JP2019513371A - 核酸ポリペプチド組成物とその使用 - Google Patents

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Abstract

ポリ核酸分子に抱合した結合部分とポリマーとを含む組成物と医薬製剤が本明細書で開示される。さらに、ポリ核酸分子に抱合した結合部分とポリマーとを含む組成物または医薬製剤を利用する、癌を処置する方法も本明細書で記載されている。【選択図】図１Ａ

Description

本出願は、２０１６年４月１日に出願された米国仮特許出願第６２／３１６，９１９号の利益を主張し、該仮出願は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０１７年３月２８日に作成された上記のＡＳＣＩＩのコピーは、４５５３２−７０７＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔのファイル名であり、６１５，６６６バイトのサイズである。
ＲＮＡにより誘発された遺伝子サイレンシングによる遺伝子抑制は、いくつかのレベルの制御：転写不活性化、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により誘発されたｍＲＮＡ分解、およびｓｉＲＮＡにより誘発された転写減衰をもたらす。いくつかの例では、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、複数の細胞分裂にわたって長い永続的な効果をもたらす。そのため、ＲＮＡｉは薬物標的確認、遺伝子機能解析、経路分析、および疾患治療に役立つ実行可能な方法を表す。
ある実施形態において、ポリ核酸分子に抱合した結合部分とポリマーとを含む組成物と医薬製剤が本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子に抱合した結合部分とポリマーとを含む組成物または医薬製剤を利用する、疾患または疾病（例えば癌）を処置する方法も本明細書で記載されている。
ある実施形態において、式（Ｉ）の分子が本明細書で開示され、
式中、
Ａは結合部分であり、
Ｂはポリヌクレオチドであり、
Ｃはポリマーであり、
Ｘは単結合または第１のリンカーであり、および、
Ｙは単結合または第２のリンカーであり、および、
ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆位脱塩基部分を含む。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチドはロックド核酸（ＬＮＡ）あるいはエチレン核酸（ＥＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合あるいはホスホロジチオエート結合を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの逆位脱塩基部分は少なくとも１つの末端にある。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは一本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは２つ以上の鎖を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、二重らせん構造のポリ核酸分子を形成するために、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つの修飾を含む。
いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドはＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡ分子である。
いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５、４５２−１９５５、１９５６−１９６２、１９６７−２００２、２０１３−２０３２、あるいは２０８２−２１０９、または２１１７に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５、４５２−１９５５、１９５６−１９６２、１９６７−２００２、２０１３−２０３２、あるいは２１１７から選択された配列からなる。
いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５、４５２−１９５５、１９５６−１９６２、１９６７−２００２、２０１３−２０３２、あるいは２１１７に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５、４５２−１９５５、１９５６−１９６２、１９６７−２００２、２０１３−２０３２、あるいは２１１７から選択された配列からなる。
いくつかの実施形態において、ＸとＹは独立して単結合あるいは非ポリマー性リンカー基である。いくつかの実施形態において、Ｘは単結合である。いくつかの実施形態において、ＸはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、ＹはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｘは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基に随意に抱合した、ホモ二官能性（ｈｏｍｏｂｉｆｕｃｔｉｏｎａｌ）リンカーあるいはヘテロ二官能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）リンカーである。いくつかの実施形態において、Ｙはホモ二官能性リンカーまたはヘテロ二官能性リンカーである。
いくつかの実施形態において、結合部分は抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいはラクダ科抗体またはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその結合フラグメントは、抗ＥＧＦＲ抗体またはその結合フラグメントである。
いくつかの実施形態において、Ｃはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、Ｃは約５，０００Ｄａの分子量を有する。
いくつかの実施形態において、Ａ−ＸはＢの５’末端へ結合し、Ｙ−ＣはＢの３’末端に抱合する。いくつかの実施形態において、Ｙ−ＣはＢの５’末端へ抱合し、Ａ−ＸはＢの３’末端へ抱合する。いくつかの実施形態において、Ａ−Ｘ、Ｙ−Ｃ、またはこれらの組み合わせは、ヌクレオチド間結合基に抱合する。
いくつかの実施形態では、分子はＤをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤはＣまたはＡに抱合する。
いくつかの実施形態において、Ｄは式（ＩＩ）に従って式（Ｉ）の分子に抱合し、
式中、
Ａは結合部分であり、
Ｂはポリヌクレオチドであり、
Ｃはポリマーであり、
Ｘは単結合または第１のリンカーであり、
Ｙは単結合または第２のリンカーであり、
Ｌは単結合または第３のリンカーであり、
Ｄはエンドソーム溶解性部分であり、および、
ｎは０から１までの整数であり、および、
ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆位脱塩基部分を含み、および、Ｄは、Ａ、Ｂ、あるいはＣのいかなる場所にも抱合する。
いくつかの実施形態において、ＤはＩＮＦ７またはメリチンである。
いくつかの実施形態において、Ｄはエンドソーム溶解性ポリマーである。
いくつかの実施形態において、ＬはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｌはホモ二官能性リンカーまたはヘテロ二官能性リンカーである。
いくつかの実施形態において、分子はさらに少なくとも第２の結合部分Ａを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも第２の結合部分ＡはＡに、Ｂに、あるいはＣに抱合する。いくつかの実施形態において、少なくとも第２の結合部分Ａはコレステロールである。
いくつかの実施形態において、分子はさらに少なくとも追加のポリヌクレオチドＢを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも追加のポリヌクレオチドＢはＡに、Ｂに、あるいはＣに抱合する。
いくつかの実施形態において、分子はさらに少なくとも追加のポリマーＣを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも追加のポリマーＣはＡに、Ｂに、あるいはＣに抱合する。
ある実施形態において、式（Ｉ）：Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ（式Ｉ）の分子が本明細書で開示され、式中、Ａは抗体あるいはその結合フラグメントであり、Ｂはポリヌクレオチドであり、Ｃはポリマーであり、Ｘは単結合または第１の非ポリマー性リンカーであり、および、Ｙは単結合または第２のリンカーであり、ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆位脱塩基部分を含み、および、ここで、ＡとＣは同じ末端でＢに結合しない。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチドはロックド核酸（ＬＮＡ）あるいはエチレン核酸（ＥＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合あるいはホスホロジチオエート結合を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの逆位脱塩基部分は少なくとも１つの末端にある。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは一本鎖を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、二重らせん構造のポリ核酸分子を形成するために、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドはＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５、４５２−１９５５、１９５６−１９６２、１９６７−２００２、２０１３−２０３２、２０８２−２１０９、あるいは２１１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５、４５２−１９５５、１９５６−１９６２、１９６７−２００２、２０１３−２０３２、２０８２−２１０９、あるいは２１１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｙは非ポリマー性リンカー基である。いくつかの実施形態において、Ｘは単結合である。いくつかの実施形態において、ＸはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、ＹはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｘは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基に随意に抱合した、ホモ二官能性（ｈｏｍｏｂｉｆｕｃｔｉｏｎａｌ）リンカーあるいはヘテロ二官能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）リンカーである。いくつかの実施形態において、Ｙはホモ二官能性リンカーまたはヘテロ二官能性リンカーである。いくつかの実施形態において、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいはラクダ科抗体またはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、Ｃはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、Ｃは約１０００Ｄａ、２０００Ｄａ、あるいは５０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、Ａ−ＸはＢの５’末端へ抱合し、Ｙ−ＣはＢの３’末端に抱合する。いくつかの実施形態において、Ｙ−ＣはＢの５’末端へ結合し、Ａ−ＸはＢの３’末端へ抱合する。いくつかの実施形態では、分子はＤをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤはＣまたはＡに抱合する。いくつかの実施形態において、Ｄは式（ＩＩ）：（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃｃ）−Ｌ−Ｄ（式ＩＩ）に従って式（Ｉ）の分子に抱合し、式中、Ａは抗体あるいはその結合フラグメントであり、Ｂはポリヌクレオチドであり、Ｃはポリマーであり、Ｘは単結合または第１の非ポリマー性リンカーであり、Ｙは単結合または第２のリンカーであり、Ｌは単結合または第３のリンカーであり、Ｄはエンドソーム溶解性部分であり、および、ｃは０から１までの整数であり、ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆位脱塩基部分を含み、ここで、ＡとＣは同じ末端ではＢに結合せず、および、ここで、ＤはＡまたはＣの任意の場所に、あるいはＢの末端に抱合する。いくつかの実施形態において、ＤはＩＮＦ７またはメリチンである。いくつかの実施形態において、Ｄはエンドソーム溶解性ポリマーである。いくつかの実施形態において、ＬはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｌはホモ二官能性リンカーまたはヘテロ二官能性リンカーである。いくつかの実施形態において、分子はさらに少なくとも第２の結合部分を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも第２の結合部分はＡに、Ｂに、あるいはＣに抱合する。いくつかの実施形態において、少なくとも第２の結合部分はコレステロールである。いくつかの実施形態において、分子はさらに少なくとも追加のポリヌクレオチドＢを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも追加のポリヌクレオチドＢはＡに、Ｂに、あるいはＣに抱合する。いくつかの実施形態において、分子はさらに少なくとも追加のポリマーＣを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも追加のポリマーＣはＡに、Ｂに、あるいはＣに抱合する。
ある実施形態において、上に記載された分子と薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物が本明細書に開示されている。いくつかの実施形態において、医薬組成物はナノ粒子製剤として製剤される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、非経口、経口、鼻腔内、バッカル、直腸、または経皮的な投与のために製剤される。
ある実施形態において、上に記載された分子を含む組成物を患者に投与する工程を含む、患者の疾患または障害を処置する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、疾患または障害は癌である。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、癌は、ＫＲＡＳに関連する癌、ＥＧＦＲに関連する癌、ＡＲに関連する癌、（β）−カテニンに関連する癌、ＰＩＫ３Ｃに関連する癌、あるいはＭＹＣに関連する癌を含む。いくつかの実施形態において、癌は、膀胱癌、乳癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、多形膠芽腫、頭頚部癌、腎癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、あるいは甲状腺癌を含む。いくつかの実施形態において、癌は急性骨髄性白血病、ＣＬＬ、ＤＬＢＣＬ、あるいは多発性骨髄腫を含む。いくつかの実施形態において、方法は免疫腫瘍治療である。
ある実施形態において、患者の初代細胞中の標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、上に記載された分子を初代細胞に投与する工程を含む方法が本明細書に開示されている。いくつかの実施形態において、方法はインビボの方法である。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。
ある実施形態において、必要としている患者の疾患または障害の処置のために上に記載された分子を含む免疫腫瘍治療が本明細書に開示されている。
本明細書では、ある実施形態において、上に記載された分子を含むキットが開示されている。
本開示の様々な態様はとりわけ添付の請求項で説明されている。本開示の特徴と利点についてのよりよい理解は、本開示の原則が用いられている例証的な実施形態と添付の図面を説明する以下の詳細な記載を参照することによって得られる：
本明細書に記載された分子の戯画表現を例証する。 本明細書に記載された分子の戯画表現を例証する。 本明細書に記載された分子の戯画表現を例証する。 コレステロール抱合体パッセンジャー鎖の構造を例証する。 本明細書に記載されたＩＮＦ７ペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５）を示す。 本明細書に記載されたメリチンペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０）を示す。 ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ２０ｋＤａ−ＥＧＦＲの分析的なＨＰＬＣを例証する。 ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ２０ｋＤａ−ＥＧＦＲ抱合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を例証する。 ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ１０ｋＤａ−ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡの分析的なクロマトグラムを例証する。 ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ５ｋＤａ−ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡの分析的なクロマトグラムを示す。 ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ１０ｋＤａ−ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡとＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ５ｋＤａ−ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ抱合体のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。 １、２、および３のｓｉＲＮＡ負荷を含むＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ１ｋＤａ−ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ抱合体のオーバーレイを例証する。 ＥＧＦＲ抗体−ＫＲＡＳ−ＰＥＧ５ｋＤａのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 パニツムマブ−ＫＲＡＳ−ＰＥＧ５ｋＤａのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 ＥＧＦＲ抗体−Ｓ−Ｓ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ５ｋＤａ（ＤＡＲ＝１）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ２４−メリチン（負荷＝〜１）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 ＥＧＦＲ抗体−メリチン（ｎ＝〜１）のＨＰＬＣクロマトグラムを例証する。 ＥＧＦＲ抗体−メリチン（ｎ＝１）の質量スペクトルを例証する。 ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ１ｋＤａＩＮＦ７のＨＩＣクロマトグラムを示す（ペプチド負荷＝〜１）。 ＥＧＦＲ抗体−ＩＮＦ７のＨＰＬＣクロマトグラムを示す（ペプチド負荷＝〜１）。 ＩＮＦ７−ＰＥＧ１ｋＤａ−（ＥＧＦＲ抗体−ＫＲＡＳ−ＰＥＧ５ｋＤａ）を示す。 メリチン−ＰＥＧ１ｋＤａ−（ＥＧＦＲ抗体−ＫＲＡＳ−ＰＥＧ５ｋＤａ）を例証する。 注入量のパーセント（％ＩＤ）として表されるｓｉＲＮＡ濃度を用いて、投与後９６時間までの血漿濃度時間プロファイルを例証する。 注入量のパーセント（％ＩＤ）として表されるｓｉＲＮＡ濃度を用いて、投与後９６時間までの血漿濃度時間プロファイルを示す。 注入量のパーセント（％ＩＤ）として表されるｓｉＲＮＡ濃度を用いて、投与後９６時間までの血漿濃度時間プロファイルを示す。 注入量のパーセント（％ＩＤ）として表されるｓｉＲＮＡ濃度を用いて、投与後９６時間までの血漿濃度時間プロファイルを例証する。 注入量のパーセント（％ＩＤ）として表されるｓｉＲＮＡ濃度を用いて、投与後９６時間までの血漿濃度時間プロファイルを例証する。 マウスの腫瘍または正常な肝臓中の組織中濃度時間プロファイルを例証する。図２６Ａは、マウスモデル中の皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍において測定された、投与後１６８時間までの組織中濃度時間プロファイルを示す。 マウスの腫瘍または正常な肝臓中の組織中濃度時間プロファイルを例証する。図２６Ｂは、マウスの正常な肝臓で測定された、投与後１６８時間までの組織中濃度時間プロファイルを示す。 マウスの皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍と正常な肝臓において測定された、投与後１６８時間までの組織中濃度時間プロファイルを示す。 マウスの皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍と正常な肝臓において測定された、投与後１６８時間までの組織中濃度時間プロファイルを例証する。 マウスの皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍と正常な肝臓において測定された、投与後１６８時間までの組織中濃度時間プロファイルを例証する。 マウスの皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍と正常な肝臓において測定された、投与後１６８時間までの組織中濃度時間プロファイルを示す。 ヒト皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍（図３１Ａ）中のヒトＫＲＡＳのｓｉＲＮＡを媒介としたｍＲＮＡノックダウンを例証する。 正常なマウス肝臓（図３１Ｂ）中のマウスＫＲＡＳのｓｉＲＮＡを媒介としたｍＲＮＡノックダウンを例証する。 ヒト皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍中のヒトＥＧＦＲのｓｉＲＮＡを媒介としたｍＲＮＡノックダウンを例証する。 ヒト皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍中のヒトＫＲＡＳのｓｉＲＮＡを媒介としたｍＲＮＡノックダウンを例証する。 ヒト皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍中のヒトＥＧＦＲのｓｉＲＮＡを媒介としたｍＲＮＡノックダウンを例証する。 マウス肝臓中のマウスＫＲＡＳのｓｉＲＮＡを媒介としたｍＲＮＡノックダウンを示す。 注入量のパーセント（％ＩＤ）として表されるｓｉＲＮＡ濃度を用いて、投与後９６時間までの血漿濃度時間プロファイルを例証する。 野生型のＣＤ−１マウスの肝臓、腎臓、および肺の中で測定された、投与後１４４時間までの組織中濃度時間プロファイルを例証する。 ｃｈｏｌ−ＩＮＦ７ペプチド（図３８Ａ）あるいはｃｈｏｌ−メリチンペプチド（図３８Ｂ）のいずれかと混合させたｃｈｏｌ−ＫＲＡＳに関してヒト皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍中で測定された、投与後１４４時間までの組織中濃度時間プロファイルを例証する。 ｃｈｏｌ−ＩＮＦ７ペプチド（図３８Ａ）あるいはｃｈｏｌ−メリチンペプチド（図３８Ｂ）のいずれかと混合させたｃｈｏｌ−ＫＲＡＳに関してヒト皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍中で測定された、投与後１４４時間までの組織中濃度時間プロファイルを例証する。 ｃｈｏｌ−ＩＮＦ７ペプチド（図３９Ａ）あるいはｃｈｏｌ−メリチンペプチド（図３９Ｂ）のいずれかと混合させたｃｈｏｌ−ＫＲＡＳに関してマウスの肝臓中で測定された、投与後１４４時間までの組織中濃度時間プロファイルを例証する。 ｃｈｏｌ−ＩＮＦ７ペプチド（図３９Ａ）あるいはｃｈｏｌ−メリチンペプチド（図３９Ｂ）のいずれかと混合させたｃｈｏｌ−ＫＲＡＳに関してマウスの肝臓中で測定された、投与後１４４時間までの組織中濃度時間プロファイルを例証する。 ｃｈｏｌ−ＩＮＦ７ペプチド（図４０Ａ）あるいはｃｈｏｌ−メリチンペプチド（図４０Ｂ）のいずれかと混合させたｃｈｏｌ−ＫＲＡＳに関してマウスの腎臓中で測定された、投与後１４４時間までの組織中濃度時間プロファイルを例証する。 ｃｈｏｌ−ＩＮＦ７ペプチド（図４０Ａ）あるいはｃｈｏｌ−メリチンペプチド（図４０Ｂ）のいずれかと混合させたｃｈｏｌ−ＫＲＡＳに関してマウスの腎臓中で測定された、投与後１４４時間までの組織中濃度時間プロファイルを例証する。 ｃｈｏｌ−ＩＮＦ７ペプチド（図４１Ａ）あるいはｃｈｏｌ−メリチンペプチド（図４１Ｂ）のいずれかと混合させたｃｈｏｌ−ＫＲＡＳに関してマウスの肺で測定された、投与後１４４時間までの組織中濃度時間プロファイルを例証する。 ｃｈｏｌ−ＩＮＦ７ペプチド（図４１Ａ）あるいはｃｈｏｌ−メリチンペプチド（図４１Ｂ）のいずれかと混合させたｃｈｏｌ−ＫＲＡＳに関してマウスの肺で測定された、投与後１４４時間までの組織中濃度時間プロファイルを例証する。 マウス肝臓中のマウスＫＲＡＳのｓｉＲＮＡを媒介としたｍＲＮＡノックダウンを例証する。 ヒト皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍（図４３Ａ）あるいはマウスの肝臓（図４３Ｂ）で測定された、投与後９６時間までの組織中濃度時間プロファイルを例証する。 ヒト皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍（図４３Ａ）あるいはマウスの肝臓（図４３Ｂ）で測定された、投与後９６時間までの組織中濃度時間プロファイルを例証する。 マウスの腎臓（図４４Ａ）あるいはマウスの肺（図４４Ｂ）で測定された、投与後９６時間までの組織中濃度時間プロファイルを示す。 マウスの腎臓（図４４Ａ）あるいはマウスの肺（図４４Ｂ）で測定された、投与後９６時間までの組織中濃度時間プロファイルを示す。 ヒト皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍中のマウスＫＲＡＳのｓｉＲＮＡを媒介としたｍＲＮＡノックダウンを示す。 ヒト皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍とマウスの肝臓、腎臓、および肺で測定された、投与後９６時間までのｓｉＲＮＡの組織中濃度を示す。 ＥＧＦＲ（図４７Ａ）あるいはＫＲＡＳ（図４７Ｂ）のヒト皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍におけるｓｉＲＮＡを媒介としたｍＲＮＡノックダウンを示す。 ＥＧＦＲ（図４７Ａ）あるいはＫＲＡＳ（図４７Ｂ）のヒト皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍におけるｓｉＲＮＡを媒介としたｍＲＮＡノックダウンを示す。 Ｈｅｐ３Ｂ同所性肝腫瘍中のヒトＣＴＮＮＢ１のｓｉＲＮＡを媒介としたｍＲＮＡノックダウンを示す。 Ｈｅｐ３Ｂ同所性肝腫瘍を抱えるマウスからの血清中のヒトα−フェトプロテインを示す。 ＬＮＣａＰ腫瘍におけるヒトＥＧＦＲのｓｉＲＮＡを媒介としたｍＲＮＡノックダウンを示す。 投与後９６時間の腫瘍または肝臓の組織におけるｓｉＲＮＡ濃度を示す。 ９６時間目のＬＮＣａＰ腫瘍におけるヒトＥＧＦＲのｓｉＲＮＡを媒介としたｍＲＮＡノックダウンを示す。 投与後９６時間の腫瘍または肝臓の組織におけるｓｉＲＮＡ濃度を示す。 本明細書に記載された典型的な分子の血漿ｓｉＲＮＡ濃度を示す。 ＨＣＣ８２７腫瘍または肝臓組織中の本明細書に記載される典型的な分子のｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 本明細書に記載された典型的な分子のＥＧＦＲ ＥＧＦＲ ｍＲＮＡ発現レベルを示す。 式（Ｉ）によって包含される分子を生成するための典型的なＡとＢを例証する。 本明細書に記載された典型的な分子のＥＧＦＲ ＥＧＦＲ ｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 ＨＣＣ８２７腫瘍または肝臓組織における本明細書に記載される典型的な分子のｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 本明細書に記載された典型的な分子のＥＧＦＲ ＥＧＦＲ ｍＲＮＡ発現レベルを示す。 肝臓（図５７Ａ）における本明細書に記載される典型的な分子のｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 腫瘍（図５７Ｂ）における本明細書に記載される典型的な分子のｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 本明細書に記載された典型的な分子のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現レベルを示す。 本明細書に記載された典型的な分子の血漿ｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 本明細書に記載された典型的な分子の血漿抗体濃度を示す。 腫瘍または肝臓組織における本明細書に記載される典型的な分子のｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍における本明細書に記載される典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを示す。 肝臓における本明細書に記載される典型的な分子のＣＴＮＮＢ１ ｍＲＮＡ発現レベルを示す。 肝臓における本明細書に記載される典型的な分子のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現レベルを示す。 本明細書に記載される典型的な分子の血漿ｓｉＲＮＡまたはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）濃度を例証する。 腫瘍または肝臓組織における本明細書に記載される典型的な分子のｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 ＬＮＣａＰ腫瘍における本明細書に記載される典型的な分子のＥＧＦＲ ｍＲＮＡ発現レベルを示す。 本明細書に記載された典型的な分子の心臓（図６４Ａ）におけるＨＰＲＴ ｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 本明細書に記載された典型的な分子の胃腸組織（図６４Ｂ）におけるＨＰＲＴ ｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 本明細書に記載された典型的な分子の肝臓（図６４Ｃ）におけるＨＰＲＴ ｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 本明細書に記載された典型的な分子の肺（図６４Ｄ）におけるＨＰＲＴ ｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 本明細書に記載された典型的な分子の組織（図６４Ｅ）におけるｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 本明細書に記載された典型的な分子の心臓（図６５Ａ）におけるｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 本明細書に記載された典型的な分子の胃腸組織（図６５Ｂ）におけるｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 本明細書に記載された典型的な分子の肝臓（図６５Ｃ）におけるｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 本明細書に記載された典型的な分子の肺（図６５Ｄ）におけるｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 本明細書に記載された典型的な分子の組織（図６５Ｅ）におけるｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 心臓（図６６Ａ）におけるｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 心臓（図６６Ｂ）におけるｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 胃腸組織（図６６Ｃ）におけるｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 筋肉（図６６Ｄ）におけるｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 本明細書に記載された典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 腫瘍または肝臓組織における本明細書に記載される典型的な分子のｓｉＲＮＡ濃度を示す。 初代のマウスＢ細胞を活性化する抗Ｂ細胞抗体−ｓｉＲＮＡ抱合体を例証する。図６８Ａは抗Ｂ細胞Ｆａｂ−ｓｉＲＮＡ抱合体を例証する。 初代のマウスＢ細胞を活性化する抗Ｂ細胞抗体−ｓｉＲＮＡ抱合体を例証する。図６８Ｂは抗Ｂ細胞モノクローナル抗体−ｓｉＲＮＡ抱合体を示す。 本明細書に記載された典型的な分子の血漿ｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 ５ｍｇ／ｋｇの投与量で血漿において本明細書に記載される典型的な分子の抗体ザルツムマブ濃度を示す。 本明細書に記載された典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 腫瘍または肝臓組織における本明細書に記載される典型的な分子のｓｉＲＮＡ濃度を示す。 本明細書に記載された典型的な分子の血漿ｓｉＲＮＡ濃度を示す。 ＬＮＣａＰ腫瘍における本明細書に記載される典型的な分子のｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 ＬＮＣａＰ腫瘍における本明細書に記載される典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 ＬＮＣａＰ腫瘍における本明細書に記載される典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 組織における本明細書に記載される典型的な分子のｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 処理後９６時間でのＨＣＣ８２７腫瘍において本明細書に記載される典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを示す。 ０．５ｍｇ／ｋｇの投与量で血漿において本明細書に記載される典型的な分子のＳｉＲＮＡ濃度を示す。 ５ｍｇ／ｋｇの投与量で血漿において本明細書に記載される典型的な分子の抗体ザルツムマブ濃度を示す。 様々なリンカーを含有する式（Ｉ）に包含される典型的な分子の血漿クリアランスを例証する。 ０．５ｍｇ／ｋｇの投与量でＨＣＣ８２７腫瘍における本明細書に記載される典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 腫瘍（図７５Ｂ）中のｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 肝臓（図７５Ｃ）中のｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 血漿（図７５Ｄ）中のｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 ＨＰＲＴを標的とする本明細書に記載された典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 ＨＰＲＴを標的とする本明細書に記載された典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 ＨＰＲＴを標的とする本明細書に記載された典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 ＨＰＲＴを標的とする本明細書に記載された典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを例証する。図７６Ａは心臓でのｍＲＮＡ発現レベルを示す。図７６Ｂは筋肉でのｍＲＮＡ発現レベルを示す。図７６Ｃは肝臓でのｍＲＮＡ発現レベルを示す。図７６Ｄは肺でのｍＲＮＡ発現レベルを示す。 筋肉（図７７Ａ）における式（Ｉ）により包含される典型的な分子のｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 心臓（図７７Ｂ）における式（Ｉ）により包含される典型的な分子のｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 肝臓（図７７Ｃ）における式（Ｉ）により包含される典型的な分子のｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 肺（図７７Ｄ）における式（Ｉ）により包含される典型的な分子のｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 処理後９６時間での心臓（図７８Ａ）における式（Ｉ）により包含される典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 処理後９６時間での胃腸組織（図７８Ｂ）における式（Ｉ）により包含される典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 処理後９６時間での肝臓（図７８Ｃ）における式（Ｉ）により包含される典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 処理後９６時間での肺（図７８Ｄ）における式（Ｉ）により包含される典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 式（Ｉ）により包含される典型的な分子の血漿ｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 処理後９６時間でのＬＮＣａＰ腫瘍における式（Ｉ）により包含される典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを示す。 ＬＮＣａＰ腫瘍、肝臓、腎臓、肺、および脾臓の組織サンプルにおける式（Ｉ）により包含される典型的な分子のｓｉＲＮＡ濃度を示す。 処理後９６時間でのＨＣＣ８２７腫瘍における式（Ｉ）により包含される典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを示す。 腫瘍、肝臓、腎臓、肺、および脾臓の組織サンプルにおける式（Ｉ）により包含される典型的な分子のｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 式（Ｉ）により包含される典型的な分子の血漿ｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 式（Ｉ）により包含される典型的な分子の血漿ｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 処理後９６時間でのＨＣＣ８２７腫瘍における式（Ｉ）により包含される典型的な分子のｍＲＮＡ発現レベルを例証する。 投与後９６時間のＨＣＣ８２７腫瘍または肝臓の組織におけるｓｉＲＮＡ濃度を例証する。 処理後４８時間でのマウスの脾臓Ｂ細胞における式（Ｉ）により包含される典型的な分子の相対的なｍＲＮＡ発現レベルを例証する。それぞれの典型的な分子はさらに数で表示される。 マウス血漿における式（Ｉ）（あるいはＡＳＣ）により包含される典型的な分子の安定性を例証する。
核酸（例えば、ＲＮＡｉ）治療は高い選択率と特異性を備えた標的療法である。しかしながら、いくつかの例では、核酸療法は、脆弱な細胞内の取り込み、制限のある血液安定性、および非特異的な免疫刺激によっても妨害される。これらの問題に対処するために、核酸組成物の様々な修飾、例えば、標的特異性および／または標的送達を増加させるために結合部分のより安定的なおよび／または毒性の低い最適化と、安定性の増加および／またはオフターゲット効果の減少のための核酸ポリマー修飾のための新規なリンカーなどが探求されている。
いくつかの実施形態において、核酸組成物を構成する様々な成分の配置または順序はさらに、細胞内の取り込み、安定性、毒性、有効性、および／または非特異的な免疫刺激を引き起こす。例えば、核酸成分が結合部分、ポリマー、およびポリ核酸分子（あるいはポリヌクレオチド）を含む場合、結合部分、ポリマー、および／またはポリ核酸分子（あるいはポリヌクレオチド）の順序または配置（例えば、結合部分−ポリ核酸分子−ポリマー、結合部分−ポリマー−ポリ核酸分子、あるいはポリマー−結合部分−ポリ核酸分子）はさらに、細胞内の取り込み、安定性、毒性、有効性、および／または非特異的な免疫刺激を引き起こす。
いくつかの実施形態において、核酸成分の配置が細胞内の取り込み、安定性、毒性、有効性、および／または非特異的な免疫刺激を引き起こす分子を含むことが本明細書に記載されている。いくつかの例では、分子は、ポリ核酸分子とポリマーに抱合した結合部分を含む。いくつかの実施形態において、分子は式（Ｉ）：Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃに係る分子を含み、ここで、Ａは結合部分であり、Ｂはポリヌクレオチドであり、Ｃはポリマーであり、Ｘは単結合あるいは第１のリンカーであり、および、Ｙは単結合または第２のリンカーである。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆位脱塩基部分を含む。いくつかの例では、式（Ｉ）の分子はさらに化合物Ｄ、エンドソーム溶解性部分を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるとおりに配されたポリ核酸分子とポリマーに抱合した結合部分を含む分子はさらに、細胞内の取り込み、安定性、および／または有効性を増強する。いくつかの例では、本明細書に記載されるとおりに配されたポリ核酸分子とポリマーに抱合した結合部分を含む分子は、毒性および／または非特異的な免疫刺激を減少させる。いくつかの場合では、分子は式（Ｉ）：Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃに係る分子を含み、ここで、Ａは結合部分であり、Ｂはポリヌクレオチドであり、Ｃはポリマーであり、Ｘは単結合あるいは第１のリンカーであり、および、Ｙは単結合または第２のリンカーである。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆位脱塩基部分を含む。いくつかの例では、式（Ｉ）の分子はさらに化合物Ｄ、エンドソーム溶解性部分を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される分子はさらに、疾患または障害を処置するために使用される。いくつかの例では、疾患または障害の処置のための分子は式（Ｉ）：Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃに係る分子であり、ここで、Ａは結合部分であり、Ｂはポリヌクレオチドであり、Ｃはポリマーであり、Ｘは単結合あるいは第１のリンカーであり、および、Ｙは単結合または第２のリンカーである。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆位脱塩基部分を含む。いくつかの例では、式（Ｉ）の分子はさらに化合物Ｄ、エンドソーム溶解性部分を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される分子は、患者の初代細胞中の標的遺伝子の発現の阻害するためにも使用される。そのような例では、そのような使用のための分子は式（Ｉ）：Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃに係る分子であり、ここで、Ａは結合部分であり、Ｂはポリヌクレオチドであり、Ｃはポリマーであり、Ｘは単結合あるいは第１のリンカーであり、および、Ｙは単結合または第２のリンカーである。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆位脱塩基部分を含む。いくつかの例では、式（Ｉ）の分子はさらに化合物Ｄ、エンドソーム溶解性部分を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される分子は、疾患または障害の処置のための免疫腫瘍治療としても使用される。いくつかの例では、分子は式（Ｉ）：Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃに係る分子であり、ここで、Ａは結合部分であり、Ｂはポリヌクレオチドであり、Ｃはポリマーであり、Ｘは単結合あるいは第１のリンカーであり、および、Ｙは単結合または第２のリンカーである。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆位脱塩基部分を含む。いくつかの例では、式（Ｉ）の分子はさらに化合物Ｄ、エンドソーム溶解性部分を含む。
追加の実施形態において、本明細書に記載されるキットは、本明細書に記載される分子の１つ以上を含む。
治療分子プラットフォーム
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される分子（例えば、治療用分子）は、ポリ核酸分子とポリマーに抱合した結合部分を含む。いくつかの実施形態において、分子（例えば、治療用分子）は式（Ｉ）に係る分子を含み、
式中、
Ａは結合部分であり、
Ｂはポリヌクレオチドであり、
Ｃはポリマーであり、
Ｘは単結合または第１のリンカーであり、および、
Ｙは単結合または第２のリンカーであり、および、
ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆位脱塩基部分を含む。
いくつかの例では、式（Ｉ）の分子はさらに化合物Ｄ、エンドソーム溶解性部分を含む。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＡおよび／または少なくとも１つのＣは、Ｂの５’末端に、Ｂの３’末端に、Ｂ上の内部部位に、あるいはその任意の組み合わせに抱合する。いくつかの例では、少なくとも１つのＡはＢの１つの末端に抱合するが、少なくとも１つのＣはＢの反対側の末端に抱合する。いくつかの例では、Ａの少なくとも１つはＢの１つの末端に抱合するが、Ｃの少なくとも１つはＢ上の内部部位に抱合する。
場合によっては、ＡとＣは同じ末端でＢに抱合せず、結合もしない。場合によっては、ＡはＢの第１の末端でＢに結合するか、抱合する。場合によっては、ＣはＢの第２の末端でＢに結合するか、抱合し、Ｂの第２の末端は第１の末端とは異なる。場合によっては、ＡはＢの５’末端でＢに結合するか、抱合し、ＣはＢの３’末端でＢに結合するか、抱合する。他の例では、ＡはＢの３’末端でＢに結合するか抱合し、ＣはＢの５’末端でＢに結合するか、抱合する。
いくつかの実施形態において、Ａは抗体またはその結合フラグメントである。場合によっては、Ｃはポリマーである。
場合によっては、ＡとＣは同じ末端でＢに抱合せず、結合もしない。場合によっては、ＡはＢの第１の末端でＢに結合するか、抱合する。場合によっては、ＣはＢの第２の末端でＢに結合するか、抱合し、Ｂの第２の末端は第１の末端とは異なる。場合によっては、ＡはＢの５’末端でＢに結合するか、抱合し、ＣはＢの３’末端でＢに結合するか、抱合する。他の例では、ＡはＢの３’末端でＢに結合するか抱合し、ＣはＢの５’末端でＢに結合するか、抱合する。場合によっては、ＡをＢに接続するＸは、単結合あるいは非ポリマー性リンカーである。場合によっては、Ｘは、非ペプチドリンカー（あるいはアミノ酸残基を含まないリンカー）である。場合によっては、ＢをＣに接続するＹは、単結合あるいは第２のリンカーである。いくつかの例では、ＸはＢの５’末端にＡを接続し、ＹはＢの３’末端にＣを接続する。他の例では、ＸはＢの３’末端にＡを接続し、ＹはＢの５’末端にＣを接続する。
いくつかの実施形態において、Ｘ−ＢはＡのＮ末端、Ｃ末端、定常領域、ヒンジ領域、あるいはＦｃ領域に抱合するか、あるいは結合する。いくつかの例では、Ｘ−ＢはＡのＮ末端に抱合するか、あるいは結合する。いくつかの例では、Ｘ−ＢはＡのＣ末端に抱合するか、あるいは結合する。いくつかの例では、Ｘ−ＢはＡのヒンジ領域に抱合するか、あるいは結合する。いくつかの例では、Ｘ−ＢはＡの定常領域に抱合するか、あるいは結合する。いくつかの例では、Ｘ−ＢはＡのＦｃ領域に抱合するか、あるいは結合する。
いくつかの例では、少なくとも１つのＢおよび／または少なくとも１つのＣ、および随意に少なくとも１つのＤは、第１のＡに抱合する。いくつかの例では、少なくとも１つのＢは、第１のＡに末端（例えば、５’末端あるいは３’末端）で抱合するか、あるいは内部部位を介して第１のＡに抱合する。場合によっては、少なくとも１つのＣは、第１のＡに直接、あるいは２つ以上のＢによって間接的に抱合する。２つ以上のＢによって間接的に抱合する場合、２つ以上のＣは、Ｂ上の第１のＡと同じ末端で、第１のＡから対向する末端で、あるいは、内部部位で独立して抱合する。いくつかの例では、少なくとも１つの追加のＡはさらに、第１のＡに、Ｂに、あるいはＣに抱合する。さらなる例では、少なくとも１つのＤは随意に、第１のＡに、少なくとも１つのＢに、あるいは少なくとも１つのＣに、直接あるいは間接的に抱合する。第１のＡに直接抱合する場合、少なくとも１つのＤもＡ−Ｄ−Ｂ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢに随意に抱合するか、Ａ−Ｄ−Ｂ−Ｃ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢと少なくとも１つのＣに随意に抱合する。場合によっては、少なくとも１つの追加のＡは第１のＡとは異なる。
場合によっては、２つ以上のＢおよび／または２つ以上のＣは第１のＡに抱合する。いくつかの例では、２つ以上のＢは、第１のＡに末端（例えば、５’末端あるいは３’末端）で抱合するか、あるいは内部部位を介して第１のＡに抱合する。いくつかの例では、２つ以上のＣは、第１のＡに直接、あるいは２つ以上のＢによって間接的に抱合する。２つ以上のＢによって間接的に抱合する場合、２つ以上のＣは、Ｂ上の第１のＡと同じ末端で、第１のＡから対向する末端で、あるいは、内部部位で独立して抱合する。いくつかの例では、少なくとも１つの追加のＡはさらに、第１のＡに、２つ以上のＢに、あるいは２つ以上のＣに抱合する。さらなる例では、少なくとも１つのＤは随意に、第１のＡに、２つ以上のＢに、あるいは２つ以上のＣに、直接あるいは間接的に抱合する。間接的に第１のＡに抱合する場合、少なくとも１つのＤは２つ以上のＢを介して、２つ以上のＣを介して、Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄタイプの抱合体を形成するためのＢ−Ｃ配向を介して、あるいはＡ−Ｃ−Ｂ−Ｄタイプの抱合体を形成するためのＣ−Ｂ配向を介して、第１のＡに抱合する。場合によっては、少なくとも１つの追加のＡは第１のＡとは異なる。場合によっては、２つ以上のＢが異なる。他の場合には、２つ以上のＢは同じである。いくつかの例では、２つ以上のＣが異なる。他の例では、２つ以上のＣが同じである。さらなる例では、２つ以上のＤが異なる。さらなる例では、２つ以上のＤが同じである。
他の例では、２つ以上のＢおよび／または２つ以上のＤ、随意に２つ以上のＣは、第１のＡに抱合する。いくつかの例では、２つ以上のＢは、第１のＡに末端（例えば、５’末端あるいは３’末端）で抱合するか、あるいは内部部位を介して第１のＡに抱合する。いくつかの例では、２つ以上のＤは、第１のＡに直接、あるいは２つ以上のＢによって間接的に抱合する。２つ以上のＢによって間接的に抱合する場合、２つ以上のＤは、Ｂ上の第１のＡと同じ末端で、第１のＡから対向する末端で、あるいは、内部部位で独立して抱合する。いくつかの例では、少なくとも１つの追加のＡはさらに、第１のＡに、２つ以上のＢに、あるいは２つ以上のＤに抱合する。さらなる例では、２つ以上のＣは随意に、第１のＡに、２つ以上のＢに、あるいは２つ以上のＤに、直接あるいは間接的に抱合する。場合によっては、少なくとも１つの追加のＡは第１のＡとは異なる。場合によっては、２つ以上のＢが異なる。他の場合には、２つ以上のＢは同じである。いくつかの例では、２つ以上のＣが異なる。他の例では、２つ以上のＣが同じである。さらなる例では、２つ以上のＤが異なる。さらなる例では、２つ以上のＤが同じである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される分子（例えば、治療用分子）は式（ＩＩ）に係る分子を含み、
式中、
Ａは結合部分であり、
Ｂはポリヌクレオチドであり、
Ｃはポリマーであり、
Ｘは単結合または第１のリンカーであり、
Ｙは単結合または第２のリンカーであり、
Ｌは単結合または第３のリンカーであり、
Ｄはエンドソーム溶解性部分であり、および、
ｃは０から１までの整数であり、および、
ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆位脱塩基部分を含み、および、Ｄは、Ａ、Ｂ、あるいはＣのいかなる場所にも抱合する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される分子（例えば、治療用分子）は式（ＩＩＩ）に係る分子を含み、
式中、
Ａは結合部分であり、
Ｂはポリヌクレオチドであり、
Ｃはポリマーであり、
Ｄはエンドソーム溶解性部分であり、
Ｘは単結合または第１のリンカーであり、
Ｙは単結合または第２のリンカーであり、
Ｌは単結合または第３のリンカーであり、
ａとｂは独立して１から３までの整数であり、
ｃは０から３までの整数であり、および、
ｎは０から１０までの整数であり、および、
ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆位脱塩基部分を含み、Ａは、Ｂ、Ｃ、あるいはＤ上のいかなる場所でも抱合し、Ｂは、Ａ、Ｃ、あるいはＤ上のいかなる場所でも抱合し、Ｃは、Ａ、Ｂ、あるいはＤ上のいかなる場所でも抱合し、および、Ｄは、Ａ、Ｂ、あるいはＣ上のいかなる場所でも抱合する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される分子（例えば、治療用分子）は式（ＩＩＩａ）：Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｌ−Ｄ−Ｙ−Ｃに係る分子を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される分子（例えば、治療用分子）は式（ＩＩＩｂ）：Ａａ−Ｘ−Ｂｂ−Ｌ−Ｄｎに係る分子を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される分子（例えば、治療用分子）は式（Ｉ∨）に係る分子を含む：
式中、
Ａは結合部分であり、
Ｂはポリヌクレオチドであり、
Ｃはポリマーであり、
Ｄはエンドソーム溶解性部分であり、
Ｘは単結合または第１のリンカーであり、
Ｙは単結合または第２のリンカーであり、
Ｌは単結合または第３のリンカーであり、
ａとｂは独立して１から３までの整数であり、
ｃは０から３までの整数であり、
ｎは０から１０までの整数であり、および、
ｍは１−３までの整数であり、および、
ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆位脱塩基部分を含み、Ｃは、ＢあるいはＤ上のいかなる場所でも抱合し、および、Ｄは、ＢあるいはＣ上のいかなる場所でも抱合する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される分子（例えば、治療用分子）は式（Ｉ∨ａ）：Ａ−Ｘ（Ｂｂ−Ｌ−Ｄｎ−Ｙ−Ｃｃ）ｍに係る分子を含む。
ある実施形態では、本明細書に記載される分子（例えば治療用分子）は図１で示されるような分子である。いくつかの例では、本明細書に記載される分子（例えば治療用分子）は図１Ａで例証されるような分子である。場合によっては、本明細書に記載される分子（例えば治療用分子）は図１Ｂで例証されるような分子である。さらなる例では、本明細書に記載される分子（例えば治療用分子）は図１Ｃで例証されるような分子である。
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
いくつかの実施形態では、分子（例えば、治療用分子）は例証されるような分子である：
上に例証されるような
は、単なる表示目的に過ぎず、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいはラクダ科抗体またはその結合フラグメントを包含する。
ポリ核酸分子標的
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは、癌遺伝子上の標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子（あるいはポリヌクレオチド）である。いくつかの例では、癌遺伝子は、いくつかのカテゴリー：成長因子または分裂促進因子、受容体チロシンキナーゼ、細胞質チロシンキナーゼ、細胞質セリン／トレオニンキナーゼ、制御性ＧＴＰアーゼ、および転写因子にさらに分類される。典型的な成長因子はｃ−Ｓｉｓを含んでいる。典型的な受容体チロシンキナーゼは表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、およびＨＥＲ２／ｎｅｕを含んでいる。典型的な細胞質チロシンキナーゼは、Ｓｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼ、チロシンキナーゼのＳｙｋ−ＺＡＰ−７０ファミリー、チロシンキナーゼのＢＴＫファミリー、およびＣＭＬのエブル遺伝子を含んでいる。典型的な細胞質セリン／トレオニンキナーゼは、Ｒａｆキナーゼとサイクリン依存性キナーゼを含んでいる。典型的な制御性ＧＴＰアーゼは、ＫＲＡＳなどのタンパク質のＲａｓファミリーを含む。典型的な転写因子はＭＹＣ遺伝子を含んでいる。いくつかの例では、本明細書に記載される癌遺伝子は、成長因子または分裂促進因子から選択された癌遺伝子、受容体チロシンキナーゼ、細胞質チロシンキナーゼ、細胞質セリン／トレオニンキナーゼ、制御性ＧＴＰアーゼ、あるいは転写因子を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、成長因子または分裂促進因子から選ばれた癌遺伝子、受容体チロシンキナーゼ、細胞質のチロシンキナーゼ、細胞質のセリン／トレオニンキナーゼ、制御性のＧＴＰアーゼあるいは転写因子の標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される癌遺伝子は、Ａｂｌ、ＡＫＴ−２、ＡＬＫ、ＡＭＬ１（またはＲＵＮＸ１）、ＡＲ、ＡＸＬ、ＢＣＬ−２，３，６、ＢＲＡＦ、ｃ−ＭＹＣ、ＥＧＦＲ、ＥｒＢｂ−２（Ｈｅｒ２、Ｎｅｕ）、Ｆｍｓ、ＦＯＳ、ＧＬＩ１、ＨＰＲＴ１、ＩＬ−３、ＩＮＴＳ２、ＪＵＮ、ＫＩＴ、ＫＳ３、Ｋ−ｓａｍ、ＬＢＣ（ＡＫＡＰ１３）、ＬＣＫ、ＬＭＯ１、ＬＭＯ２、ＬＹＬ１、ＭＡＳ１、ＭＤＭ２、ＭＥＴ、ＭＬＬ（ＫＭＴ２Ａ）、ＭＯＳ、ＭＹＢ、ＭＹＨ１１／ＣＢＦＢ、ＮＯＴＣＨ１（ＴＡＮ１）、ＮＴＲＫ１（ＴＲＫ）、ＯＳＴ（ＳＬＣ５１Ｂ）、ＰＡＸ５、ＰＩＭ１、ＰＲＡＤ−１、ＲＡＦ、ＲＡＲ／ＰＭＬ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＥＬ／ＮＲＧ、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＳＫＩ、ＳＲＣ、ＴＩＡＭ１、またはＴＳＣ２を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、Ａｂｌ、ＡＫＴ−２、ＡＬＫ、ＡＭＬ１（またはＲＵＮＸ１）、ＡＲ、ＡＸＬ、ＢＣＬ−２，３，６、ＢＲＡＦ、ｃ−ＭＹＣ、ＥＧＦＲ、ＥｒＢｂ−２（Ｈｅｒ２、Ｎｅｕ）、Ｆｍｓ、ＦＯＳ、ＧＬＩ１、ＨＰＲＴ１、ＩＬ−３、ＩＮＴＳ２、ＪＵＮ、ＫＩＴ、ＫＳ３、Ｋ−ｓａｍ、ＬＢＣ（ＡＫＡＰ１３）、ＬＣＫ、ＬＭＯ１、ＬＭＯ２、ＬＹＬ１、ＭＡＳ１、ＭＤＭ２、ＭＥＴ、ＭＬＬ（ＫＭＴ２Ａ）、ＭＯＳ、ＭＹＢ、ＭＹＨ１１／ＣＢＦＢ、ＮＯＴＣＨ１（ＴＡＮ１）、ＮＴＲＫ１（ＴＲＫ）、ＯＳＴ（ＳＬＣ５１Ｂ）、ＰＡＸ５、ＰＩＭ１、ＰＲＡＤ−１、ＲＡＦ、ＲＡＲ／ＰＭＬ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＥＬ／ＮＲＧ、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＳＫＩ、ＳＲＣ、ＴＩＡＭ１、またはＴＳＣ２の標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される癌遺伝子は、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＡＲ、ＨＰＲＴ１、ＣＮＮＴＢ１（β−カテニン）あるいはβ−カテニン関連遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＡＲ、ＨＰＲＴ１、ＣＮＮＴＢ１（β−カテニン）あるいはβ−カテニン関連遺伝子の標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは、ＫＲＡＳの標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは、ＥＧＦＲの標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは、ＡＲの標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは、ＣＮＮＴＢ１（β−カテニン）の標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは、ＣＮＮＴＢ１（β−カテニン）関連遺伝子の標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子である。いくつかの例において、（β）−カテニン関連遺伝子は、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、およびＭｙｃを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子Ｂは、ＨＰＲＴ１の標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子である。
Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルスの癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）を標的とするポリ核酸分子
Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルスの癌遺伝子ホモログ（ＧＴＰアーゼＫＲａｓ、Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２ Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルスの癌遺伝子ホモログ、あるいはＫＲＡＳとしても知られている）は、細胞分裂の調節に関与する。Ｋ−ＲＡＳタンパク質はＲＡＳスーパーファミリーに属するＧＴＰアーゼである。いくつかの例では、Ｋ−ＲＡＳは、様々な環境上のトリガー（例えば、細胞ストレス、紫外線、熱ショック、あるいはイオン化照射）下での成長停止、アポプトーシス、および複製老化を引き起こすのと同様に、細胞周期進行を調節する。場合によっては、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異が癌の発生にリンクされている一方、野性型ＫＲＡＳ遺伝子は様々なタイプの癌で腫瘍進行中に頻繁に失われることを示された。いくつかの例では、ＫＲＡＳ増幅も、癌の発生に関与してきた（例えば、Ｖａｌｔｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．“ＫＲＡＳ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＥＧＦＲ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １３３：１２５９−１２６６ （２０１３）を参照）。そのような場合、癌は、患者が特定の阻害剤あるいは特定のクラスの阻害剤に対する抵抗性を獲得した難治性癌に関連する。
いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳ遺伝子は野性型であるか、あるいは突然変異を含む。いくつかの例では、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡは野性型であるか、あるいは突然変異を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、野生型のＫＲＡＳ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子である。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、突然変異（例えば、置換、欠失、あるいは追加）を含む、ＫＲＡＳ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子である。
いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳ ＤＮＡまたはＲＮＡは１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳ ＤＮＡまたはＲＮＡは、エキソン１中のコドン１２または１３で１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、ＫＲＡＳ ＤＮＡまたはＲＮＡは、コドン６１、６３、１１７、１１９、あるいは１４６で１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、ＫＲＡＳ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＫＲＡＳポリペプチドのアミノ酸残基１２、１３、１８、１９、２０、２２、２４、２６、３６、５９、６１、６３、６４、６８、１１０、１１６、１１７、１１９、１４６、１４７、１５８、１６４、１７６、またはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＫＲＡＳポリペプチドのＧ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ａ１８Ｄ、Ｌ１９Ｆ、Ｔ２０Ｒ、Ｑ２２Ｋ、Ｉ２４Ｎ、Ｎ２６Ｋ、Ｉ３６Ｌ、Ｉ３６Ｍ、Ａ５９Ｇ、Ａ５９Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｅ６３Ｋ、Ｙ６４Ｄ、Ｙ６４Ｎ、Ｒ６８Ｓ、Ｐ１１０Ｓ、Ｋ１１７Ｎ、Ｃ１１８Ｓ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｖ、Ｋ１４７Ｎ、Ｔ１５８Ａ、Ｒ１６４Ｑ、Ｋ１７６Ｑ、またはこれらの組み合わせから選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、１つ以上の突然変異を含むＫＲＡＳ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、エキソン１中のコドン１２または１３に１つ以上の突然変異を含む、ＫＲＡＳ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、コドン６１、６３、１１７、１１９、あるいは１４６で１つ以上の突然変異を含む、ＫＲＡＳ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、ＫＲＡＳポリペプチドのアミノ酸残基１２、１３、１８、１９、２０、２２、２４、２６、３６、５９、６１、６３、６４、６８、１１０、１１６、１１７、１１９、１４６、１４７、１５８、１６４、１７６、またはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含むＫＲＡＳ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＫＲＡＳポリペプチドのＧ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ａ１８Ｄ、Ｌ１９Ｆ、Ｔ２０Ｒ、Ｑ２２Ｋ、Ｉ２４Ｎ、Ｎ２６Ｋ、Ｉ３６Ｌ、Ｉ３６Ｍ、Ａ５９Ｇ、Ａ５９Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｅ６３Ｋ、Ｙ６４Ｄ、Ｙ６４Ｎ、Ｒ６８Ｓ、Ｐ１１０Ｓ、Ｋ１１７Ｎ、Ｃ１１８Ｓ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｖ、Ｋ１４７Ｎ、Ｔ１５８Ａ、Ｒ１６４Ｑ、Ｋ１７６Ｑ、またはこれらの組み合わせから選択されるアミノ酸残基に対応する１つ以上の突然変異を含むＫＲＡＳ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。
表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とするポリ核酸分子
表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒＢｂ−１、あるいはＨＥＲ１）は、膜貫通性チロシンキナーゼ受容体と、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒＢｂ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒＢｂ−３）、およびＨｅｒ４（ＥｒＢｂ−４）も含む受容体のＥｒｂＢファミリーのメンバーである。いくつかの例では、ＥＧＦＲ突然変異は、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、および／または、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の下流の活性化を駆り立て、これは、有糸分裂、細胞増殖、およびアポプトーシスの抑制を引き起こす。加えて、野生型のＥＧＦＲ遺伝子の増幅は、神経膠芽腫と非小細胞肺癌などの癌の発生に関与している（Ｔａｌａｓｉｌａ，ｅｔ ａｌ．，“ＥＧＦＲ Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｍｏｔｅ Ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，”Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２５（５）：６８３−６９８（２０１３）； Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ−Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩＤＥＡＬ／ＩＮＴＡＣＴ Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ Ｔｒｉａｌｓ，”Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２３（３１）：８０８１−８０９２ （２００５））。
いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、突然変異を含む野性型ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲである。いくつかの例では、ＥＧＦＲは野性型ＥＧＦＲである。いくつかの例では、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは突然変異を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、野生型のＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子である。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、突然変異（例えば、置換、欠失、あるいは追加）を含む、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子である。
いくつかの例では、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、１つ以上のエキソン内に１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、１つ以上のエキソンは、エキソン１８、エキソン１９、エキソン２０、エキソン２１、あるいはエキソン２２を含む。いくつかの例では、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、エキソン１８、エキソン１９、エキソン２０、エキソン２１、エキソン２２、あるいはこれらの組み合わせにおいて１つ以上の突然変異を含む。
いくつかの例では、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＥＧＦＲポリペプチドのアミノ酸残基３４、３８、４５、６２、６３、７７、７８、１０８、１１４、１２０、１４０、１４８、１４９、１６０、１７７、１７８、１８９、１９１、１９８、２２０、２２２、２２３、２２９、２３７、２４０、２４４、２５２、２５４、２５５、２５６、２６３、２７０、２７３、２７６、２８２、２８８、２８９、３０１、３０３、３０４、３０９、３１４、３２６、３３１、３５４、３６３、３７３、３３７、３８０、３８４、３９３、４２７、４２８、４３７、４４１、４４７、４６５、４７５、５１５、５２６、５２７、５３１、５３６、５４１、５４６、５７１、５８８、５８９、５９６、５９６、５９８、６０２、６１４、６２０、６２８、６３６、６４１、６４５、６５１、６７１、６８９、６９４、７００、７０９、７１２、７１４、７１５、７１６、７１９、７２０、７２１、７３１、７３３、７３９−７４４、７４２、７４６−７５０、７４６−７５２、７４６、７４７、７４７−７４９、７４７−７５１、７４７−７５３、７５１、７５２、７５４、７５２−７５９、７５０、７６１−７６２、７６１、７６３、７６５、７６７−７６８、７６７−７６９、７６８、７６９、７６９−７７０、７７０−７７１、７７２、７７３−７７４、７７３、７７４、７７４−７７５、７７６、７７９、７８３、７８４、７８６、７９０、７９２、７９４、７９８、８０３、８０５、８０７、８１０、８２６、８２７、８３１、８３２、８３３、８３５、８３７、８３８、８３９、８４２、８４３、８４７、８５０、８５１、８５３、８５４、８５６、８５８、８６１、８６３、８９４、９１７、９６７、１００６、１０１９、１０４２、１１００、１１２９、１１４１、１１５３、１１６４、１１６７、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＥＧＦＲポリペプチドのアミノ酸残基７４７、７６１、７９０、８５４、８５８、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＥＧＦＲポリペプチドのアミノ酸残基７６１、７９０、８５８、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＥＧＦＲポリペプチドのアミノ酸残基７４７に対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＥＧＦＲポリペプチドのアミノ酸残基７６１に対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＥＧＦＲポリペプチドのアミノ酸残基７９０に対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＥＧＦＲポリペプチドのアミノ酸残基８５４に対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＥＧＦＲポリペプチドのアミノ酸残基８５８に対応する位置で突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＥＧＦＲポリペプチドのＴ３４Ｍ、Ｌ３８Ｖ、Ｅ４５Ｑ、Ｌ６２Ｒ、Ｇ６３Ｒ、Ｇ６３Ｋ、Ｓ７７Ｆ、Ｆ７８Ｌ、Ｒ１０８Ｋ、Ｒ１０８Ｇ、Ｅ１１４Ｋ、Ａ１２０Ｐ、Ｌ１４０Ｖ、Ｖ１４８Ｍ、Ｒ１４９Ｗ、Ｅ１６０Ｋ、Ｓ１７７Ｐ、Ｍ１７８Ｉ、Ｋ１８９Ｔ、Ｄ１９１Ｎ、Ｓ１９８Ｒ、Ｓ２２０Ｐ、Ｒ２２２Ｌ、Ｒ２２２Ｃ、Ｓ２２３Ｙ、Ｓ２２９Ｃ、Ａ２３７Ｙ、Ｃ２４０Ｙ、Ｒ２４４Ｇ、Ｒ２５２Ｃ、Ｒ２５２Ｐ、Ｆ２５４Ｉ、Ｒ２５５（ナンセンス変異）、Ｄ２５６Ｙ、Ｔ２６３Ｐ、Ｙ２７０Ｃ、Ｔ２７３Ａ、Ｑ２７６（ナンセンス）、Ｅ２８２Ｋ、Ｇ２８８（フレームシフト）、Ａ２８９Ｄ、Ａ２８９Ｖ、Ａ２８９Ｔ、Ａ２８９Ｎ、Ａ２８９Ｄ、Ｖ３０１（欠失）、Ｄ３０３Ｈ、Ｈ３０４Ｙ、Ｒ３０９Ｑ、Ｄ３１４Ｎ、Ｃ３２６Ｒ、Ｇ３３１Ｒ、Ｔ３５４Ｍ、Ｔ３６３Ｉ、Ｐ３７３Ｑ、Ｒ３３７Ｓ、Ｓ３８０（フレームシフト）、Ｔ３８４Ｓ、Ｄ３９３Ｙ、Ｒ４２７Ｌ、Ｇ４２８Ｓ、Ｓ４３７Ｙ、Ｖ４４１Ｉ、Ｓ４４７Ｙ、Ｇ４６５Ｒ、Ｉ４７５Ｖ、Ｃ５１５Ｓ、Ｃ５２６Ｓ、Ｒ５２７Ｌ、Ｒ５３１（ナンセンス）、Ｖ５３６Ｍ、Ｌ５４１Ｉ、Ｐ５４６Ｑ、Ｃ５７１Ｓ、Ｇ５８８Ｓ、Ｐ５８９Ｌ、Ｐ５９６Ｌ、Ｐ５９６Ｓ、Ｐ５９６Ｒ、Ｐ５９６Ｌ、Ｇ５９８Ｖ、Ｇ５９８Ａ、Ｅ６０２Ｇ、Ｇ６１４Ｄ、Ｃ６２０Ｙ、Ｃ６２０Ｗ、Ｃ６２８Ｙ、Ｃ６２８Ｆ、Ｃ６３６Ｙ、Ｔ６３８Ｍ、Ｐ６４１Ｈ、Ｓ６４５Ｃ、Ｖ６５１Ｍ、Ｒ６７１Ｃ、Ｖ６８９Ｍ、Ｐ６９４Ｓ、Ｎ７００Ｄ、Ｅ７０９Ａ、Ｅ７０９Ｋ、Ｅ７０９Ｑ、Ｅ７０９Ｋ、Ｆ７１２Ｌ、Ｋ７１４Ｎ、Ｉ７１５Ｓ、Ｋ７１６Ｒ、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１９Ｄ、Ｇ７１９Ｓ、Ｓ７２０Ｃ、Ｓ７２０Ｆ、Ｇ７２１Ｖ、Ｗ７３１Ｓｔｏｐ、Ｐ７３３Ｌ、Ｋ７３９−Ｉ７４４（挿入）、Ｖ７４２Ｉ、Ｖ７４２Ａ、Ｅ７４６−Ａ７５０（欠失）、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｌ７４７−Ｅ７４９（欠失）、Ｌ７４７−Ｔ７５１（欠失）、Ｌ７４７−Ｐ７５３（欠失）、Ｇ７４６−Ｓ７５２（欠失）、Ｔ７５１Ｉ、Ｓ７５２Ｙ、Ｋ７５４（欠失）、Ｓ７５２−Ｉ７５９（欠失）、Ａ７５０Ｐ、Ｄ７６１−Ｅ７６２（例えば、残基ＥＡＦＱ 挿入（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１０））、Ｄ７６１Ｎ、Ｄ７６１Ｙ、Ａ７６３Ｖ、Ｖ７６５Ａ、Ａ７６７−Ｓ７６８（例えば、残基ＴＬＡ 挿入）、Ａ７６７−Ｖ７６９ （例えば、残基ＡＳＶ 挿入）、Ｓ７６８Ｉ、Ｓ７６８Ｔ、Ｖ７６９Ｌ、Ｖ７６９Ｍ、Ｖ７６９−Ｄ７７０（例えば、残基Ｙ 挿入）、７７０−７７１（例えば、残基ＧＬ 挿入）、７７０−７７１（例えば、残基Ｇ 挿入）、７７０−７７１（例えば、残基ＣＶ 挿入）、７７０−７７１（例えば、残基ＳＶＤ 挿入）、Ｐ７７２Ｒ、７７３−７７４（例えば、残基ＮＰＨ 挿入）、Ｈ７７３Ｒ、Ｈ７７３Ｌ、Ｖ７７４Ｍ、７７４−７７５（例えば、残基ＨＶ 挿入）、Ｒ７７６Ｈ、Ｒ７７６Ｃ、Ｇ７７９Ｆ、Ｔ７８３Ａ、Ｔ７８４Ｆ、Ｔ８５４Ａ、Ｖ７８６Ｌ、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ７９２Ｐ、Ｐ７９４Ｈ、Ｌ７９８Ｆ、Ｒ８０３Ｗ、Ｈ８０５Ｒ、Ｄ８０７Ｈ、Ｇ８１０Ｓ、Ｎ８２６Ｓ、Ｙ８２７（ナンセンス）、Ｒ８３１Ｈ、Ｒ８３２Ｃ、Ｒ８３２Ｈ、Ｌ８３３Ｆ、Ｌ８３３Ｖ、Ｈ８３５Ｌ、Ｄ８３７Ｖ、Ｌ８３８Ｍ、Ｌ８３８Ｐ、Ａ８３９Ｖ、Ｎ８４２Ｈ、Ｖ８４３Ｌ、Ｔ８４７Ｋ、Ｔ８４７Ｉ、Ｈ８５０Ｎ、Ｖ８５１Ａ、Ｉ８５３Ｔ、Ｆ８５６Ｌ、Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８５８Ｍ、Ｌ８６１Ｑ、Ｌ８６１Ｒ、Ｇ８６３Ｄ、Ｑ８９４Ｌ、Ｇ９１７Ａ、Ｅ９６７Ａ、Ｄ１００６Ｙ、Ｐ１０１９Ｌ、Ｓ１０４２Ｎ、Ｒ１１００Ｓ、Ｈ１１２９Ｙ、Ｔ１１４１Ｓ、Ｓ１１５３Ｉ、Ｑ１１６４Ｒ、Ｌ１１６７Ｍ、あるいはこれらの組み合わせから選択された１つ以上の突然変異を含む。
