JP2018090627A - フィラグリン遺伝子発現促進剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】皮膚の保湿機能の向上に関与する新規のフィラグリン遺伝子の発現を促進する物質の提供。【解決手段】フィラグリン遺伝子が約24時間周期のリズム性を持って発現が増減していることを見出し、候補物質を添加後、発現が最大となる時間において候補物質をスクリーニングし、サンショウエキス、3-(1'-ピペリジン)-プロピオン酸、ゼラニウムオイル、サイプレスオイル、ローズオイル、ガルバナムオイル、ペッパーオイル、バジルオイル、o-トルイル酸メチル、メチルアンスラニレート、ジメチルアンスラニレートをフィラグリン遺伝子発現促進剤として同定した。【選択図】図1
Description
本発明は、化粧料及び皮膚外用剤に関し、より具体的には、皮膚の保湿機能の向上に関与するフィラグリン遺伝子の発現促進剤に関する。
皮膚の角層は生体を被覆し、水分の保持や異物の侵入に対する防御を行っている。角層は表皮角化細胞が産生するケラチン(keratin)やフィラグリン(filaggrin)などの蛋白質や脂質など様々な物質から構成されている。フィラグリンはケラチン線維を層状に束ねてケラチンパターンと呼ばれる構造を作るのに重要な役割を担っており、フィラグリン遺伝子(FLG)によってコードされる前駆物質であるプロフィラグリンから角化に伴ってフィラグリンが産生され、ケラチン線維を凝集させる。さらに、フィラグリンは角質上層で分解されて天然保湿因子と呼ばれる低分子ペプチドやアミノ酸となり、保湿や紫外線吸収に関与する。
この様にフィラグリンは皮膚の角層の保湿やバリア機能に深く関与しており、フィラグリン産生の低下は尋常性魚鱗癬、アトピー性皮膚炎、老人性乾皮症などの乾燥性皮膚疾患の発症に関与している(非特許文献1)。健康で美しい肌状態を維持するには、フィラグリンが適切に産生されて、角化が適切なサイクルで継続される必要がある。
このような背景から、フィラグリン合成を促進する物質について研究がなされており、これまでにフィラグリン合成促進効果を有する物質としては、ワイルドタイム抽出物、チョウジ抽出物、サルビア抽出物などの植物抽出物などが既に知られている(特許文献1)。また、ある種の細菌が浸透圧を調節するために蓄積するエクトインが、乾燥によるフィラグリンの低下を抑えることも知られている(特許文献2)。
Morar N. et.al. Filaggrin mutations in children with severe atopic dermatitis. Journal of Investigative Dermatology, 127, 1667-1672, 2007
Akashi, M., et al. Noninvasive method for assessing the humancircadian clock using hair follicle cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107(35), 15643-15648, 2010.
上述のようにより高いフィラグリン合成促進効果を有する物質に対する消費者の要望は強く、新規のフィラグリン合成促進剤の開発が求められている。したがって、本発明の課題は、新規のフィラグリン遺伝子の発現を促進する物質を提供することである。
本発明者らが、フィラグリン遺伝子の発現について鋭意研究を行ったところ、驚くべきことにフィラグリン遺伝子が約24時間周期のリズム性を持って発現が増減していることを初めて見出した。従って、従来技術で行われていた様に、フィラグリン産生を促進して健常な皮膚状態を維持するためには、単純にフィラグリン産生を高めたり、乾燥によるフィラグリン産生の低下を抑制したりするのみならず、リズム性を考慮してフィラグリン産生を促進させることが重要であることを見出した。そこで、リズム性を考慮して、候補物質をフィラグリン遺伝子発現促進作用についてスクリーニングを行った結果、本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤を発明するに至った。
フィラグリン遺伝子発現促進効果を有する薬剤として、サンショウエキス、3-(1'-ピペリジン)-プロピオン酸、ゼラニウムオイル、サイプレスオイル、ローズオイル、ガルバナムオイル、ペッパーオイル、バジルオイル、o-トルイル酸メチル、メチルアンスラニレート、及びジメチルアンスラニレートが、本発明者らによりスクリーニングされた。
したがって、本発明は、サンショウエキス、3-(1'-ピペリジン)-プロピオン酸、ゼラニウムオイル、サイプレスオイル、ローズオイル、ガルバナムオイル、ペッパーオイル、バジルオイル、o-トルイル酸メチル、メチルアンスラニレート、及びジメチルアンスラニレートからなる群から選ばれる1以上を含む、フィラグリン遺伝子発現促進剤に関する。
さらに、本発明は、フィラグリン遺伝子が約24時間周期のリズム性を持って発現が増減しているとの知見に基づき、フィラグリン遺伝子発現量の生体リズムと、フィラグリン遺伝子発現促進剤の投与により生じるフィラグリン遺伝子発現量のリズムとが同期するタイミングでフィラグリン遺伝子発現促進剤を投与する美容方法にも関する。さらに本発明は、フィラグリン遺伝子発現量の生体リズムと、フィラグリン遺伝子発現促進剤の投与により生じるフィラグリン遺伝子発現量のリズムとが同期するタイミングでフィラグリン遺伝子発現促進剤を投与されるように用いられることを特徴とする、フィラグリン遺伝子発現促進剤や、フィラグリン遺伝子発現量の生体リズムが乱れている対象において、フィラグリン遺伝子発現促進剤の投与により、フィラグリン遺伝子発現量のリズムを回復させるタイミングで、当該フィラグリン遺伝子発現促進剤を投与されるように用いられることを特徴とする、フィラグリン遺伝子発現促進剤にも関する。
