JP2018502050A - CD3εおよびROR1に対する二特異性抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
ROR1(同義語:チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通受容体ROR1、EC=2.7.10.1、神経栄養チロシンキナーゼ、受容体関連1、UniProtKB Q01973)はチロシン−プロテインキナーゼ受容体である。この受容体は、Masiakowski P、Carroll R.D.、J. Biol. Chem. 267巻:26181〜26190頁(1992年)「A novel family of cell surface receptors with tyrosine kinase-like domain」において記載されている。WO9218149およびWO9527060では、Rtk−2としてROR−1、およびROR−1に対する抗体について言及されている。WO2002087618では、がんの増殖および分化を、増殖因子受容体を選択的に阻害することによって制御する方法について言及されている。このような受容体は、Ror1またはRor2でありうる。WO2005100605では、乳がんに対する治療標的としてのROR1、ならびに、ROR1、ROR1の細胞外領域(M1〜V406)およびROR1断片Q73〜V139、E165〜I299、K312〜C391に特異的に結合する抗ROR1抗体について言及されている。WO2007051077は、抗ROR1抗体およびリンパ腫細胞検出におけるその使用に関する。WO2008103849でも抗ROR1抗体について言及されている。Rabbani H.ら、Blood(ASH Annual Meeting Abstracts)2010年116巻:要約916)には、慢性リンパ球性白血病(CLL)の処置のための抗ROR1抗体の使用が開示されている。Rabbaniは、抗ROR1である、細胞外ドメインに対する抗体、CRD領域(Wntタンパク質のリガンド結合性部位)に対する抗体およびクリングルドメインに対する抗体を使用した。Daneshmanesh AHら、Int. J. Cancer、123巻(2008年)1190〜1195頁は、細胞外ドメイン断片WNISSELNKDSYLTL(配列番号18)に結合する抗ROR1抗体および細胞内ドメイン断片KSQKPYKIDSKQAS(配列番号20)に結合する抗ROR1抗体に関する。CLLの処置のための、このような抗体の使用に関しても言及されている。
本発明は、2つの標的、ヒトCD3ε(さらにまた、「CD3」とも称する)およびヒトROR1の細胞外ドメイン(さらにまた、「ROR1」とも称する)に特異的に結合する二特異性抗体に関する。
a)ROR1に特異的に結合する第1の抗体の第1の軽鎖および第1の重鎖と;
b)CD3に特異的に結合する第2の抗体の第2の軽鎖および第2の重鎖であって、第2の抗体の第2の軽鎖および第2の重鎖内の可変ドメインVLおよびVHが、互いに置きかえられている、第2の軽鎖および第2の重鎖とを含み;
c)a)第1の軽鎖の定常ドメインCL内で、124位におけるアミノ酸が、リシン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により独立に置換されており(Kabatに従う番号付け)、a)第1の重鎖の定常ドメインCH1内で、147位におけるアミノ酸および213位におけるアミノ酸が、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)により独立に置換されている(Kabatに従う番号付け)(例えば、図1A、1C、1F、1H、1Jを参照されたい)こと
を特徴とする二特異性抗体に関する。
a)ROR1に特異的に結合する第1の抗体の第1の軽鎖および第1の重鎖と;
b)CD3に特異的に結合する第2の抗体の第2の軽鎖および第2の重鎖であって、第2の抗体の第2の軽鎖および第2の重鎖内の可変ドメインVLおよびVHが、互いに置きかえられている、第2の軽鎖および第2の重鎖とを含み;
c)b)第2の軽鎖の定常ドメインCL内で、124位におけるアミノ酸が、リシン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により独立に置換されており(Kabatに従う番号付け)、b)第2の重鎖の定常ドメインCH1内で、147位におけるアミノ酸および213位におけるアミノ酸が、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)により独立に置換されている(Kabatに従う番号付け)(例えば、図1B、1D、1G、1I、1Kを参照されたい)こと
を特徴とする二特異性抗体にも関する。
a)構築物ROR1 Fab−Fc−CD3 Fab−ROR1 Fabの二特異性抗体であり、
b)抗CD3抗体のFab断片内に、VL/VHクロスオーバーを含み、
c)ヒトIgG1 Fcパートを含み、
d)Fcパート内に、Pro329のグリシンによる置換およびLeu234のアラニンによる置換およびLeu235のアラニンによる置換を含み、ならびに、
e)両方のROR1 Fabの定常ドメインCL内で、124位におけるアミノ酸がリシン(K)により置換されており、123位におけるアミノ酸がカッパ軽鎖についてはアルギニン(R)により置換されており、ラムダ軽鎖についてはリシン(K)により置換されており、定常ドメインCH1内で、147位におけるアミノ酸および213位におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)により置換されている。
a)宿主細胞を、ポリペプチド、配列番号37、38、39、および40の重鎖および軽鎖のセット、または配列番号37、38、39、および41のセットをコードする核酸分子を含む1つまたは複数のベクターで形質転換するステップと、
b)宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能とする条件下で培養するステップと、
c)前記抗体分子を、前記培養物から回収するステップと
を含むことが好ましい。
本発明者らは、VH/VLの交換を伴う、CD3εおよびROR1に対する二特異性抗体は、CD3εまたはROR1に対する抗体部分の軽鎖CL内で、124位におけるアミノ酸が、リシン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により独立に置換されており(Kabatに従う番号付け)、それぞれの定常ドメインCH1内で、147位におけるアミノ酸および213位におけるアミノ酸が、グルタミン酸(E)、またはアスパラギン酸(D)により独立に置換されている(Kabatに従う番号付け)場合、高収率で作製され、容易に精製されうることを見出した。
i)本発明に従う抗体内の他方の重鎖のCH3ドメインの元の界面と向かい合う、一方の重鎖のCH3ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のCH3ドメインの界面内に、他方の重鎖のCH3ドメインの界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のCH3ドメインが変更されていることと、
ii)本発明に従う抗体内の第1のCH3ドメインの元の界面と向かい合う、第2のCH3ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、第2のCH3ドメインの界面内に、第1のCH3ドメインの界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、他方の重鎖のCH3ドメインが変更されていることと
を特徴とする。
ROR1−TCB (2+1):37、38、39、40×2または37、38、39、41×2
ROR1−TCB (1+1):36、37、39、40または36、37、39、41
Mab2 ROR1−TCB (2+1):39、54、55、56×2
Mab3 ROR1−TCB (2+1):39、57、58、59×2
Mab4 ROR1−TCB (2+1):39、60、61、62×2
実施形態1. ヒトCD3ε(さらにまた、「CD3」とも称する)およびヒトROR1(さらにまた、「ROR1」とも称する)の細胞外ドメインである、2つの標的に特異的に結合する、二価または三価の二特異性抗体であって、軽鎖およびそれぞれの重鎖内の可変ドメインVLおよびVHが、互いに置きかえられており、定常ドメインCLを含むことを特徴とし、124位におけるアミノ酸が、リシン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により独立に置換されており(Kabatに従う番号付け)、それぞれの定常ドメインCH1内で、147位におけるアミノ酸および213位におけるアミノ酸が、グルタミン酸(E)、またはアスパラギン酸(D)により独立に置換されている(Kabatに従う番号付け)二特異性抗体。
a)ROR1に特異的に結合する第1の抗体の第1の軽鎖および第1の重鎖と;
b)CD3に特異的に結合する第2の抗体の第2の軽鎖および第2の重鎖であって、前記第2の抗体の前記第2の軽鎖および第2の重鎖内の可変ドメインVLおよびVHが、互いに置きかえられている、第2の軽鎖および第2の重鎖とを含み;
c)a)前記第1の軽鎖の定常ドメインCL内で、124位におけるアミノ酸が、リシン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により独立に置換されており(Kabatに従う番号付け)、a)前記第1の重鎖の定常ドメインCH1内で、147位におけるアミノ酸および213位におけるアミノ酸が、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)により独立に置換されている(Kabatに従う番号付け)こと
を特徴とする二特異性抗体。
a)ヒトROR1に特異的に結合する第1の抗体の第1の軽鎖および第1の重鎖と;
b)CD3に特異的に結合する第2の抗体の第2の軽鎖および第2の重鎖であって、前記第2の抗体の前記第2の軽鎖および第2の重鎖内の可変ドメインVLおよびVHが、互いに置きかえられている、第2の軽鎖および第2の重鎖とを含み;
