JP2017535285A - 改善されたｉｌ−６抗体 - Google Patents

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Abstract

改善されたＩＬ−６抗体が提供される。ＩＬ−６関連疾患、例えば、糖尿病性黄斑浮腫などの眼性疾患の処置におけるこれらの抗体の使用が開示される。一局面において、（ｉ）ＧＹＸ１ＬＸ２ＮＹＬＩＥ（配列番号４５）の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、（ｉｉ）ＶＸ３ＴＰＧＸ４ＧＴＩＮ（配列番号４６）の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）ＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗体または抗原結合性断片が提供され、以下：Ｘ１はＡではない、Ｘ２はＳではない、Ｘ３はＩではない、およびＸ４はＳではない、のうちの１つまたは複数が当てはまる。

Description

関連出願
この出願は、２０１４年１１月７日に出願された米国仮出願第６２／０７７，１０５号；２０１４年１２月４日に出願された米国仮出願第６２／０８７，４４８号；および２０１５年１０月２８日に出願された米国仮出願第６２／２４７，７０５号に対する優先権を主張する。これらの出願の各々の全体の内容は、参考として本明細書に援用される。
本発明の分野は、ＩＬ−６に関する。より詳細には、本分野は、ＩＬ−６のモジュレーターおよび眼の疾患などの疾患を処置することにおけるそれらの使用に関する。
ＩＬ−６は、炎症、造血発生、血管形成、細胞分化および神経生存における報告された役割を有する多面的サイトカインである。本発明は、改善されたＩＬ−６抗体およびその使用に関する。
本発明は、ＩＬ−６抗体およびその断片（例えば、抗原結合性断片）または誘導体、ならびにＩＬ−６抗体および断片をコードする核酸に関する。本発明は、かかる抗体、断片または誘導体の使用にも関する。これらの抗体およびその断片または誘導体は、例えば、ＩＬ−６関連疾患の処置において使用され得る。実施形態では、この抗体、その断片または誘導体は、ＩＬ−６、例えばヒトＩＬ−６に結合し得る（例えば、特異的に結合し得る）。実施形態では、この抗体、その断片または誘導体は、ＩＬ−６の部位ＩＩ（例えば、ヒトＩＬ−６の部位ＩＩ）に結合し得る（例えば、特異的に結合し得る）。
一態様では、
（ｉ）ＧＹＸ１ＬＸ２ＮＹＬＩＥ（配列番号４５）の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＶＸ３ＴＰＧＸ４ＧＴＩＮ（配列番号４６）の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および
（ｉｉ）ＶＨ ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域を含む単離された抗体または抗原結合性断片が本明細書で提供され、ここで以下：Ｘ１はＡではない、Ｘ２はＳではない、Ｘ３はＩではない、およびＸ４はＳではない、のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３つまたは全て）が当てはまる。実施形態では、Ｘ１はＡではなく、Ｘ２はＳではなく、Ｘ３はＩではなく、Ｘ４はＳではない。
実施形態では、Ｘ１は、ＶまたはＶの保存的置換である。実施形態では、Ｘ２は、ＰまたはＰの保存的置換である。実施形態では、Ｘ３は、ＴまたはＴの保存的置換である。実施形態では、Ｘ４は、ＧまたはＧの保存的置換である。実施形態では、以下：Ｘ１は、ＶまたはＶの保存的置換である、Ｘ２は、ＰまたはＰの保存的置換である、Ｘ３は、ＴまたはＴの保存的置換である、およびＸ４は、ＧまたはＧの保存的置換である、のうちの１、２、３つまたは全てが当てはまる。実施形態では、Ｘ１は、ＶまたはＶの保存的置換であり、Ｘ２は、ＰまたはＰの保存的置換であり、Ｘ３は、ＴまたはＴの保存的置換であり、Ｘ４は、ＧまたはＧの保存的置換である。
実施形態では、Ｘ１は、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択される。実施形態では、Ｘ１は、Ｖ、ＩおよびＬから選択される。実施形態では、Ｘ２は、Ｐ、ＧおよびＡから選択される。実施形態では、Ｘ２は、ＰおよびＧから選択される。実施形態では、Ｘ３は、ＴおよびＳから選択される。実施形態では、Ｘ４は、ＧおよびＰから選択される。
実施形態では、以下：Ｘ１はＶである、Ｘ２はＰである、Ｘ３はＴである、およびＸ４はＧである、のうちの１または複数（例えば、１、２、３つまたは全て）が当てはまる。実施形態では、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＰであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＧである。
実施形態では、このＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３３の配列を含む。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ヒトＩＬ−６に対する増加した親和性および／または増加した効力を有する。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、以下：Ｘ１はＡである、Ｘ２はＳである、Ｘ３はＩである、およびＸ４はＳである、のうちの１または複数（例えば、１、２、３つまたは全て）が当てはまる配列を含む抗体または抗原結合性断片（例えば、他の点では同一の抗体または抗原結合性断片）と比較して、ヒトＩＬ−６に対する増加した親和性および／または増加した効力を有する。
一部の実施形態では、この単離された抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３１の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３２の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および任意選択で、配列番号３３の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む。
実施形態では、この重鎖可変領域は、配列番号１７と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列を含む。実施形態では、この重鎖可変領域は、配列番号１７と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一である配列からなるか、または配列番号１７とは５、４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸が異なる。実施形態では、この重鎖可変領域は、配列番号１７とは５、４、３、２または１個以下のアミノ酸が異なる。実施形態では、この重鎖可変領域は、配列番号１７とは１〜５個のアミノ酸が異なる。
実施形態では、この重鎖可変領域は、配列番号３７に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列を含む。実施形態では、この重鎖可変領域は、配列番号３７に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列からなる。実施形態では、この重鎖可変領域は、配列番号３７とは５、４、３、２または１個以下のアミノ酸が異なる。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号３７を含む重鎖可変領域配列を含む。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号３７からなる重鎖可変領域配列を含む。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号３９に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列を含む。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号３９とは５、４、３、２または１個以下のアミノ酸が異なる配列を含む。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号３９を含む。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、Ｆａｂである。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号５４に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列を含む。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号５４とは５、４、３、２または１個以下のアミノ酸が異なる配列を含む。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号５４を含む。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、Ｆａｂである。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ｓｃＦｖである。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ｓｃＦｖ配列
を含むまたはそれからなる。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号５２または配列番号５３に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列を含む。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号５２または配列番号５３を含む。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ｓｃＦｖである。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号４１に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である重鎖配列を含む。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号４１とは５、４、３、２または１個以下のアミノ酸が異なる重鎖配列を含む。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号４１を含む重鎖配列を含む。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号４１からなる重鎖配列を含む。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ＥＢＩ−０２９またはその断片と比較して、ヒトＩＬ−６に対する増加した親和性および／または増加した効力を有する。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号４の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および任意選択で、配列番号６の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む抗体または抗原結合性断片と比較して、ヒトＩＬ−６に対する増加した親和性および／または増加した効力を有する。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号１７を含むまたは配列番号１７からなる重鎖可変領域配列を含む抗体または抗原結合性断片と比較して、ヒトＩＬ−６に対する増加した親和性および／または増加した効力を有する。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号２４を含む抗体または抗原結合性断片と比較して、ヒトＩＬ−６に対する増加した親和性および／または増加した効力を有する。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号１１を含むまたは配列番号１１からなる重鎖配列を含む抗体または抗原結合性断片と比較して、ヒトＩＬ−６に対する増加した親和性および／または増加した効力を有する。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、表４に提供されるＥＢＩ−０３０またはＥＢＩ−０３１の１つまたは複数の配列を含む。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、図１５に示されるように、ＥＢＩ−０３０またはＥＢＩ−０３１の１つまたは複数のドメイン（例えば、重鎖配列のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ならびに／または軽鎖配列のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４およびＣＫのうち、１つまたは複数）を含む。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、重鎖および軽鎖を含む。実施形態では、この重鎖および軽鎖は、１つまたは複数のジスルフィド結合によって連結される。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、Ｆａｂである。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ｓｃＦｖである。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖまたはＦｖ断片である。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ＥＢＩ−０２９の１つもしくは複数の対応する配列、またはその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０７４９０５に記載される抗体の配列、を含む抗体または抗原結合性断片と比較して、ヒトＩＬ−６に対する増加した親和性および／または増加した効力を有する。実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、トシリズマブと比較して、ヒトＩＬ−６に対する増加した親和性および／または増加した効力を有する。
増加した親和性および／または増加した効力は、本明細書に記載される方法および／または当該分野で公知の方法を使用して評価され得る。
実施形態では、この親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して評価される。
実施形態では、この親和性は、少なくとも１．５、１．６、１．７、１．８．１．９、２、３または４倍増加する。
実施形態では、この効力は増加する。実施形態では、この効力は、ＩＣ５０における減少および／またはＩＣ９０における減少によって示されるように、増加する。実施形態では、このＩＣ５０は、多くとも１／５、１／１０、１／２０、１／３０、１／４０または１／５０に減少する。実施形態では、このＩＣ５０は、多くとも約１／５０に減少する。実施形態では、このＩＣ９０は、多くとも１／１０、１／２０、１／３０、１／４０、１／５０、１／６０、１／７０、１／８０、１／９０、１／１００、１／２００、１／３００、１／４００または１／５００に減少する。実施形態では、このＩＣ９０は、多くとも約１／１００に減少する。
実施形態では、この効力は、例えば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）アッセイまたはＴ１１６５増殖アッセイを使用することによって評価される。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、例えば、２０ｐＭの遊離ＩＬ−６を用いて本明細書に記載されるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）アッセイを使用して取得されたＩＣ５０またはＩＣ９０値に基づいて例えば評価されるように、シス−ＩＬ−６シグナル伝達を阻害する。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、４７ｐＭ未満のＩＣ５０および／または４３５０ｐＭ未満のＩＣ９０を有する。実施形態では、このＩＣ５０は、４７ｐＭ未満、例えば、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２または１ｐＭ未満である。実施形態では、このＩＣ９０は、４３５０ｐＭ未満、例えば、４０００、２０００、１０００、１００、５０、４０、３０、２０、１５、１０または５ｐＭ未満である。実施形態では、このＩＣ５０および／またはＩＣ９０は、２０ｐＭのＩＬ−６を用いてＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）アッセイで評価される。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、２０ｐＭのＩＬ−６を用いてＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）アッセイを使用して取得されたＩＣ５０値に基づいて例えば評価されるように、トシリズマブと比較して、より高い効力で遊離ＩＬ−６を遮断する。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、トシリズマブと比較して、９００倍を超える高い効力でＩＬ−６を阻害する。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ＥＢＩ−０３１またはその抗原結合性断片である。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ＩＬ−６の阻害について、１５ｐＭ未満のＩＣ５０、例えば、１４．２ｐＭのＩＣ５０を有する。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、例えば、２００ｐＭのハイパーＩＬ−６を用いて本明細書に記載されるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）アッセイを使用して例えば評価されるように、トランス−ＩＬ−６シグナル伝達を遮断する。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ハイパーＩＬ−６によるシグナル伝達を阻害する。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、トシリズマブよりも高い効力で、例えば、トシリズマブと比較して９００倍を超える高い効力で、ハイパーＩＬ−６によるシグナル伝達を阻害する。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、１μＭ未満のＩＣ５０で、ハイパーＩＬ−６によるシグナル伝達を阻害する。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、１ｎＭ未満のＩＣ５０で、ハイパーＩＬ−６によるシグナル伝達を阻害する。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、１００ｐＭ未満または５０ｐＭ未満のＩＣ５０で、例えば、約１４〜１５ｐＭのＩＣ５０で、ハイパーＩＬ−６によるシグナル伝達を阻害する。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ＥＢＩ−０３１またはその抗原結合性断片である。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、シス−ＩＬ−６シグナル伝達およびトランス−ＩＬ−６シグナル伝達を阻害する。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、例えば硝子体内投与後、少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間または６ヶ月間にわたって、眼においてＩＬ−６シグナル伝達を遮断するのに有効である。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、例えば硝子体内投与後、少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間または６ヶ月間にわたって、眼におけるＩＬ−６シグナル伝達の９５％を遮断する。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、約１５０日間にわたって、眼におけるＩＬ−６シグナル伝達の９５％を遮断する。
別の態様では、配列番号３７に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である重鎖可変領域配列を含む単離された抗体または抗原結合性断片が本明細書で提供され、前記重鎖配列は、Ｖ２８、Ｐ３０、Ｔ５１およびＧ５５（アミノ酸の番号付けは、配列番号４１に従う）から選択される１個または複数（例えば、１、２、３または４個）のアミノ酸を含む。
さらなる一態様では、配列番号３９に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列を含む単離された抗体または抗原結合性断片が本明細書で提供され、前記配列は、Ｖ２８、Ｐ３０、Ｔ５１およびＧ５５（アミノ酸の番号付けは、配列番号４１に従う）から選択される１個または複数（例えば、１、２、３または４個）のアミノ酸を含む。
さらなる一態様では、配列番号５４に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列を含む単離された抗体または抗原結合性断片が本明細書で提供され、前記配列は、Ｖ２８、Ｐ３０、Ｔ５１およびＧ５５（アミノ酸の番号付けは、配列番号４１に従う）から選択される１個または複数（例えば、１、２、３または４個）のアミノ酸を含む。
配列番号４１に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である重鎖配列を含む単離された抗体または抗原結合性断片もまた本明細書で提供され、前記重鎖配列は、Ｖ２８、Ｐ３０、Ｔ５１およびＧ５５（アミノ酸の番号付けは、配列番号４１に従う）から選択される１個または複数（例えば、１、２、３または４個）のアミノ酸を含む。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、対照抗体と比較して、例えば、ＥＢＩ−０２９またはその断片と比較して、ヒトＩＬ−６に対する増加した親和性を有する。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、Ｖ２８、Ｐ３０、Ｔ５１およびＧ５５から選択される前記１個または複数のアミノ酸を含まず、その代わりにＡ２８、Ｓ３０、Ｉ５１およびＳ５５から選択される１個または複数（例えば、１、２、３または４個）のアミノ酸を含むことを除いて他の点では同一である抗体または抗原結合性断片と比較して、ヒトＩＬ−６に対する増加した親和性を有する。実施形態では、この親和性は、少なくとも１．５、１．６、１．７、１．８．１．９、２、３または４倍増加する。実施形態では、この親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して評価される。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、対照抗体と比較して、例えば、ＥＢＩ−０２９またはその断片と比較して、増加した効力を有する。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、Ｖ２８、Ｐ３０、Ｔ５１およびＧ５５から選択される前記１個または複数のアミノ酸を含まず、その代わりにＡ２８、Ｓ３０、Ｉ５１およびＳ５５から選択される１個または複数（例えば、１、２、３または４個）のアミノ酸を含むことを除いて他の点では同一である抗体または抗原結合性断片と比較して、増加した効力を有する。
実施形態では、この効力は、ＩＣ５０における減少および／またはＩＣ９０における減少によって示されるように、増加する。実施形態では、このＩＣ５０は、多くとも１／５、１／１０、１／２０、１／３０、１／４０または１／５０に減少する。実施形態では、このＩＣ５０は、多くとも約１／５０に減少する。実施形態では、このＩＣ９０は、多くとも１／１０、１／２０、１／３０、１／４０、１／５０、１／６０、１／７０、１／８０、１／９０、１／１００、１／２００、１／３００、１／４００または１／５００に減少する。実施形態では、このＩＣ９０は、多くとも約１／１００に減少する。
実施形態では、この効力は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）アッセイまたはＴ１１６５増殖アッセイを使用して評価される。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、４７ｐＭ未満のＩＣ５０および／または４３５０ｐＭ未満のＩＣ９０を有する。実施形態では、このＩＣ５０は、４７ｐＭ未満、例えば、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２または１ｐＭ未満である。実施形態では、このＩＣ９０は、４３５０ｐＭ未満、例えば、４０００、２０００、１０００、１００、５０、４０、３０、２０、１５、１０または５ｐＭ未満である。実施形態では、このＩＣ５０および／またはＩＣ９０は、２０ｐＭのＩＬ−６を用いてＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）アッセイで評価される。
一部の実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、Ｖ２８、Ｐ３０、Ｔ５１およびＧ５５を含み、この抗体または抗原結合性断片は、Ａ２８、Ｓ３０、Ｉ５１およびＳ５５を含むことを除いて他の点では同一である抗体または抗原結合性断片と比較して、ヒトＩＬ−６に対する改善された親和性および／または改善された効力を示す。
実施形態では、本明細書に記載される抗体または抗原結合性断片は、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域またはその抗原結合性断片をさらに含む。
実施形態では、このＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号３４の配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号３５の配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号３６の配列を含む。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号３８に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である軽鎖可変領域配列をさらに含む。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号３８を含むか、または配列番号３８とは５、４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸が異なる、軽鎖可変領域配列をさらに含む。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号３８を含む軽鎖可変領域配列をさらに含む。実施形態では、この軽鎖可変領域配列は、配列番号３８からなる。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号４２に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である軽鎖配列をさらに含む。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号４２とは５、４、３、２または１個以下のアミノ酸が異なる軽鎖配列をさらに含む。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号４２を含む軽鎖配列をさらに含む。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号４２を含む軽鎖配列、または配列番号４２とは５、４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸が異なる配列をさらに含む。実施形態では、この軽鎖配列は、配列番号４２からなる。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、（ｉ）配列番号３１の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３２の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２および配列番号３３の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、ならびに（ｉｉ）配列番号３４の配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３５の配列を含むＶＬ ＣＤＲ１および配列番号３６の配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、を含む。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、６つ全てのＣＤＲ中に、変異、例えば、合計で多くても１、２または３つの変異を有することを除いて、上述のＣＤＲを含む。実施形態では、この変異（複数可）は、抗体または抗原結合性断片の親和性および／または効力を減少させない。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４抗体またはそれらの断片である。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２抗体またはそれらの断片である。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ＩｇＧ１ ＦａｂまたはＩｇＧ２ Ｆａｂである。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ＩｇＧ２抗体または抗原結合性断片である。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ＡＤＣＣ活性が低減または排除されるように工学的に操作される。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ヒト化もしくはヒトモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合性断片である。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号３７を含むまたは配列番号３７からなる重鎖可変領域および配列番号３８を含むまたは配列番号３８からなる軽鎖可変領域を含む。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、変異、例えば、合計で多くても１、２または３つの変異を有することを除いて、上述の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。実施形態では、この変異（複数可）は、抗体または抗原結合性断片の親和性および／または効力を減少させない。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号４１を含む重鎖配列および任意選択で、配列番号４２を含む軽鎖配列を含む。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号４１からなる重鎖配列および任意選択で、配列番号４２からなる軽鎖配列を含む。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号４７を含む重鎖配列および任意選択で、配列番号４２を含む軽鎖配列を含む。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、変異（例えば、配列番号４１および／または配列番号４２と比較して、１、２、３、４または５つの合計変異）を含むことを除いて、配列番号４１と同一である重鎖配列および配列番号４２と同一である軽鎖配列を含む。実施形態では、この変異（複数可）は、フレームワーク領域（複数可）中にある。実施形態では、この変異は、前記変異を含まない抗体または抗原結合性断片と比較して、この抗体または抗原結合性断片の親和性および／または効力を減少させない。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、変異（例えば、配列番号４７および／または配列番号４２と比較して、１、２、３、４または５つの合計変異）を含むことを除いて、配列番号４７と同一である重鎖配列および配列番号４２と同一である軽鎖配列を含む。実施形態では、この変異（複数可）は、フレームワーク領域（複数可）中にある。実施形態では、この変異は、前記変異を含まない抗体または抗原結合性断片と比較して、この抗体または抗原結合性断片の親和性および／または効力を減少させない。
一実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、Ｆａｂである。
一実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ＩｇＧ１ Ｆａｂである。
一実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号３９を含む重鎖配列および配列番号４２を含む軽鎖配列を含む単離されたＦａｂである。一実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号３９からなる重鎖配列および配列番号４２からなる軽鎖配列を含む単離されたＦａｂである。
一実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ＩｇＧ２ Ｆａｂである。
一実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号５４を含む重鎖配列および配列番号４２を含む軽鎖配列を含む単離されたＦａｂである。一実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、配列番号５４からなる重鎖配列および配列番号４２からなる軽鎖配列を含む単離されたＦａｂである。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、変異（例えば、配列番号３９および／または配列番号４２と比較して、１、２、３、４または５つの合計変異）を含むことを除いて、配列番号３９と同一である重鎖配列および配列番号４２と同一である軽鎖配列を含む。実施形態では、この変異（複数可）は、フレームワーク領域（複数可）中にある。実施形態では、この変異は、前記変異を含まない抗体または抗原結合性断片と比較して、この抗体または抗原結合性断片の親和性および／または効力を減少させない。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、変異（例えば、配列番号５４および／または配列番号４２と比較して、１、２、３、４または５つの合計変異）を含むことを除いて、配列番号５４と同一である重鎖配列および配列番号４２と同一である軽鎖配列を含む。実施形態では、この変異（複数可）は、フレームワーク領域（複数可）中にある。実施形態では、この変異は、前記変異を含まない抗体または抗原結合性断片と比較して、この抗体または抗原結合性断片の親和性および／または効力を減少させない。