本発明に係るフィラグリン遺伝子発現促進剤は、以下に列挙される効果:
フィラグリン遺伝子の発現促進;
皮膚バリア機能の亢進;及び
保湿
のうち少なくとも1以上の効果を有する。
フィラグリン遺伝子の発現促進;
皮膚バリア機能の亢進;及び
保湿
のうち少なくとも1以上の効果を有する。
本発明は、サンショウエキス、3-(1'-ピペリジン)-プロピオン酸、ゼラニウムオイル、サイプレスオイル、ローズオイル、ガルバナムオイル、ペッパーオイル、バジルオイル、o-トルイル酸メチル、メチルアンスラニレート、及びジメチルアンスラニレートからなる群から選ばれる1以上を含む、フィラグリン遺伝子発現促進剤に関する。フィラグリン遺伝子発現促進剤としては、上記の列挙された物質が単独で用いられてもよいし、組み合わせて用いられてもよい。より好ましくは、本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤として、サンショウエキスが選択される。さらにより好ましくは、フィラグリン遺伝子発現促進剤として、サンショウエキスと3-(1'-ピペリジン)-プロピオン酸との組み合わせが選択される。
別の態様では、本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤は、既に知られている他のフィラグリン遺伝子発現促進効果を有する薬剤、例えばワイルドタイム抽出物、チョウジ抽出物、サルビア抽出物又はエクトインをさらに含んでもよい。
本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤は、フィラグリン遺伝子の発現を促進することにより、フィラグリンの合成を促進することが可能である。より詳細に記載すると、フィラグリン遺伝子の発現により、プロフィラグリンの合成が促進され、プロフィラグリンがリン酸化を受け、そして角化する際に脱リン酸化及びペプチジルアルギニンデイミナーゼによる加水分解を経てフィラグリンが合成される。したがって、フィラグリン遺伝子発現促進剤は、プロフィラグリン遺伝子発現促進剤と呼ぶこともあり、フィラグリン遺伝子発現の促進を介してフィラグリンの合成を促進するフィラグリン合成促進剤であってもよい。
本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤は、フィラグリン合成を促進し、さらにはフィラグリンが分解されて産生する天然保湿因子(NMF)の主成分であるアミノ酸の増加をもたらすことができる。したがって、本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤は、天然保湿因子亢進剤又は保湿剤、さらに天然保湿因子を亢進することから皮膚バリア機能亢進剤であってもよく、化粧料に配合される。さらには本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤は、乾燥肌、並びに乾燥性の肌疾患、例えば老人性乾皮症、アトピー性皮膚炎、尋常性魚鱗癬などの皮膚疾患の治療剤となりうる。
本発明の1の態様では、本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤は、任意の経路により投与されてもよく、経口又は非経口(例えば、経皮、経粘膜、皮下、静脈内、腹腔内、経肺、筋肉内)のいずれにより投与されてもよい。経口投与としては、フィラグリン遺伝子促進剤は、錠剤、カプセル剤などに剤形されて投与されてもよいし、飲料やサプリメントとして投与されてもよい。経皮投与としては、化粧料又は皮膚外用剤に配合されて、皮膚に塗布することにより投与されてもよい。経肺投与として、フィラグリン遺伝子促進剤を溶解した溶液のミストとして、又は気化させて吸引することにより投与されてもよく、例えばアロマセラピーとして投与される。表皮細胞におけるフィラグリン遺伝子発現を促進する観点から、フィラグリン遺伝子発現促進剤は、経皮投与されることが好ましい。
本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤は、化粧料、医薬品、医薬部外品、外皮に適用される製品を指し、したがってその剤形も水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏系、クリーム、水−油二層系、水−油−粉末三層系など、幅広い形態をとり得る。例えば化粧料としては、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ジェル、美容液、軟膏、パック、入浴剤、ボディソープ、シャンプー、リンス、ファンデーションなどに適用可能である。医薬品又は医薬部外品であれば、各種の軟膏、クリームなどの形態に適用可能である。
本発明の化粧料及び/又は皮膚外用剤には、化粧料及び/又は皮膚外用剤の製造に一般に使用されうる有効成分及び/又は賦形剤を含んでもよく、例えば、水、アルコール、グリセリン、ヒアルロン酸などの基剤、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、pH調整剤、紫外線吸収剤、安定剤、抗菌剤、香料などが含まれてもよい。
