, 예를 들어 핵산 (DNA, RNA, mRNA, tRNA, 또는 rRNA), 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 지질, 이온, 단당류, 올리고당류, 다당류, 지질단백질, 당단백질, 당지질, 또는 이들의 단편일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표적 분석물은 단백질이며, 예를 들어 구조 미세섬유, 미세소관, 및 중간 필라멘트 단백질, 세포소기관-특이적 마커, 프로테아좀, 막관통 단백질, 표면 수용체, 핵공 단백질, 단백질/펩티드 트랜스로카제, 단백질 접힘 샤페론, 신호전달 골격, 이온 채널 등일 수 있다. 단백질은 활성화 가능한 단백질 또는 이환된 또는 비정상적인 세포에서 차별적으로 발현되거나 활성화되는 단백질일 수 있으며, 이에는 전사 인자, DNA 및/또는 RNA-결합 및 변형 단백질, 핵내 및 핵외 수송 수용체, 아폽토시스 또는 생존의 조절인자 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
검정
결합제 및 형광 표지를 이용하여, 결합된 분자를 정량화하는 검정 시스템은 잘 알려져 있다. 그러한 시스템의 예에는 유세포측정기, 스캐닝 사이토미터(scanning cytometer), 이미징 사이토미터(imaging cytometer), 형광 현미경, 및 공초점 형광 현미경이 포함된다.
일부 실시 형태에서, 유세포측정이 형광을 검출하는 데 사용된다. 이러한 용도에 적합한 다수의 디바이스가 입수가능하며, 당업자에게 알려져 있다. 예에는 BCI Navios, Gallios, Aquios, 및 CytoFLEX 유세포측정기가 포함된다.
다른 실시 형태에서, 검정은 면역검정이다. 본 발명에 유용한 면역검정의 예에는 플루오로루미네센스 검정(fluoroluminescence assay, FLA) 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 이들 검정은 또한 단백질 어레이에 대해 수행될 수 있다.
결합제가 항체인 경우, 항체 또는 다중 항체 샌드위치 검정이 또한 사용될 수 있다. 샌드위치 검정은, 연속된 인식 사건(recognition event)을 사용하여 다양한 결합제 및 리포팅 요소(reporting element)의 층들을 구축하여 특정 분석물의 존재를 신호로 표시하는 것을 지칭한다. 샌드위치 검정의 예는 미국 특허 제4,486,530호에 그리고 그 안에 언급된 참고문헌에 개시되어 있다.
V. 실시예
실시예 1: DHP 중합체 복합체의 제조
방법 1: 둥근바닥 플라스크 내에서, 다이브로모 DHP 단량체 및 다이보로닉 DHP 단량체 (1:1) 둘 모두를 (DMF-물) 혼합물 중에 넣고, 10분 동안 질소로 퍼지하였다. 질소 하에서, 약 20 당량의 CsF 및 10%의 Pd(OAc)2를 혼합하고, 80℃에서 가열하였다. UV-Vis 분광법 및 SEC 크로마토그래피를 사용하여 중합을 모니터링하였다. 이후에, 반응 혼합물에, 적절한 작용기를 함유하는 캡핑제 (G1로부터 선택됨)를 첨가하고, 3시간 후에 제2 캡핑제 (G2로부터 선택됨)를 첨가하였다. 반응 후에, 조 반응 혼합물을 증발시키고, 겔 투과 컬럼에 통과시켜 작은 유기 분자 및 저 MW 올리고머를 제거하였다. 이후에, 조 중합체가 100K MWCO 막이 구비된 접선 유동 여과 시스템을 통과하였다. 그것을, 여과액의 흡수가 줄어들 때까지, 20% 에탄올을 사용하여 세척하였다.