一部の実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ヒトＩＬ−６のＲ２４、Ｋ２７、Ｙ３１、Ｄ３４、Ｓ１１８またはＶ１２１のうち少なくとも１つに結合し得る。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ヒトＩＬ−６のＲ２４、Ｋ２７、Ｙ３１、Ｄ３４、Ｓ１１８およびＶ１２１に結合し得る。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ヒトＩＬ−６のＲ２４、Ｋ２７、Ｙ３１、Ｄ３４、Ｓ１１８およびＶ１２１のうち少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つに結合し得る。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ヒトＩＬ−６の部位ＩＩに結合し得る（例えば、特異的に結合し得る）。
実施形態では、この抗体またはその抗原結合性断片は、７０℃またはそれ超のＴｍでＩＬ−６に結合し得る。
実施形態では、この抗体またはその抗原結合性断片は、８０℃またはそれ超のＴｍでＩＬ−６に結合し得る。
実施形態では、この抗体またはその断片（例えば、その抗原結合性断片）は、ヒトＩＬ−６のＲ２４、Ｋ２７、Ｙ３１、Ｄ３４、Ｓ１１８およびＶ１２１のうち少なくとも１つに結合する。
実施形態では、この抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＩＬ−６のＲ２４、Ｋ２７、Ｙ３１、Ｄ３４、Ｓ１１８およびＶ１２１のうち少なくとも２つに結合する。実施形態では、この抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＩＬ−６のＲ２４、Ｋ２７、Ｙ３１、Ｄ３４、Ｓ１１８およびＶ１２１のうち少なくとも３つに結合する。実施形態では、この抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＩＬ−６のＲ２４、Ｋ２７、Ｙ３１、Ｄ３４、Ｓ１１８およびＶ１２１のうち少なくとも４つに結合する。実施形態では、この抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＩＬ−６のＲ２４、Ｋ２７、Ｙ３１、Ｄ３４、Ｓ１１８およびＶ１２１のうち少なくとも５つに結合する。実施形態では、この抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＩＬ−６のＲ２４、Ｋ２７、Ｙ３１、Ｄ３４、Ｓ１１８およびＶ１２１に結合する。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ヒト化モノクローナル抗体である。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ヒトモノクローナル抗体である。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中１００〜１５０ｍｇ／ｍＬの濃度、例えば、約１４２ｍｇ／ｍＬの濃度で、１０％未満の凝集を示す。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、別の治療剤と比較して、例えば、トシリズマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブおよび／またはＥｙｌｅａ（登録商標）と比較して、改善された薬物動態特性を有する。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、例えば硝子体内注射によって眼に例えば硝子体内投与された場合、眼における改善された保持を有する。実施形態では、眼における改善された保持は、眼における、例えば、硝子体、網膜、眼房水、脈絡膜および／または強膜における増加した半減期によって示される。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日間の、硝子体における半減期を有する。実施形態では、硝子体における半減期は、少なくとも１０日間である。実施形態では、硝子体における半減期は、動物において、例えば、ウサギまたはサルにおいて評価される。実施形態では、硝子体における半減期は、ヒトにおいて評価される。
実施形態では、本明細書に記載される抗体または抗原結合性断片は、別の治療剤、例えば、トシリズマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブおよび／またはアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））のものと比較して、低減された全身半減期（例えば、より低いＴ１／２β）および／または改善された全身クリアランス、例えば、低減された全身半減期もしくはより速い全身クリアランスを有する。実施形態では、この全身半減期（例えば、Ｔ１／２β）は、トシリズマブおよび／またはアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））の全身半減期よりも低い。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、Ｈ３１１、Ｄ３１３、Ｉ２５４またはＨ４３６（配列番号４１に従う番号付け）に対応する１または複数の位置において、変異（例えば、１、２、３または４つの変異）を含むＦｃドメインを含む。実施形態では、この変異は、Ｈ３１１Ａ、Ｈ３１１Ｅ、Ｈ３１１Ｎ、Ｄ３１３Ｔ、Ｉ２５４Ａ、Ｉ２５４ＲおよびＨ４３６Ａのうちの１つまたは複数から選択される。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、Ｈ３１１Ａ（配列番号４１に従う番号付け）に対応する変異を含むＦｃドメインを含む。実施形態では、このＦｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。実施形態では、このＦｃドメインは、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインである。
実施形態では、このＦｃドメインは、配列番号５０の配列を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインであり、任意選択で、下線を付した位置（Ｈ９０、Ｄ９２、Ｉ３３およびＨ２１５）のうちの１つまたは複数において変異を含む：
実施形態では、このＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、Ｈ９０Ａ、Ｈ９０Ｅ、Ｈ９０Ｎ、Ｄ９２Ｔ、Ｉ３３Ａ、Ｉ３３ＲおよびＨ２１５Ａ（配列番号５０に従う番号付け）のうちの１または複数に対応する変異を含む。
実施形態では、このＦｃドメインは、配列番号５１の配列を有するヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインであり、任意選択で、下線を付した位置：（Ｈ８６、Ｄ８８、Ｉ２９およびＨ２１１）のうちの１または複数において変異を含む：
実施形態では、このＩｇＧ２ Ｆｃドメインは、Ｈ８６Ａ、Ｈ８６Ｅ、Ｈ８６Ｎ、Ｄ８８Ｔ、Ｉ２９Ａ、Ｉ２９ＲおよびＨ２１１Ａ（配列番号５１に従う番号付け）のうちの１または複数に対応する変異を含む。
実施形態では、このＦｃ変異は、抗体または抗原結合性断片の全身蓄積を低減させる（例えば、クリアランスを増加させる、または半減期、例えばＴ１／２βを減少させる）。実施形態では、この全身蓄積は、別の治療剤（例えば、トシリズマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブおよび／またはアフリベルセプト）の全身蓄積と比較して低減される。実施形態では、この全身蓄積は、トシリズマブおよび／またはアフリベルセプトの全身蓄積と比較して低減される。実施形態では、この全身蓄積は、この変異を含まない対応する抗体または抗原結合性断片の全身蓄積と比較して低減される。実施形態では、この全身蓄積は、抗体または抗原結合性断片の硝子体内投与後に評価される。
別の一態様では、被験体においてＩＬ−６を阻害することの全身作用を低減させる方法が本明細書で提供され、この方法は、本明細書に記載される変異したＦｃドメインを含む抗体またはその断片を被験体に投与するステップを含む。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ＩＬ−６の活性を阻害し得、野生型Ｆｃドメインを有する対応する抗体またはその断片と比較して、低減されたＦｃ活性（例えば、ＦｃＲｎに対する低減された結合）を有する。一部の場合には、被験体においてＩＬ−６を阻害することの全身作用を低減させる方法は、本明細書に記載される変異したＦｃドメインを含むＩＬ−６アンタゴニストを被験体に投与することを含む。
さらなる一態様では、本明細書に記載される抗体または抗原結合性断片をコードする配列を含む核酸が、本明細書で提供される。実施形態では、この核酸は、本明細書に開示されるアミノ酸配列をコードする。実施形態では、この核酸は、配列番号４０、配列番号４３または配列番号４８を含む。実施形態では、この核酸は、表４に開示される配列をコードする。
この核酸を含むベクターもまた、本明細書で提供される。この核酸またはベクターを含む細胞もまた、本明細書で提供される。
実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ−６抗体または抗原結合性断片は、ＩＬ−６関連疾患を有する被験体（例えば、ヒト）の処置における使用のためのものである。実施形態では、この疾患は、眼性疾患、例えば、例えば硝子体における上昇したレベルのＩＬ−６を特徴とする眼性疾患である。
実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、緑内障、ドライアイ（例えば、ドライアイ疾患またはドライアイ症候群）、アレルギー性結膜炎、眼痛、裂孔原性網膜剥離（ＲＲＤ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、角膜移植、角膜上皮剥離、または眼に対する物理的傷害を有する被験体（例えば、ヒト）の処置における使用のためのものである。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ＤＭＥを有する被験体（例えば、ヒト）の処置における使用のためのものである。
実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ−６抗体または抗原結合性断片は、ＩＬ−６関連疾患の処置のための医薬の調製における使用のためのものである。実施形態では、この疾患は、眼性疾患、例えば、硝子体における上昇したレベルのＩＬ−６を特徴とする眼性疾患である。実施形態では、このＩＬ−６関連疾患は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、ドライアイ（例えば、ドライアイ疾患またはドライアイ症候群）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、裂孔原性網膜剥離（ＲＲＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、角膜移植、角膜上皮剥離、または眼に対する物理的傷害である。実施形態では、このＩＬ−６関連疾患は、糖尿病性黄斑浮腫である。実施形態では、この医薬は、被験体の眼の硝子体への送達のため（例えば、硝子体内注射のため）に製剤化される。
本明細書に記載される抗体または抗原結合性断片を含む組成物もまた、本明細書で提供される。実施形態では、この組成物は、薬学的に許容される担体、および１種または複数の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
実施形態では、この組成物は、ＩＬ−６関連疾患の処置における使用のためのものである。実施形態では、この疾患は、眼性疾患、例えば、硝子体における上昇したレベルのＩＬ−６を特徴とする眼性疾患である。実施形態では、この組成物は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、ドライアイ（例えば、ドライアイ疾患またはドライアイ症候群）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、裂孔原性網膜剥離（ＲＲＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、角膜移植、角膜上皮剥離、または眼に対する物理的傷害の処置における使用のためのものである。
ＩＬ−６関連疾患を処置する方法もまた本明細書で提供され、この方法は、治療有効量の本明細書に記載されるＩＬ−６抗体または断片を被験体に投与することを含む。実施形態では、このＩＬ−６関連疾患は、眼性疾患、例えば、硝子体における上昇したレベルのＩＬ−６を特徴とする眼性疾患である。実施形態では、このＩＬ−６関連疾患は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、ドライアイ（例えば、ドライアイ疾患またはドライアイ症候群）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、裂孔原性網膜剥離（ＲＲＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、角膜移植、角膜上皮剥離、または眼に対する物理的傷害である。実施形態では、このＩＬ−６関連疾患は、糖尿病性黄斑浮腫である。
実施形態では、この抗体もしくは抗原結合性断片、またはこの抗体もしくは抗原結合性断片を含む組成物は、被験体の眼の硝子体に（例えば、硝子体内注射によって）送達される。実施形態では、この抗体もしくは抗原結合性断片、またはこの抗体もしくは抗原結合性断片を含む組成物は、硝子体内注射のためのものである。
実施形態では、このＩＬ−６関連疾患は糖尿病性黄斑浮腫であり、この抗体もしくは断片、またはこの抗体もしくは抗原結合性断片を含む組成物は、被験体の眼の硝子体に送達される。
ＩＬ−６関連疾患の処置における使用のための（例えば、ＩＬ−６関連疾患を有する被験体、例えばヒト被験体の処置における使用のための）、抗体もしくはその断片（例えば、抗原結合性断片）（例えば、本明細書に記載されるＩＬ−６抗体もしくはその断片）、またはかかる抗体もしくはその断片を含む組成物もまた、本明細書で提供される。
実施形態では、前記疾患は、例えば硝子体における上昇したレベルのＩＬ−６を特徴とする眼性疾患である。実施形態では、この疾患は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、ドライアイ（例えば、ドライアイ障害またはドライアイ疾患）、アレルギー性結膜炎、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、裂孔原性網膜剥離（ＲＲＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、角膜移植、角膜上皮剥離、または眼に対する物理的傷害である。実施形態では、前記疾患はＤＭＥである。実施形態では、前記疾患はドライアイ疾患である。実施形態では、前記疾患はドライアイ症候群である。実施形態では、前記疾患はブドウ膜炎である。実施形態では、前記疾患はＡＭＤである。実施形態では、前記疾患はＰＤＲである。実施形態では、前記疾患は、角膜移植、角膜上皮剥離、または眼に対する物理的傷害である。実施形態では、この抗体またはその断片（例えば、抗原結合性断片）は、眼の硝子体への送達に適切である。実施形態では、この抗体またはその断片（例えば、抗原結合性断片）は、眼の硝子体に送達される。
ＩＬ−６関連疾患を処置する方法もまた本明細書で提供され、この方法は、ＩＬ−６抗体またはその断片（例えば、その抗原結合性断片）、例えば、本明細書に記載されるＩＬ−６抗体またはその断片を被験体に投与することを含む。実施形態では、このＩＬ−６抗体またはその断片（例えば、その抗原結合性断片）は、治療有効量で投与される。実施形態では、このＩＬ−６関連疾患は、硝子体における上昇したレベルのＩＬ−６を特徴とする眼性疾患である。実施形態では、このＩＬ−６関連疾患は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、ドライアイ症候群、ドライアイ疾患、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、角膜移植、角膜上皮剥離、または眼に対する物理的傷害である。
実施形態では、この抗体またはその断片（例えば、その抗原結合性断片）は、眼の硝子体への送達に適切である。実施形態では、この抗体またはその断片（例えば、その抗原結合性断片）は、被験体の眼の硝子体に送達される。実施形態では、このＩＬ−６関連疾患は糖尿病性黄斑浮腫であり、この抗体またはその断片は、被験体の眼の硝子体に送達される。
本明細書に開示されるＩＬ−６抗体または組成物、および任意選択で、使用のための指示を含むキットもまた、本明細書で提供される。
本明細書に開示されるＩＬ−６抗体または組成物を含む容器またはデバイス、例えば、薬物送達デバイスもまた、本明細書で提供される。実施形態では、前記デバイスは、眼への、例えば、硝子体への、抗体または組成物の送達のために構成される。前記容器またはデバイスを含むキットもまた、本明細書で提供される。
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、免疫グロブリンと同義であり、当該分野で一般に公知と理解すべきである。用語抗体は、抗体を産生する任意の特定の方法によって限定されない。例えば、用語抗体には、とりわけ、組換え抗体、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。本明細書で使用する場合、抗体は、テトラマーであり、他のものが開示されない限り、各々、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は、１つの軽鎖および１つの重鎖を有する。各鎖のアミノ末端は、抗原認識において主な役割を果たす約１００〜１２０またはそれ超のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、抗体エフェクター機能において主な役割を有する定常領域を含む。ヒト軽鎖のクラスは、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖と呼ばれる。重鎖のクラスは、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンであり、抗体のアイソタイプを規定する。抗体アイソタイプは、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥである。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２またはそれ超のアミノ酸の「Ｊ」領域によって繋がれ、重鎖は、約３個またはそれ超のアミノ酸の「Ｄ」領域もまた含む。
各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、それぞれ、抗原結合部位を形成する。したがって、インタクトなＩｇＧ抗体は、例えば、２つの結合部位を有する。二機能性または二特異性抗体を除いて、これら２つの結合部位は同じである。
抗体重鎖および軽鎖の可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって繋がれた、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。用語「可変」とは、可変ドメインの特定の部分が、抗体間で配列において広く異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性に関与するという事実を指す。可変性は、より高度に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）によって分離されたＣＤＲ中に主に存在する。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、当該分野で公知の方法を記載する、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７年および１９９１年））、またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２巻：８７８〜８８３頁（１９８９年）の定義に従って行われる。
「野生型」とは、ある対立遺伝子もしくは多型と、または抗原結合性分子のアミノ酸を変化させるためにある形態の操作、例えば、変異誘発、組換え方法の使用などによって取得されたバリアントもしくは誘導体と比較して、集団において最も広く見られる対立遺伝子もしくは種、または操作されていない動物から取得された抗体を指し得る。
用語「抗体断片」とは、インタクトなまたは全長の鎖または抗体の一部分、一般的には、標的結合領域または可変領域を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片が含まれるがこれらに限定されない。「機能的断片」または「抗ＩＬ−６部位ＩＩ抗体のアナログ」は、ＩＬ−６が受容体に結合する能力を防止し得るもしくは実質的に低減させ得る、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体がｇｐ１３０に結合する能力を低減させ得る、またはリガンドがｇｐ１３０に結合する能力もしくはシグナル伝達を開始させる能力を低減させ得る、断片である。本明細書で使用する場合、「抗原結合性断片」または「機能的断片」は、一般に、「抗体断片」と同義であり、ＩＬ−６が受容体に結合する能力を防止し得るまたは実質的に低減させ得る、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体がｇｐ１３０に結合する能力またはシグナル伝達を開始させる能力を低減させ得る、断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２などを指し得る。
抗体の「誘導体」は、本明細書に開示される抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むポリペプチドである。典型的には、この誘導体は、ＩＬ−６の部位ＩＩに結合し得る。
「競合する」とは、第１の抗体とそのエピトープとの結合が、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下で検出可能に減少するように、第１の抗体またはその断片が第２の抗体またはその断片と、結合について競合し得ることを意味する。一部の場合には、この用語は、第１の抗体の存在下で検出可能に減少する、そのエピトープへの第２の抗体の結合もまた指し得る。かかる競合の機構は、非限定的な例では、立体障害、コンフォメーション変化、共通のエピトープへの結合を介してであり得る。
用語「パーセント配列同一性」とは、核酸配列に関して、最大の対応のために整列された場合に同じである、２つの配列中の残基を意味する。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、例えば、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約２４ヌクレオチド、少なくとも約２８ヌクレオチド、少なくとも約３２ヌクレオチド、少なくとも約３６ヌクレオチド、または少なくとも約４８もしくはそれ超のヌクレオチドに及び得る。当該分野で公知のアルゴリズムが、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用され得る。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して比較され得る。ＦＡＳＴＡは、例えば、プログラムＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３を含み、クエリー配列と検索配列との間での最良の重複の領域のアラインメントおよびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８３巻：６３〜９８頁（１９９０年）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３２巻：１８５〜２１９頁（２０００年）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６６巻：２２７〜２５８頁（１９９６年）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７６巻：７１〜８４頁（１９９８年）；参照によって本明細書に組み込まれる）。特定のプログラムまたはアルゴリズムについてのデフォルトパラメーターが、典型的には使用される。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、そのデフォルトパラメーター（６のワードサイズ、およびスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭファクター）と共にＦＡＳＴＡを使用して、または参照によって本明細書に組み込まれるＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１中に提供されるようなそのデフォルトパラメーターと共にＧａｐを使用して、決定され得る。
用語「パーセント配列同一性」とは、アミノ酸配列に関して、最大の対応のために整列された場合に同じである、２つの配列中の残基を意味する。配列同一性比較の長さは、少なくとも約５アミノ酸残基、例えば、少なくとも約２０アミノ酸残基、少なくとも約３０アミノ酸残基、少なくとも約５０アミノ酸残基、少なくとも約１００アミノ酸残基、少なくとも約１５０アミノ酸残基、または少なくとも約２００もしくはそれ超のアミノ酸残基に及び得る。ポリペプチドについての配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。パーセント配列同一性の決定のためのアルゴリズムは、当該分野で公知である。例えば、アミノ酸配列は、ＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して比較され得る。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の改変に割り当てられた類似性の尺度を使用して、配列を一致させる。例えば、ＧＣＧは、「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含み、これらは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間、または野生型タンパク質とそのアナログとの間の配列相同性または配列同一性を決定するために、これらのプログラムによって特定されたデフォルトパラメーターと共に使用され得る。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、デフォルトまたは推奨パラメーターを使用してＦＡＳＴＡを使用して比較され得る、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１を参照のこと。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列との間での最良の重複の領域のアラインメントおよびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８３巻：６３〜９８頁（１９９０年）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３２巻：１８５〜２１９頁（２０００年））。異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースに対して配列を比較する場合に使用され得る別のアルゴリズムは、それらのプログラムと共に供給されるデフォルトパラメーターを使用するコンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、例えば、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５巻：３３８９〜４０２頁（１９９７年）を参照のこと。
タンパク質またはポリペプチドは、試料の少なくとも約６０〜７５％が単一の種のポリペプチドを示す場合、「実質的に純粋」、「実質的に均一」または「実質的に精製された」である。このポリペプチドまたはタンパク質は、モノマー性またはマルチマー性であり得る。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％純粋を構成し得る；例えば、実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％純粋である。タンパク質の純度または均一性は、任意の適切な手段、例えば、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動と、その後のタンパク質もしくはポリペプチドに関連する１つもしくは複数のバンドの可視化（例えば、ゲルを染色する際）、サイズ排除ＨＰＬＣ、カチオン交換ＨＰＬＣ、ＳＤＳ中での還元キャピラリー電気泳動、ペプチドマッピング、またはグリカンマッピングによって、評価され得る。より高い分解能は、例えば、当該分野で公知の方法、または精製の他の手段を使用して達成され得る。
用語「実質的類似性」とは、核酸またはその断片を指す場合、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列された場合に、配列同一性の任意の公知のアルゴリズム、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐによって測定したときに、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、および少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド塩基においてヌクレオチド配列同一性が存在すること、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％または９９％の配列同一性が存在することを意味する。
ポリペプチドに適用する場合、用語「実質的同一性」または「実質的類似性」とは、それらのプログラムと共に供給されるデフォルトギャップウェイトを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列された場合に、２つのアミノ酸配列が、少なくとも約７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性；例えば、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。ある特定の実施形態では、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なっている。
「治療有効量」とは、処置されている疾患の少なくとも１つの徴候もしくは症状を好転させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）、またはＩＬ−６関連疾患を処置するために有用な別の治療（例えば、別の治療剤）の予防効果（複数可）およびもしくは治療効果（複数可）を増強もしくは改善する、投与されている治療剤の量を指す。治療有効量は、限定的な量の時間にわたって、または慢性処置として、複数の用量で投与され得ることが理解される。
「処置する」、「処置すること」および「処置」とは、疾患の１つまたは複数の徴候または症状を好転させる方法を指す。
本明細書で使用する場合、用語「疾患」は、疾患および障害を含む。
本明細書で言及される各特許文献および科学論文、ならびにそれが引用する特許文献および科学論文の全開示は、全ての目的のために、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
本発明のさらなる特色および利点は、より具体的に以下に記載される。
図１は、抗ＩＬ−６抗体をラットＣＮＶモデルにおいてＩＶＴ投与した実験の結果を示すグラフである。抗ＶＥＧＦ抗体を陽性対照として投与し、陰性対照はビヒクル単独であった。抗ＩＬ−６対ビヒクル対照について、１５日目にｐ＝０．００５４、２２日目にｐ＝０．０００５。
図２は、マウス６４抗体がｇｐ１３０へのＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒの結合を阻害する能力を試験する結合実験の結果を示すグラフである。
図３Ａは、過剰量の可溶性ＩＬ−６Ｒαの非存在下でＩＬ−６シグナル伝達を遮断する能力について０２０を試験した実験を示すグラフである。実験を、０．２ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６および２μｇ／ｍＬのＩＬ６Ｒαを用いてＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＩＬ−６細胞において実施した。図３Ｂは、過剰量の可溶性ＩＬ−６Ｒαの存在下でＩＬ−６シグナル伝達を遮断する能力について０２０を試験した実験を示すグラフである。実験を、０．２ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６および２μｇ／ｍＬのＩＬ６Ｒαを用いてＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＩＬ−６細胞において実施した。
図４は、モノクローナル抗ＩＬ−６抗体（「ＩＬ−６遮断」）をマウスＣＮＶモデルにおいてＩＶＴ投与した実験の結果を示すグラフである。対照は、処置なし（反対側の眼）、抗ＶＥＧＦ抗体の硝子体内注射（「ＶＥＧＦ遮断」）または抗ＨＲＰアイソタイプ対照抗体の硝子体内注射（「対照抗体」）であった。
図５は、野生型抗体（ＥＢＩ−０２９）と比較した、以下の変異：（１）Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ、（２）Ａ２８Ｖ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ、（３）Ｓ３０Ｐ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ、および（４）Ａ２８Ｖ／Ｓ３０Ｐ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ（ＥＢＩ−０３０とも呼ばれる）を有する抗体における、ＩＬ−６への結合を示す。
図６は、ＩＬ−６および以下のＦａｂのうちの１つ：（１）ＷＴ（ＥＢＩ−０２９）、（２）Ａ２８Ｖ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ、（３）Ｓ３０Ｐ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ、（４）Ａ２８Ｖ／Ｓ３０Ｐ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ（ＥＢＩ−０３０）で処理したＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ６レポーター細胞におけるシグナル伝達率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を示す。
