JP2018522565A5

JP2018522565A5 -

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Publication number: JP2018522565A5
Application number: JP2018506219A
Authority: JP
Filing date: 2016-08-05
Publication date: 2020-08-06
Anticipated expiration: 2036-08-05

Description

以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］配列番号１により特定される、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）の、炭素供給源により調節可能なｐＧ１プロモーターの機能的変異体である、単離および／または人工ｐＧ１−ｘプロモーターであって、そのｐＧ１−ｘプロモーターは、少なくとも２９３ｂｐの長さを有する配列番号１の少なくとも一部からなるかまたはこれを含み、以下のプロモーター領域：
ａ）配列番号２および配列番号３のヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つのコア調節領域；ならびに
ｂ）前記コア調節領域以外の、ｐＧ１−ｘプロモーター配列内の任意の領域である非コア調節領域、を特徴とし、
前記ｐＧ１−ｘプロモーターが、前記プロモーター領域のうちの何れかにおける、少なくとも１つの突然変異と、配列番号２および配列番号３における、少なくとも８０％の配列同一性と、配列番号２または配列番号３以外の任意の領域における、少なくとも５０％の配列同一性とを含み；さらに、
前記ｐＧ１−ｘプロモーターが、前記ｐＧ１プロモーターと比較して、同じであるかまたは増大させた、プロモーター強度および誘導比を特徴とし、この場合、
・前記プロモーター強度が、誘導状態において、前記ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも１．１倍増大しており、かつ／または
・前記誘導比が、前記ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも１．１倍増大している、
ｐＧ１−ｘプロモーター。
［２］配列番号２および／または配列番号３が、１つ以上の転写因子結合性部位（ＴＦＢＳ）を含む、［１］に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
［３］前記コア調節領域が、配列番号４のヌクレオチド配列、または１つ以上のＴＦＢＳを含む、その機能的変異体、好ましくは、少なくとも８０％の配列同一性を伴う機能的変異体を含む、［１］または［２］に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
［４］前記コア調節領域を、配列番号５、または前記１つ以上のＴＦＢＳを含む、その機能的変異体、好ましくは、少なくとも８０％の配列同一性を伴う機能的変異体により表される主要調節領域へと組み込んだ、［１］〜［３］の何れか一つに記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
［５］前記１つ以上のＴＦＢＳが、Ｒｇｔ１、Ｃａｔ８−１、およびＣａｔ８−２からなる群から選択される転写因子のうちの何れかに対するＴＦＢＳである、［１］〜［４］の何れか一つに記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
［６］ｐＧ１配列の５’端において、１つ以上のヌクレオチドの欠失を含む前記ｐＧ１プロモーターの機能的変異体であって、好ましくは、前記ｐＧ１配列の３’側領域、または前記３’側領域の機能的変異体のうちの、少なくとも２９３ヌクレオチドを残す、［１］〜［５］の何れか一つに記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
［７］前記コア調節領域が、配列番号２のヌクレオチド配列と配列番号３のヌクレオチド配列との間に、１つ以上のヌクレオチドの欠失を含む、［１］〜［６］の何れか一つに記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
［８］前記コア調節領域または主要調節領域の、少なくとも２つのコピーを含む、［１］〜［７］の何れか一つに記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
［９］配列番号１２〜２９のうちの何れかにより特定される、少なくとも１つまたは少なくとも２つのＴモチーフを含む、［１］〜［８］の何れか一つに記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
［１０］Ｔモチーフが、前記コア調節領域の上流に配置され、任意に、主要調節領域の上流に配置される、［１］〜［９］の何れか一つに記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