방법 2: 대안적으로, 중합은 DHP 분자의 브로모-보론산 에스테르를 자기-중합함으로써 행해질 수 있다. 둥근바닥 플라스크 내에서, DHP 브로모보론산 에스테르를 (DMF-물) 혼합물 중에 넣고, 10분 동안 질소로 퍼지하였다. 질소 하에서, 약 10 당량의 CsF 및 5%의 Pd(OAc)2를 혼합하고, 80℃에서 가열하였다. UV-Vis 분광법 및 SEC 크로마토그래피를 사용하여 중합을 모니터링하였다. 이후에, 반응 혼합물에, 적절한 작용기를 함유하는 캡핑제 (G1로부터 선택됨)를 첨가하고, 3시간 후에 제2 캡핑제 (G2로부터 선택됨)를 첨가하였다. 반응 후에, 조 반응 혼합물을 증발시키고, 겔 투과 컬럼에 통과시켜 작은 유기 분자 및 저 MW 올리고머를 제거하였다. 이후에, 조 중합체가 100K MWCO 막이 구비된 접선 유동 여과 시스템을 통과하였다. 그것을, 여과액의 흡수가 줄어들 때까지, 20% 에탄올을 사용하여 세척하였다.
방법 3: 둥근바닥 플라스크 내에서, 다이브로모 다이하이드로페난트렌 단량체 및 다이보로닉 다이하이드로페난트렌 단량체 (1:1) 둘 모두를 넣고, 10 당량의 K2CO3 및 3% Pd(PPh3)4를 함유하는 THF-물 (4:1) 혼합물 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 슈렝크 라인(Schlenk line) 상에 놓고, 3회의 동결-펌프-해동 사이클로 탈기하고, 이어서 18시간 동안 격렬하게 교반하면서 질소 하에서 80℃로 가열하였다. 이후에, 반응 혼합물에, 적절한 작용기를 함유하는 캡핑제 (G1로부터 선택됨)를 과량의 질소 압력 하에서 캐뉼러를 통해 첨가하고, 3시간 후에 제2 캡핑제 (G2로부터 선택됨)를 첨가하였다. 반응 후에, 조 반응 혼합물을 증발시키고, 겔 투과 컬럼에 통과시켜 작은 유기 분자 및 저 MW 올리고머를 제거하였다. 이후에, 조 중합체가 100K MWCO 막이 구비된 접선 유동 여과 시스템을 통과하였다. 그것을, 여과액의 흡수가 줄어들 때까지, 20% 에탄올을 사용하여 세척하였다.
방법 4: 대안적으로, 중합은 다이하이드로페난트렌 분자의 브로모-보론산 에스테르를 자기-중합함으로써 행해질 수 있다. 둥근바닥 플라스크 내에서, 다이하이드로페난트렌 브로모보론산 에스테르를 넣고, 10 당량의 K2CO3 및 3% Pd(PPh3)4를 함유하는 THF-물 (4:1) 혼합물 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 슈렝크 라인 상에 놓고, 3회의 동결-펌프-해동 사이클로 탈기하고, 이어서 18시간 동안 격렬하게 교반하면서 질소 하에서 80℃로 가열하였다. 이후에, 반응 혼합물에, 적절한 작용기를 함유하는 캡핑제 (G1로부터 선택됨)를 과량의 질소 압력 하에서 캐뉼러를 통해 첨가하고, 3시간 후에 제2 캡핑제 (G2로부터 선택됨)를 첨가하였다. 반응 후에, 조 반응 혼합물을 증발시키고, 겔 투과 컬럼에 통과시켜 작은 유기 분자 및 저 MW 올리고머를 제거하였다. 이후에, 조 중합체가 100K MWCO 막이 구비된 접선 유동 여과 시스템을 통과하였다. 그것을, 여과액의 흡수가 줄어들 때까지, 20% 에탄올을 사용하여 세척하였다.
실시예 2: 플루오렌-DHP 공중합체 복합체의 제조
방법 1: 둥근바닥 플라스크 내에서, 다이브로모 DHP 단량체 및 다이보로닉 플루오렌 단량체 (1:1) 둘 모두를 (DMF-물) 혼합물 중에 넣고, 10분 동안 질소로 퍼지하였다. 질소 하에서, 약 20 당량의 CsF 및 10%의 Pd(OAc)2를 혼합하고, 80℃에서 가열하였다. UV-Vis 분광법 및 SEC 크로마토그래피를 사용하여 중합을 모니터링하였다. 이후에, 반응 혼합물에, 적절한 작용기를 함유하는 캡핑제 (G1로부터 선택됨)를 첨가하고, 3시간 후에 제2 캡핑제 (G2로부터 선택됨)를 첨가하였다. 반응 후에, 조 반응 혼합물을 증발시키고, 겔 투과 컬럼에 통과시켜 작은 유기 분자 및 저 MW 올리고머를 제거하였다. 이후에, 조 중합체가 100K MWCO 막이 구비된 접선 유동 여과 시스템을 통과하였다. 그것을, 여과액의 흡수가 줄어들 때까지, 20% 에탄올을 사용하여 세척하였다.