図７は、ＩＬ−６および示された濃度における以下のＦａｂのうちの１つ：（１）ＷＴ（ＥＢＩ−０２９）、（２）Ａ２８Ｖ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ、（３）Ｓ３０Ｐ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ、（４）Ａ２８Ｖ／Ｓ３０Ｐ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ（ＥＢＩ−０３０）で処理したＴ１１６５．８５．２．１細胞におけるルミネセンス（ＩＬ−６誘導性増殖の尺度）を示す。
図８は、２０ｐＭのＩＬ−６および種々の濃度の（１）ＨＥＫ−６Ｅ細胞において産生されたＥＢＩ−０２９ ＩｇＧ２（ＥＢＩ０２９）、（２）ＨＥＫ−６Ｅ細胞において産生されたＥＢＩ−０３０ ＩｇＧ２（ＥＢＩ０３０）、および（３）ＨＥＫ−６Ｅ細胞において産生されたＥＢＩ−０３０ ＩｇＧ２−Ｈ３１１Ａ（ＥＢＩ０３０ Ｈ３１１Ａ）；（４）トシリズマブ（ＴＯＣＩ）、および（５）安定なＣＨＯプールにおいて産生されたＥＢＩ−０３０ ＩｇＧ２（ＥＢＩ−０３０ ＣＨＯ）、で処理したＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ６レポーター細胞におけるシグナル伝達率を示す。
図９は、実施例２０に記載した薬物動態モデルを示す。
図１０は、実施例２０に記載した薬物動態モデルを使用してシミュレートした、眼におけるＩＬ−６阻害の持続時間に対する、漸増する抗体効力の影響を示す。
図１１は、硝子体内投与後の経時的な硝子体中のＥＢＩ−０２９、ＥＢＩ−０２９−Ｈ３１１Ａ、ＥＢＩ−０３０、ＥＢＩ−０３０−Ｈ３１１Ａ、Ｅｙｌｅａ（登録商標）およびトシリズマブ（ＴＣＺ）の薬物濃度を示す。
図１２は、硝子体内投与後の経時的な網膜中のＥＢＩ−０２９、ＥＢＩ−０３０、ＥＢＩ−０３０−Ｈ３１１Ａ、Ｅｙｌｅａ（登録商標）およびトシリズマブ（ＴＣＺ）の薬物濃度を示す。
図１３は、硝子体内投与後の経時的な眼房水中のＥＢＩ−０２９、ＥＢＩ−０３０、ＥＢＩ−０３０−Ｈ３１１Ａ、Ｅｙｌｅａ（登録商標）およびトシリズマブ（ＴＣＺ）の薬物濃度を示す。
図１４は、硝子体内投与後の経時的な脈絡膜中のＥＢＩ−０２９、ＥＢＩ−０３０、ＥＢＩ−０３０−Ｈ３１１Ａ、Ｅｙｌｅａ（登録商標）およびトシリズマブ（ＴＣＺ）の薬物濃度を示す。
図１５Ａは、ＥＢＩ−０２９（配列番号１１）、ＥＢＩ−０３０（配列番号４１）およびＥＢＩ−０３１（ＥＢＩ−０３１は、本明細書でＥＢＩ−０３０−Ｈ３１１Ａとも呼ばれる）（配列番号４７）の重鎖配列中のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３の位置を示す。
図１５Ｂは、軽鎖配列（ＥＢＩ−０２９、ＥＢＩ−０３０およびＥＢＩ−０３１は、同じ軽鎖配列を有する）（配列番号１２）中のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４およびＣＫの位置を示す。
図１６Ａは、２０ｐＭのＩＬ−６および種々の濃度のＥＢＩ−０３１またはトシリズマブで処理したＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−６レポーター細胞におけるシグナル伝達率を示す。図１６Ｂは、２００ｐＭのハイパーＩＬ−６および種々の濃度のＥＢＩ−０３１またはトシリズマブで処理したＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−６レポーター細胞におけるシグナル伝達率を示す。
図１７は、実施例２４に記載したコンピューターシミュレーションの結果を示す。
図１８は、ジスルフィドシャッフリングに起因するＩｇＧ２抗体の３つの異なる構造的アイソフォームの模式図を示す。
図１９は、ＥＢＩ−０３１試料：未処理（上のパネル）、５ｍＭ ＤＴＴ（中央のパネル）、１０ｍＭシステイン（下のパネル）のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
図２０は、異なるＥＢＩ−０３１細胞株：クローン性細胞株の２００Ｌスケールの培養物（上のパネル）、親細胞株由来の１０Ｌスケールの培養物（中央のパネル）、および細胞の安定にトランスフェクトされたプール（下のパネル）から収集したＥＢＩ−０３１試料のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
図２１は、クローン性細胞株の２００Ｌスケールの培養物から収集したＥＢＩ−０３１のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示し、どのアイソフォームがクロマトグラム中の各ピークによって示されるかを指定し、定量化している。
図２２Ａは、実施例２６に記載した、アフリカミドリザル（Ｋ７９７）からの薬物動態データを示すグラフである。図２２Ｂは、実施例２６に記載した、アフリカミドリザル（Ｋ６７９）からの薬物動態データを示すグラフである。
図２３は、両方のアフリカミドリザル（Ｋ７９７またはＫ６７９）からの薬物動態データおよびあてはめた曲線を示すグラフである。
図２４Ａは、硝子体内投与後の経時的な硝子体液中のＥＢＩ−０３１の薬物濃度を示す。図２４Ｂは、硝子体内投与後の経時的な眼房水中のＥＢＩ−０３１の薬物濃度を示す。図２４Ｃは、硝子体内投与後の経時的な脈絡膜中のＥＢＩ−０３１の薬物濃度を示す。
図２４Ｄは、硝子体内投与後の経時的な結膜中のＥＢＩ−０３１の薬物濃度を示す。図２４Ｅは、硝子体内投与後の経時的な角膜中のＥＢＩ−０３１の薬物濃度を示す。図２４Ｆは、硝子体内投与後の経時的な虹彩毛様体中のＥＢＩ−０３１の薬物濃度を示す。図２４Ｇは、硝子体内投与後の経時的な水晶体中のＥＢＩ−０３１の薬物濃度を示す。図２４Ｈは、硝子体内投与後の経時的な網膜中のＥＢＩ−０３１の薬物濃度を示す。図２４Ｉは、硝子体内投与後の経時的な強膜中のＥＢＩ−０３１の薬物濃度を示す。
ＩＬ−６は、関節リウマチなどのいくつかの疾患において役割を果たすものとしてと関連付けられており、眼性疾患を含むいくつかの疾患において顕著に上方調節されることが報告されている。ＩＬ−６は、シス−機構およびトランス−機構の両方を介して作用し得る。シス機構では、遊離ＩＬ−６は、膜結合型ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒは、ＩＬ−６ＲαおよびＣＤ１２６とも呼ばれる）に結合し、次いで、このＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体は、ｇｐ１３０（ＣＤ１３０、オンコスタチンＭ受容体、ＩＬ−６ＲベータおよびＩＬ−６シグナル伝達因子とも呼ばれる）と相互作用して、この複合体を含有する細胞においてシグナル伝達を活性化すると考えられている。トランス機構では、遊離ＩＬ−６は、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）に結合する。次いで、このＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体は、細胞膜中に存在するｇｐ１３０に結合し得る。これらの機構間の重要な差異は、より多くの細胞型が、その発現がより限定的であるＩＬ−６Ｒよりもｇｐ１３０を発現することである。したがって、ＩＬ−６シグナル伝達を阻害することが望ましい疾患、例えば、ＩＬ−６シグナル伝達を広く阻害することが望ましい疾患では、シス−ＩＬ−６シグナル伝達およびトランス−ＩＬ−６シグナル伝達の両方を阻害することが有用である。本出願人らは、ＩＬ−６によるシスシグナル伝達およびトランスシグナル伝達の両方を阻害できるＩＬ−６アンタゴニスト、例えば、抗ＩＬ−６抗体、断片および誘導体を工学的に作製した。さらに、本出願人らは、より迅速な全身クリアランスを達成するために、かかるＩＬ−６アンタゴニストを工学的に作製した。ＩＬ−６アンタゴニスト、例えば、ＩＬ−６抗体およびその断片または誘導体は、その全内容が参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０７４９０５に記載されている。本発明は、改善されたＩＬ−６抗体およびその使用に関する。
本明細書で使用する場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」または「この（ｔｈｅ）」が含まれるがこれらに限定されない単数形の用語は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形を含む。
ＩＬ−６アンタゴニスト（ＩＬ−６ａ）の特色
一般に、本明細書に記載されるＩＬ−６アンタゴニスト（ＩＬ−６ａ）は、ＩＬ−６の部位ＩＩ（部位２）に特異的に結合し、ＩＬ−６関連眼疾患および特定の他の疾患の処置において有用である。ＩＬ−６関連眼疾患は、その疾患の望ましくない症状または生物学的活性が、ＩＬ−６の発現または存在と関連する疾患である。一部の実施形態では、このＩＬ−６ａは、遊離ＩＬ−６および結合型ＩＬ−６の両方に対して高い親和性を有し、生物中で比較的安定であり、ＩＬ−６Ｒに結合したＩＬ−６（本明細書でＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体またはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒと呼ばれる）のｇｐ１３０への結合を阻害でき、治療効果を有し得る。一般に、このＩＬ−６ａは、抗体である、または抗体に由来する。例えば、ＩＬ−６ａは、ＩＬ−６の部位ＩＩに特異的に結合できる高親和性のヒト化Ｆａｂであり、シス−ＩＬ−６シグナル伝達およびトランス−ＩＬ−６シグナル伝達の両方を強力に遮断する。別の例では、このＩＬ−６ａは、全長抗体、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である。
一部の実施形態では、Ｆａｂは、Ｆｃを工学的に操作した配列としても構成され、または全長抗体中にある。一部の実施形態では、このＦｃを工学的に操作したＩＬ−６ａ（例えば、Ｆｃを工学的に操作したＦａｂ）は、適切な対照と比較して、例えば、工学的に操作したＦｃを有さない対応する抗体、その断片または誘導体と比較して、より迅速な全身クリアランスを有する。ＩＬ−６ａのこれらおよび他の特色は、本明細書にさらに記載される。
本出願人らは、ＩＬ−６の部位ＩＩに選択的に結合してＩＬ−６シグナル伝達の広い阻害を提供するＩＬ−６アンタゴニストを設計したが、それは、かかる分子が、ＩＬ−６が遊離であるか膜のＩＬ−６ＲまたはｓＩＬ−６Ｒに結合しているかに関わらず、ＩＬ−６へのｇｐ１３０の結合を阻害できるからである。さらに、ＩＬ−６受容体とは反対にリガンド（ＩＬ−６）を標的化することで、受容体媒介性のクリアランスおよびＡＤＣＣ（抗体依存的細胞媒介性細胞傷害）に起因する毒性を回避できる。
ＩＬ−６は、疾患において病理的役割および保護的役割の両方を果たすので、増加したＩＬ−６に関連する疾患を処置するためのＩＬ−６アンタゴニスト（ＩＬ−６ａ）の使用は、状態のある特定の態様を改善できるが、顕著な有害作用、例えば全身作用もまた引き起こし得る。ＩＬ−６経路のこの二重性（即ち、望ましいおよび／または望ましくない作用を有する能力）は、全身性阻害剤を用いてＩＬ−６関連障害を処置することを望ましくないものにし得る。したがって、本明細書で提供される組成物および方法は、少なくとも１つのＩＬ−６活性を阻害するが、ＩＬ−６の正の活性に対して過度の影響を有さない処置のために有用であり得るが、これは一部には、これらの組成物が、局所的送達、例えば、眼への局所的送達のために製剤化され得るからである。例えば、ある特定の態様では、このＩＬ−６ａは、特定の部位への送達のために適切なサイズのものであるように設計される。一部の実施形態では、このＩＬ−６ａは全長抗体である。一部の実施形態では、このＩＬ−６ａは、抗体に由来し、眼の硝子体におけるより長い滞留性および限定的な全身性漏出を有し得る形式である。一部の実施形態では、このＩＬ−６ａは、対応する未改変の抗体と比較して、眼の硝子体におけるより長い滞留性および／またはより限定的な全身性漏出を有する改変された抗体（例えば、改変されたＦｃドメインを有する抗体）である。一部の実施形態では、このＩＬ−６ａはＩｇＧ２抗体である。
一部の態様では、このＩＬ−６ａは、比較的小さいＩＬ−６ａ、例えば、抗体の断片、または全長抗体未満である抗体の他の誘導体、例えば、ＩＬ−６抗体に由来するＦａｂである。一部の場合には、ＩＬ−６ａは、組織の１つの部分から、対応する全長ＩＬ−６抗体と比較して増加した動態で別の部分へと通過できる形式である。一部の実施形態では、このＩＬ−６ａは、Ｆａｂ単独と比較して、それが送達される位置における増加した滞留を有する可能性がより高いより大きい分子になるように工学的に操作されたＦａｂであり、例えば、このＩＬ−６ａは、Ｆｃドメインを介してダイマー化される。ある特定の実施形態では、このＦｃドメインは、Ｆｃ部分が、野生型Ｆｃを含む同じＩＬ−６結合性実体と比較して全身蓄積を低減させ得る消失または低減されたＦｃＲｎ結合を有するように工学的に操作されている。この操作されたＦｃドメインは、例えば、ＩｇＧ１ドメインまたはＩｇＧ２ドメインであり得る。
典型的には、本明細書に記載されるＩＬ−６アンタゴニストは、ＩＬ−６の少なくとも１つの望ましくない作用を好転させる際に有効であるように、それらの標的ＩＬ−６に対する十分に高い親和性を有し、治療剤として有用であるのに十分に安定である。
一般に、ＩＬ−６ａ、例えば、眼における使用に適切なＩＬ−６ａのＰＫは、治療効果を提供するために、送達の部位、例えば硝子体における、十分に長い半減期を有する。非限定的な例では、ＰＫは、少なくとも８日間、１０日間、１４日間、２１日間、２８日間または３０日間の半減期であり得る。
部位ＩＩに結合するＩＬ−６アンタゴニストの同定
一般に、当該分野で公知の任意の方法が、ＩＬ−６に結合し得る分子を生成するために使用され得、例えば、ポリペプチドライブラリーまたは分子ライブラリーが、ＩＬ−６に結合するポリペプチドまたは化合物の能力についてのアッセイにおいて、候補化合物についてスクリーニングされ得る。かかる候補化合物が同定されると、その化合物の結合部位は、当該分野で公知の方法を使用して決定され得る。例えば、分子は、部位Ｉ、部位ＩＩまたは部位ＩＩＩにおいて変異したＩＬ−６に結合するその化合物の能力と比較して、野生型ＩＬ−６に結合する能力および結合について試験され得る。実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ−６ａは、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒα複合体に結合する能力およびＩＬ−６に結合する能力を保持し、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒαのｇｐ１３０への結合を防止する。実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ−６ａは、例えば、ＩＬ−６の部位ＩＩに結合することによって、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒα複合体への結合についてｇｐ１３０と競合し得る。かかる結合活性は、当該分野で公知の方法を使用してアッセイされ得る。
ＩＬ−６ａ候補は、例えば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−６アッセイシステム（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を使用して試験され得る。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−６細胞は、ヒトＩＬ−６ＲおよびＳＴＡＴ３誘導性ＳＥＡＰレポーター遺伝子を安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞である。ＩＬ−６の存在下では、ＳＴＡＴ３は活性化され、ＳＥＡＰが分泌される。ＳＥＡＰは、例えば、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を使用して評価される。これらの細胞へのＩＬ−６アンタゴニストの添加は、遊離ＩＬ−６および可溶性受容体結合型ＩＬ−６の両方を阻害した結果として、ＳＥＡＰの分泌を防止する、またはＳＥＡＰのレベルを減少させる。
ＫＤとは、特定の抗体−抗原相互作用または抗体断片−抗原相互作用の結合親和性平衡定数を指す。実施形態では、本明細書に記載される抗体または抗原結合性断片は、２５０ｐＭ未満またはそれと等しい、例えば、２２５ｐＭ、２２０ｐＭ、２１０ｐＭ、２０５ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭもしくは１ｐＭ未満またはそれと等しいＫＤで、抗原（例えば、ＩＬ−６）に結合する。ＫＤは、当該分野で公知の方法を使用して、例えば、ＢｉａＣｏｒｅ（商標）システムを例えば使用する表面プラズモン共鳴を使用して決定され得る。
Ｋｏｆｆとは、特定の抗体−抗原相互作用または抗体断片−抗原複合体の解離速度定数を指す。解離速度定数は、例えばＢｉａＣｏｒｅ（商標）システムを使用する表面プラズモン共鳴を使用して決定され得る。比較的緩徐なＫｏｆｆは、治療剤の望ましい特色に寄与し得る、例えば、かかる処置を必要とする被験体への阻害剤のより低頻度の投与を可能にする。
特異性
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ−６ａは、標的、例えばＩＬ−６に特異的に結合する。一般に、「特異的結合」は、本明細書で使用する場合、分子が、選択された分子に優先的に結合し、１または複数の他の分子に対してはるかに低い結合親和性を示すことを示す。実施形態では、別の分子に対する結合親和性は、標的に対する結合親和性よりも、１桁、２桁、３桁またはそれを超える桁数だけ低い。
上で議論したように、ＩＬ−６は、遊離ＩＬ−６として、および可溶性ＩＬ−６Ｒαに結合したＩＬ−６として存在し得る。本出願人らは、ＩＬ−６の部位Ｉに結合する阻害剤と比較して、ＩＬ−６アンタゴニストに対する最適な標的として、ＩＬ−６の部位ＩＩを同定した。部位Ｉ阻害剤は、ＩＬ−６Ｒαへの遊離ＩＬ−６の結合を阻害し得る。しかし、かかる阻害剤は、既にあるＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体によって開始される活性を、この複合体のＫｏｆｆによって限定される置き換えによる場合を除き防止することができない。別の選択肢、ＩＬ−６Ｒαに結合する阻害剤は、飽和濃度で存在しない限り、ＩＬ−６活性を防止するその能力が限定的であり得るので、あまり適切ではない。ＩＬ−６受容体の量は一般に、ＩＬ−６の量と比較して非常に高いので、このアプローチは、受容体に結合することによってＩＬ−６活性を阻害する組成物を望ましくない大量に投与することを必要とし得る。実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ−６アンタゴニスト（例えば、本明細書に記載される抗体ならびにその断片および誘導体）は、ＩＬ−６がＩＬ−６Ｒに結合している場合であっても、ＩＬ−６の活性を遮断できる。したがって、本明細書に記載されるＩＬ−６ａの利点は、ＩＬ−６受容体を標的化する阻害剤と比較して、比較的少量の組成物が、治療効果を達成するために投与される必要があり得ることである。抗受容体抗体は、それらのＰＫを顕著に限定する受容体媒介性クリアランスによって迅速に取り除かれ、したがって、より多い用量、より頻繁な投薬またはそれら両方を必要とすることが報告されている。したがって、抗受容体ＩＬ−６抗体および抗部位Ｉ ＩＬ−６抗体の両方は、リガンドの正常な受容体媒介性クリアランス経路を妨害することによってＩＬ−６の組織濃度を顕著に増加させ、それによって、組織中の潜在的に望ましくないレベルのＩＬ−６に被験体を曝露させるという点において、問題を有する。さらに、ＩＬ−６Ｒαを標的化する阻害剤の使用は、阻害が求められる部位および望ましくない部位の両方の近傍での阻害剤の存在、例えば全身処置を必要とし得る。ｇｐ１３０が結合する部位である部位ＩＩに結合するＩＬ−６ａの使用は、遊離ＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒに結合しているが、ｇｐ１３０を介したＩＬ−６経路を未だ活性化していないＩＬ−６を介した阻害を可能にする。したがって、理論に束縛されることは望まないが、本明細書に記載されるＩＬ−６アンタゴニストは、両方の形態のＩＬ−６（可溶性および受容体結合型）に結合するように設計され、具体的には、これらのＩＬ−６アンタゴニストは、両方の形態においてアクセス可能である、ＩＬ−６の部位ＩＩに結合する。本明細書に記載されるＩＬ−６ａを含有する組成物は、ＩＬ−６によるシスシグナル伝達およびトランスシグナル伝達の両方を阻害できる。
一部の場合、本明細書で提供される化合物および方法は、ＩＬ−６関連障害の少なくとも１つの徴候または症状を処置する、例えば、血管形成および／または炎症を阻害するために十分な、有効なＩＬ−６遮断を提供するように設計される。
本明細書に記載される化合物は、例えば硝子体中の、望ましくなく高いレベルのＩＬ−６を特徴とする眼疾患を処置するために有用である（Ｙｕｕｋｉら、Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｍｐｌ １５巻：２５７頁（２００１年）；Ｆｕｎａｔｓｕら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １１０巻：１６９０頁、（２００３年）；Ｏｈら、Ｃｕｒｒ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ３５巻：１１１６頁（２０１０年）；Ｎｏｍａら、Ｅｙｅ ２２巻：４２頁（２００８年）；Ｋａｗａｓｈｉｍａら、Ｊｐｎ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ５１巻：１００頁（２００７年）；Ｋａｕｆｆｍａｎら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５巻：９００頁（１９９４年）；Ｍｉａｏら、Ｍｏｌｅｃ Ｖｉｓ １８巻：５７４頁（２０１２年）を参照のこと）。
一般に、本明細書に記載されるＩＬ−６ａは、ＩＬ−６シグナル伝達の強力なアンタゴニストである。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ−６ａは、ＩＬ−６に対する高い親和性、例えば、１０ｐＭのＩＬ−６を使用するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＩＬ−６アッセイにおいて、１００ｐＭ未満またはそれと等しいＩＣ５０を有する。ＩＬ−６ａの高い親和性は、ＩＬ−６ａのＫＤ、例えば、１ｎＭ未満もしくはそれと等しい、５００ｐＭ未満もしくはそれと等しい、４００ｐＭ未満もしくはそれと等しい、３００ｐＭ未満もしくはそれと等しい、２４０ｐＭ未満もしくはそれと等しい、または２００ｐＭ未満もしくはそれと等しいＫＤに基づいて決定され得る。
増加したＩＬ−６の発現または活性に関連する障害を処置するために有用な生物的ＩＬ−６ａ（例えば、タンパク質またはポリペプチド、例えば、抗体、その断片または誘導体）を産生するために、典型的には、この生物的ＩＬ−６ａは、高い産生性を有することが望ましい。例えば、適切な産生性は、１ｇ／Ｌ超もしくはそれと等しい（例えば、２ｇ／Ｌ超もしくはそれと等しい、５ｇ／Ｌ超もしくはそれと等しい、または１０ｇ／Ｌ超もしくはそれと等しい）。
ＩＬ−６アンタゴニストを有効に投与するために、この阻害剤は、投与される濃度と適合性の溶解度を有することが必要である。例えば、全長抗体ＩＬ−６ａの場合、溶解度は、２０ｍｇ／ｍｌ超もしくはそれと等しい、１０ｍｇ／ｍｌ超もしくはそれと等しい、５ｍｇ／ｍｌ超もしくはそれと等しい、または１ｍｇ／ｍｌ超もしくはそれと等しい。
さらに、実行可能な処置であるために、この阻害剤は、送達部位および活性部位の体温における高い安定性、ならびに貯蔵安定性を有さなければならない。実施形態では、この阻害剤は、６０℃超もしくはそれと等しい（例えば、６０℃超もしくはそれと等しい、６２．５℃超もしくはそれと等しい、６５℃超もしくはそれと等しい、７０℃超もしくはそれと等しい、７３℃超もしくはそれと等しい、または７５℃超もしくはそれと等しい）Ｔｍを有する。実施形態では、この阻害剤は、４５℃超もしくはそれと等しい、例えば、５０℃超もしくはそれと等しい、５１℃超もしくはそれと等しい、５５℃超もしくはそれと等しい、または６０℃超もしくはそれと等しいＴｏｎｓｅｔを有する。ＴｍおよびＴｏｎｓｅｔを決定する方法は、当該分野で公知の方法を使用して決定され得る。
所望の特色を有するアンタゴニストは、当該分野で公知の適切な型の分子、例えば、親ＩＬ−６抗体の十分な特色（例えば、所望の結合特性）を一般に保持または維持するＩＬ−６部位ＩＩ標的化抗体の断片および誘導体を含む抗体から、選択され得る。かかるアンタゴニストには、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、Ｆｃ部分を含むように工学的に操作されたＦａｂ断片、および親ＩＬ−６部位ＩＩ標的化抗体とは異なるフレームワークを有するように工学的に操作された全長抗体が含まれる。
一部の態様では、本明細書に開示されるＩＬ−６ａは、ＩＬ−６の部位ＩＩに結合し得る抗体またはその断片と競合または交差競合し得るヒト抗体の抗原結合部位を含む。例えば、抗体またはその断片は、本明細書に開示されるＶＨドメインおよびＶＬドメインから構成され得、このＶＨおよびＶＬドメインは、本明細書に開示されるＩＬ−６／部位ＩＩ結合性抗体のＣＤＲのセットを含む。
任意の適切な方法は、例えば、ＩＬ−６上の種々の部位を変異させることによって、ＩＬ−６ａが結合するドメインおよび／またはエピトープを決定するために使用され得る。変異がＩＬ−６ａとＩＬ−６リガンドとの結合を防止または減少させる部位は、ＩＬ−６ａへの結合に直接関与するか、または例えばＩＬ−６のコンフォメーションに影響を与えることによって、結合部位に間接的に影響を与えるかのいずれかである。他の方法が、ＩＬ−６ａが結合するアミノ酸を決定するために使用され得る。例えば、ＰＥＰＳＣＡＮベースの酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのペプチド結合スキャンが使用され得る。この型のペプチド結合スキャンでは、抗原に由来する短い重複するペプチドが、結合メンバーへの結合について体系的にスクリーニングされる。これらのペプチドは、ペプチドのアレイを形成するために、支持体表面に共有結合的にカップリングされ得る。ペプチドは、線状または制約されたコンフォメーションであり得る。制約されたコンフォメーションは、ペプチド配列の各末端に末端システイン（ｃｙｓ）残基を有するペプチドを使用して産生され得る。これらのｃｙｓ残基は、ペプチドがループ型コンフォメーションで保持されるように、支持体表面に直接的または間接的に共有結合的にカップリングされ得る。したがって、この方法で使用されるペプチドは、抗原の断片に対応するペプチド配列の各末端に付加されたｃｙｓ残基を有し得る。ｃｙｓ残基がペプチド配列の中央部またはその近傍にさらに位置する二重ループ型ペプチドもまた、使用され得る。これらのｃｙｓ残基は、ペプチドが二重ループ型コンフォメーションを形成するように、支持体表面に直接的または間接的に共有結合的にカップリングされ得、１つのループは、中心ｃｙｓ残基のそれぞれの側にある。ペプチドは、合成により生成され得、したがって、ｃｙｓ残基は、ＩＬ−６部位ＩＩ配列中に天然には存在しないにもかかわらず、所望の位置において工学的に作製され得る。任意選択で、線状および制約されたペプチドは共に、ペプチド結合アッセイでスクリーニングされ得る。ペプチド結合スキャンは、結合メンバーが結合するペプチドのセットを（例えばＥＬＩＳＡを使用して）同定することであって、これらのペプチドは、ＩＬ−６ａの断片に対応するアミノ酸配列を有する（例えば、ＩＬ−６ａの約５、１０または１５連続する残基を含むペプチド）こと、および結合メンバーが結合した残基のフットプリントを決定するためにペプチドを整列させることであって、このフットプリントは、重複するペプチドに共通する残基を含むこと、を含み得る。あるいは、またはさらに、このペプチド結合スキャン法は、少なくとも選択されたシグナル：ノイズ比でＩＬ−６ａが結合するペプチドを同定するために使用され得る。
例えば、部位特異的変異誘発（例えば、本明細書に記載されるとおり）、水素重水素交換、質量分析、ＮＭＲおよびＸ線結晶解析が含まれる、当該分野で公知の他の方法が、抗体が結合する残基を決定するためおよび／またはペプチド結合スキャン結果を確認するために使用され得る。
典型的には、本明細書に記載されるように有用なＩＬ−６ａは、ヒト抗体分子、ヒト化抗体分子、またはそれらの結合性断片である。一般に、この抗体は、モノクローナル抗体である。かかる抗体の起源は、ヒト、マウス、ラット、ラクダ類（ｃａｍｅｌｉｄ）、ウサギ、ヒツジ、ブタまたはウシであり得、当業者に公知の方法に従って生成され得る。
一般に、ＩＬ−６ａは、ＩＬ−６（例えば、ヒトＩＬ−６）に、例えば、ＩＬ−６の部位ＩＩに特異的に結合し得る抗体の少なくともＣＤＲを含む。本発明のＣＤＲまたはＣＤＲのセットを保有するための構造は、抗体の重鎖もしくは軽鎖配列またはそれらの実質的な部分であり得、ここで、このＣＤＲまたはＣＤＲのセットは、再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされる天然に存在するＶＨおよびＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲまたはＣＤＲのセットに対応する位置に位置する。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、Ｋａｂａｔら、１９８３年（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、および任意のインターネット検索エンジンを使用して「Ｋａｂａｔ」の下で見出され得るそのアップデートを参照して、決定され得る。
本明細書に開示されるＩＬ−６ａは、典型的には、抗体ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを一般に含む抗体である。ＶＨドメインは、重鎖ＣＤＲ（ＶＨＣＤＲ）のセットを含み、ＶＬドメインは、軽鎖ＣＤＲ（ＶＬＣＤＲ）のセットを含む。かかるＣＤＲの例は、実施例中で本明細書に提供される。抗体分子は、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３ならびにフレームワークを含む抗体ＶＨドメインを含み得る。これは、あるいは、またはまた、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３ならびにフレームワークを含む抗体ＶＬドメインを含み得る。
本明細書に開示されるものなどのＶＨＣＤＲ１および／もしくはＶＨＣＤＲ２および／もしくはＶＨＣＤＲ３ならびに／または本明細書に開示されるものなどのＶＬＣＤＲ１および／もしくはＶＬＣＤＲ２および／もしくはＶＬＣＤＲ３を含むＩＬ−６アンタゴニストが、本明細書に開示される。このＩＬ−６ａは、本明細書に記載される抗体、断片または誘導体のうちいずれかの１つまたは複数のＣＤＲを含み得る。このＩＬ−６ａは、ＶＨＣＤＲのセット（例えば、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３）を含み得、任意選択で、ＶＬＣＤＲのセット（例えば、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３）もまた含み得る。これらのＣＤＲは、本明細書に記載される１または複数の抗体、断片または誘導体に由来し得る。例えば、これらのＶＬＣＤＲは、ＶＨＣＤＲと同じまたは異なる抗体に由来し得る。
一般に、ＶＨドメインは、ＶＬドメインと対形成して、抗体の抗原結合部位を提供する。例えば、配列番号１または配列番号３のＨＣドメインは、配列番号２のＬＣドメインと対形成する。一部の場合には、ＶＨまたはＶＬドメイン単独が、ＩＬ−６ａとして使用され得る。
一部の態様では、このＩＬ−６ａは、以下を含む、抗体分子、その断片または誘導体である：（ｉ）本明細書に記載されるＶＨドメイン（例えば、配列番号３７）と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメイン配列、または（ｉｉ）ＶＨドメイン配列由来のＶＨＣＤＲのセット（例えば、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２および／もしくはＶＨＣＤＲ３）。実施形態では、この抗体分子、その断片または誘導体は、配列番号３７のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む。実施形態では、この抗体分子、その断片または誘導体は、配列番号３７のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３とは１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のアミノ酸が合計で異なる、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む。
この抗体分子、その断片または誘導体は、任意選択で以下もまた含み得る：（ｉ）本明細書に記載されるＶＬドメイン、例えば、配列番号３８のＶＬドメインと少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメイン配列、または（ｉｉ）ＶＬドメイン由来のＶＬＣＤＲのセット（例えば、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２および／もしくはＶＬＣＤＲ３）。実施形態では、この抗体分子、その断片または誘導体は、配列番号３８のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む。実施形態では、この抗体分子、断片または誘導体は、配列番号３８のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３とは１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のアミノ酸が合計で異なる、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む。２つのアミノ酸配列のパーセント同一性を計算するために使用され得るアルゴリズムには、例えば、デフォルトパラメーターを使用する、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡまたはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが含まれる。
本明細書に記載されるＩＬ−６ａは、抗体定常領域またはその一部、例えば、ヒト抗体定常領域またはその一部を含み得る。例えば、ＶＬドメインは、ヒトＣＫまたはＣＬ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインに、そのＣ末端において付加され得る。同様に、ＶＨドメインに基づくＩＬ−６ａは、任意の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭならびにアイソタイプサブクラスのうちいずれか、特に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に由来する免疫グロブリン重鎖の全てまたは一部（例えば、ＣＨ１ドメイン）に、そのＣ末端において付加され得る。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ＡＤＣＣ活性が低減または排除されるように工学的に操作される。