いくつかの例において、ポリ核酸分子は、１つ以上の突然変異を含むＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、エキソン１８、エキソン１９、エキソン２０、エキソン２１、エキソン２２、あるいはこれらの組み合わせにおいて１つ以上の突然変異を含む、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＥＧＦＲポリペプチドのアミノ酸残基３４、３８、４５、６２、６３、７７、７８、１０８、１１４、１２０、１４０、１４８、１４９、１６０、１７７、１７８、１８９、１９１、１９８、２２０、２２２、２２３、２２９、２３７、２４０、２４４、２５２、２５４、２５５、２５６、２６３、２７０、２７３、２７６、２８２、２８８、２８９、３０１、３０３、３０４、３０９、３１４、３２６、３３１、３５４、３６３、３７３、３３７、３８０、３８４、３９３、４２７、４２８、４３７、４４１、４４７、４６５、４７５、５１５、５２６、５２７、５３１、５３６、５４１、５４６、５７１、５８８、５８９、５９６、５９６、５９８、６０２、６１４、６２０、６２８、６３６、６４１、６４５、６５１、６７１、６８９、６９４、７００、７０９、７１２、７１４、７１５、７１６、７１９、７２０、７２１、７３１、７３３、７３９−７４４、７４２、７４６−７５０、７４６−７５２、７４６、７４７、７４７−７４９、７４７−７５１、７４７−７５３、７５１、７５２、７５４、７５２−７５９、７５０、７６１−７６２、７６１、７６３、７６５、７６７−７６８、７６７−７６９、７６８、７６９、７６９−７７０、７７０−７７１、７７２、７７３−７７４、７７３、７７４、７７４−７７５、７７６、７７９、７８３、７８４、７８６、７９０、７９２、７９４、７９８、８０３、８０５、８０７、８１０、８２６、８２７、８３１、８３２、８３３、８３５、８３７、８３８、８３９、８４２、８４３、８４７、８５０、８５１、８５３、８５４、８５６、８５８、８６１、８６３、８９４、９１７、９６７、１００６、１０１９、１０４２、１１００、１１２９、１１４１、１１５３、１１６４、１１６７、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含む、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズするいくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＥＧＦＲポリペプチドのアミノ酸残基７４７、７６１、７９０、８５４、８５８、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含むＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＥＧＦＲポリペプチドのアミノ酸残基７６１、７９０、８５８、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含むＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＥＧＦＲポリペプチドのアミノ酸残基７４７に対応する位置で突然変異を含むＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＥＧＦＲポリペプチドのアミノ酸残基７６１に対応する位置で突然変異を含むＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＥＧＦＲポリペプチドのアミノ酸残基７９０に対応する位置で突然変異を含むＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＥＧＦＲポリペプチドのアミノ酸残基８５４に対応する位置で突然変異を含むＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＥＧＦＲポリペプチドのアミノ酸残基８５８に対応する位置で突然変異を含むＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＥＧＦＲポリペプチドのＴ３４Ｍ、Ｌ３８Ｖ、Ｅ４５Ｑ、Ｌ６２Ｒ、Ｇ６３Ｒ、Ｇ６３Ｋ、Ｓ７７Ｆ、Ｆ７８Ｌ、Ｒ１０８Ｋ、Ｒ１０８Ｇ、Ｅ１１４Ｋ、Ａ１２０Ｐ、Ｌ１４０Ｖ、Ｖ１４８Ｍ、Ｒ１４９Ｗ、Ｅ１６０Ｋ、Ｓ１７７Ｐ、Ｍ１７８Ｉ、Ｋ１８９Ｔ、Ｄ１９１Ｎ、Ｓ１９８Ｒ、Ｓ２２０Ｐ、Ｒ２２２Ｌ、Ｒ２２２Ｃ、Ｓ２２３Ｙ、Ｓ２２９Ｃ、Ａ２３７Ｙ、Ｃ２４０Ｙ、Ｒ２４４Ｇ、Ｒ２５２Ｃ、Ｒ２５２Ｐ、Ｆ２５４Ｉ、Ｒ２５５（ナンセンス変異）、Ｄ２５６Ｙ、Ｔ２６３Ｐ、Ｙ２７０Ｃ、Ｔ２７３Ａ、Ｑ２７６（ナンセンス）、Ｅ２８２Ｋ、Ｇ２８８（フレームシフト）、Ａ２８９Ｄ、Ａ２８９Ｖ、Ａ２８９Ｔ、Ａ２８９Ｎ、Ａ２８９Ｄ、Ｖ３０１（欠失）、Ｄ３０３Ｈ、Ｈ３０４Ｙ、Ｒ３０９Ｑ、Ｄ３１４Ｎ、Ｃ３２６Ｒ、Ｇ３３１Ｒ、Ｔ３５４Ｍ、Ｔ３６３Ｉ、Ｐ３７３Ｑ、Ｒ３３７Ｓ、Ｓ３８０（フレームシフト）、Ｔ３８４Ｓ、Ｄ３９３Ｙ、Ｒ４２７Ｌ、Ｇ４２８Ｓ、Ｓ４３７Ｙ、Ｖ４４１Ｉ、Ｓ４４７Ｙ、Ｇ４６５Ｒ、Ｉ４７５Ｖ、Ｃ５１５Ｓ、Ｃ５２６Ｓ、Ｒ５２７Ｌ、Ｒ５３１（ナンセンス）、Ｖ５３６Ｍ、Ｌ５４１Ｉ、Ｐ５４６Ｑ、Ｃ５７１Ｓ、Ｇ５８８Ｓ、Ｐ５８９Ｌ、Ｐ５９６Ｌ、Ｐ５９６Ｓ、Ｐ５９６Ｒ、Ｐ５９６Ｌ、Ｇ５９８Ｖ、Ｇ５９８Ａ、Ｅ６０２Ｇ、Ｇ６１４Ｄ、Ｃ６２０Ｙ、Ｃ６２０Ｗ、Ｃ６２８Ｙ、Ｃ６２８Ｆ、Ｃ６３６Ｙ、Ｔ６３８Ｍ、Ｐ６４１Ｈ、Ｓ６４５Ｃ、Ｖ６５１Ｍ、Ｒ６７１Ｃ、Ｖ６８９Ｍ、Ｐ６９４Ｓ、Ｎ７００Ｄ、Ｅ７０９Ａ、Ｅ７０９Ｋ、Ｅ７０９Ｑ、Ｅ７０９Ｋ、Ｆ７１２Ｌ、Ｋ７１４Ｎ、Ｉ７１５Ｓ、Ｋ７１６Ｒ、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１９Ｄ、Ｇ７１９Ｓ、Ｓ７２０Ｃ、Ｓ７２０Ｆ、Ｇ７２１Ｖ、Ｗ７３１Ｓｔｏｐ、Ｐ７３３Ｌ、Ｋ７３９−Ｉ７４４（挿入）、Ｖ７４２Ｉ、Ｖ７４２Ａ、Ｅ７４６−Ａ７５０（欠失）、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｌ７４７−Ｅ７４９（欠失）、Ｌ７４７−Ｔ７５１（欠失）、Ｌ７４７−Ｐ７５３（欠失）、Ｇ７４６−Ｓ７５２（欠失）、Ｔ７５１Ｉ、Ｓ７５２Ｙ、Ｋ７５４（欠失）、Ｓ７５２−Ｉ７５９（欠失）、Ａ７５０Ｐ、Ｄ７６１−Ｅ７６２（例えば、残基ＥＡＦＱ 挿入（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１０））、Ｄ７６１Ｎ、Ｄ７６１Ｙ、Ａ７６３Ｖ、Ｖ７６５Ａ、Ａ７６７−Ｓ７６８（例えば、残基ＴＬＡ 挿入）、Ａ７６７−Ｖ７６９ （例えば、残基ＡＳＶ 挿入）、Ｓ７６８Ｉ、Ｓ７６８Ｔ、Ｖ７６９Ｌ、Ｖ７６９Ｍ、Ｖ７６９−Ｄ７７０（例えば、残基Ｙ 挿入）、７７０−７７１（例えば、残基ＧＬ 挿入）、７７０−７７１（例えば、残基Ｇ 挿入）、７７０−７７１（例えば、残基ＣＶ 挿入）、７７０−７７１（例えば、残基ＳＶＤ 挿入）、Ｐ７７２Ｒ、７７３−７７４（例えば、残基ＮＰＨ 挿入）、Ｈ７７３Ｒ、Ｈ７７３Ｌ、Ｖ７７４Ｍ、７７４−７７５（例えば、残基ＨＶ 挿入）、Ｒ７７６Ｈ、Ｒ７７６Ｃ、Ｇ７７９Ｆ、Ｔ７８３Ａ、Ｔ７８４Ｆ、Ｔ８５４Ａ、Ｖ７８６Ｌ、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ７９２Ｐ、Ｐ７９４Ｈ、Ｌ７９８Ｆ、Ｒ８０３Ｗ、Ｈ８０５Ｒ、Ｄ８０７Ｈ、Ｇ８１０Ｓ、Ｎ８２６Ｓ、Ｙ８２７（ナンセンス）、Ｒ８３１Ｈ、Ｒ８３２Ｃ、Ｒ８３２Ｈ、Ｌ８３３Ｆ、Ｌ８３３Ｖ、Ｈ８３５Ｌ、Ｄ８３７Ｖ、Ｌ８３８Ｍ、Ｌ８３８Ｐ、Ａ８３９Ｖ、Ｎ８４２Ｈ、Ｖ８４３Ｌ、Ｔ８４７Ｋ、Ｔ８４７Ｉ、Ｈ８５０Ｎ、Ｖ８５１Ａ、Ｉ８５３Ｔ、Ｆ８５６Ｌ、Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８５８Ｍ、Ｌ８６１Ｑ、Ｌ８６１Ｒ、Ｇ８６３Ｄ、Ｑ８９４Ｌ、Ｇ９１７Ａ、Ｅ９６７Ａ、Ｄ１００６Ｙ、Ｐ１０１９Ｌ、Ｓ１０４２Ｎ、Ｒ１１００Ｓ、Ｈ１１２９Ｙ、Ｔ１１４１Ｓ、Ｓ１１５３Ｉ、Ｑ１１６４Ｒ、Ｌ１１６７Ｍ、あるいはこれらの組み合わせから選択された１つ以上の突然変異を含むＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＥＧＦＲポリペプチドのＬ７４７Ｓ、Ｄ７６１Ｙ、Ｔ７９０Ｍ、Ｔ８５４Ａ、Ｌ８５８Ｒ、あるいはこれらの組み合わせから選択された１つ以上の突然変異を含む、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＥＧＦＲポリペプチドのＤ７６１Ｙ、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、あるいはこれらの組み合わせから選択された１つ以上の突然変異を含む、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＥＧＦＲポリペプチドの突然変異Ｌ７４７Ｓを含む、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＥＧＦＲポリペプチドの突然変異Ｌ７６１Ｙを含む、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＥＧＦＲポリペプチドの突然変異Ｌ７９０Ｍを含む、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＥＧＦＲポリペプチドの突然変異Ｔ８５４Ａを含む、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＥＧＦＲポリペプチドの突然変異Ｌ８５８Ｒを含む、ＥＧＦＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。
アンドロゲン受容体（Ａｒ）を標的とするポリ核酸分子
アンドロゲン受容体（ＡＲ）（さらにＮＲ３Ｃ４、核受容体サブファミリー３、群Ｃ、遺伝子４としても知られている）は、関連するメンバー：エストロゲン受容体（ＥＲ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、およびミネラルコルチコイド受容体（ＭＲ）と共に、核受容体スーパーファミリーのステロイドホルモン群に属する。アンドロゲン（すなわちステロイドホルモン）は、アンドロゲン受容体によるタンパク質合成と組織リモデリングを調節する。ＡＲタンパク質は、標的遺伝子発現を調節するリガンド誘導可能なジンクフィンガー転写因子である。ＡＲ遺伝子中の突然変異の存在は、いくつかのタイプの癌（例えば、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、あるいは食道癌）で観察され、いくつかの例では、転移の進行に関連付けられている。
いくつかの実施形態において、ＡＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、野性型であるか、あるいは１つ以上の突然変異および／またはスプライスバリアントを含む。
いくつかの例では、ＡＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、ＡＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、限定されないが、ＡＲ１／２／２ｂ、ＡＲＶ２、ＡＲＶ３、ＡＲＶ４、ＡＲ１／２／３／２ｂ、ＡＲＶ５、ＡＲＶ６、ＡＲＶ７、ＡＲＶ９、ＡＲＶ１０、ＡＲＶ１１、ＡＲＶ１２、ＡＲＶ１３、ＡＲＶ１４、ＡＲＶ１５、ＡＲＶ１６、およびＡＲＶ（ｖ５６７ｅｓ）を含むＡＲスプライスバリアントから選択された１つ以上のスプライスバリアントを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、突然変異（例えば、置換、欠失、あるいは追加）またはスプライスバリアントを含む、ＡＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、ＡＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＡＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、１つ以上のエキソン内に１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、１つ以上のエキソンは、エキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン７、あるいはエキソン８を含む。いくつかの実施形態において、ＡＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、エキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン７、エキソン８、またはこれらの組み合わせ内に１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、ＡＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＡＲポリペプチドのアミノ酸残基２、１４、１６、２９、４５、５４、５７、６４、１０６、１１２、１７６、１８０、１８４、１９４、１９８、２０４、２１４、２２１、２２２、２３３、２４３、２５２、２５５、２６６、２６９、２８７、２８８、３３４、３３５、３４０、３６３、３６８、３６９、３９０、４０３、４４３、４９１、５０５、５１３、５２４、５２４、５２８、５３３、５４７、５４８、５６４、５６７、５６８、５７４、５４７、５５９、５６８、５７１、５７３、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８５、５８６、５８７、５９６、５９７、５９９、６０１、６０４、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１５、６１６、６１７、６１９、６２２、６２９、６３０、６３８、６４５、６４７、６５３、６６２、６６４、６７０、６７１、６７２、６７４、６７７、６８１、６８２、６８３、６８４、６８７、６８８、６８９、６９０、６９５、７００、７０１、７０２、７０３、７０５、７０６、７０７、７０８、７１０、７１１、７１２、７１５、７１７、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７３０、７３２、７３３、７３７、７３９、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７７１、７７２、７７４、７７７、７７９、７８６、７９５、７８０、７８２、７８４、７８７、７８８、７９０、７９１、７９３、７９４、７９８、８０２、８０３、８０４、８０６、８０７、８１２、８１３、８１４、８１９、８２０、８２１、８２４、８２７、８２８、８３０、８３１、８３４、８４０、８４１、８４２、８４６、８５４、８５５、８５６、８６３、８６４、８６６、８６９、８７０、８７１、８７４、８７５、８７７、８７９、８８０、８８１、８８６、８８８、８８９、８９１、８９２、８９５、８９６、８９７、８９８、９０２、９０３、９０４、９０７、９０９、９１０、９１１、９１３、９１６、９１９、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＡＲ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＡＲポリペプチドのＥ２Ｋ、Ｐ１４Ｑ、Ｋ１６Ｎ、Ｖ２９Ｍ、Ｓ４５Ｔ、Ｌ５４Ｓ、Ｌ５７Ｑ、Ｑ６４Ｒ、Ｙ１０６Ｃ、Ｑ１１２Ｈ、Ｓ１７６Ｓ、Ｋ１８０Ｒ、Ｌ１８４Ｐ、Ｑ１９４Ｒ、Ｅ１９８Ｇ、Ｇ２０４Ｓ、Ｇ２１４Ｒ、Ｋ２２１Ｎ、Ｎ２２２Ｄ、Ｄ２３３Ｋ、Ｓ２４３Ｌ、Ａ２５２Ｖ、Ｌ２５５Ｐ、Ｍ２６６Ｔ、Ｐ２６９Ｓ、Ａ２８７Ｄ、Ｅ２８８Ｋ、Ｓ３３４Ｐ、Ｓ３３５Ｔ、Ｐ３４０Ｌ、Ｙ３６３Ｎ、Ｌ３６８Ｖ、Ａ３６９Ｐ、Ｐ３９０Ｒ、Ｐ３９０Ｓ、Ｐ３９０Ｌ、Ａ４０３Ｖ、Ｑ４４３Ｒ、Ｇ４９１Ｓ、Ｇ５０５Ｄ、Ｐ５１３Ｓ、Ｇ５２４Ｄ、Ｇ５２４Ｓ、Ｄ５２８Ｇ、Ｐ５３３Ｓ、Ｌ５４７Ｆ、Ｐ５４８Ｓ、Ｄ５６４Ｙ、Ｓ５６７Ｆ、Ｇ５６８Ｗ、Ｌ５７４Ｐ、Ｌ５４７Ｆ、Ｃ５５９Ｙ、Ｇ５６８Ｗ、Ｇ５６８Ｖ、Ｙ５７１Ｃ、Ｙ５７１Ｈ、Ａ５７３Ｄ、Ｔ５７５Ａ、Ｃ５７６Ｒ、Ｃ５７６Ｆ、Ｇ５７７Ｒ、Ｓ５７８Ｔ、Ｃ５７９Ｙ、Ｃ５７９Ｆ、Ｋ５８０Ｒ、Ｖ５８１Ｆ、Ｆ５８２Ｙ、Ｆ５８２Ｓ、Ｒ５８５Ｋ、Ａ５８６Ｖ、Ａ５８７Ｓ、Ａ５９６Ｔ、Ａ５９６Ｓ、Ｓ５９７Ｇ、Ｓ５９７Ｉ、Ｎ５９９Ｙ、Ｃ６０１Ｆ、Ｄ６０４Ｙ、Ｒ６０７Ｑ、Ｒ６０８Ｋ、Ｋ６０９Ｎ、Ｄ６１０Ｔ、Ｃ６１１Ｙ、Ｒ６１５Ｈ、Ｒ６１５Ｐ、Ｒ６１５Ｇ、Ｒ６１６Ｃ、Ｌ６１６Ｒ、Ｌ６１６Ｐ、Ｒ６１７Ｐ、Ｃ６１９Ｙ、Ａ６２２Ｖ、Ｒ６２９Ｗ、Ｒ６２９Ｑ、Ｋ６３０Ｔ、Ｌ６３８Ｍ、Ａ６４５Ｄ、Ｓ６４７Ｎ、Ｅ６５３Ｋ、Ｓ６６２（ナンセンス）、Ｉ６６４Ｎ、Ｑ６７０Ｌ、Ｑ６７０Ｒ、Ｐ６７１Ｈ、Ｉ６７２Ｔ、Ｌ６７４Ｐ、Ｌ６７７Ｐ、Ｅ６８１Ｌ、Ｐ６８２Ｔ、Ｇ６８３Ａ、Ｖ６８４Ｉ、Ｖ６８４Ａ、Ａ６８７Ｖ、Ｇ６８８Ｑ、Ｈ６８９Ｐ、Ｄ６９０Ｖ、Ｄ６９５Ｎ、Ｄ６９５Ｖ、Ｄ６９５Ｈ、Ｌ７００Ｍ、Ｌ７０１Ｐ、Ｌ７０１Ｉ、Ｈ７０１Ｈ、Ｓ７０２Ａ、Ｓ７０３Ｇ、Ｎ７０５Ｓ、Ｎ７０５Ｙ、Ｅ７０６（ナンセンス）、Ｌ７０７Ｒ、Ｇ７０８Ａ、Ｒ７１０Ｔ、Ｑ７１１Ｅ、Ｌ７１２Ｆ、Ｖ７１５Ｍ、Ｋ７１７Ｑ、Ｋ７２０Ｅ、Ａ７２１Ｔ、Ｌ７２２Ｆ、Ｐ７２３Ｓ、Ｇ７２４Ｓ、Ｇ７２４Ｄ、Ｇ７２４Ｎ、Ｆ７２５Ｌ、Ｒ７２６Ｌ、Ｎ７２７Ｋ、Ｌ７２８Ｓ、Ｌ７２８Ｉ、Ｖ７３０Ｍ、Ｄ７３２Ｎ、Ｄ７３２Ｙ、Ｄ７３２Ｅ、Ｑ７３３Ｈ、Ｉ７３７Ｔ、Ｙ７３９Ｄ、Ｗ７４１Ｒ、Ｍ７４２Ｖ、Ｍ７４２Ｉ、Ｇ７４３Ｒ、Ｇ７４３Ｖ、Ｌ７４４Ｆ、Ｍ７４５Ｔ、Ｖ７４６Ｍ、Ａ７４８Ｄ、Ａ７４８Ｖ、Ａ７４８Ｔ、Ｍ７４９Ｖ、Ｍ７４９Ｉ、Ｇ７５０Ｓ、Ｇ７５０Ｄ、Ｗ７５１Ｒ、Ｒ７５２Ｑ、Ｆ７５４Ｖ、Ｆ７５４Ｌ、Ｔ７５５Ａ、Ｎ７５６Ｓ、Ｎ７５６Ｄ、Ｖ７５７Ａ、Ｎ７５８Ｔ、Ｓ７５９Ｆ、Ｓ７５９Ｐ、Ｌ７６２Ｆ、Ｙ７６３Ｈ、Ｙ７６３Ｃ、Ｆ７６４Ｌ、Ａ７６５Ｔ、Ａ７６５Ｖ、Ｐ７６６Ａ、Ｐ７６６Ｓ、Ｄ７６７Ｅ、Ｌ７６８Ｐ、Ｌ７６８Ｍ、Ｎ７７１Ｈ、Ｅ７７２Ｇ、Ｅ７７２Ａ、Ｒ７７４Ｈ、Ｒ７７４Ｃ、Ｋ７７７Ｔ、Ｒ７７９Ｗ、Ｒ７８６Ｑ、Ｇ７９５Ｖ、Ｍ７８０Ｉ、Ｓ７８２Ｎ、Ｃ７８４Ｙ、Ｍ７８７Ｖ、Ｒ７８８Ｓ、Ｌ７９０Ｆ、Ｓ７９１Ｐ、Ｅ７９３Ｄ、Ｆ７９４Ｓ、Ｑ７９８Ｅ、Ｑ８０２Ｒ、Ｇ８０３Ｌ、Ｆ８０４Ｌ、Ｃ８０６Ｙ、Ｍ８０７Ｖ、Ｍ８０７Ｒ、Ｍ８０７Ｉ、Ｌ８１２Ｐ、Ｆ８１３Ｖ、Ｓ８１４Ｎ、Ｎ８１９Ｑ、Ｇ８２０Ａ、Ｌ８２１Ｖ、Ｑ８２４Ｌ、Ｑ８２４Ｒ、Ｆ８２７Ｌ、Ｆ８２７Ｖ、Ｄ８２８Ｈ、Ｌ８３０Ｖ、Ｌ８３０Ｐ、Ｒ８３１Ｑ、Ｒ８３１Ｌ、Ｙ８３４Ｃ、Ｒ８４０Ｃ、Ｒ８４０Ｈ、Ｉ８４１Ｓ、Ｉ８４２Ｔ、Ｒ８４６Ｇ、Ｒ８５４Ｋ、Ｒ８５５Ｃ、Ｒ８５５Ｈ、Ｆ８５６Ｌ、Ｌ８６３Ｒ、Ｄ８６４Ｎ、Ｄ８６４Ｅ、Ｄ８６４Ｇ、Ｖ８６６Ｌ、Ｖ８６６Ｍ、Ｖ８６６Ｅ、Ｉ８６９Ｍ、Ａ８７０Ｇ、Ａ８７０Ｖ、Ｒ８７１Ｇ、Ｈ８７４Ｙ、Ｈ８７４Ｒ、Ｑ８７５Ｋ、Ｔ８７７Ｓ、Ｔ８７７Ａ、Ｄ８７９Ｔ、Ｄ８７９Ｇ、Ｌ８８０Ｑ、Ｌ８８１Ｖ、Ｍ８８６Ｖ、Ｓ８８８Ｌ、Ｖ８８９Ｍ、Ｆ８９１Ｌ、Ｐ８９２Ｌ、Ｍ８９５Ｔ、Ａ８９６Ｔ、Ｅ８９７Ｄ、Ｉ８９８Ｔ、Ｑ９０２Ｒ、Ｖ９０３Ｍ、Ｐ９０４Ｓ、Ｐ９０４Ｈ、Ｌ９０７Ｆ、Ｇ９０９Ｒ、Ｇ９０９Ｅ、Ｋ９１０Ｒ、Ｖ９１１Ｌ、Ｐ９１３Ｓ、Ｆ９１６Ｌ、Ｑ９１９Ｒ、あるいはこれらの組み合わせから選択されたアミノ酸残基に対応する位置で１つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、１つ以上の突然変異を含むＡＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸は、１つ以上のＡＲスプライスバリアントにハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸は、限定されないが、ＡＲ１／２／２ｂ、ＡＲＶ２、ＡＲＶ３、ＡＲＶ４、ＡＲ１／２／３／２ｂ、ＡＲＶ５、ＡＲＶ６、ＡＲＶ７、ＡＲＶ９、ＡＲＶ１０、ＡＲＶ１１、ＡＲＶ１２、ＡＲＶ１３、ＡＲＶ１４、ＡＲＶ１５、ＡＲＶ１６、およびＡＲＶ（ｖ５６７ｅｓ）を含む１つ以上のＡＲスプライスバリアントを含むＡＲ ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸は、エキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン７、エキソン８、またはこれらの組み合わせ内に１つ以上の突然変異を含むＡＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＡＲポリペプチドのアミノ酸残基２、１４、１６、２９、４５、５４、５７、６４、１０６、１１２、１７６、１８０、１８４、１９４、１９８、２０４、２１４、２２１、２２２、２３３、２４３、２５２、２５５、２６６、２６９、２８７、２８８、３３４、３３５、３４０、３６３、３６８、３６９、３９０、４０３、４４３、４９１、５０５、５１３、５２４、５２４、５２８、５３３、５４７、５４８、５６４、５６７、５６８、５７４、５４７、５５９、５６８、５７１、５７３、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８５、５８６、５８７、５９６、５９７、５９９、６０１、６０４、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１５、６１６、６１７、６１９、６２２、６２９、６３０、６３８、６４５、６４７、６５３、６６２、６６４、６７０、６７１、６７２、６７４、６７７、６８１、６８２、６８３、６８４、６８７、６８８、６８９、６９０、６９５、７００、７０１、７０２、７０３、７０５、７０６、７０７、７０８、７１０、７１１、７１２、７１５、７１７、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７３０、７３２、７３３、７３７、７３９、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７７１、７７２、７７４、７７７、７７９、７８６、７９５、７８０、７８２、７８４、７８７、７８８、７９０、７９１、７９３、７９４、７９８、８０２、８０３、８０４、８０６、８０７、８１２、８１３、８１４、８１９、８２０、８２１、８２４、８２７、８２８、８３０、８３１、８３４、８４０、８４１、８４２、８４６、８５４、８５５、８５６、８６３、８６４、８６６、８６９、８７０、８７１、８７４、８７５、８７７、８７９、８８０、８８１、８８６、８８８、８８９、８９１、８９２、８９５、８９６、８９７、８９８、９０２、９０３、９０４、９０７、９０９、９１０、９１１、９１３、９１６、９１９、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含む、ＡＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＡＲポリペプチドのＥ２Ｋ、Ｐ１４Ｑ、Ｋ１６Ｎ、Ｖ２９Ｍ、Ｓ４５Ｔ、Ｌ５４Ｓ、Ｌ５７Ｑ、Ｑ６４Ｒ、Ｙ１０６Ｃ、Ｑ１１２Ｈ、Ｓ１７６Ｓ、Ｋ１８０Ｒ、Ｌ１８４Ｐ、Ｑ１９４Ｒ、Ｅ１９８Ｇ、Ｇ２０４Ｓ、Ｇ２１４Ｒ、Ｋ２２１Ｎ、Ｎ２２２Ｄ、Ｄ２３３Ｋ、Ｓ２４３Ｌ、Ａ２５２Ｖ、Ｌ２５５Ｐ、Ｍ２６６Ｔ、Ｐ２６９Ｓ、Ａ２８７Ｄ、Ｅ２８８Ｋ、Ｓ３３４Ｐ、Ｓ３３５Ｔ、Ｐ３４０Ｌ、Ｙ３６３Ｎ、Ｌ３６８Ｖ、Ａ３６９Ｐ、Ｐ３９０Ｒ、Ｐ３９０Ｓ、Ｐ３９０Ｌ、Ａ４０３Ｖ、Ｑ４４３Ｒ、Ｇ４９１Ｓ、Ｇ５０５Ｄ、Ｐ５１３Ｓ、Ｇ５２４Ｄ、Ｇ５２４Ｓ、Ｄ５２８Ｇ、Ｐ５３３Ｓ、Ｌ５４７Ｆ、Ｐ５４８Ｓ、Ｄ５６４Ｙ、Ｓ５６７Ｆ、Ｇ５６８Ｗ、Ｌ５７４Ｐ、Ｌ５４７Ｆ、Ｃ５５９Ｙ、Ｇ５６８Ｗ、Ｇ５６８Ｖ、Ｙ５７１Ｃ、Ｙ５７１Ｈ、Ａ５７３Ｄ、Ｔ５７５Ａ、Ｃ５７６Ｒ、Ｃ５７６Ｆ、Ｇ５７７Ｒ、Ｓ５７８Ｔ、Ｃ５７９Ｙ、Ｃ５７９Ｆ、Ｋ５８０Ｒ、Ｖ５８１Ｆ、Ｆ５８２Ｙ、Ｆ５８２Ｓ、Ｒ５８５Ｋ、Ａ５８６Ｖ、Ａ５８７Ｓ、Ａ５９６Ｔ、Ａ５９６Ｓ、Ｓ５９７Ｇ、Ｓ５９７Ｉ、Ｎ５９９Ｙ、Ｃ６０１Ｆ、Ｄ６０４Ｙ、Ｒ６０７Ｑ、Ｒ６０８Ｋ、Ｋ６０９Ｎ、Ｄ６１０Ｔ、Ｃ６１１Ｙ、Ｒ６１５Ｈ、Ｒ６１５Ｐ、Ｒ６１５Ｇ、Ｒ６１６Ｃ、Ｌ６１６Ｒ、Ｌ６１６Ｐ、Ｒ６１７Ｐ、Ｃ６１９Ｙ、Ａ６２２Ｖ、Ｒ６２９Ｗ、Ｒ６２９Ｑ、Ｋ６３０Ｔ、Ｌ６３８Ｍ、Ａ６４５Ｄ、Ｓ６４７Ｎ、Ｅ６５３Ｋ、Ｓ６６２（ナンセンス）、Ｉ６６４Ｎ、Ｑ６７０Ｌ、Ｑ６７０Ｒ、Ｐ６７１Ｈ、Ｉ６７２Ｔ、Ｌ６７４Ｐ、Ｌ６７７Ｐ、Ｅ６８１Ｌ、Ｐ６８２Ｔ、Ｇ６８３Ａ、Ｖ６８４Ｉ、Ｖ６８４Ａ、Ａ６８７Ｖ、Ｇ６８８Ｑ、Ｈ６８９Ｐ、Ｄ６９０Ｖ、Ｄ６９５Ｎ、Ｄ６９５Ｖ、Ｄ６９５Ｈ、Ｌ７００Ｍ、Ｌ７０１Ｐ、Ｌ７０１Ｉ、Ｈ７０１Ｈ、Ｓ７０２Ａ、Ｓ７０３Ｇ、Ｎ７０５Ｓ、Ｎ７０５Ｙ、Ｅ７０６（ナンセンス）、Ｌ７０７Ｒ、Ｇ７０８Ａ、Ｒ７１０Ｔ、Ｑ７１１Ｅ、Ｌ７１２Ｆ、Ｖ７１５Ｍ、Ｋ７１７Ｑ、Ｋ７２０Ｅ、Ａ７２１Ｔ、Ｌ７２２Ｆ、Ｐ７２３Ｓ、Ｇ７２４Ｓ、Ｇ７２４Ｄ、Ｇ７２４Ｎ、Ｆ７２５Ｌ、Ｒ７２６Ｌ、Ｎ７２７Ｋ、Ｌ７２８Ｓ、Ｌ７２８Ｉ、Ｖ７３０Ｍ、Ｄ７３２Ｎ、Ｄ７３２Ｙ、Ｄ７３２Ｅ、Ｑ７３３Ｈ、Ｉ７３７Ｔ、Ｙ７３９Ｄ、Ｗ７４１Ｒ、Ｍ７４２Ｖ、Ｍ７４２Ｉ、Ｇ７４３Ｒ、Ｇ７４３Ｖ、Ｌ７４４Ｆ、Ｍ７４５Ｔ、Ｖ７４６Ｍ、Ａ７４８Ｄ、Ａ７４８Ｖ、Ａ７４８Ｔ、Ｍ７４９Ｖ、Ｍ７４９Ｉ、Ｇ７５０Ｓ、Ｇ７５０Ｄ、Ｗ７５１Ｒ、Ｒ７５２Ｑ、Ｆ７５４Ｖ、Ｆ７５４Ｌ、Ｔ７５５Ａ、Ｎ７５６Ｓ、Ｎ７５６Ｄ、Ｖ７５７Ａ、Ｎ７５８Ｔ、Ｓ７５９Ｆ、Ｓ７５９Ｐ、Ｌ７６２Ｆ、Ｙ７６３Ｈ、Ｙ７６３Ｃ、Ｆ７６４Ｌ、Ａ７６５Ｔ、Ａ７６５Ｖ、Ｐ７６６Ａ、Ｐ７６６Ｓ、Ｄ７６７Ｅ、Ｌ７６８Ｐ、Ｌ７６８Ｍ、Ｎ７７１Ｈ、Ｅ７７２Ｇ、Ｅ７７２Ａ、Ｒ７７４Ｈ、Ｒ７７４Ｃ、Ｋ７７７Ｔ、Ｒ７７９Ｗ、Ｒ７８６Ｑ、Ｇ７９５Ｖ、Ｍ７８０Ｉ、Ｓ７８２Ｎ、Ｃ７８４Ｙ、Ｍ７８７Ｖ、Ｒ７８８Ｓ、Ｌ７９０Ｆ、Ｓ７９１Ｐ、Ｅ７９３Ｄ、Ｆ７９４Ｓ、Ｑ７９８Ｅ、Ｑ８０２Ｒ、Ｇ８０３Ｌ、Ｆ８０４Ｌ、Ｃ８０６Ｙ、Ｍ８０７Ｖ、Ｍ８０７Ｒ、Ｍ８０７Ｉ、Ｌ８１２Ｐ、Ｆ８１３Ｖ、Ｓ８１４Ｎ、Ｎ８１９Ｑ、Ｇ８２０Ａ、Ｌ８２１Ｖ、Ｑ８２４Ｌ、Ｑ８２４Ｒ、Ｆ８２７Ｌ、Ｆ８２７Ｖ、Ｄ８２８Ｈ、Ｌ８３０Ｖ、Ｌ８３０Ｐ、Ｒ８３１Ｑ、Ｒ８３１Ｌ、Ｙ８３４Ｃ、Ｒ８４０Ｃ、Ｒ８４０Ｈ、Ｉ８４１Ｓ、Ｉ８４２Ｔ、Ｒ８４６Ｇ、Ｒ８５４Ｋ、Ｒ８５５Ｃ、Ｒ８５５Ｈ、Ｆ８５６Ｌ、Ｌ８６３Ｒ、Ｄ８６４Ｎ、Ｄ８６４Ｅ、Ｄ８６４Ｇ、Ｖ８６６Ｌ、Ｖ８６６Ｍ、Ｖ８６６Ｅ、Ｉ８６９Ｍ、Ａ８７０Ｇ、Ａ８７０Ｖ、Ｒ８７１Ｇ、Ｈ８７４Ｙ、Ｈ８７４Ｒ、Ｑ８７５Ｋ、Ｔ８７７Ｓ、Ｔ８７７Ａ、Ｄ８７９Ｔ、Ｄ８７９Ｇ、Ｌ８８０Ｑ、Ｌ８８１Ｖ、Ｍ８８６Ｖ、Ｓ８８８Ｌ、Ｖ８８９Ｍ、Ｆ８９１Ｌ、Ｐ８９２Ｌ、Ｍ８９５Ｔ、Ａ８９６Ｔ、Ｅ８９７Ｄ、Ｉ８９８Ｔ、Ｑ９０２Ｒ、Ｖ９０３Ｍ、Ｐ９０４Ｓ、Ｐ９０４Ｈ、Ｌ９０７Ｆ、Ｇ９０９Ｒ、Ｇ９０９Ｅ、Ｋ９１０Ｒ、Ｖ９１１Ｌ、Ｐ９１３Ｓ、Ｆ９１６Ｌ、Ｑ９１９Ｒ、あるいはこれらの組み合わせから選択された１つ以上の突然変異を含む、ＡＲ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。
Β−カテニンとΒ−カテニンに関連する遺伝子を標的とするポリ核酸分子
カテニンベータ−１（ＣＴＮＮＢ１、β−カテニン、あるいはベータ−カテニンとしても知られている）は、カテニンタンパク質ファミリーのメンバーである。ヒトでは、それはＣＴＮＮＢ１遺伝子によってコードされ、その二元機能−細胞間接着と遺伝子転写は知られている。ベータ−カテニンはカドヘリンベースの接着結合の不可欠な構造成分で、細胞間の細胞の成長と接着を調節し、アクチン細胞骨格を固定する。ある例では、ベータ−カテニンは、いったん上皮シートが完了すると、細胞に分割することをやめさせる接触阻害シグナルを送信することに関与する。ベータ−カテニンはＷｎｔシグナル伝達経路の重要な核エフェクターでもある。いくつかの例では、ベータ−カテニンの構造的特性とシグナル伝達特性の不均衡は、疾患や、癌などの悪性腫瘍に関係する無秩序な成長を引き起こす。例えば、ベータ−カテニンの過剰発現は、胃癌などの癌に関連付けられている（Ｓｕｒｉａｎｏ、ｅｔ ａｌ．、“Ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ（ＣＴＮＮＢ１） ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ： ａ ｎｅｗ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ，” Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ４２（３）： ２３８−２４６（２００５））。場合によっては、ＣＴＮＮＢ１遺伝子中の突然変異は、癌の発生（例えば、結腸癌、黒色腫、肝細胞癌、卵巣癌、子宮内膜癌、髄芽腫毛母腫、あるいは前立腺癌）に関連付けられており、いくつかの例では、転移の進行に関連付けられている。さらなる例では、ＣＴＮＮＢ１遺伝子中の突然変異は、外部刺激を与えることなくベータ−カテニンを核へ移動させ、かつ、その標的遺伝子の転写を絶えず駆り立てる。場合によっては、罹患した細胞の以前の上皮の表現型を侵襲性の間葉のような型に変えるベータ−カテニンの可能性が転移形成に寄与する。
いくつかの実施形態において、ＣＴＮＮＢ１遺伝子は、１つ以上の突然変異を含む野性型ＣＴＮＮＢ１あるいはＣＴＮＮＢ１である。いくつかの例では、ＣＴＮＮＢ１は野性型ＣＴＮＮＢ１である。いくつかの例では、ＣＴＮＮＢ１は１つ以上の突然変異を含むＣＴＮＮＢ１である。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、野性型ＣＴＮＮＢ１の標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子である。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、突然変異（例えば置換、欠失、あるいは追加）を含むＣＴＮＮＢ１の標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子である。
いくつかの実施形態において、ＣＴＮＮＢ１ ＤＮＡまたはＲＮＡは１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＣＴＮＮＢ１ ＤＮＡまたはＲＮＡは、１つ以上のエキソン内に１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、１つ以上のエキソンはエキソン３を含む。いくつかの例では、ＣＴＮＮＢ１ ＤＮＡまたはＲＮＡは、コドン３２、３３、３４、３７、４１、４５と１８３、２４５、２８７、あるいはこれらの組み合わせにおいて１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、ＣＴＮＮＢ１ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＣＴＮＮＢ１ポリペプチドのアミノ酸残基２５、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４１、４５、１４０、１６２、１７０、１９９、２１３、２１５、２５７、３０３、３２２、３３４、３５４、３６７、３７３、３８３、３８７、４０２、４２６、４５３、４７４、４８６、５１５、５１７、５３５、５５３、５５５、５８２、５８７、６１９、６２３、６４１、６４６、６８８、７０３、７１０、７１２、７１４、７２４、７３８、７７７、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＣＴＮＮＢ１ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＣＴＮＮＢ１ポリペプチドのＷ２５（ナンセンス変異）、Ｌ３１Ｍ、Ｄ３２Ａ、Ｄ３２Ｎ、Ｄ３２Ｙ、Ｄ３２Ｇ、Ｄ３２Ｈ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ３３Ｙ、Ｓ３３Ｆ、Ｓ３３Ｐ、Ｇ３４Ｒ、Ｇ３４Ｅ、Ｇ３４Ｖ、Ｉ３５Ｓ、Ｈ３６Ｙ、Ｓ３７Ｆ、Ｓ３７Ｐ、Ｓ３７Ｃ、Ｓ３７Ａ、Ｔ４１Ｎ、Ｔ４１Ａ、Ｔ４１Ｉ、Ｓ４５Ｙ、Ｓ４５Ｆ、Ｓ４５Ｃ、Ｉ１４０Ｔ、Ｄ１６２Ｅ、Ｋ１７０Ｍ、Ｖ１９９Ｉ、Ｃ２１３Ｆ、Ａ２１５Ｔ、Ｔ２５７Ｉ、Ｉ３０３Ｍ、Ｑ３２２Ｋ、Ｅ３３４Ｋ、Ｋ３５４Ｔ、Ｇ３６７Ｖ、Ｐ３７３Ｓ、Ｗ３８３Ｇ、Ｎ３８７Ｋ、Ｌ４０２Ｆ、Ｎ４２６Ｄ、Ｒ４５３Ｌ、Ｒ４５３Ｑ、Ｒ４７４（ナンセンス変異）、Ｒ４８６Ｃ、Ｒ５１５Ｑ、Ｌ５１７Ｆ、Ｒ５３５（ナンセンス変異）、Ｒ５３５Ｑ、Ｍ５５３Ｖ、Ｇ５５５Ａ、Ｒ５８２Ｑ、Ｒ５８７Ｑ、Ｃ６１９Ｙ、Ｑ６２３Ｅ、Ｔ６４１ （ｆｒａｍｅ ｓｈｉｆｔ）、Ｓ６４６Ｆ、Ｍ６８８Ｔ、Ｑ７０３Ｈ、Ｒ７１０Ｈ、Ｄ７１２Ｎ、Ｐ７１４Ｒ、Ｙ７２４Ｈ、Ｅ７３８Ｋ、Ｆ７７７Ｓ、あるいはこれらの組み合わせから選択されたアミノ酸残基に対応する位置で１つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、１つ以上の突然変異を含むＣＴＮＮＢ１ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、エキソン３内に１つ以上の突然変異を含む、ＣＴＮＮＢ１ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、コドン３２、３３、３４、３７、４１、４５と１８３、２４５、２８７、あるいはこれらの組み合わせにおいて１つ以上の突然変異を含む、ＣＴＮＮＢ１ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＣＴＮＮＢ１ポリペプチドのアミノ酸残基２５、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４１、４５、１４０、１６２、１７０、１９９、２１３、２１５、２５７、３０３、３２２、３３４、３５４、３６７、３７３、３８３、３８７、４０２、４２６、４５３、４７４、４８６、５１５、５１７、５３５、５５３、５５５、５８２、５８７、６１９、６２３、６４１、６４６、６８８、７０３、７１０、７１２、７１４、７２４、７３８、７７７、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含む、ＣＴＮＮＢ１ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＣＴＮＮＢ１ポリペプチドのＷ２５（ナンセンス変異）、Ｌ３１Ｍ、Ｄ３２Ａ、Ｄ３２Ｎ、Ｄ３２Ｙ、Ｄ３２Ｇ、Ｄ３２Ｈ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ３３Ｙ、Ｓ３３Ｆ、Ｓ３３Ｐ、Ｇ３４Ｒ、Ｇ３４Ｅ、Ｇ３４Ｖ、Ｉ３５Ｓ、Ｈ３６Ｙ、Ｓ３７Ｆ、Ｓ３７Ｐ、Ｓ３７Ｃ、Ｓ３７Ａ、Ｔ４１Ｎ、Ｔ４１Ａ、Ｔ４１Ｉ、Ｓ４５Ｙ、Ｓ４５Ｆ、Ｓ４５Ｃ、Ｉ１４０Ｔ、Ｄ１６２Ｅ、Ｋ１７０Ｍ、Ｖ１９９Ｉ、Ｃ２１３Ｆ、Ａ２１５Ｔ、Ｔ２５７Ｉ、Ｉ３０３Ｍ、Ｑ３２２Ｋ、Ｅ３３４Ｋ、Ｋ３５４Ｔ、Ｇ３６７Ｖ、Ｐ３７３Ｓ、Ｗ３８３Ｇ、Ｎ３８７Ｋ、Ｌ４０２Ｆ、Ｎ４２６Ｄ、Ｒ４５３Ｌ、Ｒ４５３Ｑ、Ｒ４７４（ナンセンス変異）、Ｒ４８６Ｃ、Ｒ５１５Ｑ、Ｌ５１７Ｆ、Ｒ５３５（ナンセンス変異）、Ｒ５３５Ｑ、Ｍ５５３Ｖ、Ｇ５５５Ａ、Ｒ５８２Ｑ、Ｒ５８７Ｑ、Ｃ６１９Ｙ、Ｑ６２３Ｅ、Ｔ６４１ （ｆｒａｍｅ ｓｈｉｆｔ）、Ｓ６４６Ｆ、Ｍ６８８Ｔ、Ｑ７０３Ｈ、Ｒ７１０Ｈ、Ｄ７１２Ｎ、Ｐ７１４Ｒ、Ｙ７２４Ｈ、Ｅ７３８Ｋ、Ｆ７７７Ｓ、あるいはこれらの組み合わせから選択された１つ以上の突然変異を含む、ＣＴＮＮＢ１ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、ベータ−カテニンに関連する遺伝子はさらにＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、およびＭＹＣを含む。いくつかの実施形態において、ベータ−カテニンに関連する遺伝子はさらにＰＩＫ３ＣＡ ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。ＰＩＫ３ＣＡ（ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸３−キナーゼの触媒サブユニットアルファまたはｐ１１０αタンパク質）は、ホスファチジルイノシトールをリン酸化するためにＡＴＰを使用するクラスｉ ＰＩ−３キナーゼ触媒サブユニットである。いくつかの実施形態において、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子は、１つ以上の突然変異を含む野性型ＰＩＫ３ＣＡあるいはＰＩＫ３ＣＡである。いくつかの例では、ＰＩＫ３ＣＡ ＤＮＡまたはＲＮＡは野性型ＰＩＫ３ＣＡである。いくつかの例では、ＰＩＫ３ＣＡ ＤＮＡまたはＲＮＡは１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、野性型ＰＩＫ３ＣＡ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、突然変異（例えば、置換、欠失、あるいは追加）を含む、ＰＩＫ３ＣＡ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、ＰＩＫ３ＣＡ ＤＮＡまたはＲＮＡは１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＰＩＫ３ＣＡ ＤＮＡまたはＲＮＡは、１つ以上のエキソン内に１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、ＰＩＫ３ＣＡ ＤＮＡまたはＲＮＡは、エキソン９および／または２０内に１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、ＰＩＫ３ＣＡ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＰＩＫ３ＣＡポリペプチドのアミノ酸残基１、４、１０−１６、１１−１８、１１、１２、３８、３９、６５、７２、７５、７９、８１、８３、８８、９０、９３、１０２、１０３、１０３−１０４、１０３−１０６、１０４、１０５−１０８、１０６、１０６−１０７、１０６−１０８、１０７、１０８、１０９−１１２、１１０、１１１、１１３、１１５、１３７、１７０、２５８、２７２、２７９、３２０、３２８、３３５、３４２、３４４、３４５、３５０、３５７、３５９、３６３、３６４、３６５、３６６、３７８、３９８、４０１、４１７、４２０、４４７−４５５、４４９、４４９−４５７、４５１、４５３、４５４、４５５、４５５−４６０、４６３−４６５、４７１、４９５、５２２、５３８、５３９、５４２、５４５、５４６、５４７、５７６、６０４、６１４、６１７、６２９、６４３、６６３、６８２、７２５、７２６、７７７、７９１、８１８、８６６、９０１、９０９、９３９、９５１、９５８、９７０、９７１、９７５、９９２、１００４、１００７、１０１６、１０１７、１０２１、１０２５、１０２９、１０３７、１０４０、１０４３、１０４４、１０４５、１０４７、１０４８、１０４９、１０５２、１０６５、１０６９、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＰＩＫ３ＣＡ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＰＩＫ３ＣＡポリペプチドのＭ１Ｖ、Ｒ４（ナンセンス変異）、Ｌ１０−Ｍ１６（欠失）、Ｗ１１−Ｐ１８（欠失）、Ｗ１１Ｌ、Ｇ１２Ｄ、Ｒ３８Ｌ、Ｒ３８Ｈ、Ｒ３８Ｃ、Ｒ３８Ｓ、Ｅ３９Ｋ、Ｅ３９Ｇ、Ｅ６５Ｋ、Ｓ７２Ｇ、Ｑ７５Ｅ、Ｒ７９Ｍ、Ｅ８１Ｋ、Ｅ８１（欠失）、Ｆ８３Ｙ、Ｒ８８Ｑ、Ｃ９０Ｙ、Ｃ９０Ｇ、Ｒ９３Ｑ、Ｒ９３Ｗ、Ｉ１０２（欠失）、Ｅ１０３Ｇ、Ｅ１０３−Ｐ１０４（欠失）、Ｅ１０３−Ｇ１０６（欠失）、Ｐ１０４Ｌ、Ｖ１０５−Ｒ１０８（欠失）、Ｇ１０６Ｖ、Ｇ１０６−Ｎ１０７（欠失）、Ｇ１０６−Ｒ１０８（欠失）、Ｇ１０６Ｒ、Ｎ１０７Ｓ、Ｒ１０８Ｌ、Ｒ１０８Ｈ、Ｅ１０９−Ｉ１１２（欠失）、Ｅ１１０（欠失）、Ｋ１１１Ｅ、Ｋ１１１Ｒ、Ｋ１１１Ｎ、Ｋ１１１（欠失）、Ｌ１１３（欠失）、Ｒ１１５Ｌ、Ｑ１３７Ｌ、Ｎ１７０Ｓ、Ｄ２５８Ｎ、Ｙ２７２（ナンセンス変異）、Ｌ２７９Ｉ、Ｇ３２０Ｖ、Ｗ３２８Ｓ、Ｒ３３５Ｇ、Ｔ３４２Ｓ、Ｖ３４４Ｇ、Ｖ３４４Ｍ、Ｖ３４４Ａ、Ｎ３４５Ｋ、Ｎ３４５Ｉ、Ｎ３４５Ｔ、Ｄ３５０Ｎ、Ｄ３５０Ｇ、Ｒ３５７Ｑ、Ｇ３５９Ｒ、Ｇ３６３Ａ、Ｇ３６４Ｒ、Ｅ３６５Ｋ、Ｅ３６５Ｖ、Ｐ３６６Ｒ、Ｃ３７８Ｒ、Ｃ３７８Ｙ、Ｒ３９８Ｈ、Ｒ４０１Ｑ、Ｅ４１７Ｋ、Ｃ４２０Ｒ、Ｃ４２０Ｇ、Ｐ４４７−Ｌ４５５（欠失）、Ｐ４４９Ｌ、Ｐ４４９−Ｎ４５７（欠失）、Ｇ４５１Ｒ、Ｇ４５１Ｖ、Ｅ４５３Ｋ、Ｅ４５３Ｑ、Ｅ４５３Ｄ、Ｄ４５４Ｙ、Ｌ４５５（フレームシフト挿入）、Ｌ４５５−Ｇ４６０（欠失）、Ｇ４６３−Ｎ４６５（欠失）、Ｐ４７１Ｌ、Ｐ４７１Ａ、Ｈ４９５Ｌ、Ｈ４９５Ｙ、Ｅ５２２Ａ、Ｄ５３８Ｎ、Ｐ５３９Ｒ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４２Ｖ、Ｅ５４２Ｇ、Ｅ５４２Ｑ、Ｅ５４２Ａ、Ｅ５４５Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｑ、Ｅ５４５Ｄ、Ｑ５４６Ｋ、Ｑ５４６Ｒ、Ｑ５４６Ｐ、Ｅ５４７Ｄ、Ｓ５７６Ｙ、Ｃ６０４Ｒ、Ｆ６１４Ｉ、Ａ６１７Ｗ、Ｓ６２９Ｃ、Ｑ６４３Ｈ、Ｉ６６３Ｓ、Ｑ６８２（欠失）、Ｄ７２５Ｎ、Ｗ７２６Ｋ、Ｒ７７７Ｍ、Ｅ７９１Ｑ、Ｒ８１８Ｃ、Ｌ８６６Ｗ、Ｃ９０１Ｆ、Ｆ９０９Ｌ、Ｄ９３９Ｇ、Ｒ９５１Ｃ、Ｑ９５８Ｒ、Ｅ９７０Ｋ、Ｃ９７１Ｒ、Ｒ９７５Ｓ、Ｒ９９２Ｐ、Ｍ１００４Ｉ、Ｇ１００７Ｒ、Ｆ１０１６Ｃ、Ｄ１０１７Ｈ、Ｙ１０２１Ｈ、Ｙ１０２１Ｃ、Ｔ１０２５Ａ、Ｔ１０２５Ｓ、Ｄ１０２９Ｈ、Ｅ１０３７Ｋ、Ｍ１０４０Ｖ、Ｍ１０４３Ｖ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｎ１０４４Ｋ、Ｎ１０４４Ｙ、Ｄ１０４５Ｖ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｙ、Ｈ１０４７Ｑ、Ｈ１０４８Ｒ、Ｇ１０４９Ｒ、Ｔ１０５２Ｋ、Ｈ１０６５Ｌ、１０６９Ｗ（ノンストップ変異）、あるいはこれらの組み合わせから選択されたアミノ酸残基に対応する位置で１つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、１つ以上の突然変異を含むＰＩＫ３ＣＡ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、エキソン内に１つ以上の突然変異を含む、ＰＩＫ３ＣＡ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、エキソン９またはエキソン２０内に１つ以上の突然変異を含む、ＰＩＫ３ＣＡ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＰＩＫ３ＣＡポリペプチドのアミノ酸残基１、４、１０−１６、１１−１８、１１、１２、３８、３９、６５、７２、７５、７９、８１、８３、８８、９０、９３、１０２、１０３、１０３−１０４、１０３−１０６、１０４、１０５−１０８、１０６、１０６−１０７、１０６−１０８、１０７、１０８、１０９−１１２、１１０、１１１、１１３、１１５、１３７、１７０、２５８、２７２、２７９、３２０、３２８、３３５、３４２、３４４、３４５、３５０、３５７、３５９、３６３、３６４、３６５、３６６、３７８、３９８、４０１、４１７、４２０、４４７−４５５、４４９、４４９−４５７、４５１、４５３、４５４、４５５、４５５−４６０、４６３−４６５、４７１、４９５、５２２、５３８、５３９、５４２、５４５、５４６、５４７、５７６、６０４、６１４、６１７、６２９、６４３、６６３、６８２、７２５、７２６、７７７、７９１、８１８、８６６、９０１、９０９、９３９、９５１、９５８、９７０、９７１、９７５、９９２、１００４、１００７、１０１６、１０１７、１０２１、１０２５、１０２９、１０３７、１０４０、１０４３、１０４４、１０４５、１０４７、１０４８、１０４９、１０５２、１０６５、１０６９、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含むＰＩＫ３ＣＡ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＰＩＫ３ＣＢポリペプチドのＭ１Ｖ、Ｒ４（ナンセンス変異）、Ｌ１０−Ｍ１６（欠失）、Ｗ１１−Ｐ１８（欠失）、Ｗ１１Ｌ、Ｇ１２Ｄ、Ｒ３８Ｌ、Ｒ３８Ｈ、Ｒ３８Ｃ、Ｒ３８Ｓ、Ｅ３９Ｋ、Ｅ３９Ｇ、Ｅ６５Ｋ、Ｓ７２Ｇ、Ｑ７５Ｅ、Ｒ７９Ｍ、Ｅ８１Ｋ、Ｅ８１（欠失）、Ｆ８３Ｙ、Ｒ８８Ｑ、Ｃ９０Ｙ、Ｃ９０Ｇ、Ｒ９３Ｑ、Ｒ９３Ｗ、Ｉ１０２（欠失）、Ｅ１０３Ｇ、Ｅ１０３−Ｐ１０４（欠失）、Ｅ１０３−Ｇ１０６（欠失）、Ｐ１０４Ｌ、Ｖ１０５−Ｒ１０８（欠失）、Ｇ１０６Ｖ、Ｇ１０６−Ｎ１０７（欠失）、Ｇ１０６−Ｒ１０８（欠失）、Ｇ１０６Ｒ、Ｎ１０７Ｓ、Ｒ１０８Ｌ、Ｒ１０８Ｈ、Ｅ１０９−Ｉ１１２（欠失）、Ｅ１１０（欠失）、Ｋ１１１Ｅ、Ｋ１１１Ｒ、Ｋ１１１Ｎ、Ｋ１１１（欠失）、Ｌ１１３（欠失）、Ｒ１１５Ｌ、Ｑ１３７Ｌ、Ｎ１７０Ｓ、Ｄ２５８Ｎ、Ｙ２７２（ナンセンス変異）、Ｌ２７９Ｉ、Ｇ３２０Ｖ、Ｗ３２８Ｓ、Ｒ３３５Ｇ、Ｔ３４２Ｓ、Ｖ３４４Ｇ、Ｖ３４４Ｍ、Ｖ３４４Ａ、Ｎ３４５Ｋ、Ｎ３４５Ｉ、Ｎ３４５Ｔ、Ｄ３５０Ｎ、Ｄ３５０Ｇ、Ｒ３５７Ｑ、Ｇ３５９Ｒ、Ｇ３６３Ａ、Ｇ３６４Ｒ、Ｅ３６５Ｋ、Ｅ３６５Ｖ、Ｐ３６６Ｒ、Ｃ３７８Ｒ、Ｃ３７８Ｙ、Ｒ３９８Ｈ、Ｒ４０１Ｑ、Ｅ４１７Ｋ、Ｃ４２０Ｒ、Ｃ４２０Ｇ、Ｐ４４７−Ｌ４５５（欠失）、Ｐ４４９Ｌ、Ｐ４４９−Ｎ４５７（欠失）、Ｇ４５１Ｒ、Ｇ４５１Ｖ、Ｅ４５３Ｋ、Ｅ４５３Ｑ、Ｅ４５３Ｄ、Ｄ４５４Ｙ、Ｌ４５５（フレームシフト挿入）、Ｌ４５５−Ｇ４６０（欠失）、Ｇ４６３−Ｎ４６５（欠失）、Ｐ４７１Ｌ、Ｐ４７１Ａ、Ｈ４９５Ｌ、Ｈ４９５Ｙ、Ｅ５２２Ａ、Ｄ５３８Ｎ、Ｐ５３９Ｒ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４２Ｖ、Ｅ５４２Ｇ、Ｅ５４２Ｑ、Ｅ５４２Ａ、Ｅ５４５Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｑ、Ｅ５４５Ｄ、Ｑ５４６Ｋ、Ｑ５４６Ｒ、Ｑ５４６Ｐ、Ｅ５４７Ｄ、Ｓ５７６Ｙ、Ｃ６０４Ｒ、Ｆ６１４Ｉ、Ａ６１７Ｗ、Ｓ６２９Ｃ、Ｑ６４３Ｈ、Ｉ６６３Ｓ、Ｑ６８２（欠失）、Ｄ７２５Ｎ、Ｗ７２６Ｋ、Ｒ７７７Ｍ、Ｅ７９１Ｑ、Ｒ８１８Ｃ、Ｌ８６６Ｗ、Ｃ９０１Ｆ、Ｆ９０９Ｌ、Ｄ９３９Ｇ、Ｒ９５１Ｃ、Ｑ９５８Ｒ、Ｅ９７０Ｋ、Ｃ９７１Ｒ、Ｒ９７５Ｓ、Ｒ９９２Ｐ、Ｍ１００４Ｉ、Ｇ１００７Ｒ、Ｆ１０１６Ｃ、Ｄ１０１７Ｈ、Ｙ１０２１Ｈ、Ｙ１０２１Ｃ、Ｔ１０２５Ａ、Ｔ１０２５Ｓ、Ｄ１０２９Ｈ、Ｅ１０３７Ｋ、Ｍ１０４０Ｖ、Ｍ１０４３Ｖ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｎ１０４４Ｋ、Ｎ１０４４Ｙ、Ｄ１０４５Ｖ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｙ、Ｈ１０４７Ｑ、Ｈ１０４８Ｒ、Ｇ１０４９Ｒ、Ｔ１０５２Ｋ、Ｈ１０６５Ｌ、１０６９Ｗ（ノンストップ変異）、あるいはこれらの組み合わせから選択されたアミノ酸残基に対応する位置で１つ以上の突然変異を含む、ＰＩＫ３ＣＡ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子である。
いくつかの実施形態において、ベータ−カテニンに関連する遺伝子はさらにＰＩＫ３ＣＢを含む。いくつかの実施形態において、ＰＩＫ３ＣＢ遺伝子は野性型であるか、あるいは１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、ＰＩＫ３ＣＢ ＤＮＡまたはＲＮＡは野性型ＰＩＫ３ＣＢ ＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの例では、ＰＩＫ３ＣＢ ＤＮＡまたはＲＮＡは１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、野性型ＰＩＫ３ＣＢ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、突然変異（例えば、置換、欠失、あるいは追加）を含む、ＰＩＫ３ＣＢ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、ＰＩＫ３ＣＢ ＤＮＡまたはＲＮＡは１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＰＩＫ３ＣＢ ＤＮＡまたはＲＮＡは、１つ以上のエキソン内に１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、ＰＩＫ３ＣＢ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＰＩＫ３ＣＢポリペプチドのアミノ酸残基１８、１９、２１、２８、５０、６１、６８、１０３、１３５、１４０、１６７、２５２、２７０、２９０、３０１、３０４、３２１、３６９、４１７、４４２、４７０、４９７、５０７、５１２、５４０、５５１、５５２、５５４、５６２、５６７、５９３、５９５、６１９、６２８、６６８、７６８、８０５、８２４、８３０、８８７、９６７、９９２、１００５、１０２０、１０３６、１０４６、１０４７、１０４８、１０４９、１０５１、１０５５、１０６７、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＰＩＫ３ＣＢ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ポリペプチドのＷ１８（ナンセンス変異）、Ａ１９Ｖ、Ｄ２１Ｈ、Ｇ２８Ｓ、Ａ５０Ｐ、Ｋ６１Ｔ、Ｍ６８Ｉ、Ｒ１０３Ｋ、Ｈ１３５Ｎ、Ｌ１４０Ｓ、Ｓ１６７Ｃ、Ｇ２５２Ｗ、Ｒ２７０Ｗ、Ｋ２９０Ｎ、Ｅ３０１Ｖ、Ｉ３０４Ｒ、Ｒ３２１Ｑ、Ｖ３６９Ｉ、Ｔ４１７Ｍ、Ｎ４４２Ｋ、Ｅ４７０Ｋ、Ｅ４９７Ｄ、Ｐ５０７Ｓ、Ｉ５１２Ｍ、Ｅ５４０（ナンセンス変異）、Ｃ５５１Ｒ、Ｅ５５２Ｋ、Ｅ５５４Ｋ、Ｒ５６２（ナンセンス変異）、Ｅ５６７Ｄ、Ａ５９３Ｖ、Ｌ５９５Ｐ、Ｖ６１９Ａ、Ｒ６２８（ナンセンス変異）、Ｒ６６８Ｗ、Ｌ７６８Ｆ、Ｋ８０５Ｅ、Ｄ８２４Ｅ、Ａ８３０Ｔ、Ｅ８８７（ナンセンス変異）、Ｖ９６７Ａ、Ｉ９９２Ｔ、Ａ１００５Ｖ、Ｄ１０２０Ｈ、Ｅ１０３６Ｋ、Ｄ１０４６Ｎ、Ｅ１０４７Ｋ、Ａ１０４８Ｖ、Ｌ１０４９Ｒ、Ｅ１０５１Ｋ、Ｔ１０５５Ａ、Ｄ１０６７Ｖ、Ｄ１０６７Ａ、あるいはこれらの組み合わせから選択されたアミノ酸残基に対応する位置で１つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、１つ以上の突然変異を含むＰＩＫ３ＣＢ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、エキソン内に１つ以上の突然変異を含む、ＰＩＫ３ＣＢ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＰＩＫ３ＣＢポリペプチドのアミノ酸残基１８、１９、２１、２８、５０、６１、６８、１０３、１３５、１４０、１６７、２５２、２７０、２９０、３０１、３０４、３２１、３６９、４１７、４４２、４７０、４９７、５０７、５１２、５４０、５５１、５５２、５５４、５６２、５６７、５９３、５９５、６１９、６２８、６６８、７６８、８０５、８２４、８３０、８８７、９６７、９９２、１００５、１０２０、１０３６、１０４６、１０４７、１０４８、１０４９、１０５１、１０５５、１０６７、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含む、ＰＩＫ３ＣＢ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＰＩＫ３ＣＢポリペプチドのＷ１８（ナンセンス変異）、Ａ１９Ｖ、Ｄ２１Ｈ、Ｇ２８Ｓ、Ａ５０Ｐ、Ｋ６１Ｔ、Ｍ６８Ｉ、Ｒ１０３Ｋ、Ｈ１３５Ｎ、Ｌ１４０Ｓ、Ｓ１６７Ｃ、Ｇ２５２Ｗ、Ｒ２７０Ｗ、Ｋ２９０Ｎ、Ｅ３０１Ｖ、Ｉ３０４Ｒ、Ｒ３２１Ｑ、Ｖ３６９Ｉ、Ｔ４１７Ｍ、Ｎ４４２Ｋ、Ｅ４７０Ｋ、Ｅ４９７Ｄ、Ｐ５０７Ｓ、Ｉ５１２Ｍ、Ｅ５４０（ナンセンス変異）、Ｃ５５１Ｒ、Ｅ５５２Ｋ、Ｅ５５４Ｋ、Ｒ５６２（ナンセンス変異）、Ｅ５６７Ｄ、Ａ５９３Ｖ、Ｌ５９５Ｐ、Ｖ６１９Ａ、Ｒ６２８（ナンセンス変異）、Ｒ６６８Ｗ、Ｌ７６８Ｆ、Ｋ８０５Ｅ、Ｄ８２４Ｅ、Ａ８３０Ｔ、Ｅ８８７（ナンセンス変異）、Ｖ９６７Ａ、Ｉ９９２Ｔ、Ａ１００５Ｖ、Ｄ１０２０Ｈ、Ｅ１０３６Ｋ、Ｄ１０４６Ｎ、Ｅ１０４７Ｋ、Ａ１０４８Ｖ、Ｌ１０４９Ｒ、Ｅ１０５１Ｋ、Ｔ１０５５Ａ、Ｄ１０６７Ｖ、Ｄ１０６７Ａ、あるいはこれらの組み合わせから選択されたアミノ酸残基に対応する位置で１つ以上の突然変異を含む、ＰＩＫ３ＣＢ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、ベータ−カテニンに関連する遺伝子はさらにＭＹＣを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＣ遺伝子は野性型ＭＹＣであるか、あるいは１つ以上の突然変異を含むＭＹＣである。いくつかの例では、ＭＹＣは野性型ＭＹＣ ＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの例では、ＭＹＣ ＤＮＡまたはＲＮＡは１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、野性型ＭＹＣ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、突然変異（例えば、置換、欠失、あるいは追加）を含む、ＭＹＣ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズするポリ核酸分子である。
いくつかの実施形態において、ＭＹＣ ＤＮＡまたはＲＮＡは１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＣ ＤＮＡまたはＲＮＡは、１つ以上のエキソン内に１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、ＭＹＣ ＤＮＡまたはＲＮＡは、エキソン２あるいはエキソン３内に１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、ＭＹＣ ＤＮＡまたはＲＮＡは、アミノ酸残基２、７、１７、２０、３２、４４、５８、５９、７６、１１５、１３８、１４１、１４５、１４６、１６９、１７５、１８８、２００、２０２、２０３、２４８、２５１、２９８、３２１、３４０、３６９、３７３、３７４、３８９、３９５、４０４、４１９、４３１、４３９、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＣ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＭＹＣポリペプチドのＰ２Ｌ、Ｆ７Ｌ、Ｄ１７Ｎ、Ｑ２０Ｅ、Ｙ３２Ｎ、Ａ４４Ｖ、Ａ４４Ｔ、Ｔ５８Ｉ、Ｐ５９Ｌ、Ａ７６Ｖ、Ｆ１１５Ｌ、Ｆ１３８Ｓ、Ａ１４１Ｓ、Ｖ１４５Ｉ、Ｓ１４６Ｌ、Ｓ１６９Ｃ、Ｓ１７５Ｎ、Ｃ１８８Ｆ、Ｎ２００Ｓ、Ｓ２０２Ｎ、Ｓ２０３Ｔ、Ｔ２４８Ｓ、Ｄ２５１Ｅ、Ｓ２９８Ｙ、Ｑ３２１Ｅ、Ｖ３４０Ｄ、Ｖ３６９Ｄ、Ｔ３７３Ｋ、Ｈ３７４Ｒ、Ｆ３８９Ｌ、Ｑ３９５Ｈ、Ｋ４０４Ｎ、Ｌ４１９Ｍ、Ｅ４３１Ｋ、Ｒ４３９Ｑ、あるいはこれらの組み合わせから選択されたアミノ酸残基に対応する位置で１つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、１つ以上の突然変異を含むＭＹＣ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、エキソン内に１つ以上の突然変異を含む、ＭＹＣ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、エキソン２あるいはエキソン３内に１つ以上の突然変異を含む、ＭＹＣ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＭＹＣポリペプチドのアミノ酸残基２、７、１７、２０、３２、４４、５８、５９、７６、１１５、１３８、１４１、１４５、１４６、１６９、１７５、１８８、２００、２０２、２０３、２４８、２５１、２９８、３２１、３４０、３６９、３７３、３７４、３８９、３９５、４０４、４１９、４３１、４３９、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含む、ＭＹＣ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＭＹＣポリペプチドのＰ２Ｌ、Ｆ７Ｌ、Ｄ１７Ｎ、Ｑ２０Ｅ、Ｙ３２Ｎ、Ａ４４Ｖ、Ａ４４Ｔ、Ｔ５８Ｉ、Ｐ５９Ｌ、Ａ７６Ｖ、Ｆ１１５Ｌ、Ｆ１３８Ｓ、Ａ１４１Ｓ、Ｖ１４５Ｉ、Ｓ１４６Ｌ、Ｓ１６９Ｃ、Ｓ１７５Ｎ、Ｃ１８８Ｆ、Ｎ２００Ｓ、Ｓ２０２Ｎ、Ｓ２０３Ｔ、Ｔ２４８Ｓ、Ｄ２５１Ｅ、Ｓ２９８Ｙ、Ｑ３２１Ｅ、Ｖ３４０Ｄ、Ｖ３６９Ｄ、Ｔ３７３Ｋ、Ｈ３７４Ｒ、Ｆ３８９Ｌ、Ｑ３９５Ｈ、Ｋ４０４Ｎ、Ｌ４１９Ｍ、Ｅ４３１Ｋ、Ｒ４３９Ｑ、あるいはこれらの組み合わせから選択されたアミノ酸残基に対応する位置で１つ以上の突然変異を含む、ＭＹＣ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。
ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）を標的とするポリ核酸分子
ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）は、イノシン一リン酸に対するヒポキサンチンの転換とグアノシン一リン酸に対するグアニンの転換を触媒するトランスフェラーゼである。ＨＧＰＲＴはヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ＨＰＲＴ１ ＤＮＡまたはＲＮＡは野性型であるか、あるいは１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、ＨＰＲＴ１ ＤＮＡまたはＲＮＡは、１つ以上のエキソン内に１つ以上の突然変異を含む。いくつかの例では、１つ以上のエキソンは、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン６、エキソン８、あるいはエキソン９を含む。いくつかの例では、ＨＰＲＴ１ ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＨＰＲＴ１ポリペプチドのアミノ酸残基３５、４８、５６、７４、８７、１２９、１５４、１６２、１９５、２００、２１０、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＨＰＲＴ１ポリペプチドのＶ３５Ｍ、Ｒ４８Ｈ、Ｅ５６Ｄ、Ｆ７４Ｌ、Ｒ８７Ｉ、Ｎ１２９（スプライス部位突然変異）、Ｎ１５４Ｈ、Ｓ１６２（スプライス部位突然変異）、Ｙ１９５Ｃ、Ｙ１９５Ｎ、Ｒ２００Ｍ、Ｅ２１０Ｋ、あるいはこれらの組み合わせから選択された１つ以上の突然変異を含む、ＨＰＲＴ１ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、１つ以上の突然変異を含むＨＰＲＴ１ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン６、エキソン８、あるいはエキソン９内に１つ以上の突然変異を含む、ＨＰＲＴ１ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＨＰＲＴ１ポリペプチドのアミノ酸残基３５、４８、５６、７４、８７、１２９、１５４、１６２、１９５、２００、２１０、あるいはこれらの組み合わせに対応する位置で１つ以上の突然変異を含む、ＨＰＲＴ１ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＨＰＲＴ１ポリペプチドのＶ３５Ｍ、Ｒ４８Ｈ、Ｅ５６Ｄ、Ｆ７４Ｌ、Ｒ８７Ｉ、Ｎ１２９（スプライス部位突然変異）、Ｎ１５４Ｈ、Ｓ１６２（スプライス部位突然変異）、Ｙ１９５Ｃ、Ｙ１９５Ｎ、Ｒ２００Ｍ、Ｅ２１０Ｋ、あるいはこれらの組み合わせから選択された１つ以上の突然変異を含む、ＨＰＲＴ１ ＤＮＡまたはＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。
ポリ核酸分子配列
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、表１、４、７、８、あるいは１０で例証された標的配列にハイブリダイズする配列を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はＢである。いくつかの例では、ポリ核酸分子Ｂは、表１で例証された標的配列（ＫＲＡＳ標的配列）にハイブリダイズする配列を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子Ｂは、表４で例証された標的配列（ＥＧＦＲ標的配列）にハイブリダイズする配列を含む。場合によっては、ポリ核酸分子Ｂは、表７で例証された標的配列（ＡＲ標的配列）にハイブリダイズする配列を含む。場合によっては、ポリ核酸分子Ｂは、表８で例証された標的配列（β−カテニン標的配列）にハイブリダイズする配列を含む。さらなる例では、ポリ核酸分子Ｂは、表１０で例証された標的配列（ＰＩＫ３ＣＡとＰＩＫ３ＣＢの標的配列）にハイブリダイズする配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは、表２あるいは表３で列挙された配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５からなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、第２のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する第１のポリヌクレオチドと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する第２のポリヌクレオチドとを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは、表５あるいは表６で列挙された配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５からなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、第２のポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、ポリ核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する第１のポリヌクレオチドと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１９５５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する第２のポリヌクレオチドとを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは、表７で列挙された配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２からなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、第２のポリヌクレオチドｈａ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列に相補的な配列を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する第１のポリヌクレオチドと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列に相補的な第２のポリヌクレオチドとを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは、表９で列挙された配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２からなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、第２のポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、ポリ核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する第１のポリヌクレオチドと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する第２のポリヌクレオチドとを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは、表１１で列挙された配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２からなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、第２のポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、ポリ核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する第１のポリヌクレオチドと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する第２のポリヌクレオチドとを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは、表１２で列挙された配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９または２１１７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９または２１１７に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９または２１１７に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９または２１１７に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９または２１１７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９または２１１７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９または２１１７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９または２１１７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９または２１１７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９または２１１７に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９または２１１７に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９または２１１７に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９または２１１７に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９または２１１７からなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９または２１１７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、第２のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９または２１１７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、ポリ核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９または２１１７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する第１のポリヌクレオチドと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９、または２１１７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する第２のポリヌクレオチドとを含む。
ポリ核酸分子
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子はＲＮＡまたはＤＮＡを含む。場合によっては、ポリ核酸分子はＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、あるいはヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）を含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｓｈＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｍｉＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｄｓＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｔＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｒＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｈｎＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡはｓｉＲＮＡを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はｓｉＲＮＡを含む。場合によっては、ＢはｓｉＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は長さが約１０から約５０のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、長さが約１０から約３０、約１５から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、あるいは約２０から約２２のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は長さが約５０のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約４５のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約４０のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約３５のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約３０のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約２５のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約２０のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１９のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１８のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１７のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１６のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１５のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１４のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１３のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１２のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１１のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１０のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１０から約５０のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１０から約４５のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１０から約４０のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１０から約３５のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１０から約３０のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１０から約２５のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１０から約２０のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１５から約２５のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１５から約３０のヌクレオチドである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は長さが約１２から約３０のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドはセンス鎖またはパッセンジャー鎖である。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドはアンチセンス鎖またはガイド鎖である。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１０から約５０のヌクレオチドである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、長さが約１０から約３０、約１５から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、あるいは約２０から約２２のヌクレオチドである。
いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約５０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約４５のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約４０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約３５のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約３０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約２５のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約２０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１９のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１８のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１７のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１６のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１５のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１４のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１３のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１２のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１１のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１０から約５０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１０から約４５のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１０から約４０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１０から約３５のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１０から約３０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１０から約２５のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１０から約２０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１５から約２５のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１５から約３０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは長さが約１２から約３０のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第２のポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１０から約５０のヌクレオチドである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、長さが約１０から約３０、約１５から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、あるいは約２０から約２２のヌクレオチドである。
いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約５０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約４５のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約４０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約３５のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約３０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約２５のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約２０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１９のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１８のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１７のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１６のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１５のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１４のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１３のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１２のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１１のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１０から約５０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１０から約４５のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１０から約４０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１０から約３５のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１０から約３０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１０から約２５のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１０から約２０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１５から約２５のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１５から約３０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは長さが約１２から約３０のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はさらに平滑末端、オーバーハング、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、平滑末端は、５’平滑末端、３’平滑末端、あるいは両方である。場合によっては、オーバーハングは、５’オーバーハング、３’オーバーハング、またはその両方である。場合によっては、オーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは、１、２、３、４、５、または６の非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは、１、２、３、または４の非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは１つの非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは２つの非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは３つの非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは４つの非塩基対ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は、本明細書に記載された標的配列に対して少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは９９．５％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載される標的配列に対して少なくとも５０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載される標的配列に対して少なくとも６０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載される標的配列に対して少なくとも７０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載される標的配列に対して少なくとも８０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載される標的配列に対して少なくとも９０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載される標的配列に対して少なくとも９５％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載される標的配列に対して少なくとも９９％相補的である。いくつかの例では、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載される標的配列に対して１００％相補的である。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載される標的配列に対して５以下のミスマッチを有する。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載される標的配列に対して４以下のミスマッチを有する。いくつかの例において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載される標的配列に対して４以下のミスマッチを有することもある。場合によっては、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載される標的配列に対して２以下のミスマッチを有することもある。場合によっては、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載される標的配列に対して１以下のミスマッチを有することもある。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される標的配列にハイブリダイズするポリ核酸分子の特異性は、標的配列に対するポリ核酸分子の９５％、９８％、９９％、９９．５％、あるいは１００％の配列相補性である。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションは高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件である。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載される標的配列の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の連続する塩基にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載される標的配列の少なくとも８つの連続する塩基にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載される標的配列の少なくとも９つの連続する塩基にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載される標的配列の少なくとも１０の連続する塩基にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載される標的配列の少なくとも１１の連続する塩基にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載される標的配列の少なくとも１２の連続する塩基にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載される標的配列の少なくとも１３の連続する塩基にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載される標的配列の少なくとも１４の連続する塩基にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載される標的配列の少なくとも１５の連続する塩基にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載される標的配列の少なくとも１６の連続する塩基にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載される標的配列の少なくとも１７の連続する塩基にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載される標的配列の少なくとも１８の連続する塩基にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載される標的配列の少なくとも１９の連続する塩基にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載される標的配列の少なくとも２０の連続する塩基にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はオフターゲット効果を減少させた。いくつかの例では、「オフターゲット」あるいは「オフターゲット効果」は、別のｍＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、あるいは細胞タンパク質、あるいは他の部分に直接あるいは間接的に相互に作用することより、所定の標的に対するポリ核酸ポリマーが意図しない効果を引き起こすあらゆる例を指す。いくつかの例では、その他の転写物とポリ核酸分子のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖との間の部分的な相同性あるいは相補性により該その他の転写物の同時分解が生じるときに、「オフターゲット効果」が生じる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は天然、合成、あるいは人工のヌクレオチドアナログまたは塩基を含む。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはヌクレオチドアナログの組み合わせを含む。いくつかの例では、合成または人工のヌクレオチドアナログまたは塩基は、リボース部分、リン酸塩部分、ヌクレオシド部分、あるいはこれらの組み合わせの１つ以上で修飾を含む。