［１１］Ｔモチーフが、前記コア調節領域の下流に配置され、任意に、主要調節領域の下流に配置される、［１］〜［９］の何れか一つに記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
［１２］翻訳開始部位の少なくとも一部を含む、３’末端のヌクレオチド配列を含む、［１］〜［１１］の何れか一つに記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
［１３］２０００ｂｐ以下の長さを有する、［１］〜［１２］の何れか一つに記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
［１４］ａ）配列番号３７〜４４、好ましくは、配列番号４５〜７６のうちの何れか；
ｂ）配列番号７７〜８０、好ましくは、配列番号８１〜１１２のうちの何れか；
ｃ）配列番号１１３〜１１４、好ましくは、配列番号１１５〜１３０のうちの何れか；
ｄ）配列番号１３１〜１３２、好ましくは、配列番号１３３〜１４８のうちの何れか；
ｅ）配列番号１４９〜１５０、好ましくは、配列番号１５１〜１６６のうちの何れか；
ｆ）配列番号１６７〜１６８、好ましくは、配列番号１６９〜１８４のうちの何れか；
ｇ）配列番号１８５〜１８６、好ましくは、配列番号１８７〜２０２のうちの何れか；
ｈ）配列番号２０３〜２０４、好ましくは、配列番号２０５〜２２０のうちの何れか；
ｉ）配列番号２２１〜２２２、好ましくは、配列番号２２３〜２３８のうちの何れか；
ｊ）配列番号２３９〜２４０、好ましくは、配列番号２４１〜２５６のうちの何れか；および
ｋ）配列番号３２〜３６もしくは配列番号２５７〜２５９；
のうちの何れかからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはこれらからなる；
または
ｌ）上記ａ）〜ｋ）のうちの何れかの機能的変異体である、単離および／または人工ｐＧ１−ｘプロモーターであって、
配列番号１により特定される、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）の、炭素供給源により調節可能なｐＧ１プロモーターの機能的変異体である機能的変異体である、ｐＧ１−ｘプロモーター。
［１５］前記ヌクレオチド配列のうちの何れかの機能的変異体、好ましくは、配列番号４５〜７６のうちの何れかの機能的変異体であって、以下の特色：
ａ）前記配列が、プロモーター配列の５’端において、１つ以上のヌクレオチドの欠失を含み、好ましくは、前記プロモーター配列の３’側領域、または前記３’側領域の機能的変異体のうちの、少なくとも２９３ヌクレオチドを残す、上記ａ）〜ｋ）の前記ｐＧ１−ｘプロモーターのうちの何れかのプロモーター配列の機能的変異体であること；
ｂ）前記配列が、１つ以上のＴＦＢＳを含み、好ましくは、前記ＴＦＢＳが、Ｒｇｔ１、Ｃａｔ８−１、およびＣａｔ８−２からなる群から選択される転写因子のうちの何れかに対するＴＦＢＳであること；
ｃ）コア調節領域が、配列番号４のヌクレオチド配列、または１つ以上のＴＦＢＳを含む、その機能的変異体、好ましくは、少なくとも８０％の配列同一性を伴う機能的変異体を含むこと；
ｄ）前記コア調節領域を、配列番号５、または前記ＴＦＢＳを含む、その機能的変異体、好ましくは、少なくとも８０％の配列同一性を伴う機能的変異体により表される主要調節領域へと組み込んでいること；
ｅ）前記コア調節領域が、配列番号２のヌクレオチド配列と配列番号３のヌクレオチド配列との間に、１つ以上のヌクレオチドの欠失を含むこと；
ｆ）前記配列が、前記コア調節領域または前記主要調節領域の、少なくとも２つのコピーを含むこと；
ｇ）前記配列が、配列番号１２〜２９のうちの何れかにより特定される、少なくとも１つまたは少なくとも２つのＴモチーフを含み、好ましくは、前記Ｔモチーフが、前記コア調節領域の上流または下流に配置され、任意に、前記主要調節領域の上流または下流に配置されること；
ｈ）前記配列が、翻訳開始部位の少なくとも一部を含む、３’末端のヌクレオチド配列を含むこと；
ｉ）前記配列を、２０００ｂｐ以下の長さへと伸長させていること
のうちの１つ以上を特徴とする機能的変異体である、［１４］に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
［１６］［１］〜［１５］の何れか一つに記載のｐＧ１−ｘプロモーターを含む、単離ｐＧ１−ｘプロモーター核酸、または相補的配列を含む核酸。
［１７］対象のタンパク質（ＰＯＩ：protein of interest）をコードするヌクレオチド配列に、作動可能に連結されており、前記ＰＯＩをコードする前記ヌクレオチド配列と、天然では会合しない、［１６］に記載のｐＧ１−ｘプロモーター核酸。
［１８］前記ＰＯＩの分泌を可能とするシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、好ましくは、前記シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が、前記ＰＯＩをコードする前記ヌクレオチド配列の５’端に隣接して配置される、［１７］に記載の核酸。