c)b)下にある前記第2の軽鎖の定常ドメインCL内で、124位におけるアミノ酸が、リシン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により独立に置換されており(Kabatに従う番号付け)、b)下にある前記第2の重鎖の定常ドメインCH1内で、147位におけるアミノ酸および213位におけるアミノ酸が、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)により独立に置換されている(Kabatに従う番号付け)こと
を特徴とする二特異性抗体。
を特徴とする、実施形態2に従う二特異性抗体。
a)配列番号12、13および14の重鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 H2C)の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHと、配列番号15、16および17の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 H2C)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLとを含むか、または、
b)配列番号23、24および25の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHを含み、前記可変ドメインVLが、配列番号26、27および28の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 CH2527)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLにより置きかえられていることを特徴とすることを特徴とする、実施形態1から13のいずれか一つに従う二特異性抗体。
a)配列番号10および11(VHVL MAB CD3 H2C)、または、
b)配列番号21および22(VHVL MAB CD3 CH2527)
の可変ドメインであることを特徴とすることを特徴とする、実施形態1から14のいずれか一つに従う二特異性抗体。
a)配列番号12、13および14の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHにより、前記可変ドメインVHが置きかえられ、配列番号15、16および17の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLにより、前記可変ドメインVLが置きかえられること、または、
b)配列番号23、24および25の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHにより、前記可変ドメインVHが置きかえられ、配列番号26、27および28の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLにより、前記可変ドメインVLが置きかえられることを特徴とする、実施形態20に従う抗体。
a)前記二特異性抗体内の前記他方の重鎖のCH3ドメインの前記元の界面と向かい合う、一方の重鎖のCH3ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のCH3ドメインの前記界面内に、前記他方の重鎖のCH3ドメインの前記界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のCH3ドメインが変更されていることと、
b)前記二特異性抗体内の前記第1のCH3ドメインの前記元の界面と向かい合う、前記第2のCH3ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、前記第2のCH3ドメインの前記界面内に、前記第1のCH3ドメインの前記界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、前記他方の重鎖のCH3ドメインが変更されていることと
を特徴とする、実施形態1から21のいずれか一項に従う抗体。
b)前記抗CD3抗体のFab断片内にVL/VHクロスオーバーを含むこと、
c)ヒトIgG1 Fcパートを含むこと、
d)前記Fcパート内に、Pro329のグリシンによる置換およびLeu234のアラニンによる置換およびLeu235のアラニンによる置換を含むこと、ならびに、
e)両方のROR1 Fabの定常ドメインCL内で、124位におけるアミノ酸がリシン(K)により置換されており、123位におけるアミノ酸がカッパ軽鎖についてはアルギニン(R)により置換されており、ラムダ軽鎖についてはリシン(K)により置換されており、前記定常ドメインCH1内で、147位におけるアミノ酸および213位におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)により置換されていることを特徴とする、実施形態1から22のいずれか一つに従う抗体。
a)宿主細胞を、実施形態1から31のいずれか一つに従う抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換するステップと、
b)前記宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能とする条件下で培養するステップと、
c)前記抗体分子を、前記培養物から回収するステップと
を含む方法。
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E. Aら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD(1991年)において示されている。抗体鎖のアミノ酸は、EU番号付け(Edelman, G.Mら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63巻(1969年)78〜85頁;Kabat, E.Aら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD(1991年))に従い番号付けされ、言及されている。
Sambrook,J.ら、Molecular cloning:A laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989年において記載されている、標準的方法を使用して、DNAを取り扱った。分子生物学的試薬は、製造元の指示書に従い使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A.ら、(1991年)、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、NIH刊行物番号91−3242において与えられている。抗体鎖のアミノ酸は、Kabat,E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD、(1991年)に従い番号付けされ、言及された。
a)所望の遺伝子セグメントは、化学合成により制作されたオリゴヌクレオチドから調製した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた、600〜1800bp長の遺伝子セグメントを、PCR増幅を含む、オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによりアセンブルし、その後、指し示される制限部位、例えば、Kpnl/SadまたはAscl/Paclを介して、pPCRScript(Stratagene)ベースのpGA4クローニングベクターへとクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列は、DNAシークエンシングにより確認した。遺伝子合成断片は、Geneart(Regensburg、Germany)で提供されている仕様に従い、注文した。b)要請される場合、所望の遺伝子セグメントは、適切な鋳型を使用するPCRにより作出するか、またはGeneart AG(Regensburg、Germany)によって、自動式遺伝子合成により、合成オリゴヌクレオチドおよびPCR産物から合成した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた遺伝子セグメントは、標準的な発現ベクターまたはさらなる解析のためのシークエンシングベクターへとクローニングした。プラスミドDNAは、市販されているプラスミド精製キットを使用して、形質転換された細菌から精製した。プラスミド濃度は、UV分光法により決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列は、DNAシークエンシングにより確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能とする、適切な制限部位によりデザインした。要請される場合、タンパク質コード遺伝子は、タンパク質を、真核細胞内の分泌へとターゲティングする、リーダーペプチドをコードする5’末端のDNA配列によりデザインした。
DNA配列は、二本鎖シークエンシングにより決定する。
Clone Manager(Scientific & Educational Software)ソフトウェアパッケージバーション9.2を、配列のマッピング、解析、注釈づけ、および例示のために使用した。
a)下で記載される抗体鎖を含む融合遺伝子は、PCRおよび/または遺伝子合成により作出し、対応する核酸セグメントの接続であって、例えば、それぞれのベクター内で固有の制限部位を使用する接続によって、公知の組換え方法および技法によりアセンブルした。サブクローニングされた核酸配列は、DNAシークエンシングにより検証した。一過性トランスフェクションのためには、形質転換されたE.coli培養物(Nucleobond AX、Macherey−Nagel)からのプラスミド調製により、より大量のプラスミドを調製する。
b)抗ROR1抗体の発現ベクターを作出するために、重鎖および軽鎖DNA配列の可変領域を、哺乳動物細胞系内の発現に最適化された、それぞれの汎用レシピエント発現ベクターへとあらかじめ挿入された、ヒトIgG1定常重鎖またはhum IgG1定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。抗体の発現は、CMVエンハンサーおよびMPSVプロモーターに続いて、5’UTR、イントロン、およびIgカッパMARエレメントを含むキメラMPSVプロモーターにより駆動する。転写は、CDSの3’末端における合成ポリAシグナル配列により終結させる。全てのベクターは、タンパク質を、真核細胞内の分泌へとターゲティングする、リーダーペプチドをコードする5’末端のDNA配列を保有する。加えて、各ベクターは、EBV EBNA発現細胞内のエピソームのプラスミド複製のためのEBV OriP配列も含有する。