図1に示されるように角化細胞の培養細胞系において、フィラグリン遺伝子は約24時間周期のリズムを持って発現が増減しており、このリズムは概日リズムに相当すると考えられる。概日リズムとは、特にCLOCK、BMAL1、CRY、PERなどの時計タンパク質により構成されるフィードバックループにより制御される約24時間周期の周期リズムであり、生体では、睡眠/覚醒、ホルモン分泌、体温、細胞周期など様々な生理現象に対してその影響を及ぼすことが知られている。
フィラグリン遺伝子は、in vivoにおいても概日リズムに沿って発現の増減が行われていると考えられることから、本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤は、概日リズムに合わせて投与すること、より具体的にはフィラグリン発現の最大期又は最小期が同期するように投与することにより、より効果的にフィラグリン合成を促進することが可能になる。
本発明の別の態様では、本発明は、フィラグリン遺伝子発現量の生体リズムと、フィラグリン遺伝子発現促進剤の投与により生じるフィラグリン遺伝子発現量のリズムとが同期するタイミングで、フィラグリン遺伝子発現促進剤を投与する美容方法にも関する。本発明において、美容方法とは、単に個人的に行われる方法のみならず、美容に関わる商品の提供の際に、顧客にあわせた化粧料の処方として提供され、医師以外の化粧料販売員やエステティシャンにより提供される。
本発明の別の態様では、本発明は、フィラグリン遺伝子発現量の生体リズムと、フィラグリン遺伝子発現促進剤の投与により生じるフィラグリン遺伝子発現量のリズムとが同期するタイミングで投与されるように用いられることを特徴とする、フィラグリン遺伝子発現促進剤に関する。
さらに別の態様では、本発明は、フィラグリン遺伝子発現の促進を必要とする対象において、フィラグリン遺伝子発現量の生体リズムと、フィラグリン遺伝子発現促進剤の投与により生じるフィラグリン遺伝子発現量のリズムとが同期するタイミングでフィラグリン遺伝子発現促進剤を投与する、フィラグリン遺伝子発現促進方法に関する。このフィラグリン遺伝子発現促進方法は、乾燥肌、並びに乾燥性の肌疾患、例えば老人性乾皮症、アトピー性皮膚炎、尋常性魚鱗癬などの皮膚疾患の治療方法でもある。
同期するタイミングで投与とは、フィラグリン遺伝子の発現量の生体リズムにおけるピークと、フィラグリン遺伝子発現促進剤投与により生じるフィラグリン遺伝子発現量の増減のピークとが重なるように投与することであり、例えばフィラグリン遺伝子発現量が最大となる16〜22時間、より具体的に17〜21時間、さらに具体的に18〜20時間前にフィラグリン遺伝子発現促進剤を投与することをいう。実際にヒトでは、フィラグリン遺伝子発現のピークは午前5時〜11時頃、より具体的には午前6〜10時、さらに具体的に午前7時〜9時であると推定されるので、例えばその16〜22時間、より具体的に17〜21時間、さらに具体的に18〜20時間前にフィラグリン遺伝子発現促進剤を投与することが好ましいと考えられる。例えば、16〜22時間前に相当する『午前7時〜午後1時頃』から『午後1時〜午後7時頃』の間に投与することが好ましいと考えられる。
本発明で明らかとなったようにフィラグリンは体内時計のリズムに従って発現しており、加齢やストレス、夜更かしや生活リズムの乱れなど何らかの原因で体内時計のリズムが乱れると、それに応じてフィラグリンの発現リズムがずれたり発現量が減少すると考えられる。したがって、本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤を適切なタイミングで投与することにより、フィラグリンの発現リズムの回復を促進したり、発現量を増加させることが期待できる。そこで、本発明の別の態様では、適切なタイミングで投与されることを特徴とする本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤は、フィラグリンの発現リズムの改善又は回復剤としても用いることができる。適切なタイミングについて、例えばヒトでは、フィラグリン遺伝子発現のピークは午前5時〜11時頃、より具体的には午前6〜10時、さらに具体的に午前7時〜9時であると推定されるので、その16〜22時間、より具体的に17〜21時間、さらに具体的に18〜20時間前にフィラグリン遺伝子発現促進剤を投与することが好ましいと考えられる。
フィラグリン遺伝子が約24時間の周期性を有して増減することから、フィラグリン遺伝子発現促進剤のスクリーニングにおいては、培養角化細胞などの培養細胞に対し、候補薬剤の投与後約0〜10時間、好ましくは2〜8時間、より好ましくは4〜6時間の発現最小期のフィラグリン遺伝子発現量と、16〜22時間、好ましくは17〜21時間、より好ましくは18〜20時間の発現最大期のフィラグリン遺伝子発現量を比較することにより、より高精度にフィラグリン遺伝子発現促進剤をスクリーニングすることが可能になる。さらに別の態様では、発現最大期のフィラグリン遺伝子発現量を指標としてフィラグリン遺伝子発現促進剤のスクリーニングが可能となる。さらに別の態様では、2周期目以降の発現最大期、例えば40〜48時間、64〜72時間などを指標としてフィラグリン遺伝子発現促進剤をスクリーニングすることもできる。
本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤の効果薬剤の一つであるゼラニウムオイルは、ゼラニウム(Pelargonium graveolens)などのテンジクアオイ属の全草由来の精油であり、例えば上記テンジクアオイ属の全草を水蒸気蒸留して得られる精油である。