一実施形態では、本発明の抗体はＩｇＧ２抗体である。一実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に記載されるＩｇＧ２フレームワーク、ＩｇＧ２定常領域またはＩｇＧ２ Ｆｃ領域を含む。
ＩｇＧ２抗体は、３つの主要な構造的アイソフォームとして存在し得る：ＩｇＧ２−Ａ、ＩｇＧ２−ＢおよびＩｇＧ２−Ａ／Ｂ（Ｗｙｐｙｃｈ Ｊ．ら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２００８年、２８３巻：１６１９４〜１６２０５頁）。この構造的不均一性は、Ｆａｂアームを重鎖ヒンジ領域に連結するジスルフィド結合の異なる立体配置に起因する。ＩｇＧ２−Ａアイソフォームでは、Ｆａｂアームをヒンジ領域に連結するジスルフィド結合は存在しない。ＩｇＧ２−Ｂアイソフォームでは、両方のＦａｂアームが、重鎖および軽鎖をヒンジ領域に連結するジスルフィド結合を有する。ＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームは、ＩｇＧ２−ＡアイソフォームとＩｇＧ２−Ｂアイソフォームとの間のハイブリッドであり、一方のＦａｂアームだけが、この一方のＦａｂアームの重鎖および軽鎖をヒンジ領域に連結するジスルフィド結合を有する。ジスルフィドシャッフリングとも呼ばれる、異なる構造的アイソフォームのうちの２つまたは全ての間でのＩｇＧ２抗体の変換が、天然に存在する抗体および組換え抗体の両方について、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで天然に発生する。結果として、当該分野におけるＩｇＧ２抗体の製剤は、ＩｇＧ２−Ａ、ＩｇＧ２−ＢおよびＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームの不均一な混合物を含む。異なるＩｇＧ２アイソフォームは、独自のおよび異なる機能的特性、例えば、安定性、凝集、粘度、Ｆｃ受容体結合または効力における差異を有し得る。ＩｇＧ２抗体製剤中の、複数のアイソフォームの存在、または特定のアイソフォームの増加したレベルは、安定性、凝集または効力に負の影響を与え得る。
本発明は、ＩｇＧ２−ＡまたはＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームで主に存在することの利点を有する抗体を提供する。本発明の抗体は、ＩｇＧ２−Ｂアイソフォームでは存在しない、または実質的な量の時間にわたってＩｇＧ２−Ｂアイソフォームでは存在しない。したがって、本発明の抗体を含む組成物および製剤は、当該分野で公知の他のＩｇＧ２抗体よりも不均一性が低く、したがって、治療適用での使用により好ましい。
本発明の抗体を含む組成物は、主に、抗体のＩｇＧ２−Ａおよび／またはＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームを含む。一実施形態では、本明細書に記載される抗体を含む組成物は、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の、抗体のＩｇＧ２−ＡまたはＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームを含む。一実施形態では、本明細書に記載される抗体を含む組成物は、合計で、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の、ＩｇＧ２−ＡおよびＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームを含む。かかる実施形態では、本明細書に記載される抗体を含む組成物は、実質的な量の、抗体のＩｇＧ２−Ｂアイソフォームを含まない。例えば、この組成物は、１０％、５％、２％、１％、０．５％または０．１％未満の、抗体のＩｇＧ２−Ｂアイソフォームを含む。
一部の場合には、本発明の抗体は、特定のアロタイプ、例えば、特定の地理的起源を有する集団において優勢であるアロタイプを有する配列を創出するために、当該分野で公知の方法を使用してさらに改変される。一部の場合には、ヒト重鎖定常領域は、この目的のために改変される。
ＩＬ−６ａは、抗体分子、その結合性断片、または抗体フレームワーク内に１もしくは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲのセットを有するバリアントであり得る。例えば、抗体（例えば、本明細書に記載される抗体またはその断片もしくは誘導体）の１もしくは複数のＣＤＲまたはＣＤＲのセットが、抗体分子を提供するために、フレームワーク（例えば、ヒトフレームワーク）中に移植され得る。これらのフレームワーク領域は、ヒト生殖系列遺伝子配列に由来し得る、または起源が非生殖系列であり得る。
ＶＨおよび／またはＶＬのフレームワーク残基は、例えば、部位特異的変異誘発を使用して、本明細書で議論および例示されるように、改変され得る。
アミノ酸変化が、当該分野で公知の方法およびパラメーターを使用して、ＩＬ−６の部位ＩＩに標的化された抗体ＩＬ−６ａ（本明細書で「参照ＩＬ−６抗体」と呼ぶ）に由来する１もしくは複数のフレームワーク領域および／または１もしくは複数のＣＤＲにおいて作製され得る。ＩＬ−６の部位ＩＩ（例えば、ヒトＩＬ−６の部位ＩＩ）への結合を保持し、典型的には、参照ＩＬ−６抗体と比較して少なくとも同じ結合または増加した親和性を有する得られたＩＬ−６アンタゴニストもまた、本明細書に含まれる。一部の場合には、安定性などのパラメーターを改善するために、参照ＩＬ−６ａ（例えば、参照抗体）と比較して、誘導されたＩＬ−６ａの結合親和性における減少を生じる変化が、有用なＩＬ−６ａを創出するために導入され得る。一部の実施形態では、例えば、ＦｃＲｎ結合または薬物動態（ＰＫ）パラメーター、例えば、硝子体における半減期または全身半減期（例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、肝臓、腎臓、他の組織または体液における）にその言及が関連する一部の場合には、参照抗体は、ＩＬ−６に特異的に結合しない抗体であり得る。
ＩＬ−６ａポリペプチドのアミノ酸配列における変化は、１もしくは複数のアミノ酸残基（複数可）を天然に存在しないもしくは非標準的なアミノ酸で置換すること、１もしくは複数のアミノ酸残基を天然に存在しないもしくは非標準的な形態に改変すること、または１もしくは複数の天然に存在しないもしくは非標準的なアミノ酸を配列中に挿入することを含み得る。本発明の配列における変更の数および位置の例は、本明細書の別の箇所に記載されている。天然に存在するアミノ酸には、それらの標準的な一文字コードによってＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅと特定される２０種の「標準的な」Ｌ−アミノ酸が含まれる。非標準的なアミノ酸は、ポリペプチド骨格中に取り込まれ得る、または既存のアミノ酸残基の改変から生じ得る、任意の他の残基が含まれる。非標準的なアミノ酸は、天然に存在するものまたは天然に存在しないものであり得る。いくつかの天然に存在する非標準的なアミノ酸、例えば、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシン、３−メチルヒスチジンおよびＮ−アセチルセリンが、当該分野で公知である。それらのＮ−アルファ位置において誘導体化されるアミノ酸残基は、アミノ酸配列のＮ末端にのみ位置する。このアミノ酸は、典型的には、Ｌ−アミノ酸である。一部の場合には、このアミノ酸はＤ−アミノ酸である。したがって、変更は、Ｌ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に改変すること、またはＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸で置き換えることを含み得る。メチル化、アセチル化および／またはリン酸化形態のアミノ酸もまた公知であり、本発明におけるアミノ酸は、かかる改変に供され得る。
本発明の抗体ドメインおよび結合メンバー中のアミノ酸配列は、本明細書で議論される非天然のまたは非標準的なアミノ酸を含み得る。非標準的なアミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸）は、当該分野で公知の方法を使用して、例えば、分子の合成において、またはアミノ酸の合成後改変もしくは置き換えによって、アミノ酸配列中に取り込まれ得る。一部の場合には、Ｄ−アミノ酸が、ＩＬ−６ａのＰＫを増加させるために使用される。
本発明のＣＤＲ由来配列を保有する新規ＶＨまたはＶＬ領域は、可変ドメイン全体内に変異を生成するために、１つまたは複数の選択されたＶＨおよび／またはＶＬ核酸配列のランダム変異誘発を使用して生成され得る。例えば、エラープローンＰＣＲが使用され得る（Ｃｈａｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１巻：７５５〜７６８頁（２００６年））。一部の実施形態では、１個または２個のアミノ酸置換が、可変ドメイン全体、またはＣＤＲのセット内で作製される。当該分野で公知の他の方法、例えば、部位特異的変異誘発が、典型的には１つまたは複数のＣＤＲにおいて変異を生成するために使用され得る。
抗体ＩＬ−６ａを産生するための１つの方法は、１個または複数のアミノ酸を付加、欠失、置換または挿入することによって、本明細書に開示されるものなどのＶＨドメインを変更することである。変更されたＶＨドメインは、本明細書に記載されるようにかつ当該分野で公知の方法を使用しても変更され得るＶＬドメイン（例えば、本明細書に開示されるＶＬドメイン）と組み合わされ得る。かかる変更された分子は、ＩＬ−６の部位ＩＩに結合するそれらの能力について、および任意選択で他の所望の特性、例えば、参照分子と比較して増加した親和性について、試験される。一部の場合には、バリアントＶＨまたはＶＬドメインは、１、２、３、４または５つのかかる変更（例えば、１、２、３、４または５個のアミノ酸置換）を有し得る。
実施形態では、本発明のＩＬ−６ａは、ＩＬ−６の部位ＩＩに結合し、抗原結合部位を含む、例えば、ＩＬ−６の部位ＩＩに結合できる、抗体の断片である。本発明の抗体断片は、一般に、参照（親）抗体分子、例えば、配列番号４１および配列番号４２を含む抗体分子から出発して取得される。抗体断片は、組換えＤＮＡ、酵素的切断（例えば、ペプシンまたはパパインを使用する）、抗体の化学的切断（例えば、ジスルフィド架橋の化学的還元）などの、当該分野で公知の方法を使用して生成され得る。抗体の抗原結合部位を含む抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄおよびジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）などの分子が含まれるがこれらに限定されない。例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）およびミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）を含む、１つまたは複数の抗体の抗原結合部位を含む種々の他の抗体分子が、工学的に作製され得る。抗体分子ならびにそれらの構築および使用のための方法の例は、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、２００５年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３巻：１１２６〜１１３６頁に記載されている。結合性断片の非限定的な例は、ＶＬ、ＶＨ、定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）および定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）ドメインから構成されるＦａｂ断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインから構成されるＦｄ断片；単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインから構成されるＦｖ断片；ＶＨまたはＶＬドメインから構成されるｄＡｂ断片；単離されたＣＤＲ領域；２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価断片、Ｆ（ａｂ’）２断片；ＶＨドメインとＶＬドメインとが、これら２つのドメインを会合させて抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーによって連結される、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；二特異性単鎖Ｆｖダイマー（例えば、ＷＯ１９９３／０１１１６１に開示されるとおり）、ならびに遺伝子融合を使用して構築された多価または多特異性断片であるダイアボディ（例えば、ＷＯ９４／１３８０４に開示されるとおり）である。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはダイアボディ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインとを連結するジスルフィド架橋の取込みによって安定化され得る。ＣＨ３ドメインに繋がれたｓｃＦｖを含むミニボディもまた、ＩＬ−６ａとして使用され得る。ＩＬ−６ａとして使用され得る抗体の他の断片および誘導体には、抗体ヒンジ領域由来の１個または複数のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個のアミノ酸残基の付加によってＦａｂ断片とは異なるＦａｂ’、および定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片であるＦａｂ’−ＳＨ、が含まれる。
一部の場合には、抗体断片であるＩＬ−６ａは、半減期または取込みを増加させるためのＰＥＧ化など、望ましい特性を改善または導入するために、化学的に改変されている。
ｄＡｂ（ドメイン抗体）は、抗体の、小さいモノマー性の抗原結合性断片（抗体重鎖または軽鎖の可変領域）である。ＶＨ ｄＡｂは、ラクダ類（例えば、ラクダおよびラマ）中に天然に存在し、ラクダ類を標的抗原で免疫化し、抗原特異的Ｂ細胞を単離し、個々のＢ細胞からｄＡｂ遺伝子を直接クローニングすることによって産生され得る。本発明のＩＬ−６ａは、実質的に本明細書に示されるようなＶＨもしくはＶＬドメイン、または実質的に本明細書に示されるようなＣＤＲのセットを含むＶＨもしくはＶＬドメインを含むｄＡｂであり得る。
本発明の抗体は、２つの異なる可変領域が同じ分子中で組み合わされた、二特異性抗体を含む。Ｉｌ−６ａは、当該分野で公知の方法を使用して調製された、例えば、化学的にまたはハイブリッドハイブリドーマから調製された、二特異性抗体の一部として取り込まれ得る。かかる分子は、上で議論した型の二特異性抗体断片であり得る。二特異性抗体を生成するための方法の１つの非限定的な例は、異なる特異性を有する２つの抗体の結合ドメインが使用され得、短い可撓性ペプチドを介して直接連結され得る、ＢｉＴＥ（商標）テクノロジーである。これは、２つの抗体を、短い単一のポリペプチド鎖上で組み合わせる。ダイアボディおよびｓｃＦｖは、可変ドメインだけを使用して、Ｆｃ領域なしに構築され得、抗イディオタイプ反応の影響を潜在的に低減させる。二特異性抗体は、ＩｇＧ全体として、二特異性Ｆａｂ’２として、Ｆａｂ’ＰＥＧとして、ダイアボディとして、さもなければ二特異性ｓｃＦｖとして、構築され得る。さらに、２つの二特異性抗体が、四価抗体を形成するために、当該分野で公知の慣用的な方法を使用して、連結され得る。
二特異性抗体全体とは対照的に、二特異性ダイアボディは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて構築および発現され得ることに一部起因して、有用である。適切な結合特異性のダイアボディ（および多くの他のポリペプチド、例えば抗体断片）は、ライブラリーからファージディスプレイ（ＷＯ１９９４／１３８０４）を使用して容易に選択され得る。ダイアボディの一方のアームが、例えば、ＩＬ−６の部位ＩＩに対する特異性を伴って一定に保たれる場合、他方のアームが変動されるライブラリーが作製され得、適切な特異性の抗体が選択される。
二特異性抗体全体は、ＷＯ１９９６／２７０１１、ＷＯ１９９８／５０４３１およびＷＯ２００６／０２８９３６に記載されるような、代替的な工学的作製方法によって作製され得る。
一部の場合には、本発明のＩＬ−６ａは、例えば、以下にさらに議論するように、非抗体タンパク質足場中に１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲのセットを取り込むことによって、非抗体分子内に抗原結合部位を含む。一部の場合には、これらのＣＤＲは、非抗体足場中に取り込まれる。ＩＬ−６部位ＩＩ結合部位は、非抗体タンパク質足場、例えば、フィブロネクチンもしくはチトクロムＢ上のＣＤＲの配置によって、またはＩＬ−６部位ＩＩに対する結合特異性を付与するためにタンパク質足場内のループのアミノ酸残基をランダム化もしくは変異させることによって、提供され得る。タンパク質中の新規結合部位を工学的に作製するための足場は、当該分野で公知である。例えば、抗体模倣物のためのタンパク質足場は、少なくとも１つのランダム化されたループを有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むタンパク質（抗体模倣物）を記載する、ＷＯ２０００３４７８４に開示されている。１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＨＣＤＲのセットを移植する適切な足場は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意のドメインメンバーによって提供され得る。この足場は、ヒトまたは非ヒトタンパク質であり得る。非抗体タンパク質足場の利点は、かかる足場が、少なくとも一部の抗体分子よりも小さいおよび／または製造がより容易である足場分子中に抗原結合部位を提供できることである。結合メンバーの小さいサイズは、有用な生理学的特性、例えば、細胞に進入し、組織中に深く貫通し、もしくは他の構造内の標的に到達する能力、または標的抗原のタンパク質空洞内に結合する能力を付与し得る。安定な骨格および１つまたは複数の可変ループを有するタンパク質が典型的であり、ループ（単数または複数）のアミノ酸配列は、標的抗原に結合する抗原結合部位を創出するために、特異的にまたはランダムに変異される。かかるタンパク質には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のプロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン（例えば、１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを使用する）、リポカリンならびにガンマ−クリスタリン（ｇａｍｍａ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）および他のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）足場（Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれる。他のアプローチの例には、サイクロチドに基づく合成マイクロボディ−−分子内ジスルフィド結合を有する小さいタンパク質、ミクロタンパク質（ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓ（商標）、Ａｍｕｎｉｘ Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）およびアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ−Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから）が含まれる。かかるタンパク質には、小さい工学的に操作されたタンパク質ドメイン、例えば、イムノドメイン（ｉｍｍｕｎｏ−ｄｏｍａｉｎ）（例えば、米国特許出願公開第２００３／０８２６３０号および米国特許出願公開第２００３／１５７５６１を参照のこと）などもまた含まれる。イムノドメインは、抗体の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
ＩＬ−６ａは、例えば、抗原に結合する能力に加えて、別の機能的特徴を分子に付与するために、さらなるアミノ酸を含み得る。
一部の場合には、ＩＬ−６ａは、検出可能な標識を保有する、あるいは（例えば、ペプチジル結合またはリンカーを介して）毒素または標的化部分もしくは酵素にコンジュゲート化される。例えば、ＩＬ−６ａは、抗原結合部位が抗原に結合し、したがって、触媒部位をＩＬ−６またはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に標的化するように、触媒部位（例えば、酵素ドメイン中）ならびに抗原結合部位（例えば、ＩＬ−６の部位ＩＩに対する結合部位）を含み得る。この触媒部位は、一部の場合には、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、またはＩＬ−６ａ／ＩＬ−６複合体と会合する他の分子の切断によって、ＩＬ−６の生物学的機能をさらに阻害し得る。
一部の態様では、本発明は、ＩＬ−６ａの生物学的作用機能を変更、例えば、増加、減少または排除するように、参照抗体と比較して改変された抗体ＩＬ−６ａを含む。一例では、Ｆｃ領域が改変されているか、または未改変の親と比較して改変されたＩＬ−６ａの薬物動態を変更させるために、親Ｆｃドメインが、改変されたＦｃドメインで置き換えられる。一部の実施形態では、このＩＬ−６ａは、ＩｇＧ２フレームワークを有するように工学的に操作される。他の実施形態では、このＩＬ−６ａは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２フレームワーク中にあり、親または他の参照ＩＬ−６ａと比較して、ｐＨ６．０においてＩＬ−６ａの結合親和性を増加させるが、ｐＨ７．０においては結合親和性を実質的に変更させない、改変されたＦｃを有する。実施形態では、Ｆｃドメインが改変され、このＩＬ−６ａは、親または他の参照ＩＬ−６ａと比較して、低減された全身蓄積、減少した半減期および／または増加した全身クリアランスを有する。
一部の実施形態では、抗体ＩＬ−６ａは、補体結合および補体依存的細胞傷害を増加させるために改変される。他の態様では、この抗体ＩＬ−６ａは、参照抗体と比較して、抗体がエフェクター細胞を活性化する能力および抗体依存的細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する能力を増加させるために改変される。一部の場合には、本明細書に開示される抗体は、エフェクター細胞を活性化し抗体依存的細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与するそれらの能力を増強するため、かつ補体に結合し補体依存的細胞傷害（ＣＤＣ）に関与する能力を増強するために、改変され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、補体に結合し補体依存的細胞傷害（ＣＤＣ）に関与するそれらの能力を低減させるために改変される。他の実施形態では、これらの抗体は、エフェクター細胞を活性化し抗体依存的細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与するそれらの能力を低減させるために改変される。さらに他の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、エフェクター細胞を活性化し抗体依存的細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与するその能力を低減させるため、かつ補体に結合し補体依存的細胞傷害（ＣＤＣ）に関与するその能力を低減させるために、改変され得る。
例えば、注射によって眼中に送達される場合、ＩＬ−６ａの用量の頻繁な送達を回避することが、一般に有利である。この特色を促進するために、ある特定の実施形態では、送達の部位、例えば硝子体における本明細書に開示されるＩＬ−６ａの半減期は、少なくとも４日間、例えば、少なくとも７日間、少なくとも９日間、少なくとも１１日間または少なくとも１４日間である。ある特定の実施形態では、ＩＬ−６ａの平均半減期は、少なくとも２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２５日間、３０日間、４０日間、５０日間または６０日間である。抗体の半減期を増加させる方法は、例えば、米国特許第６，２７７，３７５号ならびに国際公開番号ＷＯ１９９８／２３２８９およびＷＯ１９９７／３４６１に記載されるように、当該分野で公知である。一部の実施形態では、ＩＬ−６ａの半減期は、全身半減期、例えば、血液、血清、血漿、リンパ液、肝臓、腎臓または他の組織もしくは体液における半減期よりも、標的送達部位、例えば硝子体においてより大きい。
別の実施形態では、本発明は、容器を含む製造物品を提供する。この容器は、本明細書に開示されるＩＬ−６ａを含有する組成物、およびこの組成物がＩＬ−６関連障害を処置するために使用できることを示す添付文書またはラベルを含む。典型的には、この組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む組成物中のＩＬ−６ａである。
一部の場合には、本発明は、本明細書に開示されるＩＬ−６ａを含有する組成物と、処置を必要とする被験体にこの組成物を投与するための指示とを含むキットである。
例えば、送達の部位またはその近傍でのＩＬ−６ａの保持を増強するために、大きいＩＬ−６ａが望ましい実施形態では、ＩＬ−６ａのサイズを増加させるがＩＬ−６ａの機能（例えば、ＩＬ−６またはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対するＩＬ−６の結合親和性）に顕著に有害な影響を与えない部分を、Ｉｌ−６ａと会合させてもよい。例えば、Ｆａｂは、ＦａｂおよびＦｃ部分を含む単一のポリペプチドとして発現されるように遺伝子操作され得る。
ＩＬ−６ａについて比較的小さいサイズが望ましい実施形態では、ＩＬ−６抗体の断片、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片が使用され得る。ＩｇＧ抗体は、サイズが約１５０ｋＤであり、Ｆａｂは約５０ｋＤであり、ｓｃＦｖは約２５ｋＤである。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ−６ａは、サイズが約５０ｋＤ未満である。かかるアンタゴニストは、例えば、５０ｋＤ未満もしくはそれと等しくかつ１０ｋＤ超、５０ｋＤ未満もしくはそれと等しくかつ２０ｋＤ超、または５０ｋＤ未満もしくはそれと等しくかつ２５ｋＤ超もしくはそれと等しくすることができる。
一部の場合には、ＩＬ−６アンタゴニスト、例えば、ジスルフィドを有する抗体または他の阻害剤の安定性は、ジスルフィド架橋のうちの１つまたは複数が親分子中よりも安定であるバリアントを創出することによって改善される。
本発明に記載される特定のＩＬ−６ａ分子の別の利点は、送達の様式、送達の部位または活性の様式のために適切なサイズを有する有効な分子の入手可能性であり得る。例えば、Ｆａｂ形式のＩＬ−６ａは、外用適用に使用され得る。かかる分子を工学的に作製する方法は、本明細書に記載されており、当該分野で公知である。
適応症／ＩＬ−６関連疾患
本発明のＩＬ−６ａで処置され得る疾患には、上昇したＩＬ−６がその疾患状態と関連しているまたはその疾患状態への必要条件としてである疾患が含まれる。かかる疾患には、ＩＬ−６によって駆動される血管形成および炎症が疾患病理に寄与する疾患が含まれる。これには、ＩＬ−６が正常レベルと比較して上昇している疾患、例えば、ＩＬ−６が眼の硝子体において上昇している疾患（例えば、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症およびブドウ膜炎など）または眼の組織において上昇している疾患が含まれる。例には、ドライアイ（例えば、ドライアイ疾患またはドライアイ症候群）、アレルギー性結膜炎、ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、裂孔原性網膜剥離（ＲＲＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）が含まれるがこれらに限定されない特定の眼疾患が含まれる。処置され得る他の眼性障害には、角膜移植、角膜上皮剥離または眼に対する他のかかる物理的傷害などの外傷によって引き起こされる障害が含まれる。したがって、本発明は、ＩＬ−６関連疾患を有する被験体を、本明細書に記載されるＩＬ−６ａで処置することを含む。
一部の実施形態では、このＩＬ−６関連疾患は炎症性疾患である。一部の実施形態では、この疾患は緑内障である。
一部の実施形態では、この疾患は眼痛である。
一部の実施形態では、被験体の処置は、その被験体がＩＬ−６関連疾患を有するかどうか、および任意選択で、その被験体が他の非ＩＬ−６阻害処置、例えば、ステロイドまたは抗ＶＥＧＦ治療剤に対して抵抗性であるかどうかを決定することもまた含む。
眼などの特異的位置、例えば硝子体において有効な特定の抗体ベースの治療剤に関する１つの問題は、全身投与から生じる有害作用である。１つの解法は、本明細書に記載される分子によって例示されるように、全身的とは対照的に局所的に送達できる治療剤を提供することである。例えば硝子体に局所的に送達される一部の治療剤は、ある程度まで全身的に出現するので、比較的迅速な全身代謝回転を有する分子を設計することが有利である。本出願人らは、例えば、親分子または参照抗体と比較して、迅速な全身代謝回転のために設計されたＩＬ−６抗体の例を工学的に作製した。これを、分子のＦｃＲｎ結合を改変するため、例えば、ＩＬ−６ａのＦｃＲｎ媒介性のリサイクルを低減させるために、Ｆｃドメインを変異させることによって達成した。
糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）。糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）には、低減された視力および潜在的には失明を引き起こす、網膜血管の閉塞および漏出が関与する。ＤＭＥに対する標準的な処置は、ステロイドまたは抗ＶＥＧＦ抗体の局所的投与を含む。しかし、多くの患者は、これらの治療に対して不応性である。糖尿病性黄斑浮腫の病因には、血管形成、炎症および酸化ストレスの構成要素が関与する。ＩＬ−６は、低酸素症および高血糖症によって誘導され、血管炎症、血管透過性および病理的血管形成を増加させ得る。ＩＬ−６は、ＶＥＧＦ発現を直接誘導し得、動物モデルにおいて脈絡膜新生血管形成を促進し得る。ＤＭＥ患者では、眼のＩＬ−６レベルは、黄斑の厚さおよび疾患重症度と正に相関する。ＩＬ−６レベルは、報告によれば、抗ＶＥＧＦ治療に失敗する患者では上昇するが、抗ＶＥＧＦ応答性患者では減少する。したがって、本明細書に記載されるＩＬ−６ａの投与は、抗ＶＥＧＦ治療剤と組み合わせた、または抗ＶＥＧＦ治療に応答しない患者のためを含む抗ＶＥＧＦ処置の代替法として、糖尿病患者の処置のために有用である。ＩＬ−６ａによる黄斑浮腫の処置はまた、病理を阻害するためにいずれかの機構を完全に阻害する必要性を除去し、したがって、各サイトカインの所望の生理学的役割の一部を防止することによって、安全性を改善し得る。したがって、ＶＥＧＦ阻害と組み合わせた局所的ＩＬ−６ａ処置は、用量頻度を減少させ得、処置の有害作用を低減させ得る。
ＤＭＥでは、硝子体ＩＬ−６レベルと、疾患重症度およびＶＥＧＦ不応性被験体の両方との間に、正の相関が存在する。したがって、本明細書に記載されるＩＬ−６ａは、ステロイド治療、抗ＶＥＧＦ治療またはそれら両方に対して不応性であるＤＭＥ被験体を処置するために使用され得る。一部の場合には、ＩＬ−６ａは、例えばＤＭＥを処置するために、抗ＶＥＧＦ治療またはステロイド治療と組み合わせて使用される。
本明細書に記載されるＩＬ−６ａは、障害、例えば、がん、例えば、前立腺がん、白血病、多発性骨髄腫、炎症性疾患（例えば、慢性炎症性増殖性疾患）および自己免疫性疾患、例えば、関節リウマチ、キャッスルマン病（巨大または血管濾胞性リンパ節過形成（ｇｉａｎｔ ｏｒ ａｎｇｉｏｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、リンパ様過誤腫（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｈａｍａｒｔｏｍａ）、血管濾胞性リンパ節過形成（ａｎｇｉｏｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ））、若年性特発性関節炎（多関節型若年性特発性関節炎（ｐｏｌｙａｒｔｉｃｕｌａｒ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）および全身型若年性特発性関節炎が含まれる）、スチル病（若年性特発性関節炎および成人発症スチル病を包含する）、成人発症スチル病、アミロイドＡアミロイドーシス、リウマチ性多発筋痛、圧痕浮腫を伴う寛解型血清反応陰性対称滑膜炎（ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ｓｙｎｏｖｉｔｉｓ ｗｉｔｈ ｐｉｔｔｉｎｇ ｅｄｅｍａ）、脊椎関節炎（ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）、ベーチェット病（眼の症状発現の処置を含む）、アテローム動脈硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎（炎症性ミオパチー）、再発性多発軟骨炎、後天性血友病Ａ、多発性硬化症、炎症による貧血、およびクローン病を処置するためにも使用され得る。
ＩＬ−６アンタゴニストは、特定の神経性疾患、例えば、抑うつおよびアルツハイマー病の処置にも有用である。
本明細書に記載されるＩＬ−６ａで処置され得る他の疾患には、全身性硬化症、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、移植片対宿主病およびＴＮＦ受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）が含まれるがこれらに限定されない。
投薬