방법 2: 둥근바닥 플라스크 내에서, 다이브로모 플루오렌 단량체 및 다이보로닉 DHP 단량체 (1:1) 둘 모두를 (DMF-물) 혼합물 중에 넣고, 10분 동안 질소로 퍼지하였다. 질소 하에서, 약 20 당량의 CsF 및 10%의 Pd(OAc)2를 혼합하고, 80℃에서 가열하였다. UV-Vis 분광법 및 SEC 크로마토그래피를 사용하여 중합을 모니터링하였다. 이후에, 반응 혼합물에, 적절한 작용기를 함유하는 캡핑제 (G1로부터 선택됨)를 첨가하고, 3시간 후에 제2 캡핑제 (G2로부터 선택됨)를 첨가하였다. 반응 후에, 조 반응 혼합물을 증발시키고, 겔 투과 컬럼에 통과시켜 작은 유기 분자 및 저 MW 올리고머를 제거하였다. 이후에, 조 중합체가 100K MWCO 막이 구비된 접선 유동 여과 시스템을 통과하였다. 그것을, 여과액의 흡수가 줄어들 때까지, 20% 에탄올을 사용하여 세척하였다.
방법 3: 둥근바닥 플라스크 내에서, 다이브로모 다이하이드로페난트렌 단량체 및 다이보로닉 플루오렌 단량체 (1:1) 둘 모두를 넣고, 10 당량의 K2CO3 및 3% Pd(PPh3)4를 함유하는 THF-물 (4:1) 혼합물 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 슈렝크 라인 상에 놓고, 3회의 동결-펌프-해동 사이클로 탈기하고, 이어서 18시간 동안 격렬하게 교반하면서 질소 하에서 80℃로 가열하였다. 이후에, 반응 혼합물에, 적절한 작용기를 함유하는 캡핑제 (G1로부터 선택됨)를 과량의 질소 압력 하에서 캐뉼러를 통해 첨가하고, 3시간 후에 제2 캡핑제 (G2로부터 선택됨)를 첨가하였다. 반응 후에, 조 반응 혼합물을 증발시키고, 겔 투과 컬럼에 통과시켜 작은 유기 분자 및 저 MW 올리고머를 제거하였다. 이후에, 조 중합체가 100K MWCO 막이 구비된 접선 유동 여과 시스템을 통과하였다. 그것을, 여과액의 흡수가 줄어들 때까지, 20% 에탄올을 사용하여 세척하였다.
방법 4: 둥근바닥 플라스크 내에서, 다이브로모 플루오렌 단량체 및 다이보로닉 다이하이드로페난트렌 단량체 (1:1)를 넣고, 10 당량의 K2CO3 및 3% Pd(PPh3)4를 함유하는 THF-물 (4:1) 혼합물 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 슈렝크 라인 상에 놓고, 3회의 동결-펌프-해동 사이클로 탈기하고, 이어서 18시간 동안 격렬하게 교반하면서 질소 하에서 80℃로 가열하였다. 이후에, 반응 혼합물에, 적절한 작용기를 함유하는 캡핑제 (G1로부터 선택됨)를 과량의 질소 압력 하에서 캐뉼러를 통해 첨가하고, 3시간 후에 제2 캡핑제 (G2로부터 선택됨)를 첨가하였다. 반응 후에, 조 반응 혼합물을 증발시키고, 겔 투과 컬럼에 통과시켜 작은 유기 분자 및 저 MW 올리고머를 제거하였다. 이후에, 조 중합체가 100K MWCO 막이 구비된 접선 유동 여과 시스템을 통과하였다. 그것을, 여과액의 흡수가 줄어들 때까지, 20% 에탄올을 사용하여 세척하였다.