本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤の効果薬剤の一つであるサイプレスオイルは、サイプレス(Cupressus sempervirens)由来の精油であり、例えばサイプレスの枝葉などを水蒸気蒸留して得られる精油である。
本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤の効果薬剤の一つであるローズオイルは、キャベッジ・ローズ(Rosa centifolia L)やダマスク・ローズ(Rosa damascena Mill.) などのバラ属の花弁由来の精油であり、例えば上記バラ属の花弁を水蒸気蒸留して得られる精油である。
本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤の効果薬剤の一つであるガルバナムオイルは、セリ科のFerula galbaniflua および近縁種の葉や芽から浸出するゴム状の浸出物由来の精油であり、例えば水蒸気蒸留して得られる精油である。
本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤の効果薬剤の一つであるペッパーオイルは、コショウ科に属する多年生植物であるペッパー(Piper nigrum L.)の漿果由来の精油であり、例えば漿果を水蒸気蒸留して得られる精油である。
本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤の効果薬剤の一つであるバジルオイルは、シソ科の一年草であるバジル(Ocimum basilicum L.)の地上部全草由来の精油であり、例えば地上全草を水蒸気蒸留して採取される精油である。
本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤の効果薬剤の一つであるサンショウエキスは、ミカン科サンショウ属のサンショウ(Zanthoxylum piperitum)の抽出物である。本発明サンショウエキスは、常法により得ることができ、例えばサンショウの葉、茎、根、花、果実、果皮、果核、全草、又はそれらの混合物を抽出溶媒とともに浸漬または加熱還流した後、濾過し、濃縮して得ることができる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、含水アルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン等の有機溶媒等を、それぞれ単独あるいは組み合わせて用いることができる。また、必要に応じて、上記溶媒で抽出した得た抽出液をそのまま、あるいは濃縮したエキスを、吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー(例えばアンバーライトXAD−2)のカラムにて吸着させた後、メタノールまたはエタノールで溶出し、濃縮したものも使用することができる。また分配法、例えば水/酢酸エチルで抽出した抽出物等も用いることができる。皮膚に直接適用する化粧料又は医薬品、例えば皮膚外用剤などに用いる観点から、低刺激性の溶媒、例えば水、1,3−ブチレングリコール、グリセリンなどを用いて抽出された抽出物が好ましい。
精油とは、植物に含まれる水に不溶〜難溶性の有機化合物の混合物であり、一般に揮発性の有機化合物を含み、原料に応じて芳香性を有する。精油は、植物に含まれる水に不溶〜難溶性の有機化合物の混合物であるため、水蒸気蒸留によって一般的に生成される。しかしながら、本発明において、精油は、水蒸気蒸留により生成した混合物に限ることを意図しておらず、植物体の一部を原料とし、有機溶媒で抽出される水に不溶〜難溶性の抽出物も包含することを意図している。すなわち、本発明において「精油」とは、原料として使用される植物(及び場合によってその部位)により特定された有機化合物の混合物であって、本発明の所望の効果、すなわちフィラグリン遺伝子発現促進作用を有する有機化合物の混合物を指す。
本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤の効果薬剤の一つであるo-トルイル酸メチル(Methyl o-toluate、英語別名METHYL 2-METHYLBENZOATE)は分子式C9H10O2、分子量150.17の常温で液体の化合物である。
本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤の効果薬剤の一つであるメチルアンスラニレート(Methyl anthranilate、英語別名METHYL 2-AMINOBENZOATE)は分子式C8H9O2N、分子量151.17の常温で液体の化合物である。
本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤の効果薬剤の一つであるジメチルアンスラニレート(Methyl N-METHYL ANTHRANILATE、英語別名2-Methyl AMINO METHYL BENZOATE)は分子式C9H11O2N、分子量165.20の常温で液体の化合物である。
本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤の効果薬剤の一つである3-(1'-ピペリジン)-プロピオン酸(3-(1'-piperidine)-propionic acid:1PP)は、分子式C8H15NO2、分子量157.21、常温で固体の化合物である。
実施例1:ヒト皮膚由来角化細胞におけるフィラグリン遺伝子発現の検討