ＩＬ−６抗体またはその断片は、例えば、異常に高いレベルのＩＬ−６を発現する被験体（例えば、患者）に投与され得る。この抗体またはその断片は、１回投与され得るか、または複数回投与され得る。この抗体は、例えば、１日３回から６ヶ月またはそれ超毎に１回までで投与され得る。投与は、スケジュール通り、例えば、１日３回、１日２回、１日１回、２日毎に１回、３日毎に１回、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月毎に１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回および６ヶ月毎に１回であり得る。この抗体またはその断片は、ミニポンプもしくは他の経路、例えば、移植可能な緩徐放出性カプセルを介して、またはこの抗体もしくはその断片を産生するカプセル化された細胞によって、持続的に投与され得る。この抗体またはその断片は、粘膜、頬側、鼻腔内、吸入可能な、静脈内、皮下、筋内、非経口、眼内または腫瘍内経路を介して投与され得る。この抗体またはその断片は、１回、少なくとも２回、または少なくとも、状態が処置、軽減もしくは治癒されるまでの期間にわたって、投与され得る。この抗体またはその断片は、一般に、状態が存在する限りにわたって投与される。この抗体またはその断片は、一般に、本明細書に記載される医薬組成物の一部として投与される。抗体の投薬量は、一般に、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、１〜２０ｍｇ／ｋｇおよび１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。この抗体またはその断片の血清濃度は、任意の適切な方法によって測定され得る。本明細書に記載される特定の化合物の１つの特色は、それらが、比較的低頻度の投薬、例えば、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、４週間毎に１回、２週間毎に１回、８週間毎に１回、１２週間毎に１回、１６週間毎に１回、３２週間毎に１回、１ヶ月毎に１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、または６ヶ月毎に１回を要求することである。一部の場合には、この化合物は、例えば、被験体の状態によって決定されるように、必要に応じて投与される。比較的低頻度の投薬を可能にする本明細書に記載されるＩＬ−６アンタゴニストの特色は、少なくとも部分的には、ＩＬ−６に結合したときの緩徐なオフレート（ｏｆｆ ｒａｔｅ）によって達成される高い効力と、比較的高い濃度の化合物を送達する能力との組合せである。
一部の場合には、このＩＬ−６ａは、単剤治療として投与される。他の実施形態では、このＩＬ−６ａは、メトトレキセートまたは他の疾患改変性抗関節炎薬物と随伴して投与される。
抗体の生成
抗体ＩＬ−６ａまたはその誘導体もしくは断片は、モノクローナル抗体方法論（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ ２５６巻：４９５頁を参照のこと）などの、当該分野で公知の方法を使用して産生され得る。Ｂリンパ球のウイルス性形質転換または発がん性形質転換などの、モノクローナル抗体を産生するための他の技術もまた使用され得る。
キメラまたはヒト化抗体は、当該分野で公知の方法を使用して調製されるマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製され得る。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的のマウスハイブリドーマから取得され得、標準的な分子生物学の技術を使用して、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するように工学的に作製され得る。例えば、キメラ抗体を創出するために、マウス可変領域は、当該分野で公知の方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）を使用して、ヒト定常領域に連結され得る。ヒト化抗体を創出するために、マウスＣＤＲ領域は、当該分野で公知の方法（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号、ならびに米国特許第５，５３０，１０１号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６２号；および米国特許第６，１８０，３７０号を参照のこと）を使用して、ヒトフレームワーク中に挿入され得る。
実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ−６ａ（例えば、抗ＩＬ−６抗体またはその誘導体もしくは断片）は、ヒトＩＬ−６に特異的に結合し得る。実施形態では、このＩＬ−６ａは、ＩＬ−６の部位ＩＩ（例えば、ヒトＩＬ−６の部位ＩＩ）に特異的に結合し得る。
一部の実施形態では、ＩＬ−６ａ抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。かかる抗体は、マウス免疫系ではなくヒト免疫系の部分を含むトランスジェニックまたはトランスクロモソミック（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃ）マウスを使用して生成され得る。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソミックマウスには、「ヒトＩｇマウス」、例えば、ＨｕＭＡｂ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＫＭ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）が含まれる（例えば、米国特許第５，５４５，８０６号；米国特許第５，５６９，８２５号；米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，６３３，４２５号；米国特許第５，７８９，６５０号；米国特許第５，８７７，３９７号；米国特許第５，６６１，０１６号；米国特許第５，８１４，３１８号；米国特許第５，８７４，２９９号；および米国特許第５，７７０，４２９号；米国特許第５，５４５，８０７号；ＰＣＴ公開番号：ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／１４４２４を参照のこと）。
別の一態様では、ヒト抗ＩＬ−６抗体は、導入遺伝子および導入染色体（ｔｒａｎｓｃｈｏｍｏｓｏｍｅ）上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保有するマウスを使用して、惹起され得る。かかるマウスは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／４３４７８に詳細に記載されている。
ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスジェニック動物系は、当該分野で入手可能であり、抗体ＩＬ−６ａを惹起するために使用され得る。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と呼ばれる代替的なトランスジェニック系が使用され得る；かかるマウスは、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号；米国特許第６，０７５，１８１号；米国特許第６，１１４，５９８号；米国特許第６，１５０，５８４号；および米国特許第６，１６２，９６３号に記載されている。さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスクロモソミック動物系は、当該分野で入手可能であり、抗体ＩＬ−６ａを惹起するために使用され得る。例えば、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を保有するマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａら（２０００年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７号：７２２〜７２７頁）に記載されている。ヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体応答が免疫化の際に生成され得るようにヒト免疫細胞が再構成されたＳＣＩＤマウスを使用しても調製され得る。かかるマウスは、例えば、米国特許第５，４７６，９９６号および米国特許第５，６９８，７６７号に記載されている。
ファージディスプレイライブラリー
一部の場合には、抗体ＩＬ−６ａ抗体またはその誘導体もしくは断片は、ファージを使用してヒト抗体のライブラリーを合成し、このライブラリーをＩＬ−６、例えば、ヒトＩＬ−６またはその断片を用いてスクリーニングし、ＩＬ−６に結合するファージを単離し、このファージから抗体を取得することを含む方法において、産生される。
組換えヒト抗体ＩＬ−６ａは、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることによっても単離され得る。一般に、このライブラリーは、Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨのｃＤＮＡを使用して生成される、ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。かかるライブラリーを調製およびスクリーニングするための方法は、当該分野で公知である。ファージディスプレイライブラリーを生成するためのキットは、市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリーを生成およびスクリーニングする際に使用され得る他の方法および試薬は、当該分野で公知である（例えば、全て参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；Ｆｕｃｈｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９巻：１３７０〜１３７２頁（１９９１年）；Ｈａｙら、Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３巻：８１〜８５頁（１９９２年）；Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６巻：１２７５〜１２８１頁（１９８９年）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８巻：５５２〜５５４頁（１９９０年）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ Ｊ １２巻：７２５〜７３４頁（１９９３年）；Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６巻：８８９〜８９６頁（１９９２年）；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）；Ｇｒａｍら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９巻：３５７６〜３５８０頁（１９９２年）；Ｇａｒｒａｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９巻：１３７３〜１３７７頁（１９９１年）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９巻：４１３３〜４１３７頁（１９９１年）；およびＢａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８巻：７９７８〜７９８２頁（１９９１年）を参照のこと）。
所望の特徴を有するヒトＩＬ−６抗体を単離および産生するための一例では、ヒトＩＬ−６抗体が、参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０６２１３に記載されるエピトープインプリント法を使用して、ＩＬ−６に対する類似の結合活性を有するヒト重鎖および軽鎖配列を選択するために、最初に使用される。この方法で使用される抗体ライブラリーは、一般に、全て参照によって本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０１０４７；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８巻：５５２〜５５４頁（１９９０年）；およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ Ｊ １２巻：７２５〜７３４頁（１９９３年）に記載されるように調製およびスクリーニングされるｓｃＦｖライブラリーである。
初期ヒトＶＬおよびＶＨドメインが一旦選択されると、「ミックスアンドマッチ（ｍｉｘ ａｎｄ ｍａｔｃｈ）」実験が実施され、この実験では、初期に選択されたＶＬおよびＶＨセグメントの異なる対が、好ましいＶＬ／ＶＨ対の組合せを選択するために、ＩＬ−６結合についてスクリーニングされる。ＩＬ−６ａの望ましい特色について選択するために、選択された対のＶＬおよび／またはＶＨセグメントは、ランダムに変異され得る。このｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟は、例えば、選択されたＶＨおよびＶＬドメインの一方または両方のＣＤＲに対して相補的なＰＣＲプライマーを使用してＶＨおよびＶＬドメインを増幅することによって達成され得、これらのプライマーは、得られたＰＣＲ産物が、ランダム変異がＶＨおよび／またはＶＬ中に導入されたＶＨおよびＶＬセグメントをコードするように、特定の位置における４ヌクレオチド塩基のランダム混合物を含む。かかるランダムに変異したＶＨおよびＶＬセグメントは、ＩＬ−６への、例えば、ＩＬ−６の部位ＩＩへの結合について、再スクリーニングされ得る。
組換え免疫グロブリンディスプレイライブラリーからの抗体ＩＬ−６ａのスクリーニングおよび単離の後、選択された抗体をコードする核酸が、ディスプレイパッケージから（例えば、ファージゲノムから）回収され得、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術を使用して他の発現ベクター中にサブクローニングされ得る。かかる抗体は、本明細書に記載されるものなどの抗体断片を産生するために、さらに操作され得る。
薬物動態（ＰＫ）
ＰＫについての試験は、本明細書に記載される方法および／または当該分野で公知の方法を使用して実施され得る。動物の使用を必要とする決定、例えば、ＰＫの決定に対する１つの障壁は、ヒトＩＬ−６が、かかる試験に一般に使用される一部の動物のＩＬ−６と、５０％未満の相同性を有することである。したがって、ＰＫを試験する１つの方法は、ヒトＩＬ−６を発現するトランスジェニックマウスを使用することである。一部の実施形態では、非ヒト霊長類が、ＰＫを決定するために使用される。
一部の実施形態では、抗ＩＬ６抗体は、例えば、ＦｃＲｎ結合のｐＨ感受性を変更させることによって、そのＰＫを変更させるように変異される。かかる変異を取得する方法は、実施例に記載されている。したがって、一部の実施形態では、ＩＬ−６ａは、親ＩＬ−６ａまたは参照分子と比較して、変更された全身ＰＫを有する。一部の場合には、ＰＫは、硝子体において変更されない、または改善される。一部の実施形態では、このＩＬ−６ａは、親ＩＬ−６ａまたは参照分子と比較して、低減された全身ＰＫ（例えば、例えば循環液、例えば、血液、血漿、リンパ液または血清においてアッセイされる、減少した半減期および／または増加したクリアランス）を有する。
ＩＬ−６アンタゴニストを試験するためのモデル
ＩＬ−６アンタゴニストは、特に、処置の有効性、および有利なＩＬ−６特性に対する限定的な有害作用について、ＩＬ−６関連送達のための疾患のモデルにおいて試験され得る。例えば、ブドウ膜炎は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）免疫化において光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）を使用して、ラットまたはマウスにおける実験的自己免疫性ブドウ膜炎モデル（Ｃａｓｐｉ、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５２巻：１８７３年；Ａｇａｒｗａｌら、９００巻：４４３〜６９頁、２０１２年）において試験され得る。他のモデルには、樹状細胞誘導性ブドウ膜炎、培養されたエフェクターＴ細胞の養子移入、ＩＲＢＰ ＴＣＲ Ｔｇマウスにおける自発的ＥＡＵ、エンドトキシン誘導性ブドウ膜炎、自己免疫性網膜ブドウ膜炎についての、当該分野で公知のモデルが含まれる（Ｈａｒｕｔａら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５３巻：３２６４頁（２０１１年）；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ４８巻：３４７〜３５４頁（２００９年））。
ＩＬ−６関連疾患の処置におけるＩＬ−６ａの効果を試験するために使用され得る他のモデル系は、例えば、脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）モデル（Ｉｚｕｍｉ−Ｎａｇａｉら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７０巻：６頁（２００７年）；Ｋｒｚｙｓｔｏｌｉｋら、Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １２０巻：３３８頁（２００２年））および糖尿病モデル、例えば、Ｋｅｒｎら（Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ Ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（Ｐ０１ ＤＫ５７７３３）、Ｕｐｄａｔｅ Ｒｅｐｏｒｔ（２００１年９月〜２００４年１月））に記載されるモデル系である。関節リウマチにおいてＩＬ−６ａを試験するために有用な動物モデルは、当該分野で公知であり、例えば、Ａｓｑｕｉｔｈら（Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３９巻：２０４０〜４頁（２００９年））およびＫｏｌｌｉａｓら（Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ７０巻：１３５７〜６２頁（２０１１年）を参照のこと。
例えば、ＡＭＤおよびＤＭＥのヒト状態のＣＮＶモデルが、代表的である。網膜新生血管形成モデルは、例えば、虚血性網膜症、例えば、糖尿病性網膜症または未熟児網膜症を研究するために有用である。種々の脈絡膜および網膜新生血管形成モデルが、当該分野で公知であり（例えば、Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ， Ｈ．Ｅ．ら Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ２０１０年１１月；２９巻（６号）：５００〜１９頁．ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｐｒｅｔｅｙｅｒｅｓ．２０１０．０５．００３． ２０１０年５月１９日に電子出版；Ｓａｉｓｉｎ， Ｙら（２００３年）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１９５巻：２４１〜２４８頁；Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｋ．ら（２００３年）Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、４４巻（１号）：４０９〜４１５頁；Ｌｉｍａ ｅ Ｓｉｌｖａ， Ｒ．ら（２００７年）ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ、２１巻：３２１９〜３２３０頁；Ｔｏｂｅら（１９９８年）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１５３巻（５号）：１６４１〜１６４６頁；Ｄｏｎｇ， Ａら（２０１１年）ＰＮＡＳ、１０８巻（３５号）：１４６１４〜１４６１９頁；Ｄｏｎｇら（２００９年）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２１９巻：５４４〜５５２頁；Ｓｍｉｔｈ， ＬＥら １９９４年 Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ １９９４年；３５巻：１０１〜１１１頁；Ｓｈｅｎ， Ｊ．ら（２００７年）Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、４８巻（９号）：４３３５〜４３４１頁を参照のこと）、ＩＬ−６ａの有効性を調査するために使用され得る。脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）は、例えば、レーザー、光、手術または遺伝子改変によって誘導され得る。酸素誘導性網膜新生血管形成のモデルは、当該分野で公知であり、例えば、Ｓｍｉｔｈ， ＬＥら １９９４年 Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ １９９４年；３５巻：１０１〜１１１頁；Ｓｈｅｎ， Ｊ．ら（２００７年）Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、４８巻（９号）：４３３５〜４３４１頁に記載されている。
虚血／再灌流モデルもまた使用され得る。例えば、Ｚｈｅｎｇ， Ｌら Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、４８巻１号、３６１〜３６７頁、２００７年を参照のこと。例えば、１日目に、流体バッグに取り付けられた３０ゲージ針が、麻酔されたマウスの角膜中に挿入され、眼内圧（ＩＯＰ）が、およそ１２０ｍｍＨｇに上昇して、虚血を生じさせる。３０〜９０分後、針が除去され、ＩＯＰが正常化され、網膜循環の再流が生じる。ＴＮＦ−αおよびＩＣＡＭ−１を含む炎症マーカーの発現は、２〜６日目に、ウエスタンブロットおよびｑＰＣＲによって評価され得る。さらに、神経節細胞の喪失が、３〜１４日目に組織学によって評価され得、毛細血管変性が、１０〜１４日目にトリプシン消化技術によって測定される。治療的研究のために、試験物品（例えば、１μＬの適切な濃度、例えば、２０ｍｇ／ｍＬのＩＬ６ａ）が、虚血の誘導の直前または直後のいずれかに、硝子体内注射される。
組合せ治療
一部の実施形態では、ＩＬ−６ａは、第２の治療的実体と組み合わせて投与される。例えば、ＩＬ−６ａは、例えば、ラニビズマブなどのＶＥＧＦ阻害剤を含む処置レジメンにおいて投与される。一部の実施形態では、ＩＬ−６ａは、例えば、抗ＰＤＧＦ抗体または抗ＰＤＧＦ受容体抗体（例えば、イマチニブ）などのＰＤＧＦ阻害剤を含む処置レジメンにおいて投与される。一部の実施形態では、ＩＬ−６ａは、補体経路阻害剤、例えば、ランパリズマブ（ｌａｍｐａｌｉｚｕｍａｂ）（Ｄ因子阻害剤）またはＣ５阻害剤と組み合わせて投与される。
ＩＬ−６アンタゴニストの送達
本明細書に記載されるＩＬ−６アンタゴニストまたは組成物は、ＩＬ−６阻害のために標的化されている細胞もしくは組織と直接接触して、またはかかる細胞もしくは組織の近傍のいずれかで、局所的に送達され得る。かかる送達方法の非限定的な例には、ＩＬ−６アンタゴニストを含む物質の注射、注入または移植が含まれる。
実施形態では、このＩＬ−６ａまたは組成物は、例えば、硝子体内注射、眼科インサート（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｉｎｓｅｒｔ）または遺伝子送達を介して、眼内投与、例えば、硝子体内投与される。
一部の実施形態では、このＩＬ−６ａ組成物は、眼科製剤として投与される。これらの方法は、ＩＬ−６ａ組成物および眼科的に許容される担体の投与を含み得る。一部の実施形態では、この眼科製剤は、液体、半固体、インサート、フィルム、マイクロ粒子またはナノ粒子である。このＩＬ−６ａ組成物は、例えば、外用的に、または注射（例えば、硝子体内注射）によって、投与され得る。
一部の実施形態では、このＩＬ−６ａ組成物は、硝子体内投与のために製剤化される。
一部の実施形態では、このＩＬ−６ａ組成物は、例えば眼への外用投与のために製剤化される。この外用製剤は、液体製剤または半固体であり得、例えば、外用製剤には、水性溶液、水性懸濁物、軟膏またはゲルが含まれ得る。眼科ＩＬ−６ａ製剤は、眼の前面、上眼瞼下、下眼瞼上、および結膜嚢中に、外用適用され得る。典型的には、この眼科製剤は無菌である。ＩＬ−６ａ眼科製剤は、眼科製剤の調製に適切な１種または複数の医薬賦形剤を含み得る。かかる賦形剤の例は、保存剤、緩衝剤、キレート剤、抗酸化剤、および浸透圧を調節するための塩である。軟膏および懸濁物の両方を含む眼科製剤は、典型的には、選択された投与経路に適した粘度を有する。一部の実施形態では、この眼科製剤は、約１，０００から約３０，０００センチポアズまでの粘度を有する。
一部の実施形態では、この製剤は、ポリマーを含む液体製剤である。かかるポリマーは、液体製剤のバイオアベイラビリティを改善し、その粘度を上昇させ、または眼からのそのドレナージを低減させるために、使用され得る。適切なポリマーには、Ｗａｇｈら（Ａｓｉａｎ Ｊ Ｐｈａｒｍ、２巻：１２〜１７頁、２００８年）に記載されるポリマーが含まれるがこれらに限定されない。非限定的な例では、このポリマーは、ヒアルロン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙａｌｕｒｏｎａｓｅ）、キトサン、シクロデキストリン（例えば、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、ポリガラクツロン酸（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、キシログルカン、キサンタンガム、ジェランガム、チオマー（ｔｈｉｏｍｅｒ）、ポリ（オルトエステル）（例えば、Ｅｉｎｍａｈｌ、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５３巻：４５〜７３頁、２００１年）、またはタマリンド種子ポリサッカライド（例えば、Ｇｈｅｌａｒｄｉら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４８巻：３３９６〜３４０１頁、２００４年）である。
一部の実施形態では、眼科送達のためのＩＬ−６ａ組成物を含む製剤は、界面活性剤、アジュバント、緩衝液、抗酸化薬、張度調整剤、防腐剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＢＡＫ（塩化ベンザルコニウム）、亜塩素酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、ポリクオタニウム−１（ｐｏｌｙｑｕａｔｅｒｉｕｍ−１）、増粘剤または粘度改変剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、グリコール４００、プロピレングリコールヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピル−グアー（ｈｙｄｒｏｘｐｒｏｐｙｌ−ｇｕａｒ）、ヒアルロン酸およびヒドロキシプロピルセルロース）などのうちの１つまたは複数を含み得る。製剤中の添加剤には、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ソルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ヒマシ油および過ホウ酸ナトリウムが含まれ得るがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、精製水または脱イオン水が、この組成物中で使用される。ｐＨは、約５．０から８．５の範囲内、例えば、ｐＨ７．０、ｐＨ７．３、ｐＨ、７．４またはｐＨ７．５になるように、任意の生理学的および眼科的に許容されるｐＨ調整性の酸、塩基または緩衝液を添加することによって調整され得る。酸の眼科的に許容される例には、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、塩酸などが含まれ、塩基の例には、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、トロメタミン、トリスヒドロキシメチルアミノ−メタンなどが含まれる。製剤において使用され得る塩および緩衝液の例には、クエン酸塩／デキストロース、炭酸水素ナトリウム、塩化アンモニウム、ならびに上述の酸および塩基の混合物が含まれる。
一部の実施形態では、眼科組成物の浸透圧は、約１０ミリオスモル（ｍｉｌｌｉｏｓｍｏｌａｒ）（ｍＯｓＭ）から約４００ｍＯｓＭまで、例えば、２００から４００ｍＯｓＭまで、または２２０から３７０ｍＯｓＭまでであり得る。一般に、浸透圧は、生理学的および眼科的に許容される塩または賦形剤を使用して調整され得る。一部の実施形態では、塩化ナトリウムが製剤中に含まれ、例えば、塩化ナトリウムが、組成物の総重量に基づいて、０．０１重量％から１重量％まで、または０．０５重量％から０．４５重量％までの範囲の濃度で製剤中に存在する。カチオン、例えば、カリウム、アンモニウムなど、およびアニオン、例えば、クロライド、シトレート、アスコルベート、ボレート、ホスフェート、ビカーボネート、サルフェート、チオサルフェート、ビサルフェート、重硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどから構成される、１つまたは複数の塩の等価な量もまた、所望の範囲内の質量オスモル濃度を達成するために、塩化ナトリウムに加えて、またはその代わりに使用され得る。一部の実施形態では、糖、例えば、マンニトール、デキストロース、ソルビトール、グルコースなどもまた、質量オスモル濃度を調整するために使用される。
一部の実施形態では、これらの方法は、眼の外部表面と接触した薬剤のデポーを形成または供給することを含む。デポーとは、涙または他の眼クリアランス機構によって迅速に除去されない薬剤の供給源を指す。これは、単一の適用によって、眼の外部表面上の流体中に存在する薬剤の、継続性で持続性の高い濃度を可能にする。一部の実施形態では、このデポーは、最大で８時間またはそれ超にわたって残存し得る。一部の実施形態では、この眼科デポー製剤には、水性ポリマー性懸濁物、軟膏および固体インサートが含まれるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、半固体組成物は、温度、ｐＨまたは電解質濃度が変化すると粘度の増加が生じる液体製剤中のポリマーの存在に典型的には起因して、眼への適用の際に粘度が増加する液体製剤である。このポリマーは、例えば、酢酸フタル酸セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅａｃｅｔｏｐｈｔｈａｌａｔｅ）、ポリアクリル酸、ジェランガム、ヒアルロン酸塩（ｈｙａｌｕｒｏｎａｓｅ）、キトサン、アルギン酸の塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）、またはエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのブロックコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）、ＢＡＳＦ；ポロクサマー）であり得る。一部の実施形態では、このポリアクリル酸は、架橋アクリル酸（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））である。一部の実施形態では、この半固体組成物は、ｃａｒｂｏｐｏｌとエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのブロックコポリマーとの混合物；メチルセルロースとヒドロキシエチルセルロースとの混合物；またはポリエチレングリコールとエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのブロックコポリマーとの混合物を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ−６ａ含有眼科製剤は、軟膏またはゲルである。一部の実施形態では、この眼科製剤は、油ベースの送達ビヒクルである。例えば、この製剤は、ＩＬ−６ａ組成物が（例えば、０．１〜２％で）添加される石油またはラノリン基剤と賦形剤とを含み得る。一般的な基剤には、鉱油、ペトロラタムおよびそれらの組合せが含まれ得るがこれらに限定されない。一部の実施形態では、この軟膏は、下眼瞼上へのリボンとして適用される。
一部の場合には、この眼科組成物は、眼科インサートである。実施形態では、この組成物は、眼科インサートを介して硝子体内投与される。
例えば、この眼科インサートは、生物学的に不活性、軟質、生体内分解性（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）、粘弾性であり、治療剤への曝露後の無菌化に対して安定、空気伝搬細菌からの感染に対して抵抗性、生体内分解性、生体適合性、および／または粘弾性である。一部の実施形態では、このインサートは、眼科的に許容されるマトリックス、例えば、ポリマーマトリックスを含む。このマトリックスは、典型的にはポリマーであり、ＩＬ−６ａ組成物が、マトリックス内に分散され、またはポリマーマトリックスに結合される。一部の実施形態では、薬剤は、溶解または共有結合の加水分解を介してマトリックスから緩徐に放出される。一部の実施形態では、このポリマーは、生体内分解性（可溶性）であり、その溶解速度は、その中に分散された薬剤の放出速度を制御できる。別の形態では、このポリマーマトリックスは、そこに結合したまたはその中に分散された薬剤をそれによって放出するように、加水分解などによって分解する生分解性ポリマーである。さらなる実施形態では、このマトリックスおよび薬剤は、放出をさらに制御するために、さらなるポリマー性コーティングで囲まれ得る。一部の実施形態では、このインサートは、生分解性ポリマー、例えば、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、エチレン／酢酸ビニルコポリマー（ＥＶＡ）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリウレタン、ナイロン、もしくはポリ（ｄｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、またはこれらのいずれかのコポリマーを含む。一部の場合には、薬剤は、マトリックス材料中に分散され、または重合前にマトリックス材料を作製するために使用されるモノマー組成物の中に分散される。一部の実施形態では、薬剤の量は、約０．１から約５０％まで、または約２から約２０％までである。生分解性または生体内分解性ポリマーマトリックスは、使用済みのインサートを眼から除去する必要がないように、使用され得る。生分解性または生体内分解性ポリマーが分解または溶解するにつれて、薬剤が放出される。
さらなる実施形態では、この眼科インサートは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＷａｇｈら、「Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｏｃｕｌａｒ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ａｓｉａｎ Ｊ． Ｐｈａｒｍ．、１２〜１７頁（２００８年１月）に記載されるものが含まれるがそれらに限定されないポリマーを含む。一部の実施形態では、このインサートは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アクリレートもしくはメタクリレートのポリマーもしくはコポリマー（例えば、ＲｏｈｍまたはＤｅｇｕｓｓａのＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ファミリーのポリマー）、ヒドロキシメチルセルロース、ポリアクリル酸、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（ジメチルシロキサン）、ポリエチレンオキシド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリビニルアルコール）またはポリ（フマル酸プロピレン）から選択されるポリマーを含む。一部の実施形態では、このインサートは、Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標）を含む。一部の実施形態では、このインサートは、４５０ｋＤａシステインコンジュゲートのポリアクリル酸である。