c)ROR1×CD3二特異性抗体ベクターを作出するために、IgG1由来の二特異性分子は、少なくとも、2つの顕著に異なる抗原性決定基CD3およびROR1に特異的に結合することが可能な、2つの抗原結合性部分からなる。抗原結合性部分とは、各々が、可変領域および定常領域を含む、重鎖および軽鎖から構成されるFab断片である。Fab断片のうちの少なくとも1つは、VHとVLとを交換した、「Crossfab」断片であった。Fab断片内のVHとVLとの交換により、特異性の異なるFab断片が、同一のドメインの並びを有さないことを確保する。二特異性分子のデザインは、CD3について一価であり、ROR1について二価であり、この場合、1つのFab断片を、内側のCrossFab(2+1)のN末端へと融合させた。二特異性分子は、分子の半減期が長くなるように、Fcパートを含有した。構築物の概略表示を、図1に与え、構築物の好ましい配列を、配列番号39〜52に示す。分子は、懸濁液中で成長するHEK293 EBNA細胞に、哺乳動物用発現ベクターを、ポリマーベースの共トランスフェクトをすることにより作製した。2+1 CrossFab−IgG構築物を調製するために、細胞に、対応する発現ベクターを、1:2:1:1の比(「Fc(ノブ)ベクター」:「軽鎖ベクター」:「軽鎖 CrossFabベクター」:「重鎖−CrossFabベクター」)でトランスフェクトした。
Current Protocols in Cell Biology(2000年)、Bonifacino,J.S.、Dasso,M.、Harford,J.B.、Lippincott−Schwartz,J.、およびYamada,K.M.(編)、John Wiley&Sons,Inc.において記載されている、標準的な細胞培養技法を使用する。
二特異性抗体は、ポリマーを使用して、懸濁液中で培養される、HEK293−EBNA細胞内の、それぞれの哺乳動物用発現ベクターの一過性共トランスフェクションにより発現させた。トランスフェクションの1日前に、HEK293−EBNA細胞を、6mMのL−グルタミンを補充した、Ex−Cell培地中に、生細胞150万個/mLで播種した。最終的な産生容量1mL当たり、生細胞200万個を遠心分離した(210×gで5分間)。上清を吸引し、細胞を、100μLのCD CHO培地中に再懸濁させた。最終的な産生容量1mL当たりのDNAは、1μgのDNA(重鎖:修飾重鎖:軽鎖:修飾軽鎖の比=1:1:2:1)を、100μLのCD CHO培地中で混合することにより調製した。0.27μLのポリマー溶液(1mg/mL)を添加した後で、混合物を、15秒間ボルテックスし、室温で10分間放置した。10分後、再懸濁させた細胞およびDNA/ポリマー混合物をまとめ、次いで、適切な容器へと移し、これを、振とうデバイス(37℃、5%のCO2)内に置いた。3時間のインキュベーション時間後に、6mMのL−グルタミン、1.25mMのバルプロ酸、および12.5%のPepsoy(50g/L)を補充した、800μLのEx−Cell Mediumを、最終的な産生容量1mL当たり添加した。24時間後、70μLのフィード溶液を、最終的な産生容量1mL当たり添加した。7日後、または細胞の生存率が、70%と等しいかまたはそれ未満となったところで、遠心分離および滅菌濾過により、細胞を、上清から分離した。抗体は、アフィニティーステップ、ならびにカチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーである、1つまたは2つの仕上げステップにより精製した。要請される場合は、さらなる仕上げステップも使用した。組換え抗BCMAヒト抗体および二特異性抗体は、懸濁液中で、HEK293−EBNA細胞に、哺乳動物用発現ベクターを、ポリマーベースの共トランスフェクトをすることにより作製した。細胞には、フォーマットに応じて、2つまたは4つのベクターをトランスフェクトした。ヒトIgG1では、一方のプラスミドにより、重鎖をコードし、他方のプラスミドにより、軽鎖をコードした。二特異性抗体では、4つのプラスミドを共トランスフェクトした。これらのうちの2つにより、2つの異なる重鎖をコードし、他の2つにより、2つの異なる軽鎖をコードした。トランスフェクションの1日前に、HEK293−EBNA細胞を、6mMのL−グルタミンを補充した、F17 Medium中に、生細胞150万個/mLで播種した。
抗体濃度の決定は、0.1%の抗体溶液の吸光度についての理論値を使用する、280nmにおける吸光度の測定により行った。この値は、アミノ酸配列に基づくものであり、GPMAWソフトウェア(Lighthouse data)により計算した。
NuPAGE(登録商標)Pre−Castゲルシステム(Invitrogen)を、製造元の指示書に従い使用する。特に、10%または4〜12%のNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis−TRIS Pre−Castゲル(pH6.4)およびNuPAGE(登録商標)MES(還元ゲル、NuPAGE(登録商標)Antioxidantランニングバッファー添加剤を伴う)、またはMOPS(非還元ゲル)ランニングバッファーを使用する。
プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによる精製
アフィニティーステップのために、上清を、20mMのリン酸ナトリウム、20mMのクエン酸ナトリウム、pH7.5 6CVで平衡化させたプロテインAカラム(HiTrap Protein A FF、5mL、GE Healthcare)上にロードした。同じ緩衝液による洗浄ステップの後で、20mMのリン酸ナトリウム、100mMの塩化ナトリウム、100mMのグリシン、pH3.0による段階的溶出によって、抗体を、カラムから溶出させた。所望の抗体を伴う画分を、0.5Mのリン酸ナトリウム、pH8.0(1:10)で速やかに中和し、プールし、遠心分離により濃縮した。濃縮物は、滅菌濾過し、さらにカチオン交換クロマトグラフィーおよび/またはサイズ除外クロマトグラフィーに掛けた。
カチオン交換クロマトグラフィーステップのために、濃縮されたタンパク質を、アフィニティーステップのために使用した溶出緩衝液で、1:10に希釈し、カチオン交換カラム(Poros 50 HS、Applied Biosystems)へとロードした。それぞれ、20mMのリン酸ナトリウム、20mMのクエン酸ナトリウム、20mMのトリス、pH5.0、および20mMのリン酸ナトリウム、20mMのクエン酸ナトリウム、20mMのトリス、100mMの塩化ナトリウム、pH5.0である、平衡緩衝液および洗浄緩衝液による、2回の洗浄ステップの後で、タンパク質を、20mMのリン酸ナトリウム、20mMのクエン酸ナトリウム、20mMのトリス、100mMの塩化ナトリウム、pH8.5を使用する勾配により溶出させた。所望の抗体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌濾過し、さらにサイズ除外ステップに掛けた。
サイズ除外ステップのために、濃縮されたタンパク質を、製剤緩衝液としての、Tween20を伴うかまたは伴わない、20mMのヒスチジン、140mMの塩化ナトリウム、pH6.0と共に、XK16/60 HiLoad Superdex 200カラム(GE Healthcare)に注入した。単量体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌バイアルへと滅菌濾過した。
最終タンパク質調製物の純度および単量体含量は、25mMのリン酸カリウム、125mMの塩化ナトリウム、200mMのL−アルギニン一塩酸塩、0.02%(w/v)のアジ化ナトリウム、pH6.7による緩衝液中で、CE−SDS(Caliper LabChip GXIIシステム(Caliper Life Sciences))およびHPLC(TSKgel G3000 SW XL解析用サイズ除外カラム(Tosoh))のそれぞれにより決定した。
脱グリコシル化
分子の均質の調製を確認するために、最終タンパク質溶液を、LC−MS解析により解析した。炭水化物により導入される異質性を除去するために、構築物を、PNGaseF(ProZyme)で処理する。したがって、2Mのトリス2μlを、濃度を0.5mg/mlとする20μgのタンパク質へと添加することにより、タンパク質溶液のpHを、pH7.0へと調整した。0.8μgのPNGaseFを、添加し、37℃で12時間インキュベートした。
LC−MS法は、TOF 6441質量分析計(Agilent)へとカップリングさせた、Agilent HPLC 1200上で実施した。クロマトグラフィーによる分離は、Macherey Nagel Polystereneカラム;RP1000−8(粒子サイズを8μmとする、4.6×250mm;カタログ番号719510)上で実施した。溶離液Aは、水中に5%のアセトニトリル、および0.05%(v/v)のギ酸であり、溶離液Bは、95%のアセトニトリル、5%の水、および0.05%のギ酸であった。流量は、1ml/分であり、分離は、40℃で実施し、前に記載した処理により、6μg(15μl)のタンパク質試料を得た(表7)。
末梢血単核細胞(PBMC)は、Histopaque密度遠心分離により、地域の血液バンク、または健常ヒトドナーに由来する採取したての血液から得られる、富化されたリンパ球調製物(軟膜)から調製した。略述すると、血液を、滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma、H8889)にわたり、注意深く層化させた。450×g、室温で30分間遠心分離の後(ブレーキをオフに切り替える)、PBMCを含有する相間部の上方の血漿部分を廃棄した。PBMCを、新しい50ml Falconチューブへと移し、チューブを、PBSで、50mlの総容量まで満たした。混合物を、400×g、室温で10分間遠心分離した(ブレーキをオンに切り替える)。上清を廃棄し、PBMCペレットを、滅菌PBSで2回洗浄した(350×g、4℃で10分間の遠心分離ステップ)。結果として得られるPBMC集団を、自動的にカウントし(ViCell)、アッセイ開始まで、インキュベーター内、37℃、5%のCO2、10%のFCS、および1%のL−アラニル−L−グルタミン(Biochrom、K0302)を含有するRPMI1640培地中で保存した。