市販の正常成人皮膚由来角化細胞(Cellntec社)を3×103個/cm2となるように培養プレートに播種し、上皮細胞用培地(CnT-BM.1、Cellntec社)中で37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。3日後、コルチゾール50ng/mLを含む培地に交換し、37℃、5%CO2で同調培養を行なった。2時間後、通常培地に交換して培養を続け、経時的に細胞を採取した。採取した細胞から、市販のRNA抽出−cDNA合成キット(FastLane Cell cDNA Kit, Qiagen社)を用いてRNAを抽出し、cDNAを調製した。このcDNAを用いて定量PCR(QPCR)法によりフィラグリン遺伝子の発現量を測定した。同時に時計遺伝子PER3とBMAL1の発現量を測定し、フィラグリン遺伝子の発現リズムと比較した。QPCR法には市販のQPCR試薬キット(Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Kit、Agilent社)とQPCR測定装置(MX-3000P Real-time Quantitative PCR System、Agilent社)を用いた。内部標準としてハウスキーピング遺伝子であるRPLP0遺伝子の発現量を定量し、RPLP0に対する相対発現量を算出してフィラグリン遺伝子発現量とした。PCR用プライマーには市販のフィラグリン、PER3、BMAL1、RPLP0用プライマー(Perfect Real Time Primer、タカラバイオ社)を用いた。表1に使用したプライマー配列を示す。
市販の正常成人皮膚由来角化細胞(Cellntec社)を3×103個/cm2となるように培養プレートに播種し、上皮細胞用培地(CnT-BM.1、Cellntec社)中で37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。3日後、コルチゾール50ng/mLを含む培地に交換し、37℃、5%CO2で同調培養を行なった。2時間後、通常培地に交換して培養を続け、経時的に細胞を採取した。採取した細胞から、市販のRNA抽出−cDNA合成キット(FastLane Cell cDNA Kit, Qiagen社)を用いてRNAを抽出し、cDNAを調製した。このcDNAを用いて定量PCR(QPCR)法によりフィラグリン遺伝子の発現量を測定した。同時に時計遺伝子PER3とBMAL1の発現量を測定し、フィラグリン遺伝子の発現リズムと比較した。QPCR法には市販のQPCR試薬キット(Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Kit、Agilent社)とQPCR測定装置(MX-3000P Real-time Quantitative PCR System、Agilent社)を用いた。内部標準としてハウスキーピング遺伝子であるRPLP0遺伝子の発現量を定量し、RPLP0に対する相対発現量を算出してフィラグリン遺伝子発現量とした。PCR用プライマーには市販のフィラグリン、PER3、BMAL1、RPLP0用プライマー(Perfect Real Time Primer、タカラバイオ社)を用いた。表1に使用したプライマー配列を示す。
結果を図1と図2に示した。角化細胞の培養細胞系において、フィラグリン遺伝子は約24時間周期のリズムを持って発現が増減しており、培養角化細胞ではコルチゾールによる同調培養を開始してから約18時間後にフィラグリン遺伝子の発現量が最大となることを見出した。このリズムは概日リズムに相当すると考えられる。また、フィラグリン遺伝子の発現リズムは時計遺伝子PER3の発現リズムと同位相であり、BMAL1とは逆位相であった。実際にヒトではPER3の発現ピークは午前5〜11時、より具体的に午前6〜10時、さらに具体的に午前7〜9時頃であることが報告されている(非特許文献2)。図2に記載したPER3の発現ピーク時間とフィラグリン遺伝子の発現ピーク時間の比較から、ヒトでのフィラグリン遺伝子の発現ピークはPER3の発現ピークとほぼ同じであると推察される。
実施例2 フィラグリン遺伝子発現を促進させる薬剤のスクリーニング
市販の正常成人皮膚由来角化細胞(Cellntec社)を3x103個/cm2となるように培養プレートに播種し、上皮細胞用培地(CnT-BM.1、Cellntec社)中で37℃、5%CO2で培養した。3日後、各種候補薬剤を1%濃度となるように添加した培地に交換して、37℃、5%CO2で培養を続け、2時間後と18時間後に細胞を採取した。候補薬剤として、サンショウエキス(丸善製薬社)、ゼラニウムオイル(香栄興業社)、サイプレスオイル(ビオランド社)、ローズオイル(ビオランド社)、ガルバナムオイル(ビオランド社)、ペッパーオイル(ビオランド社)、バジルオイル(ビオランド社)、o-トルイル酸メチル(アルドリッチ社)、メチルアンスラニレート(東京化成工業社)、ジメチルアンスラニレート(東京化成工業社)、クローブ・バッドカリオフィラータオイル(ビオランド社)、アルニカ(香栄興業社)を添加した。薬剤未添加を対照に、コルチゾール(培地中濃度50ng/mL)を陽性対照とした。