このインサートは、ＩＬ−６ａ組成物および外側チューブを含有するコアを含み得る（例えば、米国特許出願公開第２００４０００９２２２号に記載される）。一部の場合には、この外側チューブは、薬物に対して透過性、半透過性または不透過性であり得る。一部の実施形態では、このコアは、ＩＬ−６ａ組成物放出の速度に対して顕著な影響を有さないポリマーマトリックスを含む。一部の場合には、外側チューブ、コアのポリマーマトリックスまたはそれら両方が、生体内分解性である。共押出された産物は、薬物送達デバイスへとセグメント化され得る。一部の実施形態では、このデバイスは、それぞれの末端が開放している（ｏｐｅｎ）ように、コーティングされず、またはこのデバイスは、例えば、ＩＬ−６ａ組成物に対して透過性である、ＩＬ−６ａ組成物に対して半透過性である、もしくは生体内分解性である層で、コーティングされる。ある特定の実施形態では、このＩＬ−６ａ組成物および少なくとも１種のポリマーは、粉末形態で混合される。
一部の実施形態では、この眼科組成物は、眼科フィルムである。かかるフィルムに適切なポリマーには、Ｗａｇｈら（上記）に記載されるものが含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、このフィルムは、ソフトコンタクトレンズ、例えば、エチレングリコールジメタクリレートで架橋されたＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミドおよびメタクリル酸のコポリマーで構成されたレンズである。
ある特定の実施形態では、ＩＬ−６ａは、チューブ状形態のインサート中にあり、セグメント化され得る。
一部の実施形態では、ＩＬ−６ａ組成物が顆粒状形態または粒状形態であるように、このＩＬ−６ａ組成物は、ポリマーマトリックスによってコーティングされたまたはポリマーマトリックス中に分散された治療有効量で製剤化される。一部の実施形態では、このＩＬ−６ａ組成物は、顆粒からの薬物が、マトリックス中にまたはマトリックス内に溶解し、マトリックスを介して拡散し、周囲の生理学的流体中に放出される際に、製剤から放出される。一部の実施形態では、放出の速度は、顆粒／粒子からマトリックス中へのＩＬ−６ａ組成物の溶解の速度によって主に限定される；マトリックスを介した拡散および周囲の流体中への分散のステップは、主に、放出律速ではない。ある特定の実施形態では、このポリマーマトリックスは非生体内分解性であるが、他の実施形態では生体内分解性である。例示的な非生体内分解性ポリマーマトリックスは、ポリウレタン、ポリシリコーン、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）（ＥＶＡ）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの誘導体およびコポリマーから形成され得る。例示的な生体内分解性ポリマーマトリックスは、ポリ酸無水物、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリアルキルシアノアクリレート、ならびにそれらの誘導体およびコポリマーから形成され得る。
一部の場合には、このＩＬ−６ａ組成物は、コラーゲン性材料中に製剤化される。例えば、インサートは、可溶性眼科薬物インサート（例えば、薬物送達のために上部結膜嚢中に導入され得るポリマー性卵形フィルム；楕円形インサート、例えば、エチレン酢酸ビニル製のＯＣＵＳＥＲＴ（登録商標）（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが開発したピロカルピン眼治療システム）；セルロース製の棒形状のインサート、Ｌａｃｒｉｓｅｒｔ（登録商標）；ポリ（ビニルアルコール）製のＮｅｗ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＮＯＤＳ）；またはＦａｂｒｉｚｉｏ（Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ １６巻：９５〜１０６頁、１９９８年）に記載されるものなどのインサート、であり得る。一部の場合には、このインサートは、コラーゲン、ゼラチンまたはポリマーを含み、このポリマーは、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、エチレン／酢酸ビニルコポリマー（ＥＶＡ）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリウレタン、ナイロン、ポリ（ｄｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、またはこれらのいずれかのコポリマーから選択される。一部の場合には、このインサートは、上眼瞼下に移植される。一部の場合には、このインサートは、後眼部中に、脈絡膜空間中に、または強膜中に移植される。一部の実施形態では、このインサートは、硝子体内または網膜下に移植される。一部の実施形態では、このインサートは、網膜下注射される。投与の方法およびそれらの調製のための技術は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ： Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００６年）に示される。
他の実施形態では、ＩＬ−６ａ組成物を含有するインサートは、眼の硝子体への薬剤の徐放を提供する。本明細書で使用する場合、「徐放」とは、その組成物が、制御された様式で延長された期間にわたって薬剤を放出することを意味する。一部の実施形態では、このインサートは、眼房水薬剤濃度が、放出の間、硝子体薬剤濃度未満のままであるような速度で薬剤を放出する。一部の実施形態では、この眼房水薬剤濃度は、約０．００２μｇ／ｍＬから約０．０１μｇ／ｍＬまで、または約０．０１μｇ／ｍＬから約０．０５μｇ／ｍＬまで、または約０．０５μｇ／ｍＬ未満である。一部の実施形態では、この薬剤は、約１μｇ／日から約５０μｇ／日まで、または約１μｇ／日から約１０μｇ／日までの速度で放出される。一部の実施形態では、このインサートは、上で詳述したようなさらなる治療剤、例えば、フルオシノロンアセトニド（眼科インサートＲｅｔｉｓｅｒｔ（登録商標）中で見出されるものなど）をさらに含む。
一部の実施形態では、この眼科組成物は、ミクロスフェアまたはナノ粒子を含む。一部の実施形態では、このミクロスフェアは、ゼラチンを含む。一部の実施形態では、このミクロスフェアは、後眼部に、脈絡膜空間中に、強膜中に、硝子体内に、または網膜下に注射される。一部の実施形態では、このミクロスフェアまたはナノ粒子は、Ｗａｇｈら（Ａｓｉａｎ Ｊ Ｐｈａｒｍ ２巻：１２〜１７頁、２００８年）に記載されるものなどが含まれるがこれらに限定されないポリマーを含む。一部の実施形態では、このポリマーは、キトサン、ポリカルボン酸、例えば、ポリアクリル酸、アルブミン粒子、ヒアルロン酸エステル、ポリイタコン酸、ポリ（ブチル）シアノアクリレート、ポリカプロラクトン、ポリ（イソブチル）カプロラクトン、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）またはポリ（乳酸）である。一部の実施形態では、このミクロスフェアまたはナノ粒子は、固体脂質粒子を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ−６ａ組成物は、イオン交換樹脂を含む。一部の実施形態では、このイオン交換樹脂は、無機ゼオライトまたは合成有機樹脂である。一部の実施形態では、このイオン交換樹脂には、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＷａｇｈら、上記に記載されるものが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、このイオン交換樹脂は、部分的に中和されたポリアクリル酸である。
ＩＬ−６ａ組成物は、水性ポリマー性懸濁物中で提供され得る。一部の実施形態では、このＩＬ−６ａ組成物またはポリマー性懸濁剤は、水性媒体（例えば、上記特性を有する）中に懸濁される。ポリマー性懸濁剤の例には、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリサッカライドゲル、Ｇｅｌｒｉｔｅ（登録商標）、セルロース由来ポリマー、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびカルボキシ含有ポリマー、例えば、アクリル酸のポリマーまたはコポリマー、ならびに他のポリマー性粘滑薬が含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、このポリマー性懸濁剤は、水膨潤性の水不溶性ポリマー、特に、架橋カルボキシ含有ポリマーである。一部の実施形態では、このポリマー性懸濁剤は、存在するモノマーの総重量に基づいて、少なくとも約９０重量％から約９９．９重量％まで、または約９５重量％から約９９．９重量％の、１つまたは複数のカルボキシ含有モノエチレン性（ｍｏｎｏｅｔｈｙｌｅｎｉｃａｌｌｙ）不飽和モノマーを含む。一部の実施形態では、このカルボキシ含有モノエチレン性不飽和モノマーには、アクリル酸、メタクリル酸、エタクリル酸（ｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、メチルアクリル酸（クロトン酸）、シス−アルファ−メチルクロトン酸（アンゲリカ酸）、トランス−α−メチルクロトン酸（チグリン酸）、α−ブチルクロトン酸、アルファ−フェニルアクリル酸、α−ベンジルアクリル酸、α−シクロヘキシルアクリル酸、フェニルアクリル酸（ケイ皮酸）、クマル酸（ｏ−ヒドロキシケイ皮酸）およびウンベル酸（ｕｍｂｅｌｌｉｃ ａｃｉｄ）（ｐ−ヒドロキシクマル酸）が含まれる。一部の実施形態では、このポリマーは、多官能性架橋剤（例えば、二官能性架橋剤）によって架橋される。一部の実施形態では、この架橋剤は、存在するモノマーの総重量に基づいて、約０．０１％から約５％まで、または約０．１％から約５．０％まで、または約０．２％から約１％までの量で含まれる。一部の実施形態では、この架橋剤は、非ポリアルケニルポリエーテル二官能性架橋モノマー、例えば、ジビニルグリコール、２，３−ジヒドロキシヘキサ−１，５−ジエン、２，５−ジメチル−１，５−ヘキサジエン、ジビニルベンゼン、Ｎ，Ｎ−ジアリルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアリルメタクリルアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉａｌｌｙｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）；少なくとも４つの炭素原子および少なくとも３つのヒドロキシル基を含有する多価アルコールをアルケニルハライド、例えば、臭化アリルなどでエーテル化することによって調製された、１分子当たり２またはそれ超のアルケニルエーテル基、例えば、末端Ｈ２Ｃ＝Ｃ基を含むアルケニルエーテル基を含むポリアルケニルポリエーテル架橋剤、例えば、ポリアリルスクロース、ポリアリルペンタエリスリトールなど；約４００から約８，０００までの分子量を有するジオレフィン性非親水性マクロマー性架橋剤、例えば、ジオールおよびポリオールの不溶性ジアクリレートおよびポリアクリレートならびにメタクリレート、ポリエステルジオール、ポリエーテルジオールまたはポリシロキサンジオールに由来するイソシアネート終結プレポリマーの、ヒドロキシアルキルメタクリレートとのジイソシアネートヒドロキシアルキルアクリレートまたはメタクリレート反応産物などである。
一部の実施形態では、これらの架橋ポリマーは、架橋剤（単数または複数）と一緒に、存在する唯一のモノエチレン性不飽和モノマーとしてのカルボキシ含有モノエチレン性不飽和モノマー（単数または複数）から作製される。一部の実施形態では、これらのポリマーは、カルボキシ含有モノエチレン性不飽和モノマー（単数または複数）の最大で約４０重量％、好ましくは約０重量％から約２０重量％が、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステル、例えば、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、ブチルアクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、オクチルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、３−ヒドロキシプロピルアクリレートなど、酢酸ビニル、Ｎ−ビニルピロリドンなどを含む、生理学的および眼科的に無害な置換基のみを含む１つまたは複数の非カルボキシル含有モノエチレン性不飽和モノマー（単数または複数）で置き換えられているポリマーである（例えば、Ｍｕｅｌｌｅｒら、米国特許第４，５４８，９９０号）。一部の実施形態では、これらのポリマーには、ポリカルボフィル（Ｎｏｖｅｏｎ ＡＡ−１）、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）およびＤｕｒａＳｉｔｅ（登録商標）が含まれる。一部の実施形態では、これらの架橋ポリマーは、従来のフリーラジカル重合触媒を使用して、等価な球の直径で約５０μｍ以下の乾燥粒子サイズまで、モノマーを懸濁重合またはエマルジョン重合させることによって調製される。一部の実施形態では、平均乾燥粒子サイズは、等価な球の直径で、約１から約３０μｍまで、または約３から約２０μｍまでである。一部の実施形態では、これらのポリマー粒子は、より大きいポリマー粒子を機械的に製粉することによって取得される。さらなる実施形態では、かかるポリマーは、約２５０，０００から約４，０００，０００まで、および３，０００，０００，０００から４，０００，０００，０００までの分子量を有する。他の実施形態では、架橋ポリマーの粒子は単分散であり、これは、粒子の少なくとも約８０％、約９０％または約９５％が、主要粒子サイズ分布の１μｍバンド内に入るような粒子サイズ分布をそれらが有することを意味している。さらなる実施形態では、単分散粒子サイズとは、約２０％、約１０％または約５％以下の、１μｍ未満のサイズの粒子が存在することを意味している。一部の実施形態では、この水性ポリマー性懸濁物は、約０．０５から約１％まで、約０．１から約０．５％まで、または約０．１から約０．５％までの薬剤、および約０．１から約１０％まで、約０．５から約６．５％まで、約０．５から約２．０％まで、約０．５％から約１．２％まで、約０．６から約０．９％まで、または約０．６から約０．８％までのポリマー性懸濁剤を含む。単数形で言及されていても、ポリマー性懸濁剤の１または複数の種が、述べられた範囲内に入る総量で使用され得ることを理解すべきである。一実施形態では、不溶性の軽く架橋されたポリマー粒子の量、ｐＨおよび浸透圧は、互いに相関し、ならびに２５番スピンドルおよび１３Ｒ小試料アダプターを備えたＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ Ｄｉｇｉｔａｌ ＬＶＴ Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒを１２ｒｐｍで使用して、室温（約２５℃）で測定したとき、約５００から約１００，０００センチポアズまで、好ましくは約１，０００から約３０，０００センチポアズまで、または約１，０００から約１０，０００センチポアズまでの範囲の粘度を有する組成物を得るための架橋の程度と相関する。一部の実施形態では、この粘度は、約１０から約４００センチポアズまで、約１０から約２００センチポアズまでまたは約１０から約２５センチポアズまでである。
一部の実施形態では、これらの水性ポリマー性懸濁物は、眼への投与の前にそれらが有したのと同じまたは実質的に同じ、眼における粘度を保持するように、製剤化され得る。一部の実施形態では、これらは、涙液との接触の際に増加したゲル化が存在するように、製剤化され得る。例えば、ＤｕｒａＳｉｔｅ（登録商標）または他の類似のポリアクリル酸型ポリマーを含む製剤が、約６．７未満のｐＨで眼に投与される場合、涙液はより高いｐＨ（およそ７）を有するので、このポリマーは、涙液と接触した際に、膨潤し得る。このゲル化またはゲル化における増加は、懸濁された粒子の捕捉をもたらし得、それによって、眼における組成物の滞留時間を延長させる。一部の実施形態では、薬剤は、懸濁された粒子が経時的に溶解するにつれて、緩徐に放出される。一部の実施形態では、この送達経路は、患者の快適さを増加させ、眼組織との薬剤接触時間を増加させ、それによって、眼における薬物吸収の程度および製剤の作用の持続時間を増加させる。これらの薬物送達系中に含まれる薬剤は、薬物自体およびその物理的形態、薬物負荷の程度、および系のｐＨなどの因子に依存する速度で、ならびにこれもまた存在し得る、眼表面と適合性の任意の薬物送達アジュバント、例えばイオン交換樹脂に依存する速度で、ゲルから放出される。
一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニストは、遺伝子送達、例えば、局所的遺伝子送達を使用して被験体に提供される。かかる送達は、一過的発現系、安定な（例えば、組み込まれた）発現系、例えば、Ｂｌｕｅｂｉｒｄ Ｂｉｏ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）によって製造されたレンチウイルス送達系、またはＮｅｕｒｏｔｅｃｈ（Ｃｕｍｂｅｒｌａｎｄ、Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ）によって製造されたものなどの細胞工場（ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ）中での送達を介してであり得る。
全ての技術的特色は、かかる特色の全ての可能な組合せで個々に組み合わされ得る。
均等物
本発明は、その精神または本質的特徴から逸脱することなしに、他の具体的な形態で具体化され得る。したがって、上述の実施形態は、全ての観点において、本明細書に記載される発明に対する限定ではなく例示とみなされるべきである。
以下の非限定的な実施例は、本明細書に記載される発明の実施形態をさらに説明する。
（実施例１）
脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）モデルにおける局所的ＩＬ−６遮断の検証
局所的ＩＬ−６遮断が、眼疾患、例えば、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）またはウエット型ＡＭＤを処置するために有効であり得るかどうかを決定するために、抗ＩＬ−６抗体を、脈絡膜新生血管形成のモデル系を使用して局所投与した。レーザー誘導性ＣＮＶモデル（ｅｙｅｃｒｏ．ｃｏｍ／ｉｎ−ｖｉｖｏ／ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｃｈｏｒｏｉｄａｌ−ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ｃｎｖ／）は、炎症および血管形成を含む、ＤＭＥの基礎をなす病理的プロセスの多くを再現する。研究を、ＥｙｅＣＲＯ（Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ、ＯＫ）においてラットにおいて実施した。各群中の６匹の動物は、０日目に両側性レーザー処置を受けて、眼１つ当たり３つの病変を生じた。３日目および１０日目に、３μｇのポリクローナル抗ラット−ＩＬ−６抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＦ５０６；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、硝子体内（ＩＶＴ）注射によって試験群に投与し、ＰＢＳまたは抗ＶＥＧＦポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＦ５６４）を、それぞれ、ビヒクル群および陽性対照群に投与した。ｉｎ ｖｉｖｏ血管造影を１５日目および２２日目に実施して、病変面積を測定した。１５日目および２２日目の両方で、抗ＩＬ−６処置群は、ビヒクル対照と比較して、有意に低減された新生血管形成を有した。抗ＩＬ−６処置群と抗ＶＥＧＦ陽性対照との間には、応答における有意差は存在しなかった。図１は、かかる実験の結果を示す。これらのデータは、ＩＶＴ投与したＩＬ−６ａ、例えば抗ＩＬ６抗体が、抗ＶＥＧＦ陽性対照と類似のレベルまで、ラットＣＮＶモデルにおける新生血管形成を低減させ得ることを実証している（抗ＩＬ−６対ビヒクル対照について、１５日目にｐ＝０．００５４、２２日目にｐ＝０．０００５）。
これらのデータは、ＩＬ−６の局所的遮断が、眼疾患、例えば、脈管漏出が関与する疾患、例えば黄斑浮腫を処置するために有用であり得ることを示している。
（実施例２）
候補抗体ＩＬ−６アンタゴニスト
候補抗体ＩＬ−６アンタゴニストを、最初に免疫化を伴うプロセスを使用して開発した。免疫化は、医薬品開発受託機関（ＣＲＯ）が、本発明者らの指示で実施した。５匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスに、フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）と共に、１Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳ中８０μｇのヒトＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２０６−ＩＬ／ＣＦ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を皮下注射した。２回の追加免疫を、８０μｇおよび５０μｇのＩＬ−６を用いて実施した。脾臓細胞を、最も高い力価のマウスから回収し、Ｐ３ｘ７６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを形成した。
ハイブリドーマ上清を、ＩＬ−６結合および拮抗作用についてスクリーニングした。結合ＥＬＩＳＡのために、Ｃｏｓｔａｒ ９０１８プレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのヒトＩＬ−６で、４℃で一晩コーティングした。ウェルを、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳでブロッキングし、洗浄し、次いで、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１：２希釈した各ハイブリドーマ上清５０μＬと共にインキュベートした。６０分後、ウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ ３００μｌで３回洗浄した。次いで、ＰＢＳ−ＢＳＡ中に１：３０００希釈した抗マウス−ＨＲＰを各ウェルに添加し、３０分間インキュベートした。ウェルを、上記のように洗浄し、次いで、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加し、４５０ｎｍおよび５５０ｎｍでシグナルを測定した。拮抗作用研究のために、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ＩＬ６レポーター細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、１：１０希釈したハイブリドーマ上清の存在下で漸増濃度のヒトＩＬ−６と共にインキュベートした。２０〜２４時間後、２０μｌの上清を、１８０μｌのＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）と混合し、吸光度を６５５ｎｍで測定した。
結合研究および拮抗作用研究に基づいて、本出願人らは、ハイブリドーマ６４をリードとして選択し、ＣＲＯにおいてサブクローニングした。ハイブリドーマ６４（マウスモノクローナル）を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ｇｐ１３０へのＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒα複合体の結合を阻害する能力について、さらに試験した。１．５μｇ／ｍｌの濃度のハイブリドーマ６４は、ＥＬＩＳＡによる、固定化されたｇｐ１３０へのＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒα複合体の結合を、有意に低減させた（図２）。
これらのサブクローンを再スクリーニングし、サブクローン６４．５８の可変ドメインを、５’ＲＡＣＥ ＰＣＲによって増幅し、配列決定した。マウス可変ドメイン配列（ｍ６４と呼ぶ）は、以下の通りである：
ヒト化配列を創出するために、ｍ６４相補性決定領域（ＣＤＲ）を、コンピューターアルゴリズムによってマウス配列との類似性について選択されたヒト生殖系列フレームワーク中に移植した。ヒト化配列（ｈ６４と呼ぶ）は、以下の通りであり（ｍ６４配列と比較して変更された残基に下線を付す）、マウス配列と約７９．５％の同一性（ＶＨ）および８４．４％の同一性（ＶＬ）を有する：
これらのヒト化配列を、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって合成し、次いで、ヒトＩｇＧ１定常ドメインとの直列融合物として、ｐｃＤＮＡ３．１由来発現ベクター中にクローニングした。ＩｇＧを、一過的トランスフェクションによってＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）−２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）において発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。結合研究および拮抗作用研究の両方において、ｈ６４ ＩｇＧは、そのｍ６４先祖と比較して、かなり低減された効力を実証した。したがって、酵母ディスプレイを利用して、喪失した親和性を回復させた。
ヒト化ｈ６４ＩｇＧの親和性を回復または改善するように設計された親和性成熟を実施するために、ｈ６４抗体配列を再クローニングして、ｐＹＣ２／ＣＴ由来酵母ベクター中でＦａｂ分子を生成し、このとき、ＦａｂＨ鎖を、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号２９）を介して抗ＦＩＴＣ ｓｃＦｖ ４ｍ５．３に融合させた。次いで、ｈ６４バリアントのライブラリーを、Ｃｈａｏら（２００６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１巻：７５５〜７６８頁）のプロトコールに従ってエラープローンＰＣＲによって生成した。ｈ６４バリアントを発現させ、ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＮＨＳで標識した酵母によって表面捕捉し、次いで、ビオチン化ヒトＩＬ−６と共にインキュベートした。結合したＩＬ−６を、ストレプトアビジン−ＡＰＣを用いて検出し、ディスプレイされたＦａｂの量に対して、最も高い量の結合したＩＬ−６を有する細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）セルソーターで選択した。４ラウンドの選択の後、より高い親和性のバリアントの集団を選択し、配列決定した。親和性成熟によって選択されたクローン（ｈ６４−１．４と呼ぶ）の配列は、太字の選択された変異（即ち、ｈ６４ ＶＨおよびＶＬの配列と比較して変異した）を伴って以下の通りであり、ＣＤＲに下線を付す。これらは、０１８（ならびに以下に記載される０２０および０２９ ＩＬ−６ａ分子）の可変ドメインである。完全Ｆａｂは、ＣＫおよびＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインを含むことに留意のこと。本出願に関して、「Ｆａｂ」重鎖または軽鎖アミノ酸配列に対する言及は、配列が、軽鎖由来配列および重鎖由来配列からなる機能的なＦａｂの一部であり得ることを意味している。
これらのｈ６４−１．４可変ドメインを、ｐｃＤＮＡ３．１ヒトＩｇＧ１ベクター中に再クローニングし、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）−ＨＥＫ２９３細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において全長ＩｇＧ１として発現させた。得られた精製されたＩｇＧは、結合研究および細胞拮抗作用研究の両方において、元のｈ６４抗体よりも顕著に強力であった。酵母系を使用して親和性を試験したところ、親和性は、元のヒト化分子についての３４３ｐＭから、４３ｐＭまで増加した。アンタゴニスト効力は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞系を使用してアッセイした場合、約１０倍の増加であった。
ｈ６４−１．４ ＩｇＧを、眼性適応症および他の適応症における使用のために、Ｆａｂとして再形式化した。さらに、別のラウンドのライブラリー生成および酵母ベースの選択を実施して、親和性をさらに改善した。４ラウンドの選択後、Ａ７９Ｖ変異を有するＶＨバリアントについての顕著な富化が存在した。Ａ７９Ｖバリアントを含む抗体、そのバリアントおよび断片を、０１９ ＩＬ−６ａ抗体、そのバリアントおよび断片と呼ぶ。
（実施例３）
形式選択
抗体ベースのＩＬ−６アンタゴニストに適切な形式を調査するために、上記のように選択したＩＬ−６抗体を、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）およびｓｃＦｖ（ＶＬ−ＶＨ）形態の０１８配列を使用して、一過的発現、安定性、凝集特性、結合親和性およびＩＣ５０について試験した。
候補ＩＬ−６ａ分子（０１８可変領域を含有する配列）のうちの１つについてのこれらの研究の結果を、表１に示す。
これらのデータは、種々の形式の抗体ベースのＩＬ−６アンタゴニストの重要な特色を同定する方法を実証しており、０１８可変領域を含有するＩＬ−６アンタゴニストについて、０１８Ｆａｂ形式が、ｓｃＦｖ構成と比較して、ほとんどの重要なカテゴリー、即ち、発現、安定性、凝集および結合親和性において、最も好ましい特色を有することを示している。０１８ ＦａｂのＩＣ５０は、治療的使用のための合理的な範囲内に入る。
（実施例４）
ＩＬ−６ａ抗体、断片および誘導体の例
本出願人らは、本明細書に記載される方法を使用して以下の配列を同定した。下線を付した配列は、重鎖および軽鎖のＣＤＲを示す。他の配列は、本明細書を通じて見出され得る。
ＩｇＧ１フレームワーク中の０１８重鎖（全長；ｆｌ０１８ＨＣ）ポリペプチド配列
ＩｇＧ１フレームワーク中の０１８重鎖（全長；ｆｌ０１８ＨＣ）核酸配列
ＩｇＧ１フレームワーク中の０１８ Ｆａｂ重鎖（０１８ＦａｂＨＣ）ポリペプチド配列。ＣＤＲに下線を付す
０１８全長軽鎖（ｆｌ０１８ＬＣ）ポリペプチド配列。ＣＤＲに下線を付す
これは、０２０および０２９ ＩＬ−６アンタゴニストについての軽鎖配列でもある。
ＩｇＧ１フレームワーク中の０１８全長軽鎖（０１８ＬＣ）核酸配列
０１９ Ｆａｂ重鎖（０１９ＦａｂＨＣ、Ａ７９Ｖ（太字／イタリック）を除き、０１８ＦａｂＨＣと同じ配列）
０１９ ＶＨ（可変領域／０１９ＨＣ）
０１９抗体軽鎖（０１９ＬＣ）配列（ポリペプチドおよび核酸）は、０１８ＬＣと同じである。
（実施例５）
エピトープおよび構造マッピング
エピトープマッピング
機能的エピトープマッピングを、選択された候補ＩＬ−６アンタゴニストに対して実施した。候補抗体（マウス６４抗体）は、ＥＬＩＳＡにおいてＩＬ−６へのＩＬ−６Ｒαの結合を低減させなかったことが見出され、このことは、この候補抗体が部位Ｉに結合していないことを示している。さらなる実験を実施したところ、キメラマウス６４抗体が、ＥＬＩＳＡにおいてｇｐ１３０へのＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒα複合体の結合を低減させたことが実証され、このことは、ＩＬ−６の部位ＩＩまたは部位ＩＩＩのいずれかが、この抗体に対する結合部位を有したことを示している。マウス６４抗体は、ＩＬ−６への公知の部位ＩＩＩ結合性抗体ＡＨ−６５（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）の結合を顕著に遮断しないこともまた見出され、このことは、この候補抗体がＩＬ−６の部位ＩＩに結合することを示している。これらのデータは、部位ＩＩに対する抗体が生成され得ることを実証し、かかる抗体を同定する方法を実証している。
エピトープをさらに規定するために、ＩＬ−６中の変異を、４ｍ５．３への融合物として、酵母において生成した（Ｂｏｄｅｒら、２０００年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７巻、１０７０１〜１０７０５頁；Ｃｈａｏら、２００６年、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １巻、７５５〜７６８頁）。発現させた変異は、以下の単一または二重変異を有するヒトＩＬ−６中にあった：Ｒ２４Ｅ／Ｄ２７Ｅ、Ｒ３０Ｅ、Ｙ３１Ｅ、Ｄ３４Ｒ、Ｓ１１８Ｒ／Ｖ１２１Ｅ、Ｗ１５７Ｅ、Ｑ１５９Ｅ／Ｔ１６２Ｐ、Ｋ１７１ＥおよびＲ１７９Ｅ。発現させた変異したＩＬ−６分子を、０１８（Ｆａｂ）との結合研究において使用した。０１８（Ｆａｂ）に対する低減された親和性は、Ｒ２４Ｅ／Ｋ２７Ｅ、Ｙ３１Ｅ、Ｄ３４ＲおよびＳ１１８Ｒ／Ｖ１２１Ｒについて観察され、その全てが、ＩＬ−６の部位ＩＩ中に位置している。したがって、本明細書に記載される発明は、ヒトＩＬ−６の２４位、２７位、３１位、３４位、１１８位および１２１位またはＩＬ−６中の等価な部位におけるアミノ酸のうち少なくとも１、２、３、４、５または６個に結合する抗体を含む。
部位ＩＩエピトープの構造的規定
以下の距離を計算して、部位ＩＩを構造的に規定した。計算は、ＩＬ−６／ＩＬ−６α／ｇｐ１３０ヘキサマー結晶構造、ＰＤＢ １Ｐ９Ｍに基づく（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒら、２００３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００巻：２１０１〜２１０４頁）。ＩＬ−６のヘリックス１は、部位Ｉと部位ＩＩとの間に及び、部位ＩＩの近くにあるが部位Ｉの方向を指す側鎖を有する特定の残基、例えば、Ｒ３０を生じる。Ｄ２およびＤ３とは、ＩＬ−６Ｒαの細胞外ドメインを指す。
ＩＬ−６の以下のアミノ酸は、ｇｐ１３０−Ｄ２−Ｄ３の５Å以内に入ると決定された：Ｌ１９、Ｒ２４、Ｋ２７、Ｑ２８、Ｒ３０、Ｙ３１、Ｄ３４、Ｅ１１０、Ｑ１１１、Ｒ１１３、Ａ１１４、Ｍ１１７、Ｓ１１８、Ｖ１２１、Ｑ１２４、Ｆ１２５およびＫ１２８
以下のアミノ酸は、ｇｐ１３０−Ｄ２−Ｄ３の７Å以内に入ると決定された：Ｌ１９、Ｅ２３、Ｒ２４、Ｉ２５、Ｋ２７、Ｑ２８、Ｉ２９、Ｒ３０、Ｙ３１、Ｄ３４、Ｋ４１、Ｑ１０２、Ｅ１０９、Ｅ１１０、Ｑ１１１、Ａ１１２、Ｒ１１３、Ａ１１４、Ｖ１１５、Ｑ１１６、Ｍ１１７、Ｓ１１８、Ｋ１２０、Ｖ１２１、Ｌ１２２、Ｑ１２４、Ｆ１２５およびＫ１２８。
したがって、分子、例えば、部位ＩＩの５Å以内または７Å以内に入るＩＬ−６アミノ酸のうちの１つまたは複数に結合できる抗体またはその断片は、ＩＬ−６ａであり得る。