いくつかの実施形態において、上に記載されたヌクレオチドアナログまたは人工のヌクレオチド塩基は、リボース部分の２’水酸基に修飾を備えた核酸を含む。いくつかの例では、修飾はＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＣＮを含み、Ｒはアルキル部分である。典型的なアルキル部分としては、限定されないが、ハロゲン、硫黄、チオール、チオエーテル、チオエステル、アミン（一級、二級、または三級）、アミド、エーテル、エステル、アルコール、および酸素が挙げられる。いくつかの例では、アルキル部分はさらに修飾を含む。いくつかの例では、修飾はアゾ基、ケト基、アルデヒド基、カルボキシル基、ニトロ基、ニトロソ基、ニトリル基、複素環（例えば、イミダゾール、ヒドラジノ、またはヒドロキシルアミノ）基、イソシアネート基またはシアネート基、あるいは硫黄含有基（例えば、スルホキシド、スルホン、スルフィド、またはジスルフィド）を含む。いくつかの例では、アルキル部分はさらにヘテロ置換を含む。いくつかの例では、複素環基の炭素は窒素、酸素、または硫黄によって置換される。いくつかの例では、複素環の置換としては、限定されないが、モルホリノ、イミダゾール、およびピロリジノが挙げられる。
いくつかの例では、２’水酸基の修飾は、２’−Ｏ−メチル修飾、または２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾である。場合によっては、２’−Ｏ−メチル修飾は、リボース部分の２’水酸基にメチル基を加え、一方で、２’Ｏ−メトキシエチル修飾はリボース部分の２’水酸基にメトキシエチル群を加える。アデノシン分子の２’−Ｏ−メチル修飾とウリジンの２’Ｏ−メトキシエチル修飾の典型的な化学構造が以下に例証される。
いくつかの例では、２’水酸基の修飾は、プロピルリンカーを含む拡張アミン基がアミン基を２’酸素に結合する、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾である。いくつかの例では、この修飾は、１つの糖当たりアミン基から１つの正電荷を導入することにより、オリゴヌクレオチド分子のリン酸塩由来の全体的な負電荷を中和し、それによって、その両性イオン性により細胞の取り込み特性を改善する。２’−Ｏ−アミノプロピルヌクレオシドホスホロアミダイトの典型的な化学構造が以下に例証される。
いくつかの例では、２’水酸基の修飾は、２’炭素で結合された酸素分子がメチレン基によって４’炭素に結合されるロックドまたは架橋リボース修飾（例えば、ロックド核酸またはＬＮＡ）であり、したがって、２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシ−メチレン結合した二環式のリボヌクレオチドモノマーを形成する。ＬＮＡの化学構造の典型的な表現が以下に例証される。左に示された表現は、ＬＮＡモノマーの化学的な結合性を強調する。右に示された表現は、ＬＮＡモノマーのフラノース環のロックド３’−エンド（３Ｅ）立体構造を強調する。
いくつかの例では、２’水酸基の修飾は、例えば、糖構造をＣ３’−エンド糖の歪み構造（ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に固定する２’−４’−エチレン架橋核酸などのエチレン核酸（ＥＮＡ）を含む。ＥＮＡは、ＬＮＡも含む修飾された核酸の架橋された核酸クラスの一部である。ＥＮＡと架橋され核酸の典型的な化学構造が以下に例証される。
いくつかの実施形態において、２’水酸基でのさらなる修飾は、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）を含む。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、限定されないが、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，−ジメチルアデニン、２−プロピルアデニン、２プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、および５位に修飾を有する他のヌクレオチド、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−ハロウリジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルアミノエチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、デアザヌクレオチド（７−デアザ−アデノシン、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、または６−アゾチミジンなど）、５−メチル−２−チオウリジン、他のチオ塩基（２−チオウリジン、４−チオウリジン、および２−チオシチジンなど）、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチルおよび置換されたナフチル基、任意の（Ｏ）−アルキル化およびＮ−アルキル化プリンおよびピリミジン（Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン５−オキシ酢酸、ピリジン−４−オン、あるいはピリジン−２−オンなど）、アミノフェノールなどのフェニルおよび修飾されたフェニル、あるいは２，４，６−トリメトキシベンゼン、Ｇ−クランプヌクレオチド、８−置換されたアデニン、およびグアニンとして作用する修飾されたシトシン、５−置換されたウラシルとチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、およびアルキルカルボニルアルキル化されたヌクレオチドなどの修飾された塩基を含む。修飾されたヌクレオチドは、糖およびリボシルではない糖であるあるいはそのアナログを有するヌクレオチドと同様に、糖部分に関して修飾されるヌクレオチドを含む。例えば、糖部分は、場合によっては、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース、および他の糖、複素環、あるいは炭素環であるか、あるいはこれらに基づく。ヌクレオチドとの用語は、普遍的な塩基として当該技術分野で知られているものも含む。例として、普遍的な塩基としては、限定されないが、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、あるいはネブラリンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログはさらに、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイト、あるいは１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）を含む。モルホリノあるいはホスホロジアミデートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ）は、その構造が天然の核酸構造を模倣しているが正常な糖とリン酸塩構造からは外れている合成分子を含む。いくつかの例では、５員のリボース環は、４つの炭素、１つの窒素、および１つの酸素を含有する６員のモルホリノ環で置換される。場合によっては、リボースモノマーはリン酸基の代わりにホスホロジアミデート基によって結合される。そのような場合、骨格の変化は正と負の電荷をすべて取り除いて、モルホリノ中性分子を、荷電オリゴヌクレオチドによって使用される薬剤などの細胞送達薬剤の力を借りることなく、細胞膜と架橋させることができるようにする。
いくつかの実施形態において、上に記載されたモルホリノまたはＰＭＯは、正電荷またはカチオン電荷を含むＰＭＯである。いくつかの例では、ＰＭＯはＰＭＯｐｌｕｓ（Ｓａｒｅｐｔａ）である。ＰＭＯｐｌｕｓは、任意の数の（１−ピエラジノ）ホスフィニリデンオキシ、（１−（４−（オメガ−グアニジノ−アルカノイル））−ピエラジノ）ホスフィニリデンオキシ結合（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／０３６１２７に記載されるものなど）を含むホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーを指す。場合によっては、ＰＭＯは、米国特許第７９４３７６２に記載されるＰＭＯである。
いくつかの実施形態において、上に記載されたモルホリノまたはＰＭＯは、ＰＭＯ−Ｘ（Ｓａｒｅｐｔａ）である。場合によっては、ＰＭＯ−Ｘは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／１５０４０８と米国特許出願公開第２０１２／００６５１６９で開示されるものなどの少なくとも１つの結合あるいは開示された末端修飾の少なくとも１つを含むホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーを指す。
いくつかの実施形態において、上に記載されたモルホリノまたはＰＭＯは、米国特許出願公開第２０１４／０２９６３２１の表５に記載されるようなＰＭＯである。
いくつかの実施形態において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は糖骨格環あるいはリン酸塩結合を含まず、塩基は結合してオリゴグリシン様分子によって適切に間隔を置かれ、したがって骨格電荷を除去する。
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾は随意にヌクレオチド間結合で生じる。いくつかの例では、修飾されたヌクレオチド間結合としては、限定されないが、ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；メチルホスホン酸；５’−アルキレンホスホン酸；５’−メチルホスホン酸；３’−アルキレンホスホン酸；三フッ化ホウ素；３’−５’結合あるいは２’−５’結合のボラノリン酸エステルとセレノリン酸；ホスホトリエステラーゼ；チオノアルキルホスホトリエステラーゼ；水素ホスホン酸結合；アルキルホスホン酸；アルキルホスホンチオ酸；アリールホスホンチオ酸；ホスホロセレノエート；ホスホロジセレノエート；ホスフィン酸；ホスホロアミド酸；３’−アルキルホスホロアミド酸；アミノアルキルホスホロアミド酸；チオノホスホロアミド酸；ホスホロピペラジデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｐｉｐｅｒａｚｉｄａｔｅｓ）；ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅｓ）；ホスホロアニリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｉｄａｔｅｓ）；ケトン；スルホン；スルホンアミド；炭酸塩；カルバマート；メチレンヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｈｙｄｒａｚｏｓ）；メチレンジメチルヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒａｚｏｓ）；ホルムアセタル（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌｓ）；チオホルムアセタル（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔａｌｓ）；オキシム；メチレンイミノ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｏｓ）；メチレンメチルイミノ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏｓ）；チオアミデート（ｔｈｉｏａｍｉｄａｔｅｓ）；リボアセチル基を有する結合；アミノエチルグリシン；シリル結合またはシロキサン結合；例えば、飽和した、または不飽和で、および／あるいは、非置換の、または置換した、および／あるいは、ヘテロ原子を含有する、１〜１０の炭素のヘテロ原子を含む、または含まない、アルキル結合、あるいはシクロアルキル結合；モルホリノ構造、アミド、またはポリアミドとの結合であって、塩基が骨格のアザ窒素に直接あるいは間接的に結合する、結合；および、これらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの例では、修飾は、メチルホスホン酸あるいはチオールホスホン酸の修飾などのメチルまたはチオール修飾である。典型的なチオールホスホン酸ヌクレオチド（左）とメチルホスホン酸ヌクレオチド（右）が以下に例証される。
いくつかの例では、修飾されたヌクレオチドとしては、限定されないが、以下のように例証される２’−フルオロ Ｎ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトが挙げられる。
いくつかの例では、修飾されたヌクレオチドとしては、限定されないが、以下のように例証されるヘキシトール核酸（あるいは１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ））が挙げられる。
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾が修飾されたリン酸塩骨格を含み、ここで、修飾は中性または荷電した骨格を生成する。いくつかの例では、無電荷または中性のリン酸骨格を生成するために、リン酸骨格はアルキル化によって修飾される。本明細書で使用されるように、アルキル化はメチル化、エチル化、プロピル化を含む。場合によっては、アルキル基は、アルキル化の文脈において本明細書で使用されるように、１から６の炭素原子を含有する直線または分枝した飽和炭化水素基を指す。いくつかの例では、典型的なアルキル基としては、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３．３−ジメチルブチル、および２−エチルブチルの基が挙げられる。場合によっては、修飾されたリン酸塩は、米国特許第９４８１９０５に記載されるようなリン酸基である。
いくつかの実施形態において、さらなる修飾されたリン酸骨格は、メチルホスホン酸、エチルホスホナート、メチルチオホスホナート、あるいはメトキシホスホナートを含む。場合によっては、修飾されたリン酸はメチルホスホン酸である。場合によっては、修飾されたリン酸はエチルホスホナートである。場合によっては、修飾されたリン酸はメチルチオホスホナートである。場合によっては、修飾されたリン酸はメトキシホスホナートである。
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾はさらに、随意にリボース部分、リン酸骨格、およびヌクレオシドの修飾、あるいは３’または５’末端のヌクレオチドアナログの修飾を含む。例えば、３’末端は随意に、あるいは３’−３’結合により３’−末端でヌクレオシドを逆位させることによって、３’カチオン基を含む。別の代替物では、３’−末端は、随意にアミノアルキル基、例えば、３’Ｃ５アミノアルキルｄＴと抱合する。さらなる代替物では、３’−末端は随意に、脱塩基部位と、例えば、アプリン酸またはアピリミジン酸の部位と抱合する。いくつかの例では、５’−末端はアミノアルキル基（例えば、５’−Ｏ−アルキルアミノ置換基と抱合する。場合によっては、５’−末端は、脱塩基部位と、例えば、アプリン酸またはアピリミジン酸の部位と抱合する。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載される１つ以上の人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５またはそれ以上の人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、人工ヌクレオチドアナログは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾されたＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、２’−フルオロ Ｎ３−Ｐ５’−ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾されたＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、２’−フルオロ Ｎ３−Ｐ５’−ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせから選択された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、またはそれ以上の人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、またはそれ以上の２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、またはそれ以上の２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）で修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、またはそれ以上のチオールホスホン酸ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５、４５２−１９５５、１９５６−１９６２、１９６７−２００２、２０１３−２０３２、２０８２−２１０９、または２１１７のポリ核酸分子である。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５、４５２−１９５５、１９５６−１９６２、１９６７−２００２、２０１３−２０３２、２０８２−２１０９、または２１１７のポリ核酸分子である。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、以下の少なくとも１つを含む：約５％から約１００％の修飾、約１０％から約１００％の修飾、約２０％から約１００％の修飾、約３０％から約１００％の修飾、約４０％から約１００％の修飾、約５０％から約１００％の修飾、約６０％から約１００％の修飾、約７０％から約１００％の修飾、約８０％から約１００％の修飾、および、約９０％から約１００％の修飾。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５、４５２−１９５５、１９５６−１９６２、１９６７−２００２、２０１３−２０３２、２０８２−２１０９、または２１１７のポリ核酸分子である。
いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５から約１００％は、本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは１００％は、本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５、４５２−１９５５、１９５６−１９６２、１９６７−２００２、２０１３−２０３２、２０８２−２１０９、または２１１７のポリ核酸分子の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは１００％は、本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−４５のポリ核酸分子の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは１００％は、本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５２−１２０３のポリ核酸分子の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは１００％は、本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５６−１９６２のポリ核酸分子の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは１００％は、本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２のポリ核酸分子の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは１００％は、本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２のポリ核酸分子の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは１００％は、本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９、または２１１７のポリ核酸分子の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは１００％は、本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、人工ヌクレオチドアナログは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾されたＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、２’−フルオロ Ｎ３−Ｐ５’−ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの例では、人工ヌクレオチドアナログを含むポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６−７５を含む。いくつかの例では、人工ヌクレオチドアナログを含むポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０４−１９５５を含む。いくつかの例では、人工ヌクレオチドアナログを含むポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６７−２００２を含む。いくつかの例では、人工ヌクレオチドアナログを含むポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１３−２０３２を含む。いくつかの例では、人工ヌクレオチドアナログを含むポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２−２１０９、または２１１７を含む。
場合によっては、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログの１つ以上は、天然のポリ核酸分子と比較すると、例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈなどのリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅなどのデオキシリボヌクレアーゼ、あるいは５’−３’エキソヌクレアーゼおよび３’−５’エキソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼに対する耐性を有する。いくつかの例では、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾されたＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、２’−フルオロ Ｎ３−Ｐ５’−ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせを含む人工ヌクレオチドアナログは、例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈなどのリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅなどのデオキシリボヌクレアーゼ、あるいは５’−３’エキソヌクレアーゼおよび３’−５’エキソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼに対する耐性を有するいくつかの例では、２’−Ｏ−メチル修飾されたポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有する。いくつかの例では、２’Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾されたポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有する。いくつかの例では、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾されたポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有する。いくつかの例では、２’−デオキシ修飾されたポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有する。いくつかの例では、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有する。いくつかの例では、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）修飾されたポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有する。いくつかの例では、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）修飾されたポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有する。いくつかの例では、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）修飾されたポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有する。いくつかの例では、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）修飾されたポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有する。いくつかの例では、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾されたポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有する。いくつかの例では、ＬＮＡ修飾されたポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有する。いくつかの例では、ＥＮＡ修飾されたポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有する。いくつかの例では、ＨＮＡ修飾されたポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有する。モルホリノは、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有することがある。いくつかの例では、ＰＮＡ修飾されたポリ核酸分子は、ヌクレアーゼに対して耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有する。いくつかの例では、メチルホスホン酸ヌクレオチド修飾されたポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有する。いくつかの例では、チオールホスホン酸ヌクレオチド修飾されたポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有する。いくつかの例では、２’−フルオロ Ｎ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトを含むポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ耐性）を有する。いくつかの例では、本明細書に記載される５’抱合体は５’−３’エキソヌクレアーゼ切断を阻害する。いくつかの例では、本明細書に記載される３’抱合体は３’−５’エキソヌクレアーゼ切断を阻害する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログの１つ以上は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾されたＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、あるいは２’−フルオロ Ｎ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトを含む人工ヌクレオチドアナログの１つ以上は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−メチル修飾されたポリ核酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾されたポリ核酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾されたポリ核酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、２’−デオキシ修飾されたポリ核酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたポリ核酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）修飾されたポリ核酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）修飾されたポリ核酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）修飾されたポリ核酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）修飾されたポリ核酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾されたポリ核酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、ＬＮＡ修飾されたポリ核酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、ＥＮＡ修飾されたポリ核酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、ＰＮＡ修飾されたポリ核酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、ＨＮＡ修飾されたポリ核酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、モルホリノ修飾されたポリ核酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、メチルホスホン酸ヌクレオチド修飾されたポリヌクレイン酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、チオールホスホン酸ヌクレオチド修飾されたポリヌクレイン酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。いくつかの例では、２’−フルオロ Ｎ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトを含むポリ核酸分子は、同等な天然のポリ核酸分子に関連してそのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増加させた。場合によっては、増加した親和性は、より低いＫｄ、より高い溶融温度（Ｔｍ）、あるいはこれらの組み合わせで例証される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、キラル的に純粋な（あるいは立体的に純粋な（ｓｔｅｒｅｏ ｐｕｒｅ））ポリ核酸分子、あるいは単一のエナンチオマーを含むポリ核酸分子である。いくつかの例では、ポリ核酸分子はＬ−ヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はＤヌクレオチドを含む。ある例では、ポリ核酸分子組成物は、その鏡像異性体の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、あるいは１％以下未満を含む。場合によっては、ポリ核酸分子組成物は、ラセミ混合物の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、あるいは１％以下未満を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、米国特許公開第２０１４／１９４６１０と第２０１５／２１１００６、および、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５１０７４２５に記載されるポリ核酸分子である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子はアプタマー抱合部分を含むようにさらに修飾される。いくつかの例では、アプタマー抱合部分は、ＤＮＡのアプタマー抱合部分である。いくつかの例では、アプタマー抱合部分は、Ａｌｐｈａｍｅｒ（Ｃｅｎｔａｕｒｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）であり、これは、特定の細胞表面標的を認識するアプタマー部分と、循環抗体に結合するための特異的なエピトープを表す部分とを含む。ある例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、米国特許出願第８，６０４，１８４、第８，５９１，９１０、および、第 ７，８５０，９７５に記載されるようなアプタマー抱合部分を含むようにさらに修飾される。
追加の実施形態では、本明細書に記載されるポリ核酸分子はその安定性を増加させるために修飾される。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）であり、ポリ核酸分子はその安定性を増加させるために修飾される。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、その安定性を増加させるために上に記載された修飾の１つ以上によって修飾される。場合によっては、ポリ核酸分子は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾によって、あるいはロックドまたは架橋リボース立体構造（例えば、ＬＮＡまたはＥＮＡ）によるなどして、２’ヒドロキシル位置で修飾される。場合によっては、ポリ核酸分子は、２’−Ｏ−メチルおよび／または２’−Ｏ−メトキシエチルリボースによって修飾される。場合によっては、ポリ核酸分子はさらに、その安定性を増加させるために、モルホリノ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、および／または２’−フルオロ Ｎ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はキラル的に純粋な（あるいは立体的に純粋な）ポリ核酸分子である。いくつか例では、キラル的に純粋な（あるいは立体的に純粋な）ポリ核酸分子はその安定性を増加させるために修飾される。送達のために安定性を増加させるＲＮＡへの適切な修飾は当業者には明白である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、上で記載された遺伝子によってコードされたＲＮＡの発現を調節するＲＮＡｉ活性を有する。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖のｓｉＲＮＡ分子であり、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の鎖の１つは、遺伝子あるいはその一部によってコードされた遺伝子またはＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の第２の鎖は、遺伝子あるいはその一部によってコードされた遺伝子またはＲＮＡのヌクレオチド配列に実質的に類似するヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖のｓｉＲＮＡ分子であり、ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は、約１５〜２５、１８〜２４、あるいは１９〜約２３のヌクレオチドを含み、ここで、各鎖は別の鎖のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１４、１７、あるいは１９のヌクレオチドを含む。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖のｓｉＲＮＡ分子であり、ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は約１９〜約２３のヌクレオチドを含み、ここで、各鎖は別の鎖のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１９のヌクレオチドを含む。いくつかの例では、遺伝子は、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＡＲ、ＨＰＲＴ１、ＣＮＮＴＢ１（β−カテニン）、あるいはβ−カテニン関連遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、化学合成、および／または当該技術分野で既知の手順を使用する酵素結合反応を用いて構築される。例えば、ポリ核酸分子は、分子の生物学的安定性を増加させるために、あるいはポリ核酸分子と標的核酸との間で形成された二本鎖の物理的安定性を増加させるために設計された種々に修飾されたヌクレオチド、あるいは自然発生ヌクレオチドを使用して、化学的に合成される。典型的な方法は、米国特許第５，１４２，０４７、第５，１８５，４４４、 第５，８８９，１３６、第６，００８，４００、および、第６，１１１，０８６；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００９０９９９４２、あるいはヨーロッパ公開第１５７９０１５に記載されるものを含む。追加の典型的な方法は、Ｇｒｉｆｆｅｙ ｅｔ ａｌ．、“２’−Ｏ−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ： ａ ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３９（２６）：５１００−５１０９（１９９７））； Ｏｂｉｋａ、ｅｔ ａｌ． “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２’−Ｏ，４’−Ｃ−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｕｒｉｄｉｎｅ ａｎｄ −ｃｙｔｉｄｉｎｅ． Ｎｏｖｅｌ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ ａ ｆｉｘｅｄ Ｃ３、−ｅｎｄｏ ｓｕｇａｒ ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ”． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８（５０）： ８７３５（１９９７）； Ｋｏｉｚｕｍｉ、Ｍ． “ＥＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８（２）： １４４−１４９（２００６）； ａｎｄ Ａｂｒａｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．、“Ｎｏｖｅｌ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｓｕｂｕｎｉｔｓ−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： ｎｅｗ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，” Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８Ｂ：１７２１−１７２６（２００９）に記載されるものを含む。代替的に、ポリ核酸分子は、ポリ核酸分子がアンチセンスの配向（つまり、挿入されたポリ核酸分子から転写されたＲＮＡは、所望の標的ポリヌクレイン酸分子へのアンチセンス配向である）にサブクローン化された発現ベクターを生物学的に使用して生成される。
抱合化学
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は結合部分に抱合する。いくつかの例では、結合部分は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗原、毒素、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖、炭水化物、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールなどのポリマー、同様に、これらのクラスのすべての物質のアナログまたは誘導体を含む。結合部分のさらなる例としては、限定されないが、コレステロールなどのステロイド、リン脂質、ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール、脂肪酸、炭化水素（例えば、不飽和の、飽和した、あるいは置換を含む）、酵素基質、ビオチン、ジゴキシゲニン、および多糖類を含む。いくつかの例では、結合部分は抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、さらにポリマーと、随意にエンドソーム溶解性部分と抱合する。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は化学的ライゲーションプロセスによって結合部分に抱合する。いくつかの例では、ポリ核酸分子は天然のライゲーションによって結合部分に抱合する。いくつかの例では、抱合は、Ｄａｗｓｏｎ、ｅｔ ａｌ． “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４、２６６、７７６−７７９； Ｄａｗｓｏｎ、ｅｔ ａｌ． “Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｔｈｉｏｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，” Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９７、１１９、４３２５−４３２９； Ｈａｃｋｅｎｇ、ｅｔ ａｌ． “Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ： Ｅｘｐａｎｄｅｄ ｓｃｏｐｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒｗａｒｄ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９９、９６、１００６８−１００７３； ｏｒ Ｗｕ、ｅｔ ａｌ． “Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｆｒｅｅ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ，” Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ２００６、４５、４１１６−４１２５に記載される通りである。いくつかの例では、抱合は米国特許第８，９３６，９１０に記載される通りである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、天然のライゲーション化学検査によって結合部分に部位特異的にあるいは非特異的に抱合する。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、「痕跡のない」カップリング技術（Ｐｈｉｌｏｃｈｅｍ）を利用する、部位標的方法によって結合部分に抱合する。いくつかの例では、「痕跡のない」カップリング技術は、アルデヒド基を含有するポリ核酸分子と抱合する結合部分上のＮ末端１，２ーアミノチオール基を利用する。（Ｃａｓｉ ｅｔ ａｌ．、“Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｄｒｕｇｓ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｏｄｅｌｉｖｅｒｙ，” ＪＡＣＳ １３４（１３）： ５８８７−５８９２（２０１２）を参照）。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、結合部分に組み込まれる非天然アミノ酸を利用する、部位標的方法によって結合部分に抱合する。いくつかの例では、非天然アミノ酸はｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）を含む。いくつかの例では、ｐＡｃＰｈｅのケト基は、オキシム結合を形成するためにアルコキシ−アミン誘導体抱合部分に選択的に結合される。（Ａｘｕｐ ｅｔ ａｌ．、“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，” ＰＮＡＳ １０９（４０）： １６１０１−１６１０６（２０１２）を参照）。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、酵素触媒プロセスを利用する、部位標的方法によって結合部分に抱合する。いくつかの例では、部位標的方法は、ＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術（Ｒｅｄｗｏｏｄ）を利用する。いくつかの例では、ＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術は、アルデヒドタグの存在下での酸化プロセスによるホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によるシステインからのホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基の生成と、その後の、ヒドラジノ−Ｐｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒ（ＨＩＰＳ）ライゲーションによるＦＧｌｙのアルキルヒドラジン機能化ポリ核酸分子への抱合を含む。（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．、“Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｔａｇ，”ＰＮＡＳ １０６（９）： ３０００−３００５（２００９）； Ａｇａｒｗａｌ、ｅｔ ａｌ．、“Ａ Ｐｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”ＰＮＡＳ １１０（１）： ４６−５１（２０１３）を参照）。
いくつかの例では、酵素触媒プロセスは、微生物によるトランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）を含む。場合によっては、ポリ核酸分子は、微生物によるトランスグルタミナーゼ触媒プロセスを利用して結合部分に抱合する。いくつかの例では、ｍＴＧは、認識配列内のグルタミンのアミド側鎖と機能化ポリ核酸分子の一級アミンとの間の共有結合の形成を触媒する。いくつかの例では、ｍＴＧはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓから生成される。（Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．、“Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｍａｔｔｅｒｓ： ｓｉｔｅ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０（２） １６１−１６７（２０１３）を参照）。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、配列特異的なトランスペプチダーゼを利用するＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１４０３１７に記載されるような方法によって結合部分に抱合する。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、米国特許出願公開第２０１５／０１０５５３９と第２０１５／０１０５５４０に記載されるような方法によって結合部分に抱合する。
結合部分
いくつかの実施形態において、結合部分Ａはポリペプチドである。いくつかの例では、ポリペプチドは抗体またはそのフラグメントである。場合によっては、フラグメントは結合フラグメントである。いくつかの例では、抗体または結合フラグメントはヒト化抗体またはその結合フラグメント、マウス抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価のＦａｂ’、二価のＦａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ビス−ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ ＮＡＲ、ラクダ科抗体またはその結合フラグメント、二重特異性抗体またはその結合フラグメント、あるいはその化学修飾された誘導体を含む。
いくつかの例では、Ａは抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、マウス抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価のＦａｂ’、二価のＦａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ビス−ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定Ｆｖタンパク質（“ｄｓＦｖ”）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ ＮＡＲ、ラクダ科抗体またはその結合フラグメント、二重特異性抗体またはその結合フラグメント、あるいはその化学修飾された誘導体を含む。いくつかの例では、Ａはヒト化抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａはマウス抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａはキメラ抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａはモノクローナル抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａは一価のＦａｂ’である。いくつかの例では、Ａは二価のＦａｂ２である。いくつかの例では、Ａは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは二重特異性抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、二重特異性抗体は三機能性抗体または二重特異性のミニ抗体である。場合によっては、二重特異性抗体は三機能性抗体である。いくつかの例では、三機能性抗体は、２つの異なる抗原用の結合部位を含む完全長のモノクローナル抗体である。典型的な三機能性抗体は、カツマキソマブ（ＥｐＣＡＭとＣＤ３；Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａを標的とする）、エルツマキソマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＣＤ３を標的とする； Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ）、ｌｙｍｐｈｏｍｕｎ ＦＢＴＡ０５（ＣＤ２０／ＣＤ３を標的とする；Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ）、ＲＧ７２２１（ＲＯ５５２０９８５を標的とする；Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ／ＶＥＧＦ ２；Ｒｏｃｈｅ）、ＲＧ７５９７（Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ３を標的とする；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、ＭＭ１４１（ＩＧＦ１Ｒ／Ｈｅｒ３を標的とする；Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、ＡＢＴ１２２（ＴＮＦα／ＩＬ１７を標的とする；Ａｂｂｖｉｅ）、ＡＢＴ９８１（ＩＬ１α／ＩＬ１βを標的とする；Ａｂｂｏｔｔ）、ＬＹ３１６４５３０（Ｈｅｒ１／ｃＭＥＴを標的とする；Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、および、ＴＲＢＳ０７（Ｅｋｔｏｍａｂを標的とする；ＧＤ２／ＣＤ３；Ｔｒｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｍｂｈ）。さらなる典型的な三機能性抗体は、Ｆ−ｓｔａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＬｔｄからのｍＡｂ２を含む。いくつかの例では、Ａは二重特異性の三機能性抗体である。いくつかの実施形態において、Ａは以下から選択される二重特異性の三機能性抗体抗体である：カツマキソマブ（ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３を標的とする；Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ）、エルツマキソマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＣＤ３を標的とする； Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ）、ｌｙｍｐｈｏｍｕｎ ＦＢＴＡ０５（ＣＤ２０／ＣＤ３を標的とする；Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ）、ＲＧ７２２１（ＲＯ５５２０９８５を標的とする；Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ／ＶＥＧＦ ２；Ｒｏｃｈｅ）、ＲＧ７５９７（Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ３を標的とする；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、ＭＭ１４１（ＩＧＦ１Ｒ／Ｈｅｒ３を標的とする；Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、ＡＢＴ１２２（ＴＮＦα／ＩＬ１７を標的とする；Ａｂｂｖｉｅ）、ＡＢＴ９８１（ＩＬ１α／ＩＬ１βを標的とする；Ａｂｂｏｔｔ）、ＬＹ３１６４５３０（Ｈｅｒ１／ｃＭＥＴを標的とする；Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＴＲＢＳ０７（Ｅｋｔｏｍａｂを標的とする；ＧＤ２／ＣＤ３；Ｔｒｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｍｂｈ）および、Ｆ−ｓｔａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＬｔｄからのｍＡｂ２。
場合によっては、二重特異性抗体は二重特異性のミニ抗体である。いくつかの例では、二重特異性のミニ抗体は、二価のＦａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、トリアボディ、テトラボディ、または二重特異性Ｔ細胞結びつけ（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性Ｔ細胞結びつけは、２つのｓｃＦｖｓが２つの異なる抗原のエピトープを標的とする２つの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）を含む融合タンパク質である。典型的な二重特異性のミニ抗体としては、限定されないが、以下が挙げられる：ＤＡＲＴ（二重親和性再標的プラットフォーム； ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、ブリナツモマブ（ＭＴ１０３あるいはＡＭＧ１０３を標的とする；ＣＤ１９／ＣＤ３；Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）ＭＴ１１１（ＣＥＡ／ＣＤ３を標的とする；Ｍｉｃｒｏｍｅｔ／Ａｍｅｇｅｎ）、ＭＴ１１２（ＢＡＹ２０１０１１２を標的とする；ＰＳＭＡ／ＣＤ３；Ｍｉｃｒｏｍｅｔ／Ｂａｙｅｒ）、ＭＴ１１０（ＡＭＧ １１０を標的とする；ＥＰＣＡＭ／ＣＤ３； Ａｍｇｅｎ／Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、ＭＧＤ００６（ＣＤ１２３／ＣＤ３を標的とする；ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、ＭＧＤ００７（ＧＰＡ３３／ＣＤ３を標的とする；ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、ＢＩ１０３４０２０（β−アミロイド上の２つの様々なエピトープを標的とする；Ａｂｌｙｎｘ）、ＡＬＸ０７６１（ＩＬ１７Ａ／ＩＬ１７Ｆを標的とする；Ａｂｌｙｎｘ）、ＴＦ２（ＣＥＡ／ヘプテンを標的とする；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ＩＬ−１７／ＩＬ−３４ ｂｉＡｂ（ＢＭＳ）、ＡＦＭ１３（ＣＤ３０／ＣＤ１６を標的とする；Ａｆｆｉｍｅｄ）、ＡＦＭ１１（ＣＤ１９／ＣＤ３を標的とする；Ａｆｆｉｍｅｄ）、およびドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ／ＧＳＫからのｄＡｂｓ）。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは二重特異性のミニ抗体である。場合によっては、Ａは二重特異性のＦａｂ２である。いくつかの例では、Ａは二重特異性のＦ（ａｂ）’３フラグメントである。場合によっては、Ａは二重特異性のビス−ｓｃＦｖである。場合によっては、Ａは二重特異性の（ｓｃＦｖ）２である。いくつかの実施形態では、Ａは二重特異性のダイアボディである。いくつかの実施形態では、Ａは二重特異性のミニボディである。いくつかの実施形態では、Ａは二重特異性のトリアボディである。他の実施形態では、Ａは二重特異性のテトラボディである。他の実施形態では、Ａは二重特異性Ｔ細胞結びつけ（ＢｉＴＥ）である。さらなる実施形態において、Ａは以下から選択されるミニ抗体である：ＤＡＲＴ（二重親和性再標的プラットフォーム； ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、ブリナツモマブ（ＭＴ１０３あるいはＡＭＧ１０３を標的とする；ＣＤ１９／ＣＤ３；Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）ＭＴ１１１（ＣＥＡ／ＣＤ３を標的とする；Ｍｉｃｒｏｍｅｔ／Ａｍｅｇｅｎ）、ＭＴ１１２（ＢＡＹ２０１０１１２を標的とする；ＰＳＭＡ／ＣＤ３；Ｍｉｃｒｏｍｅｔ／Ｂａｙｅｒ）、ＭＴ１１０（ＡＭＧ １１０を標的とする；ＥＰＣＡＭ／ＣＤ３； Ａｍｇｅｎ／Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、ＭＧＤ００６（ＣＤ１２３／ＣＤ３を標的とする；ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、ＭＧＤ００７（ＧＰＡ３３／ＣＤ３を標的とする；ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、ＢＩ１０３４０２０（β−アミロイド上の２つの様々なエピトープを標的とする；Ａｂｌｙｎｘ）、ＡＬＸ０７６１（ＩＬ１７Ａ／ＩＬ１７Ｆを標的とする；Ａｂｌｙｎｘ）、ＴＦ２（ＣＥＡ／ヘプテンを標的とする；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ＩＬ−１７／ＩＬ−３４ ｂｉＡｂ（ＢＭＳ）、ＡＦＭ１３（ＣＤ３０／ＣＤ１６を標的とする；Ａｆｆｉｍｅｄ）、ＡＦＭ１１（ＣＤ１９／ＣＤ３を標的とする；Ａｆｆｉｍｅｄ）、およびドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ／ＧＳＫからのｄＡｂｓ）。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは三重特異性抗体である。いくつかの例では、三重特異性抗体は、Ｆ（ａｂ）’３フラグメントまたはトリアボディを含む。いくつかの例では、Ａは三重特異性Ｆ（ａｂ）’３フラグメントである。場合によっては、Ａはトリアボディである。いくつかの実施形態において、Ａは、Ｄｉｍａｓ、ｅｔ ａｌ．、“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｔａｒｇｅｔ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ，” Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、１２（９）：３４９０−３５０１（２０１５）に記載されるような三重特異性の抗体である。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは、細胞表面タンパク質を認識する抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、細胞表面タンパク質は癌細胞によって発現される抗原である。典型的な癌抗原としては、限定されないが、アルファフェトプロテイン、ＡＳＬＧ６５９、Ｂ７−Ｈ３、ＢＡＦＦ−Ｒ、ブレビカン、ＣＡ１２５（ＭＵＣ１６）、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ２４２、ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、テラトカルシノーマ由来の成長因子）、ＣＴＬＡ−４、ＣＸＣＲ５、Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５）、ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ホスファターゼアンカータンパク質１ａを含有するＳＨ２ドメイン）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）、上皮成長因子、ＥＴＢＲ、Ｆｃ受容体様タンパク質１（ＦＣＲＨ１）、ＧＥＤＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のベータサブユニット、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＩＣＯＳ、ＩＬ−２受容体、ＩＬ２０Ｒα、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２（ＩＲＴＡ２）、Ｌ６、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、Ｌｅｗｉｓ Ｘ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ１、メソテリン、ＭＤＰ、ＭＰＦ（ＳＭＲ、ＭＳＬＮ）、ＭＣＰ１（ＣＣＬ２）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＰＧ、ＭＳＧ７８３、ムチン、ＭＵＣ１−ＫＬＨ、Ｎａｐｉ３ｂ（ＳＬＣ３４Ａ２）、ネクチン−４、Ｎｅｕ癌遺伝子産物、ＮＣＡ、胎盤性アルカリホスファターゼ、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、前立腺性酸性ホスファターゼ、ＰＳＣＡ ｈｌｇ、ｐ９７、プリン受容体Ｐ２Ｘのリガンド開口型イオンチャネル５（Ｐ２Ｘ５）、ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ｇｐ１００、Ｐ２１、前立腺の６つの膜貫通性上皮抗原（ＳＴＥＡＰ１）、ＳＴＥＡＰ２、Ｓｅｍａ ５ｂ、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）、ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）などが挙げられる。
いくつかの例では、細胞表面タンパク質は、分化（ＣＤ）細胞表面マーカーのクラスターを含む。典型的なＣＤ細胞表面マーカーとしては、限定されないが、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７９（例えば、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ）、ＣＤ９０、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１２５（ＩＬ５ＲＡ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ２２１、ＣＤ２７４、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３１９（ＳＬＡＭＦ７）、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）などが挙げられる。
いくつかの例では、結合部分Ａは、癌抗原を認識する抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、結合部分Ａは、以下を認識する抗体または結合フラグメントである：アルファフェトプロテイン、ＡＳＬＧ６５９、Ｂ７−Ｈ３、ＢＡＦＦ−Ｒ、ブレビカン、ＣＡ１２５（ＭＵＣ１６）、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ２４２、ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、テラトカルシノーマ由来の成長因子）、ＣＴＬＡ−４、ＣＸＣＲ５、Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５）、ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ホスファターゼアンカータンパク質１ａを含有するＳＨ２ドメイン）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）、上皮成長因子、ＥＴＢＲ、Ｆｃ受容体様タンパク質１（ＦＣＲＨ１）、ＧＥＤＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のベータサブユニット、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＩＣＯＳ、ＩＬ−２受容体、ＩＬ２０Ｒα、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２（ＩＲＴＡ２）、Ｌ６、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、Ｌｅｗｉｓ Ｘ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ１、メソテリン、ＭＣＰ１（ＣＣＬ２）、ＭＤＰ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＰＦ（ＳＭＲ、ＭＳＬＮ）、ＭＰＧ、ＭＳＧ７８３、ムチン、ＭＵＣ１−ＫＬＨ、Ｎａｐｉ３ｂ（ＳＬＣ３４Ａ２）、ネクチン−４、Ｎｅｕ癌遺伝子産物、ＮＣＡ、胎盤性アルカリホスファターゼ、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、前立腺性酸性ホスファターゼ、ＰＳＣＡ ｈｌｇ、ｐ９７、プリン受容体Ｐ２Ｘのリガンド開口型イオンチャネル５（Ｐ２Ｘ５）、ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ｇｐ１００、Ｐ２１、前立腺の６つの膜貫通性上皮抗原（ＳＴＥＡＰ１）、ＳＴＥＡＰ２、Ｓｅｍａ ５ｂ、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）、ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）、あるいはこれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの例では、結合部分Ａは、ＣＤ細胞表面マーカーを認識する抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例の中で、結合部分Ａは、以下を認識する抗体またはその結合フラグメントである：ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７９（例えば、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ）、ＣＤ９０、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１２５（ＩＬ５ＲＡ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ２２１、ＣＤ２７４、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３１９（ＳＬＡＭＦ７）、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）、またはこれらの組み合わせ。