실시예 3: 형광 방출 스펙트럼의 비교
플루오렌 (Fl-Fl), 다이하이드로페난트렌 (DHP-DHP) 및 플루오렌-DHP (DHP-Fl) 중합체의 형광 방출 스펙트럼의 비교를 실시하였다. DHP 함유 중합체는 그들의 형광 최대값이 426 내지 428 nm에 위치하면서 현저한 차이를 나타내는 반면, 플루오렌 기반 중합체는 421 nm의 최대값을 나타낸다 (도 1).
실시예 4: 흡수 스펙트럼의 비교
플루오렌 (Fl-Fl) 중합체 및 다이하이드로페난트렌 (DHP-DHP) 중합체 둘 모두의 흡수 스펙트럼을 측정하였다. 그래프는 390 및 410 nm에서 DHP-DHP 중합체 (흑색 곡선)의 흡수를 나타내는 반면, Fl-Fl (회색 곡선) 중합체는 약 400 nm에서 최대값을 나타낸다. 샘플을 상이한 농도 하에서 측정하였다 (도 2).
실시예 5: CD4 신호 내지 노이즈 비
새로운 중합체-표지 항-인간 CD4 및 퍼시픽 블루-표지 CD4로 염색된 용해된 전혈의 유세포측정 분석을 실시하였다. 중합체 염료의 양성 신호 세기는 퍼시픽 블루보다 거의 5배 더 높았다 (도 3).
실시예 6
본 발명의 중합체는 흡수, 형광, 휘도, 분자량, 다분산성, 항체에 접합될 때의 염료 대 단백질 비 등의 소정의 물리적 및 화학적 특성을 갖는 것으로 확인되었다. 이들 파라미터의 바람직한 범위는 도 4의 표에 제시되어 있다.
탠덤 중합체의 여기 및 방출 스펙트럼을 측정하였다. 중합체 최대값 (405 nm)에서 여기를 수행하였으며, 골격에 부착된 다양한 억셉터 염료로부터 방출이 관찰되었다 (도 5).
본 명세서에 기재된 실시예 및 실시 형태는 단지 예시적인 목적을 위한 것이고, 그에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 시사될 것이고, 이는 본 출원의 사상 및 범위 그리고 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되어야 함이 이해된다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

Claims (21)

  1. 하기의 구조를 가지는 수용성 형광 중합체를 포함하는 탠덤 중합체 염료:

    여기서,
    각각의 X는 독립적으로 C 및 Si로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 R1은 독립적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 암모늄 알킬 염, 암모늄 알킬옥시 염, 암모늄 올리고에테르 염, 설포네이트 알킬 염, 설포네이트 알콕시 염, 설포네이트 올리고에테르 염, 설폰아미도 올리고에테르, 및 으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 R2는 독립적으로 H, 알킬, 알켄, 알킨, 사이클로알킬, 할로알킬, 알콕시, (헤테로)아릴옥시, 아릴, (헤테로)아릴아미노, PEG 기, 암모늄 알킬 염, 암모늄 알킬옥시 염, 암모늄 올리고에테르 염, 설포네이트 알킬 염, 설포네이트 알콕시 염, 설포네이트 올리고에테르 염, 설폰아미도 올리고에테르, 및 으로 이루어진 군으로 부터 선택되고;
    각각의 R3은 독립적으로 H, 알킬, 알켄, 알킨, 사이클로알킬, 할로알킬, 알콕시, (헤테로)아릴옥시, 아릴, (헤테로)아릴아미노, 및 PEG 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 Z는 독립적으로 CH2, O, 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 Q는 독립적으로 결합, NH, NR4, 및 CH2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 M은 독립적으로 중합체 밴드 갭(band gap)을 변경시킬 수 있는 전자 풍부 링커 단위(electron rich linker unit)이고, 중합체 주쇄를 따라 균일하게 또는 랜덤하게 분포되고, 각각 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
    , , ,, , , , , , , , , , , , 및
    상기 식에서,