ヒトＩＬ−６の配列を、参照のために以下に提供する（下線を付した配列はリーダー配列である）。ｇｐ１３０−Ｄ２−Ｄ３の７Å以内のアミノ酸は、イタリックである。アミノ酸番号付け、例えば、エピトープを規定するために使用した変異は、リーダー配列なしである：
ｈ６４−１．４ヒト化抗体のＦａｂ断片を試験する実験を実施したところ、この抗体が、部位ＩＩ標的化に起因して、シスＩＬ−６シグナル伝達およびトランスＩＬ−６シグナル伝達の両方を遮断することができたことが実証された。Ｆａｂ断片の効力は、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）の存在下で変化しなかった。これは、ｓＩＬ６Ｒの存在下で減少した効力を有し、シスシグナル伝達のみを遮断する抗ＩＬ−６Ｒ ＩｇＧとは対照的である。
これらの実験は、部位ＩＩを標的化する抗体または抗体の断片、例えばＦａｂ断片が、Ｉｌ−６のシスシグナル伝達およびトランスシグナル伝達の両方を阻害するために使用できることを実証している。
（実施例６）
霊長類研究
非霊長類活性は、霊長類の活性とは大きく異なり得るので、候補ＩＬ−６アンタゴニストは、典型的には、非ヒト霊長類を使用してＰＫおよび他のパラメーターについてさらに評価される。ヒトＩＬ−６は、７つの部位においてカニクイザルおよびアカゲザルのＩＬ−６とは異なり、そのうちの１つは、部位ＩＩ中にあり（アミノ酸２８）、アフリカミドリザルＩＬ−６の部位ＩＩにおいて同じである。これは、約１／３〜１／４にだけ、０１８配列を含む抗体の結合を減少させるようである。非ヒト霊長類ＩＬ−６に結合する能力は、ＩＬ−６アンタゴニストの有用な特色であり、例えば、非ヒト霊長類における毒性学試験などの試験を可能にすることによって、薬物としてのこの候補の開発を促進する。
ほとんどのＩＬ−６抗体と同様に、本明細書に記載される抗ＩＬ−６抗体は、低い配列相同性に起因して、げっ歯類、ウサギまたはイヌのＩＬ−６とは交差反応しなかった。しかし、親和性研究において、０１８ Ｆａｂは、ほとんどヒトにおける親和性で、カニクイザルおよびアフリカミドリザルのＩＬ−６に結合することが見出された（表２）。
これらのデータは、特異的に結合する本明細書に記載されるＩＬ−６ａの能力、ならびに適切な動物における例えば毒性学についての試験および再現研究を可能にする特性を有する分子を開発する能力をさらに実証している。
（実施例７）
ＩＬ−６ａの漸増する発現
０１８ Ｆａｂおよび０１９ Ｆａｂポリペプチドの発現を増加させるために、当該分野で公知の方法を使用して、ＣＨ１／ヒンジ領域において重鎖に５つのさらなるアミノ酸（ＤＫＴＨＴ（配列番号３０））を導入する構築物を作製した。変更された０１８Ｆａｂ重鎖の配列は、配列番号２４として以下に示される。変更された０１８配列は、本明細書で０２０と呼び、変更された０１９配列は、本明細書で０２１と呼ぶ。０２０分子（０２０Ｆａｂ重鎖および０１８Ｆａｂ軽鎖）は、０１８Ｆａｂ重鎖および０１８Ｆａｂ軽鎖を有する親Ｆａｂと比較して、改善された発現を有した。０１９分子は、０２０分子と比較して、有意な親和性の差異を示さなかった。０２０および０１９の両方の発現は、それぞれ約２倍増加し、親和性は、この変更によって影響を受けなかった。
０２０重鎖（カルボキシ末端にＤＫＴＨＴ（配列番号３０）を有するＦａｂ））
０２０Ｆａｂを使用したＩＬ−６拮抗作用を、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−６レポーター細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）において測定した。細胞を、５０ｎＭのＩＬ−６Ｒαありまたはなしで、１０ｐＭのＩＬ−６と変動する濃度の０２０またはＩＬ−６Ｒα抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｎｔｏｎ、ＭＡ）のいずれかとの混合物中で、インキュベートした。２０〜２４時間のインキュベーション後、２０μＬの細胞培養物上清を、１８０μＬのＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）基質と混合し、１時間インキュベートした；次いで、吸光度を６５５ｎｍで測定した。図３Ａおよび図３Ｂは、これらの実験からのデータを示しており、ＩＬ−６Ｒの存在下または非存在下でＩＬ−６活性を阻害する０２０の能力を実証している。
（実施例８）
ＩｇＧ２ ＩＬ−６抗体
０１８を、当該分野で公知の方法を使用して、ヒトＩｇＧ２アイソタイプフレームワークへと再形式化して、ＩｇＧ１形式の抗体と比較して、ＦｃγＲ結合を低減させ、ＡＤＣＣを低減させた。さらに、０１８を全長形式、例えばＩｇＧ２に再形式化することは、分子のより大きいサイズに起因して、硝子体からのクリアランスの速度を減少させると予測される。
抗ＩＬ６ ＩｇＧ２抗体の構築／精製
上記抗ＩＬ−６配列を使用してヒトＩｇＧ２抗体を構築するために、ヒトＩｇＧ２定常ドメインを、それぞれＮ末端およびＣ末端にＮｈｅＩおよびＭｌｕＩ制限部位を伴って、ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、ＮｈｅＩおよびＭｌｕＩ制限酵素を用いて消化し、次いで、抗ＩＬ６可変ドメイン、即ち、配列番号１（上を参照のこと）を含むｐＴＴ５ベクター中にライゲーションした。これにより、全長ＩｇＧ２重鎖配列が得られた。０１８配列を含む全長軽鎖を含むプラスミドを使用して、軽鎖を提供した。
ＦｃＲｎ結合をさらに低減させ、それによって、ＩＬ−６ａのリサイクルを低減させるために、重鎖中に点変異を作成した。これらの変異は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）変異誘発（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）によって作成した。重鎖および軽鎖プラスミドを、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を使用して、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞の１００ｍＬの一過的培養物中に共トランスフェクトし、約５日間培養して発現を可能にした。これにより、抗ＩＬ−６部位ＩＩ結合部分およびＩｇＧ２構造を含む抗体が生成された。０１８のＣＤＲを含むかかる構造は、本明細書で０１８ＩｇＧ２または０２９と呼ぶ。点変異は、残基Ｉ２５３において作成した。
ＩｇＧ２分子は、十分に発現され、０２０Ｆａｂと比較して僅かに改善された効力で、細胞アッセイにおいてＩＬ−６を遮断する。
変更されたＦｃＲｎ結合
ＩＬ−６は、特定の肯定的な全身作用を有し得る。したがって、硝子体中での良好な保持を有するが、限定的な全身半減期を有するＩＬ−６ａを工学的に作製することが、有利である。ＦｃＲｎ結合の低減または排除は、循環中に逃れる任意の薬物の全身蓄積を低減させ、それによって、ＩＬ−６ａの安全性を改善するはずである。
したがって、ＦｃＲｎ媒介性の輸送は、眼からの抗体の流出を増加させ得るので、０２０ ＩｇＧ２をさらに改変して、残基Ｉ２５４、Ｈ３１１またはＨ４３６（配列番号２３を参照のこと）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、７巻：４号、８６７〜８７７頁（２００１年）に従う番号付け）においてＦｃ変異を導入することによって、ＦｃＲｎ結合を消失させた。変異した部位は、配列番号２３中で太字で示される；Ｉ２５４を、ＡまたはＲに変異させ、Ｈ３１１を、ＡまたはＥに変異させ、Ｈ３１１を、Ｔに変異させたＤ３１３と共にＮに変異させ、Ｈ４３６を、Ａに変異させた（番号付けは、配列番号２３中で下線を付したリーダー配列の後に始まる）。かかる配列を含むＩＬ−６アンタゴニストを、０１８ＩｇＧ２ｍと呼ぶ。
変異部位（太字）を示す抗ＩＬ−６重鎖（ＩｇＧ２）（通常のフォント：ＶＨ；イタリックのフォント：ＣＨ）（リーダー配列なし）
変異部位（太字）を示す抗ＩＬ−６重鎖（ＩｇＧ２）（通常のフォント：ＶＨ；イタリックのフォント：ＣＨ）、リーダー配列（下線を付した）あり
したがって、一部の実施形態は、Ｎに変異したＨ３１１と共に、Ｉ２５４における変異（例えば、ＡまたはＲ）、Ｈ３１１における変異（ＡまたはＥに変異した）、Ｈ４３６における変異（Ａに変異した）、またはＤ３１３における変異（Ｔに変異した）を有する、配列番号２３に示される重鎖配列を有する抗体を含む。
したがって、配列番号２５は、Ｉ１３３（例えば、Ｉ１３３ＡまたはＩ１３３Ｒ）、Ｈ１９０（例えば、Ｈ１９０ＡまたはＨ１９０Ｅ）、Ｈ３１５（例えば、Ｈ３１５Ａ）、またはＨ１９０と共にＤ１９２（例えば、Ｈ１９０Ｎと共にＤ１９２Ｔ）において変異させた場合、その配列を含まない親または他の参照分子と比較して、低いｐＨ、例えば、ｐＨ５．５もしくはリソソームｐＨにおける低減されたＦｃ結合を有するポリペプチドおよび／または低減された全身半減期を有するポリペプチドを産生するために、抗体、その断片または誘導体において使用され得る配列を提供する。
抗ＩＬ−６軽鎖（ＩｇＧ２）（通常のフォント：ＶＫ；イタリックのフォント：ＣＫ）
（実施例９）
製剤安定性
抗ＩＬ−６／ＩｇＧ１ Ｆａｂ断片（ＩｇＧ１ＣＨ１ドメインを含む）の安定性を、示差走査型蛍光定量を使用して、ＰＢＳ中で最初に、次いで一定範囲の緩衝液および賦形剤中で、Ｔｍを決定することによって試験した。クエン酸緩衝液、ｐＨ５．５は、Ｔｍを８０℃超まで増加させることが見出された。したがって、一部の実施形態では、ＩＬ−６ａは、クエン酸緩衝液中に提供され、一部の場合には、少なくとも８０℃のＴｍを有する。
ＳＥＣ−ＭＡＬＳを使用して凝集を試験したところ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中２０ｍｇ／ｍｌで、凝集は観察されなかった。
（実施例１０）
増強されたＰＫのためのｐＨ感受性抗体
ＩＬ−６は、特定の肯定的な全身作用を有し得る。したがって、硝子体中での良好な保持を有するが、限定的な全身半減期を有するＩＬ−６ａを工学的に作製することが、有利である。ＦｃＲｎ結合の低減または排除は、循環中に逃れる任意の薬物の全身蓄積を低減させ、それによって、ＩＬ−６ａの安全性を改善するはずである。したがって、ＦｃＲｎ媒介性の輸送は、眼からの抗体の流出を増加させ得るので、０２０ ＩｇＧ２をさらに改変して、残基Ｉ２５３、Ｈ３１０またはＨ４３５（Ｍａｒｔｉｎら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、７巻：４号、８６７〜８７７頁（２００１年））に従う番号付け）においてＦｃ変異を導入することによって、ＦｃＲｎ結合を消失させた。かかる抗体は、本明細書でＩＬ−６ｐＨ抗体または抗ＩＬ−６ｐＨと呼ばれ、以下にさらに記載される。
ｐＨ感受性結合を有する抗体の生成
ヒスチジンのｐＫａは、約６．０であり、結合界面において挿入されたヒスチジンは、低ｐＨにおける側鎖プロトン化の際に結合を妨害し得る。本明細書に記載される抗ＩＬ−６部位ＩＩ標的化抗体を使用して、０１８由来のＣＤＲのヒスチジンリッチバリアントを含むライブラリーを生成し、このライブラリーを、酵母ディスプレイを使用してｐＨ感受性結合についてスクリーニングした。生成されたライブラリーは、各残基が、野生型残基（即ち、親抗体中と同じ）またはヒスチジン残基のいずれかであるように縮重コドンによってコードされたＣＤＲを有する、コンビナトリアルライブラリーであった。スクリーニングを、生理学的ｐＨ（７．４）における高い結合およびエンドソームｐＨ（５．５）における低い結合について交互にソートすることによって実施した。
ｐＨ７．４における比較的高い結合（親分子についての１９２ｐＭと比較して、変異体について４０７ｐＭの一価Ｋｄ）およびｐＨ５．５における比較的低い結合（親についての１９５ｐＭと比較して、変異体について２．３６２ｎＭの一価Ｋｄ）を有する、酵母で選択された変異体が同定された。これは、ｐＨ５．５における親和性における、およそ５．８倍の変化を構成する。この変異体は、軽鎖ＣＤＲ１中に複数のヒスチジン変異を含有した。したがって、この変異体は、ｐＨ７．４における親分子と類似の結合、およびＨ５．５における親和性の有意な喪失を実証した。この観察を、当該分野で公知の方法によって、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳおよびＳＰＲ分析を使用して検証した。
これらのデータは、ＩＬ−６のシス活性およびトランス活性の両方を阻害するために使用され得るＩＬ−６の部位ＩＩを標的化する抗ＩＬ−６の特色を有する、抗体に基づくＩＬ−６ａが創出され得ることを実証しており、ｐＨ５．５における変更された結合によって少なくとも一部もたらされる、野生型Ｆｃドメインを有する親抗体または他の抗体と比較して増加したＰＫを有している。
（実施例１１）
マウスレーザー脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）モデルにおける局所的ＩＬ−６遮断の有効性
局所的ＩＬ−６遮断が、眼疾患、例えば、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）またはウエット型ＡＭＤを処置するために有効であり得るかどうかを決定するために、モノクローナル抗ＩＬ−６抗体を、脈絡膜新生血管形成のモデル系において局所投与した。Ｓａｉｓｈｉｎら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１９５巻：２４１〜２４８頁（２００３年）に記載されるレーザー誘導性ＣＮＶモデルを、この実施例において使用した。レーザー誘導性ＣＮＶモデルは、炎症および血管形成を含む、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）の基礎をなす病理的プロセスの多くを再現する。
モノクローナル抗マウスＩＬ−６抗体（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌから購入されるラットＩｇＧ１アイソタイプ抗体であるＭＰ５−２０Ｆ３、カタログ番号ＢＥ００４６）を、硝子体内（ＩＶＴ）注射によって試験群に投与した。対照は、ＶＥＧＦトラップの硝子体内注射または抗ＨＲＰアイソタイプ対照抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼに対するラットＩｇＧ１、クローンＨＲＰＮ、ＢｉｏＸＣｅｌｌから購入した；カタログ番号ＢＥ００８８）の硝子体内注射を受けた。全ての抗体群について、１μＬ容積中の２０μｇのタンパク質を、試験眼中に注射し、反対側の眼は、さらなる対照として未処置のままにした。
マウスを、レーザーの後、７日目に安楽死させ、脈絡膜フラットマウントを、Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ（ＧＳＡ）レクチンで染色して、病変面積を測定した。図４は結果を示す。抗ＩＬ−６抗体処置群は、対照抗体処置群と比較して、新生血管形成における統計的に有意な低減を示した（ｐ＜０．０５）。平均して、抗ＩＬ−６抗体処置群は、抗ＶＥＧＦ陽性対照と比較して低減された新生血管形成もまた示した。
これらのデータは、ＩＶＴ投与されたＩＬ−６ａ、例えば、モノクローナル抗ＩＬ−６抗体が、マウスＣＮＶモデルにおいて新生血管形成を有意に低減させ得ることを実証している。これらの結果は、抗ＩＬ−６抗体が、抗ＶＥＧＦ抗体と少なくとも同程度の、またはおそらくはそれよりも大きい、新生血管形成における低減を生じさせ得ることを、さらに示唆している。これらのデータは、ＩＬ−６の局所的阻害が、眼疾患、例えば、ウエット型ＡＭＤまたは黄斑浮腫、例えば、糖尿病性黄斑浮腫などの、脈管漏出が関与する疾患を処置するために有用であることを示している。
（実施例１２）
改善されたＩＬ−６抗体の開発
ＥＢＩ−０２９抗体のバリアントを生成した。変異Ａ２８Ｖ、Ｓ３０Ｐ、Ｉ５１ＴおよびＳ５５Ｇの寄与をより良く特徴付けるために、特定の組合せを、野生型ＥＢＩ−０２９ Ｆａｂディスプレイベクター中に導入し、結合を測定した。結果を図５に示す。２μＭのＩＬ−６との一晩の競合の後、全ての変異体は、野生型ＥＢＩ−０２９ Ｆａｂと比較して、ディスプレイに関してそれらの細胞表面上に残存するビオチン化ＩＬ−６の有意により高いレベルを有した。最も高い親和性から最も低い親和性までの結合の順位は、Ａ２８Ｖ／Ｓ３０Ｐ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ＞Ａ２８Ｖ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ＞Ｓ３０Ｐ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ＞Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ＞ｗｔであった。四重変異Ａ２８Ｖ／Ｓ３０Ｐ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇは、本明細書でＥＢＩ−０３０とも呼ぶ。
ＥＢＩ−０３０の配列を以下に示す。
０３０重鎖可変領域配列（０２９と比較した変異が太字で示される）：
０３０軽鎖可変領域配列：
０３０ Ｆａｂ（ＩｇＧ１）重鎖ポリペプチド配列（ＣＤＲに下線を付した、０２９と比較した変異が太字で示される）：
実施形態では、配列番号３９のカルボキシ末端におけるＤＫＴＨＴ配列（配列番号３０）は、Ｆａｂ配列中に含まれない。
０３０ Ｆａｂ重鎖核酸配列：
０３０はまた、ＩｇＧ２ Ｆａｂ重鎖ポリペプチド配列としても産生され得る：
（実施例１３）
バリアントＦａｂ断片の発現および精製
以下の変異体組合せ、Ａ２８Ｖ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ、Ｓ３０Ｐ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５ＧおよびＡ２８Ｖ／Ｓ３０Ｐ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ（ＥＢＩ−０３０）を含有するＶＨドメインインサートを、ＢａｍＨＩ−ＨＦ／ＮｈｅＩ−ＨＦを用いた二重消化によって酵母ディスプレイベクターから生成した。インサートを、１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、リーダー配列、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインおよびＣ末端Ｈｉｓタグを含有するｐＴＴ５由来哺乳動物発現ベクター中にライゲーションした。形質転換体を、ＬＢ−Ａｍｐ上で選択し、ミニプレップし、インサートを配列決定によって確認した。一過的トランスフェクションを、トランスフェクション試薬としてＰＥＩを使用して、野生型ＥＢＩ−０２９軽鎖（本明細書で配列番号１２として開示される）と対形成した各変異体Ｆａｂ重鎖について、ＨＥＫ−６Ｅ細胞（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）において実施した。野生型ＥＢＩ−０２９ Ｆａｂもまた、対照として発現させた（野生型Ｆａｂ重鎖は、本明細書で配列番号２４として開示される）。上清を５日後に回収し、発現されたＦａｂを、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したタンパク質を、数ラウンドの濃縮／希釈によってＰＢＳ、ｐＨ７．４へと緩衝液交換し、タンパク質の濃度および純度を、吸光度２８０およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。
（実施例１４）
バリアント抗体は、表面プラズモン共鳴を使用して評価した場合、改善された結合を示した
ＩＬ−６に対するバリアント０２９ Ｆａｂ分子の親和性を、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ＳＲ７０００Ｄｃ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒでの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中２０μｇ／ｍＬのヒトＩＬ−６を、標準的なアミンカップリングを介して、５００ｋＤａカルボキシメチルデキストランチップ上に固定化した。１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３中での各Ｆａｂ分子の段階希釈を、２５μＬ／分の流量で２５℃で注入した。４分後、ローディングを停止させ、ランニング緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）を５分間流すことによって、解離を測定した。センサグラムトレースは、チップ上のＩＬ−６の混合型の配向または非特異的抗体結合に潜在的に起因して、１：１結合モデルにあまりあてはまらない。その代り、曲線を、ＴｒａｃｅＤｒａｗｅｒソフトウェアを使用して、２種（低親和性および高親和性種、表３中で「低親和性」および「高親和性」と表示される）のあてはめ（ｆｉｔ）にあてはめた。ここで、ｋａ１、ｋｄ１およびＫＤ１は、低親和性種についての会合速度、解離速度および平衡結合定数であり、ｋａ２、ｋｄ２およびＫＤ２は、高親和性種についての会合速度、解離速度および平衡結合定数である。全ての変異体Ｆａｂは、最も高い親和性から最も低い親和性までの以下の順位で、ｗｔ ＥＢＩ−０２９ Ｆａｂと比較して、顕著により緩徐な解離を有した−Ａ２８Ｖ／Ｓ３０Ｐ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ（ＥＢＩ−０３０）＞Ｓ３０Ｐ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ＞Ａ２８Ｖ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ＞ＷＴ（ＥＢＩ−０２９）。
（実施例１５）
バリアント抗体は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ６レポーター細胞において、改善されたアンタゴニスト効力を示した
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ６レポーター細胞株（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して、異なる変異体ＥＢＩ−０２９ Ｆａｂ断片間でＩＬ６シグナル伝達阻害の効力を比較した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ６細胞は、ＩＬ−６Ｒ遺伝子を安定に発現し、４つのＳＴＡＴ３結合部位に融合させたＩＦＮβ最小プロモーターの制御下に分泌型アルカリホスファターゼレポーター遺伝子を含有する、改変されたＨＥＫ２９３株である。ＩＬ６拮抗作用を測定するために、１０μＬの４００ｐＭヒトＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２０６−ＩＬ−０１０／ＣＦ）を、９６ウェルプレート中で一定範囲の濃度の各Ｆａｂバリアント１０μＬと混合し、ＲＴで３０分間インキュベートした。対数期にあるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ６細胞をトリプシン処理し、アッセイ培地（ＤＭＥＭ、４．５ｇ／ｌグルコース、１０％熱不活化ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｐｅｎ−Ｓｔｅｐ）中に２８０，０００細胞／ｍＬで再懸濁した。１８０μＬの細胞懸濁物を、ＩＬ−６／Ｆａｂ混合物の各ウェルに添加して、最終ＩＬ−６濃度を２０ｐＭにした。これらの細胞を、３７℃／５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。次いで、各ウェルからの上清２０μＬを、１８０μＬのＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合し、３７℃で４０分間インキュベートし、その後、６５０ｎＭにおける吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで測定した。ＩＬ−６なしのウェルからのバックグラウンドシグナルを減算し、次いで、阻害剤なしのＩＬ−６処理細胞によって除算して、シグナル伝達率値を導出した。全ての変異体が、以下のようなアンタゴニスト効力の順位で、ｗｔ ＥＢＩ−０２９ Ｆａｂと比較して、有意に高い効力を示した：Ａ２８Ｖ／Ｓ３０Ｐ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ（ＥＢＩ−０３０）＞Ａ２８Ｖ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ＞Ｓ３０Ｐ／Ｉ５１Ｔ／Ｓ５５Ｇ＞ＷＴ（ＥＢＩ−０２９）。これらの結果を図６に示す。
（実施例１６）
バリアント抗体は、Ｔ１１６５増殖アッセイにおいて改善されたアンタゴニスト効力を示した
Ｔ１１６５．８５．２．１細胞（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、マウス、ラットまたはヒトのＩＬ−６に応答して増殖するマウス形質細胞腫細胞株である。ＥＢＩ−０２９ Ｆａｂ変異体からの拮抗作用を測定するために、２５μＬの２ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２０６−ＩＬ−０１０／ＣＦ）を、９６ウェルプレート中で一定範囲の濃度の各Ｆａｂバリアント２５μＬと混合し、ＲＴで３０分間インキュベートした。対数期にあるＴ１１６５細胞をペレット化し、アッセイ培地（９０％ＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）中に２×１０５細胞／ｍＬで再懸濁した。５０μＬの細胞懸濁物を、ＩＬ−６／Ｆａｂ混合物の各ウェルに添加して、最終ＩＬ−６濃度を０．５ｎｇ／ｍＬにした。これらの細胞を、３７℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。１００μＬのＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加し、ＲＴで１０分間インキュベートした。ルミネセンスを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで測定した。全ての変異体が、ｗｔ ＥＢＩ−０２９ Ｆａｂと比較して有意に高い効力を示し、試験した範囲のＦａｂ濃度を超えると、測定可能なＩＬ−６シグナル伝達はなかった（図７を参照のこと）。
（実施例１７）
バリアント抗体の薬物様特性の比較
各Ｆａｂバリアントの熱安定性を、示差走査型蛍光定量（ＤＳＦ）によって決定した。２．５ｍｇ／ｍＬまたは５ｍｇ／ｍＬのタンパク質２μＬを、ＢｉｏＲａｄ ９６ウェルＰＣＲプレート中で、１８μＬのＰＢＳおよび２μＬの５０×Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅと混合した。このプレートを、２５℃および９５℃からの線形温度増加を用いてＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍにおいて実行し、蛍光を経時的に測定した。Ｔｍを、融解曲線の一次導関数の最低点として計算した。全てのバリアントは、７６℃におけるｗｔ ＥＢＩ−０２９ Ｆａｂの測定されたＴｍと一致して、７６℃と７８℃との間の測定されたＴｍ値を有した。
凝集を測定するために、試料を、Ｗｙａｔｔ ｍｉｎｉＤａｗｎ ＴＲＥＯＳ光散乱装置およびＷｙａｔｔ Ｏｐｔｉｌａｂ ｒＥＸ屈折率装置と組み合わせてＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣを使用するＳＥＣ−ＭＡＬＳによって評価した。２０〜１００μｇのタンパク質を注入し、１ｍＬ／分の流量で実行した。全てのバリアントが、野生型ＥＢＩ−０２９ Ｆａｂと一致して、光散乱によって測定した場合、４５０００Ｄａと５２０００Ｄａとの間の分子量を有した。
これらの結果は、ＥＢＩ−０３０が、その薬物様特性に関して、ＥＢＩ−０２９と比較して同様に良好に挙動することを示している。
（実施例１８）
全長ＥＢＩ−０２９およびＥＢＩ−０３０ ＩｇＧ２抗体ならびに変異体Ｆｃドメインを有するＩｇＧ２抗体の産生
ＥＢＩ−０２９およびＥＢＩ−０３０をＩｇＧ２および変異体Ｆｃ ＩｇＧ２に再形式化する
リーダー配列（ＭＤＷＴＷＲＩＬＦＬＶＡＡＡＴＧＡＨＳ；配列番号４９）を含むＥＢＩ−０２９およびＥＢＩ−０３０の重鎖可変ドメインを、Ｎ末端ＥｃｏＲＩ部位およびＣ末端ＮｈｅＩ部位を導入したプライマーを使用して、ＦａｂベクターからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上で精製し、ＥｃｏＲＩ−ＨＦおよびＮｈｅＩ−ＨＦを用いて二重消化した。野生型ＩｇＧ２重鎖配列またはＨ３１１Ａ変異を有するバリアントＩｇＧ２ドメイン（Ｈ３１１は、配列番号４１中の番号付けに対応する；これは、Ｍａｒｔｉｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、７巻：４号、８６７〜８７７頁（２００１年）に提供された番号付けではＨ３１０に対応する）を含むｐＴＴ５ベースの骨格ベクターを、ＥｃｏＲＩ−ＦＨ／ＮｈｅＩ−ＨＦを用いて同様に消化し、１％アガロースゲル上で精製した。インサートを、Ｑｕｉｋｌｉｇａｓｅ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、消化された骨格中にライゲーションし、ＴＯＰ１０細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に形質転換し、ＬＢ−Ａｍｐ上で選択した。クローンをミニプレップし、配列決定して、インサートを確認した。眼の組織から逃れる分子の全身蓄積を低減させるために、Ｈ３１１Ａ変異を選択して、ＦｃＲｎに対するＦｃ結合親和性を低減させた。
一過的トランスフェクションによるＩｇＧ２バリアントの発現および精製
ＥＢＩ−０２９ ＩｇＧ２、ＥＢＩ−０２９ ＩｇＧ２−Ｈ３１１Ａ、ＥＢＩ−０３０ ＩｇＧ２およびＥＢＩ−０３０ ＩｇＧ２−Ｈ３１１Ａを、一過的トランスフェクションによってＨＥＫ−６Ｅ細胞において発現させた。各重鎖を含有するｐＴＴ５ベクターを、トランスフェクション試薬としてＰＥＩを使用して、ＥＢＩ−０２９ ＬＣプラスミドと共トランスフェクトした。上清を５日後に回収し、発現されたＩｇＧ２分子を、プロテインＡアガロースを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したタンパク質を、数ラウンドの濃縮／希釈によってＰＢＳ、ｐＨ７．４へと緩衝液交換し、タンパク質の濃度および純度を、吸光度２８０およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。
ＣＨＯの安定なプールの産生
ＥＢＩ−０２９ ＩｇＧ２、ＥＢＩ−０３０ ＩｇＧ２またはＥＢＩ−０３０ ＩｇＧ２−Ｈ３１１Ａを産生する安定なＣＨＯプールを、製造業者の指示に従って、Ｆｒｅｅｄｏｍ ＣＨＯ−Ｓキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して生成した。簡潔に述べると、各重鎖を、ＥＢＩ−０２９ ＬＣと組み合わせて、標準的な消化／ライゲーションによってｐＣＨＯ １．０ベクター中にクローニングした。構築物を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ＭＡＸ試薬を使用してＣＨＯ−Ｓ細胞中にトランスフェクトし、安定なプールを、漸増濃度のピューロマイシンおよびＭＴＸを用いて選択した。２ラウンドの選択の後、プールを、分析的プロテインＡクロマトグラフィーによって抗体産生についてスクリーニングし、最も高い産生体を、スケールアップおよびサブクローニングのために選択した。
配列を以下に示す。
０３０重鎖ポリペプチド配列（ＩｇＧ２フレームワーク中、ＣＤＲに下線を付した）：
０３０軽鎖ポリペプチド配列（ＩｇＧ２フレームワーク中、ＣＤＲに下線を付した）：
０３０重鎖核酸配列：
０３０軽鎖核酸配列：
Ｈ３１１Ａ変異を有する０３０重鎖ポリペプチド配列（３１１Ａは太字であり、ＣＤＲに下線を付す）、本明細書で０３１重鎖ポリペプチド配列とも呼ぶ：
０３１重鎖核酸配列：
（実施例１９）
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＩＬ６アッセイにおけるＥＢＩ−０３０対ＥＢＩ−０２９ ＩｇＧ２の効力比較
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ６レポーター細胞株（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して、ＥＢＩ−０２９ ＩｇＧ２抗体とＥＢＩ−０３０ ＩｇＧ２抗体との間で、ＩＬ６シグナル伝達阻害の効力を比較した。安定なＣＨＯプールにおいて産生されたＥＢＩ−０３０ ＩｇＧ２のプレップと共に、ＨＥＫ−６Ｅ細胞から精製した３つのタンパク質プレップを比較した−ＥＢＩ−０２９ ＩｇＧ２、ＥＢＩ−０３０ ＩｇＧ２およびＥＢＩ−０３０ ＩｇＧ２−Ｈ３１１Ａ（０３１またはＥＢＩ−０３１とも呼ぶ）。さらに、承認された抗ＩＬ６Ｒ抗体トシリズマブを、対照として含めた。ＩＬ６拮抗作用を測定するために、４００ｐＭのヒトＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２０６−ＩＬ−０１０／ＣＦ）を、９６ウェルプレート中で変動する濃度の各抗体と混合し、ＲＴで３０分間インキュベートした。対数期にあるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ６細胞をトリプシン処理し、アッセイ培地（ＤＭＥＭ、４．５ｇ／ｌグルコース、１０％熱不活化ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｐｅｎ−Ｓｔｅｐ）中に２８０，０００細胞／ｍＬで再懸濁した。１８０μＬの細胞懸濁物を、ＩＬ−６／Ｆａｂ混合物の各ウェルに添加して、最終ＩＬ−６濃度を２０ｐＭにした。これらの細胞を、３７℃／５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。次いで、各ウェルからの上清２０μＬを、１８０μＬのＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合し、３７℃で４０分間インキュベートし、その後、６５０ｎＭにおける吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで測定した。
結果を図８および表５に示す。ＥＢＩ−０３０（Ｈ３１１Ａ変異ありまたはなしの、ＨＥＫ細胞中で産生されたＥＢＩ−０３０、およびＣＨＯ細胞中で産生されたＥＢＩ−０３０が含まれる）は、ＥＢＩ−０２９と比較して、大きく改善された効力（ＩＣ５０における約１／５０の減少およびＩＣ９０における１／１００未満への減少）を示した。効力における増加は、ＳＰＲによって測定した親和性における増加よりも大きかった。
ＥＢＩ−０３１（本明細書でＥＢＩ−０３０ ＩｇＧ２−Ｈ３１１Ａとも呼ぶ）は、ＥＢＩ−０２９のＩＣ５０の１／７５未満のＩＣ５０、およびＥＢＩ−０２９のＩＣ９０の約１／３５０のＩＣ９０を有した。ＨＥＫ細胞において産生されたＥＢＩ−０３０は、ＥＢＩ−０２９のＩＣ５０の１／５０未満のＩＣ５０、およびＥＢＩ−０２９のＩＣ９０のおよそ１／４０００のＩＣ９０を有した。
（実施例２０）
硝子体ＩＬ−６遮断の持続時間に対する増加した効力のモデル化分析
硝子体内投与後のＩＬ−６遮断の程度および持続時間に対する増加した効力の影響を、薬物動態モデルを使用してシミュレートした（図９）。遊離抗体（Ａ）、遊離ＩＬ−６（ＩＬ）および抗体／ＩＬ−６複合体（ＡＩＬ）における変化を記述する微分方程式を、以下のように規定した：
ｄ／ｄｔ（Ａ）＝−Ａ＊ｋａｅ−Ａ＊ＩＬ＊ｋ１＋ＡＩＬ＊ｋ２
ｄ／ｄｔ（ＩＬ）＝ｋｐｉ−ＩＬ＊ｋｉｅ−Ａ＊ＩＬ＊ｋ１＋ＡＩＬ＊ｋ２