いくつかの実施形態において、抗体またはその結合フラグメントは、ザルツムマブ（ＨｕＭａｘ−ＥＦＧｒ、Ｇｅｎｍａｂ）、アバゴボマブ（Ｍｅｎａｒｉｎｉ）、アビツズマブ（Ｍｅｒｃｋ）、アデカツムマブ（ＭＴ２０１）、アラシズマブペゴール、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈ、あるいはＣａｍｐａｔｈー１Ｈ；Ｌｅｕｋｏｓｉｔｅ）、アロムン（ＡｌｌｏＭｕｎｅ）（ＢｉｏＴｒａｎｓｐｌａｎｔ）、アマツキシマブ（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ Ｉｎｃ．）、抗ＶＥＧＦ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）、アナツモマブマフェナトックス（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ ｍａｆｅｎａｔｏｘ）、アポリズマブ（ｈｕ１Ｄ１０）、アスクリンバクマブ（Ｐｆｉｚｅｒ社）、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、Ｂ４３．１３（ＯｖａＲｅｘ、ＡｌｔａＲｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ベリムマブ（Ｂｅｎｌｙｓｔａ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ、ＡＭＧ１０３；Ａｍｇｅｎ）、ＢＥＣ２（ＩｍＧｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、カルルマブ（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、カツマキソマブ（Ｒｅｍｏｖａｂ、Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ）、ＣＥＡｃｉｄｅ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、ＩｍＣｌｏｎｅ）、シタツズマブボガトクス（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ ｂｏｇａｔｏｘ）（ＶＢ６−８４５）、シズツムマブ（ＩＭＣ−Ａ１２、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）（ＡＭＧ ６５５、Ａｍｇｅｎ）、ダセツズマブ（ＳＧＮ−４０、ｈｕＳ２Ｃ６；Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）、ダラツムマブ（Ｄａｒｚａｌｅｘ（登録商標）、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、デツモマブ、ドロジツマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、デュルバルマブ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、デュシギツマブ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、エドレコロマブ（ＭＡｂ１７−１Ａ、Ｐａｎｏｒｅｘ、Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）、エロツズマブ（Ｅｍｐｌｉｃｉｔｉ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、エミベツズマブ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、エナバツズマブ（Ｆａｃｅｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．）、エンフォルツマブ ベドチン（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、エノビリツズマブ（ＭＧＡ２７１、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、エンシツクスマブ（ｅｎｓｉｔｕｘｕｍａｂ）（Ｎｅｏｇｅｎｉｘ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．）、エプラツズマブ（ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、エルツマキソマブ（Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）、Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ）、エタラシズマブ（Ａｂｅｇｒｉｎ、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ファーレツズマブ（ＭＯＲＡｂ−００３、Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ、Ｉｎｃ）、ＦＢＴＡ０５（Ｌｙｍｐｈｏｍｕｎ、Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ）、フィクラツズマブ（ＡＶＥＯ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、フィギツムマブ（ＣＰ−７５１８７１、Ｐｆｉｚｅｒ）、フランボツマブ（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、フレソリムマブ（ＧＣ１００８、Ａａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、フツキシマブ、グラキシマブ（ｇｌａｘｉｍａｂ）、ガニツマブ（Ａｍｇｅｎ）、ギレンツキシマブ（Ｒｅｎｃａｒｅｘ（登録商標）、Ｗｉｌｅｘ ＡＧ）、ＩＭＡＢ３６２（クローディキシマブ（Ｃｌａｕｄｉｘｉｍａｂ）、Ｇａｎｙｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡＧ）、イマルマブ（Ｂａｘａｌｔａ）、ＩＭＣ−１Ｃ１１（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＭＣ−Ｃ２２５（Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、イムガツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、インテツムマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｉｎｃ．）、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）、 Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ），イラツムマブ（Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｉｎｃ．）、イサツキシマブ（ＳＡＲ６５０９８４、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ラベツズマブ（ＣＥＡ−ＣＩＤＥ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、レクサツムマブ（ＥＴＲ２−ＳＴ０１、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、リンツズマブ（ＳＧＮ−３３、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ルカツムマブ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ルミリキシマブ、マパツズマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ１、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マツズマブ（ＥＭＤ ７２０００、Ｍｅｒｃｋ）、ミラツズマブ（ｈＬＬ１、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、ミツモマブ（ＢＥＣ−２、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ナルナツマブ（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ネシツムマブ（Ｐｏｒｔｒａｚｚａ（商標）、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ネスバクマブ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ニモツズマブ（ｈ−Ｒ３、ＢＩＯＭＡｂ ＥＧＦＲ、ＴｈｅｒａＣＩＭ、Ｔｈｅｒａｌｏｃ、またはＣＩＭＡｈｅｒ； Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．），ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、オビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ ｏｒ Ｇａｚｙｖａｒｏ； Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）、オカラツズマブ（ＡＭＥ−１３３ｖ、ＬＹ２４６９２９８；Ｍｅｎｔｒｉｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＬＬＣ）、オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標）、Ｇｅｎｍａｂ）、オナルツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、オンツキシズマブ（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ、Ｉｎｃ．）、オレゴボマブ（ＯｖａＲｅｘ（登録商標）、ＡｌｔａＲｅｘ Ｃｏｒｐ．）、オトレルツズマブ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）、パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ、Ａｍｇｅｎ）、パンコマブ（ｐａｎｋｏｍａｂ）（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧＭＢＨ）、パルサツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、パトリツマブ、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ）、ペムツモマブ（Ｔｈｅｒａｇｙｎ、Ａｎｔｉｓｏｍａ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ），ピディリズマブ（ＣＴ−０１１、Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）、ポラツズマブベドチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、プリツムマブ、ラコツモマブ（Ｖａｘｉｒａ（登録商標）、Ｒｅｃｏｍｂｉｏ）、ラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ（登録商標）、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ロバツムマブ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）、セリバンツマブ（Ｓａｎｏｆｉ／Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）、シブロツマブ、シルツキシマブ（Ｓｙｌｖａｎｔ（商標）、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｓｍａｒｔ ＭＩ９５（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ、Ｉｎｃ．）、Ｓｍａｒｔ ＩＤ１０（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．），タバルマブ（ＬＹ２１２７３９９、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、プリツモマブパプトックス、テナツモマブ、テプロツムマブ（Ｒｏｃｈｅ）、テツロマブ、ＴＧＮ１４１２（ＣＤ２８−ＳｕｐｅｒＭＡＢまたはＴＡＢ０８）、ティガツズマブ（ＣＤ−１００８、Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ）、トシツモマブ、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、トレメリムマブ（ＣＰ−６７２，２０６； Ｐｆｉｚｅｒ）、ツコツズマブセルモロイキン（ＥＭＤ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ウブリツキシマブ、ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ボロシキシマブ（Ｍ２００、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、ザツキシマブなどを含む。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは、ザルツムマブ（ＨｕＭａｘ−ＥＦＧｒ、Ｇｅｎｍａｂ）、アバゴボマブ（Ｍｅｎａｒｉｎｉ）、アビツズマブ（Ｍｅｒｃｋ）、アデカツムマブ（ＭＴ２０１）、アラシズマブペゴール、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈ、あるいはＣａｍｐａｔｈー１Ｈ；Ｌｅｕｋｏｓｉｔｅ）、アロムン（ＡｌｌｏＭｕｎｅ）（ＢｉｏＴｒａｎｓｐｌａｎｔ）、アマツキシマブ（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ Ｉｎｃ．）、抗ＶＥＧＦ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）、アナツモマブマフェナトックス（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ ｍａｆｅｎａｔｏｘ）、アポリズマブ（ｈｕ１Ｄ１０）、アスクリンバクマブ（Ｐｆｉｚｅｒ社）、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、Ｂ４３．１３（ＯｖａＲｅｘ、ＡｌｔａＲｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ベリムマブ（Ｂｅｎｌｙｓｔａ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ、ＡＭＧ１０３；Ａｍｇｅｎ）、ＢＥＣ２（ＩｍＧｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、カルルマブ（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、カツマキソマブ（Ｒｅｍｏｖａｂ、Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ）、ＣＥＡｃｉｄｅ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、ＩｍＣｌｏｎｅ）、シタツズマブボガトクス（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ ｂｏｇａｔｏｘ）（ＶＢ６−８４５）、シズツムマブ（ＩＭＣ−Ａ１２、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）（ＡＭＧ ６５５、Ａｍｇｅｎ）、ダセツズマブ（ＳＧＮ−４０、ｈｕＳ２Ｃ６；Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、ダラツムマブ（Ｄａｒｚａｌｅｘ（登録商標）， Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、デツモマブ、ドロジツマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、デュルバルマブ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、デュシギツマブ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、エドレコロマブ（ＭＡｂ１７−１Ａ， Ｐａｎｏｒｅｘ， Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）、エロツズマブ（Ｅｍｐｌｉｃｉｔｉ（商標）， Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、エミベツズマブ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、エナバツズマブ（Ｆａｃｅｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．）、エンフォルツマブ ベドチン（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、エノビリツズマブ（ＭＧＡ２７１， ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、エンシツクスマブ（ｅｎｓｉｔｕｘｕｍａｂ）（Ｎｅｏｇｅｎｉｘ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）， エプラツズマブ（ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ， Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．）， エルツマキソマブ（Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）、Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ）、エタラシズマブ（Ａｂｅｇｒｉｎ、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ファーレツズマブ（ＭＯＲＡｂ−００３、Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ、Ｉｎｃ）、ＦＢＴＡ０５（Ｌｙｍｐｈｏｍｕｎ、Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ）、フィクラツズマブ（ＡＶＥＯ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、フィギツムマブ（ＣＰ−７５１８７１、Ｐｆｉｚｅｒ）、フランボツマブ（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、フレソリムマブ（ＧＣ１００８、Ａａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、フツキシマブ、グラキシマブ（ｇｌａｘｉｍａｂ）、ガニツマブ（Ａｍｇｅｎ）、ギレンツキシマブ（Ｒｅｎｃａｒｅｘ（登録商標）、Ｗｉｌｅｘ ＡＧ）、ＩＭＡＢ３６２（クローディキシマブ（Ｃｌａｕｄｉｘｉｍａｂ）、Ｇａｎｙｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡＧ）、イマルマブ（Ｂａｘａｌｔａ）、ＩＭＣ−１Ｃ１１（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＭＣ−Ｃ２２５（Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、イムガツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、インテツムマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｉｎｃ．）、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）、 Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ），イラツムマブ（Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｉｎｃ．）、イサツキシマブ（ＳＡＲ６５０９８４、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ラベツズマブ（ＣＥＡ−ＣＩＤＥ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、レクサツムマブ（ＥＴＲ２−ＳＴ０１、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、リンツズマブ（ＳＧＮ−３３、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ルカツムマブ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ルミリキシマブ、マパツズマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ１、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マツズマブ（ＥＭＤ ７２０００、Ｍｅｒｃｋ）、ミラツズマブ（ｈＬＬ１、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、ミツモマブ（ＢＥＣ−２、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ナルナツマブ（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ネシツムマブ（Ｐｏｒｔｒａｚｚａ（商標）、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ネスバクマブ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ニモツズマブ（ｈ−Ｒ３、ＢＩＯＭＡｂ ＥＧＦＲ、ＴｈｅｒａＣＩＭ、Ｔｈｅｒａｌｏｃ、またはＣＩＭＡｈｅｒ； Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．），ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、オビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ ｏｒ Ｇａｚｙｖａｒｏ； Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）、オカラツズマブ（ＡＭＥ−１３３ｖ、ＬＹ２４６９２９８；Ｍｅｎｔｒｉｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＬＬＣ）、オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標）、Ｇｅｎｍａｂ）、オナルツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、オンツキシズマブ（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ、Ｉｎｃ．）、オレゴボマブ（ＯｖａＲｅｘ（登録商標）、ＡｌｔａＲｅｘ Ｃｏｒｐ．）、オトレルツズマブ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）、パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ、Ａｍｇｅｎ）、パンコマブ（ｐａｎｋｏｍａｂ）（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧＭＢＨ）、パルサツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、パトリツマブ、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ）、ペムツモマブ（Ｔｈｅｒａｇｙｎ、Ａｎｔｉｓｏｍａ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ），ピディリズマブ（ＣＴ−０１１、Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）、ポラツズマブベドチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、プリツムマブ、ラコツモマブ（Ｖａｘｉｒａ（登録商標）、Ｒｅｃｏｍｂｉｏ）、ラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ（登録商標）、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ロバツムマブ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）、セリバンツマブ（Ｓａｎｏｆｉ／Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）、シブロツマブ、シルツキシマブ（Ｓｙｌｖａｎｔ（商標）、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｓｍａｒｔ ＭＩ９５（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ、Ｉｎｃ．）、Ｓｍａｒｔ ＩＤ１０（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．），タバルマブ（ＬＹ２１２７３９９、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、プリツモマブパプトックス、テナツモマブ、テプロツムマブ（Ｒｏｃｈｅ）、テツロマブ、ＴＧＮ１４１２（ＣＤ２８−ＳｕｐｅｒＭＡＢまたはＴＡＢ０８）、ティガツズマブ（ＣＤ−１００８、Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ）、トシツモマブ、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、トレメリムマブ（ＣＰ−６７２，２０６；Ｐｆｉｚｅｒ）、ツコツズマブセルモロイキン（ＥＭＤ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ウブリツキシマブ、ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ボロシキシマブ（Ｍ２００、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、またはザツキシマブを含む。いくつかの実施形態において、結合部分Ａはザルツムマブ（ＧｅｎｍａｂによるＨｕＭａｘ−ＥＦＧｒ）である。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは式（Ｉ）に従って、ポリ核酸分子（Ｂ）とポリマー（Ｃ）に、および、随意に本明細書に記載される式（ＩＩ）に従ってエンドソーム溶解性部分（Ｄ）に抱合する。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、表２、３、５，６、７、９、または１１で列挙された配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５、４５２−１９５５、１９５６−１９６２、１９６７−２００２、２０１３−２０３２、２０８２−２１０９、または２１１７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５、４５２−１９５５、１９５６−１９６２、１９６７−２００２、２０１３−２０３２、２０８２−２１０９、または２１１７から選択される配列を含む。いくつかの例では、ポリマーＣはポリアルキルエンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）を含む。いくつかの実施形態において、エンドソーム溶解性部分Ｄは、ＩＮＦ７またはメリチン、あるいはそれぞれの誘導体を含む。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは、ポリ核酸分子（Ｂ）とポリマー（Ｃ）に、および、随意に、図１で例証されるようなエンドソーム溶解性部分（Ｄ）に抱合する。いくつかの例では、結合部分Ａは抗体またはその結合フラグメントである。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは、ポリ核酸分子（Ｂ）に非特異的に抱合する。いくつかの例では、結合部分Ａは、非部位特異的な手法でリシン残基またはシステイン残基によってポリ核酸分子（Ｂ）に抱合する。いくつかの例では、結合部分Ａは非部位特異的な手法でリシン残基によってポリ核酸分子（Ｂ）に抱合する。場合によっては、結合部分Ａは非部位特異的な手法でシステイン残基によってポリ核酸分子（Ｂ）に抱合する。いくつかの例では、結合部分Ａは抗体またはその結合フラグメントである。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは部位特異的な手法でポリ核酸分子（Ｂ）に抱合する。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的な手法を介して、リシン残基、システイン残基によって、５’−末端、３’−末端、非天然アミノ酸、あるいは酵素修飾または酵素触媒された残基で、ポリ核酸分子（Ｂ）に抱合する。いくつかの例では、結合部分Ａは部位特異的な手法でリシン残基によってポリ核酸分子（Ｂ）に抱合する。いくつかの例では、結合部分Ａは部位特異的な手法でシステイン残基によってポリ核酸分子（Ｂ）に抱合する。いくつかの例では、結合部分Ａは部位特異的な手法で５’−末端でポリ核酸分子（Ｂ）に抱合する。いくつかの例では、結合部分Ａは部位特異的な手法で３’−末端でポリ核酸分子（Ｂ）に抱合する。いくつかの例では、結合部分Ａは部位特異的な手法で非天然アミノ酸によってポリ核酸分子（Ｂ）に抱合する。いくつかの例では、結合部分Ａは部位特異的な手法で酵素修飾または酵素触媒された残基によってポリ核酸分子（Ｂ）に抱合する。いくつかの例では、結合部分Ａは抗体またはその結合フラグメントである。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａ（例えば、抗体またはその結合フラグメント）の１つ以上の領域は、ポリ核酸分子（Ｂ）に抱合する。いくつかの例では、結合部分Ａの１つ以上の領域は、結合部分Ａの定常領域、ヒンジ領域、あるいはＦｃ領域で、Ｎ末端、Ｃ末端を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）は、結合部分ＡのＮ末端（例えば、抗体またはその結合フラグメントのＮ末端）に抱合する。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）は、結合部分ＡのＣ末端（例えば、抗体またはその結合フラグメントのＮ末端）に抱合する。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）は、結合部分Ａの定常領域（例えば、抗体またはその結合フラグメントの定常領域）に抱合する。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）は、結合部分Ａのヒンジ領域（例えば、抗体またはその結合フラグメントの定常領域）に抱合する。いくつかの例では、ポリ核酸分子（Ｂ）は、結合部分ＡのＦｃ領域（例えば、抗体またはその結合フラグメントの定常領域）に抱合する。
いくつかの実施形態において、１つ以上のポリ核酸分子（Ｂ）は結合部分Ａに抱合する。いくつかの例では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはそれ以上のポリ核酸分子は、１つの結合部分Ａに抱合する。いくつかの例では、約１つのポリ核酸分子は１つの結合部分Ａに抱合する。いくつかの例では、約２つのポリ核酸分子は１つの結合部分Ａに抱合する。いくつかの例では、約３つのポリ核酸分子は１つの結合部分Ａに抱合する。いくつかの例では、約４つのポリ核酸分子は１つの結合部分Ａに抱合する。いくつかの例では、約５つのポリ核酸分子は１つの結合部分Ａに抱合する。いくつかの例では、約６つのポリ核酸分子は１つの結合部分Ａに抱合する。いくつかの例では、約７つのポリ核酸分子は１つの結合部分Ａに抱合する。いくつかの例では、約８つのポリ核酸分子は１つの結合部分Ａに抱合する。いくつかの例では、約９つのポリ核酸分子は１つの結合部分Ａに抱合する。いくつかの例では、約１０のポリ核酸分子は１つの結合部分Ａに抱合する。いくつかの例では、約１１のポリ核酸分子は１つの結合部分Ａに抱合する。いくつかの例では、約１２のポリ核酸分子は１つの結合部分Ａに抱合する。いくつかの例では、約１３のポリ核酸分子は１つの結合部分Ａに抱合する。いくつかの例では、約１４のポリ核酸分子は１つの結合部分Ａに抱合する。いくつかの例では、約１５のポリ核酸分子は１つの結合部分Ａに抱合する。いくつかの例では、約１６のポリ核酸分子は１つの結合部分Ａに抱合する。場合によっては、１つ以上のポリ核酸分子は同じである。他の場合では、１つ以上のポリ核酸分子が異なる。いくつかの例では、結合部分Ａは抗体またはその結合フラグメントである。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａ（例えば、抗体またはその結合フラグメント）に抱合したポリ核酸分子（Ｂ）の数は、ある比率を形成する。いくつかの例では、比率はＤＡＲ（薬物対抗体）比率と呼ばれ、本明細書に引用されるような薬物はポリ核酸分子である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、あるいはそれよりも大きい。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約２以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約３以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約４以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約５以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約６以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約７以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約８以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約９以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１０以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１１以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１２以上である。
いくつかの例では、結合部分Ａ（例えば、抗体またはその結合フラグメント）に対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約２である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約３である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約４である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約５である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約６である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約７である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約８である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約９である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１０である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１１である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１２である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１３である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１４である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１５である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１６である。
いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は１である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は２である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は４である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は６である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は８である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は１２である。
いくつかの実施形態において、抗体またはその結合フラグメントはさらに、例えば、当該技術分野で知られている従来技術、例えば、アミノ酸欠失、挿入、置換、追加によって、および／または、組み換えによって、および／または、他の修飾（例えば、グリコシル化やリン酸化などの翻訳後および化学修飾）を、単独でまたは組み合わせて使用して修飾される。いくつかの例では、修飾は、Ｆｃ受容体との相互作用を調節するための修飾をさらに含む。いくつかの例では、１つ以上の修飾は、例えば、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与するアミノ酸残基を開示している国際公開第ＷＯ９７／３４６３１に記載されるものを含る。抗体またはその結合フラグメントのアミノ酸配列の基礎となる核酸配列にこのような修飾を導入する方法は、当業者には周知である。
いくつかの例では、抗体結合フラグメントはさらにその誘導体を包含し、少なくとも１つのＣＤＲを含有するポリペプチド配列を含む。
いくつかの例では、本明細書で使用されるような用語「単鎖」は、二重特異性の単鎖構築物の第１と第２のドメインが、好ましくは、単一の核酸分子によってコード可能な共に直線状のアミノ酸配列の形態で共有結合されることを意味する。
いくつかの例では、二重特異性の単鎖抗体構築物は、２つの抗体由来の結合ドメインを含む構築物に関する。そのような実施形態では、二重特異性の単鎖抗体構築物は、タンデムｂｉーｓｃＦｖあるいはダイアボディである。いくつかの例では、ｓｃＦｖは、リンカーペプチドによって結合されたＶＨとＶＬのドメインを含む。いくつかの例では、リンカーは、第１と第２のドメインの各々が、互いから独立して、それらの異なる結合特異性を確実に保持することができるのに十分な長さと配列である。
いくつかの実施形態において、本明細書で使用されるような結合または相互作用は、互いに対して少なくとも２つの抗原相互作用部位の結合／相互作用を定義する。いくつかの例では、抗原相互作用部位は、特異的な抗原または抗原の特異的な群との特異的な相互作用の能力を示すポリペプチドのモチーフを定義する。場合によっては、結合／相互作用はさらに、特異的な認識を定義するとも理解される。このような場合、特異的な認識は、抗体またはその結合フラグメントが標的分子の各々の少なくとも２つのアミノ酸に特異的に相互作用および／または結合することができることを指す。例えば、特異的認識は、抗体分子の特異性に関するか、あるいは標的分子の特異的領域を区別するその能力に関する。さらなる例では、特異性抗原を備えた抗原相互作用部位の特異的な相互作用は、例えば、抗原の立体構造の変化、抗原のオリゴマー化などの誘発により、シグナルの開始をもたらす。さらなる実施形態では、結合は「キーとロックの原則（ｋｅｙ−ｌｏｃｋ−ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）」の特異性によって例証される。したがって、いくつかの例では、抗原相互作用部位と抗原のアミノ酸配列中の特定のモチーフは、上記の構造の第２の修飾の結果と同様に、その第１、第２、または第３の構造の結果として互いに結合する。そのような場合、抗原に対する部位の単純な結合と同様に、特異性抗原による抗原相互作用部位の特異的な相互作用がもたらされる。
いくつかの例では、特定の相互作用は、さらに抗体またはその結合フラグメントの還元された交差反応性あるいは還元されたオフターゲット効果を指す。例えば、興味のあるポリペプチド／タンパク質に結合する抗体またはその結合フラグメント、しかし行う、ない、あるいは本質的に他のポリペプチドのうちのどれにも結合しない、興味のあるポリペプチド／タンパク質には特定のものとして考慮される。特異性抗原による抗原相互作用部位の特異的な相互作用の例は、受容体に対するリガンドの特異性、例えば、抗体の抗原結合部位との抗原決定基群（エピトープ）の相互作用を含む。さらなる結合部分
いくつかの実施形態において、結合部分は血漿タンパク質である。いくつかの例では、血漿タンパク質はアルブミンを含む。いくつかの例では、結合部分Ａはアルブミンである。いくつかの例では、アルブミンは、本明細書に記載される抱合化学の１つ以上によってポリ核酸分子に抱合する。いくつかの例では、アルブミンは、天然のライゲーション化学検査によってポリ核酸分子に抱合する。いくつかの例では、アルブミンはリジン抱合によってポリ核酸分子に抱合する。
いくつかの例では、結合部分はステロイドである。典型的なステロイドは、コレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール、脂肪酸（例えば、飽和されるか、不飽和であり、あるいは置換を含む炭化水素、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、ステロイドはコレステロールである。いくつかの例では、結合部分はコレステロールである。いくつかの例では、コレステロールは、本明細書に記載される抱合化学の１つ以上によってポリ核酸分子に抱合される。いくつかの例では、コレステロールは、天然のライゲーション化学検査によってポリ核酸分子に抱合する。いくつかの例では、コレステロールはリジン抱合によってポリ核酸分子に抱合する。
いくつかの例では、結合部分は、限定されないが、細胞上の比表面積マーカーに結合するポリ核酸分子アプタマーを含むポリマーである。この例では、結合部分は、標的遺伝子またはｍＲＮＡにハイブリダイズしないが、その代りに、同様に細胞表面マーカーのその特定のエピトープに結合する抗体と同じように細胞表面マーカーに選択的に結合することができるポリ核酸である。
場合によっては、結合部分はペプチドである。場合によっては、ペプチドは約１〜約３ｋＤａである。場合によっては、ペプチドは約１．２〜約２．８ｋＤａ、約１．５〜約２．５ｋＤａ、あるいは約１．５〜２ｋＤａを含む。いくつかの例では、ペプチドは二環式のペプチドである。場合によっては、二環式のペプチドは制限された二環式のペプチドである。いくつかの例では、結合部分は二環式のペプチド（例えば、Ｂｉｃｙｃｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからの二環）である。
さらなる例では、結合部分は小分子である。いくつかの例では、小分子は抗体を補充する小分子である。場合によっては、抗体を補充する小分子は、標的結合末端と抗体結合末端を含み、標的結合末端は細胞表面受容体を認識して相互作用する対話することができる。例えば、いくつかの例では、グルタミン酸塩尿素化合物を含む標的結合末端は、ＰＳＭＡとの相互作用を可能にし、それにより、ＰＳＭＡを発現する細胞（例えば癌細胞）との抗体相互作用を増強する。いくつかの例では、結合部分はＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｒｅｍｏｔｅ ａｒｅｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，” Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． １３２（３６）： １２７１１−１２７１６ （２０１０）； ｏｒ ＭｃＥｎａｎｅｙ， ｅｔ ａｌ．， “Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ： ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ｅｎｇａｇｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ，”ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ７（７）： １１３９−１１５１ （２０１２）に記載される小分子である。抗体またはその結合フラグメントの産生
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、抗体とその結合フラグメント）は、とりわけ、化学合成または組み換え発現によってポリペプチド（例えば、抗体）の合成に役立つことが当該技術分野で知られている任意の方法を使用して生成され、好ましくは組み換え発現技術によって生成される。
いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントは組み換えで発現され、および、抗体またはその結合フラグメントをコードする核酸は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２に記載されるような）から組み立てられ、これは、抗体をコードする配列の一部を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成と、このオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションと、その後の、ＰＣＲによるライゲートされたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。
代替的に、抗体をコードする核酸分子は、配列の３’と５’の末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、あるいは特別な遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローン化によって、適切なソース（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、あるいは免疫グロブリンを発現する任意の組織あるいは細胞から生成されたｃＤＮＡライブラリー）から随意に生成される。
いくつかの例では、抗体またはその結合は、ポリクローナル抗体を生成するためにウサギなどの動物を免疫化することにより、あるいはより好ましくは、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７） に記載されるように、または、Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ． （１９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）、あるいはＣｏｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９８５ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６）により記載されるように、モノクローナル抗体を生成することにより、随意に生成される。代替的に、抗体の少なくともＦａｂ部分をコードするクローンは、特異的な抗原を結合するＦＡｂフラグメントのクローンのためのＦａｂ発現ライブラリー（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１に記載されるように）をスクリーニングすることにより、あるいは抗体ライブラリー（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４； Ｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：４９３７を参照）をスクリーニングすることにより、随意に得られる。
いくつかの実施形態において、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることにより、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：８５１−８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４）が使用される。キメラ抗体は、様々な部分が、マウスのモノクローナル抗体とヒト免疫グロブリン定常領域（例えばヒト化抗体）に由来する可変領域を有するものなどの様々な動物種に由来する分子である。
いくつかの実施形態において、単鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第４，６９４，７７８；Ｂｉｒｄ， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２； Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３； ａｎｄ Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５４）は、単鎖抗体を産生するのに適している。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントを結合することにより形成され、単鎖ポリペプチドをもたらす。大腸菌における機能的なＦｖフラグメントのアセンブリのための技術も随意に使用される（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１）。
いくつかの実施形態において、抗体のヌクレオチド配列を含む発現ベクター、あるいは抗体のヌクレオチド配列は、従来の技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈澱反応）によって宿主細胞に移され、トランスフェクトされた細胞はその後、抗体を産生するために従来の技術によって培養される。特定の実施形態では、抗体の発現は構成的で、誘導可能で、あるいは組織に特異的なプロモーターによって調節される。
いくつかの実施形態において、様々な宿主発現ベクターシステムは、本明細書に記載される抗体またはその結合フラグメントを発現するために利用される。このような宿主発現系は、抗体のコード配列を生成し、その後精製するビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列で変形されるか、またはトランスフェクトされるとき、抗体またはその結合フラグメントをインサイツで発現する細胞を表す。これらは、限定されないが、などの微生物、抗体またはその結合フラグメントコード配列を含む、組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、あるいはコスミドＤＮＡ発現ベクターで変形された細菌（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ とＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体またはその結合フラグメントコード配列を含む組み換え酵母発現ベクターで変形された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｉｃｈｉａ）；抗体またはその結合フラグメントコード配列を含む組み替えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウィルス）に感染した昆虫細胞系；抗体またはその結合フラグメントコード配列を含み、組み替えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）とタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染したか、あるいは組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で変形された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞（例えばメタロチオネインプロモーター）のゲノムに、あるいは哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含有する組み換え発現構築物を抱える哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）を含む。
組換えタンパク質の長期間の高収率の産生のために、安定した発現が好ましい。いくつかの例では、抗体を安定して発現する細胞株は随意に操作される。ウイルスの複製開始点を含有する発現ベクターを使用するよりもむしろ、ホスト細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されたＤＮＡと選択可能なマーカーで変形される。外来ＤＮＡの導入後に、操作した細胞を富化培地１−２日間成長させ、その後、選択培地に切り替えた。組換えプラスミドの選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞がプラスミドをその染色体へ安定的に組み入れるようにさせ、細胞を成長させて病巣を形成し、その後、これをクローン化して細胞株へと広げる。この方法は、抗体またはその結合フラグメントを発現する細胞株を操作するために有利に使用可能である。
いくつかの例では、多くの選択システムが用いられ、限定されないが、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７７， Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ， １９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８：２０２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：８１７）遺伝子を含み、これらはそれぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔｔｋ細胞、あるいはａｐｒｔ細胞で採用される。さらに、以下の遺伝子について選定基準として代謝拮抗薬の耐性が使用される：メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５７； Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１５２７）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５； Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， １９９１， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５； Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ， １９９３， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３２：５７３−５９６； Ｍｕｌｌｉｇａｎ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２； ａｎｄ Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ， １９９３， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７； Ｍａｙ， １９９３， ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５）。および、ヒグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｇｅｎｅ ３０：１４７）。使用することができる組み換えＤＮＡ技術の当該技術分野で共通して知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．， １９９３， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ； Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ； ａｎｄ ｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３， Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ）， １９９４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ．； Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１）において記載される。
いくつかの例では、抗体の発現レベルはベクター増幅によって増加する（検討のために、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ， Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｖｏｌ． ３． （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）を参照）。抗体を発現するベクターシステム中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増大は、マーカー遺伝子のコピーの数を増加させる。増幅された領域が抗体のヌクレオチド配列に関係しているので、抗体の産生はさらに増加する（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２５７）。
いくつかの例では、抗体の精製に関して当該技術分野で知られているあらゆる方法が、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、とりわけ、プロテインＡの後の特異的な抗原に対する親和性、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、異なる溶解性、あるいはタンパク質の精製のための他の標準的な技術によって使用される。
ポリマー抱合部分
いくつかの実施形態において、ポリマー部分Ｃはさらに、本明細書に記載されるポリ核酸分子に、本明細書に記載される結合部分に、あるいはこれらの組み合わせで抱合する。いくつかの例では、ポリマー部分Ｃはポリ核酸分子に抱合する。場合によっては、ポリマー部分Ｃは結合部分に抱合する。他の場合には、ポリマー部分Ｃはポリ核酸分子−結合部分分子に抱合する。さらなる場合には、図１に例証されるように、および治療分子プラットフォームの段落で議論されるように、ポリマー部分Ｃは抱合する。
いくつかの例では、ポリマー部分Ｃは天然または合成のポリマーであり、分枝または非分枝のモノマーの長鎖、および／あるいは２次元または３次元のモノマーの架橋ネットワークからなる。いくつかの例では、ポリマー部分Ｃは、多糖類、リグニン、ゴム、あるいはポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）を含んでいる。いくつかの例では、少なくとも１つのポリマー部分Ｃは、限定されないが、アルファ−、オメガ−ジヒドロキシルポリエチレングリコール、生物分解性ラクトンベースポリマー、例えば、ポリアクリル酸、ポリラクチド酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリシアノアクリレート、ポリイミド、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ、ＰＥＴＧ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＥ）、ポリテトラメチレングリコール（ＰＴＧ）、またはポリウレタン、同様にこれらの混合物を含む。本明細書で使用されるように、混合物は、ブロックコポリマーに関してと同様に、同じ化合物内の様々なポリマーの使用を指す。場合によっては、ブロックコポリマーは、ポリマーの少なくとも１つの部分が別のポリマーのモノマーから作られている、ポリマーである。いくつかの例では、ポリマー部分Ｃはポリアルキレンオキシドを含む。いくつかの例では、ポリマー部分ＣはＰＥＧを含む。いくつかの例では、ポリマー部分Ｃはポリエチレンイミド（ＰＥＩ）またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む。
いくつかの例では、ＣはＰＥＧ部分である。いくつかの例では、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の５’末端で抱合するが、結合部分はポリ核酸分子の３’末端で抱合する。いくつかの例では、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の３’末端で抱合するが、結合部分はポリ核酸分子の５’末端で抱合する。いくつかの例では、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の内部部位へ抱合する。いくつかの例では、ＰＥＧ部分、結合部分、あるいはこれらの組み合わせは、ポリ核酸分子の内部部位に抱合する。いくつかの例では、抱合は直接抱合である。いくつかの例では、抱合が天然のライゲーションを介する。
いくつかの実施形態において、ポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ）は、多分散または単分散の化合物である。いくつかの例では、多分散材料は、平均重量（重量平均）サイズと分散度を特徴として、材料の様々な分子量の分散分布を含む。いくつかの例では、単分散のＰＥＧは、１つのサイズの分子を含む。いくつかの実施形態において、Ｃは多分散または単分散のポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ）であり、示された分子量は、ポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ）分子の分子量の平均を表す。
いくつかの実施形態において、ポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ）の分子量は、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、または、１００，０００ Ｄａである。
いくつかの実施形態において、Ｃはポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ）であり、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、または、１００，０００ Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ＣはＰＥＧであり、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、または、１００，０００ Ｄａの分子量を有する。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約７００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約８００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約９００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１１００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１２００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１３００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１４００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１４５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１７００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１８００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１９００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２１００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２２００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２３００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２４００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２７００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２８００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２９００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３２５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３３５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３７５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４２５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４７５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約７０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約７５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約８０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１２，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３５，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１００，０００Ｄａである。
いくつかの実施形態において、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）は、分散型のＰＥＧであり、分散型のＰＥＧは１つを超える繰り返しエチレンオキシド単位を含むポリマーＰＥＧである。いくつかの例では、分散型のＰＥＧ（ｄＰＥＧ）は、２〜６０、２〜５０、あるいは２〜４８の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４２、４８、または５０以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２つ以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約３つ以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約４つ以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約５つ以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約６つ以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約７つ以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約８つ以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約９つ以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１０以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１１以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１２以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１３以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１４以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１５以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１６以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１７以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１８以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１９以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２０以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２２以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２４以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２６以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２８以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約３０以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約３５以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約４０以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約４２以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約４８以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約５０以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。場合によっては、ｄＰＥＧは、段階的な方法で純粋な（例えば、約９５％、９８％、９９％、あるいは９９．５％）出発材料から単一の分子量化合物として合成される。場合によっては、ｄＰＥＧは、平均分子量ではなく特定の分子量を有する。場合によっては、本明細書に記載されるｄＰＥＧは、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ， ＬＭＤからのｄＰＥＧである。
いくつかの実施形態において、ポリマー部分Ｃはカチオンムチン酸ベースのポリマー（ｃＭＡＰ）を含む。いくつかの例では、ｃＭＰＡは少なくとも１つの繰り返しサブユニットの１つ以上のサブユニットを含み、サブユット構造は式（ＩＩＩ）として表される：
ここで、ｍは独立して、各出現時に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、好ましくは４−６または５であり、および、ｎは独立して、各出現時に、１、２、３、４、または５である。いくつかの実施形態において、ｍとｎは、例えば、１０である。
いくつかの例では、ｃＭＡＰはさらにＰＥＧ部分に抱合し、ｃＭＡＰ−ＰＥＧコポリマー、ｍＰＥＧ−ｃＭＡＰ−ＰＥＧｍトリブロックポリマー、あるいはｃＭＡＰ−ＰＥＧ−ｃＭＡＰトリブロックポリマーを生成する。いくつかの例では、ＰＥＧ部分は、約５００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａまでの範囲である。いくつかの例では、ＰＥＧ部分は、約５００Ｄａ〜約１０００Ｄａ、約１０００Ｄａ〜約５０００Ｄａ以上、約５０００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａ以上、約１０，０００Ｄａ〜約２５，０００Ｄａ以上、約２５，０００〜約５０，０００Ｄａ以上、あるいは、これらの範囲の２つ以上の任意の組み合わせの範囲である。
いくつかの例では、ポリマー部分ＣはｃＭＡＰ−ＰＥＧコポリマー、ｍＰＥＧ−ｃＭＡＰ−ＰＥＧｍトリブロックポリマー、あるいはｃＭＡＰ−ＰＥＧ−ｃＭＡＰトリブロックポリマーである。場合によっては、ポリマー部分ＣはｃＭＡＰ−ＰＥＧコポリマーである。他の場合には、ポリマー部分ＣはｍＰＥＧ−ｃＭＡＰ−ＰＥＧｍトリブロックポリマーである。さらなる場合には、ポリマー部分ＣはｃＭＡＰ−ＰＥＧ−ｃＭＡＰトリブロックポリマーである。
いくつかの実施形態において、ポリマー部分Ｃは、図１で例証されるように、ポリ核酸分子、結合部分、および随意にエンドソーム溶解性部分に抱合する。
エンドソーム溶解性部分
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）：Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃの分子はさらに、追加の抱合部分を含む。いくつかの例では、追加の抱合部分はエンドソーム溶解性部分である。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム、リソソーム、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、微小管、ペルオキシソーム、あるいは細胞を含む他の小胞性本体などの当該技術分野で知られている細胞区画のいずれかから放出することができる化合物などの細胞区画の放出成分である。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム溶解性ポリペプチド、エンドソーム溶解性ポリマー、エンドソーム溶解性脂質、あるいはエンドソーム溶解性小分子を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性ポリペプチドを含む。他の場合には、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性ポリマーを含む。
エンドソーム溶解性ポリペプチド
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）：Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃの分子はさらに、エンドソーム溶解性ポリペプチドと抱合する。場合によっては、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ｐＨ依存性の膜活性なペプチドである。場合によっては、エンドソーム溶解性ポリペプチドは両親媒性ポリペプチドである。さらなる場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドはペプチド模倣性である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ＩＮＦ、メリチン、メイシン（ｍｅｕｃｉｎ）、あるいはこれらの誘導体を含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドはＩＮＦまたはその誘導体を含む。他の場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドはメリチンまたはその誘導体を含む。さらなる場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドはメイシン（ｍｅｕｃｉｎ）またはその誘導体を含む。
いくつかの例では、ＩＮＦ７は２４残基ポリペプチドであり、これはの配列は、ＣＧＩＦＧＥＩＥＥＬＩＥＥＧＬＥＮＬＩＤＷＧＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５）、またはＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５６）を含む。いくつかの例では、ＩＮＦ７またはその誘導体は、以下の配列を含む：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＷＤＹＧＳＧＳＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０５７）， ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧ ＷＹＧ−（ＰＥＧ）６−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５８）、または ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＷＤＹＧ−ＳＧＳＣ−Ｋ（ＧａｌＮＡｃ）２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５９）．
場合によっては、メリチンは２６残基ポリペプチドであり、これはの配列は、ＣＬＩＧＡＩＬＫＶＬＡＴＧＬＰＴＬＩＳＷＩＫＮＫＲＫＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０）、またはＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６１）を含む。いくつかの例では、メリチンは米国特許第８，５０１９３０に記載される通りのポリペプチド配列を含む。
いくつかの例では、メイシン（ｍｅｕｃｉｎ）は、サソリ（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ ｅｕｐｅｕｓ）の毒腺に由来する抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）である。いくつかの例では、メイシン（ｍｅｕｃｉｎ）は、ＩＦＧＡＩＡＧＬＬＫＮＩＦ−ＮＨ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６２）配列を含むメイシン−１３と、ＦＦＧＨＬＦＫＬＡＴＫＩＩＰＳＬＦＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６３）配列を含むメイシン−１８からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、その配列がＩＮＦ７またはそのその誘導体、メリチンまたはその誘導体、あるいはメイシンまたはその誘導体に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、あるいは９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＩＮＦ７またはそのその誘導体、メリチンまたはその誘導体、あるいはメイシンまたはその誘導体を含む。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分はＩＮＦ７またはその誘導体である。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５−２０５９に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５６−２０５９に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５６−２０５９を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５からなる。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５６−２０５９からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分はメリチンまたはその誘導体である。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０または２０６１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６１を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０からなる。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６１からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分はメイシンまたはその誘導体である。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６２または２０６３に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６３に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６２を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６３を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６２からなる。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６３からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は表６２に例証されるような配列を含む。
場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、Ｂｃｌ−２および／またはＢｃｌ−ｘＬなどの 抑制遺伝子標的の拮抗によってアポプトーシスを誘発するＢａｋ ＢＨ３ポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、Ａｌｂａｒｒａｎ， ｅｔ ａｌ．， “Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｉｔｈ ａ ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｃａｒｒｉｅｒ，” Ｒｅａｃｔｉｖｅ ＆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ７１： ２６１−２６５ （２０１１）において記載されるＢａｋ ＢＨ３ポリペプチドを含む。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１６６１５５またはＷＯ２０１５／０６９５８７に記載されるようなポリペプチド（例えば、細胞透過性ポリペプチド）を含む。
エンドソーム溶解性ポリマー
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）：Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃの分子はさらに、エンドソーム溶解性ポリマーと抱合する。本明細書で使用されるように、エンドソーム溶解性ポリマーは、線形、分岐ネットワーク、星形、櫛形、あるいははしご型のタイプのポリマーを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリマーは２つ以上の異なるタイプのモノマーを含む、ホモポリマーまたはコポリマーである。場合によっては、エンドソーム溶解性ポリマーはポリカチオンポリマーである。他の場合には、エンドソーム溶解性ポリマーはポリアニオンポリマーである。
いくつかの例では、ポリカチオンポリマーは、正に荷電し、中性に荷電し、または負に荷電するモノマー単位を含み、正味の電荷は正である。他の場合には、ポリカチオンポリマーは、２つ以上の正電荷を含む非ポリマー分子を含む。典型的なカチオンポリマーとしては、限定されないが、ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、ポリ（Ｌ−アルギニン）（ＰＬＡ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］（ＰＡＧＡ）、２−（ジメチルアミノ）メタクリル酸エチル（ＤＭＡＥＭＡ）、またはＮ，Ｎ−メタクリル酸ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥＭＡ）が挙げられる。
場合によっては、ポリアニオンポリマーは、正に荷電し、中性に荷電し、または負に荷電するモノマー単位を含み、正味の電荷は負である。他の場合には、ポリアニオンポリマーは、２つ以上の負の電荷を含む非ポリマー分子を含む。典型的なアニオンポリマーとしては、ｐ（アルキルアクリレート）（例えば、ポリ（アクリル酸プロピル）（ＰＰＡＡ））またはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＭ）が挙げられる。追加の例としては、Ｋｈｏｒｍａｅｅ， ｅｔ ａｌ．， “Ｅｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡｓ ｉｎ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，” Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２３： ５６５−５７４ （２０１３）に記載される、ＰＰ７５、Ｌ−フェニルアラニン−ポリ（Ｌ−リジンイソフタルアミド）ポリマーが挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるエンドソーム溶解性ポリマーはｐＨ応答性のエンドソーム溶解性ポリマーである。ｐＨ応答性のポリマーは、環境のｐＨに依存してサイズを増加させる（膨張）か、または崩壊するポリマーを含む。ポリアクリル酸とキトサンはｐＨ応答性ポリマーの例である。
いくつかの例では、本明細書に記載されるエンドソーム溶解性部分は、膜破壊性のポリマーである。場合によっては、膜破壊性のポリマーは、カチオンポリマー、中性または疎水性ポリマー、あるいはアニオンポリマーを含む。いくつかの例では、膜破壊性のポリマーは親水性ポリマーである。
いくつかの例では、本明細書に記載されるエンドソーム溶解性部分は、ｐＨ応答性のポリマーである。典型的なｐＨ応答性の膜破壊性のポリマーは、ｐ（アクリル酸アルキル）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＭ）コポリマー、スクシニル化ｐ（グリシドール）、およびｐ（β−リンゴ酸）ポリマーを含む。
いくつかの例では、ｐ（アクリル酸アルキル）は、ポリ（アクリル酸プロピル）（ｐｏｌｙＰＡＡ）、ポリ（メタクリル酸）（ＰＭＡＡ）、ポリ（アクリル酸エチル）（ＰＥＡＡ）、およびポリ（アクリル酸プロピル）（ＰＰＡＡ）を含む。いくつかの例では、ｐ（アクリル酸アルキル）は、Ｊｏｎｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ３７２： ６５−７５ （２００３）に記載されるｐ（アクリル酸アルキル）を含む。
いくつかの実施形態において、ｐＨ応答性膜破壊性のポリマーはｐ（アクリル酸ブチル−コ−メタクリル酸）を含む。（Ｂｕｌｍｕｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ９３： １０５−１２０ （２００３）； ａｎｄ Ｙｅｓｓｉｎｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６１３： ２８−３８ （２００３）を参照）。
いくつかの実施形態において、ｐＨ応答性膜破壊性のポリマーはｐ（スチレン−アルト−無水マレイン酸）を含む。（Ｈｅｎｒｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ７： ２４０７−２４１４ （２００６）を参照）。
いくつかの実施形態において、ｐＨ応答性膜破壊性のポリマーは、ポリ（ＭＡＡ−ｃｏ−ＰＤＳＡ）、ポリ（ＥＡＡ−ｃｏ−ＰＤＳＡ）、ポリ（ＰＡＡ−ｃｏ−ＰＤＳＡ）、ポリ（ＭＡＡ−ｃｏ−ＢＡ−ｃｏ−ＰＤＳＡ）、ポリ（ＥＡＡ−ｃｏ−ＢＡ−ｃｏ−ＰＤＳＡ）、またはポリ（ＰＡＡ−ｃｏ−ＢＡ−ｃｏ−ＰＤＳＡ）ポリマーなどのピリジルジスルフィドアクリレート（ＰＤＳＡ）ポリマーを含む。（Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ， ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ａｎｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０４： ４１７−４２７ （２００５）； ｏｒ Ｆｌａｎａｒｙ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ） ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ＭＨＣ−１ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２０： ２４１−２４８ （２００９）を参照）。
いくつかの実施形態において、ｐＨ応答性膜破壊性のポリマーは、以下のベース構造体を含む細胞溶解ポリマーを含む：
いくつかの例では、本明細書に記載されるエンドソーム溶解性部分はさらに、追加の抱合体、例えば、ポリマー（例えばＰＥＧ）あるいは修飾されたポリマー（例えば、コレステロール修飾ポリマー）に抱合する。
いくつかの例では、追加の抱合体は洗浄薬（例えば、トリトンＸ−１００）を含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるエンドソーム溶解性部分は、洗浄薬（例えば、トリトンＸ−１００）と抱合したポリマー（例えば、ポリ（アミドアミン））を含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるエンドソーム溶解性部分は、ポリ（アミドアミン）−トリトンＸ−１００抱合体を含む（Ｄｕｎｃａｎ， ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｐＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ： ａ ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈｉｎ ａｃｉｄｉｃ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ２： ３４１−３４７ （１９９４））。
エンドソーム溶解性脂質
いくつかの実施形態において、エンドソーム溶解性部分は脂質（例えば、膜融合脂質）である。いくつかの実施形態、式（Ｉ）：Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃの分子はさらに、エンドソーム溶解性脂質（例えば、膜融合脂質）と抱合する。典型的な膜融合脂質としては、１，２−ジレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オール（Ｄｉ−Ｌｉｎ）、Ｎ−メチル（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）メタンアミン（ＤＬｉｎｋ−ＤＭＡ）、およびＮ−メチル−２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）エタンアミン（ＸＴＣ）が挙げられる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分はＰＣＴ公開第ＷＯ０９／１２６，９３３に記載される脂質（例えば、膜融合脂質）である。