末梢血単核細胞(PBMC)は、Histopaque密度遠心分離により、地域の血液バンク、または健常ヒトドナーに由来する採取したての血液から得られる、富化されたリンパ球調製物(軟膜)から調製した。PBMCからのT細胞の富化は、製造元の指示書に従い、Miltenyi Biotec(型番130−093−244)製のNaive CD8+ T cell isolation Kitを使用して実施したが、CD8+T細胞の最後の単離ステップは省略した(初代ヒト汎T細胞の単離についての記載もまた参照されたい)。
抗ROR1抗体の作出
配列番号2〜9のROR1抗体(MAB1)のVHおよびVL領域のタンパク質配列は、WO2012/075158において記載されている。略述すると、上で記載した配列をコードするオリゴヌクレオチドをPCRによって繋ぎ合わせて、それぞれ抗ROR1抗体のVHおよびVL配列をコードするcDNAを合成する。
ROR1をそれらの表面において発現するヒトB−CLL細胞系、または初代B−CLL細胞、多発性骨髄腫細胞系、またはマントル細胞リンパ腫細胞系
a)採取したてのヒト初代B−CLL細胞(CD19+CD5+)をCLL患者の血液から単離した。地域の倫理審査委員会によるガイドラインおよびヘルシンキ宣言に従い、説明同意文書の署名を得た後で、CLL患者から、血液を収集する。低温保存されたヒト初代B−CLL細胞(CD19+CD5+)は、Allcells(Alameda、CA、USA)から入手した。患者由来の初代B−CLL細胞は、合法的に得られたものであり、以下の倫理的要件に応じるものであった:(i)CLLと診断された患者からの試料の取得が、Institute Reviewing Board(IRB)、またはHuman Subject Committeeにより承認されていること;(ii)患者から、Allcells Diseased Cells Programへの参加の前に署名および証人署名された説明同意文書の署名フォームを得ること;(iii)上で記載した疾患と診断された患者全員が、プログラムに対する彼らの責務に対して正当な補償を受けること、およびその補償がIRBまたはHuman Subject Committeeにより承認されたものであること;(iv)患者全員が、提供した試料が任意の研究適用に使用される可能性があり、研究適用から生じるあらゆる権利を放棄することを承知していること。初代B−CLL細胞を、10%ウシ胎仔血清を補充したRPMI中で成長させた。初代CD19+CD5+B−CLL細胞上のROR1の発現を、蛍光色素コンジュゲート抗ヒトROR1抗体を使用するフローサイトメトリーにより確認した(実施例3を参照されたい)。
b)ヒトBリンパ球多発性骨髄腫細胞系RPMI8226は、ATCCから入手した(ATCC CCL−155)。RPMI8226骨髄腫細胞をDMEM、10%のFCS、1%のグルタミン中で培養した。RPMI8226細胞系におけるROR1の発現を、蛍光色素コンジュゲート抗ヒトROR1抗体を使用するフローサイトメトリーにより確認した(実施例3を参照されたい)。
c)ヒトマントル細胞リンパ腫(B細胞非ホジキンリンパ腫)Rec−1細胞系は、ATCCから入手した(ATCC CRL−3004)。Rec−1細胞をDMEM、10%のFCS、1%のグルタミン中で培養した。Rec−1細胞系におけるROR1の発現を、蛍光色素コンジュゲート抗ヒトROR1抗体を使用するフローサイトメトリーにより確認した(実施例3を参照されたい)。
細胞表面におけるROR1の発現のレベルが異なるヒト卵巣がん細胞系
a)卵巣奇形癌に由来するヒト卵巣がん細胞系PA−1は、American Type Culture Collection(ATCC;カタログ番号CRL−1572)から入手した。PA−1細胞系を、10%ウシ胎仔血清(熱不活化)、2mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、および1500mg/Lの炭酸水素ナトリウムを補充したEagle’s Minimum Essential Medium(MEM)(ATCC、カタログ番号30−2003)中で培養した。フローサイトメトリーにより測定される通り、PA−1細胞系におけるROR1の発現は高度であることが確認された(実施例3.1を参照されたい)。
b)卵巣腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系COLO−704は、Leibniz Institute DSMZ−German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ;カタログ番号ACC198)から入手した。COLO−704細胞系を90%のRPMI1640および10%の熱不活化ウシ胎仔血清中で培養した。フローサイトメトリーにより測定される通り、COLO−704細胞系におけるROR1の発現は中程度であることが確認された(実施例3.1を参照されたい)。
c)卵巣明細胞癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ES−2は、American Type Culture Collection(ATCC;カタログ番号CRL−1978)から入手した。ES−2細胞系を、ATCCにより配合されたMcCoy’s 5a Medium Modified(カタログ番号30−2007)および10%ウシ胎仔血清中で培養した。フローサイトメトリーにより測定される通り、ES−1細胞系におけるROR1の発現は陰性であることが確認された(実施例3.1を参照されたい)。
d)卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系SK−OV−3は、American Type Culture Collection(ATCC;カタログ番号HTB−77)から入手した。SK−OV−3細胞系を、ATCCにより配合されたMcCoy’s 5a Medium Modified(カタログ番号30−2007)および10%ウシ胎仔血清中で培養した。フローサイトメトリーにより測定される通り、SK−OV−3細胞系におけるROR1の発現は低度であることが確認された(実施例3.1を参照されたい)。
e)卵巣腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系OVCAR−5は、US National Cancer Institute NCI−60ヒトがん細胞系パネルから入手した。OVCAR−5細胞系を90%のRPMI1640および10%の熱不活化ウシ胎仔血清中で培養した。フローサイトメトリーにより測定される通り、OVCAR−5細胞系におけるROR1の発現は中程度であることが確認された(実施例3.1を参照されたい)。
初代B−CLL細胞、RPMI8226骨髄腫細胞またはRec−1 MCL細胞上に発現したROR1への結合(フローサイトメトリー)
a)初代CD19+CD5+CLL細胞上のROR1の発現を、フローサイトメトリーにより評価した。略述すると、細胞を採取し、洗浄し、生存率についてカウントし、96ウェル丸底プレートのウェル当たり細胞50000個で再懸濁させ、10μg/mlの、Alexa488で標識された抗ヒトROR1抗体と共に、4℃で30分間インキュベートした(内部化を防止するように)。インキュベーション時間の終了時に、細胞を遠心分離し(350×gで5分間)、FACS緩衝液で2回洗浄し、100ulのFACS緩衝液中に再懸濁させ、FACS Divaソフトウェアを作動させるCantoIIデバイス上で解析した。図2Aは、抗ROR1抗体の初代B−CLL細胞への結合時の蛍光強度中央値の増大を示し、これにより、ROR1が初代CLL細胞上に発現することが示される。
b)次いで、Bリンパ球骨髄腫RPMI8226細胞系におけるROR1の発現を、上で記載した方法を使用してフローサイトメトリーにより評価した。図3は、増大する濃度の抗ROR1抗体がRPMI8226細胞に結合する際には蛍光強度中央値が増大するが(A)、ROR1陰性MKN45細胞(ヒト胃腺癌細胞系、DSMZ ACC409)に結合する際には蛍光強度中央値が増大しない(B)ことを示す。表1は、抗ROR1抗体の、ROR1陽性RPMI8226細胞系への結合についてのEC50を示す。
ROR1 IgG抗体の、ROR1陽性ヒト卵巣がん細胞系への結合(フローサイトメトリーにより検出される)
a)PA−1、COLO−704、ES−2、SK−OV−3、およびOVCAR−5を含めたヒト卵巣がん細胞系におけるROR1の発現レベルを、フローサイトメトリーにより測定した。略述すると、細胞を採取し、洗浄し、生存率についてカウントし、96ウェル丸底プレートのウェル当たり細胞50,000個で再懸濁させ、Alexa488で標識された抗ヒトROR1抗体と共に4℃で30分間インキュベートした。全てのROR1およびアイソタイプ対照抗体を滴定し、0.01〜100nM(0.0015〜15μg/mL)の間の最終濃度範囲で解析した。標識されていない抗体を使用した試料については、細胞を遠心分離し(350×gで5分間)、120μl/ウェルのFACS Stain緩衝液(BD Biosciences)で洗浄し、再懸濁させ、蛍光色素コンジュゲートAlexaFluor 647コンジュゲートAffiniPure F(ab’)2 Fragment goat anti−human IgG Fc Fragment Specific(Jackson Immuno Research Lab;#109−606−008)と共に、4℃でさらに30分間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、細胞を遠心分離し(350×gで5分間)、FACS緩衝液で2回洗浄し、100ulのFACS緩衝液中に再懸濁させ、FACS Divaソフトウェアを作動させるCantoIIデバイス上で解析した。次いで、ROR1の発現を蛍光強度中央値(MFI)として定量化し、MFIをROR1抗体濃度の関数として示すグラフをプロットした。次いで、Prismソフトウェア(GraphPad)を使用してEC50値を測定した。表2は、Mab1およびMab2抗ROR1抗体の、ROR1陽性SK−OV−3卵巣がん細胞系およびPA−1卵巣がん細胞系への結合についてのEC50を示す。Mab1およびMab2抗ROR1抗体はどちらも、PA−1細胞系(高レベルのROR1を発現することが後で見出された)に、SK−OV−3(低レベルのROR1を発現することが後で見出された)に対するよりも大きな効力で結合する。ROR1 Mab1およびROR1 Mab2のSK−OV−3への結合について計算されるEC50は外挿による推定値であり、実際よりも高く、または低く見積もられている可能性がある。図3−3は、SK−OV−3細胞(A、白抜きの四角)およびPA−1細胞(B、白抜きの三角形)におけるMFIの増大をROR1 Mab2 IgGの濃度の関数として示す。最大強度は、10μg/mLの抗体濃度で、PA−1細胞において、SK−OV−3細胞に対しておよそ3倍に達することができた。