［１９］［１６］〜［１８］の何れか一つに記載の核酸を含む発現構築物、好ましくは、自己複製ベクターもしくは自己複製プラスミド、または宿主細胞の染色体ＤＮＡへと組み込まれる、ベクターもしくはプラスミドである発現構築物。
［２０］［１９］に記載の発現構築物を含む組換え宿主細胞、好ましくは、真核細胞、より好ましくは、酵母細胞または糸状真菌細胞、より好ましくは、サッカロミセス（Saccharomyces）属またはピキア（Pichia）属の酵母細胞である、組換え宿主細胞。
［２１］［２０］に記載の組換え宿主細胞系を培養すること（culturing）により、ＰＯＩを作製する方法であって、
ａ）前記ＰＯＩを発現させる条件下で、前記細胞系を培養する（cultivating）工程と、
ｂ）前記ＰＯＩを回収する工程と
を含む方法。
［２２］培養が、
ａ）基本炭素供給源を使用することでｐＧ１−ｘプロモーターを抑制する、第１の工程と、これに続く
ｂ）補充炭素供給源を使用しないか、または限定量の補充炭素供給源を使用することで前記ｐＧ１−ｘプロモーターの抑制を解除して、前記ＰＯＩの産生を誘導する第２の工程と
を含む、［２１］に記載の方法。
［２３］前記第２の工程ｂ）が、増殖制限量の前記補充炭素供給源を供給して、比増殖速度を、０．００１ｈ ^−１〜０．２ｈ ^−１、好ましくは、０．００５ｈ ^−１〜０．１５ｈ ^−１の範囲内に保つ、フィード培地を援用する、［２２］に記載の方法。
［２４］ａ）前記基本炭素供給源を、グルコース、グリセロール、エタノール、これらの混合物、および複合栄養物材料からなる群から選択し；
ｂ）前記補充炭素供給源が、ヘキソース、たとえば、グルコース、果糖、ガラクトースもしくはマンノース、二糖、たとえば、サッカロース、アルコール、たとえば、グリセロールもしくはエタノール、または前出のうちの何れかの混合物である、
［２２］または［２３］に記載の方法。
［２５］前記培養を、バイオリアクター内で、前記第１の工程としての回分期で始め、前記第２の工程としての流加期または連続培養期を後続させて実施する、［２２］〜［２４］の何れか一つに記載の方法。
［２６］前記基本炭素供給源を、前記細胞系が消費するまで、前記回分期を実施する、［２５］に記載の方法。
［２７］前記回分期が、酸素分圧（ｐＯ２）シグナルの持続的減少を特徴とし、前記回分期の終点が、ｐＯ２の増大を特徴とする、［２５］または［２６］に記載の方法。
［２８］回分期中に、前記ｐＯ２を、６５％未満または低飽和へと減少させるのに続き、回分の終点では、６５％を上回る増大または高飽和をもたらす、［２７］に記載の方法。
［２９］前記回分期を、約２０〜３６時間にわたり実施する、［２５］〜［２８］の何れか一つに記載の方法。
［３０］前記回分期を、回分培地１Ｌ中４５ｇのグリセロールを使用して実施し、培養を、２５℃で、約２７〜３０時間にわたり、または３０℃で、約２３〜３６時間にわたり実施する、［２５］〜［２９］の何れか一つに記載の方法。
［３１］前記流加期中の前記培養を、約１５〜８０時間、約１５〜７０時間、約１５〜６０時間、約１５〜５０時間、約１５〜４５時間、約１５〜４０時間、約１５〜３５時間、約１５〜３０時間、約１５〜３５時間、約１５〜２５時間、または約１５〜２０時間；好ましくは、約２０〜４０時間のうちの何れかにわたり実施する、［２５］〜［３０］の何れか一つに記載の方法。
［３２］前記流加期中の前記培養を、約８０時間、約７０時間、約６０時間、約５５時間、約５０時間、約４５時間、約４０時間、約３５時間、約３０時間、約２５時間、約２０時間、または約１５時間のうちの何れかにわたり実施する、［２５］〜［３１］の何れか一つに記載の方法。
［３３］前記第２の工程ｂ）が、増殖制限量の前記補充炭素供給源を供給して、比増殖速度を、０．０４ｈ ^−１〜０．２ｈ ^−１の範囲内に保つフィード培地を流加期において援用する、［２５］〜［３２］の何れか一つに記載の方法。
［３４］約３０ｍｇ（Ｌｈ） ^−１の空時収量を達成する、［２５］〜［３３］の何れか一つに記載の方法。
［３５］前記流加期中の前記培養を、約３０時間にわたり実施する、［３４］の何れか一つに記載の方法。
［３６］組換え宿主細胞が、サッカロミセス（Saccharomyces）属またはピキア（Pichia）属またはコマガタエラ（Komagataella）属のうちの何れかの酵母、好ましくは、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）またはコマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）である、［２５］〜［３５］の何れか一つに記載の方法。
［３７］前記ｐＧ１−ｘプロモーターが、配列番号３７〜４４のうちの何れか、好ましくは、配列番号４５〜７６のうちの何れかである、［２５］〜［３６］の何れか一つに記載の方法。