市販の正常成人皮膚由来角化細胞(Cellntec社)を3x103個/cm2となるように培養プレートに播種し、上皮細胞用培地(CnT-BM.1、Cellntec社)中で37℃、5%CO2で培養した。3日後、各種候補薬剤を1%濃度となるように添加した培地に交換して、37℃、5%CO2で培養を続け、2時間後と18時間後に細胞を採取した。候補薬剤として、サンショウエキス(丸善製薬社)、ゼラニウムオイル(香栄興業社)、サイプレスオイル(ビオランド社)、ローズオイル(ビオランド社)、ガルバナムオイル(ビオランド社)、ペッパーオイル(ビオランド社)、バジルオイル(ビオランド社)、o-トルイル酸メチル(アルドリッチ社)、メチルアンスラニレート(東京化成工業社)、ジメチルアンスラニレート(東京化成工業社)、クローブ・バッドカリオフィラータオイル(ビオランド社)、アルニカ(香栄興業社)を添加した。薬剤未添加を対照に、コルチゾール(培地中濃度50ng/mL)を陽性対照とした。
採取した細胞から、市販のRNA抽出−cDNA合成キット(FastLane Cell cDNA Kit, Qiagen社)を用いてRNAを抽出し、cDNAを調製した。このcDNAを用いて定量PCR(QPCR)法によりフィラグリン遺伝子の発現量を測定した。QPCR法には市販のQPCR試薬キット(Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Kit、Agilent社)とQPCR測定装置(MX-3000P Real-time Quantitative PCR System、Agilent社)を用いた。内部標準としてハウスキーピング遺伝子であるRPLP0遺伝子の発現量を定量し、RPLP0に対する相対発現量を算出してフィラグリン遺伝子発現量とした。PCR用プライマー配列は表1に示したものを用いた。
図3に各種候補薬剤を添加して2時間後、18時間後のフィラグリン遺伝子の発現量を示した。サンショウエキス、ゼラニウムオイル、サイプレスオイル、ローズオイル、ガルバナムオイル、ペッパーオイル、バジルオイル、o-トルイル酸メチル、メチルアンスラニレート、ジメチルアンスラニレートが、対照に比べて18時間後のフィラグリン遺伝子の発現を促進させることが示された。一方で、クローブ・バッド、及びアルニカでは、18時間後におけるフィラグリン遺伝子は増加しているものの、その増加量は、コントロールと有意な差が無いものであった。
実施例3 フィラグリン遺伝子の発現を促進させる薬剤
市販の正常成人皮膚由来角化細胞(Cellntec社)を3x103個/cm2となるように培養プレートに播種し、上皮細胞用培地(CnT-BM.1、Cellntec社)中で37℃、5%CO2で培養した。3日後、3-(1'-ピペリジン)-プロピオン酸(1PP:有機合成工業社)を0.1%、サンショウエキスを0.1%、並びに1PPを0.1%及びサンショウエキスを0.1%の濃度となるように添加した培地に交換して、37℃、5%CO2で培養を続け、18時間後に細胞を採取した。薬剤未添加を対照として用いた。
市販の正常成人皮膚由来角化細胞(Cellntec社)を3x103個/cm2となるように培養プレートに播種し、上皮細胞用培地(CnT-BM.1、Cellntec社)中で37℃、5%CO2で培養した。3日後、3-(1'-ピペリジン)-プロピオン酸(1PP:有機合成工業社)を0.1%、サンショウエキスを0.1%、並びに1PPを0.1%及びサンショウエキスを0.1%の濃度となるように添加した培地に交換して、37℃、5%CO2で培養を続け、18時間後に細胞を採取した。薬剤未添加を対照として用いた。
採取した細胞から、市販のRNA抽出−cDNA合成キット(FastLane Cell cDNA Kit, Qiagen社)を用いてRNAを抽出し、cDNAを調製した。このcDNAを用いて定量PCR(QPCR)法によりフィラグリン遺伝子の発現量を測定した。QPCR法には市販のQPCR試薬キット(Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Kit、Agilent社)とQPCR測定装置(MX-3000P Real-time Quantitative PCR System、Agilent社)を用いた。内部標準としてハウスキーピング遺伝子であるRPLP0遺伝子の発現量を定量し、RPLP0に対する相対発現量を算出してフィラグリン遺伝子発現量とした。PCR用プライマー配列は表1に示したものを用いた。結果を図4に示す。1PPは、0.1%で、サンショウエキス0.1%と同等のフィラグリン遺伝子の発現促進効果を有し、さらにサンショウエキスと1PPとを併用することにより、フィラグリン遺伝子の発現がさらに促進した。
配合例
以下、本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤の配合例を示すが、本発明の実施は以下に限定されるものではない。
以下、本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤の配合例を示すが、本発明の実施は以下に限定されるものではない。
フレグランス
(1)アルコール 75.0
(2)精製水 残余
(3)ジプロピレングリコール 5.0
(4)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:ローズオイル 10.0
(5)酸化防止剤 8.0
(6)色素 適量
(7)紫外線吸収剤 適量
(1)アルコール 75.0
(2)精製水 残余
(3)ジプロピレングリコール 5.0
(4)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:ローズオイル 10.0
(5)酸化防止剤 8.0
(6)色素 適量
(7)紫外線吸収剤 適量
ルームフレグランス
(1)アルコール 80.0
(2)精製水 残余
(3)酸化防止剤 5.0
(4)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:サイプレスオイル 3.0