CLL患者由来の初代PBMCまたはRPMI8226 MM細胞における抗ROR1抗体の内部化(フローサイトメトリー)
抗ROR1抗体を内部化アッセイにおいてさらに試験した。略述すると、ヒトROR1を発現する初代B−CLL標的細胞を、Cell Dissociation緩衝液により採取し、ViCellを使用して細胞生存率を決定した後に、洗浄し、10%のFCSを補充したRPMI中に、1×106個(1×106個/mL)の、非処置CLL患者に由来するPBMCまたは細胞1×106個/mLのRPMI8226細胞の濃度で再懸濁させた。細胞懸濁液を、各被験IgG/TCBおよび各濃度について15ml Falconチューブに移した。Alexa488とコンジュゲートした、希釈された抗ROR1 IgGまたは抗ROR1/抗CD3 TCB(RPMI+10%のFCS中1nMまで希釈)0.5mlをチューブに添加し、低温室内、シェーカーで30分間インキュベートした。インキュベートし、細胞を冷PBSで3回洗浄して結合していない抗体を除去した後、細胞を氷上で放置したか、または96ウェルFACSプレート中のあらかじめ加温した培地中に移し(細胞0.1×106個)、内部化を容易にするために、37℃で15分間、30分間、1時間、2時間、および24時間インキュベートした。さらに、細胞の試料をまた、内部化を阻害するために、3μMのフェニルアルシンオキシド(Sigma−Aldrich)の存在下、37℃で2時間および/または24時間インキュベートした。その後、細胞を冷PBSで1回洗浄し、Alexa647で標識された抗ヒトFc二次抗体(F(ab)2)と共に、4℃で30分間インキュベートした。PBSで3回の最終的な洗浄後、細胞を400×gで4分間遠心分離し、ヨウ化プロピジウム(1:4000)(Sigma)を伴うかまたは伴わないFACS緩衝液に再懸濁させた。抗ROR1 IgGおよび抗ROR1/抗CD3 TCBについての細胞の平均蛍光強度(MFI)を、FACS CantoIIフローサイトメーター(BD Biosciences)およびFlowJo解析用ソフトウェアを使用して測定した。
抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の作出
(実施例5.1)
抗CD3抗体の作出
以下のVHおよびVL領域のタンパク質配列を使用して、ヒトおよびカニクイザル交差反応性CD3ε抗体を作出した。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
CH2527_VL(配列番号22)
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性1+1フォーマット(すなわち、ROR1に対して一価であり、CD3に対して一価である、1アーム二特異性(Fab)x(Fab)抗体)の作出
a)本発明に従う抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体は、週に少なくとも1回または2回の投与を可能にする、約1〜12日間の消失半減期という利点を有し得る。
抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性2+1フォーマット(すなわち、ROR1に対して二価であり、CD3に対して一価である、二特異性(Fab)2×(Fab)抗体)の作出
a)2+1フォーマットによる抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体、すなわち、ROR1に対して二価であり、CD3に対して一価である、二特異性(Fab)2×(Fab)抗体は、腫瘍標的ROR1に優先的に結合し、CD3抗体シンクを回避し、したがって、腫瘍に焦点を当てた薬物曝露の確率がより高いので、効力に対する利点、有効性および安全性に対する予測可能性を有し得る。
電荷変異体を伴うかまたは伴わない、抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の作製および精製
二特異性抗体を作製するために、二特異性抗体を、懸濁液中で培養される、HEK293−EBNA細胞内の、それぞれの哺乳動物用発現ベクターの一過性のポリマーベースの共トランスフェクションにより発現させる。トランスフェクションの1日前に、HEK293−EBNA細胞を、6mMのL−グルタミンを補充した、Ex−Cell培地中に、生細胞150万個で/mLで播種する。最終的な産生容量1mL当たり、生細胞200万個を遠心分離する(210×gで5分間)。上清を吸引し、細胞を、100μLのCD CHO培地中に再懸濁させる。最終的な産生容量1mL当たりのDNAは、1μgのDNA(重鎖:修飾重鎖:軽鎖:修飾軽鎖の比=1:1:2:1)を、100μLのCD CHO培地中で混合することにより調製する。0.27μLのポリマー溶液(1mg/mL)を添加した後で、混合物を、15秒間ボルテックスし、室温で10分間放置する。10分後、再懸濁させた細胞およびDNA/ポリマー混合物をまとめ、次いで、適切な容器へと移し、これを、振とうデバイス(37℃、5%のCO2)内に置く。3時間のインキュベーション時間後に、6mMのL−グルタミン、1.25mMのバルプロ酸、および12.5%のPepsoy(50g/L)を補充した、800μLのEx−Cell Mediumを、最終的な産生容量1mL当たり添加する。24時間後、70μLのフィード溶液を、最終的な産生容量1mL当たり添加する。7日後、または細胞の生存率が、70%と等しいかまたはそれ未満となったところで、遠心分離および滅菌濾過により、細胞を、上清から分離する。抗体は、アフィニティーステップ、ならびにカチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーである、1つまたは2つの仕上げステップにより精製する。要請される場合は、さらなる仕上げステップも使用する。
抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の、ROR1陽性B−CLL細胞または骨髄腫細胞またはT細胞上のCD3への結合(フローサイトメトリー)
抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の、卵巣がん細胞およびT細胞への結合(フローサイトメトリーにより測定される)
実施例5において作出した抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体を、フローサイトメトリーにより、ヒト卵巣がん細胞系PA−1およびSK−OV−3ならびにヒト白血病性T細胞Jurkat(ATCC TIB−152)上に発現するヒトCD3へのそれらの結合について解析した。Jurkat T細胞を、10%のウシ胎仔血清を補充したRPMI1640培地中で培養した。略述すると、培養細胞を採取し、カウントし、ViCellを使用して細胞生存率を査定する。次いで、生細胞を、0.1%のBSAを含有するFACS Stain緩衝液(BD Biosciences)中、1ml当たりの細胞2×106個に調整した。この細胞懸濁液100μlを、丸底96ウェルプレートに、ウェルごとに、さらにアリコート分割した。細胞を含有するウェルに、30μlの、Alexa488で標識された抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体または対応するIgG対照を添加して、1nM〜500nM(Jurkat T細胞)、または0.1nM〜100nM(ヒト卵巣がん細胞)の最終濃度を得た。抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体と対照IgGは同じモル濃度で使用した。4℃で30分間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離し(350×gで5分間)、150μl/ウェルの、BSAを含有するFACS Stain緩衝液(BD Biosciences)で2回洗浄し、次いで、細胞を、ウェル1つ当たり100ulのBD Fixation緩衝液(BD Biosciences、型番554655)を使用して、4℃で20分間固定し、120μlのFACS緩衝液中に再懸濁させ、BD FACS CantoIIを使用して解析した。抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の、ヒト卵巣がん細胞およびT細胞への結合を査定し、蛍光強度中央値を、ヒト卵巣がん細胞またはCD3を発現するJurkat T細胞のいずれかをゲーティングして決定し、ヒストグラムおよびドットプロットにプロットした。標識されていない抗体を使用した試料については、細胞を遠心分離し(350×gで5分間)、120μl/ウェルのFACS Stain緩衝液(BD Biosciences)で洗浄し、再懸濁させ、蛍光色素コンジュゲートAlexaFluor 647コンジュゲートAffiniPure F(ab’)2 Fragment goat anti−human IgG Fc Fragment Specific(Jackson Immuno Research Lab;109−606−008)と共に、4℃でさらに30分間インキュベートした。次いで、細胞を、Stain緩衝液(BD Biosciences)で2回洗浄し、ウェル1つ当たり100ulのBD Fixation緩衝液(BD Biosciences、型番554655)を使用して、4℃で20分間固定し、120μlのFACS緩衝液中に再懸濁させ、BD FACS CantoIIを使用して解析した。抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体についての蛍光強度中央値を抗体濃度の関数としてプロットした。抗ROR1/抗CD3抗体のヒト卵巣がん細胞への結合についてのEC50値(最大結合の50%に達するのに要請される抗体の濃度を示す)を、Prism(GraphPad)を使用して測定した。図3−3に示される通り、抗体濃度の関数として、蛍光強度シグナル中央値の増大によって測定される通り、ROR1 Mab2 IgGおよびROR1 Mab2−TCBcvの、SK−OV−3卵巣がん細胞系(A)およびPA−1ヒト卵巣がん細胞系(B)における濃度依存的結合が見られた。このような陽性シグナルは、CD3だけに結合し、ROR1に結合しない対照TCBをSK−OV−3卵巣がん細胞系およびPA−1卵巣がん細胞系の両方で試験した場合には観察されなかった(AおよびB;塗りつぶし丸)。図3−4に示される通り、ROR1 Mab2−TCBcvおよび対照TCBの、Jurkat T細胞における濃度依存的結合が見られ、これにより、両方のTCB抗体が、T細胞上のCD3に結合することが確認される。