［３８］前記ｐＧ１−ｘプロモーターが、配列番号３９、好ましくは、配列番号４９により特徴付けられる、［３７］に記載の方法。
［３９］前記ＰＯＩを、前記細胞の天然ｐＧＡＰプロモーターと比較して、少なくとも１５％の転写速度で作製する、［２１］〜［３８］の何れか一つに記載の方法。
［４０］前記ＰＯＩが、好ましくは、抗体もしくはその断片、酵素およびペプチド、タンパク質抗生剤、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質もしくは粒子、プロセシング酵素、増殖因子、ホルモン、ならびにサイトカイン、またはＰＯＩの代謝物を含む治療用タンパク質から選択される異種タンパク質である、［２１］〜［３９］の何れか一つに記載の方法。

Claims

単離および／または人工ｐＧ１−ｘプロモーターであって、ｐＧ１−ｘプロモーターは、以下のプロモーター領域：
ａ）少なくとも２つのコア調節プロモーター領域、ここで、前記各コア調節プロモーター領域は配列番号２および配列番号３のヌクレオチド配列を含み、かつ、前記コア調節プロモーター領域は配列番号１のヌクレオチド配列内の対応する領域と少なくとも８０％の配列同一性を有する；ならびに
ｂ）前記少なくとも２つのコア調節プロモーター領域以外の、ｐＧ１−ｘプロモーター配列内の任意の領域である非コア調節プロモーター領域、ここで、前記非コア調節プロモーター領域は配列番号１のヌクレオチド配列内の対応する領域と少なくとも５０％の配列同一性を有する、
を含み、
前記ｐＧ１−ｘプロモーターは、配列番号１で表されるｐＧ１プロモーターの２９３ｂｐと少なくとも８０％同一であり；かつ、
前記ｐＧ１−ｘプロモーターは、前記ｐＧ１プロモーターと比較して、プロモーター強度の増加、および／または誘導比の増加を特徴とし、この場合、
・前記プロモーター強度の増加が、誘導状態において、前記ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも１．１倍増大しており、かつ
・前記誘導比の増加が、前記ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも１．１倍増大している、
ｐＧ１−ｘプロモーター。
配列番号２および／または配列番号３のヌクレオチド配列が、１つ以上の転写因子結合性部位（ＴＦＢＳ）を含む、請求項１に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
前記コア調節プロモーター領域の少なくとも１つが、（ｉ）配列番号４のヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号２および配列番号３のヌクレオチド配列を含み、配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列番号４のヌクレオチド配列の機能的変異体を含み、前記コア調節プロモーター領域は１つ以上のＴＦＢＳを含む、請求項１に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
前記コア調節プロモーター領域の少なくとも１つが、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号２および配列番号３のヌクレオチド配列を含み、配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列番号５のヌクレオチド配列の機能的変異体を含む主要調節領域に組み込まれ、前記コア調節プロモーター領域は１つ以上のＴＦＢＳを含む、請求項１に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
グルコース輸送転写調節因子（Ｒｇｔ１）、亜鉛クラスター転写活性化因子１（Ｃａｔ８−１）、および亜鉛クラスター転写活性化因子２（Ｃａｔ８−２）からなる群から選択される転写因子に対するＴＦＢＳを含む、請求項１に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
前記コア調節プロモーター領域の少なくとも１つが、配列番号２および配列番号３のヌクレオチド配列を含み、配列番号２のヌクレオチド配列と配列番号３のヌクレオチド配列との間に、１つ以上のヌクレオチドの欠失を含む、請求項１に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
前記主要調節領域の少なくとも２つのコピーを含む、請求項４に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
配列番号１２〜２９のヌクレオチド配列のうちの何れか１つにより特定される、少なくとも１つまたは少なくとも２つのチミン（Ｔ）モチーフを含む、請求項１に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
前記Ｔモチーフが、前記少なくとも１つのまたは両方のコア調節プロモーター領域の上流に配置される、請求項８に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