(5)3−メチルー3メトキシブタノール 5.0
(6)ジベンジリデンソルビトール 5.0
(1)アルコール 80.0
(2)精製水 残余
(3)酸化防止剤 5.0
(4)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:サイプレスオイル 3.0
(5)3−メチルー3メトキシブタノール 5.0
(6)ジベンジリデンソルビトール 5.0
インセンス
(1)タブ粉 75.5
(2)安息香酸ナトリウム 15.5
(3)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:ガルバナムオイル 5.0
(4)ユーカリオイル 1.0
(5)精製水 残余
(1)タブ粉 75.5
(2)安息香酸ナトリウム 15.5
(3)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:ガルバナムオイル 5.0
(4)ユーカリオイル 1.0
(5)精製水 残余
入浴剤
(1)硫酸ナトリウム 45.0
(2)炭酸水素ナトリウム 45.0
(3)ラベンダーオイル 9.0
(4)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:メチルアンスラニレート 1.0
(1)硫酸ナトリウム 45.0
(2)炭酸水素ナトリウム 45.0
(3)ラベンダーオイル 9.0
(4)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:メチルアンスラニレート 1.0
マッサージ用ジェル
(1)エリスリトール 2.0
(2)カフェイン 5.0
(3)オウバク抽出物 3.0
(4)グリセリン 50.0
(5)カルボキシビニルポリマー 0.4
(6)ポリエチレングリコール400 30.0
(7)エデト3ナトリウム 0.1
(8)ポリオキシレン(10)メチルポリシロキサン共重合体 2.0
(9)スクワラン 1.0
(10)水酸化カリウム 0.15
(11)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:ゼラニウムオイル 1.0
(1)エリスリトール 2.0
(2)カフェイン 5.0
(3)オウバク抽出物 3.0
(4)グリセリン 50.0
(5)カルボキシビニルポリマー 0.4
(6)ポリエチレングリコール400 30.0
(7)エデト3ナトリウム 0.1
(8)ポリオキシレン(10)メチルポリシロキサン共重合体 2.0
(9)スクワラン 1.0
(10)水酸化カリウム 0.15
(11)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:ゼラニウムオイル 1.0
マッサージクリーム
(1)固形パラフィン 5.0
(2)ミツロウ 10.0
(3)ワセリン 15.0
(4)流動パラフィン 41.0
(5)1.3−ブチレングリコール 4.0
(6)モノステアリン酸グリセリン 2.0
(7)POE(20)ソルビタンモノラウリン酸エステル 2.0
(8)ホウ砂 0.2
(9)カフェイン 2.0
(10)防腐剤 適量
(11)酸化防止剤 適量
(12)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:サンショウエキス 1.0
(13)精製水 残余
(1)固形パラフィン 5.0
(2)ミツロウ 10.0
(3)ワセリン 15.0
(4)流動パラフィン 41.0
(5)1.3−ブチレングリコール 4.0
(6)モノステアリン酸グリセリン 2.0
(7)POE(20)ソルビタンモノラウリン酸エステル 2.0
(8)ホウ砂 0.2
(9)カフェイン 2.0
(10)防腐剤 適量
(11)酸化防止剤 適量
(12)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:サンショウエキス 1.0
(13)精製水 残余
芳香性繊維
キュプロアンモニウムセルロース溶液(セルロース濃度10重量%、アンモニウム濃度7重量%、銅濃度3.6重量%)に、本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤を内包したマイクロカプセル(粒子径50μm以下、マイクロカプセルに占める剤の割合は50重量%)をセルロース重量に対して0.1〜20重量%の範囲内で添加、混和した後、通常の湿式紡糸方法に従って紡糸し、精錬工程、乾燥工程を経て、芳香性繊維を得た。
キュプロアンモニウムセルロース溶液(セルロース濃度10重量%、アンモニウム濃度7重量%、銅濃度3.6重量%)に、本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤を内包したマイクロカプセル(粒子径50μm以下、マイクロカプセルに占める剤の割合は50重量%)をセルロース重量に対して0.1〜20重量%の範囲内で添加、混和した後、通常の湿式紡糸方法に従って紡糸し、精錬工程、乾燥工程を経て、芳香性繊維を得た。
顆粒
(1)スクラロース 0.1
(2)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:サンショウエキス 0.1
(3)香味料 5.0
(4)賦形剤(セオラス) 10.0
(5)マルチトール 残余
(1)スクラロース 0.1
(2)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:サンショウエキス 0.1
(3)香味料 5.0
(4)賦形剤(セオラス) 10.0