EHEB B−CLL細胞系、またはCLL患者由来の初代PBMCまたはRPMI8226 MM細胞における、抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の内部化(フローサイトメトリー)。
抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体との会合時のT細胞の活性化(フローサイトメトリー)
a)ヒトROR1陽性細胞の存在下または非存在下における、CD4+およびCD8+T細胞上の、早期活性化マーカーCD69、または後期活性化マーカーCD25の表面発現を査定することにより、実施例5において作出した抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体を、フローサイトメトリーにより、T細胞の活性化を誘導するそれらの潜在性についても解析した。略述すると、ROR1陽性細胞を、Cell Dissociation緩衝液により採取し、カウントし、細胞生存率を、ViCellを使用して検証した。生存B−CLL細胞を、10%のFCSを補充したRPMI中、1ml当たりの細胞0.2×106個に調整し、この細胞懸濁液100μlを、丸底96ウェルプレートに、ウェルごとに、ピペットにより移した。50μlのT細胞二特異性構築物を、ROR1陽性細胞を含有するウェルに添加して、0.01fM〜100pMまたは0.01pM〜100nMの最終濃度を得た。96ウェルプレートを、取りおき、さらに操作するまで37℃、5%のCO2で維持した。
卵巣がん細胞の存在下での、抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体との会合時のT細胞の活性化(フローサイトメトリー)
実施例5において作出した抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体を、ROR1陽性ヒト卵巣がん細胞系PA−1および/またはSK−OV−3の存在下における、CD4+およびCD8+T細胞上の、早期活性化マーカーCD69および/または後期活性化マーカーCD25の表面発現を査定することにより、フローサイトメトリーにより、T細胞の活性化を誘導するそれらの潜在性についても解析した。略述すると、ヒト卵巣がん標的細胞を、トリプシン/EDTAにより採取し、洗浄し、平底96ウェルプレートを使用して、細胞25,000個/ウェルの密度でプレーティングした。細胞を、一晩放置して接着させた。末梢血単核細胞(PBMC)を、Histopaque密度遠心分離により、健常ヒトドナーから得られる、富化されたリンパ球調製物(軟膜)から調製した。採取したての血液を、滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma、#H8889)上に、層状に載せた。遠心分離の後(室温、450×gで30分間)、PBMCを含有する相間部の上方の血漿を廃棄し、PBMCを、新しいfalconチューブに移し、その後、50mlのPBSを満たした。混合物を遠心分離し(室温、400×gで10分間)、上清を廃棄し、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄した(350×gで10分間の遠心分離ステップ)。結果として得られるPBMC集団を、自動的にカウントし(ViCell)、さらなる使用まで(24時間を超えない)、細胞系の供給元(実施例2.1を参照されたい)に従い、それぞれの培養培地中、細胞インキュベーター内、5%のCO2、37℃で保存した。抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体によって誘導されるT細胞の活性化を調査するために、ヒト卵巣がん細胞を示されている濃度の二特異性抗体に曝露した(0.1pM〜200nMの範囲、三連で)。次いで、PBMCを、ヒト卵巣がん標的細胞に、最終的なエフェクターと標的との比(E:T比)、10:1で添加した。5%のCO2、37℃で24〜48時間のインキュベーション後に、T細胞の活性化を評価した。インキュベーション期間後、細胞を、遠心分離により(350×gで5分間)ウェルから収集し、ペレット化し、150μl/ウェルのFACS Stain緩衝液(BD Biosciences)で2回洗浄した。ヒトCD4(マウスIgG1、K;クローンRPA−T4)、CD8(マウスIgG1、K;クローンHIT8a;BD型番555635)、CD69(マウスIgG1;クローンL78;BD型番340560)およびCD25(マウスIgG1、K;クローンM−A251;BD型番555434)に対する、選択された蛍光色素コンジュゲート抗体によるエフェクター細胞の表面染色を、光から保護して、FACS Stain緩衝液(BD Biosciences)中、製造元のプロトコールに従って、4℃で30分間実施した。細胞を、150μl/ウェルのFACS Stain緩衝液で2回洗浄し、次いで、ウェル1つ当たり100ulのBD Fixation緩衝液(BD Biosciences、型番554655)を使用して、4℃で20分間固定し、120μlのFACS緩衝液中に再懸濁させ、BD FACS CantoIIを使用して解析した。CD69活性化マーカーまたはCD25活性化マーカーの発現を、ヒストグラムまたはドットプロットに示される通り、CD4+およびCD8+T細胞集団をゲーティングした場合の蛍光強度中央値を測定することにより決定した。図9.1に示される通り、ROR1 Mab2−TCBcv(四角)は、ROR1の発現が低度なSK−OV−3標的細胞の存在下で、CD4+T細胞(A)およびCD8+T細胞(B)において観察された、CD69早期活性化マーカーの濃度依存的な増大を誘導したのに対し、対照TCB(三角形)は、T細胞の活性化を少しも誘導しなかった。臨床的に関与性の濃度である1nMのROR1 Mab2−TCBcvにおいて、48時間のインキュベーション後、最大40%の活性化CD4 T細胞および25%の活性化CD8 T細胞が既に存在していた。
抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の、T細胞上のCD3への架橋結合時、および多発性骨髄腫細胞上のROR1への架橋結合時の、リダイレクトされたT細胞による、多発性骨髄腫細胞に対する細胞傷害作用(LDH放出アッセイ)
実施例5において作出した抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体を、抗原結合性部分の、細胞上のROR1への結合を介する、構築物の架橋結合時に、ROR1を発現する多発性骨髄腫細胞内でT細胞媒介性アポトーシスを誘導するそれらの潜在性についても解析した。略述すると、ヒトROR1を発現するRPMI−8226多発性骨髄腫標的細胞(American Type Culture Collection;ATCC CCL−155から入手可能である)を、Cell Dissociation緩衝液により採取し、洗浄し、10%のFCSを補充したRPMI中に再懸濁させた。ウェル1つ当たりの細胞約30,000個を、丸底96ウェルプレート内にプレーティングし、構築物のそれぞれの希釈液を、所望の最終濃度、0.01fM〜100pMまたは0.2nM〜30nMの最終濃度になるように添加した(三連で)。適切な比較のために、全てのT細胞二特異性構築物および対照を、同じモル濃度に調整した。ヒト全T細胞またはCD8 T細胞クローン(エフェクター)をウェルに添加して、3:1の最終E:T比を得た。ヒトPBMCをエフェクター細胞として使用した場合には、10:1の最終E:T比を使用した。PHA−L(Sigma)を、ヒトT細胞の活性化についての陽性対照として、1μg/mlの濃度で使用した。陰性対照群は、エフェクター細胞だけ、または標的細胞だけで表した。標準化のために、RPMI−8226多発性骨髄腫標的細胞の最大溶解(=100%)を、最終濃度1%のTriton X−100を伴い、細胞死を誘導する、標的細胞のインキュベーションにより決定した。最小溶解(=0%)を、エフェクター細胞だけを伴い、すなわち、T細胞二特異性抗体を伴わずに共インキュベートされた標的細胞により表した。次いで、5%のCO2、37℃で、6〜24時間のインキュベーション(エフェクターとしてCD8 T細胞クローン)、または24〜48時間のインキュベーション(エフェクターとしてPBMC)の後、製造元の指示書に従い、LDH検出キット(Roche Applied Science)により、アポトーシス性/壊死性ROR1陽性標的細胞から上清へのLDH放出を測定した。LDH放出の百分率を、濃度反応曲線において、抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の濃度に対してプロットした。IC50値は、Prismソフトウェア(GraphPad)を使用して測定し、最大LDH放出の50%を結果としてもたらすT細胞二特異性抗体の濃度として決定した。
ヒト卵巣がん細胞の細胞溶解(LDH放出アッセイ)