    각각의 R4는 10 mg/mL인 경우 과량으로 물 중에서 용해성을 부여할 수 있는 비이온성 측기(side group)이고, 각각 독립적으로 할로겐, 하이드록실, C1-C12 알킬, C2-C12 알켄, C2-C12 알킨, C3-C12 사이클로알킬, C1-C12 할로알킬, C1-C12 알콕시, C2-C18 (헤테로)아릴옥시, C2-C18 (헤테로)아릴아미노, (CH2)x'(OCH2-CH2)y'OCH3 (여기서, 각각의 x'은 독립적으로 0 내지 20의 정수이고; 각각의 y'은 독립적으로 0 내지 50의 정수임), 및 C2-C18 (헤테로)아릴 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 링커 L은 독립적으로 중합체 주쇄를 따라 균일하게 또는 랜덤하게 분포된 아릴 또는 헤테로아릴 기이고, 아민, 카르바메이트, 카르복실산, 카르복실레이트, 말레이미드, 활성화된 에스테르, N-하이드록시석신이미딜, 하이드라진, 하이드라지드, 하이드라존, 아지드, 알킨, 알데하이드, 티올, 및 이들의 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용기로 말단화된 하나 이상의 펜던트 사슬로 치환되고, 선택적으로 다른 기질, 억셉터 염료, 또는 결합제와 연결되고;
    적어도 하나의 L은 억셉터 염료에 연결되며, 은 억셉터 염료이고;
    G1 및 G2는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 알킨, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 할로겐 치환된 아릴, 실릴, 다이아조늄 염, 트라이플레이트, 아세틸옥시, 아지드, 설포네이트, 포스페이트, 보론산 치환된 아릴, 보론산 에스테르 치환된 아릴, 보론산 에스테르, 보론산, 선택적으로 치환된 다이하이드로페난트렌 (DHP), 선택적으로 치환된 플루오렌, 아민, 카르바메이트, 카르복실산, 카르복실레이트, 말레이미드, 활성화된 에스테르, N-하이드록시석신이미딜, 하이드라진, 하이드라지드, 하이드라존, 아지드, 알킨, 알데하이드, 티올, 및 이들의 보호기로부터 선택되는 작용기로 말단화된 하나 이상의 펜던트 사슬로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 선택적으로 기질 또는 결합제와 접합되고;
    a, c, 및 d는, 각각이 균일하게 또는 랜덤하게 반복될 수 있는 상기 구조 내의 각각의 단위의 몰%를 정의하며, a는 10 내지 100%의 몰%이고, c는 0 내지 90%의 몰%이고, 각각의 d는 몰%이며, 0<d≤25%이고;
    각각의 b는 독립적으로 0 또는 1이고;
    m은 1 내지 10,000의 정수이고;
    각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수임.
  2. 제1항에 있어서,
    각각의 X는 C인, 탠덤 중합체 염료.
  3. 제1항에 있어서,
    R1은 인, 탠덤 중합체 염료.
  4. 제3항에 있어서,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 인, 탠덤 중합체 염료.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 수용성 형광 중합체는 공중합체이고, 화학식 VI의 구조를 포함하는, 탠덤 중합체 염료.
    (VI)
    상기 식에서,
    g 및 a는 총합하여 10 내지 100%의 몰%임.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 수용성 형광 중합체는 공중합체이고, 화학식 VII의 구조를 포함하는, 탠덤 중합체 염료.
    (VII)
    상기 식에서,
    각각의 g 및 a는 총합하여 10 내지 100%의 몰%이고,
    각각의 f는 독립적으로 0 내지 50의 정수이고,
    각각의 R5는 독립적으로 H, C1-C12 알킬, C2-C12 알켄, C2-C12 알킨, C3-C12 사이클로알킬, C1-C12 할로알킬, C1-C12 알콕시, C2-C18 (헤테로)아릴옥시, C2-C18 (헤테로)아릴아미노, 및 C1-C12 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택됨.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 수용성 형광 중합체는 공중합체이고, 화학식 VIII의 구조를 포함하는, 탠덤 중합체 염료.
    (VIII)
    상기 식에서,
    각각의 g 및 a는 총합하여 10 내지 100%의 몰%이고,
    각각의 f는 독립적으로 0 내지 50의 정수이고,
    각각의 R5는 독립적으로 H, C1-C12 알킬, C2-C12 알켄, C2-C12 알킨, C3-C12 사이클로알킬, C1-C12 할로알킬, C1-C12 알콕시, C2-C18 (헤테로)아릴옥시, C2-C18 (헤테로)아릴아미노, 및 C1-C12 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택됨.