エンドソーム溶解性小分子
いくつかの実施形態では、エンドソーム溶解性部分は小分子である。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）：Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃの分子はさらに、エンドソーム溶解性小分子と抱合する。エンドソーム溶解性部分として適切な典型的な少分子は、限定されないが、キニーネ、クロロキン、水酸化クロロキン、アモジアキン（カルノキン（ｃａｒｎｏｑｕｉｎｅｓ））、アモピロキン（ａｍｏｐｙｒｏｑｕｉｎｅｓ）、プリマキン、メフロキン、ニバキン（ｎｉｖａｑｕｉｎｅｓ）、ハロファントリン、キノンイミン、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、キノリンエンドソーム溶解性部分は、限定されないが、７−クロロ−４−（４−ジエチルアミノ−１−メチルブチル−アミノ）キノリン（クロロキン）；７−クロロ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチル−アミノ）キノリン（ヒドロキシクロロキン）；７−フルオロ−４−（４−ジエチルアミノ−１−メチルブチル−アミノ）キノリン；４−（４−ジエチルアミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（４−ジエチル−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−クロロ−４−（４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン（デスメチルクロロキン）；７−フルオロ−４−（４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；４−（４−ジエチル−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−クロロ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−フルオロ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチル−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−クロロ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−フルオロ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチル−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−フルオロ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノキノリン；４−（４−エチル−（２−ヒドロキシ−エチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ−）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；リン酸ヒドロキシクロロキン；７−クロロ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル−１）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン（デスメチルヒドロキシクロロキン）；７−フルオロ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−クロロ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−フルオロ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−クロロ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−フルオロ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；８−［（４−アミノペンチル）アミノ−６−メトキシジヒドロクロリドキノリン；１−アセチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン；８−［（４−アミノペンチル）アミノ］−６−メトキシキノリン二塩酸塩；１−ブチリル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン；３−クロロ−４−（４−ヒドロキシ−アルファ，アルファ’−ビス（２−メチル−１−ピロリジニル）−２，５−キシリジノキノリン、４−［（４−ジエチル−アミノ）−１−メチルブチル−アミノ］−６−メトキシキノリン；３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシ−アルファ，アルファ’−ビス（２−メチル−１−ピロリジニル）−２，５−キシリジノキノリン、４−［（４−ジエチルアミノ）−１−メチルブチル−アミノ］−６−メトキシキノリン；４−（４−ヒドロキシ−アルファ，アルファ’−ビス（２−メチル−１−ピロリジニル）−２，５−キシリジノキノリン；４−［（４−ジエチルアミノ）−１−メチルブチル−アミノ］−６−メトキシキノリン；３，４−ジヒドロ−１−（２Ｈ）−キノリンカルボキシアルデヒド；１，１’−ペンタメチレンジキノリニウム（ｄｉｑｕｉｎｏｌｅｉｎｉｕｍ）ジヨウ化物；８−キノリノール硫酸塩およびアミノ、アルデヒド、カルボン酸、ヒドロキシル、ハロゲン、ケト、スルフヒドリル、ならびにビニルの誘導体またはそのアナログを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、Ｎａｉｓｂｉｔｔ ｅｔ ａｌ （１９９７， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａｐｙ ２８０：８８４−８９３）と米国特許第５，７３６，５５７において記載される小分子である。
式（Ｉ）分子−エンドソーム溶解性部分抱合体
いくつかの実施形態において、１つ以上のエンドソーム溶解性部分は、少なくとも１つの結合部分、少なくとも１つのポリヌクレオチド、少なくとも１つのポリマー、あるいはその任意の組み合わせを含む分子に抱合する。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は式（ＩＩ）にしたがって抱合し、
式中、Ａは結合部分であり、Ｂはポリヌクレオチドであり、Ｃはポリマーであり、Ｘは単結合または第１のリンカーであり、および、Ｙは単結合または第２のリンカーであり、Ｌは単結合または第３のリンカーであり、Ｄはエンドソーム溶解性部分であり、および、ｃは０から１までの整数であり、および、ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆位脱塩基部分を含み、および、Ｄは、Ａ、Ｂ、あるいはＣのいかなる場所にも抱合する。
いくつかの実施形態において、ＡとＣは同じ末端でＢには結合しない。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの例では、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチドはロックド核酸（ＬＮＡ）あるいはエチレン核酸（ＥＮＡ）を含む。場合によっては、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合あるいはホスホロジチオエート結合を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、二重らせん構造のポリ核酸分子を形成するために、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つの修飾を含む。場合によっては、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドはＲＮＡ分子である。場合によっては、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、Ｘ、Ｙ、およびＬは独立して結合または非ポリマーリンカー基である。いくつかの例では、Ａは抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいはラクダ科抗体あるいはその結合フラグメントを含む。場合によっては、Ｃはポリエチレングリコールである。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ポリペプチド、ポリマー、脂質、あるいは小分子を含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性ポリペプチドである。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性ポリマーである。他の場合には、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性脂質である。さらなる場合には、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性小分子である。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分はＩＮＦ７またはその誘導体である。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分はメリチンまたはその誘導体である。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は表６２で例証されるような配列である。
さらなる例では、エンドソーム溶解性部分は、例えば、ｐＨ応答性エンドソーム溶解性ポリマー、膜破壊性のポリマー、ポリカチオンポリマー、ポリアニオンポリマー、ｐＨ応答性膜破壊性のポリマー、あるいはこれらの組み合わせなどのエンドソーム溶解性ポリマーである。さらなる場合には、エンドソーム溶解性部分は、ｐ（アクリル酸アルキル）ポリマー、ｐ（アクリル酸ブチル−コ−メタクリル酸）ポリマー、ｐ（スチレン−アルト−無水マレイン酸）ポリマー、ピリジルジスルフィドアクリレート（ＰＤＳＡ）ポリマー、ポリマー−ＰＥＧ抱合体、ポリマー洗浄薬抱合体、あるいはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、エンドソーム溶解性部分抱合体は、式（ＩＩａ）によれば：
ここで、Ａは結合部分であり；
Ｂはポリヌクレオチドであり；
Ｃはポリマーであり；
Ｘは単結合または第１のリンカーであり；
Ｙは単結合または第２のリンカーであり；
Ｌは単結合または第３のリンカーであり；
Ｄはエンドソーム溶解性部分であり；
および、ｃは１という整数であり；
および、ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間の結合、または、少なくとも１つの逆位の脱塩基部分を含む。
いくつかの実施形態では、ＡおよびＣは同じ末端でＢに結合しない。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏメチル、２’−Ｏメトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏアミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏアミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−ＯＮ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの例では、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはエチレン核酸（ＥＮＡ）を含む。いくつかの場合には、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間の結合は、ホスホロチオエート結合、または、ホスホロジチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖のポリ核酸分子を形成するために、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチドと、を含む。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの場合には、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子である。いくつかの場合には、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、Ｘ、ＹおよびＬは、独立して、単結合または非ポリマー性リンカー基である。いくつかの例では、Ａは抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、１価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、または、ラクダ科抗体またはその結合フラグメント、を含む。いくつかの場合には、Ｃはポリエチレングリコールである。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ポリペプチド、ポリマー、脂質、または、少分子を含む。いくつかの実施形態では、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム溶解性ポリペプチドである。いくつかの場合には、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム溶解性ポリマーである。他の場合には、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性脂質である。さらなる場合には、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性少分子である。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＩＮＦ７またはその誘導体である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５に対し、少なくとも、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５を含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、メリチンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０に対し、少なくとも、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０を含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は表６２に例示されるような配列である。
さらなる場合には、エンドソーム溶解性部分は、例えば、ｐＨ応答性エンドソーム溶解性ポリマー、膜破壊性ポリマー、ポリカチオンポリマー、ポリアニオンポリマー、ｐＨ応答性膜破壊性ポリマー、またはその組み合わせ、などのエンドソーム溶解性ポリマーである。さらなる場合には、エンドソーム溶解性部分は、ｐ（アルキルアクリル酸）ポリマー、ｐ（ブチルアクリレート−コ−メタクリル酸）ポリマー、ｐ（スチレン−アルト−無水マレイン酸）ポリマー、ピリジルジスルフィドアクリレート（ＰＤＳＡ）ポリマー、ポリマー−ＰＥＧ抱合体、ポリマー洗浄薬抱合体、またはその組み合わせ、を含む。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分抱合体は、式（ＩＩｂ）によれば：
ここで、Ａは結合部分であり；
Ｂはポリヌクレオチドであり；
Ｘは単結合または第１のリンカーであり；
Ｌは単結合または第３のリンカーであり；
および、Ｄはエンドソーム溶解性部分であり；
および、ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間の結合、または、少なくとも１つの逆位の脱塩基部分を含む。
いくつかの実施形態では、ＡおよびＣは同じ末端でＢに結合しない。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏメチル、２’−Ｏメトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏアミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏアミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−ＯＮ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの例では、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはエチレン核酸（ＥＮＡ）を含む。いくつかの場合には、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間の結合は、ホスホロチオエート結合、または、ホスホロジチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖のポリ核酸分子を形成するために、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチドと、を含む。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの場合には、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子である。いくつかの場合には、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ＸおよびＬは、独立して、単結合または非ポリマー性リンカー基である。いくつかの例では、Ａは抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、１価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、または、ラクダ科抗体またはその結合フラグメント、を含む。いくつかの場合には、Ｃはポリエチレングリコールである。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ポリペプチド、ポリマー、脂質、または、少分子を含む。いくつかの実施形態では、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム溶解性ポリペプチドである。いくつかの場合には、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム溶解性ポリマーである。他の場合には、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性脂質である。さらなる場合には、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性少分子である。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＩＮＦ７またはその誘導体である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５に対し、少なくとも、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５を含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、メリチンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０に対し、少なくとも、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０を含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は表６２に例示されるような配列である。
さらなる場合には、エンドソーム溶解性部分は、例えば、ｐＨ応答性エンドソーム溶解性ポリマー、膜破壊性ポリマー、ポリカチオンポリマー、ポリアニオンポリマー、ｐＨ応答性膜破壊性ポリマー、またはその組み合わせ、などのエンドソーム溶解性ポリマーである。さらなる場合には、エンドソーム溶解性部分は、ｐ（アルキルアクリル酸）ポリマー、ｐ（ブチルアクリレート−コ−メタクリル酸）ポリマー、ｐ（スチレン−アルト−無水マレイン酸）ポリマー、ピリジルジスルフィドアクリレート（ＰＤＳＡ）ポリマー、ポリマー−ＰＥＧ抱合体、ポリマー洗浄薬抱合体、またはその組み合わせ、を含む。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分抱合体は、式（ＩＩｃ）によれば：
ここで、Ａは結合部分であり；
Ｂはポリヌクレオチドであり；
Ｃはポリマーであり；
Ｘは単結合または第１のリンカーであり；
Ｙは単結合または第２のリンカーであり；
Ｌは単結合または第３のリンカーであり；
Ｄはエンドソーム溶解性部分であり；
および、ｃは１という整数であり；
および、ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間の結合、または、少なくとも１つの逆位の脱塩基部分を含む。
いくつかの実施形態では、ＡおよびＣは同じ末端でＢに結合しない。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏメチル、２’−Ｏメトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏアミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏアミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−ＯＮ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの例では、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはエチレン核酸（ＥＮＡ）を含む。いくつかの場合には、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間の結合は、ホスホロチオエート結合、または、ホスホロジチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖のポリ核酸分子を形成するために、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチドと、を含む。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの場合には、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子である。いくつかの場合には、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、Ｘ、ＹおよびＬは、独立して、単結合または非ポリマー性リンカー基である。いくつかの例では、Ａは抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、１価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、または、ラクダ科抗体またはその結合フラグメント、を含む。いくつかの場合には、Ｃはポリエチレングリコールである。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ポリペプチド、ポリマー、脂質、または、少分子を含む。いくつかの実施形態では、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム溶解性ポリペプチドである。いくつかの場合には、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム溶解性ポリマーである。他の場合には、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性脂質である。さらなる場合には、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性少分子である。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＩＮＦ７またはその誘導体である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５に対し、少なくとも、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５を含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、メリチンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０に対し、少なくとも、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０を含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は表６２に例示されるような配列である。
さらなる場合には、エンドソーム溶解性部分は、例えば、ｐＨ応答性エンドソーム溶解性ポリマー、膜破壊性ポリマー、ポリカチオンポリマー、ポリアニオンポリマー、ｐＨ応答性膜破壊性ポリマー、またはその組み合わせ、などのエンドソーム溶解性ポリマーである。さらなる場合には、エンドソーム溶解性部分は、ｐ（アルキルアクリル酸）ポリマー、ｐ（ブチルアクリレート−コ−メタクリル酸）ポリマー、ｐ（スチレン−アルト−無水マレイン酸）ポリマー、ピリジルジスルフィドアクリレート（ＰＤＳＡ）ポリマー、ポリマー−ＰＥＧ抱合体、ポリマー洗浄薬抱合体、またはその組み合わせ、を含む。
いくつかの実施形態では、エンドソーム溶解性部分抱合体は、式（ＩＩｄ）によれば：
ここで、Ａは結合部分であり；
Ｂはポリヌクレオチドであり；
Ｃはポリマーであり；
Ｘは単結合または第１のリンカーであり；
Ｙは単結合または第２のリンカーであり；
Ｌは単結合または第３のリンカーであり；
Ｄはエンドソーム溶解性部分であり；
および、ｃは１という整数であり；
および、ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間の結合、または、少なくとも１つの逆位の脱塩基部分を含む。
いくつかの実施形態では、ＡおよびＣは同じ末端でＢに結合しない。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏメチル、２’−Ｏメトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏアミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏアミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−ＯＮ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの例では、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはエチレン核酸（ＥＮＡ）を含む。いくつかの場合には、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間の結合は、ホスホロチオエート結合、または、ホスホロジチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖のポリ核酸分子を形成するために、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチドと、を含む。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの場合には、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子である。いくつかの場合には、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、Ｘ、ＹおよびＬは、独立して、単結合または非ポリマー性リンカー基である。いくつかの例では、Ａは抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、１価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、または、ラクダ科抗体またはその結合フラグメント、を含む。いくつかの場合には、Ｃはポリエチレングリコールである。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ポリペプチド、ポリマー、脂質、または、少分子を含む。いくつかの実施形態では、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム溶解性ポリペプチドである。いくつかの場合には、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム溶解性ポリマーである。他の場合には、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性脂質である。さらなる場合には、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性少分子である。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＩＮＦ７またはその誘導体である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５に対し、少なくとも、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５を含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、メリチンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０に対し、少なくとも、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０を含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は表６２に例示されるような配列である。
さらなる場合には、エンドソーム溶解性部分は、例えば、ｐＨ応答性エンドソーム溶解性ポリマー、膜破壊性ポリマー、ポリカチオンポリマー、ポリアニオンポリマー、ｐＨ応答性膜破壊性ポリマー、またはその組み合わせ、などのエンドソーム溶解性ポリマーである。さらなる場合には、エンドソーム溶解性部分は、ｐ（アルキルアクリル酸）ポリマー、ｐ（ブチルアクリレート−コ−メタクリル酸）ポリマー、ｐ（スチレン−アルト−無水マレイン酸）ポリマー、ピリジルジスルフィドアクリレート（ＰＤＳＡ）ポリマー、ポリマー−ＰＥＧ抱合体、ポリマー洗浄薬抱合体、またはその組み合わせ、を含む。
リンカー
いくつかの実施形態では、本明細書に記述されたリンカーは切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーである。いくつかの例では、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの例では、リンカーは酸切断可能なリンカーである。いくつかの例では、リンカーは切断不可能なリンカーである。いくつかの例では、リンカーはＣ１−Ｃ６アルキル基（例えばＣ５、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２またはＣ１アルキル基）を含む。いくつかの例では、リンカーは、ホモ二官能性クロスリンカー、ヘテロ二官能性クロスリンカーなどを含んでいる。いくつかの例では、リンカーは痕跡のないリンカー（ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｌｉｎｋｅｒ）（またはゼロレングスリンカー（ｚｅｒｏ−ｌｅｎｇｔｈ ｌｉｎｋｅｒ））である。いくつかの例では、リンカーは、非ポリマー性リンカーである。いくつかの場合には、リンカーは、非ペプチドリンカー、または、アミノ酸残基を包含していないリンカーである。
いくつかの例では、リンカーはホモ二官能性リンカーを含む。典型的なホモ二官能性リンカーは、限定されないが、Ｌｏｍａｎｔ試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）ＤＳＰ、３’３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジルスベリレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホＤＳＴ）、エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、Ｎ、Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）、ジメチルアジピミデート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ）（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ）（ＤＭＳ）、ジメチル−３、３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ｄｉｔｈｉｏｂｉｓｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｄａｔｅ）（ＤＴＢＰ）、１、４−ジ−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ハロゲン化アリール含有化合物（ＤＦＤＮＢ）、例えば１，５−ジフルオロ−２，４ジニトロベンゼンまたは１，３−ジフルオロ−４，６ジニトロベンゼン、４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）、ビス−［β−エチル（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｏ−トルイジン、３，３’−ジメチルベンジジン、ベンジジン、α，α’−ｐ−ジアミノジフェニル、ジヨードｐ−キシレンスルホン酸、Ｎ、Ｎ’−エチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、または、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーはヘテロ二官能性リンカーを含む。典型的なヘテロ二官能性リンカーは、限定されないが、アミン反応性スルフヒドリルクロスリンカー、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ｓＰＤＰ）、長鎖Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＬＣ−ｓＰＤＰ）、水溶性長鎖Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（スルホＬＣ−ｓＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ｓＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ｓＭＰＴ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボンキシレート（スルホ−ｓＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ｓＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ｓＩＡＢ）、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ｓＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ｓＭＰＢ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢ）、スクシンイミジル６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノエート（ｓＩＡＸ）、スクシンイミジル６−［６−（（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ］ヘキサノエート（ｓＩＡＸＸ）、スクシンイミジル４−（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＩＡＣ）、スクシンイミジル６−（（（（４−ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボニル）アミノヘキサノエート（ｓＩＡＣＸ）、ｐ−ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）、カルボニル反応性かつスルフヒドリル反応性クロスリンカー、例えば、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）ブチル酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド−８（Ｍ２Ｃ２Ｈ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）、アミン反応性かつ光反応性クロスリンカー、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（ＮＨ−ＡｓＡ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（スルホ−ＮＨ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル（４−アジドサリチルアミド）−ヘキサノエート（スルホ−ＮＨ−ＬＣ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル−２−（ρ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡｓＤ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（ＨｓＡＢ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（スルホ−ＨｓＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ｓＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（スルホ−ｓＡＮＰＡＨ）、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ−ＮＯ）、スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＮＤ）、Ｎ−スクシンイミジル−４（４−アジドフェニル）１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＤＰ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−アジドフェニル）−１，３’−ジチオプロピオネート（スルホ−ｓＡＤＰ）、スルホスクシンイミジル４−（ρ−アジドフェニル）ブチレート（スルホ−ｓＡＰＢ）、スルホスクシンイミジル２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＥＤ）、スルホスクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート（スルホ−ｓＡＭＣＡ）、ρ−ニトロフェニルジアゾピルバート（ρＮＰＤＰ）、ρ−ニトロフェニル−２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオネート（ＰＮＰ−ＤＴＰ）、スルフヒドリル反応性かつ光反応性のクロスリンカー、例えば、ａｓ１−（ρ−アジドサリチルアミド）−４−（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡｓＩＢ）、Ｎ−［４−（ρ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、ベンゾフェノン−４−ヨードアセトアミド、ベンゾフェノン−４−マレイミドカルボニル反応性かつ光反応性のクロスリンカー、例えば、ρ−アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）、カルボキシレート反応性かつ光反応性のクロスリンカー、例えば、４−（ρ−アジドサリチルアミド）ブチルアミン（ＡｓＢＡ）、および、アルギニン反応性かつ光反応性のクロスリンカー、例えば、ρ−アジドフェニルグリオキサール（ＡＰＧ）。
いくつかの例では、リンカーは反応性官能基を含む。いくつかの場合には、反応性官能基は、結合部分上に存在する求電子性基に反応する求核基を含む。典型的な求電子基は、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、ハロゲン化アシルまたは酸無水物などのカルボニル基を含む。いくつかの実施形態では、反応性官能基は、アルデヒドである。典型的な求核基は、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリルヒドラジド、を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーはマレイミド基を含む。いくつかの例では、マレイミド基もマレイミドスペーサーと呼ばれる。いくつかの例では、マレイミド基はさらにカプロン酸を含み、マレイミドカプロイル（ｍｃ）を形成する。いくつかの場合には、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）を含む。いくつかの場合には、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）である。他の例では、マレイミド基は、上述された、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、または、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ｓＭＣＣ）などのマレイミドメチル基を含む。
いくつかの実施形態では、マレイミド基は自己安定化マレイミドである。いくつかの例では、自己安定化マレイミドは、チオスクシンイミド輪加水分解の分子内の触媒作用を提供するために、マレイミドに隣接している塩基性アミノ基を組込むためにジアミノプロピオン酸（ＤＰＲ）を利用し、それによって、マレイミドがレトロマイケル反応（ｒｅｔｒｏ−Ｍｉｃｈａｅｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により脱離反応を起こさないようにする。いくつかの例では、自己安定化マレイミドは、Ｌｙｏｎ， ｅｔ ａｌ．， “Ｓｅｌｆ−ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，” Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３２（１０）：１０５９−１０６２（２０１４）に記載のマレイミド基である。いくつかの例では、リンカーは自己安定化マレイミドを含む。いくつかの例では、リンカーは自己安定化マレイミドである。
いくつかの実施形態では、リンカーはペプチド部分である。いくつかの例では、ペプチド部分は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８またはより多くのアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ペプチド部分は、（例えば酵素で、または化学的に）切断可能なペプチド部分である。いくつかの実施形態では、ペプチド部分は、切断不可能なペプチド部分である。いくつかの例では、ペプチド部分は、Ｖａｌ−Ｃｉｔ（バリン−シトルリン）、 Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１１）、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１２）、またはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１３）を含む。いくつかの例では、リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ（バリン−シトルリン）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１１）、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１２）、またはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１３）などのペプチド部分を含む。ある場合には、リンカーはＶａｌ−Ｃｉｔを含む。いくつかの実施形態では、リンカーはＶａｌ−Ｃｉｔである。
いくつかの実施形態では、リンカーは安息香酸基、またはその誘導体を含む。いくつかの例では、安息香酸基またはその誘導体は、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）を含む。いくつかの例では、安息香酸基またはその誘導体は、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、任意の組み合わせにおいて、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基、の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の組み合わせを含む。いくつかの例では、マレイミド基はマレイミドカプロイル（ｍｃ）である。いくつかの例では、ペプチド基はｖａｌ−ｃｉｔである。いくつかの例では、安息香酸基はＰＡＢＡである。いくつかの例では、リンカーはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ基を含む。いくつかの場合には、リンカーはｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。さらなる場合には、リンカーはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、自壊性リンカーまたは自己脱離リンカーである。いくつかの場合には、リンカーは自壊性リンカーである。他の場合には、リンカーは自己脱離リンカー（例えば環化自己脱離リンカー）である。いくつかの例では、リンカーは、米国特許第９，０８９，６１４号またはＰＣＴ公開ＷＯ２０１５０３８４２６に記載のリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは樹状型リンカー（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｔｙｐｅ ｌｉｎｋｅｒ）である。いくつかの例では、樹状型リンカーは、枝分かれした多機能のリンカー部分を含む。いくつかの例では、樹状型リンカーは、ポリヌクレオチドＢ対結合部分Ａのモル比を増加させるために使用される。いくつかの例では、樹状型リンカーはＰＡＭＡＭデンドリマーを含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、痕跡のないリンカー、または、切断後にリンカー部分（例えば、原子またはリンカー基）を結合部分Ａ、ポリヌクレオチドＢ、ポリマーＣ、またはエンドソーム溶解性部分Ｄに残さないリンカー、である。典型的な痕跡のないリンカーは、限定されないが、ゲルマニウムリンカー、ケイ素リンカー、硫黄リンカー、セレンリンカー、窒素リンカー、リンリンカー、ホウ素リンカー、クロミウムリンカー、または、フェニルヒドラジドリンカーを含んでいる。いくつかの場合には、リンカーは、Ｈｅｊｅｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ａｒｙｌ−ｔｒｉａｚｅｎｅ ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ＤＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，” Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ １１（１５）： ２４９３−２４９７（２０１３）に記載の痕跡のないアリルトリアゼンリンカーである。いくつかの例では、リンカーは、Ｂｌａｎｅｙ， ｅｔ ａｌ．， “Ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，” Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １０２： ２６０７−２０２４（２００２）に記載の痕跡のないリンカーである。いくつかの例では、リンカーは、米国特許第６，８２１，７８３号に記載の痕跡のないリンカーである。
いくつかの例では、リンカーは、リンカーと抱合体部分（例えば、本明細書に記載のＡ、Ｂ、ＣまたはＤ）との間の結合部位に立体障害を及ぼす官能基を含む。いくつかの例では、立体障害はジスルフィド結合の周囲の立体障害である。立体障害を示す典型的なリンカーは、上述のヘテロ二官能性リンカーなどの、ヘテロ二官能性リンカーを含む。いくつかの場合には、立体障害を示すリンカーはＳＭＣＣとＳＰＤＢを含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、酸切断可能なリンカーである。いくつかの例では、酸切断可能なリンカーは、ヒドラゾン結合を含み、これは加水分解されやすい。いくつかの場合には、酸切断可能なリンカーはチオマレアミド酸リンカー（ｔｈｉｏｍａｌｅａｍｉｃ ａｃｉｄ ｌｉｎｋｅｒ）を含む。いくつかの場合には、酸切断可能なリンカーは、Ｃａｓｔａｎｅｄａ， ｅｔ ａｌ， “Ａｃｉｄ−ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｔｈｉｏｍａｌｅａｍｉｃ ａｃｉｄ ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ，” Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． ４９： ８１８７−８１８９（２０１３）に記載のチオマレアミド酸リンカーを含む。
いくつかの例では、リンカーは、米国特許第６，８８４，８６９号；第７，４９８，２９８号；第８，２８８，３５２号；第８，６０９，１０５号；第８，６９７，６８８号、米国出願公開２０１４／０１２７２３９；２０１３／０２８９１９；２０１４／２８６９７０；２０１３／０３０９２５６；２０１５／０３７３６０；または２０１４／０２９４８５１、または、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１５０５７６９９；ＷＯ２０１４０８０２５１；ＷＯ２０１４１９７８５４；ＷＯ２０１４１４５０９０；またはＷＯ２０１４１７７０４２、に記載のリンカーである。
いくつかの実施形態では、Ｘ、ＹおよびＬは、独立して、単結合または非ポリマー性リンカーである。いくつかの例では、Ｘ、ＹおよびＬは独立して単結合である。いくつかの場合には、Ｘ、ＹおよびＬは独立してリンカーである。
いくつかの実施形態では、Ｘは単結合またはリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｘは単結合である。いくつかの実施形態では、Ｘはリンカーである。いくつかの例では、リンカーはＣ１−Ｃ６アルキル基である。ある場合には、Ｘは、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２またはＣ１アルキル基などのＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの場合には、Ｃ１−Ｃ６アルキル基は、非置換のＣ１−Ｃ６アルキル基である。リンカーのコンテクストで使用されるように、かつ、特にＸのコンテクストで使用されるように、アルキルは、６個までの炭素原子を含む飽和した直鎖または分岐の炭化水素基を意味する。いくつかの例では、Ｘは非ポリマー性リンカーである。いくつかの例では、Ｘは上述のホモ二官能性リンカーまたはヘテロ二官能性リンカーを含む。いくつかの場合には、Ｘはヘテロ二官能性リンカーを含む。いくつかの場合には、ＸはｓＭＣＣを含む。他の例では、Ｘは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基に随意に抱合するヘテロ二官能性リンカーを含む。他の例では、Ｘは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基に随意に抱合するｓＭＣＣを含む。さらなる例では、Ｘは、上述のホモ二官能性リンカーまたはヘテロ二官能性リンカーを含まない。
いくつかの実施形態では、Ｙは単結合またはリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｙは単結合である。他の場合では、Ｙはリンカーである。いくつかの実施形態では、ＹはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの例では、Ｙは、上述のホモ二官能性リンカーまたはヘテロ二官能性リンカーである。いくつかの例では、Ｙは、上述のホモ二官能性リンカーである。いくつかの例では、Ｙは、上述のヘテロ二官能性リンカーである。いくつかの例では、Ｙは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）または上述の自己安定化マレイミド基などのマレイミド基を含む。いくつかの例では、Ｙは、Ｖａｌ−Ｃｉｔなどのペプチド部分を含む。いくつかの例では、Ｙは、ＰＡＢＡなどの安息香酸基を含む。さらなる例では、Ｙは、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基、の組み合わせを含む。さらなる例では、Ｙはｍｃ基を含む。さらなる例では、Ｙはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ基を含む。さらなる例では、Ｙはｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。さらなる例では、Ｙはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌは単結合またはリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｌは単結合である。さらなる例では、Ｌはリンカーである。いくつかの実施形態では、ＬはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの例では、Ｌは前述のホモ二官能性リンカーまたはヘテロ二官能性リンカーである。いくつかの例では、Ｌは前述のホモ二官能性リンカーである。いくつかの例では、Ｌは前述のヘテロ二官能性リンカーである。いくつかの例では、Ｌは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）などのマレイミド基または上述の自己安定化マレイミド基を含む。いくつかの例では、Ｌは、ｖａｌ−Ｃｉｔなどのペプチド部分を含む。いくつかの例では、Ｌは、ＰＡＢＡなどの安息香酸基を含む。さらなる例では、Ｌは、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の組み合わせを含む。さらなる例では、Ｌはｍｃ基を含む。さらなる例では、Ｌはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ基を含む。さらなる例では、Ｌはｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。さらなる例では、Ｌはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。
使用の方法
いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子およびポリマーに結合された結合部分を含む本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、疾患または障害の処置のために使用される。いくつかの例では、疾患または障害は癌である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、疾患または障害の処置のために免疫療法として使用される。いくつかの例では、免疫療法は免疫腫瘍治療である。
癌
いくつかの実施形態では、本明細書に記述された組成物または医薬製剤は、癌の処置に使用される。いくつかの例では、癌は固形腫瘍である。いくつかの例では、癌は血液系腫瘍である。いくつかの例では、癌は再発性癌または難治性癌、または転移性癌である。いくつかの例では、固形腫瘍は再発性固形腫瘍または難治性固形腫瘍、または転移性固形腫瘍である。いくつかの場合には、血液系腫瘍は、再発血液系腫瘍または難治性血液系腫瘍、または転移性である。
いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。典型的な固形腫瘍としては、限定されないが、肛門癌、虫垂癌、胆管癌（すなわち胆管細胞癌）、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、原発不明癌（ＣＵＰ）、食道癌、目癌、ファロピウス管癌、消化器癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、髄芽腫、黒色腫、口腔癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺疾患、陰茎癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、喉頭癌、甲状腺癌、子宮癌、膣癌または外陰癌、が含まれる。
いくつかの例では、ポリ核酸分子およびポリマーに抱合する結合部分を含む本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、固形腫瘍の処置のために使用される。いくつかの例では、ポリ核酸分子およびポリマーに抱合する結合部分を含む、本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、肛門癌、虫垂癌、胆管癌（すなわち胆管細胞癌）、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、原発不明癌（ＣＵＰ）、食道癌、目癌、ファロピウス管癌、消化器癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、髄芽腫、黒色腫、口腔癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺疾患、陰茎癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、喉頭癌、甲状腺癌、子宮癌、膣癌、または、外陰癌、の処置に使用される。いくつかの例では、固形腫瘍は、再発性固形腫瘍または難治性固形腫瘍、または転移性固形腫瘍である。
いくつかの例では、癌は血液系腫瘍である。いくつかの実施形態では、血液系腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、または、ホジキンリンパ腫である。いくつかの例では、血液系腫瘍は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、ハイリスクＣＬＬ、非ＣＬＬ／ＳＬＬリンパ腫、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンストレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、非バーキット高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽細胞性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓周辺帯リンパ腫、プラスマ細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、または、リンパ腫様肉芽腫症、を含む。
いくつかの例では、ポリ核酸分子およびポリマーに抱合する結合部分を含む本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、血液系腫瘍の処置のために使用される。いくつかの例では、ポリ核酸分子およびポリマーに抱合する結合部分を含む本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、白血病、リンパ腫、髄腫、非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫の処置のために使用される。いくつかの例では、血液系腫瘍は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、ハイリスクＣＬＬ、非ＣＬＬ／ＳＬＬリンパ腫、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンストレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、非バーキット高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽細胞性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓周辺帯リンパ腫、プラスマ細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、または、リンパ腫様肉芽腫症、を含む。いくつかの場合には、血液系腫瘍は、再発血液系腫瘍または難治性血液系腫瘍、または転移性である。
いくつかの例では、癌は、ＫＲＡＳ関連、ＥＧＦＲ関連、ＡＲ関連癌、ＨＰＲＴ１関連癌、または、β−カテニン関連癌である。いくつかの例では、ポリ核酸分子およびポリマーに抱合する結合部分を含む本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、ＫＲＡＳ関連、ＥＧＦＲ関連、ＡＲ関連癌、ＨＰＲＴ１関連癌、または、β−カテニン関連癌の処置のために使用される。いくつかの例では、ポリ核酸分子およびポリマーに抱合する結合部分を含む本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、ＫＲＡＳ関連癌の処置のために使用される。いくつかの例では、ポリ核酸分子およびポリマーに抱合する結合部分を含む本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、ＥＧＦＲ関連癌の処置のために使用される。いくつかの例では、ポリ核酸分子およびポリマーに抱合する結合部分を含む本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、ＡＲ関連癌の処置のために使用される。いくつかの例では、ポリ核酸分子およびポリマーに抱合する結合部分を含む本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、ＨＰＲＴ１関連癌の処置のために使用される。いくつかの例では、ポリ核酸分子およびポリマーに抱合する結合部分を含む本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、β−カテニン関連癌の処置のために使用される。いくつかの例では、癌は固形腫瘍である。いくつかの例では、癌は血液系腫瘍である。いくつかの例では、固形腫瘍は、再発性固形腫瘍または難治性固形腫瘍、または転移性固形腫瘍である。いくつかの場合には、血液系腫瘍は、再発血液系腫瘍または難治性血液系腫瘍、または転移性である。いくつかの例では、癌は、膀胱癌、乳癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、多形神経膠芽腫、頭頚部癌、腎癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、甲状腺癌、急性骨髄性白血病、ＣＬＬ、ＤＬＢＣＬ、または、多発性骨髄腫を含む。いくつかの例では、β−カテニン関連癌は、さらに、ＰＩＫ３Ｃ関連癌および／またはＭＹＣ関連癌を含む。
免疫療法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、疾患または障害の処置のために免疫療法として使用される。いくつかの例では、免疫療法は免疫腫瘍治療である。いくつかの例では、免疫腫瘍治療は、能動型、受動型または併用型の（能動型および受動型）方法に分類される。能動型の免疫腫瘍治療の方法では、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が免疫系に提示され、これらのＴＡＡを提示する癌細胞に対する攻撃を引き起こす。いくつかの例では、能動型の免疫腫瘍治療の方法は、腫瘍標的化剤および／または免疫標的化剤（例えば、モノクローナル抗体などのチェックポイント阻害剤）、および／または、インサイチュワクチン接種および／または細胞系または非細胞系の（例えば、樹状細胞系、腫瘍細胞系、抗原、抗イディオタイプ、ＤＮＡ、またはベクター系）ワクチンなどのワクチン、を含む。いくつかの例では、細胞系のワクチンは、次いで患者自身の癌によって活性化される、患者自身の免疫系から得られた活性化免疫細胞を用いて生成されるワクチンである。いくつかの例では、能動型の免疫腫瘍治療は、さらに、非特異的能動免疫療法および特異的能動免疫療法に細分される。いくつかの例では、非特異的能動免疫療法は、サイトカイン、および／または、一般的な免疫系応答を誘導する他の細胞シグナル伝達構成要素、を利用する。いくつかの場合には、特異的能動免疫療法は、特異的なＴＡＡを利用して免疫応答を誘発する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、疾患または障害（例えば癌）の処置のための能動型の免疫腫瘍治療の方法として使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、腫瘍標的化剤を含む。いくつかの例では、腫瘍標的化剤は、結合部分Ａに包含される。他の例では、腫瘍標的化剤は、式（Ｉ）の分子と組み合わされて使用される追加の薬剤である。いくつかの例では、腫瘍標的化剤は、腫瘍指向性ポリペプチド（ｔｕｍｏｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）（例えば、腫瘍指向性抗体）である。いくつかの例では、腫瘍標的化剤は、直接的死滅（例えば、シグナル伝達誘発アポトーシス）などの機序を介してその抗腫瘍活性を発揮する腫瘍指向性抗体、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。さらなる場合には、腫瘍標的化剤は、抗腫瘍Ｔ細胞の誘発と共に、適応免疫応答を誘発する。
いくつかの実施形態では、結合部分Ａは、腫瘍指向性ポリペプチド（例えば、腫瘍指向性抗体）である。いくつかの例では、結合部分Ａは、直接的死滅（例えば、シグナル伝達誘発アポトーシス）などの機序を介してその抗腫瘍活性を発揮する腫瘍指向性抗体、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。さらなる場合には、結合部分Ａは、抗腫瘍Ｔ細胞の誘発と共に、適応免疫応答を誘発する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、免疫標的化剤を含む。いくつかの例では、免疫標的化剤は、結合部分Ａに包含される。他の例では、免疫標的化剤は、式（Ｉ）の分子と組み合わされて使用される追加の薬剤である。いくつかの例では、免疫標的化剤は、サイトカイン、チェックポイント阻害剤またはその組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、免疫標的化剤は、チェックポイント阻害剤である。いくつかの場合には、免疫チェックポイント分子は、ＣＤ４および／またはＣＤ８ Ｔ細胞の細胞表面上で提示される分子である。典型的な免疫チェックポイント分子は、限定されないが、プログラム死リガンド１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ−Ｌｉｇａｎｄ １）（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４としても知られるＰＤ−Ｌ１）、プログラム死（ＰＤ−１）、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ４、ＯＸ １ − ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、２Ｂ４、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）、ＬＡＧ３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤＬ２、Ｂ７Ｈ３、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＧＡＬ９、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、ＭＡＲＣＯ（膠原性（ｃｏｌｌａｇｅｎｅｏｕｓ）構造を有するマクロファージ受容体）、ＰＳ（ホスファチジルセリン）、ＩＣＯＳ（誘発可能Ｔ細胞補助刺激分子）、ＨＡＶＣＲ２、ＣＤ２７６、ＶＴＣＮ１、ＣＤ７０およびＣＤ１６０、を含む。
いくつかの例では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント分子の活性を調節または阻害する任意の分子を指す。いくつかの例では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、抗体誘導体（例えばＦａｂ断片、ｓｃＦｖｓ、ミノボディ、ダイアボディ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アプタマーまたはペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム死リガンド１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４としても知られるＰＤ−Ｌ１）の阻害剤である、プログラム死（ＰＤ−１）、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、２Ｂ４、Ａ２ａＲ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２２６、ＣＤ２７６、ＤＲ３、ＧＡＬ９、ＧＩＴＲ、ＨＡＶＣＲ２、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＩＣＯＳ（誘発可能Ｔ細胞補助刺激分子）、ＫＩＲ、ＬＡＩＲ１、ＬＩＧＨＴ、ＭＡＲＣＯ（膠原性構造を有するマクロファージ受容体）、ＰＳ（ホスファチジルセリン）、ＯＸ−４０、ＳＬＡＭ、ＴＩＧＨＴ、ＶＩＳＴＡ、ＶＴＣＮ１、または、その任意の組み合わせ、を含む。
いくつかの実施形態では、典型的なチェックポイント阻害剤は以下が含まれる。
Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４６）、ＢｉｏＸｃｅｌｌの抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体クローン１０Ｆ．９Ｇ２（カタログ番号ＢＥ０１０１）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒ’ｓ Ｓｑｕｉｂｂの抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体ＭＤＸ−１１０５（ＢＭＳ−９３６５５９）およびＢＭＳ−９３５５５９、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、マウス抗ＰＤ−Ｌ１クローン２９Ｅ．２Ａ３、および、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ＭＥＤＩ４７３６、などのＰＤ−Ｌ１阻害剤。
ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのＡＭＰ−２２４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）、およびｒＨＩｇＭ１２Ｂ７、などのＰＤ−Ｌ２阻害剤。
ＢｉｏＸｃｅｌｌからの抗マウスＰＤ−１抗体クローンＪ４３（カタログ番号ＢＥ００３３−２）、ＢｉｏＸｃｅｌｌからの抗マウスＰＤ−１抗体クローンＲＭＰ１−１４（カタログ番号ＢＥ０１４６）、マウス抗ＰＤ−１抗体クローンＥＨ１２、Ｍｅｒｃｋ’ｓ ＭＫ−３４７５抗マウスＰＤ−１抗体（キイトルーダ、ペンブロリズマブ、ランブロリズマブ）、ＡＮＢ０１１として知られるＡｎａｐｔｙｓＢｉｏの抗ＰＤ−１抗体、抗体ＭＤＸ−１ １０６（ＯＮＯ−４５３８）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ ＳｑｕｉｂｂのヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体ニボルマブ（オプジーボ（登録商標）、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６）、ＣｕｒｅＴｅｃｈ ＬｔｄのＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ＡＭＰ−５１４およびＡＭＰ−２２４、およびピディリズマブ（ＣＴ−０１１）、などのＰＤ−１阻害剤。
Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂの抗ＣＴＬＡ−４抗体イピリムマブ（またヤーボイ（登録商標）、ＭＤＸ−０１０、ＢＭＳ−７３４０１６およびＭＤＸ−１０１として知られている）、抗ＣＴＬＡ４抗体、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅのクローン９Ｈ１０、Ｐｆｉｚｅｒのトレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６、チシリムマブ）、および、Ａｂｃａｍの抗ＣＴＬＡ４抗体クローンＢＮＩ３、などのＣＴＬＡ−４阻害剤。
ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅの抗Ｌａｇ−３抗体クローンｅＢｉｏＣ９Ｂ７Ｗ（Ｃ９Ｂ７Ｗ）などのＬＡＧ３阻害剤、ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの抗Ｌａｇ３抗体ＬＳ−Ｂ２２３７、ＩｍｍｕｔｅｐのＩＭＰ３２１（ＩｍｍｕＦａｃｔ）、抗Ｌａｇ３抗体ＢＭＳ−９８６０１６、および、ＬＡＧ−３キメラ抗体Ａ９Ｈ１２、などのＬＡＧ３阻害剤。
ＭＧＡ２７１などのＢ７−Ｈ３阻害剤。
リリルマブ（Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）（ＩＰＨ２１０１）などのＫＩＲ阻害剤。
ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＰＦ−０５０８２５６６（抗−４−１ＢＢ、ＰＦ−２５６６、Ｐｆｉｚｅｒ）、またはＸｍＡｂ−５５９２（Ｘｅｎｃｏｒ）、などのＣＤ１３７（４１ＢＢ）阻害剤。
バビツキシマブなどのＰＳ阻害剤。
その抗体または断片などの阻害剤（例えば、モノクローナル抗体、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体）、ＲＮＡｉ分子、または、ＴＩＭ３、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ２７、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＴＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴ、ＤＲ３、ＣＤ２２６、ＣＤ２、またはＳＬＡＭに対する小分子。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤を含む結合部分Ａは、疾患または障害（例えば癌）の処置のために使用される。いくつかの例では、結合部分Ａは、免疫チェックポイント阻害剤を含む、二重特異性抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、プログラム死リガンド１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４としても知られるＰＤ−Ｌ１）、プログラム死（ＰＤ−１）、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、２Ｂ４、Ａ２ａＲ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２２６、ＣＤ２７６、ＤＲ３、ＧＡＬ９、ＧＩＴＲ、ＨＡＶＣＲ２、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＩＣＯＳ（誘発可能Ｔ細胞補助刺激分子）、ＫＩＲ、ＬＡＩＲ１、ＬＩＧＨＴ、ＭＡＲＣＯ（膠原性構造を有するマクロファージ受容体）、ＰＳ（ホスファチジルセリン）、ＯＸ−４０、ＳＬＡＭ、ＴＩＧＨＴ、ＶＩＳＴＡ、ＶＴＣＮ１、または、その任意の組み合わせの阻害剤を含む結合部分Ａは、疾患または障害（例えば癌）の処置に使用される。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わされる式（Ｉ）の分子は、疾患または障害（例えば癌）の処置のために使用される。いくつかの例では、免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム死リガンド１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４としても知られるＰＤ−Ｌ１）の阻害剤である、プログラム死（ＰＤ−１）、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、２Ｂ４、Ａ２ａＲ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２２６、ＣＤ２７６、ＤＲ３、ＧＡＬ９、ＧＩＴＲ、ＨＡＶＣＲ２、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＩＣＯＳ（誘発可能Ｔ細胞補助刺激分子）、ＫＩＲ、ＬＡＩＲ１、ＬＩＧＨＴ、ＭＡＲＣＯ（膠原性構造を有するマクロファージ受容体）、ＰＳ（ホスファチジルセリン）、ＯＸ−４０、ＳＬＡＭ、ＴＩＧＨＴ、ＶＩＳＴＡ、ＶＴＣＮ１、または、その任意の組み合わせ、の阻害剤を含む。いくつかの場合には、式（Ｉ）の分子は、疾患または障害（例えば癌）の処置のために、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＭＫ−３４７５またはＢＭＳ−９３６５５９と組み合わされて使用される。
いくつかの実施形態では、免疫標的化剤は、サイトカインである。ある場合には、サイトカインは、さらに、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキンおよび腫瘍壊死因子に小群に分けられる。いくつかの実施形態では、ケモカインは、細胞の移動をガイドする化学誘引物質としての役割を果たし、４つのサブファミリーＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３ＣおよびＸＣに分類される。典型的なケモカインは、ＣＣサブファミリー：ＣＣＬ１、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９（またはＣＣＬ１０）、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７およびＣＣＬ２８；ＣＸＣサブファミリー：ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、および、ＣＸＣＬ１７；ＸＣサブファミリー：ＸＣＬ１とＸＣＬ２；および、ＣＸ３ＣサブファミリーＣＸ３ＣＬ１、からのケモカインを含む。
インターフェロン（ＩＦＮ）は、インターフェロンタイプＩ（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κおよびＩＦＮ −ω）、インターフェロンタイプＩＩ（例えばＩＦＮ−γ）およびインターフェロンタイプＩＩＩを含む。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ−αはさらに、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７およびＩＦＮＡ２１を含む約１３のサブタイプに分類される。
インターロイキンは、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）または白血球細胞（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）によって発現され、Ｔリンパ球およびＢリンパ球および造血細胞の発生および分化を促進する。典型的なインターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５およびＩＬ−３６、を含む。
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）はアポトーシスを調節する一群のサイトカインである。いくつかの例では、限定されないが、ＴＮＦα、リンフォトキシンアルファ（ＬＴ−α）、リンフォトキシンベータ（ＬＴ−β）、Ｔ細胞抗原ｇｐ３９（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＦＡＳＬ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０ＬおよびＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を含む、ＴＮＦファミリー内の約１９のメンバーがある。