(5)マルチトール 残余
錠剤(チュアブルタイプ)
(1)イノシトール 11.0
(2)マルチトール 21.0
(3)スクロース 0.5
(4)鮭白子抽出物(DNA Na) 0.1
(5)酵母抽出物 0.1
(6)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:バジルオイル 0.1
(7)香味料 5.0
(8)賦形剤 残余
(1)イノシトール 11.0
(2)マルチトール 21.0
(3)スクロース 0.5
(4)鮭白子抽出物(DNA Na) 0.1
(5)酵母抽出物 0.1
(6)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:バジルオイル 0.1
(7)香味料 5.0
(8)賦形剤 残余
タブレット
(1)潤沢剤(ショ糖脂肪酸エステル等) 1.0
(2)アラビアガム水溶液(5%) 2.0
(3)酸味料 1.0
(4)着色料 適量
(5)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:ペッパーオイル 0.1
(6)糖質(粉糖またはソルビトール等) 残余
(1)潤沢剤(ショ糖脂肪酸エステル等) 1.0
(2)アラビアガム水溶液(5%) 2.0
(3)酸味料 1.0
(4)着色料 適量
(5)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:ペッパーオイル 0.1
(6)糖質(粉糖またはソルビトール等) 残余
キャンディー
(1)砂糖 50.0
(2)水飴 47.95
(3)有機酸 2.0
(4)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:ローズオイル 0.05
(1)砂糖 50.0
(2)水飴 47.95
(3)有機酸 2.0
(4)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:ローズオイル 0.05
ガム
(1)砂糖 43.0
(2)ガムベース 30.95
(3)グルコース 10.0
(4)水飴 16.0
(5)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:バジルオイル 0.05
(1)砂糖 43.0
(2)ガムベース 30.95
(3)グルコース 10.0
(4)水飴 16.0
(5)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:バジルオイル 0.05
化粧水
(1)1,3−ブチレングリコール 6.0
(2)グリセリン 4.0
(3)オレイルアルコール 0.1
(4)POE(20)ソルビタンモノラウリン酸エステル 0.5
(5)POE(15)ラウリルアルコールエステル 0.5
(6)エタノール 10.0
(7)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:3-(1'-ピペリジン)-プロピオン酸
1.0
(8)精製水 残余
(1)1,3−ブチレングリコール 6.0
(2)グリセリン 4.0
(3)オレイルアルコール 0.1
(4)POE(20)ソルビタンモノラウリン酸エステル 0.5
(5)POE(15)ラウリルアルコールエステル 0.5
(6)エタノール 10.0
(7)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:3-(1'-ピペリジン)-プロピオン酸
1.0
(8)精製水 残余
乳液
(1)マイクロクリスタリンワックス 1.0
(2)ミツロウ 2.0
(3)ラノリン 20.0
(4)流動パラフィン 10.0
(5)スクワラン 5.0
(6)POE(20)ソルビタンモノオレイン酸エステル 1.0
(7)プロピレングリコール 7.0
(8)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:3-(1'-ピペリジン)-プロピオン酸
0.5
(9)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:サンショウエキス 0.1
(10)亜硫酸水素ナトリウム 0.01
(11)エチルパラベン 0.3
(12)香料 適量
(13)精製水 残余
(1)マイクロクリスタリンワックス 1.0
(2)ミツロウ 2.0
(3)ラノリン 20.0
(4)流動パラフィン 10.0
(5)スクワラン 5.0
(6)POE(20)ソルビタンモノオレイン酸エステル 1.0
(7)プロピレングリコール 7.0
(8)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:3-(1'-ピペリジン)-プロピオン酸
0.5
(9)本発明のフィラグリン遺伝子発現促進剤:サンショウエキス 0.1
(10)亜硫酸水素ナトリウム 0.01
(11)エチルパラベン 0.3
(12)香料 適量
(13)精製水 残余
Claims (2)
- サンショウエキス及び3-(1'-ピペリジン)-プロピオン酸を含む、フィラグリン遺伝子発現促進剤。
- フィラグリン遺伝子発現量の生体リズムと、サンショウエキス及び3-(1'-ピペリジン)-プロピオン酸を含むフィラグリン遺伝子発現促進剤の投与により生じるフィラグリン遺伝子発現量のリズムとが同期するタイミングで、当該フィラグリン遺伝子発現促進剤を投与する、美容方法。
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