前記Ｔモチーフが、前記少なくとも１つのまたは両方のコア調節プロモーター領域の下流に配置される、請求項８に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
ａ）配列番号３７〜４４、または配列番号４５〜７６のうちの何れか；
ｂ）配列番号７７〜８０、または配列番号８１〜１１２のうちの何れか；
ｃ）配列番号１１３〜１１４、または配列番号１１５〜１３０のうちの何れか；
ｄ）配列番号１３１〜１３２、または配列番号１３３〜１４８のうちの何れか；または
ｅ）配列番号１８５〜１８６、または配列番号１８７〜２０２のうちの何れか；
ｆ）前出のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有し、少なくとも２つのコア調節プロモーター領域を含むヌクレオチド配列であって、前記各コア調節プロモーター領域は配列番号２および配列番号３のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはこれらからなる、単離および／または人工ｐＧ１−ｘプロモーター。
前記ヌクレオチド配列は、配列番号４５〜７６のヌクレオチド配列の何れかと少なくとも８０％の配列同一性を有し、以下：
ａ）前記配列が、１つ以上のＴＦＢＳを含み、前記１つ以上のＴＦＢＳが、Ｒｇｔ１、Ｃａｔ８−１、およびＣａｔ８−２からなる群から選択される転写因子のうちの何れかに対するＴＦＢＳであること；
ｂ）前記コア調節プロモーター領域の少なくとも１つが、配列番号４のヌクレオチド配列、または１つ以上のＴＦＢＳを含む、配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するその機能的変異体を含むこと；
ｃ）前記コア調節プロモーター領域の少なくとも１つが、配列番号５のヌクレオチド配列、または１つ以上のＴＦＢＳを含む、配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む主要調節領域に組み込まれていること；
ｄ）前記コア調節プロモーター領域の少なくとも１つが、配列番号２および配列番号３のヌクレオチド配列を含み、配列番号２のヌクレオチド配列と配列番号３のヌクレオチド配列との間に、１つ以上のヌクレオチドの欠失を含むこと；
ｅ）前記配列が、配列番号５のヌクレオチド配列、または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するその機能的変異体含む、主要調節領域を少なくとも２つ含むこと；
ｆ）前記配列が、配列番号１２〜２９のヌクレオチド配列のうちの何れか１つにより特定される、少なくとも１つまたは少なくとも２つのＴモチーフを含むこと；
ｇ）前記配列が、翻訳開始部位の少なくとも一部を含む、３’末端のヌクレオチド配列を含むこと；
ｈ）前記配列は、最大で２０００ｂｐの長さを有すること
のうちの１つ以上を含む、請求項１１に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
請求項１に記載のｐＧ１−ｘプロモーターを含む、単離ｐＧ１−ｘプロモーター核酸、またはその相補的配列を含む核酸。
対象のタンパク質（ＰＯＩ：protein of interest）をコードするヌクレオチド配列に、作動可能に連結されており、前記ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列と、天然では会合しない、請求項１３に記載のｐＧ１−ｘプロモーター核酸。
請求項１３に記載の核酸を含む発現構築物。
請求項１５に記載の発現構築物を含む組換え宿主細胞。
請求項１６に記載の組換え宿主細胞系を培養すること（culturing）により、ＰＯＩを作製する方法であって、
ａ）前記ＰＯＩを発現させる条件下で、前記細胞系を培養する（cultivating）工程と、
ｂ）前記ＰＯＩを回収する工程と
を含む方法。
培養が、
ａ）基本炭素供給源を使用することでｐＧ１−ｘプロモーターを抑制する、第１の工程と、これに続く
ｂ）補充炭素供給源を使用しないか、または限定量の補充炭素供給源を使用することで前記ｐＧ１−ｘプロモーターの抑制を解除して、前記ＰＯＩの産生を誘導する第２の工程と
を含む、請求項１７に記載の方法。
前記ｐＧ１−ｘプロモーターが、配列番号３７〜４４のヌクレオチド配列のうちの何れかである、請求項１８に記載の方法。
前記ｐＧ１−ｘプロモーターが、配列番号３９のヌクレオチド配列により特徴付けられる、請求項１９に記載の方法。
前記宿主細胞が真核細胞である、請求項１６に記載の組換え宿主細胞。
前記真核細胞が酵母細胞または糸状真菌細胞である、請求項２１に記載の組換え宿主細胞。
前記真核細胞がサッカロミセス（Saccharomyces）属またはピキア（Pichia）属の酵母細胞である、請求項２１に記載の組換え宿主細胞。
前記少なくとも２つのコア調節プロモーター領域が同一である、請求項１に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。