いくつかの実施形態では、サイトカインと組み合わされる式（Ｉ）の分子は、疾患または疾病（例えば癌）の処置に使用される。いくつかの場合には、ケモカインと組み合わされる式（Ｉ）の分子が、疾患または障害（例えば癌）の処置に使用される。いくつかの場合には、インターフェロンと組み合わされる式（Ｉ）の分子が、疾患または障害（例えば癌）の処置に使用される。いくつかの場合には、インターロイキンと組み合わされる式（Ｉ）の分子が、疾患または障害（例えば癌）の処置に使用される。いくつかの場合には、腫瘍壊死因子と組み合わされる式（Ｉ）の分子が、疾患または障害（例えば癌）の処置に使用される。いくつかの例では、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ５、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０またはＣＸＣＬ１１と組み合わされる式（Ｉ）の分子が、疾患または障害（例えば癌）の処置に使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または医薬は、免疫化剤を含む。いくつかの例では、ワクチンは、インサイチュ接種である。いくつかの例では、ワクチンは細胞系ワクチンである。いくつかの例では、ワクチンは、非細胞系ワクチンである。いくつかの例では、樹状細胞系ワクチンと組み合わされる式（Ｉ）の分子が、疾患または障害（例えば癌）の処置に使用される。いくつかの例では、腫瘍細胞系ワクチンと組み合わされる式（Ｉ）の分子が、疾患または障害（例えば癌）の処置に使用される。いくつかの例では、抗原ワクチンと組み合わされる式（Ｉ）の分子が、疾患または障害（例えば癌）の処置に使用される。いくつかの例では、抗イディオタイプ系ワクチンと組み合わされる式（Ｉ）の分子が、疾患または障害（例えば癌）の処置に使用される。いくつかの例では、ＤＮＡワクチンと組み合わされる式（Ｉ）の分子が、疾患または障害（例えば癌）の処置に使用される。いくつかの例では、ベクター系ワクチンと組み合わされる式（Ｉ）の分子が、疾患または障害（例えば癌）の処置に使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、疾患または障害（例えば癌）の処置のための受動型の免疫腫瘍治療の方法として使用される。受動型の方法は、いくつかの例において、癌細胞を攻撃するために外因的に生成された、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、および／または、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞などの養子免疫系構成要素を利用する。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞系治療剤と組み合わされる式（Ｉ）の分子は、疾患または疾病（例えば癌）の処置に使用される。いくつかの場合には、Ｔ細胞系治療剤は、上述のＣＤ細胞表面マーカーの１つ以上を認識する活性化Ｔ細胞薬剤である。いくつかの例では、Ｔ細胞系治療剤は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１６０、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２２３、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ２５８、ＣＤ２６７、ＣＤ２７２、ＣＤ２７４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９またはＣＤ３５７の１つ以上を認識する活性化Ｔ細胞薬剤を含む。いくつかの例では、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１６０、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２２３、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ２５８、ＣＤ２６７、ＣＤ２７２、ＣＤ２７４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９またはＣＤ３５７の１つ以上を認識する活性化Ｔ細胞薬剤と組み合わされる式（Ｉ）の分子は、疾患または障害（例えば癌）の処置に使用される。
いくつかの実施形態では、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞系治療剤と組み合わされる式（Ｉ）の分子は、疾患または障害（例えば癌）の処置に使用される。いくつかの例では、ＮＫ系治療剤は、上述のＣＤ細胞表面マーカーの１つ以上を認識する活性化ＮＫ薬剤である。いくつかの場合には、ＮＫ系治療剤が、ＣＤ２、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８５ｊ、ＣＤ１５８ａ／ｂ、ＣＤ１５８ｃ、ＣＤ１５８ｅ／ｆ／ｋ、ＣＤ１５８ｈ／ｊ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１６２、ＣＤ２２６、ＣＤ３１４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３７、ＣＤ２４４またはＣＤ３１９の１つ以上を認識する活性化ＮＫ薬剤である。いくつかの例では、ＣＤ２、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８５ｊ、ＣＤ１５８ａ／ｂ、ＣＤ１５８ｃ、ＣＤ１５８ｅ／ｆ／ｋ、ＣＤ１５８ｈ／ｊ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１６２、ＣＤ２２６、ＣＤ３１４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３７、ＣＤ２４４またはＣＤ３１９の１つ以上を認識する活性化ＮＫ薬剤と組み合わされる式（Ｉ）の分子は、疾患または障害（例えば癌）の処置に使用される。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞系治療剤と組み合わされる式（Ｉ）の分子は、疾患または障害（例えば癌）の処置に使用される。
いくつかの実施形態では、エンドソーム膜を不安定化する（またはエンドソーム−リソソーム膜輸送を妨害する）追加の薬剤と組み合わされる式（Ｉ）の分子は、疾患または障害（例えば癌）の処置に使用される。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は有糸分裂阻害剤を含む。典型的な抗有糸分裂薬剤は、限定されないが、パクリタキセルおよびドセタセルなどのタキサン；ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド；カバジタキセル；コルヒチン；エリブリン；エストラムスチン；エトポシド；イキサベピロン；ポドフィロトキシン；テニポシド；または、グリセオフルビン、を含む。いくつかの例では、補足薬剤はパクリタキセル、ドセタセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カバジタキセル、コルヒチン、エリブリン、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、エトポシド、イキサベピロン、ポドフィロトキシン、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）またはグリセオフルビンを含む。いくつかの実施形態では、追加の薬剤はタキソール（ｔａｘｏｌ）を含む。いくつかの実施形態では、追加の薬剤はパクリタキセルを含む。いくつかの実施形態では、追加の薬剤はエトポシドを含む。他の例では、追加の薬剤はビタミンＫ３を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、疾患または障害（例えば癌）の処置における併用型の方法（能動型の方法および受動型の方法の両方を含む）として使用される。
医薬製剤
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された医薬製剤は、限定されないが、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）、経口、鼻腔内、頬側、局所、直腸、または、経皮の投与経路を含む、複数の投与経路によって被験体に投与される。いくつかの例では、本明細書に記載の医薬組成物は、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）投与のために製剤される。他の例では、本明細書に記載の医薬組成物は、経口投与のために製剤される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、直腸内投与のために処方される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬製剤は、限定されないが、水性液分散、自己乳化分散液、固溶体、リポソーム分散剤、エアロゾル、固体の剤形、粉末、即時放出製剤、制御放出製剤、高速溶解製剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス状放出製剤、多重粒子製剤（例えばナノ粒子製剤）、および、即時かつ制御性の混合型放出製剤、を含む。
いくつかの例では、医薬製剤は多粒子製剤を含む。いくつかの例では、医薬製剤はナノ粒子製剤を含む。いくつかの例では、ナノ粒子は、ｃＭＡＰ、シクロデキストリン、または脂質を含む。いくつかの場合には、ナノ粒子は、固体脂質ナノ粒子、ポリマー性ナノ粒子、自己乳化ナノ粒子、リポソーム、マイクロエマルジョン、または、ミセル溶液を含む。追加の典型的なナノ粒子は、限定されないが、常磁性のナノ粒子、超常磁性のナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様の材料、無機のナノチューブ、デンドリマー（例えば共有結合した金属キレートを有するようなもの）、ナノファイバー、ナノホーン、ナノオニオン（ｎａｎｏ−ｏｎｉｏｎ）、ナノロッド、ナノロープおよび量子ドット、を含む。いくつかの例では、ナノ粒子は、金属ナノ粒子、例えばスカンジウム、チタン、バナジウム、クロミウム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、プラチナ、金、ガドリニウム、アルミニウム、ガリウム、インジウム、錫、タリウム、鉛、ビスマス、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、リチウム、ナトリウム、カリウム、ホウ素、シリコン、燐、ゲルマニウム、ヒ素、アンチモニ、および、その組み合わせ、合金または酸化物、のナノ粒子である。
いくつかの例では、コアシェルナノ粒子においてのように、ナノ粒子は、コアまたはコアおよびシェルを含む。
いくつかの例では、ナノ粒子は、機能的要素（例えば、本明細書に記載される１つ以上のポリ核酸分子または結合部分）と結合するための分子でさらに被覆される。いくつかの例では、コーティングは、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、アルギン酸、ペクチン、カラギーナン、フコイダン、アガロペクチン、ポルフィラン、カラヤゴム、ジェランガム、キサンタンガム、ヒアルロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、キチン（またはキトサン）、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リゾチーム、シトクロムｃ、リボヌクレアーゼ、トリプシノゲン、キモトリプシノゲン、α−キモトリプシン、ポリリシン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、オバルブミン、デキストリンまたはシクロデキストリン、を含む。いくつかの例では、ナノ粒子は、グラフェン被覆ナノ粒子を含む。
いくつかの場合には、ナノ粒子は、約５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍまたは１００ｎｍ未満のうち少なくとも１つの寸法を有する。
いくつかの例では、ナノ粒子製剤は、限定されないが、常磁性のナノ粒子、超常磁性のナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様の材料、無機のナノチューブ、デンドリマー（例えば共有結合した金属キレートを有するようなもの）、ナノファイバー、ナノホーン、ナノオニオン（ｎａｎｏ−ｏｎｉｏｎ）、ナノロッド、ナノロープ、または、量子ドット、を含む。いくつかの例では、本明細書に記載のポリ核酸分子または結合部分は、ナノ粒子に直接または間接的に抱合する。いくつかの例では、少なくとも１、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０の、８０、９０、１００またはより多くの、本明細書に記載のポリ核酸分子または結合部分は、ナノ粒子に直接または間接的に抱合する。
いくつかの実施形態では、医薬製剤は、本明細書に開示される組成物との適合性、および所望の剤形の放出プロフィール特性に基づいて選択される担体または担体物質を含む。典型的な担体物質は、例えば、結合剤、懸濁化剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、溶解剤、スタビライザー、潤滑剤、湿潤剤、希釈剤などを含む。薬学的に適合性の担体物質は、限定されないが、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼインナトリウム、大豆レシチン、タウロコール酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロースおよびセルロース抱合体、砂糖ナトリウムステアロイルラクチレート（ｓｕｇａｒｓ ｓｏｄｉｕｍ ｓｔｅａｒｏｙｌ ｌａｃｔｙｌａｔｅ）、カラゲニン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファ化デンプン、などを含む。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９５）； Ｈｏｏｖｅｒ， Ｊｏｈｎ Ｅ．， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５； Ｌｉｂｅｒｍａｎ， Ｈ．Ａ． ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ， Ｌ．， Ｅｄｓ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８０； ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）、を参照。
いくつかの例では、医薬製剤はさらにｐＨ調節剤、または緩衝剤を含み、これらには、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸および塩酸などの酸；水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウムおよびトリスヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基；および、クエン酸塩／ブドウ糖、重炭酸ナトリウムおよび塩化アンモニウムなどの緩衝液、が含まれる。そのような酸、塩基および緩衝液は、組成物のｐＨを許容範囲内に維持するのに必要な量で含まれる。
いくつかの例では、医薬製剤は、組成物の重量オスモル濃度を許容範囲内にするのに必要な量の１種以上の塩を含む。そのような塩類は、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムカチオンおよび塩化物を有するもの、クエン酸、アスコビル酸、ホウ酸、リン酸、重炭酸ソーダ、硫酸、チオ硫酸または亜硫酸水素アニオンを含み；適切な塩類は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、ナトリウム亜硫酸水素および硫酸アンモニウムを含む。
いくつかの例では、医薬製剤は、より安定な環境を提供することができるため、化合物を安定化するために使用される希釈剤をさらに含む。緩衝液（ｐＨの制御または維持を提供することもできる）に溶解された塩は、リン酸緩衝食塩水を含むがこれに限定されない、当該技術分野の希釈剤として利用される。特定の例では、希釈剤は、圧縮を容易にするため、またはカプセル充填のための均質なブレンドのために十分な嵩を作り出すために、組成物の嵩を増加させる。このような化合物は、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）などの微結晶性セルロース；リン酸水素カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物；リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム；無水ラクトース、スプレー乾燥ラクトース；アルファ化デンプン、Ｄｉ−Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）などの圧縮性糖；マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ ｓｔｅａｒａｔｅ）、スクロース系希釈剤、粉砂糖；一塩基硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物；乳酸カルシウム三水和物、デキストレート（ｄｅｘｔｒａｔｅｓ）；加水分解されたシリアル固体、アミロース；粉末セルロース、炭酸カルシウム；グリシン、カオリン；マンニトール、塩化ナトリウム；イノシトール、ベントナイトなど、を含む。
いくつかの場合には、医薬製剤は、物質の分解または崩壊を容易にするための分解剤または崩壊剤を含む。「崩壊する」という用語には、胃腸液と接触した場合の剤形の溶解および分散の両方が含まれる。分解剤の例は、スターチ例えばコーンスターチまたはポテトスターチのような天然のスターチ、Ｎａｔｉｏｎａｌ１５５１またはＡｍｉｊｅｌ（登録商標）のようなアルファ化デンプン、あるいは、Ｐｒｏｍｏｇｅｌ（登録商標）またはＥｘｐｌｏｔａｂ（登録商標）などのナトリウムスターチグリコレート、木産物などのセルロース、メチル結晶性セルロース、例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０１、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０５、Ｅｌｃｅｍａ（登録商標）Ｐ１００、Ｅｍｃｏｃｅｌ（登録商標）、Ｖｉｖａｃｅｌ（登録商標）、ＭｉｎｇＴｉａ（登録商標）、およびＳｏｌｋａＦｌｏｃ（登録商標）、メチルセルロース、クロスカルメロース、または、交差結合ナトリウムカルボキシメチルセルロース（Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ（登録商標））、交差結合カルボキシメチルセルロース、あるいは交差結合クロスカルメロース、などの交差結合セルロース、ナトリウムスターチグリコレートなどの交差結合スターチ、クロスポビドンなどの架橋ポリマー、交差結合ポリビニルピロリドン、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸塩、などのアルギネート、Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）ＨＶ（ケイ酸アルミニウムマグネシウム）などの粘土、カンテン、グアー、イナゴマメ、カラヤ、ペクチンまたはトラガントなどのゴム、ナトリウムスターチグリコレート、ベントナイト、天然スポンジ、界面活性剤、陽イオン交換樹脂などの樹脂、柑橘パルプ、ラウリル硫酸ナトリウム、併用スターチ中のラウリル硫酸ナトリウム、などを含む。
いくつかの例では、医薬製剤は、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶性セルロース、セルロース粉末、ブドウ糖、デキストレート、デキストラン、スターチ、アルファ化デンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどの充填剤を含む。
潤滑剤および流動促進剤も、物質の接着または摩擦を防止、低減または阻害するために、本明細書に記載の医薬製剤に任意に含まれる。典型的な潤滑剤は、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、滑石、ナトリウムステアリルフマレート、鉱油などの炭化水素、水素化大豆油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））などの硬化植物油、高級脂肪酸およびそれらのアルカリ金属とアルカリ土類金属塩、例えばアルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、滑石、ワックス、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ−４０００）またはメトキシポリエチレンエチレングリコール、例えばＣａｒｂｏｗａｘ（商標）、オレイン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムまたはナトリウム、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）などのコロイダルシリカ、Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ（登録商標）、コーンスターチなどのデンプン、シリコン油、界面活性剤など、を含む。
可塑剤には、マイクロカプセル化材料またはフィルムコーティングを軟化させて脆さを少なくするために使用される化合物が含まれる。適切な可塑剤は、例えば、ＰＥＧ ３００、ＰＥＧ ４００、ＰＥＧ ６００、ＰＥＧ １４５０、ＰＥＧ ３３５０およびＰＥＧ ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、トリアセチン、を含む。可塑剤は、さらに分散剤または湿潤剤として機能することができる。
溶解剤は、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ドクサートナトリウム、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ−ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁酸塩、ポリエチレングリコール２００−６００、グリコフロール（ｇｌｙｃｏｆｕｒｏｌ）、トランスクトール（ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）、プロピレングリコール、ジメチルイソソルビド、などの化合物を含む。
スタビライザーは、任意の酸化防止剤、緩衝剤、酸、防腐剤などの化合物が含まれる。
懸濁化剤は、ポリビニルピロリドン例えばポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、または、ポリビニルピロリドンＫ３０、ビニールピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール例えば、約３００〜約６０００、または約３３５０〜約４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有することができるポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースアセテートステアレート、ポリソルベート−８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ゴム例えばトラガカントゴム、アラビアゴム、グアーゴム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、セルロース由来物例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリソルベート−８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート（ｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポビドン、などの化合物を含む。
界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ドクサートナトリウム、トゥイーン６０または８０、トリアセチン、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート、ポロクサマー（ｐｏｌａｘｏｍｅｒ）、胆汁酸塩、モノステアリン酸グリセリン、エチレンオキシドおよび酸化プロピレンのコポリマー、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）、などの化合物を含む。さらなる界面活性剤は、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリドおよび植物油、例えばポリオキシエチレン（６０）硬化ヒマシ油；および、ポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびアルキルフェニルエーテル、例えばｏｃｔｏｘｙｎｏｌ １０、ｏｃｔｏｘｙｎｏｌ ４０、を含む。場合によっては、物理的安定性を強化するため、または他の目的のために界面活性剤が含まれることがある。
粘度増強剤は、例えばメチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギネート、アカシア、キトサン、およびその組み合わせ、を含む。
湿潤剤は、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ドクサートナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ドクサートナトリウム、トリアセチン、トゥイーン８０、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などの化合物を含む。
処置レジメン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、治療用途のために投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１日１回、１日２回、１日３回、またはそれより多く、投与される。医薬組成物は、日常的に、毎日、隔日、週５日、週１回、隔週、月２週間、月３週間、月１回、月２回、月３回、またはそれより多く、投与される。医薬組成物は、少なくとも１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月間、１２か月間、１８か月間、２年間、３年間、またはそれより長く、投与される。
いくつかの実施形態では、１つ以上の医薬組成物は、同時に、連続して、または、一定の間隔で、投与される。いくつかの実施形態では、１つ以上の医薬組成物は、同時に投与される。いくつかの場合には、１つ以上の医薬組成物は、連続して投与される。さらなる場合には、１つ以上の医薬組成物が、一定の間隔で投与される（例えば、第１の医薬組成物の第１の投与が１日目であり、その後、少なくとも第２の医薬組成物の投与前に、少なくとも１、２、３、４、５日間又はそれ以上の間隔があけられる）。
いくつかの実施形態では、２つ以上の異なる医薬組成物が、共投与される。いくつかの例では、２つ以上の異なる医薬組成物は、同時に共投与される。いくつかの場合には、２つ以上の異なる医薬組成物は、投与間の隙間時間なく、連続して共投与される。他の場合には、２つ以上の異なる医薬組成物は、投与の間が約０．５時間、１時間、２時間、３時間、１２時間、１日、２日、またはより長く、連続して共投与される。
患者の状態が改善する場合には、医師の裁量により組成物の投与が継続的に行われ；あるいは、投与されている組成物の用量は一時的に減少され、または、一定の期間の間、一時的に中断される（すなわち、「休薬日」）。いくつかの例では、休薬日の長さは、一例として、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日、７０日、１００日、１２０日、１５０日、１８０日、２００日、２５０日、２８０日、３００日、３２０日、３５０日、または３６５日、を含む、２日〜１年の間で変動する。休薬日中の用量低減は、一例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を含む、１０％−１００％である。
患者の症状が改善すると、必要に応じて維持用量を投与する。続いて、投与量または投与頻度またはその両方を、症状に応じて、疾患、障害または状態の改善が保持されるレベルにまで随意に低下させる。
いくつかの実施形態では、そのような量に対応する所与の薬剤の量は、特定の化合物、疾患の重症度、処置を必要とする被験体または宿主の独自性（例えば、体重）などの要因に依存して変化するが、しかし、例えば、投与される特定の薬剤、投与経路、および処置される被験体または宿主を含む、当該症例を取り巻く特定の状況に応じて当技術分野で公知の方法で慣例的に決定される。いくつかの例では、所望の用量は、単一用量で、または、同時（または短期間にわたって）または適切な間隔、例えば、１日当たり２、３、４回またはそれより多くのサブ用量で、投与される分割用量として、都合がいいように提供される。
個々の処置レジメンに関する変動の数が多く、かつ、これらの推奨値からのかなりの偏差が珍しいことではないため、上記の範囲は、単なる示唆的なものである。このような投与は、使用される化合物の活性、処置される疾患または症状、投与モード、扱われている管理、個々の被験体の必要条件、処置される疾患または症状の重症度、および開業医の判断、を含むがこれに限定されない多くの変数に応じて変更される。
いくつかの実施形態では、そのような治療レジメンの毒性および治療効能は、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（人口の５０％に対する治療上有効な用量）の判定を含むがこれらに限定されない、細胞培養または実験動物における標準的な製薬手続によって判定される。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、これはＬＤ５０とＥＤ５０との間の比として表される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための用量の範囲を定式化する際に使用される。そのような化合物の用量は、好ましくは、最小限の毒性のＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化する。
キット／製品
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法の１つ以上との使用のためのキットおよび製品である。このようなキットは、バイアル、チューブなどの１つ以上の容器を受け容れるために仕切られている運搬装置（ｃａｒｒｉｅｒ）、包装または容器を含み、この容器の各々は、本明細書に記載の方法で使用される、個別の要素のうちの１つを含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。一実施形態では、容器はガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成される。
本明細書で提供される製品は、包装材料を含む。医薬包装材料としては、ブリスターパック、瓶、チューブ、バッグ、容器、瓶、および、選択された製剤と投与および処置の意図された様式とに適切な任意の包装材料が挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、容器は、本明細書に開示されるエンドソーム溶解性部分Ｄに随意に抱合する、式（Ｉ）：Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃの分子を含む。このようなキットは、本明細書中に記載される方法におけるその使用に関する、識別的な解説書、又はラベル、或いは説明書を随意に含む。
キットは、典型的には、典型的には、内容を列挙したラベル、および／または使用説明書、および使用説明書付き添付文書を含む。典型的には、１セットの説明書も含まれる。
１つの実施形態では、ラベルは容器上にあるか、または容器に付随する。一実施形態では、ラベルを形成する文字、数字または他の記号が、容器自体に付けられ、モールド加工され、または刻まれている場合は、ラベルは容器上にあるとする。ラベルが、例えば添付文書として、容器を保持する入れ物または運搬装置の中に存在する場合、ラベルは容器に付随するとする。一実施形態において、ラベルは、内容物が特定の治療用途に用いられるべきものであるということを示すために用いられる。ラベルは、例えば、本明細書に記載の方法で、内容物を用いる使用するための指示を示すように使用されてもよい。
特定の実施形態において、医薬組成物は、本明細書で提供される化合物を含む１以上の単位剤形を含む、パックまたはディスペンサーデバイスで与えられる。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含む。一実施形態において、パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付してある。一実施形態において、パックまたはディスペンサーには、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態の容器に付属の通知書が添付してあり、この通知書は、ヒトまたは動物の投与のための薬物の形態についての、当局の承認を反映するものである。このような通知書は、例えば、処方薬または承認された生成物の挿入に関して、米国食品医薬品局により承認されたラベルである。一実施形態では、適合性の医薬の運搬装置（ｃａｒｒｉｅｒ）中で処方される、本明細書で提供される化合物を含む組成物はまた、適切な包装容器において調合、入れることができ、示された疾患の処置のために標識される。
特定の用語別段の定めのない限り、本明細書に記載される技術的かつ科学的な用語はすべて、本特許請求の主題が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。前述の一般的な記載と以下の詳細な記載は典型的かつ説明的なものに過ぎず、任意の主題に限定されるものではないことが理解されよう。本出願では、単数の使用は、特別に別記しない限り、複数を含む。明細書および添付の請求項内で用いられる通り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その文脈で明確に別記しない限り、複数の指示対象を含む。本出願において、「または」の使用は特に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」といった他の形態と同じく、限定的なものではない。
本明細書で使用されているように、範囲と量は、「約（ａｂｏｕｔ）」として特定の値または範囲を表すことができる。「約」は正確な量も含んでいる。ゆえに、「約５μｇ」は「約５μｇ」も「５μｇ」も意味する。一般に、用語「約」は、実験誤差内にあると予想される量を含む。
本明細書で使用される段落の表題は、単に編成のみを目的とし、記載された主題を制限すると解釈されるものではない。
本明細書に使用されるように、用語「個人」、「被験体」および「患者」は、任意の哺乳動物を意味する。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトではない。これらの用語は、医療従事者（例えば、医師、登録看護士、看護師、医師のアシスタント、用務員またはホスピスワーカー）の監督（例えば、一定または断続的なもの）を特徴とする状況を必要せず、これらに限定されることもない。
＜実施例＞
これらの実施例は、説明の目的でのみ提供され、本明細書に提供される特許請求の範囲を限定するものではない。
実施例１．配列
表１、４、７、８および１０は、本明細書に記載の標的配列を示す。表２、３、５、６、９、１２は、本明細書に記載のポリ核酸分子配列を示す。
実施例２．一般的な実験プロトコルｓｉＲＮＡの定量のためのステムループｑＰＣＲアッセイ
血漿サンプルをＴＥ緩衝液中で直接希釈した。ＦａｓｔＰｒｅｐ−２４組織ホモジナイザー（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて５０ｍｇの組織片を１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ中でホモジナイズし、次いでＴＥ緩衝液で希釈した。標準曲線を、未処置動物由来の血漿またはホモジナイズした組織にｓｉＲＮＡを添加（ｓｐｉｋｉｎｇ）し、次いでＴＥ緩衝液で連続的に希釈することによって、生成した。２５ｎＭの配列特異的ステムループＲＴプライマーを備えるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を逆転写した。１．５μＭのフォワードプライマー、０．７５μＭのリバースプライマー、および０．２μＭのプローブを備えるＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＲＴステップからのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲに利用した。ＫＲＡＳおよびＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖、および、それらを測定するために使用されたすべてのプライマーおよびプローブの配列を表１３に示す。量的ＰＣＲ反応を、ＶｉｉＡ ７ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において標準的なサイクル条件を用いて行った。標準曲線から導き出された線形方程式を用いて、Ｃｔ値を血漿濃度または組織濃度に変換した。
ｍＲＮＡノックダウンの判定のための比較ｑＰＣＲアッセイ
組織サンプルを、上述のようにＴｒｉｚｏｌでホモジナイズした。ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ単離９６ウェルプレート（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを単離し、次いで、５００ｎｇのＲＮＡをＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で逆転写した。ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＣＴＮＮＢ１およびＰＰＩＢ ｍＲＮＡを、ＶｉｉＡ ７ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行ったＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ分析によって定量した。ＫＲＡＳについてのＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブは、Ａｖｉｄｉｔｙによって設計および検証され、表１４に示されている。ＥＧＦＲおよびＣＴＮＮＢ１についてのＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブを、事前に検証された遺伝子発現アッセイとしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照（ＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用し、ＰＰＩＢについてのすべてのＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブを事前検証された遺伝子発現アッセイとしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。結果は比較Ｃｔ方法によって計算され、ここで、標的遺伝子（ＫＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１またはＥＧＦＲ）のＣｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）の間の差を計算し、次いで、次に第２の差（ΔΔＣｔ）を取ることによってＰＢＳ対照群に対してさらに正規化した。
動物
動物試験はすべて、ＵＳＤＡ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔおよび“Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ”（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、第８版、２０１１年改訂）に記載されている規制に準拠する、Ｅｘｐｌｏｒａ ＢｉｏＬａｂでのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によるプロトコルに従い実施した。すべてのマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたはＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。
Ｈ３５８、ＨＣＣ８２７、およびＨｅｐ−３Ｂ２ １−７皮下の側腹部腫瘍モデル
Ｈ３５８皮下の側腹部腫瘍モデルについて、腫瘍細胞を接種し、以下の方法に従って腫瘍を株化した（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）。メスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスを、細胞注射の前日に耳タグで識別した。マウスを接種に先立ち計量した。Ｈ３５８細胞を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地で培養し、０．０５％トリプシンおよびＣｅｌｌ Ｓｔｒｉｐｐｅｒ（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ）で採集した。マトリゲル（１：１）を含む０．０５ｍｌハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中の５００万個のＨ３５８細胞を、各マウスの右上側腹部に皮下（ＳＣ）注射した。腫瘍増殖を、接種後７日目に開始するデジタルキャリパー（ｄｉｇｉｔａｌ ｃａｌｉｐｅｒ）を用いた腫瘍体積測定によってモニタリングし、平均腫瘍体積が １００超かつ３００ｍｍ３以下に達するまで週２回追跡した。腫瘍が所望の体積（平均１００〜３００ｍｍ３）に分類されると、動物を無作為化し、非常に大きな腫瘍または小さな腫瘍を有するマウスを屠殺した。マウスを必要な群に分け、腫瘍体積によって無作為化した。その後、マウスを、記載のように、個々の実験で処置した。
Ｈｅｐ３Ｂの直向性の肝臓腫瘍モデルについては、腫瘍細胞を接種し、腫瘍を下記方法によって株化した。前日にメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスを耳タグで識別し、マウスをイソフルランで麻酔した。次いで、体温を維持するために水循環式加熱パッド上でマウスを仰臥位で置いた。肝臓を露出させるために、胸骨の下での小さな横方向の切開が行われる。２８ゲージ針を用いて、肝臓の左上葉に癌細胞をゆっくりと注入した。細胞を肝臓に３０度の角度で注入し、肝臓の莢膜から透明な細胞小胞を確認した。冷ＰＢＳ（０．１−５×１０６細胞）中に懸濁し、希釈マトリゲル（ＰＢＳ中３０ｘ）と混合することにより、Ｈｅｐ ３Ｂ２．１ ７細胞を調製した。３０−５０ ｕｌの細胞／マトリゲルを接種した。注入後、滅菌ガーゼの小片を注射部位に置き、出血を防ぐために軽い圧力を１分間加えた。次いで、腹部を６−０絹縫合糸で閉じた。腫瘍細胞注入後に、動物を暖かいケージに入れ、１〜２時間観察し、その後、麻酔から完全に回復した後、動物の部屋に戻した。腫瘍移植から７〜１０日後に、動物を無作為化し、必要な群に分け、次いで個々の実験で記載したように処理した。
ＬＮＣａｐの皮下の側腹部腫瘍モデル
ＬＮＣａＰ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ−１７４０（商標））を、非必須アミノ酸およびピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ ＋ １０％ＦＢＳ中で、培養密度約８０％まで増殖させた。細胞をマトリゲルと１：１で混合し、５−７＊１０６細胞をオスのＳＣＩＤマウスに皮下注射した（６−８週）。腫瘍は通常、３−５週以内に１００−３５０ｍｍ３のサイズに発達した。この範囲内の腫瘍を有する動物を無作為化し、尾部静脈への注入によるＡＳＣで処理した。ＰＤ試験について、動物を、注入の９６時間後に屠殺し、臓器断片を採集し、計量し、液体窒素中で凍結させた。ＲＮＡ単離については、器官サンプルをＴｒｉｚｏｌ中でホモジナイズし、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ９６ Ｐｌｕｓキットを使用して製造元のインストラクションに従いＲＮＡを調製した。ＲＮＡ濃度は分光測光法で判定した。ＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換し、および、特異的標的の発現を、ΔΔＣＴ法および検証されたＴａｑｍａｎアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ｑＰＣＲによって定量化した。サンプルをＰＰＩＢの発現レベルに標準化した。
コレステロールｓｉＲＮＡ抱合合成
全てのｓｉＲＮＡ一本鎖は、標準的なホスホラミダイト化学（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いて固相上に完全に集められ、ＨＰＬＣで精製された。精製された一本鎖を二本鎖化して二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖に抱合したコレステロールの構造を図２に示す。表１５はＫＲＡＳ、ＥＧＦＲおよびＣＴＮＮＢ１ ｓｉＲＮＡ配列を示す。
ｓｉＲＮＡ化学修飾は以下を含む。
● 大文字（Ｎ）＝２’−ＯＨ（リボ）；
● 小文字（ｎ）＝２’−Ｏ−Ｍｅ（メチル）；
● ｄＮ＝２’−Ｈ（デオキシ）；
● Ｎｆ＝２’−Ｆ（フルオロ）；
● ｓ＝ホスホロチオエート骨格修飾；
● ｉＢ＝逆位脱塩基性（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ａｂａｓｉｃ）
ペプチド合成
ペプチドを標準的なＦｍｏｃ化学を用いて固相上で合成した。両方のペプチドはＮ末端にシステインを有し、切断されたペプチドをＨＰＬＣによって精製し、質量分析計によって確認した。ＩＮＦ７ペプチドは図３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５５）で例示される通りである。メリチンペプチドは図４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６０）で例示される通りである。
抗ＥＧＦＲ抗体
抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する完全ヒトＩｇＧ１κモノクローナル抗体である。これを、ハイブリドーマ細胞株（２Ｆ８）を産生するヒト抗ＥＧＦＲ抗体に由来する抗体遺伝子を保有するＧＳベクターでのトランスフェクションによるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ由来のＣＨＯ細胞株ＤＪＴ３３において産生した。標準的な哺乳動物の細胞培養および精製技術が抗ＥＧＦＲ抗体の生産において使用された。
グリカンを含まない抗ＥＧＦＲ抗体の理論分子量（ＭＷ）は１４６．６ｋＤａである。抗体の主なグリコシル化アイソフォームの実験的ＭＷは、質量分析によって判定されたように、１４９ｋＤａである。還元状態（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、軽鎖のＭＷは約２５ｋＤａであり、重鎖のＭＷは約５０ｋＤａであることがわかった。重鎖は、２つの鎖間ジスルフィド結合によって互いに結合され、１つの軽鎖は、単一の鎖間ジスルフィド結合によって各重鎖に付けられる。軽鎖は２つの鎖内ジスルフィド結合を有し、重鎖は４つの鎖内ジスルフィド結合を有する。抗体は、Ｎ−アセチル−グルコサミン、マンノース、フコースおよびガラクトースからなるグリカンと重鎖のＡｓｎ３０５で、Ｎ−結合されグリコシル化されている。存在する主なグリカンは、末端のガラクトース残基を含まないまたは１個含む、フコシル化された二分岐の（ｂｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）構造である。
ＩｇＧ１κ抗体の荷電アイソフォームパターンは、画像化された毛細血管ＩＥＦ、アガロースＩＥＦおよび分析的な陽イオン交換ＨＰＬＣを用いて調べられている。多数の荷電アイソフォームが見出され、主なアイソフォームは約８．７の等電点を有する。
抗ＥＧＦＲ抗体の作用の主要なメカニズムは、Ａ４３１癌細胞におけるＥＧＦ誘発ＥＧＦＲリン酸化の濃度依存的阻害である。さらに、低抗体濃度での抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の誘発が、前臨床細胞インビトロ試験で観察されている。
実施例３．抗体−ＰＥＧ−ＥＧＦＲおよび抗体−ＥＧＦＲ抱合体の合成、精製および分析
工程１：マレイミド−ＰＥＧ−ＮＨＳとそれに続くＳＨ−ＥＧＦＲとの抗体抱合
抗ＥＧＦＲ抗体（ＥＧＦＲ−Ａｂ）を１Ｘリン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）で交換し、５ｍｇ／ｍｌの濃度まで上昇させた。この溶液に、２当量のＳＭＣＣのリンカーまたはマレイミド−ＰＥＧｘｋＤａ−ＮＨＳ（ｘ＝１、５、１０、２０）を加え、室温で４時間回転させた。未反応のマレイミド−ＰＥＧを、５０ｋＤａ ＭＷＣＯＡｍｉｃｏｎスピンフィルターおよびＰＢＳ ｐＨ ７．４を用い、回転濾過によって除去した。抗体−ＰＥＧ−Ｍａｌ抱合体を収集し反応容器に移送した。ＳＨ−Ｃ６−ＥＧＦＲ（２当量）をＰＢＳ中の抗体−ＰＥＧ−マレイミドに室温で添加し、一晩回転させた。反応混合物を分析的なＳＡＸカラムクロマトグラフィーによって分析し、および、未反応の抗体とｓｉＲＮＡとの抱合体が見られた。
工程２：精製
粗製の反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー法−１を用いてＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣにより精製した。抗体−ＰＥＧ−ＥＧＦＲ抱合体を含む分画を貯留し、濃縮し、ＰＢＳｐＨ７．４で緩衝液交換した。ＳＭＣＣリンカー、ＰＥＧ１ｋＤａ、ＰＥＧ５ｋＤａおよびＰＥＧ１０ｋＤａとの抗体ｓｉＲＮＡ抱合体を、ｓｉＲＮＡ負荷に基づいて分離した。ＰＥＧ２０ｋＤａとの抱合体は、分離が不十分であった。
工程３：精製された抱合体の分析
単離された抱合体は、質量スペクトル（ｍａｓｓ ｓｐｅｃ）またはＳＤＳ−ＰＡＧＥのいずれかによって特徴付けられた。抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー法−２または陰イオン交換クロマトグラフィー法−３のいずれかを用いる分析的なＨＰＬＣによって評価した。これらの方法を用いて作られたすべての抱合体の例が、表１６に記載される。
陰イオン交換クロマトグラフィー方法−１
陰イオン交換クロマトグラフィー方法−２
陰イオン交換クロマトグラフィー方法−３
ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ２０ｋＤａ−ＥＧＦＲについての分析的なデータが図５および図６で示される。図５は、ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ２０ｋＤａ−ＥＧＦＲの分析的なＨＰＬＣを示す。図６は、ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ２０ｋＤａ−ＥＧＦＲ抱合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ１０ｋＤａ−ＥＧＦＲの分析的なクロマトグラムが図７で示される。ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ５ｋＤａ−ＥＧＦＲについての分析的なデータが図８および図９で示される。図８は、ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ５ｋＤａ−ＥＧＦＲの分析的なクロマトグラムを示す。図９は、ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ１０ｋＤａ−ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ５ｋＤａ−ＥＧＦＲ抱合体のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。異なるｓｉＲＮＡ負荷でのＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ１ｋＤａ−ＥＧＦＲ抱合体についての分析的なデータが、図１０で示される。
実施例４：抗体−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ抱合体の合成、精製および分析
工程１：ＳＭＣＣリンカーとそれに続くＳＨ−ＫＲＡＳ−ＰＥＧ５ｋＤａとの抗体抱合
抗ＥＧＦＲ抗体を１Ｘリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で交換し、５ｍｇ／ｍｌの濃度まで上昇させた。この溶液に、２当量のＳＭＣＣリンカー（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）を加え、室温で４時間回転した。未反応のＳＭＣＣリンカーを、５０ｋＤａ ＭＷＣＯ ＡｍｉｃｏｎスピンフィルターおよびＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４を用い、回転濾過によって除去した。残余分を収集し、２当量のＳＨ−Ｃ６−ＫＲＡＳ−ＰＥＧ５ｋＤａを室温で加え、一晩回転した。反応混合物を分析的なＳＡＸカラムクロマトグラフィーによって分析し、および、未反応の抗体とｓｉＲＮＡとの抱合体を観察した。
工程２：精製
粗製の反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー法−１を用いてＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣにより精製した。抗体−ＫＲＡＳ−ＰＥＧ抱合体を含む分画を貯留し、濃縮し、ＰＢＳｐＨ７．４で緩衝液交換した。
工程３：精製された抱合体の分析
単離された抱合体は、質量スペクトルまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥのいずれかによって特徴付けられた。抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−３（実施例１に記載）を使用し、分析的なＨＰＬＣによって評価した。実施例４および５に記載の方法を使用して作られた抱合体の例が、表１７に例示される。
ＥＧＦＲ抗体−ＫＲＡＳ−ＰＥＧ５ｋＤａのＨＰＬＣクロマトグラムが図１１で示される。パニツムマブ−ＫＲＡＳ−ＰＥＧ５ｋＤａのＨＰＬＣクロマトグラムは図１２に示される通りである。
実施例５：抗体−Ｓ−Ｓ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ抱合体の合成、精製および分析
工程１：ＳＰＤＰリンカーとそれに続くＳＨ−ＳｉＲＮＡ−ＰＥＧ５ｋＤａとの抗体抱合
抗ＥＧＦＲ抗体を１Ｘリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で交換し、５ｍｇ／ｍｌの濃度まで上昇させた。この溶液に、２当量のＳＰＤＰリンカー（スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）を加え、室温で４時間回転した。未反応のＳＰＤＰリンカーを、５０ｋＤａ ＭＷＣＯ ＡｍｉｃｏｎスピンフィルターおよびｐＨ７．４ＰＢＳ緩衝液を用い、回転濾過によって除去した。残余分を収集し、２当量のＳＨ−Ｃ６−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ５ｋＤａを室温で加え、一晩回転した。反応混合物を分析的なＳＡＸカラムクロマトグラフィーによって分析し、および、未反応の抗体とｓｉＲＮＡとの抱合体を観察した。
工程２：精製
粗製の反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー法−１を用いてＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣにより精製した。抗体−ＰＥＧ−ＳｉＲＮＡ抱合体を含む分画を貯留し、濃縮し、ＰＢＳｐＨ７．４で緩衝液交換した。
工程３：精製された抱合体の分析
単離された抱合体は、質量スペクトルまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥのいずれかによって特徴付けられた。抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−２を使用し、分析的なＨＰＬＣによって評価した。ＥＧＦＲ抗体−Ｓ−Ｓ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ５ｋＤａ（ＤＡＲ＝１）のＨＰＬＣクロマトグラムは、図１３に示される通りである。
実施例６：抗体−ＳＭＣＣ−エンドソームエスケープペプチド抱合体の合成、精製および分析
工程１：ＳＭＣＣのリンカー、またはマレイミド−ＰＥＧ−ＮＨＳとそれに続くＳＨ−Ｃｙｓ−ペプチドＣＯＮＨ２、との抗体抱合
抗ＥＧＦＲ抗体を１Ｘリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で交換し、１０ｍｇ／ｍｌの濃度まで上昇させた。この溶液に、３当量のＳＭＣＣリンカー（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）またはマレイミド−ＰＥＧ１ｋＤａ−ＮＨＳを加え、室温で１．５時間回転した。未反応のＳＭＣＣリンカーまたはＰＥＧリンカーを、５０ｋＤａ ＭＷＣＯ ＡｍｉｃｏｎスピンフィルターおよびＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４（メリチン抱合体について２５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ＝６．１）を使用し、回転濾過によって除去した。残余分を収集し、ＳＨ−Ｃｙｓ−ペプチド−ＣＯＮＨ２の３当量を室温で加え、一晩回転した。次いで、反応混合物をＨＩＣクロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製して、抗ＥＧＦＲ抗体−ペプチドまたは抗ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ１ｋ−ペプチドを単離した。
工程２：精製
粗製の反応混合物を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）法−１または陽イオン交換クロマトグラフィー法−１のいずれかを用いて、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒＦＰＬＣにより精製した。抗体−ペプチド抱合体を含む分画を貯留し、濃縮し、ＰＢＳｐＨ７．４で緩衝液交換した（メリチン抱合体については１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ＝６．０）。
工程３：精製された抱合体の分析
単離された抱合体は、質量スペクトルまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥのいずれかによって特徴付けられた。純度およびペプチド負荷を、ＨＩＣ法−２または陽イオン交換クロマトグラフィー法−２のいずれかを用いて、分析的なＨＰＬＣによって評価した。実施例６の方法を使用して作られたすべての抱合体の例が、表１８および１９に記載される。
陽イオン交換クロマトグラフィー方法−１
陽イオン交換クロマトグラフィー方法−２
疎水性相互作用クロマトグラフィー方法−１（ＨＩＣ方法−１）
疎水性相互作用クロマトグラフィー方法−２（ＨＩＣ方法−２）
図１４は、ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ２４−メリチンのＨＰＬＣクロマトグラムを例示する（負荷＝〜１）。図１５は、ＥＧＦＲ抗体−メリチンのＨＰＬＣクロマトグラムを例示する（ｎ＝〜１）。図１６は、ＥＧＦＲ抗体メリチンの質量スペクトルを示す（ｎ＝１）。図１７は、ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ１ｋＤａ−ＩＮＦ７のＨＩＣクロマトグラムを示す（ペプチド負荷＝〜１）。図１８は、ＥＧＦＲ抗体−ＩＮＦ７のＨＰＬＣクロマトグラムを示す（ペプチド負荷＝〜１）。
実施例７：ＥＥＰ抗体−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ抱合体の合成、精製および分析
工程１：ＥＧＦＲ−Ａｂ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧに対する、ＰＥＧ２４リンカーとそれに続くＳＨ−Ｃｙｓ−ペプチド−ＣＯＮＨ２の抱合
１のｓｉＲＮＡ負荷とのＥＧＦＲ−Ａｂ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ抱合体を、ＰＢＳｐＨ７．４緩衝液中の４当量のＰＥＧ１ｋリンカー（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボンキシレート）と抱合させ、室温で１．５時間回転させた。未反応のＰＥＧ１ｋリンカーを、５０ｋＤａ ＭＷＣＯ ＡｍｉｃｏｎスピンフィルターおよびＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４を用い、回転濾過によって除去した。残余分を収集し、４当量のＳＨ−Ｃｙｓ−ペプチド−ＣＯＮＨ２を室温で加え、一晩回転した。
工程２：精製
次いで、反応混合物を、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４および５０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎスピンフィルターを使用して、未反応のペプチドがＨＰＬＣによってモニターされるとおり除去されるまで、繰り返し回転濾過により精製した。この生成物は、抗体骨格に抱合した０、１、２、３またはそれ以上のペプチドを有する抱合体の混合物を含有する。
工程３：精製された抱合体の分析
単離された抱合体は、質量スペクトルまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥのいずれかによって特徴付けられた。抱合体の純度およびペプチド負荷を、ＨＩＣ法−２または陽イオン交換クロマトグラフィー法−２のいずれかを用いて、分析的なＨＰＬＣによって評価した。例７に記載の方法を使用して作られた抱合体の例が、表２０に示される。
図１９は、ＩＮＦ７−ＰＥＧ１ｋＤａ−（ＥＧＦＲ抗体−ＫＲＡＳ−ＰＥＧ５ｋＤａ）を示す。図２０は、メリチン−ＰＥＧ１ｋＤａ−（ＥＧＦＲ抗体−ＫＲＡＳ−ＰＥＧ５ｋＤａ）を示す。
実施例８．ＥＧＦＲ抗体−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ抱合体（ＰＫ−０５５）のインビボ薬物動態研究
体積が１００〜１５０ｍｍ３の皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍を有するメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスの群（ｎ＝３）を、ｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、一方、同マウスの対照群（ｎ＝４）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。ＥＧＦＲ抗体−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ抱合体を受けた処置群は、０．５ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）で投与され、および、コレステロール−ｓｉＲＮＡ抱合体を投与された群には１５ｍｇ／ｋｇで投与した。すべての群（処置群および対照群）が、５ｍＬ／ｋｇの用量を投与された。非終末期血液サンプルを、投与後２分、１５分または６０分後に、後眼窩神経叢の穿刺によって収集し、遠心分離して、ＰＫ分析用の血漿を生成した。マウスは、投与後２４、９６または１６８時間でＣＯ２窒息によって犠牲になった。表２１は研究設計についてより詳細に記述し、抱合体の合成および特徴付けに相互参照を提供する。心臓穿刺によって終末期血液サンプル（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ）を収集し、ＰＫ分析のために血漿を生成するように処理した。腫瘍、肝臓、腎臓、および肺の５０ｍｇ片を収集し、液体窒素中で急速凍結した。実施例２−７に記載されるように、ｍＲＮＡノックダウン分析およびｓｉＲＮＡ定量を行なった。
種々の分子量のＰＥＧリンカーおよび小分子リンカーを使用して、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡをＥＧＦＲ抗体（ＥＧＦＲ−Ａｂ）に結合させ、かつ、ＰＫを、血漿中のｍＡｂ−ｓｉＲＮＡ抱合体の挙動に対するリンカー分子量の影響を判定するために評価した。図２１に例示されるように、ＰＥＧリンカーの分子量は、１０ｋＤａ ＰＥＧが、より速いｓｉＲＮＡクリアランス（すなわち、後の時点での血漿濃度の低下）をもたらすことを除いて、血漿ＰＫに大きな影響を及ぼさない。ＥＧＦＲ−Ａｂに関するｓｉＲＮＡおよびＰＥＧの配向も調査した。図２２に例示されるように、ＥＧＦＲ−ＡｂとＰＥＧ５ｋ（ＥＧＦＲ抗体−ＫＲＡＳ−ＰＥＧ５ｋ）との間にｓｉＲＮＡがあることで、ＰＥＧ５ｋがＥＧＦＲ−ＡｂとｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ５ｋ−ＥＧＦＲ）との間にある代替的な抱合体よりも、有意に高い血漿濃度が得られる。いくつかの例では、これらの抱合体上の２つの異なるｓｉＲＮＡの使用は、血漿動態に影響を与えない。
ＥＧＦＲ−Ａｂに対する薬物負荷も調査し、ＥＧＦＲ−Ａｂ当たりｎ＝１およびｎ＝２のｓｉＲＮＡを用いた。図２３に例示されるように、ＥＧＦＲ−Ａｂ当たり１つのｓｉＲＮＡのみを有することにより、はるかに高い血漿濃度が得られた一方、ＥＧＦＲ−Ａｂ当たりｎ＝２のｓｉＲＮＡのより高い負荷は、血漿からのより速いクリアランスをもたらした。エンドソームエスケープペプチド（メリチン）を加えることの影響を評価した。ＥＧＦＲ抗体−ＫＲＡＳ−ＰＥＧ５ｋおよびＥＧＦＲ抗体メリチンを、溶液中でともに混合し、共同注入した。図２４に例示されるように、ＥＧＦＲ抗体メリチンの存在は、後の時点でのＥＧＦＲ抗体−ＫＲＡＳ−ＰＥＧ５ｋの血漿からのクリアランスを増大させる。
次に、コレステロール−ｓｉＲＮＡ抱合体の血漿ＰＫを、尾静脈注射による静脈内投与後のｍＡｂ−ｓｉＲＮＡ抱合体と比較した。図２５に例示されるように、ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ抱合体は、ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡ抱合体よりはるかに速く血漿から取り除かれる。ＰＫプロフィールから例示されるように、抱合体上にＥＧＦＲまたはＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡのいずれかを有することは、血漿動態に影響しなかった。
血漿ＰＫ分析に加えて、ｓｉＲＮＡ濃度を投与後の様々な時点の組織中で判定し、組織ＰＫを判定した。組織濃度をｐｍｏｌ／ｇで測定し、次いで、組織の密度を１ｇ／ｍＬと仮定してｐｍｏｌ／ｍＬに変換した。図２６では、１ｎＭ＝１ｎｍｏｌ／Ｌ＝１ｐｍｏｌ／ｍＬ＝１ｐｍｏｌ／ｇの組織の濃度。図２６Ａで例示されるように、０．５ｍｇ／ｋｇのＥＧＦＲ抗体−ｓｉＲＮＡの単一のｉ．ｖ．投与は、実質的に全ての抱合体について、投与後２４時間で腫瘍中に約１００ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡをもたらした。これらのＥＧＦＲ抗体−リンカー−ｓｉＲＮＡ抱合体の場合、ＥＧＦＲ−ＡｂとＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡの間のリンカーの分子量が、皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍におけるこれらの抱合体のＰＫを変化させるようには見えない。図２６Ｂで例示されるように、０．５ｍｇ／ｋｇのＥＧＦＲ抗体−ｓｉＲＮＡの単一のｉ．ｖ．投与の後の肝臓中のｓｉＲＮＡ濃度は、腫瘍で見られたものと同様に、投与後２４時間で約１００ｎＭである。投与後２４時間の小分子リンカーだけが、より長いＰＥＧリンカーで見られるものの約半分の、肝臓中のｓｉＲＮＡ濃度を生じさせる。ｓｉＲＮＡ濃度は、これらのＥＧＦＲ抗体−リンカー−ｓｉＲＮＡ抱合体により腫瘍組織および肝臓組織の両方で経時的に減少する。
ＥＧＦＲ−Ａｂに関するｓｉＲＮＡおよびＰＥＧの配向も、組織ＰＫプロフィールに関して調査された。図２７に例示されるように、ＥＧＦＲ抗体−ＫＲＡＳ−ＰＥＧ５ｋおよびＥＧＦＲ抗体−ＰＥＧ５ｋ−ＥＧＦＲ抱合体の両方が、０．５ｍｇ／ｋｇの単一ｉ．ｖ投与後の腫瘍と肝臓の両方におよそ１００ｎＭのｓｉＲＮＡを送達する。しかしながら、ＥＧＦＲ抗体−ＫＲＡＳ−ＰＥＧ５ｋが投与後１６８時間までおよそ１００ｎＭで腫瘍におけるｓｉＲＮＡ濃度を維持する一方、他の３つの曲線は時間とともに濃度が減少する。次に、薬物負荷に応じて組織ＰＫを評価した。図２８から例示されるように、ＥＧＦＲ−Ａｂ当たりｎ＝１のｓｉＲＮＡは、肝臓と比較してより多量のｓｉＲＮＡを腫瘍に送達した。しかしながら、ＥＧＦＲ−Ａｂ当たりｎ＝２のｓｉＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ負荷の増加は、肝臓に送達されるｓｉＲＮＡの量を増加させ、腫瘍に送達されるｓｉＲＮＡの量を減少させた。さらに、エンドソームエスケープ機能を導入するために、ＥＧＦＲ抗体−メリチンをいくつかの製剤と混合した。図２９から例示されるように、ＥＧＦＲ抗体−メリチンとＥＧＦＲ抗体−ｓｉＲＮＡとの混合および共投与は、組織ＰＫに大きな影響を与えなかった。メリチンの追加は、腫瘍中のｓｉＲＮＡの取り込みを減少させ、肝臓中のｓｉＲＮＡの取り込みを増大させた。
肝臓および皮下の側腹部Ｈ３５８腫瘍のコレステロール−ｓｉＲＮＡ抱合体（ＥＧＦＲおよびＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡの両方を使用）の組織ＰＫプロフィールも評価した。図３０で例示されるように、両方のｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ抱合体は、１５ｍｇ／ｋｇの単一のｉ．ｖ投与後２４時間の肝臓におよそ５μＭ濃度のｓｉＲＮＡを送達した。肝臓では、ｃｈｏｌ−ＫＲＡＳは、１週間の時間スケールではｃｈｏｌ−ＥＧＦＲよりもわずかに速く除去する（ｃｌｅａｒ）ようである。２つの異なるｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ抱合体はさらに、腫瘍において異なるＰＫプロフィールを示す。両方のコレステロール抱合体は、肝臓に比べて腫瘍にｓｉＲＮＡをあまり送達しないが、ｃｈｏｌ−ＥＧＦＲは、ｃｈｏｌ−ＫＲＡＳ抱合体と比較すると、より多くのｓｉＲＮＡを腫瘍に送達する。両方のｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ抱合体は、経時的にかつ同様の勾配（ｓｌｏｐｅ）で腫瘍から除去される。
ＰＤ分析がＰＫ分析に続いた。図３１Ａで例示されるように、ｃｈｏｌ−ＫＲＡＳ抱合体は、１５ｍｇ／ｋｇの単一のｉ．ｖ．投与の後の腫瘍においてＫＲＡＳ標的遺伝子の周辺的なｍＲＮＡノックダウン（〜２５％）しか生成しなかった。しかしながら、図３１Ｂで例示されるように、同じ１５ｍｇ／ｋｇの用量のｃｈｏｌ−ＫＲＡＳは、マウスの肝臓において５０％を超えるｍＲＮＡノックダウンを生成することができた。図３２に例示されるように、ｃｈｏｌ−ＥＧＦＲ抱合体は腫瘍において５０％を超えるｍＲＮＡノックダウンを生成することができた。いくつかの例では、ｃｈｏｌ−ＫＲＡＳと比較してより高い、腫瘍におけるｃｈｏｌ−ＥＧＦＲでのノックダウンは、ｃｈｏｌ−ＫＲＡＳと比較してより高い、ｃｈｏｌ−ＥＧＦＲを有する腫瘍において観察されるｓｉＲＮＡ濃度に起因する（図３０）。最後に、図３３および３４に例示されるように、大部分のＥＧＦＲ抗体−ｓｉＲＮＡ抱合体は、単一のＩＶ投与の後に腫瘍において約２５〜５０％のＥＧＦＲまたはＫＲＡＳ ｍＲＮＡノックダウンをもたらしたが、ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ抱合体と比較してはるかに低用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）でのことだった。
実施例９：追加の抗体−ｓｉＲＮＡ抱合体の合成、精製、及び分析
工程１：ＳＭＣＣリンカー、次いでＳＨ−ｓｉＲＮＡとの抗体抱合
抗体を、１Ｘリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で緩衝液交換し、最大１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、ＤＭＳＯに溶解させた２当量のＳＭＣＣリンカーを加え、室温で４時間回転させた。未反応のＳＭＣＣリンカーを、５０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎスピンフィルター及びＰＢＳ ｐＨ７．４を使用する回転濾過によって除去した。抗体−マレイミドの抱合体を反応容器に集め、ＳＨ−Ｃ６−ｓｉＲＮＡ又はＳＨ−Ｃ６−ｓｉＲＮＡ−Ｃ６−ＮＨＣＯ−ＰＥＧ−ＸｋＤａ（２当量）（Ｘ＝０．５ｋＤａ〜１０ｋＤａ）を、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳにおいてＲＴで加え、一晩回転させた。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィー方法−２による反応混合物の分析は、未反応の抗体及びｓｉＲＮＡと共に抗体ｓｉＲＮＡ抱合体を示した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−１を使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１及びＤＡＲ＞２の抗体−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧの抱合体を含む分画を分離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
工程３：精製された抱合体の分析
分離された抱合体を、ＳＡＸクロマトグラフィー、ＳＥＣクロマトグラフィー、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により特徴付けした。抱合体の純度を、何れかの陰イオン交換クロマトグラフィー方法−２を使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した。全てのＤＡＲ１抱合体は通常、９．０±０．４分で溶出したが、ＤＡＲ２及びＤＡＲ３の抱合体は通常、９．７±０．２分で溶出した。典型的なＤＡＲ１抱合体の純度は精製後９０％より大きいが、典型的なＤＡＲ＞２のリジン抱合体は７０−８０％のＤＡＲ２及び２０−３０％のＤＡＲ３を含んでいる。
工程１：ＴＣＥＰでの抗体の鎖間のジスルフィド還元
抗体を、ホウ砂緩衝液（ｐＨ８）で緩衝液交換し、最大１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、水中の２当量のＴＣＥＰを加え、ＲＴで２時間回転させた。結果として生じる反応混合物を、５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換し、ＲＴで５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳにおいてＳＭＣＣ−Ｃ６−ｓｉＲＮＡ又はＳＭＣＣ−Ｃ６−ｓｉＲＮＡ−Ｃ６−ＮＨＣＯ−ＰＥＧ−ＸｋＤａ（２当量）の溶液に加え（Ｘ＝０．５ｋＤａ〜１０ｋＤａ）、一晩回転させた。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析は、未反応の抗体及びｓｉＲＮＡと共に抗体ｓｉＲＮＡ抱合体を示した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−１を使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１及びＤＡＲ＞２の抗体−ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を分離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
工程３：精製された抱合体の分析
分離された抱合体を、ＳＥＣ、ＳＡＸクロマトグラフィー、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴付けした。抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−２又は陰イオン交換クロマトグラフィー方法−３の何れかを使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した。分離されたＤＡＲ１抱合体は、分析的ＳＡＸ方法−２上で９．０＋０．３分で典型的に溶出され、９０％より大きな純度である。典型的なＤＡＲ＞２のシステイン抱合体が、８５％を超えるＤＡＲ２及び１５％未満のＤＡＲ３を含んでいる。
工程１：ＴＣＥＰでの抗体の鎖間のジスルフィド還元
抗体を、ホウ砂緩衝液（ｐＨ８）で緩衝液交換し、最大１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、水中の２当量のＴＣＥＰを加え、ＲＴで２時間回転させた。結果として生じる反応混合物を、５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換し、ＲＴで５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳにおいてＣＢＴＦ−Ｃ６−ｓｉＲＮＡ−Ｃ６−ＮＨＣＯ−ＰＥＧ−５ｋＤａ（２当量）の溶液に加え、一晩回転させた。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析は、未反応の抗体及びｓｉＲＮＡと共に抗体ｓｉＲＮＡ抱合体を示した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−１を使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１及びＤＡＲ≧２の抗体−ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を分離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。典型的なＤＡＲ＞２のシステイン抱合体は、８５％を超えるＤＡＲ２及び１５％未満のＤＡＲ３、或いはそれ以上を含んでいる。
工程３：精製された抱合体の分析
分離された抱合体を、質量スペクトル又はＳＤＳ−ＰＡＧＥの何れかにより特徴付けした。抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−２又は陰イオン交換クロマトグラフィー方法−３の何れかを使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した。
工程１：ＴＣＥＰでの抗体の還元
抗体を、ホウ砂緩衝液（ｐＨ８）で緩衝液交換し、最大５ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、水中の２当量のＴＣＥＰを加え、ＲＴで２時間回転させた。結果として生じる反応混合物を、５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳで交換し、ＲＴで５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳにおいてＭＢＳ−Ｃ６−ｓｉＲＮＡ−Ｃ６−ＮＨＣＯ−ＰＥＧ−５ｋＤａ（２当量）の溶液に加え、一晩回転させた。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析は、未反応の抗体及びｓｉＲＮＡと共に抗体ｓｉＲＮＡ抱合体を示した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−１を使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１及びＤＡＲ＞２の抗体−ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を分離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。典型的なＤＡＲ＞２のシステイン抱合体は、８５％を超えるＤＡＲ２及び１５％未満のＤＡＲ３、或いはそれ以上を含んでいる。
工程３：精製された抱合体の分析
分離された抱合体を、質量スペクトル又はＳＤＳ−ＰＡＧＥの何れかにより特徴付けした。抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−２又は陰イオン交換クロマトグラフィー方法−３の何れかを使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した。
工程１：ＴＣＥＰでの抗体の還元
抗体を、ホウ砂緩衝液（ｐＨ８）で緩衝液交換し、最大５ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、水中の２当量のＴＣＥＰを加え、ＲＴで２時間回転させた。結果として生じる反応混合物を、５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳで交換し、ＲＴで５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳにおいてＭＢＳ−Ｃ６−ｓｉＲＮＡ−Ｃ６−ＮＨＣＯ−ＰＥＧ−５ｋＤａ（２当量）の溶液に加え、一晩回転させた。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析は、未反応の抗体及びｓｉＲＮＡと共に抗体ｓｉＲＮＡ抱合体を示した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−１を使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１及びＤＡＲ＞２の抗体−ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を分離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。典型的なＤＡＲ＞２のシステイン抱合体は、８５％を超えるＤＡＲ２及び１５％未満のＤＡＲ３、或いはそれ以上を含んでいる。
工程３：精製された抱合体の分析
分離された抱合体を、質量スペクトル又はＳＤＳ−ＰＡＧＥの何れかにより特徴付けした。抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−２又は陰イオン交換クロマトグラフィー方法−３の何れかを使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した。
工程１：ＳＰＤＰリンカー、次いでＳＨ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ５ｋＤａとの抗体抱合