  8. 제1항에 있어서,
    각각의 L은 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 탠덤 중합체 염료.
    , , , , , , , 및 ,
    상기 식에서,
    각각의 R6은 독립적으로 H, OH, SH, NHCOO-t-부틸, (CH2)nCOOH, (CH2)nCOOCH3,(CH2)nNH2, (CH2)nNH-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOOH, (CH2)nNHCO-(CH2)n-CO-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOO-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOOC(CH3)3, (CH2)nNHCO(C3-C12)사이클로알킬, (CH2)nNHCO(CH2)nCOOH, (CH2)nNHCO(CH2)nCOO(CH2)nCH3, (CH2)n(OCH2CH2)fOCH3, N-말레이미드, 할로겐, C2-C12 알켄, C2-C12 알킨, C3-C12 사이클로알킬, C1-C12 할로 알킬, C1-C12 (헤테로)아릴, C1-C12 (헤테로)아릴아미노, 및 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, C1-C12 알콕시, 또는 (OCH2CH2)fOCH3로 선택적으로 치환된 벤질로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 f는 독립적으로 0 내지 50의 정수이고;
    각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수임.
  9. 제1항에 있어서,
    G1 및 G2는 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 다이하이드로페난트렌 (DHP), 선택적으로 치환된 플루오렌, 작용기로 말단화된 하나 이상의 펜던트 사슬로 치환된 아릴, 및 작용기로 말단화된 하나 이상의 펜던트 사슬로 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는, 탠덤 중합체 염료.
  10. 제1항에 있어서, G1 및 G2는 각각 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 탠덤 중합체 염료.
    , , , , , , , , , 및 ,
    상기 식에서,
    각각의 R6은 독립적으로 H, OH, SH, NHCOO-t-부틸, (CH2)nCOOH, (CH2)nCOOCH3,(CH2)nNH2, (CH2)nNH-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOOH, (CH2)nNHCO-(CH2)n-CO-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOO-(CH2)n-CH3, (CH2)nNHCOOC(CH3)3, (CH2)nNHCO(C3-C12)사이클로알킬, (CH2)nNHCO(CH2)nCOOH, (CH2)nNHCO(CH2)nCOO(CH2)nCH3, (CH2)n(OCH2CH2)fOCH3, N-말레이미드, 할로겐, C2-C12 알켄, C2-C12 알킨, C3-C12 사이클로알킬, C1-C12 할로 알킬, C1-C12 (헤테로)아릴, C1-C12 (헤테로)아릴아미노, 및 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, C1-C12 알콕시, 또는 (OCH2CH2)fOCH3로 선택적으로 치환된 벤질로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 f는 독립적으로 0 내지 50의 정수이고;
    각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수임.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 억셉터 염료는 FITC, CY3B, Cy55, Alexa 488, 텍사스 레드, Cy5, Cy7, Alexa 750, 및 800CW으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 탠덤 중합체 염료.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수용성 형광 중합체에 연결된 결합제를 추가로 포함하는, 탠덤 중합체 염료.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 결합제는 항체인, 탠덤 중합체 염료.
  14. 샘플에서 분석물을 검출하기 위한 방법으로서,
    상기 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계;
    상기 샘플을 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 탠덤 중합체 염료에 접합된 결합제와 접촉시키는 단계를 포함하며;
    상기 결합제는 상기 분석물 또는 표적-회합된 비아오분자와 상호작용할 수 있는, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 결합제는 단백질, 펩티드, 친화성 리간드, 항체, 항체 단편, 당, 지질, 핵산 또는 압타머인, 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 결합제는 항체인, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 방법은 유세포측정을 위해 구성되는, 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 결합제는 기질에 결합되어 있는, 방법.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 분석물은 세포 표면 상에서 발현되는 단백질인, 방법.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 방법은 면역검정으로서 구성되는, 방법.
  21. 제16항에 있어서,
    상기 방법은 추가의 분석물을 동시에 검출하기 위한 추가의 결합제를 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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