実施例5において作出した抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体を、ヒト卵巣がん細胞におけるT細胞媒介性細胞傷害作用の誘導について解析した。ヒト卵巣がん細胞系PA−1、COLO−704、SK−OV−3およびOVCAR−5。略述すると、ヒト卵巣がん標的細胞を、トリプシン/EDTAにより採取し、洗浄し、平底96ウェルプレートを使用して、細胞25,000個/ウェルの密度でプレーティングした。細胞を一晩放置して接着させた。末梢血単核細胞(PBMC)を、Histopaque密度遠心分離により、健常ヒトドナーから得られる、富化されたリンパ球調製物(軟膜)から調製した。採取したての血液を、滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma、#H8889)上に、層状に載せた。遠心分離の後(室温、450×gで30分間)、PBMCを含有する相間部の上方の血漿を廃棄し、PBMCを、新しいfalconチューブに移し、その後、50mlのPBSを満たした。混合物を遠心分離し(室温、400×gで10分間)、上清を廃棄し、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄した(350×gで10分間の遠心分離ステップ)。結果として得られるPBMC集団を、自動的にカウントし(ViCell)、さらなる使用まで(24時間を超えない)、細胞系の供給元(実施例2.1を参照されたい)の示唆に従い、それぞれの培養培地中、細胞インキュベーター内、5%のCO2、37℃で保存した。殺滅アッセイのために、TCB抗体を、示されている濃度で添加した(0.1pM〜200nMの範囲、三連で)。PBMCを、ヒト卵巣がん標的細胞に最終的なエフェクターと標的との比(E:T比)、10:1で添加した。5%のCO2、37℃で24〜48時間のインキュベーション後、アポトーシス性/壊死性細胞により細胞の上清中に放出されるLDHの定量化(LDH検出キット、Roche Applied Science、#11 644 793 001)により、製造元の指示書に従い、標的細胞による殺滅を評価した。標的細胞の最大溶解(=100%)を、1%のTriton X−100を伴う、標的細胞のインキュベーションにより実現した。最小溶解(=0%)は、エフェクター細胞を伴い、二特異性構築物を伴わずに共インキュベートされた標的細胞を指す。LDH放出の百分率を、濃度反応曲線において、抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の濃度に対してプロットした。EC50値は、Prismソフトウェア(GraphPad)を使用して測定し、最大LDH放出の50%を結果としてもたらすT細胞二特異性抗体の濃度として決定した。図12に示される通り、ROR1 Mab2−TCBcv(四角)は、ROR1の発現が高度なPA−1卵巣がん細胞(A)、ROR1の発現が中程度なCOLO−704(B)およびOVCAR−5(C)卵巣がん細胞およびROR1の発現が低度なSK−OV−3卵巣がん細胞(D)の腫瘍細胞溶解の濃度依存的な増大を誘導した。対照的に、CD3だけに結合する対照TCB(A、B、C;丸)は、臨床的に関与性の濃度(すなわち、最大10nM)において腫瘍細胞溶解を誘導しなかった。代表的な実験を示す。
Claims (36)
- ヒトCD3εおよびヒトROR1の細胞外ドメインである、2つの標的に特異的に結合する、二価または三価の二特異性抗体であって、軽鎖およびそれぞれの重鎖内の可変ドメインVLおよびVHが、互いに置きかえられており、定常ドメインCLを含むことを特徴とし、124位におけるアミノ酸が、リシン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により独立に置換されており(Kabatに従う番号付け)、それぞれの定常ドメインCH1内で、147位におけるアミノ酸および213位におけるアミノ酸が、グルタミン酸(E)、またはアスパラギン酸(D)により独立に置換されている(Kabatに従う番号付け)二特異性抗体。
- ヒトCD3εおよびヒトROR1の細胞外ドメインである、2つの標的に特異的に結合する二特異性抗体であって、
a)ヒトROR1の細胞外ドメインに特異的に結合する第1の抗体の第1の軽鎖および第1の重鎖と;
b)CD3εに特異的に結合する第2の抗体の第2の軽鎖および第2の重鎖であって、前記第2の抗体の前記第2の軽鎖および第2の重鎖内の可変ドメインVLおよびVHが、互いに置きかえられている、第2の軽鎖および第2の重鎖とを含み;
c)a)前記第1の軽鎖の定常ドメインCL内で、124位におけるアミノ酸が、リシン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により独立に置換されており(Kabatに従う番号付け)、a)前記第1の重鎖の定常ドメインCH1内で、147位におけるアミノ酸および213位におけるアミノ酸が、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)により独立に置換されている(Kabatに従う番号付け)こと
を特徴とする二特異性抗体。 - ヒトCD3εおよびヒトROR1の細胞外ドメインである、2つの標的に特異的に結合する二特異性抗体であって、
a)ヒトROR1の細胞外ドメインに特異的に結合する第1の抗体の第1の軽鎖および第1の重鎖と;
b)ヒトCD3εに特異的に結合する第2の抗体の第2の軽鎖および第2の重鎖であって、前記第2の抗体の前記第2の軽鎖および第2の重鎖内の可変ドメインVLおよびVHが、互いに置きかえられている、第2の軽鎖および第2の重鎖とを含み;
c)b)下にある前記第2の軽鎖の定常ドメインCL内で、124位におけるアミノ酸が、リシン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により独立に置換されており(Kabatに従う番号付け)、b)下にある前記第2の重鎖の定常ドメインCH1内で、147位におけるアミノ酸および213位におけるアミノ酸が、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)により独立に置換されている(Kabatに従う番号付け)こと
を特徴とする二特異性抗体。 - さらに、前記第1の抗体のFab断片(さらにまた、「ROR1−Fab」とも称する)も含み、前記ROR1−Fabの定常ドメインCL内で、124位におけるアミノ酸が、リシン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により独立に置換されており(Kabatに従う番号付け)、前記ROR1−Fabの定常ドメインCH1内で、147位におけるアミノ酸および213位におけるアミノ酸が、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)により独立に置換されている(Kabatに従う番号付け)こと
を特徴とする、請求項2に記載の二特異性抗体。 - さらに、前記第1の抗体の第2のFab断片(「ROR1−Fab」)を含むことを特徴とする、請求項3に記載の二特異性抗体。
- ヒトCD3εに特異的に結合する抗体の1つのFab断片(さらにまた、「CD3−Fab」とも称する)と、ヒトROR1の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体の1つのFab断片(さらにまた、「ROR1−Fab」とも称する)と、Fcパートとからなり、前記CD3−Fabおよび前記ROR1−Fabが、それらのC末端を介して、前記Fcパートのヒンジ領域へと連結されており、前記CD3−Fabまたは前記ROR1−Fabのいずれかが、アミノ酸置換を含み、前記CD3−Fabが、クロスオーバーを含むことを特徴とする、請求項1のいずれかに記載の二特異性抗体。
- 前記CD3−Fabおよび前記ROR1−Fabが、それらのC末端を介して、前記Fcパートのヒンジ領域へと連結されている、1つのCD3−Fabと、1つのROR1−Fabと、Fcパートと、そのC末端により前記CD3−FabのN末端へと連結された第2のROR1−Fabとからなり、前記CD3−Fabが、クロスオーバーを含み、前記CD3−Fabまたは両方のROR1−Fabのいずれかが、アミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項6に記載の二特異性抗体。
- ROR1−Fab−Fc−CD3−Fab−ROR1−Fabからなり、両方のROR1−Fabが、アミノ酸置換を含み、前記CD3−Fabが、VL/VHクロスオーバーを含むことを特徴とする、請求項7に記載の二特異性抗体。
- それらのC末端を介して、前記Fcパートのヒンジ領域へと連結されている2つのROR1−Fabと、Fcパートと、そのC末端により1つのROR1−FabのN末端へと連結されているCD3−Fabとからなり、前記CD3−Fabが、クロスオーバーを含み、前記CD3−Fabまたは両方のROR1−Fabのいずれかが、アミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項1に記載の二特異性抗体。
- そのC末端を介して、前記Fcパートのヒンジ領域へと連結された、1つのCD3−Fabと、そのC末端により、前記CD3−FabのN末端へと連結されたROR1−Fabとからなり、前記CD3−Fabまたは前記ROR1−Fabのいずれかが、アミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- そのC末端を介して、前記Fcパートのヒンジ領域へと連結された、1つのROR1−Fabと、そのC末端により、前記ROR1−FabのN末端へと連結されたCD3−Fabとからなり、前記CD3−Fabまたは前記ROR1−Fabのいずれかが、アミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- 抗ROR1抗体MAB1のCDR配列を含むことを特徴とする、請求項1から11のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- 抗ROR1抗体MAB1のVHおよびVL配列を含むか、または抗ROR1抗体MAB1のVH、VL、CH1、およびCL配列を含む抗体であることを特徴とする、請求項1から12のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- ヒトCD3εに特異的に結合する抗体部分、好ましくは、前記Fab断片が、
a)配列番号12、13および14の重鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 H2C)の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHと、配列番号15、16および17の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 H2C)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLとを含むか、または、