抗体を、ｐＨ７．４の１Ｘ ＰＢＳで緩衝液交換し、最大１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、２当量のＳＰＤＰリンカー［スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート］又はそのメチル化されたバージョンを加え、室温で４時間回転させた。未反応のＳＰＤＰリンカーを、５０ｋＤａのＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎスピンフィルター及びｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を使用する回転濾過によって除去した。残余分を集め、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の２当量のＳＨ−Ｃ６−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ５ｋＤａを室温で加え、一晩回転させた。反応混合物を分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによって分析して、未反応の抗体及びｓｉＲＮＡと共に抱合体を確認した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−１を使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１及びＤＡＲ＞２の抗体−ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を分離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。典型的なＤＡＲ＞２のリジン抱合体は、７０〜８０％のＤＡＲ２及び２０〜３０％のＤＡＲ３、或いはそれ以上を含んでいる。
工程３：精製された抱合体の分析
単離された抱合体を、質量スペクトル又はＳＤＳ−ＰＡＧＥの何れかにより特徴付けした。抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−２を使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した。
工程１：ピリジルジチオ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ５ｋＤａでの抗体の還元及び抱合
抗体を、ｐＨ８．０のホウ砂緩衝液で緩衝液交換し、最大１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、１．５当量のＴＣＥＰを加え、反応混合物を室温で１時間回転させた。未反応のＴＣＥＰを、５０ｋＤａのＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎスピンフィルターを使用する回転濾過によって除去し、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で緩衝液交換した。残余分を集め、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の２当量のピリジルジチオ−Ｃ６−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ５ｋＤａを室温で加え、一晩回転させた。反応混合物を分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによって分析して、未反応の抗体及びｓｉＲＮＡと共に抱合体を確認した
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−１を使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１及びＤＡＲ＞２の抗体−ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を分離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
工程３：精製された抱合体の分析
単離された抱合体を、質量スペクトル又はＳＤＳ−ＰＡＧＥの何れかにより特徴付けした。抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−２を使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した。典型的なＤＡＲ＞２のシステイン抱合体は、９０％のＤＡＲ２及び１０％のＤＡＲ３、或いはそれ以上を含んでいる。
工程１：マレイミド−ＥＣＬ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ５ｋＤａでの抗体の還元及び抱合
抗体を、ｐＨ８．０のホウ砂緩衝液で緩衝液交換し、最大１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、１．５当量のＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩試薬を加え、室温で１時間回転させた。未反応のＴＣＥＰを、５０ｋＤａのＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎスピンフィルター、及び５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を使用する回転濾過によって除去した。残余分を集め、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の１．５当量のマレイミド−ＥＣＬ−Ｃ６−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ５ｋＤａを室温で加え、一晩回転させた。反応混合物を分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによって分析して、未反応の抗体及びｓｉＲＮＡと共に抱合体を確認した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−１を使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１及びＤＡＲ＞２の抗体−ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を分離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
工程３：精製された抱合体の分析
単離された抱合体を、質量スペクトル又はＳＤＳ−ＰＡＧＥの何れかにより特徴付けした。抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−２を使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した。典型的なＤＡＲ＞２のリジン抱合体は、７０〜８０％のＤＡＲ２及び２０〜３０％のＤＡＲ３、或いはそれ以上を含んでいる。
工程１：ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ＴＣＯ、次いでメチルテトラジン−ＰＥＧ４−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ５ｋＤａとの抗体抱合
抗体を、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換し、最大５ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、２当量のＮＨＳ−ＰＥＧ４−ＴＣＯリンカーを加え、室温で４時間回転させた。未反応のリンカーを、５０ｋＤａのＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎスピンフィルター及びｐＨ７．４のＰＢＳを使用する回転濾過によって除去した。残余分を集め、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の２当量のメチルテトラジン−ＰＥＧ４−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ５ｋＤａを室温で加えた。反応混合物を分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによって分析して、抗体−ｓｉＲＮＡの抱合体を、未反応の抗体及びｓｉＲＮＡと共に確認した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−１を使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１及びＤＡＲ＞２の抗体−ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を分離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。典型的なＤＡＲ＞２のリジン抱合体は、７０−８０％のＤＡＲ２及び２０−３０％のＤＡＲ３、或いはそれ以上を含んでいる。
工程３：精製された抱合体の分析
単離された抱合体の特徴付け及び純度を、質量スペクトル又はＳＤＳ−ＰＡＧＥの何れかにより特徴付けした。抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−２を使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した。
工程１：抗体グリカン修飾及びＧａｌ−Ｎ３の追加
抗体を、ｐＨ６．０、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で緩衝液交換し、１６時間３７℃でＥｎｄｏＳ２により処理した。反応混合物を、ＴＢＳ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、０．９％のＮａＣｌ、ｐＨ７．４）へと緩衝液交換し、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚを加え、その後、５０ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）においてＭｎＣｌ２、及びＧａｌ−Ｔ（Ｙ２８９Ｌ）を加えた。最終溶液は０．４ｍｇ／ｍＬの抗体、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、１ｍＭのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ、及び０．２ｍｇ／ｍＬのＧａｌ−Ｔ（Ｙ２８９Ｌ）の濃度を含んでおり、これを３０℃で一晩インキュベートした。
工程２：アジドで修飾した抗体へのＤＩＢＯ−ＰＥＧ−ＴＣＯの抱合
工程１の反応混合物をＰＢＳで緩衝液交換し、２当量のＤＩＢＯ−ＰＥＧ４−ＴＣＯリンカーを加え、室温で６時間回転させた。未反応のリンカーを、５０ｋＤａのＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎスピンフィルター及びｐＨ７．４のＰＢＳを使用する回転濾過によって除去した。残余分を集め、工程３におけるように使用した。
工程３：ＴＣＯ標識化抗体へのメチルテトラジン−ｓｉＲＮＡの抱合
ｐＨ７．４のＰＢＳ中の２当量のメチルテトラジン−ＰＥＧ４−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ５ｋＤａを、工程２の残余分に加え、１時間室温で回転させた。反応混合物を分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによって分析して、抗体−ｓｉＲＮＡの抱合体を、未反応の抗体及びｓｉＲＮＡと共に確認した。
工程４：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−１を使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１及びＤＡＲ＞２の抗体−ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を分離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。典型的なＤＡＲ＞２のリジン抱合体は、７０−８０％のＤＡＲ２及び２０−３０％以上のＤＡＲ３を含んでいる。
工程５：精製された抱合体の分析
単離された抱合体の特徴付け及び純度を、質量スペクトル又はＳＤＳ−ＰＡＧＥの何れかにより特徴付けした。抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−２を使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した。
工程１：ペプシンでの抗体消化
抗体を、ｐＨ４．０、２０ｍＭの酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液で緩衝液交換し、最大５ｍｇ／ｍｌの濃度とした。固定されたペプシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｒｏｄ＃２０３４３）を加え、３７℃で３時間インキュベートした。反応混合物を、３０ｋＤａのＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎスピンフィルター及びｐＨ７．４のＰＢＳを使用して濾過した。残余分を集めて、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製し、Ｆ（ａｂ’）２を単離した。その後、集めたＦ（ａｂ’）２を、１０当量のＴＣＥＰによって還元し、ｐＨ７．４のＰＢＳにおいて室温でＳＭＣＣ−Ｃ６−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ５と抱合させた。ＳＡＸクロマトグラフィー上での反応混合物の分析は、未反応のＦａｂ及びｓｉＲＮＡ−ＰＥＧと共にＦａｂ−ｓｉＲＮＡの抱合体を示した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法−１を使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１及びＤＡＲ２ Ｆａｂ−ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を分離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
工程３：精製された抱合体の分析
単離された抱合体の特徴付け及び純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び陰イオン交換クロマトグラフィー方法−２を使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した。
精製及び分析の方法
陰イオン交換クロマトグラフィー方法−１。
カラム：Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫＧｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ、２１．５ｍｍ ＩＤ Ｘ １５ｃｍ、１３ｕｍ
溶媒Ａ：２０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．０；溶媒Ｂ：２０ｍＭのＴＲＩＳ、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０；流速：６．０ｍｌ／分
陰イオン交換クロマトグラフィー方法−２。
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｒｏＰａｃ（商標） ＳＡＸ−１０、Ｂｉｏ ＬＣ（商標）、４×２５０ｍｍ
溶媒Ａ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、２０％のエタノール；溶媒Ｂ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、２０％のエタノール、１．５ＭのＮａＣｌ；流速：１．０ｍｌ／分
陰イオン交換クロマトグラフィー方法−３。
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｒｏＰａｃ（商標） ＳＡＸ−１０、Ｂｉｏ ＬＣ（商標）、４×２５０ｍｍ
溶媒Ａ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、２０％のエタノール；溶媒Ｂ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、２０％のエタノール、１．５ＭのＮａＣｌ
流速：０．７５ｍｌ／分
サイズ排除クロマトグラフィー方法−１
カラム：ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ ＸＬ、７．８×３００ｍｍ、５μＭ
移動相：１５０ｍＭのリン酸緩衝液
流速：２０分間で１．０ｍｌ／分
ｓｉＲＮＡ合成
ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。
ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖はそれぞれ、２つの抱合ハンドル、Ｃ６−ＮＨ２及びＣ６−ＳＨを、鎖の各末端に１つ含んでいる。５’末端のＣ６−ＮＨ２ハンドルを持つパッセンジャー鎖は、その３’末端にＣ６−ＳＨを含み、且つ、３’末端にＣ６−ＮＨ２ハンドル及びその５’末端にＣ６−ＳＨを含む鎖を含んでいる。両方の抱合ハンドルは、逆位脱塩基のリン酸ジエステル又はホスホロチオエートを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続される。
ｓｉＲＮＡの代表的な構造は、パッセンジャー鎖の５’末端にＣ６−ＮＨ２抱合ハンドル、及び３’末端にＣ６−ＳＨを備えている。
実施例１０−４１に記載されるＡＳＣ構造
ＡＳＣ構造−１：抗体−Ｌｙｓ−ＳＭＣＣ−Ｓ−３’−パッセンジャー鎖。この抱合体を、パッセンジャー鎖の３’末端でのチオールへの抗体リジン−ＳＭＣＣの抱合によって生成した。
ＡＳＣ構造−２：抗体−Ｃｙｓ−ＳＭＣＣ−Ｓ−３’−パッセンジャー鎖。この抱合体を、パッセンジャー鎖の３’末端でのＳＭＣＣへの抗体の鎖間のシステイン抱合によって生成した。
ＡＳＣ構造−３：抗体−Ｌｙｓ−ＳＭＣＣ−Ｓ−５’−パッセンジャー鎖。この抱合体を、パッセンジャー鎖の５’末端でのＣ６−チオールへの抗体リジン−ＳＭＣＣの抱合によって生成した。
ＡＳＣ構造−４：抗体−Ｃｙｓ−ＳＭＣＣ−Ｓ−５’−パッセンジャー鎖。この抱合体を、パッセンジャー鎖の５’末端でのＳＭＣＣへの抗体の鎖間のシステイン抱合によって生成した。
ＡＳＣ構造−５：抗体−Ｌｙｓ−ＰＥＧ−５’−パッセンジャー鎖。この抱合体を、パッセンジャー鎖の５’末端でのテトラジンへの抗体ＰＥＧ−ＴＣＯの抱合によって生成した。
ＡＳＣ構造−６：抗体−Ｌｙｓ−ＰＥＧ−５’−パッセンジャー鎖。この抱合体を、パッセンジャー鎖の５’末端でのテトラジンへの抗体ＰＥＧ−ＴＣＯの抱合によって生成した。
ＡＳＣ構造−７：５’末端に逆位脱塩基が無い抗体−システイン−ＰＥＧ−５’−パッセンジャー鎖。この抱合体を、構造−２と同様の手順を使用して生成した。抗体を、パッセンジャー鎖の５’末端の糖の上でアミンに直接抱合させた。
ザルツムマブ（ＥＧＦＲ−Ａｂ）
ザルツムマブは、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して配向された完全なヒトＩｇＧ１κモノクローナル抗体である。これは、チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＤＪＴ３３において産出され、ハイブリドーマ細胞株（２Ｆ８）を産出するヒト抗ＥＧＦＲ抗体由来の抗体遺伝子を運ぶＧＳベクターでのトランスフェクションによってＣＨＯ細胞株ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶから導かれたものである。標準の哺乳動物細胞の培養及び精製の技術が、ザルツムマブの製造に利用される。
グリカンのないザルツムマブの理論上の分子量（ＭＷ）は１４６．６ｋＤａである。抗体の主要なグリコシル化されたアイソフォームの実験的なＭＷは、質量分析法によって判定されるように１４９ｋＤａである。還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用すると、軽鎖のＭＷはおよそ２５ｋＤａであり、重鎖のＭＷはおよそ５０ｋＤａであることが分かった
重鎖は２つの鎖間のジスルフィド結合によって互いに接続され、１つの軽鎖は単一の鎖間のジスルフィド結合によって各重鎖に付けられる。軽鎖には２つの鎖間のジスルフィド結合があり、重鎖には４つの鎖間のジスルフィド結合がある。抗体には、Ｎ−アセチル−グルコサミン、マンノース、フコース、及びガラクトースから成るグリカンを備えた重鎖のＡｓｎ３０５にて、Ｎ結合型グリコシル化が行われる。存在する主なグリカンは、末端ガラクトース残基を１つも含まない又はそれを１つ含んでいる、フコシル化された二分岐の構造である。ＩｇＧ１κ抗体の荷電されたアイソフォームパターンは、画像化されたキャピラリーＩＥＦ、アガロースＩＥＦ、及び分析的陽イオン交換ＨＰＬＣを使用して調べられた。多数の荷電されたアイソフォームが見出され、主なアイソフォームはおよそ８．７の等電点を持つ。
ザルツムマブの作用の主要機構は、Ａ４３１癌細胞における、ＥＧＦで誘導されたＥＧＦＲリン酸化の濃縮依存性阻害である。加えて、低い抗体濃度での抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の誘導を、前臨床的細胞のインビトロでの研究において観察した。
パニツムマブ（ＥＧＦＲ２−Ａｂ）
パニツムマブは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的な、臨床的に承認された完全なヒトＩｇＧサブクラスのモノクローナル抗体である。パニツムマブには２つのガンマ重鎖及び２つのカッパ軽鎖がある。グリコシル化されたパニツムマブには、合計およそ１４７ｋＤａの分子量がある。パニツムマブは、重鎖に位置付けられた単一のコンセンサスＮ結合グリコシル化部位を備えた糖タンパク質として発現される。パニツムマブはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から産出され、一連のクロマトグラフィー工程、ウイルス不活性化工程、ウイルス濾過工程、及び限外濾過／ダイアフィルトレーション工程によって精製される。
パニツムマブは、この受容体のための天然リガンドであるＥＧＦ及び形質転換増殖因子αによって媒介される結合及びシグナル伝達を阻害するために、ＥＧＦＲのリガンド結合部位にて競合的アンタゴニストとして作用する。ＥＧＦＲへのパニツムマブの結合の親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ方法を使用して組み換え型ＥＧＦＲにおいて３．５及び５．７×１０−１２Ｍであると判定された。ＥＧＦの結合の阻害は、Ａ４３１細胞、即ちＥＧＦＲを発現するヒト表皮癌細胞株において示された。ＥＧＦＲの細胞内酸性化、リン酸化、及び内部移行は、Ａ４３１細胞においてパニツムマブによって用量依存性の方法で遮断された。
パニツムマブは、同じ細胞株においてインビトロ及びインビボで細胞増殖を阻害するとも示された。
ハーセプチン（ＥＧＦＲ３−Ａｂ）
ハーセプチンは、Ｈｅｒ２としても知られる上皮増殖因子受容体２（ＥＧＦＲ２）に特異的な、臨床的に承認されたヒト化ＩｇＧサブクラスのモノクローナル抗体である。ハーセプチンはカッパ軽鎖と共にヒトＦｃγ１アイソタイプを有している。
ＰＳＭＡ−Ａｂ
ＰＳＭＡ−Ａｂは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的なヒト化ＩｇＧ１サブクラスモノクローナル抗体である。
ＡＳＧＲ１−Ａｂ
ＡＳＧＲ ｍＡｂ−Ｓｉｎｏ１０３は、マウスアシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＰＲ１）を結合するウサギＩｇＧモノクローナル抗体である。これはＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｃａｔ ＃ ５００８３−Ｒ１０３）によって供給される。
ＡＳＧＲ２−Ａｂ
ＡＳＧＲ ｍＡｂ−Ｒ＆Ｄは、マウスアシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＰＲ１）を結合するラットＩｇＧ２Ａサブクラスモノクローナル抗体である。これは、タンパク質Ａ又はＧによってハイブリドーマ培養物の上清から精製され、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｔ ＃ ＭＡＢ２７５５）によって供給される。
ｓｉＲＮＡ−ＴｒｉＧａｌＮＡｃの抱合体
ｓｉＲＮＡ ｔｒｉＧａｌＮＡｃの抱合体を、Ｌｙｓ−Ｌｙｓジペプチドを使用して合成した。保護されたｔｒｉＧａｌＮＡｃをジペプチドＰＥＧリンカーと結合させ、精製した。ｔｒｉＧａｌＮＡｃ−ジペプチド上のカルボン酸保護基の除去後、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の５’末端に抱合させた。
実施例１０：２０１６−ＰＫ−１６３−ＬＮＣａｐ
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ， ３１（１２）：３４４５−６０）２１量体の二本鎖を、使用した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１６）であった。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して免疫原性を減らし、これは活性なｓｉＲＮＡで使用されるものに匹敵した。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
群３−４で使用されるＡＸＢＹＣ抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。ＡＸＢとＡＸＣＹＢの抱合体を実施例９に記載されるように作成した。
インビボの研究設計
１００−３５０ｍｍ３の体積の皮下の側腹部ＬＮＣａＰ腫瘍を持つメスのＳＣＩＤ ＳＨＯマウスの群（ｎ＝５）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。処置群１−６に、以下の研究設計につき１．０又は０．５ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）で投与した。全ての群（処置及び対照）に、５ｍＬ／ｋｇの用量を投与した。投与後９６時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。表２２は研究設計をより詳細に記載している。５０ｍｇ片の腫瘍及び肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照（ｉｎｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
ＰＳＭＡ−Ａｂに対するｓｉＲＮＡ及びＰＥＧの配向を、インビボのマウス腫瘍モデルにおいて調査した。図５０Ａに例示されるように、ＰＳＭＡ−ＡｂとＰＥＧ５ｋ（ＰＳＭＡ−Ａｂ（Ｃｙｓ）−ＥＧＦＲ−ＰＥＧ５ｋ又はＡＸＢＹＣのフォーマット）との間にｓｉＲＮＡを持つことで、代替的な抱合体に比べて腫瘍においてより高レベルのＥＧＦＲ ｍＲＮＡのノックダウンが結果として生じ、そこではＰＥＧ５ｋがＰＳＭＡ−ＡｂとｓｉＲＮＡ（ＰＳＭＡ−Ａｂ（Ｃｙｓ）−ＰＥＧ５ｋ−ＥＧＦＲ又はＡＸＣＹＢのフォーマット）との間にある。この手法（ＡＸＢＹＣ）はまた、ＰＥＧ５Ｋ（ＰＳＭＡ−Ａｂ（Ｃｙｓ）−ＥＧＦＲ又はＡＸＢのフォーマット）の無い抱合体に比べて腫瘍においてより高レベルのＥＧＦＲ ｍＲＮＡのノックダウンを結果としてもたらした。
ＰＳＭＡ−Ａｂに対するｓｉＲＮＡ及びＰＥＧの配向を、組織ＰＫ特性に対しても調査した。組織濃度をｐｍｏｌ／ｇで測定し、次に、組織の密度が１ｇ／ｍＬ（１ｎＭ＝１ｎｍｏｌ／Ｌ＝１ｐｍｏｌ／ｍＬ＝１ｐｍｏｌ／ｇの組織の濃度）に等しいと仮定することによりｐｍｏｌ／ｍＬに変換した。図５０Ｂに例示されるように、ＰＳＭＡ−ＡｂとＰＥＧ５ｋ（ＡＸＢＹＣ）との間にｓｉＲＮＡを持つことで、代替的な抱合体に比べて腫瘍へのより高レベルのｓｉＲＮＡ送達が結果として生じ、そこではＰＥＧ５ｋがＰＳＭＡ−ＡｂとｓｉＲＮＡ（ＡＸＣＹＢ）との間にある。この手法（ＡＸＢＹＣ）は、ＰＥＧ５Ｋ（ＰＳＭＡ−ＡｂＡＸＢの）の無い抱合体に比べて腫瘍へのより高レベルのＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ送達を結果としてもたらした。
マウスＬＮＣａＰ皮下異種移植片モデルにおいて、抗体ｓｉＲＮＡ抱合体のためのＡＸＢＹＣフォーマットは、ＡＸＣＹＢ及びＡＸＢのフォーマットに比べて、腫瘍組織におけるより高レベルのｓｉＲＮＡ蓄積、及びより大きな規模のＥＧＦＲ ｍＲＮＡのノックダウンを結果としてもたらしたことが実証された。ＬＮＣａｐ腫瘍はヒトＰＳＭＡを発現し、その結果、ｉ．ｖ投与、受容体媒介性の取り込み、及び標的遺伝子のｓｉＲＮＡで促されたノックダウンの後に、ＰＳＭＡ標的化ｓｉＲＮＡ抱合体の腫瘍組織特異的蓄積が生じた。
実施例１１：２０１６−ＰＫ−２０２−ＬＮＣａｐ［７０１］ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ， ３１（１２）：３４４５−６０）２１量体の二本鎖を、使用した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１６）であった。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して免疫原性を減らし、これは活性なｓｉＲＮＡで使用されるものに匹敵した。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
群３−５及び７で使用されるＡＸＢＹＣ抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。ＡＸＢ（群１−２）及びＡＸＣＹＢ（群６）の抱合体を実施例９に記載されるように作成した。
インビボの研究設計
１００−３５０ｍｍ３の体積の皮下の側腹部ＬＮＣａＰ腫瘍を持つメスのＳＣＩＤ ＳＨＯマウスの群（ｎ＝５）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。処置群１−６に、以下の研究設計につき１．０又は０．５ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）で投与した。全ての群（処置及び対照）に、５ｍＬ／ｋｇの用量を投与した。投与後９６時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。表２３は研究設計をより詳細に記載している。５０ｍｇ片の腫瘍及び肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
ＰＳＭＡ−Ａｂに対するｓｉＲＮＡ及びＰＥＧの配向を、インビボのマウス腫瘍モデルにおいても調査した。図５１Ａに例示されるように、ＰＳＭＡ−ＡｂとＰＥＧ５ｋ（ＰＳＭＡ−Ａｂ（Ｃｙｓ）−ＥＧＦＲ−ＰＥＧ５ｋ又はＡＸＢＹＣのフォーマット）との間にｓｉＲＮＡを持つことで、代替的な抱合体に比べて腫瘍においてより高レベルのＥＧＦＲ ｍＲＮＡのノックダウンが結果として生じ、そこではＰＥＧ５ｋがＰＳＭＡ−ＡｂとｓｉＲＮＡ（ＰＳＭＡ−Ａｂ（Ｃｙｓ）−ＰＥＧ５ｋ−ＥＧＦＲ又はＡＸＣＹＢのっフォーマット）との間にある。この手法（ＡＸＢＹＣ）はまた、ＰＥＧ５Ｋ（ＰＳＭＡ−Ａｂ（Ｃｙｓ）−ＥＧＦＲ又はＡＸＢのフォーマット）の無い抱合体に比べて腫瘍においてより高レベルのＥＧＦＲ ｍＲＮＡのノックダウンを結果としてもたらした。
ＰＳＭＡ−Ａｂに対するｓｉＲＮＡ及びＰＥＧの配向を、組織ＰＫ特性に対しても調査した。組織濃度をｐｍｏｌ／ｇで測定し、次に、組織の密度が１ｇ／ｍＬ（１ｎＭ＝１ｎｍｏｌ／Ｌ＝１ｐｍｏｌ／ｍＬ＝１ｐｍｏｌ／ｇの組織の濃度）に等しいと仮定することによりｐｍｏｌ／ｍＬに変換した。図５１Ｂに例示されるように、ＰＳＭＡ−ＡｂとＰＥＧ５ｋ（ＰＳＭＡ−Ａｂ（Ｃｙｓ）−ＥＧＦＲ−ＰＥＧ５ｋ又はＡＸＢＹＣ）のとの間にｓｉＲＮＡを持つことで、代替的な抱合体に比べて腫瘍への高レベルのｓｉＲＮＡ送達が結果として生じ、そこではＰＥＧ５ｋがＰＳＭＡ−ＡｂとｓｉＲＮＡ（ＰＳＭＡ−Ａｂ（Ｃｙｓ）−ＰＥＧ５ｋ−ＥＧＦＲ又はＡＸＣＹＢ）との間にある。この手法（ＡＸＢＹＣ）はまた、ＰＥＧ５Ｋ（ＰＳＭＡ−Ａｂ（Ｃｙｓ）−ＥＧＦＲ又はＡＸＢの）の無い抱合体に比べて腫瘍へのより高レベルのｓｉＲＮＡ送達を結果としてもたらした。
マウスＬＮＣａＰ皮下異種移植片モデルにおいて、抗体ｓｉＲＮＡ抱合体のためのＡＸＢＹＣフォーマットは、ＡＸＣＹＢ及びＡＸＢのフォーマットに比べて、腫瘍組織におけるより高レベルのｓｉＲＮＡ蓄積、及びより大きな規模のＥＧＦＲ ｍＲＮＡのノックダウンを結果としてもたらしたことが実証された。ＬＮＣａｐ腫瘍はヒトＰＳＭＡを発現し、その結果、ｉ．ｖ投与、受容体媒介性の取り込み、及び標的遺伝子のｓｉＲＮＡで促されたノックダウンの後に、ＰＳＭＡ標的化ｓｉＲＮＡ抱合体の腫瘍組織特異的蓄積が生じた。
実施例１２：２０１６−ＰＫ−２１９−ＷＴ［７１１］ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ， ３１（１２）：３４４５−６０）２１量体の二本鎖を、使用した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１６）であった。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して免疫原性を減らし、これは活性なｓｉＲＮＡで使用されるものに匹敵した。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
群４−６で使用されるＡＸＢＹＣ抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。ＡＸＢ（群１−３）及びＡＸＣＹＢ（群７−９）及びＢＹＣ（群１０−１２）の抱合体を実施例９に記載されるように作成した。
インビボの研究設計
野生型のメスのＣＤ−１マウスの群（ｎ＝４）を、ｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置した。処置群は０．５ｍｇ／ｋｇを受け（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）、全ての群は５．０ｍＬ／ｋｇの用量を投与された。表２４は研究設計をより詳細に例示している。非終末期の血液サンプルを、眼窩後方の網状組織の穿刺を介して投与の５、３０、及び１８０分後に集め、遠心分離して、ＰＫ分析のために血漿を生成した。投与の２４、９６、又は１６８時間後にＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。終末期の血液サンプルを、心臓の穿刺を介して集め、処理することで、ＰＫ分析のために血漿を生成した。血漿ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
このインビボのＰＫ実験において、ＥＧＦＲ−Ａｂに対するｓｉＲＮＡ及びＰＥＧの配向はまた、血漿中のｍＡｂ−ｓｉＲＮＡの抱合体の挙動を判定するために調査された。図５２に例示されるように、ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡの抱合体（ＡＸＢ、ＡＸＢＹＣ、及びＡＸＣＹＢのフォーマット）には全て、血漿から迅速に取り除かれたｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ５Ｋ（ＢＹＣフォーマット）と比較して、１６８時間（７日）後に全身循環におよそ１０％のｓｉＲＮＡが残っている比較可能な血漿ＰＫがあった。
抗体ｓｉＲＮＡ抱合体のためのＡＸＢＹＣフォーマットは、血漿から迅速に取り除かれたｓｉＲＮＡ−ＰＥＧの抱合体（ＢＹＣ）に比べてＰＫ特性を改善した。
実施例１３：２０１６−ＰＫ−１９９−ＨＣＣ８２７
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。
陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ， ３１（１２）：３４４５−６０）２１量体の二本鎖を、使用した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１６）であった。活性なＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ二本鎖のために使用されたのと同じ塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を、陰性対照ｓｉＲＮＡにおいて使用した。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
１００−３５０ｍｍ３の体積の側腹部ＨＣＣ８２７腫瘍を皮下（ＳＣ）に持つメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスの群（ｎ＝５）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。処置群１−３及び４−６に、以下の研究設計につき１．０、０．５、又は０．２５ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）で投与した。実施例９に記載されるように、群１−３は同じ標的抗体を含んでいたが、群４−６には異なるＥＧＦＲ標的抗体があり、一方で抱合体成分の残り（リンカー、ｓｉＲＮＡ、及びＰＥＧ）は同一であった。群７は、群１に対する対照として陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）との抗体抱合体を受けた。全ての群（処置及び対照）に、５ｍＬ／ｋｇの用量を投与した。投与後９６時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。表２５は研究設計をより詳細に記載している。５０ｍｇ片の腫瘍及び肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
ｓｉＲＮＡ濃度を、１．０、０．５、及び０．２５ｍｇ／ｋｇでの単回ｉ．ｖ注入後の腫瘍と肝臓において９６時間で判定した。組織濃度をｐｍｏｌ／ｇで測定し、次に、組織の密度が１ｇ／ｍＬに等しいと仮定することによりｐｍｏｌ／ｍＬに変換した。図５３Ａにおいて、１ｎＭ＝１ｎｍｏｌ／Ｌ＝１ｐｍｏｌ／ｍＬ＝１ｐｍｏｌ／ｇの組織の濃度。図５３Ａに例示されるように、両方の抗体抱合体は、肝臓に比べて腫瘍へのより高レベルのｓｉＲＮＡを送達することができ、用量応答が観察された。ＥＧＦＲ抗体抱合体は、ＥＧＦＲ２抗体に比べて、試験される全ての用量において、腫瘍組織により多くのｓｉＲＮＡを送達することが可能であった。図５３Ｂを参照。両方の抱合体は、投与の９６時間後にＥＧＦＲ遺伝子特異的ｍＲＮＡノックダウンが可能であった。スクランブルされたｓｉＲＮＡ及びＰＢＳビヒクル対照を含んでいた対照抱合体は、有意なＥＧＦＲ遺伝子特異的ｍＲＮＡノックダウンをもたらさなかった。
図５４で強調されるように、生物活性は、様々な異なる組織標的におけるインビボの生物活性が可能である、様々な異なる抗体及びｓｉＲＮＡカーゴを備えたＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で実証された。この例において、２つの抱合体の腫瘍特異的蓄積は、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡをダウンレギュレートするように設計されたｓｉＲＮＡに抱合した２つの異なるＥＧＦＲ抗体で標的とされることが実証された。ＨＣＣ８２７腫瘍は高レベルのヒトＥＧＦＲを発現し、両方の抱合体はｓｉＲＮＡを標的とするためにヒト特異的ＥＧＦＲ抗体を有し、その結果抱合体の腫瘍組織特異的蓄積がもたらされる。受容体媒介性の取り込みは、結果として標的遺伝子のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンをもたらした。
実施例１４：２０１６−ＰＫ−２３６−ＨＣＣ８２７
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＥＦＧＲ：
相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ， ３１（１２）：３４４５−６０）２１量体の二本鎖を、使用した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１６）であった。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して免疫原性を減らし、これは活性なｓｉＲＮＡで使用されるものに匹敵した。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
１００−３５０ｍｍ３の体積の側腹部ＨＣＣ８２７腫瘍を皮下（ＳＣ）に持つメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスの群（ｎ＝５）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群６（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。処置群１−３に、以下の研究設計につき１．０、０．５又は０．２５ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）で投与し、群４と５には１．０ｍｇ／ｋｇで投与した。実施例９に記載されるように、群１−３は同じ標的抗体を含んでいたが、群４には異なるＥＧＦＲ標的抗体があり、一方で抱合体成分の残り（リンカー、ｓｉＲＮＡ、及びＰＥＧ）は同一であった。群６は、群５に対する対照として陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）との抗体抱合体を受けた。全ての群（処置及び対照）に、５ｍＬ／ｋｇの用量を投与した。投与後９６時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。表２６は研究設計をより詳細に記載している。５０ｍｇ片の腫瘍及び肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。
このインビボのＰＤ実験において、第３の例のＥＧＦＲ抗体標的化剤（ＥＧＦＲ３）での投与の９６時間後、用量依存性のＥＧＦＲ遺伝子特異的ｍＲＮＡノックダウン（図５５）が実証された。スクランブルされたｓｉＲＮＡ及びＰＢＳビヒクル対照を含んでいた対照抱合体は、有意なＥＧＦＲ遺伝子特異的ｍＲＮＡノックダウンをもたらさなかった。
図５４で強調されるように、様々な異なる組織標的におけるインビボの生物活性が可能である、様々な異なる抗体及びｓｉＲＮＡカーゴを備えたＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物活性が実証された。この例において、第３のＥＧＦＲ抗体標的化リガンドを使用するＥＧＦＲ ｍＲＮＡのその腫瘍特異的ダウンレギュレーションが実証された。ＨＣＣ８２７腫瘍はヒトＥＧＦＲを発現し、両方の抱合体はｓｉＲＮＡを標的とするためにヒト特異的ＥＧＦＲ抗体（ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ３）を有し、その結果抱合体の腫瘍組織特異的蓄積がもたらされる。受容体媒介性の取り込みは、結果として標的遺伝子のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンをもたらした。
実施例１５：２０１６−ＰＫ−２３４−ＨＣＣ８２７
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）はＴＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１７）であり、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡ転写のために塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的となるように設計された。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ， ３１（１２）：３４４５−６０）２１量体の二本鎖を、使用した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１６）であった。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して免疫原性を減らし、これは活性なｓｉＲＮＡで使用されるものに匹敵した。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
１００−３５０ｍｍ３の体積の側腹部ＨＣＣ８２７腫瘍を皮下（ＳＣ）に持つメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスの群（ｎ＝５）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群１０（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。処置群１−３、４−６、及び７−９に、以下の研究設計につき１．０、０．５、又は０．２５ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）で投与した。実施例９に記載されるように、群１−３は同じ標的抗体（ＥＧＦＲ３）を含んでいたが、群４−６には異なるＥＧＦＲ標的抗体があり、一方で抱合体成分の残り（リンカー、ｓｉＲＮＡ、及びＰＥＧ）は同一であった。群７−９は、群１−６に対する対照として陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）との抗体抱合体を受けた。全ての群（処置及び対照）に、５ｍＬ／ｋｇの用量を投与した。投与後９６時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。表２７は研究設計をより詳細に記載している。５０ｍｇ片の腫瘍及び肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
ｓｉＲＮＡ濃度を、１．０、０．５、及び０．２５ｍｇ／ｋｇでの単回ｉ．ｖ注入後の腫瘍と肝臓において９６時間で判定した。組織濃度をｐｍｏｌ／ｇで測定し、次に、組織の密度が１ｇ／ｍＬに等しいと仮定することによりｐｍｏｌ／ｍＬに変換した。図５６Ａにおいて、１ｎＭ＝１ｎｍｏｌ／Ｌ＝１ｐｍｏｌ／ｍＬ＝１ｐｍｏｌ／ｇの組織の濃度。図５６Ａに例示されるように、両方の抗体抱合体は、肝臓に比べて腫瘍へより高レベルのｓｉＲＮＡを送達することができ、用量応答が観察された。両方の抱合体は、スクランブル及びビヒクルの対照に比べて、投与の９６時間後にＥＧＦＲ遺伝子特異的ｍＲＮＡノックダウンが可能であった。図５６Ｂを参照。
図５４で強調されるように、様々な異なる組織標的におけるインビボの生物活性が可能である、様々な異なる抗体及びｓｉＲＮＡカーゴを備えたＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物活性が実証された。この例において、２つの抱合体の腫瘍特異的蓄積は、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡをダウンレギュレートするように設計されたｓｉＲＮＡに抱合した２つの異なるＥＧＦＲ抗体で標的とされることが実証された。ＨＣＣ８２７腫瘍は高レベルのヒトＥＧＦＲを発現し、両方の抱合体はｓｉＲＮＡを標的とするためにヒト特異的ＥＧＦＲ抗体を有し、その結果抱合体の腫瘍組織特異的蓄積がもたらされる。受容体媒介性の取り込みは、結果として標的遺伝子のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンをもたらした。
実施例１６：２０１６−ＰＫ−２３７−ＨＣＣ８２７
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＫＲＡＳ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＫＲＡＳに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＫＲＡＳのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置２３７で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＵＧＡＡＵＵＡＧＣＵＧＵＡＵＣＧＵＣＡＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８８）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、即ち、リン酸ジエステルを逆転した脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された、３’末端におけるＣ６−ＳＨを含んでいた。Ｃ６−ＳＨはリン酸ジエステルを介して接続され、化学構造については実施例９を参照されたい。加えて、パッセンジャー鎖の５’末端では逆位脱塩基が取り除かれ、抗体は、構造２と同様の手順を使用して、Ｔ塩基上のパッセンジャー鎖５’末端の糖上のアミンに直接抱合された。実施例９を参照。
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
群１−３の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−７を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
群４−６のる抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
１００−３５０ｍｍ３の体積の側腹部ＨＣＣ８２７腫瘍を皮下（ＳＣ）に持つメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスの群（ｎ＝５）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群７（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。処置群１−３及び４−６に、以下の研究設計につき１．０、０．５、又は０．２５ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）で投与した。実施例９に記載されるように、群１−６は、同じ標的化抗体（ＥＧＦＲ）を含んでいたが、群１−３にはＫＲＡＳをダウンレギュレートするように設計されたｓｉＲＮＡがあり、群４−６にはＥＧＦＲをダウンレギュレートするように設計されたｓｉＲＮＡがあった。全ての群（処置及び対照）に、５ｍＬ／ｋｇの用量を投与した。投与後９６時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。表２８は研究設計をより詳細に記載している。５０ｍｇ片の腫瘍及び肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、方法のセクションに記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。抱合体の抗体成分の血漿濃度を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して判定した。
ｓｉＲＮＡ濃度を、１．０、０．５、及び０．２５ｍｇ／ｋｇでの単回ｉ．ｖ注入後の腫瘍と肝臓において９６時間で判定した。組織濃度をｐｍｏｌ／ｇで測定し、次に、組織の密度が１ｇ／ｍＬに等しいと仮定することによりｐｍｏｌ／ｍＬに変換した。図５７Ａと図５７Ｂにおいて、１ｎＭ＝１ｎｍｏｌ／Ｌ＝１ｐｍｏｌ／ｍＬ＝１ｐｍｏｌ／ｇの組織の濃度。図５７Ａと図５７Ｂに例示されるように、両方の抗体抱合体は、肝臓に比べて腫瘍へより高レベルのｓｉＲＮＡを送達することができた。ＫＲＡＳをダウンレギュレートするように設計されたｓｉＲＮＡを含んでいた抱合体は、ＥＧＦＲ又はＰＢＳビヒクル対照をダウンレギュレートするように設計されたｓｉＲＮＡを含んでいた抱合体に比べて、投与の９６時間後にＫＲＡＳ遺伝子特異的ｍＲＮＡのノックダウン（図５７Ｃ）が可能であった。両方の抗体抱合体の構成には同様のＰＫ特性があり（図５８Ａと図５８Ｂを参照）、このことは、抗体のために５’ガイド鎖の上で使用される代替的な抱合戦略がこの生物学的パラメータに影響を及ぼさなかったことを示している。
図５４で強調されるように、様々な異なる組織標的におけるインビボの生物活性が可能である、様々な異なる抗体及びｓｉＲＮＡカーゴを備えたＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物活性が実証された。この例において、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡをダウンレギュレートするように設計されたｓｉＲＮＡに抱合されたＥＧＦＲ抗体の腫瘍特異的蓄積及びｓｉＲＮＡ媒介性ｍＲＮＡノックダウンが、実証された。ＨＣＣ８２７腫瘍は高レベルのヒトＥＧＦＲを発現し、抱合体はｓｉＲＮＡを標的とするためにヒト特異的ＥＧＦＲ抗体を有し、その結果抱合体の腫瘍組織特異的蓄積がもたらされる。受容体媒介性の取り込みは、結果としてＫＲＡＳ遺伝子のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンをもたらした。
実施例１７：２０１６−ＰＫ−１８７−ＨＣＣ８２７
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ， ３１（１２）：３４４５−６０）２１量体の二本鎖を、使用した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１６）であった。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して免疫原性を減らし、これは活性なｓｉＲＮＡで使用されるものに匹敵した。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
１００−３５０ｍｍ３の体積の側腹部Ｈｅｐ−３Ｂ２ １−７腫瘍を皮下（ＳＣ）に持つメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスの群（ｎ＝５）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群５（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。処置群１−３に、以下の研究設計につき１．０、０．５又は０．２５ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）で投与し、群４（スクランブル対照）には１．０ｍｇ／ｋｇで投与した。群４は、群１に対する対照として陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）との抗体抱合体を受けた。全ての群（処置及び対照）に、５ｍＬ／ｋｇの用量を投与した。投与後９６時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。表２９は研究設計をより詳細に記載している。５０ｍｇ片の腫瘍及び肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
ｓｉＲＮＡ濃度を、１．０、０．５、及び０．２５ｍｇ／ｋｇでの単回ｉ．ｖ注入後の腫瘍と肝臓において９６時間で判定した。組織濃度をｐｍｏｌ／ｇで測定し、次に、組織の密度が１ｇ／ｍＬに等しいと仮定することによりｐｍｏｌ／ｍＬに変換した。図５９Ａにおいて、１ｎＭ＝１ｎｍｏｌ／Ｌ＝１ｐｍｏｌ／ｍＬ＝１ｐｍｏｌ／ｇの組織の濃度。図５９Ａにおいて示されるように、抗体抱合体は腫瘍にｓｉＲＮＡを送達することができた。抱合体は、陰性対照ｓｉＲＮＡ配列又はＰＢＳビヒクル対照を含んでいた抱合体に比べて、投与の９６時間後にＥＧＦＲ遺伝子特異的ｍＲＮＡのノックダウン（図５９Ｂ）が可能であった。
図５４で強調されるように、様々な異なる組織標的におけるインビボの生物活性が可能である、様々な異なる抗体及びｓｉＲＮＡカーゴを備えたＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物活性が実証された。この例において、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡをダウンレギュレートするように設計されたｓｉＲＮＡに抱合されたＥＧＦＲ抗体の腫瘍特異的蓄積及びｓｉＲＮＡ媒介性ｍＲＮＡノックダウンが、実証された。Ｈｅｐ−３Ｂ２ １−７腫瘍細胞はヒトＥＧＦＲを発現し、抱合体はｓｉＲＮＡを標的とするためにヒト特異的ＥＧＦＲ抗体を有し、その結果抱合体の腫瘍組織特異的蓄積がもたらされる。受容体媒介性の取り込みは、結果としてＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンをもたらした。
実施例１８：２０１６−ＰＫ−２５７−ＷＴ
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
Ｒ１４４２：Ｎ５−ＣＴＮＮＢ１−３’Ｓ
ＣＴＮＮＢ１：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＣＴＮＮＢ１に対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＣＴＮＮＢ１のヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置１２４８で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＵＡＡＵＧＡＧＧＡＣＣＵＡＵＡＣＵＵＡＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９５）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。Ｃ６−ＮＨ２及びＣ６−ＳＨはリン酸ジエステルを介して接続され、化学構造については実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
抗体抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−１を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。トリ−ＧａｌＮＡｃ−ＣＴＮＮＢ１の抱合体を実施例９に記載されるように作成した。
インビボの研究設計
野生型のメスのＣＤ−１マウスの群１−３（ｎ＝４）を、ｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、ＧａｌＮＡｃを標的とした対照には皮下注射で投与した。処置群１−３は、２．０、１．０、及びと０．５ｍｇ／ｋｇの用量（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）を受け、ＧａｌＮＡを標的とした対照の抱合体は２ｍｇ／ｋｇで投与された。全ての群に、５．０ｍＬ／ｋｇの用量を投与した。表３０は研究設計をより詳細に例示している。５０ｍｇ片の肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。
ＣＴＮＮＢ１遺伝子ノックダウンを、投与の９６時間後に判定した。図６０に例示されるように、ＧａｌＮａｃを抱合したｓｉＲＮＡは、当該技術分野で十分に説明されてきたように、単回のｓ．ｃ注射後に遺伝子特異的ノックダウンが可能であった。ＡＳＧＲ抗体に抱合された同じｓｉＲＮＡはまた、用量依存的な方法でＣＴＮＮＢ１遺伝子ダウンレギュレーションが可能であった。
図５４で強調されるように、様々な異なる組織標的におけるインビボの生物活性が可能である、様々な異なる抗体及びｓｉＲＮＡカーゴを備えたＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物活性が実証された。この例において、ＣＴＮＮＢ１ ｍＲＮＡをダウンレギュレートするように設計されたＡＳＧＲでの肝臓送達が実証された。マウス肝臓細胞はアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＲ）を発現し、抱合体はｓｉＲＮＡを標的とするためにマウス特異的ＡＳＧＲ抗体を有し、結果として肝臓にＣＴＮＮＢ１のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンをもたらした。
実施例１９：２０１６−ＰＫ−２５３−ＷＴ
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＫＲＡＳ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＫＲＡＳに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＫＲＡＳのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置２３７で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＵＧＡＡＵＵＡＧＣＵＧＵＡＵＣＧＵＣＡＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８８）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。Ｃ６−ＮＨ２及びＣ６−ＳＨはリン酸ジエステルを介して接続され、化学構造については実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
抗体抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−１を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。トリ−ＧａｌＮＡｃ−ＣＴＮＮＢ１の抱合体を実施例９に記載されるように作成した。
インビボの研究設計
野生型のメスのＣＤ−１マウスの群１−３（ｎ＝４）を、ｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、ＧａｌＮＡｃを標的とした対照には皮下注射で投与した。処置群１−３は、２．０、１．０、及びと０．５ｍｇ／ｋｇの用量（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）を受け、ＧａｌＮＡを標的とした対照の抱合体は２ｍｇ／ｋｇで投与された。全ての群に、５．０ｍＬ／ｋｇの用量を投与した。表３１は研究設計をより詳細に例示している。５０ｍｇ片の肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。
ＫＲＡＳ遺伝子ノックダウンを、投与の９６時間後に判定した。図６１に例示されるように、ＧａｌＮａｃを抱合したｓｉＲＮＡは、当該技術分野で十分に説明されてきたように、単回のｓ．ｃ注射後に遺伝子特異的ノックダウンが可能であった。ＡＳＧＲ抗体に抱合された同じｓｉＲＮＡはまた、用量依存的な方法でＫＲＡＳ遺伝子ダウンレギュレーションが可能であった。
図５４で強調されるように、様々な異なる組織標的におけるインビボの生物活性が可能である、様々な異なる抗体及びｓｉＲＮＡカーゴを備えたＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物活性が実証された。この例において、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡをダウンレギュレートするように設計されたＡＳＧＲでの肝臓送達が実証された。マウス肝臓細胞はアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＲ）を発現し、抱合体はｓｉＲＮＡを標的とするためにマウス特異的ＡＳＧＲ抗体を有し、結果として肝臓にＫＲＡＳのｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンをもたらした。
実施例２０：２０１６−ＰＫ−１２９−ＷＴ−血漿
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＫＲＡＳ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＫＲＡＳに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＫＲＡＳのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置２３７で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＵＧＡＡＵＵＡＧＣＵＧＵＡＵＣＧＵＣＡＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８８）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＥＦＧＲ：
相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−１を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
野生型のメスのＣＤ−１マウスの群（ｎ＝３）を、ｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置した。処置群は０．５ｍｇ／ｋｇを受け（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）、全ての群は５．０ｍＬ／ｋｇの用量を投与された。表３２は研究設計をより詳細に例示している。非終末期の血液サンプルを、眼窩後方の網状組織の穿刺を介して投与の５、３０、及び１８０分後に集め、遠心分離して、ＰＫ分析のために血漿を生成した。投与の２４、９６、又は１６８時間後にＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。終末期の血液サンプルを、心臓の穿刺を介して集め、処理することで、ＰＫ分析のために血漿を生成した。血漿ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。抗体の血漿濃度を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して判定した。
このインビボのＰＫ実験において、２つの異なる抱合体の血漿クリアランスを調べた。図６２に例示されるように、ｓｉＲＮＡ（ＫＲＡＳ対ＥＧＦＲ）又は抗体（ＥＧＦＲ２対ＰＳＭＡ）の血漿レベルを比較すると、両方のｍＡｂ−ｓｉＲＮＡの抱合体には比較可能な血漿ＰＫがあった。
図５４で強調されるように、様々な異なる組織標的におけるインビボの生物活性が可能である、様々な異なる抗体及びｓｉＲＮＡカーゴを備えたＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物活性が実証された。この例において、異なる抗体標的リガンド及び異なるｓｉＲＮＡカーゴを持つ２つの異なる抱合体には比較可能な血漿ＰＫ特性があることが実証された。
実施例２１：２０１６−ＰＫ−１２３−ＬＮＣａＰ
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−１を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）又はＤＡＲ２（ｎ＝２）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
１００−３５０ｍｍ３の体積の皮下の側腹部ＬＮＣａＰ腫瘍を持つメスのＳＣＩＤ ＳＨＯマウスの群（ｎ＝５）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。処置群は、表３３の研究設計ごとに投与された。全ての群（処置及び対照）に、５．７１ｍＬ／ｋｇの用量を投与した。投与後７２時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。５０ｍｇ片の腫瘍及び肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
ｓｉＲＮＡ濃度を、０．５、及びでの単回ｉ．ｖ注入後の腫瘍と肝臓において７２時間で判定した。図６３Ａを参照。図６３Ａに例示されるように、１（ｎ＝１）の薬物対抗体の比率を持つ抗体抱合体は、肝臓で測定されたものより大きなレベルで、用量依存的な方法で腫瘍にｓｉＲＮＡを送達することができ、且つ、スクランブルされた及びＰＢＳの対照に比べてＥＧＦＲ遺伝子特異的ｍＲＮＡノックダウンをもたらした。これは２（ｎ＝２）の薬物対抗体の比率を持つ抗体抱合体と対照的であり、このことは、同等の用量で腫瘍において低濃度のｓｉＲＮＡ、同じ規模及び低レベルのＥＧＦＲノックダウンであった肝臓及び腫瘍の濃度を達成した。抱合されていないｓｉＲＮＡの腫瘍及び肝臓蓄積は乏しく、測定可能なＥＧＦＲ ｍＲＮＡのノックダウンは無かった。図６３Ｂは、ＬＮＣａＰ腫瘍におけるＥＧＦＲ ｍＲＮＡの相対的なパーセンテージを示す。
図５４で強調されるように、様々な異なる組織標的におけるインビボの生物活性が可能である、様々な異なる抗体及びｓｉＲＮＡカーゴを備えたＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物活性が実証された。この例において、ＤＡＲ１抱合体は、ＤＡＲ２及び抱合されていないｓｉＲＮＡに比べて、より大きなｓｉＲＮＡ腫瘍濃度を達成することができることが実証された。加えて、ＤＡＲ１抱合体は、ＤＡＲ２及び抱合されていないｓｉＲＮＡに比べて、ＥＧＦＲのより大きなレベルのｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンを達成することができる。
実施例２２：２０１６−ＰＫ−２５８−ＷＴ
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＨＰＲＴ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＨＰＲＴに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列はＡＵＡＡＡＡＵＣＵＡＣＡＧＵＣＡＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０２）であり、ＨＰＲＴのヒトｍＲＮＡ転写のために塩基位置４２５で始まる遺伝子配列に相補的となるように設計された。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。Ｃ６−ＮＨ２及びＣ６−ＳＨはリン酸ジエステルを介して接続され、化学構造については実施例９を参照されたい。
陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ， ３１（１２）：３４４５−６０）２１量体の二本鎖を、使用した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１６）であった。活性なＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ二本鎖のために使用されたのと同じ塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を、陰性対照ｓｉＲＮＡにおいて使用した。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
群１−３及び７−９の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。群４−６の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−１を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
野生型のメスのＣＤ−１マウスの群（ｎ＝４）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝４）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。表３４は研究設計をより詳細に例示している。５０ｍｇ片の組織を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
図６４Ａ−図６４Ｃに例示されるように、ＡＳＣの単回のｉ．ｖ．投与後、心筋、胃骨格筋（ｇａｓｔｒｏｃ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ）及び肝臓におけるＨＰＲＴの用量依存性ノックダウンを測定した。肺組織（図６４Ｄ）にＨＰＲＴの測定可能なノックダウンはなかった。加えて、４つの組織区画全てのｓｉＲＮＡの用量依存性蓄積を観察した（図６４Ｅ）。リジン及びシステインの抱合体の間に生物活性（ＫＤ及び組織濃度）の有意差はなかった。
図５４で強調されるように、様々な異なる組織標的におけるインビボの生物活性が可能である、様々な異なる抗体及びｓｉＲＮＡカーゴを備えたＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物活性が実証された。この例において、心筋、胃骨格筋、及び肝臓に対してｓｉＲＮＡを標的とし、且つレポーター遺伝子ＨＰＲＴの遺伝子特異的ダウンレギュレーションを達成するために、抗Ｂ細胞抗体を使用することができることが、実証された。リジン又はシステインの抱合の戦略を使用して抗体に取り付けた時、ＡＳＣ構築物の生物活性に測定可能な差はなかった。
実施例２３：２０１６−ＰＫ−２５４−ＷＴ
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＨＰＲＴ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＨＰＲＴに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列はＡＵＡＡＡＡＵＣＵＡＣＡＧＵＣＡＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０２）であり、ＨＰＲＴのヒトｍＲＮＡ転写のために塩基位置４２５で始まる遺伝子配列に相補的となるように設計された。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。Ｃ６−ＮＨ２及びＣ６−ＳＨはリン酸ジエステルを介して接続され、化学構造については実施例９を参照されたい。
陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ， ３１（１２）：３４４５−６０）２１量体の二本鎖を、使用した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１６）であった。活性なＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ二本鎖のために使用されたのと同じ塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を、陰性対照ｓｉＲＮＡにおいて使用した。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
野生型のメスのＣＤ−１マウスの群（ｎ＝４）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。表３５は研究設計をより詳細に例示している。５０ｍｇ片の組織を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
図６５Ａ−図６５Ｃに例示されるように、抗Ｂ細胞Ｆａｂ標的リガンドを含むＡＳＣの単回のｉ．ｖ．投与後、心筋、胃骨格筋、及び肝臓におけるＨＰＲＴのＡＳＣ用量依存性ノックダウンを測定した。肺組織にＨＰＲＴの測定可能なノックダウンはなかった（図６５Ｄ）。加えて、４つの組織区画全てのｓｉＲＮＡの用量依存性蓄積を観察した（図６５Ｅ）。
図５４で強調されるように、生物活性は、様々な異なる組織標的におけるインビボの生物活性が可能である、様々な異なる抗体及びｓｉＲＮＡカーゴを備えたＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で実証された。この例において、心筋、胃骨格筋、及び肝臓に対してｓｉＲＮＡを標的とし、且つレポーター遺伝子ＨＰＲＴの遺伝子特異的ダウンレギュレーションを達成するために、抗Ｂ細胞Ｆａｂを使用することができることが、実証された。
実施例２４：２０１６−ＰＫ−２４５−ＷＴ
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＣＴＮＮＢ１：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＣＴＮＮＢ１に対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列はＴＵＵＣＧＡＡＵＣＡＡＵＣＣＡＡＣＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９６）であり、ＣＴＮＮＢ１のヒトｍＲＮＡ転写のために塩基位置１７９７で始まる遺伝子配列を標的とするように設計された。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。Ｃ６−ＮＨ２及びＣ６−ＳＨはリン酸ジエステルを介して接続され、化学構造については実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
群３−４の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。群１−２の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−１を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
野生型のメスのＣＤ−１マウスの群（ｎ＝４）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。表３６は研究設計をより詳細に例示している。５０ｍｇ片の組織を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
図６６Ａと図６６Ｂに例示されるように、抗Ｂ細胞抗体標的リガンド（抗Ｂ細胞−Ａｂ）を含むＡＳＣの単回のｉ．ｖ．投与後、心筋におけるＨＰＲＴノックダウン及び用量依存性組織ｓｉＲＮＡ蓄積を誘発させた。図６６Ｃ−図６６Ｄに例示されるように、抗Ｂ細胞抗体標的リガンドを含むＡＳＣの単回のｉ．ｖ．投与後、胃骨格筋におけるＨＰＲＴノックダウン及び用量依存性組織ｓｉＲＮＡ蓄積を誘発させた。リジン及びシステインの抱合体の間に生物活性（ＫＤ及び組織濃度）の有意差はなかった。
図５４で強調されるように、様々な異なる組織標的におけるインビボの生物活性が可能である、様々な異なる抗体及びｓｉＲＮＡカーゴを備えたＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物活性が実証された。この例において、心筋及び胃骨格筋に対してｓｉＲＮＡを標的とし、且つＣＴＮＮＢ１ ｍＲＮＡの遺伝子特異的ダウンレギュレーションを達成するために、抗Ｂ細胞抗体を使用することが、実証された。
実施例２５：２０１６−ＰＫ−１６０−ＬＮＣａｐ
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＡＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＡＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＡＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置２８２２で始まる遺伝子配列に相補的であった（ガイド鎖配列：ＧＡＧＡＧＣＵＣＣＡＵＡＧＵＧＡＣＡＣＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０８）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ， ３１（１２）：３４４５−６０）２１量体の二本鎖を、使用した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１６）であった。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して免疫原性を減らし、これは活性なｓｉＲＮＡで使用されるものに匹敵した。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−１を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
１００−３５０ｍｍ３の体積の皮下の側腹部ＬＮＣａＰ腫瘍を持つメスのＳＣＩＤ ＳＨＯマウスの群（ｎ＝５）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。下記の表は研究設計について記載している。投与後９６時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。５０ｍｇ片の腫瘍及び肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
図６７Ａに例示されるように、ＡＲをダウンレギュレートするように設計されたＰＳＭＡ抗体標的リガンド及びｓｉＲＮＡを含むＡＳＣのｉ．ｖ．投与後、スクランブルされた対照と比べて試験される全ての用量でのＬＮＣａＰ腫瘍組織におけるＡＲノックダウンを、誘発させた。図６７Ｂに例示されるように、腫瘍組織にｓｉＲＮＡの測定可能な蓄積があり、肝臓組織において測定されたものよりも高いレベルであった。
図５４で強調されるように、様々な異なる組織標的におけるインビボの生物活性が可能である、様々な異なる抗体及びｓｉＲＮＡカーゴを備えたＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物活性が実証された。この例において、ＡＲ ｍＲＮＡをダウンレギュレートするように設計されたｓｉＲＮＡに抱合されるＰＳＭＡでのＬＮＣａＰ前立腺腫瘍への送達が実証された。ＬＮＣａＰ細胞は細胞表面上にヒトＰＳＭＡを発現し、抱合体は、抗原に結合し且つｓｉＲＮＡの内部移行を可能にするヒト特異的ＰＳＭＡ抗体を有しており、その結果、腫瘍組織におけるＡＲのｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンが生じた。
実施例２６：Ｂ細胞におけるインビトロの取り込み及びノックダウン
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＨＰＲＴ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＨＰＲＴに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列はＡＵＡＡＡＡＵＣＵＡＣＡＧＵＣＡＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０２）であり、ＨＰＲＴのヒトｍＲＮＡ転写のために塩基位置４２５で始まる遺伝子配列に相補的となるように設計された。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。Ｃ６−ＮＨ２及びＣ６−ＳＨはリン酸ジエステルを介して接続され、化学構造については実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビトロの研究設計
マウスの脾臓を採取し、氷の上で１００ｕ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシンを含むＰＢＳの中で維持した。脾臓を清潔なスライドガラスで押しつぶし、小片に切断し、１８Ｇ針でホモジナイズして、濾過した（７０ｕｍのナイロン膜）。死細胞を、製造業者の指示に従いＭｉｌｔｅｎｙ ｂｉｏｔｅｃの死細胞除去キット（Ｃａｔａｌｏｇ＃１３０−０９０１０１）で除去した。マウスＢ細胞を単離するために、Ｍｉｌｔｅｎｙ ｂｉｏｔｅｃのＢ細胞単離キット（Ｃａｔａｌｏｇ＃ １３０−０９０−８６２）を、製造業者の指示に従い使用した。簡単に、生きた脾臓細胞を、マウスの脾臓あたり２００μｌのＭＡＣＳ緩衝液で再懸濁した。非Ｂ細胞を、抗ビオチン磁気マイクロビーズと結合される、ビオチンを抱合したモノクローナル抗体ＣＤ４３（Ｌｙ４８）、ＣＤ４、及びＴｅｒ−１１９で枯渇させた。１つのマウスの脾臓から、３０００万の生きたＢ細胞を得ることができる。単離されたマウスＢ細胞（１００ｕ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシンを含む１０％のＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０において２ｘ１０６／ｍｌ）を活性化するために、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ、５μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭ、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０、０．０５μｇ／ｍｌのＩＬ−４、及び０．０５μｇ／ｍｌのＩＮＦγのカクテルを加えた。活性化の４時間後、ＡＳＣ（１ｐＭ〜１０ｎＭ）を、２４（０．５ｍｌの培地）又は１２（１ｍｌの培地）ウェルのプレートにおいて１つのウェルにつき１０６の細胞に加えた。ＡＳＣ処置の４８時間後、細胞を採取し、単離されたＲＮＡをｍＲＮＡのノックダウンのために分析した。
活性化された初代マウスＢ細胞のこのインビトロの試験において、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をダウンレギュレートするように設計されたｓｉＲＮＡを送達するための抗Ｂ細胞抗体及びＦａｂ ＡＳＣの能力を、測定した。図６８Ａに例示されるように、Ｆａｂ抱合体は、ビヒクル又はスクランブル対照に比べてＨＰＲＴをダウンレギュレートすることができた。図６８Ｂに例示されるように、抗体抱合体は、抗体、ビヒクル、及びスクランブル対照に比べてＨＰＲＴをダウンレギュレートすることができた。
図５４で強調されるように、様々な異なる組織標的におけるインビボの生物活性が可能である、様々な異なる抗体及びｓｉＲＮＡカーゴを備えたＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物活性が実証された。この例において、ＨＰＲＴ ｍＲＮＡをダウンレギュレートするように設計されたｓｉＲＮＡに抱合されるマウス抗Ｂ細胞抗体又は抗Ｂ細胞Ｆａｂを持つ活性化マウスＢ細胞への送達が実証された。活性化マウスＢ細胞は、抗Ｂ細胞抗体を認識する表面受容体を介して抗体−ｓｉＲＮＡ抱合体を認識且つ内在化し、結果としてＨＰＲＴのｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンをもたらした。
実施例２７：２０１６−ＰＫ−２４９−ＷＴ
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＫＲＡＳ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＫＲＡＳのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置２３７で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＵＧＡＡＵＵＡＧＣＵＧＵＡＵＣＧＵＣＡＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８８）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
群１−２の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。群３−４の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ２（ｎ＝２）として作成且つ精製した。群５−６の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−５を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。群７−８の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−５を使用してＤＡＲ２（ｎ＝２）として作成且つ精製した。群９−１０の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−６を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。群１１−１２の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−６を使用してＤＡＲ２（ｎ＝２）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
野生型のメスのＣＤ−１マウスの群（ｎ＝４）を、ｓｉＲＮＡ抱合体（群１−１２）又は抗体単独（群１３−１４）の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置した。表３９は研究設計を例示している。非終末期の血液サンプルを、眼窩後方の網状組織の穿刺を介して投与の０．２５及び３時間後に集め、遠心分離して、ＰＫ分析のために血漿を生成した。投与後２４及び７２時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。終末期の血液サンプルを、心臓の穿刺を介して集め、処理することで、ＰＫ分析のために血漿を生成した。血漿ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。抗体の血漿濃度を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して判定した。
このインビボのＰＫ研究において、部位特異的抱合の有用性が実証された。図６９Ａに例示されるように、ＤＡＲ１（ｎ＝１）被験物質（群９）は、２つの対照（群１及び５）に対して比較可能なｓｉＲＮＡ血漿クリアランス特性を有しており、およそ１０％のｓｉＲＮＡが１６８時間後に血漿に残っている。ＤＡＲ２（ｎ＝２）抱合体は全て、ＤＡＲ１抱合体に比べて血漿からのｓｉＲＮＡのはるかに速いクリアランスを有していた。図６９Ｂに例示されるように、ＤＡＲ１（ｎ＝１）被験物質（群９）は、２つの対照（群１及び５）に対して比較可能なＥＧＦＲ−Ａｂ血漿クリアランス特性を有していた。ＤＡＲ２（ｎ＝２）抱合体は全て、ＤＡＲ１抱合体に比べて血漿からの抗体のはるかに速いクリアランスを有していた。
上記実施例において、抗体にｓｉＲＮＡを付けるためのリジン及びシステインの抱合の戦略の使用を実証した。この例において、部位特異的抱合戦略の有用性が実証され、且つ、抱合体は非特異的抱合戦略に対して比較可能なＰＫ特性を有していることが実証された。
実施例２８：２０１６−ＰＫ−１８０−ＨＣＣ８２７
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ， ３１（１２）：３４４５−６０）２１量体の二本鎖を、使用した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１６）であった。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して免疫原性を減らし、これは活性なｓｉＲＮＡで使用されるものに匹敵した。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
１００−３５０ｍｍ３の体積の側腹部ＨＣＣ８２７腫瘍を皮下（ＳＣ）に持つメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスの群（ｎ＝５）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。表４０は研究設計を記載している。投与後９６時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。５０ｍｇ片の腫瘍及び肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。血漿及び組織のｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿及び組織濃度に転換させた。
このインビボのＰＫ研究において、抗体とｓｉＲＮＡの間のＳＭＣＣリンカーの酵素学的に切断可能なリンカーとの交換、ｓｉＲＮＡとＰＥＧの間の切断可能なジスルフィドリンカーの導入、或いはその両方の組み合わせを、試験した。図７０Ａに例示されるように、全てのリンカーの組み合わせ、スクランブルされた対象に比べてＨＣＣ８２７腫瘍細胞においてＥＧＦＲ ｍＲＮＡノックダウンが可能であった。図７０Ｂに例示されるように、全てのリンカーの組み合わせは、腫瘍と肝臓に比較可能なｓｉＲＮＡ組織内蓄積をもたらした。図７０Ｃに例示されるように、抱合体は全て、血漿において高レベルのｓｉＲＮＡを維持することができ、およそ１０％が１６８時間後に血漿に残っている。
このＡＸＢＹＣの例において、異なるリンカーの組み合わせ（「Ｘ」及び／又は「Ｙ」）は、抗体及びＰＥＧにｓｉＲＮＡを抱合させるために使用され得ることが実証された。
実施例２９：２０１６−ＰＫ−１６２−ＬＮＣａｐ
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ， ３１（１２）：３４４５−６０）２１量体の二本鎖を、使用した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１６）であった。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して免疫原性を減らし、これは活性なｓｉＲＮＡで使用されるものに匹敵した。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
１００−３５０ｍｍ３の体積の皮下の側腹部ＬＮＣａＰ腫瘍を持つメスのＳＣＩＤ ＳＨＯマウスの群１−７（ｎ＝５）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群８（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。下記の表は研究設計について記載している。投与後９６時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。５０ｍｇ片の腫瘍及び肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
このインビボのＰＫ研究において、ジスルフィド（ＳＳ）、酵素学的に切断可能な（ＥＣＬ）又はＳＭＣＣのリンカーを、抗体とｓｉＲＮＡの間で使用した。スライド４２上のグラフ１に例示されるように、切断可能なジスルフィドリンカー（ｌｅａｋｅｒ）がＥＣＬ又はＳＭＣＣのリンカーの代わりに使用された時、ｓｉＲＮＡの腫瘍組織蓄積が減少した。スライド４２上のグラフ２に例示されるように、ＥＣＬリンカー戦略は、スクランブルされた対照に比べてＬＮＣａＰ腫瘍細胞においてＥＧＦＲ ｍＲＮＡノックダウンをもたらした。しかし、ＳＳリンカーは、スクランブルされた対照に比べて、ＬＮＣａＰ腫瘍細胞においてＥＧＦＲ ｍＲＮＡノックダウンをもたらすことはできなかった。これらのリンカー実験に加えて、ＡＳＣの−８０℃での保管の実現可能性を調べた。製剤を５ｍｇ／ｍｌの抗体濃度で液体窒素の中に急速凍結し、−８０℃で３０日保管した後に室温で溶かし、投与前に必要とされた投薬濃縮に希釈した。スライド４２上のグラフ３に例示されるように、構築物を−８０℃で保存し、投与前に溶かし、スクランブルされた対照に比べてＬＮＣａＰ腫瘍細胞においてＥＧＦＲ ｍＲＮＡノックダウンをもたらす能力を保持した。
このＡＸＢＹＣの例において、ＥＣＬリンカー（「Ｘ」）は、ｓｉＲＮＡに抗体を抱合させるために使用され得ること、及び、ＡＳＣは１か月間−８０℃で保存され投与前に溶かされることが実証された。
実施例３０：２０１６−ＰＫ−１８１−ＨＣＣ８２７
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ， ３１（１２）：３４４５−６０）２１量体の二本鎖を、使用した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１６）であった。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して免疫原性を減らし、これは活性なｓｉＲＮＡで使用されるものに匹敵した。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
１００−３５０ｍｍ３の体積の側腹部ＨＣＣ８２７腫瘍を皮下（ＳＣ）に持つメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスの群（ｎ＝５）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。表４２は研究設計を記載している。投与後９６時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。５０ｍｇ片の腫瘍及び肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、方法のセクションに記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して組織濃度に転換させた。
このインビボのＰＫ研究において、ジスルフィド又はＳＭＣＣのリンカーを、抗体とｓｉＲＮＡの間で使用した。
上の図７２Ａに例示されるように、切断可能なジスルフィドリンカー（ｌｅａｋｅｒ）がより安定したＳＭＣＣのリンカーの代わりに使用された時、ｓｉＲＮＡの腫瘍組織蓄積が減少した。図７２Ｂに例示されるように、両方のリンカー戦略が、スクランブルされた対照に比べてＨＣＣ８２７腫瘍細胞においてＥＧＦＲ ｍＲＮＡノックダウンを産生することが可能であった。
このＡＸＢＹＣの例において、抗体とｓｉＲＮＡとの間の切断可能なジスルフィドリンカー（「Ｘ」）の使用が実証された。
実施例３１：２０１６−ＰＫ−２２０−ＷＴ
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＫＲＡＳ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＫＲＡＳに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＫＲＡＳのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置２３７で始まる遺伝子配列に相補的であった（ガイド鎖配列：ＵＧＡＡＵＵＡＧＣＵＧＵＡＵＣＧＵＣＡＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８８）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
野生型のメスのＣＤ−１マウスの群（ｎ＝４）を、ｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置した。処置群は０．５ｍｇ／ｋｇを受け（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）、全ての群は５．０ｍＬ／ｋｇの用量を投与された。表４３は研究設計をより詳細に例示している。非終末期の血液サンプルを、眼窩後方の網状組織の穿刺を介して投与の５、３０、及び１８０分後に集め、遠心分離して、ＰＫ分析のために血漿を生成した。投与の２４、９６、又は１６８時間後にＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。終末期の血液サンプルを、心臓の穿刺を介して集め、処理することで、ＰＫ分析のために血漿を生成した。血漿ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。抗体の血漿濃度を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して判定した。
このインビボのＰＫ研究において、立体障害の程度が様々な状態で、異なるジスルフィドリンカーを調べて、ジスルフィド切断の速度がどのようにＡＳＣ血漿ＰＫに影響を与えるのかを理解した。図７３Ａに例示されるように、血漿からのｓｉＲＮＡのクリアランスを、ジスルフィドリンカーの立体障害の程度を変えることにより調整した。図７３Ｂは、血漿からの抗体ザルツムマブのクリアランスを示す。
この例において、抗体にｓｉＲＮＡを抱合させるために様々な異なるジスルフィドリンカー（「Ｘ」）が使用され得る、様々な異なるＡＸＢＹＣ抱合体で生物活性を実証した。
実施例３２：２０１６−ＰＫ−２５６−ＷＴ
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＫＲＡＳ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＫＲＡＳに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＫＲＡＳのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置２３７で始まる遺伝子配列に相補的であった（ガイド鎖配列：ＵＧＡＡＵＵＡＧＣＵＧＵＡＵＣＧＵＣＡＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８８）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
野生型のメスのＣＤ−１マウスの群（ｎ＝４）を、ｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置した。処置群は０．５ｍｇ／ｋｇを受け（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）、全ての群は５．０ｍＬ／ｋｇの用量を投与された。表４４は研究設計をより詳細に例示している。非終末期の血液サンプルを、眼窩後方の網状組織の穿刺を介して投与の０．２５、３、及び２４時間後に集め、遠心分離して、ＰＫ分析のために血漿を生成した。投与の７２、９６、又は１６８時間後にＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。終末期の血液サンプルを、心臓の穿刺を介して集め、処理することで、ＰＫ分析のために血漿を生成した。血漿ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。抗体の血漿濃度を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して判定した。
このインビボのＰＫ研究において、抗体とｓｉＲＮＡとの間の様々な異なるリンカーを試験して、血漿クリアランスに対する効果を判定した。スライド４５のグラフに例示されるように、抱合体は全て、血漿において高レベルのｓｉＲＮＡを維持することができ、１０％より多くが１６８時間後に血漿に残っている。
この例において、抗体にｓｉＲＮＡを抱合させつつ、抱合されていないｓｉＲＮＡに履歴的に観察されたものにわたって血漿動態の改善を維持するために様々な異なるリンカー（「Ｙ」）が使用され得る、様々な異なるＡＸＢＹＣ抱合体で生物活性を実証した。
実施例３３：２０１６−ＰＫ−２３７−ＨＣＣ８２７
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ガイド鎖配列：ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。
２つの異なる配向に２つの抱合ハンドル（Ｃ６−ＮＨ２及びＣ６−ＳＨ）を含む異なる２つのパッセンジャー鎖を作成した（Ｓ５’−ＥＧＦＲ−３’Ｎ及びＮ５’−ＥＧＦＲ−３’Ｓ）。Ｎ５’−ＥＧＦＲ−３’Ｓパッセンジャー鎖において、両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。Ｓ５’−ＥＧＦＲ−３’Ｎパッセンジャー鎖において、両方の抱合ハンドルを、リン酸ジエステルで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。Ｃ６−ＮＨ２及びＣ６−ＳＨはリン酸ジエステルを介して接続され、化学構造については実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
群１−３の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。群４−６の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−２を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
１００−３５０ｍｍ３の体積の側腹部ＨＣＣ８２７腫瘍を皮下（ＳＣ）に持つメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスの群（ｎ＝５）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。表４５は研究設計を記載している。投与の７２、９６、及び１６８時間後にＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。５０ｍｇ片の腫瘍及び肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織及び血漿のｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
このインビボのＰＫ研究において、ｓｉＲＮＡへの抗体及びＰＥＧの抱合部位の配向（５’又は３’）の変化の生物学的結果を、評価した。加えて、抗体にリンカーを取り付けるためにリジン又はシステインを使用した生物学的結果を評価した。図７５Ａに例示されるように、ｓｉＲＮＡの両方の配向は、比較可能なＥＧＦＲ腫瘍ノックダウンをもたらした。図７５Ｂと図７５Ｃに例示されるように、両方の配向は、腫瘍と肝臓に比較可能なｓｉＲＮＡ組織内蓄積をもたらした。図７５Ｄに例示されるように、両方の配向は、比較可能な血漿クリアランス動態をもたらす。
図５４で強調されるように、様々な異なる組織標的におけるインビボの生物活性が可能である、様々な異なる抗体及びｓｉＲＮＡカーゴを備えたＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物活性が実証された。この例において、抗体は、ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖の５’及び３’末端に抱合され、その一方でＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ及び組織分布の生物活性を維持し得ることが、実証された。
実施例３４：２０１６−ＰＫ−２５９−ＷＴ
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＨＰＲＴ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＨＰＲＴに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＨＰＲＴのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置４２５で始まる遺伝子配列に相補的であった（ガイド鎖配列：ＵＵＡＡＡＡＵＣＵＡＣＡＧＵＣＡＵＡＧＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０４）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。２つの異なる配向に２つの抱合ハンドル（Ｃ６−ＮＨ２及びＣ６−ＳＨ）を含む異なる２つの異なるパッセンジャー鎖を作成した（Ｓ５’−ＨＰＲＴ−３’Ｎ及びＮ５’−ＨＰＲＴ−３’Ｓ）。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。Ｃ６−ＮＨ２及びＣ６−ＳＨはリン酸ジエステルを介して接続され、化学構造については実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
群１−３の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。群４−６の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−２を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。群７−９の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−１を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。群１０−１２の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−３を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
野生型のメスのＣＤ−１マウスの群（ｎ＝４）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。表４６は研究設計をより詳細に例示している。５０ｍｇ片の組織を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。
その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
このインビボのＰＫ研究において、ｓｉＲＮＡへの抗体及びＰＥＧの抱合部位の配向（５’又は３’）の変化の生物学的結果を、評価した。加えて、抗体にリンカーを取り付けるためにリジン又はシステインを使用した生物学的結果を評価した。図７６Ａ−図７６Ｄに例示されるように、抗体抱合体を作成する全ての組み合わせは、測定される４つの組織区画において比較可能なＨＰＲＴノックダウンをもたらした。図７７Ａ−図７７Ｄに例示されるように、抗体抱合体を作成する全ての組み合わせは、測定される異なる区画において比較可能なｓｉＲＮＡ組織蓄積をもたらした。
この例において、ｓｉＲＮＡと抗体に対する様々な異なる抱合の戦略はＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃフォーマットで使用することができ、その一方でＨＰＲＴ ｓｉＲＮＡ及び組織分布の生物活性を維持することが、実証された。
実施例３５：２０１６−ＰＫ−２６７−ＷＴ
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＣＴＮＮＢ１：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＣＴＮＮＢ１に対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＣＴＮＮＢ１のヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置１７９７で始まる遺伝子配列に相補的であった（ガイド鎖配列：ＵＵＵＣＧＡＡＵＣＡＡＵＣＣＡＡＣＡＧＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９８）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。
２つの異なる配向に２つの抱合ハンドル（Ｃ６−ＮＨ２及びＣ６−ＳＨ）を含む異なる２つのパッセンジャー鎖を作成した（Ｓ５’−ＣＴＮＮＢ１−３’Ｎ及びＮ５’−ＣＴＮＮＢ１−３’Ｓ）。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。Ｃ６−ＮＨ２及びＣ６−ＳＨはリン酸ジエステルを介して接続され、化学構造については実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
群１−３の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。群４−６の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−３を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。群７−９の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−２を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。群１０−１２の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−１を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
野生型のメスのＣＤ−１マウスの群（ｎ＝４）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。表４７は研究設計をより詳細に例示している。５０ｍｇ片の組織を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。
このインビボのＰＫ研究において、ｓｉＲＮＡへの抗体及びＰＥＧの抱合部位（５’又は３’）の配向の変化の生物学的結果、及びリンカーに取り付けられるリジン又はシステインを使用した生物学的結果を、評価した。図７８Ａ−図７８Ｄに例示されるように、抗体抱合体を作成する全ての組み合わせは、測定される４つの組織区画において比較可能なＣＴＮＮＢ１ノックダウンをもたらした。
この例において、ｓｉＲＮＡと抗体に対する様々な異なる抱合の戦略はＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃフォーマットで使用することができ、その一方でＣＴＮＮＢ１ ｓｉＲＮＡ及びの生物活性を維持することが、実証された。
実施例３６：２０１６−ＰＫ−１８８−ＷＴ
ＥＦＧＲ：
相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
野生型のメスのＣＤ−１マウスの群（ｎ＝４）を、ｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置した。処置群は０．５ｍｇ／ｋｇを受け（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）、全ての群は５．０ｍＬ／ｋｇの用量を投与された。表４８は研究設計をより詳細に例示している。非終末期の血液サンプルを、眼窩後方の網状組織の穿刺を介して投与の５、３０、及び１８０分後に集め、遠心分離して、ＰＫ分析のために血漿を生成した。投与の２４、９６、又は１６８時間後にＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。終末期の血液サンプルを、心臓の穿刺を介して集め、処理することで、ＰＫ分析のために血漿を生成した。血漿ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
図７９に例示されるように、異なる切断可能なリンカー配置を持つＡＳＣは全て同等の血漿ＰＫ特性を達成し、ｓｉＲＮＡのおよそ１０％が投与の１６８時間後に残っていた。
この例において、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖にＰＥＧ及び抗体を抱合させるために様々な異なるリンカー戦略（成分Ｘ及びＹ）が使用された、様々なＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物活性を実証した。
実施例３７：２０１６−ＰＫ−２０１−ＬＮＣａｐ
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ， ３１（１２）：３４４５−６０）２１量体の二本鎖を、使用した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１６）であった。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して免疫原性を減らし、これは活性なｓｉＲＮＡで使用されるものに匹敵した。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
１００−３５０ｍｍ３の体積の皮下の側腹部ＬＮＣａＰ腫瘍を持つメスのＳＣＩＤ ＳＨＯマウスの群１−７（ｎ＝５）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群８（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。表４９は研究設計を記載している。投与後９６時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。５０ｍｇ片の腫瘍及び肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
図８０Ａに例示されるように、に様々な異なるリンカーがｓｉＲＮＡとＰＥＧの間で使用され、ｓｉＲＮＡの１回のｉ．ｖ投与後、陰性対照ｓｉＲＮＡ配列又はＰＢＳ対照に比べて、測定可能な腫瘍組織ＥＧＦＲダウンレギュレーションが達成された。加えて、図８０Ｂに例示されるように、異なるリンカー配置は、測定される他の組織試料（肝臓、脾臓、肺、及び腎臓）よりも高レベルでの腫瘍ｓｉＲＮＡ蓄積を結果としてもたらした。
この例において、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖にＰＥＧ及びを抱合させるために様々な異なるリンカー戦略（成分Ｙ）が使用された、様々なＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物活性を実証した。
実施例３８：２０１６−ＰＫ−１９８−ＨＣＣ８２７
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ， ３１（１２）：３４４５−６０）２１量体の二本鎖を、使用した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１６）であった。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して免疫原性を減らし、これは活性なｓｉＲＮＡで使用されるものに匹敵した。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
１００−３５０ｍｍ３の体積の側腹部ＨＣＣ８２７腫瘍を皮下（ＳＣ）に持つメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスの群１−１５（ｎ＝５）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群１６（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。表５０は研究設計を記載している。投与後９６時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。５０ｍｇ片の腫瘍及び肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
図８１Ａに例示されるように、線形のＰＥＧ長の異なる配置を持つＡＳＣは全て、陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）及びＰＢＳ対照に比べて、ＨＣＣ８２７腫瘍細胞において用量依存性のＥＧＦＲ ｍＲＮＡノックダウンを達成した。図８１Ｂに例示されるように、線形のＰＥＧ長の異なる配置を持つＡＳＣは全て、同等の用量依存性のｓｉＲＮＡ腫瘍組織蓄積を達成した。加えて、肝臓、肺、腎臓、及び脾臓の蓄積は、腫瘍に比べて少なかった。
この例において、様々な異なるＰＥＧ（成分Ｃ）長が使用された様々なＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物活性を実証した。
実施例３９：２０１６−ＰＫ−１９４−ＷＴ
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
野生型のメスのＣＤ−１マウスの群（ｎ＝４）を、ｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置した。処置群は０．５ｍｇ／ｋｇを受け（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）、全ての群は５．０ｍＬ／ｋｇの用量を投与された。表５１は研究設計をより詳細に例示している。非終末期の血液サンプルを、眼窩後方の網状組織の穿刺を介して投与の５、３０、及び１８０分後に集め、遠心分離して、ＰＫ分析のために血漿を生成した。投与の２４、９６、又は１６８時間後にＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。終末期の血液サンプルを、心臓の穿刺を介して集め、処理することで、ＰＫ分析のために血漿を生成した。血漿ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
スライド５４に例示されるように、異なる線形のＰＥＧ長を持つＡＳＣは全て同等の血漿ＰＫ特性を達成し、ｓｉＲＮＡのおよそ１０％が投与の１６８時間後に残っていた。
この例において、様々な異なるＰＥＧ（成分Ｃ）長が使用された様々なＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で同等の血漿ＰＫ特性を実証した。
実施例４０：２０１６−ＰＫ−１９５−ＷＴ
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
野生型のメスのＣＤ−１マウスの群（ｎ＝４）を、ｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置した。処置群は０．５ｍｇ／ｋｇを受け（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）、全ての群は５．０ｍＬ／ｋｇの用量を投与された。表５２は研究設計をより詳細に例示している。非終末期の血液サンプルを、眼窩後方の網状組織の穿刺を介して投与の５、３０、及び１８０分後に集め、遠心分離して、ＰＫ分析のために血漿を生成した。投与の２４、９６、又は１６８時間後にＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。終末期の血液サンプルを、心臓の穿刺を介して集め、処理することで、ＰＫ分析のために血漿を生成した。血漿ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
図８３に例示されるように、異なるＰＥＧ配置（長さ及び分岐）を持つＡＳＣは全て同等の血漿ＰＫ特性を達成し、ｓｉＲＮＡのおよそ１０％が投与の１６８時間後に残っていた。
この例において、様々な異なるＰＥＧ（成分Ｃ）の長さ及び分岐が使用された様々なＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で同等の血漿ＰＫ特性を実証した。
実施例４１：２０１６−ＰＫ−２３６−ＨＣＣ８２７
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＥＦＧＲ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＥＧＦＲに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＥＧＦＲのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置３３３で始まる遺伝子配列に相補的であった（ＡＣＵＣＧＵＧＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＣＵＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホロチオエートで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ， ３１（１２）：３４４５−６０）２１量体の二本鎖を、使用した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１６）であった。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して免疫原性を減らし、これは活性なｓｉＲＮＡで使用されるものに匹敵した。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
全ての抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビボの研究設計
１００−３５０ｍｍ３の体積の側腹部ＨＣＣ８２７腫瘍を皮下（ＳＣ）に持つメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスの群１−１２（ｎ＝５）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群１３（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。表５３は研究設計を記載している。投与後９６時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。５０ｍｇ片の腫瘍及び肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、実施例２に記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対して更に標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、実施例２に記載されるようなステム−ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム−ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿又は組織濃度に転換させた。
図８４に例示されるように、ＰＥＧの異なる配置（長さ及び分岐）を持つＡＳＣは全て、１ｍｇ／ｋｇの用量で線形のＰＥＧ５Ｋを持つ構築物に対して、ＨＣＣ８２７腫瘍細胞において同等のＥＧＦＲ ｍＲＮＡノックダウンを達成した。用量応答フォーマットで試験されたそれら構築物は、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡの用量依存性ノックダウンを示した。図８５に例示されるように、線形のＰＥＧ長及びＰＥＧ分岐において様々な変動を伴うＡＳＣは全て、１ｍｇ／ｋｇの用量で線形のＰＥＧ５Ｋを持つ構築物に対して同等のｓｉＲＮＡ腫瘍組織蓄積を達成した。腫瘍に比べて少ない肝臓蓄積に加えて、用量応答フォーマットで試験されたそれら構築物は、ｓｉＲＮＡの用量依存性の腫瘍組織蓄積を示した。
この例において、様々な異なるＰＥＧ（成分Ｃ）の長さ及び分岐が使用された様々なＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物活性を実証した。
実施例４２：ＰＥＧポリマーを含むＡＳＣでのインビトロのノックダウン
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＨＰＲＴ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＨＰＲＴに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列はＡＵＡＡＡＡＵＣＵＡＣＡＧＵＣＡＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８２）であり、ＨＰＲＴのヒトｍＲＮＡ転写のために塩基位置４２５で始まる遺伝子配列に相補的となるように設計された。塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。Ｃ６−ＮＨ２及びＣ６−ＳＨはリン酸ジエステルを介して接続され、化学構造については実施例９を参照されたい。
陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ， ３１（１２）：３４４５−６０）２１量体の二本鎖を、使用した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’〜３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１６）であった。活性なＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ二本鎖のために使用されたのと同じ塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を、陰性対照ｓｉＲＮＡにおいて使用した。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
群１−３の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−１を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。群４−６の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。
インビトロの研究設計
マウスの脾臓を採取し、氷の上で１００ｕ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシンを含むＰＢＳの中で維持した。脾臓を清潔なスライドガラスで押しつぶし、小片に切断し、１８Ｇ針でホモジナイズして、濾過した（７０ｕｍのナイロン膜）。死細胞を、製造業者の指示に従いＭｉｌｔｅｎｙ ｂｉｏｔｅｃの死細胞除去キット（Ｃａｔａｌｏｇ＃１３０−０９０１０１）で除去した。マウスＢ細胞を単離するために、Ｍｉｌｔｅｎｙ ｂｉｏｔｅｃのＢ細胞単離キット（Ｃａｔａｌｏｇ＃ １３０−０９０−８６２）を、製造業者の指示に従い使用した。簡単に、生きた脾臓細胞を、マウスの脾臓あたり２００μｌのＭＡＣＳ緩衝液で再懸濁した。非Ｂ細胞を、抗ビオチン磁気マイクロビーズと結合される、ビオチンを抱合したモノクローナル抗体ＣＤ４３（Ｌｙ４８）、ＣＤ４、及びＴｅｒ−１１９で枯渇させた。１つのマウスの脾臓から、３０００万の生きたＢ細胞を得ることができる。単離されたマウスＢ細胞（１００ｕ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシンを含む１０％のＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０において２ｘ１０６／ｍｌ）を活性化するために、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ、５μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭ、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０、０．０５μｇ／ｍｌのＩＬ−４、及び０．０５μｇ／ｍｌのＩＮＦγのカクテルを加えた。活性化の４時間後、ＡＳＣ（１ｐＭ〜１０ｎＭ）を、２４（０．５ｍｌの培地）又は１２（１ｍｌの培地）ウェルのプレートにおいて１つのウェルにつき１０６の細胞に加えた。ＡＳＣ処置の４８時間後、細胞を採取し、単離されたＲＮＡをｍＲＮＡのノックダウンのために分析した。研究設計については表５４を参照。
活性化された初代マウスＢ細胞のこのインビトロの試験において、様々な代替的なＰＥＧポリマーでヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をダウンレギュレートするように設計されたｓｉＲＮＡを送達するための抗Ｂ細胞抗体及びＦａｂ ＡＳＣの能力を、測定した。図８６に例示されるように、代替的なＰＥＧを持つ様々なＡＳＣは、スクランブル対照に比べてＨＰＲＴをダウンレギュレートすることができた。
この例において、ＰＥＧ（成分Ｃ）に代わる様々なポリマーが使用された様々なＡ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ抱合体で生物学的活性を実証した。
実施例４３：ＰＫ−２３６−ＷＴ
ｓｉＲＮＡの設計及び合成
ＫＲＡＳ：相補性の１９の塩基及び３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二本鎖を、ヒトＫＲＡＳに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＫＲＡＳのヒトｍＲＮＡの転写のための塩基位置２３７で始まる遺伝子配列に相補的であった（ガイド鎖配列：ＵＧＡＡＵＵＡＧＣＵＧＵＡＵＣＧＵＣＡＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８８）。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、及びリン酸塩の修飾を使用して、二本鎖の潜在能を最適化し且つ免疫原性を減らした。ｓｉＲＮＡ一本鎖を全て、標準のホスホロアミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。パッセンジャー鎖上の位置１１の塩基は、実施例９に記載されるように、Ｃｙ５蛍光標識を付けられている。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６−ＮＨ２及び３’末端にＣ６−ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルを、ホスホジエステルで逆位脱塩基のホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続した。化学構造は実施例９を参照されたい。
ＡＳＣの合成及び特徴付け
群１−３の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。群４−６の抱合体を、ＡＳＣ構造−４を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製したが、パッセンジャー鎖の３’末端上にＰＥＧはなかった。抱合の前に、Ｎ‐エチルマレイミドを使用して、３’チオールをエンドキャップした。群７−９の抱合体を、実施例９に記載されるようにＡＳＣ構造−１を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製した。群１０−１２の抱合体を、ＡＳＣ構造−１を使用してＤＡＲ１（ｎ＝１）として作成且つ精製したが、パッセンジャー鎖の５’末端上にＰＥＧはなかった。
インビボの研究設計
野生型のメスのＣＤ−１マウスの群（ｎ＝４）を、ｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置した。処置群は０．５ｍｇ／ｋｇを受け（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）、全ての群は５．０ｍＬ／ｋｇの用量を投与された。表５５は研究設計をより詳細に例示している。非終末期の血液サンプルを、眼窩後方の網状組織の穿刺を介して投与の０．２５、１、及び４時間後に集め、遠心分離して、ＰＫ分析のために血漿を生成した。投与の２４、４８、又は７２時間後にＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。終末期の血液サンプルを、心臓の穿刺を介して集め、処理することで、ＰＫ分析のために血漿を生成した。
血漿サンプル（Ｋ２ ＥＤＴＡ）を、採取後４時間以内に処理した。適合したマウス血漿（ｍａｔｃｈｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｐｌａｓｍａ）（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）（２−４００倍）で血漿サンプルを希釈し、これら血漿サンプル中のＣＹ５−ｓｉＲＮＡの濃度を、ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏ（励起６３５ｎｍ；発光６７５ｎｍ）を使用して分光定量化した。ＣＹ５蛍光をクエンチし得る巨大分子の相互作用を放つために、サンプルを全て、定量化前に０．０１％のＴｗｅｅｎ２０及び１００ｕｇ／ｍｌのヘパリンを含む水に２倍希釈した。これら血漿サンプル中の無傷のＡＳＣの量を判定するために、血漿サンプルを、２−５０ｎＭのＣＹ５−ｓｉＲＮＡにまでマウス血漿を用いて希釈し、１５０ｎＭの精製されたＥＧＦＲ−Ｆｃタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）で負荷されたプロテインＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）でインキュベートした。これら結合反応を、室温で１時間インキュベートした。ＥＧＦＲに結合したＡＳＣが０．１Ｍのクエン酸（ｐＨ２．７）中でのインキュベーションによって溶出される前に、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０及び０．０５％のＢＳＡを含むＰＢＳでビーズを２回洗浄した。インプット、結合されていない分画、洗浄、及びビーズ溶出液に含まれる、ＣＹ５−ｓｉＲＮＡの量を、上述のように蛍光によって定量化した。
このインビボのＰＫ研究において、２つのＡＸＢ抱合体に対して、２つのＡＸＢＹＣ抱合体（ＥＧＦＲ−Ａｂへのシステイン及びリジンの抱合）のインビボの血漿安定性を、比較した。図８７に例示されるように、ｓｉＲＮＡの濃度を、２つの方法を使用して判定した。血漿の蛍光を直接測定し、標準曲線を使用してｓｉＲＮＡ濃度を判定した。或いは、ＥＧＦＲで装飾された磁気ビーズを使用して、抗体抱合体を結合し、その後、サンプルの蛍光を測定し、標準曲線を使用してｓｉＲＮＡ濃度を判定した。データは全て注入量の割合としてプロットされた。ＡＸＢＹＣ抱合体（ＥＧＦＲ−Ａｂへのシステイン及びリジンの抱合）の両方の例において、対応するＡＸＢ抱合体に比べて改善された血漿ＰＫを観察した。
この例において、適合した対照ＡＸＢ抱合体と比較された、Ｃｙｓ及びＬｙｓ ＡＸＢＹＣ抱合体のためのインビボの血漿ＰＫを実証した。
実施例４４：コレステロール−ＫＲＡＳの抱合体（ＰＤ−０５８）のインビボの薬物動態研究
摂取の１週間後にＨｅｐ ３Ｂ腫瘍を肝臓内に持つメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスの群（ｎ＝５）を、コレステロール−ｓｉＲＮＡの抱合体の３回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射（４８時間毎に分割）で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝５）は、同じ投薬スケジュールでビヒクル対照としてＰＢＳの３回のｉ．ｖ．注射を受けた。ｃｈｏｌ−ＫＲＡＳを受けた処置群に、１０、４、又は２ｍｇ／ｋｇで投与した。全ての群（処置及び対照）に、６．２５ｍＬ／ｋｇの用量を投与した。表５６は研究設計をより詳細に記載しており、抱合体の合成及び特徴付けに対する相互参照を提供する。最後の投与後７２時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。５０ｍｇ片の腫瘍を持つ肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。ｍＲＮＡノックダウンの分析及びｓｉＲＮＡの定量化を、実施例２−７に記載されるように実行した。
ｃｈｏｌ−ＫＲＡＳの抱合体を、用量応答で３回の投与の研究におけるｍＲＮＡノックダウンについて評価した。図３５に例示されるように、マウス肝臓組織内には、マウスＫＲＡＳ ｍＲＮＡノックダウンの明らかな用量応答があった。最も少ない２ｍｇ／ｋｇの用量の結果、マウスＫＲＡＳの４５％のノックダウンがもたらされ、その一方で最大の１０ｍｇ／ｋｇの用量の結果、この３回の投与のフォーマットにおいてマウスＫＲＡＳの６５％のノックダウンがもたらされた。しかし、ヒトＫＲＡＳからシグナルを検出するための最終の時間には、マウス肝臓に十分なヒト腫瘍細胞は存在しなかった（潜在的には、モデル発達の問題が原因で、急増殖する腫瘍を産生するのに十分なヒト細胞が摂取されていないと思われる）。そのため、腫瘍中のノックダウンを測定することは不可能であった。
実施例４５：コレステロール−ｓｉＲＮＡの抱合体（ＰＫ−０６３）のインビボの薬物動態研究
野生型のメスのＣＤ−１マウスの群（ｎ＝３）を、ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡの抱合体の１回又は２回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置した。処置群は１０ｍｇ／ｋｇでｃｈｏｌ−ＫＲＡＳを受け（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）、２回の投与の群は第１の投与の４８時間後に第２の投与を受けた。全ての群に、６．２５ｍＬ／ｋｇの用量を投与した。表５７は研究設計をより詳細に例示しており、抱合体の合成及び特徴付けに対する相互参照を提供する。非終末期の血液サンプルを、眼窩後方の網状組織の穿刺を介して最終投与の２、１５、６０、又は１２０分後に集め、遠心分離して、ＰＫ分析のために血漿を生成した。最終投与の４、２４、９６、又は１４４時間後にＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。終末期の血液サンプルを、心臓の穿刺を介して集め、処理することで、ＰＫ分析のために血漿を生成した。５０ｍｇ片の腫瘍、腎臓、及び肺を集め、液体窒素中で急速凍結した。ｍＲＮＡノックダウンの分析及びｓｉＲＮＡの定量化を、実施例２−７に記載されるように実行した。
ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡの薬物動態的な挙動を、２回の投与のフォーマットと比較して、単回投与のフォーマットで評価した。図３６に例示されるように、第１の投与、その４８時間後の第２の投与に関する血漿ＰＫ特性は、ほぼ同一である。血漿からのクリアランスのための機構は第１の投与から飽和しておらず、第２の投与も同様に作用する。３つの主要組織（肝臓、腎臓、及び肺）の組織ＰＫも同様に評価した。図３７に例示されるように、ｃｈｏｌ−ＫＲＡＳを最大濃度で肝臓に送達し、腎臓と肺には、肝臓に比べておよそ１０倍少ないｓｉＲＮＡ濃度があった。３つの組織全てに関して、第２の投与後のｓｉＲＮＡ濃度は、第１の投与後のｓｉＲＮＡ濃度よりも高く、このことは、ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡの投与が４８時間毎に配される時に組織中にｓｉＲＮＡの蓄積が存在することを実証した。
コレステロール−ｓｉＲＮＡの抱合体（ＰＫ−０６７）のインビボの研究。
１００−３５０ｍｍ３の体積の側腹部ＨＣＣ８２７腫瘍を皮下に持つメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスの群（ｎ＝３）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝４）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。コレステロール−ｓｉＲＮＡ抱合体を受けた処置群に、５ｍｇ／ｋｇで投与した（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）。幾つかの処置群は、特定されたペプチド：ｓｉＲＮＡのモル比でコレステロール−ペプチドの抱合体を受け、そこではｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ及びｃｈｏｌ−ペプチドの抱合体は全て溶液中に共に混合し、同時に注入された。全ての群（処置及び対照）に、５ｍＬ／ｋｇの用量を投与した。表５８は研究設計をより詳細に示しており、抱合体の合成及び特徴付けに対する相互参照を提供する。投与の２４、７２、又は１４４時間後にＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。５０ｍｇ片の腫瘍、肝臓、腎臓、及び肺を集め、液体窒素中で急速凍結した。ｍＲＮＡノックダウンの分析及びｓｉＲＮＡの定量化を、実施例２−７に記載されるように実行した。
ＩＮＦ７及びメリチンなどのエンドソーム溶解性の（Ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）部分（ＥＥＰ）をコレステロールに抱合させ、ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡと混合し、次にマウスに同時注入して、改善されたエンドソームエスケープによるｓｉＲＮＡ潜在能の増大を実証した。最初に、様々な組織中のｓｉＲＮＡ濃度に対するＥＥＰを加えることの効果を評価した。図３８Ａに例示されるように、ＥＥＰ：ｓｉＲＮＡのモル比のうち何れかでのｃｈｏｌ−ＩＮＦ７の追加は、ｓｉＲＮＡ腫瘍ＰＫに影響を及ぼさなかった。しかし、図３８Ｂに例示されるように、１：１比率でのｃｈｏｌ−メリチンの追加は腫瘍ＰＫに影響を及ぼさなかったが、３：１のＥＥＰ：ｓｉＲＮＡの比率でのコレステロール−メリチンの追加は、腫瘍中のｓｉＲＮＡの量を減少させた。図３９に例示されるように、ｃｈｏｌ−ＩＮＦ７もｃｈｏｌ−メリチンも、肝臓ＰＫに対する影響はあまりなかった。同様に、図４０と４１に例示されるように、ｃｈｏｌ−ＩＮＦ７及びコレステロール−メリチンには、腎臓及び肺におけるＰＫ特性に対する影響もあまり無かった。最後に、ｍＲＮＡ ＫＤに対するｃｈｏｌ−ＥＥＰの抱合体の効果を評価し、図４２に示されるように、ｃｈｏｌ−ＫＲＡＳのみのノックダウンのベースライン値はおよそ５０％であった。１：１のｃｈｏｌ−メリチン又は３：１のｃｈｏｌ−ＩＮＦ７の追加は、改善されたエンドソームエスケープにより、各時点でノックダウンを改善する。
コレステロール−ｓｉＲＮＡの抱合体（ＰＫ−０７６）のインビボの研究。
１００−３５０ｍｍ５の体積の側腹部ＨＣＣ８２７腫瘍を皮下に持つメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスの群（ｎ＝３）を、４８時間毎に分割されるｓｉＲＮＡ抱合体の３回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝５）は、同じ投薬スケジュールでビヒクル対照としてＰＢＳの３回のｉ．ｖ．注射を受けた。コレステロール−ｓｉＲＮＡ抱合体を受けた処置群に、５ｍｇ／ｋｇで投与した（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）。幾つかの処置群は、特定されたペプチド：ｓｉＲＮＡのモル比でコレステロール−ペプチドの抱合体を受け、そこではｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ及びｃｈｏｌ−ペプチドの抱合体は全て溶液中に共に混合し、同時に注入された。全ての群（処置及び対照）に、５ｍＬ／ｋｇの用量を投与した。表５９は研究設計をより詳細に記載しており、抱合体の合成及び特徴付けに対する相互参照を提供する。投与後２４又は９６時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。５０ｍｇ片の腫瘍、肝臓、腎臓、及び肺を集め、液体窒素中で急速凍結した。ｍＲＮＡノックダウンの分析及びｓｉＲＮＡの定量化を、実施例２−７に記載されるように実行した。
ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ及びｃｈｏｌ−ＥＥＰでの単回の用量の研究において見られる活性を、３回の用量の研究でフォローアップした。ＥＥＰ：ｓｉＲＮＡの３：１の比率をＩＮＦ７のために選択し、１：１の比率をメリチンのために選択した。図４３と図４４に例示されるように、ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡへのｃｈｏｌ−ＥＥＰの追加は、３回の投与後の組織ＰＫに大いに影響を及ぼさないと考えられる。ノックダウンに関して、図４５は、ｃｈｏｌ−メリチンの追加が、投与の２４時間後に腫瘍ノックダウンを明らかに改善することを示している。また、ｃｈｏｌ−メリチンは投与の９６時間後に腫瘍ノックダウンを改善することも示されている。
コレステロール−ｓｉＲＮＡの抱合体（ＰＫ−０７９）のインビボの研究。
１００−３５０ｍｍ５の体積の側腹部ＨＣＣ８２７腫瘍を皮下に持つメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスの群（ｎ＝５）をｓｉＲＮＡ抱合体の１回の静脈内（ｉ．ｖ．）尾静脈注射で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝５）はビヒクル対照としてＰＢＳの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。ＥＧＦＲ抗体−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧの抱合体を受けた処置群に、０．５ｍｇ／ｋｇで投与し（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）、ＥＧＦＲ抗体−メリチンも受けた群は、ＥＧＦＲ抗体−ｓｉＲＮＡとＥＧＦＲ抗体−メリチンとの間で一致したＥＧＦＲ−Ａｂの用量を受けた。全ての群（処置及び対照）に、５ｍＬ／ｋｇの用量を投与した。表６０は研究設計をより詳細に記載しており、抱合体の合成及び特徴付けに対する相互参照を提供する。投与後９６時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。５０ｍｇ片の腫瘍、腎臓、及び肺を集め、液体窒素中で急速凍結した。ｍＲＮＡノックダウンの分析及びｓｉＲＮＡの定量化を、実施例２−７に記載されるように実行した。
腫瘍にｓｉＲＮＡを送達し且つ腫瘍中にｍＲＮＡノックダウンをもたらすためのＥＧＦＲ抗体−ｓｉＲＮＡの抱合体のＰＫ／ＰＤ環形を、再現性について評価した。図４６に例示されるように、再び、０．５ｍｇ／ｋｇのＥＧＦＲ抗体−ｓｉＲＮＡの抱合体の単回のｉ．ｖ．投与により、抱合体の両方の配置を持つ腫瘍へおよそ１００ｎＭの濃度のｓｉＲＮＡを送達することが可能であった。ＥＧＦＲ抗体−メリチンの追加は、組織ＰＫに影響を与えるとは考えられなかった。分析された４つの組織のうち、腫瘍の濃度が最も高く、肝臓は二番目に高く、腎臓と肺は低いｓｉＲＮＡの取り込みを示していた。図４７に例示されるように、腫瘍への強固なｓｉＲＮＡの送達は再び、腫瘍におけるＥＧＦＲ又はＫＲＡＳのおよそ５０％のノックダウンへと翻訳された。遊離ＥＧＦＲ−Ａｂは、対照群として使用され、ＰＢＳ対照がそうであったようにｍＲＮＡのノックダウンを示さなかった。
コレステロール−ｓｉＲＮＡの抱合体（ＰＤ−０７７）のインビボの研究。
摂取の１週間後にＨｅｐ３Ｂ腫瘍を肝臓内に持つメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスの群（ｎ＝１１）を、コレステロール−ｓｉＲＮＡの抱合体の９回の静脈内（ｉ．ｖ．）又は皮下（ｓ．ｃ．）の注射（ＴＩＷ）で処置し、同じマウスの対照群（ｎ＝１１）は、ビヒクル対照としてＰＢＳの９回のｉ．ｖ．尾部静脈注射を受けた（ＴＩＷでも投与）。ｃｈｏｌ−ＣＴＮＮＢ１を受けた処置群に、５ｍｇ／ｋｇで投与した。全ての群（処置及び対照）に、６．２５ｍＬ／ｋｇの用量を投与した。表６１は研究設計をより詳細に記載しており、抱合体の合成及び特徴付けに対する相互参照を提供する。非終末期の血液サンプルを、眼窩後方の網状組織の穿刺を介して週に１回集められ、処理することで、アルファ−胎児タンパク（ＡＦＰ）測定のための血清を生成した。最後の投与後２４時間で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。５０ｍｇ片の腫瘍を持つ肝臓を集め、液体窒素中で急速凍結した。ｍＲＮＡノックダウン分析を上述のように実行した。メーカーの指示に従い、ヒトアルファ−胎児タンパクＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＡＦＰを定量化した。
早期の研究によりｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡの単回投与が正常な肝臓にノックダウンを生成することが可能であることが実証されたため、ノックダウンは同様に同所性の肝臓腫瘍でも達成され得ると仮定した。マウスに、肝臓内Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍を接種し、これを摂取後１週間にわたり増殖させ、その後、これらマウスに、３週間にわたり週に３回（合計９回の投与）、５ｍｇ／ｋｇの用量のｃｈｏｌ−ＣＴＮＮＢ１（ｉ．ｖ．又はｓ．ｃ．）を投与した。図４８に例示されるように、ｓ．ｃ．で投与されたｃｈｏｌ−ＣＴＮＮＢ１は、最終投与の２４時間後の最終の時点で＞５０％のｍＲＮＡノックダウンをもたらすことができた。対照的に、ｉ．ｖ．で投与されたｃｈｏｌ−ＣＴＮＮＢ１ ｓｉＲＮＡは、この時点でどのｍＲＮＡノックダウンも示さないと思われる（幾つかマウスには何の測定可能なヒトＣＴＮＮＢ１シグナルもなかったが、シグナルの損失がノックダウン或いは少ない腫瘍量（ｔｕｍｏｒ ｂｕｒｄｅｎ）に関連したかどうかを判定することは困難であった。ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞は、ヒトアルファ−胎児タンパク（ＡＦＰ）を分泌するとも知られており、分泌されたＡＦＰの量はＨｅｐ３Ｂ細胞の数と関連づけられると知られている。故に、血清中のＡＦＰの濃度はマウスにおける腫瘍負荷のマーカーとして得られ、経時的なＡＦＰの増加は腫瘍増殖と関連付けられる。図４９に例示されるように、ｓ．ｃ．で投与されたｃｈｏｌ−ＣＴＮＮＢ１は、それらマウスのＡＦＰレベルを著しく下げ、このことは、ＣＴＮＮＢ１ ｍＲＮＡのノックダウンが腫瘍増殖の阻害につながったという証明をもたらす。
実施例４６．肝臓のＰＫ／ＰＤ研究
メスの野生型ＣＤ−１マウスに、５ｍｇ／ｋｇでｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ−ＥＥＰの抱合体を投与する（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）。これらの研究において、ｓｉＲＮＡをマウス第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）に対して使用し、それにより、血漿中のＦＶＩＩタンパク質レベルを測定することによってＦＶＩＩノックダウンが判定され得る。多数のＥＥＰ（エンドソーム溶解性の部分）を使用して、最適なエンドソームエスケープを実証するペプチド配列を判定し、その結果、対照に比べて最良のＦＶＩＩ標的遺伝子のノックダウンがもたらされる。
実施例４７．腫瘍のＰＫ／ＰＤ研究
側腹部Ｈ３５８腫瘍を皮下に持つメスのＮＣｒ ｎｕ／ｎｕマウスに、０．５ｍｇ／ｋｇでＥＧＦＲ抗体−ｓｉＲＮＡ−ＥＥＰの抱合体を投与する（ｓｉＲＮＡに基づく）。多数のＥＥＰ（エンドソーム溶解性の部分）を使用して、最適なエンドソームエスケープを実証するペプチド配列を判定し、その結果、対照に比べて最良の標的遺伝子のノックダウンがもたらされる。
実施例４８．ナノ粒子でのＡＢＣ抱合体の製剤
典型的なＡＢＣ抱合体を、シクロデキストリンポリマー（１０ｋＤａ）、及び過剰な抱合されていないｓｉＲＮＡ（ＥＤ４０−６０ｎｍ、ＰＤＩ０．１−０．２）を使用して、自己組織化したナノ粒子へと包装する。これら粒子において、典型的なＡＢＣ抱合体は、抗体標的と相互に作用する自身の能力を維持する。インビボでの循環における粒子の安定性及び標的結合能力を、包装ｓｉＲＮＡの修飾を介して調節する。
ナノ粒子の形成
ナノ粒子を、１．６ｍｇ／ｍＬの最終のｓｉＲＮＡ濃度で調製する。１：２０の比率でＣＹ５−ｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡを、水中で２ｘの最終濃度へと最初に希釈する。シクロデキストリンポリマー（ＣＤＰ）を、中性のｐＨで１０ｍＭのリン酸緩衝液において３：１の窒素対リンの比率（Ｎ：Ｐ）を達成するのに必要な２ｘの最終濃度に希釈する。ＣＤＰをｓｉＲＮＡに素早く加え、ピペッティングによって更に混合する。投与又は分析の前に、粒子を少なくとも１５分間インキュベートする。
インビトロのＥＧＦＲ結合
様々な量の典型的なＡＢＣ抱合体を含むナノ粒子を、１０ｎＭの最終濃度にまでウシ胎仔血清に希釈し、１５０ｎＭの精製されたＥＧＦＲ−Ｆｃタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を充填したプロテインＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いてＲＴで１時間インキュベートする。ビーズに結合されたナノ粒子が０．０１％のＴｗｅｅｎ２０及び１００ｕｇ／ｍｌのヘパリンを含む水で分裂される前に、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０及び０．０５％のＢＳＡを含むＰＢＳでビーズを２回洗浄する。インプット、結合されていない分画、洗浄、及びビーズ溶出液に含まれる、ＣＹ５−ｓｉＲＮＡの量を、ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏ（励起６３５ｎｍ；発光６７５ｎｍ）を使用した蛍光によって定量化する。
ＣＹ５−ＡＳＣ血漿の定量化
実施例４３に例示されるように、マウス血漿中のナノ粒子の定量化を実行する。ＥＧＦＲビーズに結合されるＣＹ５−ｓｉＲＮＡは、ＣＤＰとｓｉＲＮＡとの間で静電的相互作用を競合させるためにヘパリンを使用することによって放たれる。
本開示の好ましい実施形態が、本明細書に示され且つ記載されている一方で、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは当業者に明白であろう。多数の変形、変化、及び置換は、本開示から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される開示の実施形態の様々な代案が、本開示の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本開示の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲及びそれらの同等物の範囲内の方法及び構成は、それによって包含されることが、意図される。

Claims (51)

  1. 式（Ｉ）の分子であって、
    式中、
    Ａは抗体あるいはその結合フラグメントであり、
    Ｂはポリヌクレオチドであり、
    Ｃはポリマーであり、
    Ｘは単結合または第１の非ポリマー性リンカーであり、および、
    Ｙは単結合または第２のリンカーであり、
    ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆位脱塩基部分を含み、および、
    ここで、ＡとＣは同じ末端でＢに結合しない、分子。
  2. 少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１に記載の分子。
  3. 少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチドはロックド核酸（ＬＮＡ）あるいはエチレン核酸（ＥＮＡ）を含む、請求項１または２に記載の分子。
  4. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合あるいはホスホロジチオエート結合を含む、請求項１−３のいずれか１つに記載の分子。
  5. 少なくとも１つの逆位脱塩基部分は少なくとも１つの末端にある、請求項１に記載の分子。
  6. ポリヌクレオチドは一本鎖を含む、請求項１−５のいずれか１つに記載の分子。
  7. ポリヌクレオチドは、二重らせん構造のポリ核酸分子を形成するために、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチドとを含む、請求項１−５のいずれか１つに記載の分子。
  8. 第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つの修飾を含む、請求項７に記載の分子。
  9. 第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドはＲＮＡ分子である、請求項１−８のいずれか１つに記載の分子。
  10. 第１のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５、４５２−１９５５、１９５６−１９６２、１９６７−２００２、２０１３−２０３２、あるいは２０８２−２１０９、または２１１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１−９のいずれか１つに記載の分子。
  11. 第２のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−７５、４５２−１９５５、１９５６−１９６２、１９６７−２００２、２０１３−２０３２、あるいは２１１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１−１０のいずれか１つに記載の分子。
  12. Ｙは非ポリマー性リンカー基である、請求項１−１１のいずれか１つに記載の分子。
  13. Ｘは単結合である、請求項１−１２のいずれか１つに記載の分子。
  14. ＸはＣ１−Ｃ６アルキル基である、請求項１−１２のいずれか１つに記載の分子。
  15. ＹはＣ１−Ｃ６アルキル基である、請求項１−１４のいずれか１つに記載の分子。
  16. Ｘは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基に随意に抱合した、ホモ二官能性リンカーあるいはヘテロ二官能性リンカーである、請求項１−１４のいずれか１つに記載の分子。
  17. Ｙはホモ二官能性リンカーまたはヘテロ二官能性リンカーである、請求項１−１４のいずれか１つに記載の分子。
  18. 抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいはラクダ科抗体またはその結合フラグメントを含む、請求項１−１７のいずれか１つに記載の分子。
  19. Ｃはポリエチレングリコールである、請求項１−１８のいずれか１つに記載の分子。
  20. Ｃは約１０００Ｄａ、２０００Ｄａ、あるいは５０００Ｄａの分子量を有する、請求項１−１９のいずれか１つに記載の分子。
  21. Ａ−ＸはＢの５’末端へ抱合し、Ｙ−ＣはＢの３’末端に抱合する、請求項１−２０のいずれか１つに記載の分子。
  22. Ｙ−ＣはＢの５’末端へ結合し、Ａ−ＸはＢの３’末端へ抱合する、請求項１−２０のいずれか１つに記載の分子。
  23. Ｄをさらに含む、請求項１−２２のいずれか１つに記載の分子。
  24. ＤはＣまたはＡに抱合する、請求項２３に記載の分子。
  25. Ｄは式（ＩＩ）に従って式（Ｉ）の分子に抱合し、
    式中、
    Ａは抗体あるいはその結合フラグメントであり、
    Ｂはポリヌクレオチドであり、
    Ｃはポリマーであり、
    Ｘは単結合または第１の非ポリマー性リンカーであり、
    Ｙは単結合または第２のリンカーであり、
    Ｌは単結合または第３のリンカーであり、
    Ｄはエンドソーム溶解性部分であり、
    および、ｃは０から１までの整数であり、
    ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾されたヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆位脱塩基部分を含み、
    ここで、ＡとＣは同じ末端ではＢに結合せず、
    および、ここで、ＤはＡまたはＣの任意の場所に、あるいはＢの末端に抱合する、請求項２３または２４に記載の分子。
  26. ＤはＩＮＦ７またはメリチンである、請求項２３−２５のいずれか１つに記載の分子。
  27. Ｄはエンドソーム溶解性ポリマーである、請求項２３−２５のいずれか１つに記載の分子。
  28. ＬはＣ１−Ｃ６アルキル基である、請求項２５に記載の分子。
  29. Ｌはホモ二官能性リンカーまたはヘテロ二官能性リンカーである、請求項２５に記載の分子。
  30. 少なくとも第２の結合部分をさらに含む、請求項１−２９のいずれか１つに記載の分子。
  31. 少なくとも第２の結合部分はＡに、Ｂに、あるいはＣに抱合する、請求項３０に記載の分子。
  32. 少なくとも第２の結合部分はコレステロールである、請求項３０または３１に記載の分子。
  33. 少なくとも追加のポリヌクレオチドＢをさらに含む、請求項１−３２のいずれか１つに記載の分子。
  34. 少なくとも追加のポリヌクレオチドＢはＡに、Ｂに、あるいはＣに抱合する、請求項３３に記載の分子。
  35. さらに少なくとも追加のポリマーＣを含む、請求項１−３４のいずれか１つに記載の分子。
  36. 少なくとも追加のポリマーＣはＡに、Ｂに、あるいはＣに抱合する、請求項３５に記載の分子。
  37. 請求項１−３６に記載された分子と
    薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
  38. 医薬組成物はナノ粒子製剤として製剤される、請求項３７に記載の医薬組成物。
  39. 医薬組成物は、非経口、経口、鼻腔内、バッカル、直腸、または経皮的な投与のために製剤される、請求項３７または３８に記載の医薬組成物。
  40. 請求項１−３６に記載の分子を含む組成物を患者に投与する工程を含む、患者の疾患または障害を処置する方法。
  41. 疾患または障害は癌である、請求項４０に記載の方法。
  42. 癌は固形腫瘍である、請求項４１に記載の方法。
  43. 癌は血液悪性腫瘍である、請求項４１に記載の方法。
  44. 癌は、ＫＲＡＳに関連する癌、ＥＧＦＲに関連する癌、ＡＲに関連する癌、（β）−カテニンに関連する癌、ＰＩＫ３Ｃに関連する癌、あるいはＭＹＣに関連する癌を含む、請求項４０−４３のいずれか１つに記載の方法。
  45. 癌は、膀胱癌、乳癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、多形膠芽腫、頭頚部癌、腎癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、あるいは甲状腺癌を含む、請求項４０−４４のいずれか１つに記載の方法。
  46. 癌は急性骨髄性白血病、ＣＬＬ、ＤＬＢＣＬ、あるいは多発性骨髄腫を含む、請求項４０−４４のいずれか１つに記載の方法。
  47. 方法は免疫腫瘍治療である、請求項４０に記載の方法。
  48. 患者の初代細胞中の標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、請求項１−３６に記載の分子を初代細胞に投与する工程を含む、方法。
  49. 前記方法がインビボの方法である、請求項４８に記載の方法。
  50. 患者はヒトである、請求項４０−４９に記載の方法。
  51. 患者の疾患または障害の処置のための、請求項１−３６に記載の分子を含む免疫腫瘍治療。
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