b)配列番号23、24および25の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHを含み、前記可変ドメインVLが、配列番号26、27および28の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 CH2527)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLにより置きかえられていることを特徴とすることを特徴とする、請求項1から13のいずれか一項に記載の二特異性抗体。 - ヒトCD3εに特異的に結合する前記抗体部分が、
a)前記可変ドメインが、配列番号10および11(VHVL MAB CD3 H2C)の可変ドメインであるか、または、
b)前記可変ドメインが、配列番号21および22(VHVL MAB CD3 CH2527)の可変ドメインであることを特徴とすることを特徴とする、請求項1から14のいずれか一項に記載の二特異性抗体。 - ヒトROR1に特異的に結合する前記Fab断片が、重鎖CDR、配列番号7のCDR1H、配列番号8のCDR2H、配列番号9のCDR3Hを含む可変ドメインVHを含むことと、軽鎖CDR、配列番号3のCDR1L、配列番号4のCDR2L、配列番号5のCDR3Lを含む可変ドメインVLを含むこととを特徴とする(CDR MAB1)ことを特徴とする、請求項1から15のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- ヒトROR1に特異的に結合する前記Fab断片が、配列番号10のVHと配列番号11のVLとを含むことを特徴とする(VHVL MAB1)ことを特徴とする、請求項1から16のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- 前記定常ドメインCL内の124位における前記アミノ酸の置きかえに加えて、123位におけるアミノ酸が、リシン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により独立に置換されていることを特徴とする、請求項1から17のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- アミノ酸124がKであり、アミノ酸147がEであり、アミノ酸213がEであり、およびアミノ酸123がカッパ軽鎖についてはRであり、ラムダ軽鎖についてはKであることを特徴とする、請求項1から18のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- ヒトCD3ε、およびヒトROR1の細胞外ドメインに特異的に結合する二特異性抗体であって、ポリペプチド、配列番号37、配列番号38、配列番号39、および配列番号40からなる群、または、ポリペプチド、配列番号37、配列番号38、配列番号39、および配列番号41からなる群から選択される、重鎖および軽鎖のセットを含むことを特徴とする二特異性抗体。
- ヒトCD3εに特異的に結合する前記抗体部分内で、
a)配列番号12、13および14の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHにより、前記可変ドメインVHが置きかえられ、配列番号15、16および17の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLにより、前記可変ドメインVLが置きかえられること、または、
b)配列番号23、24および25の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHにより、前記可変ドメインVHが置きかえられ、配列番号26、27および28の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLにより、前記可変ドメインVLが置きかえられることを特徴とする、請求項20に記載の抗体。 - 一方の重鎖のCH3ドメインおよび他方の重鎖のCH3ドメインの各々が、抗体のCH3ドメインの間の、元の界面を含む界面において向かい合い、前記界面が、前記二特異性抗体の形成を促進するように変更されていることを特徴とし、前記変更が、
a)前記二特異性抗体内の前記他方の重鎖のCH3ドメインの前記元の界面と向かい合う、一方の重鎖のCH3ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のCH3ドメインの前記界面内に、前記他方の重鎖のCH3ドメインの前記界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のCH3ドメインが変更されていることと、
b)前記二特異性抗体内の前記第1のCH3ドメインの前記元の界面と向かい合う、前記第2のCH3ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、前記第2のCH3ドメインの前記界面内に、前記第1のCH3ドメインの前記界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、前記他方の重鎖のCH3ドメインが変更されていることと
を特徴とする、請求項1から21のいずれか一項に記載の抗体。 - ヒトIgG1 Fcパート内に、Pro329のグリシンもしくはアルギニンによるアミノ酸置換、ならびに/またはLeu234のアラニンによる置換およびLeu235のアラニンによる置換を含むことを特徴とする、請求項1から22のいずれか一項に記載の抗体。
- 構築物ROR1 Fab−Fc−CD3 Fab−ROR1 Fabであり、前記抗CD3ε抗体のFab断片内にVL/VHクロスオーバーを含むこと、ならびに、前記ヒトIgG1 Fcパート内に、Pro329のグリシンによるアミノ酸置換、Leu234のアラニンによるアミノ酸置換およびLeu235のアラニンによるアミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項23に記載の抗体。
- a)構築物ROR1 Fab−Fc−CD3 Fab−ROR1 Fabの抗体であること、
b)前記抗CD3ε抗体のFab断片内にVL/VHクロスオーバーを含むこと、
c)ヒトIgG1 Fcパートを含むこと、
d)前記Fcパート内に、Pro329のグリシンによる置換およびLeu234のアラニンによる置換およびLeu235のアラニンによる置換を含むこと、ならびに、
e)両方のROR1 Fabの定常ドメインCL内で、124位におけるアミノ酸がリシン(K)により置換されており、123位におけるアミノ酸がカッパ軽鎖についてはアルギニン(R)により置換されており、ラムダ軽鎖についてはリシン(K)により置換されており、前記定常ドメインCH1内で、147位におけるアミノ酸および213位におけるアミノ酸がグルタミン酸(E)により置換されていることを特徴とする、請求項1から22のいずれか一項に記載の抗体。 - 初代B−CLL細胞において、1nMの濃度で、37℃で2時間の間に内部化しないことを特徴とする、請求項1から25のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記二特異性抗体が、細胞ベースのアッセイにおいて、ROR1陽性初代B−CLL細胞を使用し、1nMの抗体濃度で使用した場合、37℃で2時間の間に内部化しないことを特徴とし、内部化しないとは、0時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出される前記二特異性抗体のROR1陽性初代B−CLL細胞への結合の際における平均蛍光強度(MFI)が、37℃で2時間のインキュベーション後の再測定のときに、50%を超えて低減しないか、好ましくは30%を超えて低減しないことを意味する、請求項1から26のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1から27のいずれか一項に記載の二特異性抗体を調製するための方法であって、
a)宿主細胞を、請求項1から27のいずれか一項に記載の抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換するステップと、
b)前記宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能とする条件下で培養するステップと、
c)前記抗体分子を、前記培養物から回収するステップと
を含む方法。 - 請求項1から27のいずれか一項に記載の抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1から27のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
- 医薬としての使用のための、請求項1から27のいずれか一項に記載の抗体、または請求項30に記載の医薬組成物。
- 慢性リンパ球性白血病(CLL)、ヘアリー細胞白血病(HCL)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、辺縁帯リンパ腫(MZL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、多発性骨髄腫(MM)、濾胞性リンパ腫(FL)、および潜在的に、腫瘍細胞の表面上にROR1を有する他の血液悪性腫瘍を含むROR1陽性血液悪性腫瘍の処置における医薬としての使用のため、ならびに乳がんおよび肺がんなどのROR1陽性固形腫瘍の処置のための、請求項1から27のいずれか一項に記載の抗体、または請求項30に記載の医薬組成物。
- 多発性骨髄腫の処置における医薬としての使用のための、請求項1から27のいずれか一項に記載の抗体、または請求項30に記載の医薬組成物。
- B細胞系系統の慢性リンパ球性白血病(CLL)(B−CLL)の処置のため、および多発性骨髄腫MMのような形質細胞障害、またはROR1を発現する他のB細胞障害の処置における医薬としての使用のための、請求項1から27のいずれか一項に記載の抗体、または請求項30に記載の医薬組成物。
- 卵巣がん、肺がん、乳がん、胃がん、および膵がんからなる群から選択される疾患の処置における医薬としての使用のための、請求項1から27のいずれか一項に記載の抗体、または請求項30に記載の医薬組成物。
- 卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、請求項1から27のいずれか一項に記載の抗体、または請求項30に記載の医薬組成物。
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