ｄ／ｄｔ（ＡＩＬ）＝−ＡＩＬ＊ｋａｉｅ＋Ａ＊ＩＬ＊ｋ１−ＡＩＬ＊ｋ２
式中、ｋａｅは、硝子体からの遊離抗体クリアランスの速度であり、ｋ１は、抗体／ＩＬ−６結合についての会合速度であり、ｋ２は、抗体／ＩＬ６複合体についての解離速度であり、ｋｐｉは、ＩＬ−６産生の速度であり、ｋｅｉは、硝子体からの遊離ＩＬ−６クリアランスの速度であり、ｋａｉｅは、硝子体からの抗体／ＩＬ−６複合体クリアランスの速度である。出発パラメーター値および速度を、表６に示すように規定した。
Ａ０を、５ｍＬの硝子体容積を有するヒト眼中への５０μＬ用量の５０ｍｇ／ｍＬ抗体の前提に基づいて計算した。ＩＬ０を、約２００ｐｇ／ｍＬの、ＤＭＥ患者における硝子体ＩＬ−６についての臨床的に測定された値に基づいて推定した。ｋ１を、１Ｅ５Ｍ−１ｓ−１の典型的な抗体会合速度に基づいて推定し、ｋ２を変動させて、１００ｐＭから１ｐＭまでの範囲の効力値をシミュレートした。ｋａｅを、ヒトＰＫについて、以前に測定されたように１．８の比率での約１１日間のウサギにおける測定された硝子体クリアランス半減時間から導出した。ｋｉｅを、２４時間のクリアランス半減時間において推定し、ｋｐｉを、ＩＬ０ ＊ｋｉｅとして計算した。
遊離抗体および遊離ＩＬ−６のシミュレーションを、３００日間の時間経過にわたってＢｅｒｋｅｌｅｙ Ｍａｄｏｎｎａソフトウェアを使用して実施した（図１０）。９５％ ＩＬ−６遮断のカットオフを選択して、阻害の持続時間を測定した。このモデルは、抗体効力を増加させることで、眼におけるＩＬ−６阻害の持続時間が、ｋ２／ｋ１＝１００ｐＭについての１３０日間から、ｋ２／ｋ１＝１０ｐＭについての２００日間からｋ２／ｋ１＝１ｐＭについての２２５日間まで、有意に延長されることを予測する。
（実施例２１）
ＩＬ−６ａの薬物動態
薬物動態（ＰＫ）実験を、ＰｈａｒｍＯｐｔｉｍａ（Ｐｏｒｔａｇｅ、ＭＩ）によって雄性Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ Ｒａｂｂｉｔにおいて実施した。全ての動物は、１２〜１３月齢であり、重量が２．６１〜３．４２ｋｇであった。以下のタンパク質を比較した：ＥＢＩ−０２９−ＩｇＧ２（配列番号１１および配列番号１２）、ＥＢＩ−０２９−ＩｇＧ２−Ｈ３１１Ａ（配列番号１０および配列番号１２）、ＥＢＩ−０３０（配列番号４１および配列番号４２）、ＥＢＩ−０３０−ＩｇＧ２−Ｈ３１１Ａ（配列番号４７および配列番号４２）、ＥＢＩ−０２９ Ｆａｂ（配列番号２４および配列番号１２）、Ｅｙｌｅａ（登録商標）（ＶＥＧＦトラップ）およびトシリズマブ（ＴＣＺ；抗ＩＬ６Ｒ抗体）。全てのタンパク質を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中１３．８ｍｇ／ｍＬで製剤化した。ＥＢＩ−０２９−ＩｇＧ２、ＥＢＩ−０２９−ＩｇＧ２−Ｈ３１１Ａ、ＥＢＩ−０３０、ＥＢＩ−０３０−ＩｇＧ２−Ｈ３１１Ａ、ＥＢＩ−０２９ Ｆａｂおよびトシリズマブは、ウサギにおいてそれらの標的抗原に結合しないが、Ｅｙｌｅａ（登録商標）は、ウサギＶＥＧＦに結合する。
硝子体内ＰＫの調査のために、９匹の動物の各眼に、５０μＬの試験物品を注射した。注射前に、塩酸リドカイン（注射剤２％）、０．５％プロパラカインまたは０．５％テトラカインを、眼表面に適用した。注射を、眼の背側側頭側（ｄｏｒｓｏｔｅｍｐｏｒａｌ）四分円を介して挿入したＢＤ ３００μＬインスリンシリンジ（３１Ｇ×５／１６インチ針）を用いて硝子体中央部内に実施した。全身ＰＫの調査のために、３匹の動物に、耳静脈を介して１００μＬの試験物品を注射した。
逐次的な血液試料を、０．０８３、１、４、８、２４、７２、１６８、２４０および３３６時間の時点においてＩＶＴアームおよびｉｖアームの両方における３匹の動物から収集し、クエン酸塩−リン酸塩−デキストロース溶液で１：１希釈し、氷上に配置した。血漿を、４０００ｒｐｍで４℃で１０分間の冷却血液試料の遠心分離によって回収し、−８０℃で凍結貯蔵した。
眼の組織を、ＩＶＴアーム中の全ての動物の両眼から、用量後０．２５、２４、１６８および３３６時間の時点で回収した。動物を、静脈内バルビツレート過量を介して安楽死させた。眼房水を回収するために、安楽死の直後に、針を有するシリンジを角膜下に挿入し、眼房水を緩徐に引き出した。眼房水を、事前ラベルしたチューブに移し、ドライアイス上に配置したか、または−８０℃で凍結させた。硝子体液を回収するために、小さいスライスを、メスを使用して、眼球除去した眼の強膜中に導入し、硝子体を、シリンジを介して開口部を通じて引き出した。この試料を、シリンジ上の目盛によって測定し、事前ラベルしたチューブに移し、ドライアイス上に配置したか、または−８０℃で凍結させた。
網膜および脈絡膜を回収するために、小さいスライスを、メスを用いて、縁に対して並行かつ尾側で、眼球除去した眼の強膜中に導入した。ハサミを使用して、眼の眼球周囲の開口を続けて、眼球を２つの半分に分離した。後側眼球を、内部が上を向くように位置させた。ギルナイフ（ｇｉｌｌ ｋｎｉｆｅ）を使用して、網膜を、眼球から注意深く収集した。網膜を眼球から収集したところで、脈絡膜を、残りの眼球から類似の様式で収集した。両方の試料を別々に、事前秤量し事前ラベルしたＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）チューブに移し、秤量し、ドライアイス上に配置したか、または−８０℃で凍結させた。網膜および脈絡膜組織を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で１０倍希釈し、ホモジナイズし、−８０℃で貯蔵した。
各組織におけるタンパク質濃度を、ＥＬＩＳＡによって評価した。ＥＢＩ−０２９−ＩｇＧ２、ＥＢＩ−０２９−ＩｇＧ２−Ｈ３１１Ａ、ＥＢＩ−０３０、ＥＢＩ−０３０−ＩｇＧ２−Ｈ３１１ＡおよびＥＢＩ−０２９ Ｆａｂについて、Ｃｏｓｔａｒ半容積プレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのヒトＩＬ−６で、ＲＴで１時間コーティングした。ウェルを、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳでブロッキングし、洗浄し、次いで、希釈剤としてＰＢＳ＋５％ウサギ血漿＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を使用して、各試料についての一連の希釈物と共にインキュベートした。精製されたタンパク質を使用する検量線もまた、各プレート上に含めた。試料を、ＲＴで６０分間インキュベートし、次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ ３００μｌで３回洗浄した。次いで、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中に１：１０，０００希釈した抗カッパ−ＨＲＰ（Ｇｅｎｗａｙ Ｉｎｃ．）を各ウェルに添加し、３０分間インキュベートした。ウェルを、上記のように洗浄し、次いで、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加し、シグナルを、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダーで４５０ｎｍおよび５５０ｎｍにおいて測定した。タンパク質濃度を、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ ６ソフトウェアを使用して検量線に基づいて計算した。各ＥＬＩＳＡを、少なくとも３つの独立したプレート上で反復し、平均半減時間を報告した。
トシリズマブについて、抗トシリズマブＦａｂ（ＢｉｏＲａｄ ＨＣＡ２５２）を捕捉試薬として使用し、抗ヒト−ＩｇＧ−Ｆｃ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ Ａ０１７０）を検出抗体として使用したこと以外上記と同様のＥＬＩＳＡによって、タンパク質濃度を決定した。２つの異なるＥＬＩＳＡアッセイを使用して、遊離および総Ｅｙｌｅａ（登録商標）を測定した。遊離Ｅｙｌｅａ（登録商標）について、ウェルを、組換えＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングし、結合したタンパク質を、抗ヒト−ＩｇＧ−Ｆｃ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ Ａ０１７０）を用いて検出した。総Ｅｙｌｅａ（登録商標）を測定するために、抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ Ｉ２１３６）を捕捉のために使用し、抗ヒトＩｇＧ−ＣＨ２−ＨＲＰ（ＢｉｏＲａｄ ＭＣＡ６４７Ｐ）を検出のために使用した。各ＥＬＩＳＡを、少なくとも３つの独立したプレート上で反復し、平均半減時間を報告した。
結果の要約
ほとんどの動物において、注射されたタンパク質に対する頑強な抗体形成が、２４０時間および３３６時間の時点で観察された。この抗体形成は、タンパク質クリアランスに影響を与え得る、またはＥＬＩＳＡを妨害し得るので、データ分析を、最大で１６８時間かつ１６８時間を含む時点に限定した。硝子体内ＰＫについて、ＥＢＩ−０２９およびＥＢＩ−０３０ ＩｇＧ２タンパク質の全てが、Ｅｙｌｅａ（登録商標）（Ｔ１／２＝６．３日間）、トシリズマブ（Ｔ１／２＝４．８日間）またはＥＢＩ−０２９ Ｆａｂ断片（Ｔ１／２＝３．９日間）と比較して、有意により緩徐に（それぞれ、ＥＢＩ−０２９、ＥＢＩ−０２９−Ｈ３１１Ａ、ＥＢＩ−０３０およびＥＢＩ−０３０−Ｈ３１１Ａについて、Ｔ１／２＝９．３、９．０、１５．７および９．８日間）取り除かれた（図１１、表７）。類似の傾向が、網膜、脈絡膜および眼房水において観察され、ＥＢＩ−０３０およびＥＢＩ−０３０−Ｈ３１１Ａは、Ｅｙｌｅａ（登録商標）およびトシリズマブと比較して、より高いレベルで蓄積した（図１２および図１３を参照のこと）。全てのタンパク質が、ＩＶＴ投与後に血漿中で検出可能であり、ＥＢＩ−０２９、ＥＢＩ−０３０およびトシリズマブは、Ｅｙｌｅａ（登録商標）またはＥＢＩ−０３０−Ｈ３１１Ａよりも有意に高いレベルで蓄積した（図１４を参照のこと）。同様に、Ｅｙｌｅａ（登録商標）およびＥＢＩ−０３０−Ｈ３１１Ａは、ＩＶ投与後に血漿からより迅速に取り除かれ、ＥＢＩ−０３０−Ｈ３１１Ａの半減時間は、低減されたＦｃＲｎ結合に起因して、野生型ＩｇＧ２の半減時間のおよそ半分であった（表７）。
（実施例２２）
高濃度でのＥＢＩ−０３１の溶解度
精製されたＥＢＩ−０３１を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５スピンコンセントレーターを使用して、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で３ｍｇ／ｍＬから１４２ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。濃縮前および濃縮後プレップを、Ｗｙａｔｔ ｍｉｎｉＤａｗｎ ＴＲＥＯＳ光散乱装置およびＷｙａｔｔ Ｏｐｔｉｌａｂ ｒＥＸ屈折率装置と組み合わせてＴｏｓｏｈ Ｇ３０００ＳＷＸＬ ７．８×３０ ＳＥＣカラム上で実行することによって、凝集について評価した。２０μｇのタンパク質を注入し、ＰＢＳ中１ｍＬ／分の流量で実行した。約１５０ｋＤａの予測分子量におけるピークについての質量分率は、２つの濃度についておよそ等しく（３ｍｇ／ｍＬプレップについて９０．９％、１４２ｍｇ／ｍＬプレップについて９１．３％）、このことは、濃縮の間にタンパク質凝集において顕著な増加が存在しなかったことを示している。これらの結果は、ＥＢＩ−０３１が、測定可能な凝集をほとんど伴わずに（１０％凝集未満）、最大で１４２ｍｇ／ｍＬまで濃縮され得ることを実証している。
（実施例２３）
ＥＢＩ−０３１は、シス−ＩＬ６シグナル伝達およびトランス−ＩＬ６シグナル伝達を遮断する
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ６レポーター細胞株（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して、シス−ＩＬ６シグナル伝達およびトランス−ＩＬ６シグナル伝達を遮断することについての、ＥＢＩ−０３１およびトシリズマブの効力を比較した。シス−シグナル伝達について、遊離ＩＬ−６（最終濃度＝２０ｐＭ）を、９６ウェルプレート中で一定範囲の濃度のＥＢＩ−０３１またはトシリズマブと混合し、ＲＴで３０分間インキュベートした。対数期にあるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ６細胞をトリプシン処理し、アッセイ培地（ＤＭＥＭ、４．５ｇ／ｌグルコース、１０％熱不活化ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｐｅｎ−Ｓｔｅｐ）中に再懸濁し、５０，０００細胞を、２００μＬの最終容積で各ウェルに添加した。プレートを、３７℃／５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。次いで、各ウェルからの上清５０μＬを、１５０μＬのＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合し、３７℃で４０分間インキュベートし、その後、６５０ｎＭにおける吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで測定した。ＩＬ−６なしのウェルからのバックグラウンドシグナルを減算し、次いで、阻害剤なしのＩＬ−６処理細胞によって除算して、シグナル伝達率値を導出した。ＥＢＩ−０３１（ＩＣ５０＝１４．２ｐＭ）は、トシリズマブ（ＩＣ５０＝１２．９ｎＭ）と比較して、９００倍を超えて高い効力で遊離ＩＬ−６を遮断する（図１６Ａ）。
トランス−シグナル伝達の遮断を測定するために、遊離ＩＬ−６の代わりに、２００ｐＭの最終濃度でハイパーＩＬ−６を使用したこと以外、実験を上記のように実施した。ハイパーＩＬ−６は、ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６受容体との間の遺伝子融合物である（Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５巻：１４２〜１４５頁（１９９７年））。ＥＢＩ−０３１は、ハイパーＩＬ−６を強力に遮断したが（ＩＣ５０＝３２ｐＭ）、トシリズマブは、１μＭ濃度まで、シグナル伝達を有意に阻害することができなかった（図１６Ｂ）。
これらの結果は、ＥＢＩ−０３１が、ｐＭの親和性で、部位ＩＩ、またはｇｐ１３０と接触する部位においてヒトＩＬ−６に結合し、細胞アッセイにおけるＩＬ−６およびＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒα複合体のシグナル伝達を、トシリズマブよりも９００倍を超えて強力に遮断することを示している。
（実施例２４）
ＩＬ−６シグナル伝達の硝子体内ＥＢＩ−０３１抑制についてのコンピューターシミュレーション
コンピューターシミュレーションを、実施例２０に記載したように実施して、ヒトにおけるＥＢＩ−０３１の硝子体内投与がＩＬ−６シグナル伝達の９５％を抑制するであろう時間の長さを予測した。効力アッセイで測定した場合にｋ２／ｋ１＝１４ｐＭになるように、ｋ２を０．１２ ｄ−１に設定した。Ｔ１／２クリアランスを、ヒトに対して１．８の比率でのウサギにおける測定された硝子体内クリアランス半減時間に基づいて、１８日間に設定した。全ての他のパラメーターは表６に記載する。このモデルは、ＥＢＩ−０３１が、硝子体内投与後約１５０日間にわたってＩＬ−６シグナル伝達の９５％を遮断するはずであると予測する（図１７）。これらのモデル化結果は、ＥＢＩ−０３１が、長い期間、例えば、最大で約６ヶ月間にわたって、眼におけるＩＬ−６シグナル伝達を実質的に遮断できることを示している。
（実施例２５）
ＥＢＩ−０３１アイソフォームの特徴付け
ＥＢＩ−０３１はＩｇＧ２抗体である。以前に議論したように、ＩｇＧ２抗体は、３つの異なる構造的アイソフォーム、ＩｇＧ２−Ａ、ＩｇＧ２−ＢおよびＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームで存在する（図１８）。この実施例では、ＥＢＩ−０３１試料中の構造的アイソフォームを同定するための実験を実施した。
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析
逆相高速液体クロマトグラフ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して、ＥＢＩ−０３１の種々の構造的アイソフォームを分解した。ＩｇＧ２ジスルフィド媒介性構造的アイソフォームを分解するために以前に使用された増強分析ＲＰ−ＨＰＬＣ法（Ｄｉｌｌｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ、２００６年、１１２０巻：１１２〜１２０頁を参照のこと）を、ＥＢＩ−０３１を分解するために最適化した。
およそ３０μｇを含むＥＢＩ−０３１試料を、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ８カラム（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、５．０μｍ、３００Å）上にロードした。カラム温度を７５℃に設定した。移動相Ａは、０．１％ＴＦＡを含む水であり、移動相Ｂは、５５％ＩＰＡ、４０％ＡＣＮ、４．９％水および０．１％ＴＦＡであった。流量は０．５ｍＬ／分であった。このカラムを、９０％移動相Ａおよび１０％移動相Ｂで２分間最初に平衡化し、その後、１０％Ｂから２５％Ｂまでの２分間のステップ勾配が続いた。溶出を、２１分間にわたる２５〜３２％Ｂの線形勾配で達成した。ＵＶ吸光度を、２１４ｎｍおよび／または２８０ｎｍにおいてモニタリングした。
この分解がジスルフィドに関連するかどうかを決定するために、試料を、室温で２分間５ｍＭ ＤＴＴおよび１０ｍＭシステインで処理し、次いで、ＲＰ−ＨＰＬＣ法で分析した（図１９）。強力な還元剤であるＤＴＴによる処理は、ＩｇＧ２抗体の還元を引き起こし、初期ピーク（ピーク０およびピーク１）への溶出を生じる（図１９、中央のパネル）。ＤＴＴと比較してより穏やかな還元剤であるシステインによる処理もまた、ＤＴＴ処理試料において見られた程度までではなかったものの、アイソフォーム分布を初期ピーク（ピーク０およびピーク１）に向けてシフトさせる（図１９、下のパネル）。
このデータは、ＲＰ−ＨＰＬＣ法が、異なるジスルフィド接続性を有する構造的アイソフォームを分解したことを実証している。異なるジスルフィド結合構造を、非還元ペプチドマッピングおよび質量分析的分析によって確認した：初期に溶出するピーク（ピーク１）は、ＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームを含み、後に溶出するピーク（ピーク２）は、ＩｇＧ２−Ａアイソフォームを含む。重要なことに、ＥＢＩ−０３１試料では、ＩｇＧ２−ＢアイソフォームＢ（ピーク０）は検出されなかった（図１９、上のパネル）。
異なるＥＢＩ−０３１試料の比較
上記ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を使用して、異なるＥＢＩ−０３１発現細胞株から収集したＥＢＩ−０３１試料を分析して、産生された抗体のアイソフォーム分布を比較した。ＥＢＩ−０３１試料を、クローン性細胞株の２００Ｌスケールの培養物、親細胞株からの１０Ｌスケールの培養物、および細胞の安定にトランスフェクトされたプールから収集した。ＥＢＩ−０３１を、クローン性および親ＥＢＩ−０３１発現細胞株から、３ステップクロマトグラフィー法を使用して精製した。ＥＢＩ−０３１を、プロテインＡ精製を使用して、細胞の安定にトランスフェクトされたプールから精製した。これらの試料を、上記方法によって分析した。
図２０に示される結果は、３つ全てのＥＢＩ−０３１試料が、アイソフォームＩｇＧ２−ＡおよびＩｇＧ２−Ａ／Ｂを含有したが、実質的な量のＩｇＧ２−Ｂは含有しなかったことを示している。このデータは、産生が、クローン性ＥＢＩ−０３１発現細胞株からであれ、親ＥＢＩ−０３１発現細胞株からであれ、ＥＢＩ−０３１を安定に発現する不均一な細胞集団からであれ、このＥＢＩ−０３１ ＩｇＧ２抗体が、他のＩｇＧ２抗体よりも不均一ではない混合物として産生されることを実証している。図２１は、クローン性ＥＢＩ−０３１発現細胞株、例えば、図２０の上のパネルの２００Ｌスケールの培養物由来のＥＢＩ−０３１試料からのアイソフォームの分布を示す。曲線下面積もまた測定し、アイソフォーム間の分布を図の下の表に示す。
（実施例２６）
霊長類研究における薬物動態
ＥＢＩ−０３１の薬物動態を、霊長類研究において調査した。２匹の雄性アフリカミドリザルを試験した。５０ｍｇ／ｍＬのＥＢＩ−０３１ ５０μｌを、眼中に硝子体内注射した。Ｍａｄｏｎｎａソフトウェアを、曲線あてはめに使用した。
霊長類研究からのデータを、曲線あてはめを使用してモデル化した。硝子体中の抗体（Ａ）および硝子体の外側、例えば全身の抗体（Ａｐ）における変化を記述する微分方程式を、以下のように規定した：
ｄ／ｄｔ（Ａ）＝−Ａ＊ｋａｅ
ｄ／ｄｔ（Ａｐ）＝Ａ＊ｋａｅ（Ｄｉｌ）−Ａｐ＊ｋａｐｅ
出発パラメーター値および速度を、以下の表に示すように規定した：
あてはめのために含まれる他の考慮事項には、以下が含まれる：希釈および両方の速度定数を、あてはめのために浮動させた。初期Ａを一定に維持した（５ｍＬの眼中、２×５０ｍｌの５０ｍｇ／ｍＬ）。図２２Ａ、２２Ｂおよび２３に示されるモデル化の結果は、硝子体排除速度定数が、２匹のサルについて、それぞれ４．６日間および５．７日間の半減期を生じたことを示した。平均硝子体排除速度定数は、５．２日間であると計算された。全身排除は、１．１日間および０．６３日間（平均０．８５日間）としてモデル化された。これらの結果は、硝子体におけるＥＢＩ−０３１の半減期が、霊長類では全身半減期よりも有意に長かったことを実証している。
（実施例２７）
ＥＢＩ−０３１の薬物動態
別の薬物動態（ＰＫ）実験を実施し、この実験では、ＥＢＩ−０３１の２０ｍｇ／ｍＬ溶液５０μｌを、ウサギの眼中に硝子体内注射した。試験した時点は、１、３、７および１４日（例えば、２４、７２、１６８および３３６時間）であった。２匹の動物（４つの眼）を、各時点について分析した。ＥＢＩ−０３１製剤を投与するための方法、眼の組織を回収するための方法、およびタンパク質濃度を決定するための方法は、実施例２１に記載したように実施した。
結果を図２４Ａ〜２４Ｉに示す。１〜１４日目にわたって硝子体液中のタンパク質濃度を分析すると、ＥＢＩ−０３１の半減期は、８．９５日間であると決定された（図２４Ａ）。しかし、これらの結果に影響を与え得る強い抗体応答が１４日目に検出された。１〜７日目にわたって硝子体液中のタンパク質濃度を分析すると、ＥＢＩ−０３１の半減期は、１８．８８日間であると決定された。
ＥＢＩ−０３１は、硝子体内注射後に眼の他の区画においても検出された。ＥＢＩ−０３１は、眼房水（図２４Ｂ）、脈絡膜（図２４Ｃ）、結膜（図２４Ｄ）、角膜（図２４Ｅ）、毛様体（図２４Ｆ）、水晶体（図２４Ｇ）、網膜（図２４Ｈ）および強膜（図２４Ｉ）にも透過した。これらの組織における薬物濃度は、硝子体において検出された濃度よりも、１桁から２桁低かった。
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (52)

  1. （ｉ）ＧＹＸ１ＬＸ２ＮＹＬＩＥ（配列番号４５）の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、
    （ｉｉ）ＶＸ３ＴＰＧＸ４ＧＴＩＮ（配列番号４６）の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および
    （ｉｉ）ＶＨ ＣＤＲ３
    を含む重鎖可変領域を含む抗体または抗原結合性断片であって、以下：Ｘ１はＡではない、Ｘ２はＳではない、Ｘ３はＩではない、およびＸ４はＳではない、のうちの１つまたは複数が当てはまる、抗体または抗原結合性断片。
  2. Ｘ１が、ＶまたはＶの保存的置換であり、Ｘ２が、ＰまたはＰの保存的置換であり、Ｘ３が、ＴまたはＴの保存的置換であり、Ｘ４が、ＧまたはＧの保存的置換である、請求項１に記載の抗体または抗原結合性断片。
  3. Ｘ１がＡであり、Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＩであり、Ｘ４がＳである重鎖可変領域配列を含む、他の点では同一の抗体または抗原結合性断片と比較して、ヒトＩＬ−６に対する増加した親和性および／または増加した効力を有する、請求項１または２に記載の抗体または抗原結合性断片。
  4. （ｉ）配列番号３１の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３２の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２および配列番号３３の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片。
  5. 配列番号４の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２および配列番号６の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む抗体または抗原結合性断片と比較して、ヒトＩＬ−６に対する増加した親和性および／または増加した効力を有する、請求項４に記載の抗体または抗原結合性断片。
  6. （ｉ）配列番号３７を含む重鎖可変領域配列、または（ｉｉ）配列番号３７に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一である重鎖可変領域配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  7. （ｉ）配列番号３９もしくは配列番号５４、または（ｉｉ）配列番号３９もしくは配列番号５４に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一である配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  8. （ｉ）配列番号４１を含む重鎖配列、または（ｉｉ）配列番号４１に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一である重鎖配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  9. 配列番号３７に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である重鎖可変領域配列を含む単離された抗体または抗原結合性断片であって、前記重鎖配列は、Ｖ２８、Ｐ３０、Ｔ５１およびＧ５５（配列番号４１に従う番号付け）から選択される１個または複数（例えば、１、２、３または４個）のアミノ酸を含む、単離された抗体または抗原結合性断片。
  10. 配列番号３９または配列番号５４に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列を含む単離された抗体または抗原結合性断片であって、前記配列は、Ｖ２８、Ｐ３０、Ｔ５１およびＧ５５（配列番号４１に従う番号付け）から選択される１個または複数（例えば、１、２、３または４個）のアミノ酸を含む、単離された抗体または抗原結合性断片。
  11. 配列番号４１に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である重鎖配列を含む単離された抗体または抗原結合性断片であって、前記重鎖配列は、Ｖ２８、Ｐ３０、Ｔ５１およびＧ５５（配列番号４１に従う番号付け）から選択される１個または複数（例えば、１、２、３または４個）のアミノ酸を含む、単離された抗体または抗原結合性断片。
  12. 前記１個または複数のアミノ酸を含まず、その代わりにＡ２８、Ｓ３０、Ｉ５１およびＳ５５から選択される１個または複数（例えば、１、２、３または４個）のアミノ酸を含むことを除いて他の点では同一である抗体または抗原結合性断片と比較して、ヒトＩＬ−６に対する増加した親和性および／または増加した効力を有する、請求項９から１１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  13. 前記抗体または前記抗原結合性断片が、Ｖ２８、Ｐ３０、Ｔ５１およびＧ５５を含み、そしてＡ２８、Ｓ３０、Ｉ５１およびＳ５５を含むことを除いて他の点では同一である抗体または抗原結合性断片と比較して、ヒトＩＬ−６に対する改善された親和性および／または改善された効力を示す、請求項９から１１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  14. 配列番号３４の配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３５の配列を含むＶＬ ＣＤＲ２および配列番号３６の配列を含むＶＬ ＣＤＲ３をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  15. （ｉ）配列番号３８を含む軽鎖可変領域配列、または（ｉｉ）配列番号３８に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一である軽鎖可変領域配列をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  16. （ｉ）配列番号４２を含む軽鎖配列、または（ｉｉ）配列番号４２に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一である軽鎖配列をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  17. 前記親和性が、少なくとも１．５、１．６、１．７、１．８．１．９、２、３または４倍増加する、請求項３、５、１２または１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  18. 前記親和性が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはフローサイトメトリーを使用して評価される、請求項１７に記載の抗体または抗原結合性断片。
  19. （ｉ）ＩＣ５０における減少であって、任意選択で、前記ＩＣ５０は、多くとも１／５、１／１０、１／２０、１／３０、１／４０もしくは１／５０に減少する、減少
    および／または
    （ｉｉ）ＩＣ９０における減少であって、任意選択で、前記ＩＣ９０は、多くとも１／１０、１／２０、１／３０、１／４０、１／５０、１／６０、１／７０、１／８０、１／９０、１／１００、１／２００、１／３００、１／４００もしくは１／５００に減少する、減少
    によって示されるように、前記効力が増加する、請求項３、５、１２または１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  20. 前記効力が、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）アッセイまたはＴ１１６５増殖アッセイを使用して評価される、請求項３、５または１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  21. 配列番号３７を含む重鎖可変領域および配列番号３８を含む軽鎖可変領域を含む、単離された抗体または抗原結合性断片。
  22. 配列番号４１を含む重鎖配列および配列番号４２を含む軽鎖配列を含む、単離された抗体または抗原結合性断片。
  23. 配列番号３９または配列番号５４を含む重鎖配列および配列番号４２を含む軽鎖配列を含む、単離されたＦａｂ。
  24. （ｉ）２０ｐＭのＩＬ−６を用いてＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）アッセイで評価したときに、４７ｐＭ未満のＩＣ５０（例えば、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２もしくは１ｐＭ未満のＩＣ５０）
    および／または
    （ｉｉ）２０ｐＭのＩＬ−６を用いてＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）アッセイで評価したときに、４３５０ｐＭ未満のＩＣ９０（例えば、４０００、２０００、１０００、１００、５０、４０、３０、２０、１５、１０もしくは５ｐＭ未満のＩＣ９０）
    を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  25. 例えば、トシリズマブおよび／またはＥｙｌｅａ（登録商標）と比較して、硝子体内投与された場合、眼における改善された保持を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  26. Ｈ３１１、Ｄ３１３、Ｉ２５４またはＨ４３６（配列番号４１に従う番号付け）に対応する１つまたは複数の位置において、変異（例えば、１、２、３または４つの変異）を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  27. 前記変異が、Ｈ３１１Ａ、Ｈ３１１Ｅ、Ｈ３１１Ｎ、Ｄ３１３Ｔ、Ｉ２５４Ａ、Ｉ２５４ＲおよびＨ４３６Ａのうちの１つまたは複数から選択される、請求項２６に記載の抗体または抗原結合性断片。
  28. Ｈ３１１Ａ変異（配列番号４１に従う番号付け）を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  29. 前記変異が、前記変異を含まない抗体または抗原結合性断片の全身蓄積と比較して、前記抗体または前記抗原結合性断片の全身蓄積を低減させる、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  30. 前記変異が、前記変異を含まない抗体または抗原結合性断片の全身蓄積と比較して、前記抗体または前記抗原結合性断片の全身蓄積を低減させ、前記全身蓄積は、前記抗体または前記抗原結合性断片の硝子体内投与後に評価される、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  31. トシリズマブおよび／またはＥｙｌｅａ（登録商標）の全身半減期よりも短い全身半減期を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  32. ＩｇＧ２−ＡアイソフォームまたはＩｇＧ２−Ａ／ＢアイソフォームであるがＩｇＧ２−Ｂアイソフォームではない、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  33. 配列番号４７を含む重鎖配列、および任意選択で、配列番号４２を含む軽鎖配列を含む、単離された抗体または抗原結合性断片。
  34. ＩＬ−６関連疾患を有する被験体（例えば、ヒト）の処置における使用のための、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  35. 前記疾患が、硝子体における上昇したレベルのＩＬ−６を特徴とする眼性疾患である、請求項３４に記載の抗体または抗原結合性断片。
  36. 糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、ドライアイ（例えば、ドライアイ疾患またはドライアイ症候群）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、角膜移植、角膜上皮剥離、または眼に対する物理的傷害を有する被験体（例えば、ヒト）の処置における使用のための、請求項３４または３５に記載の抗体または抗原結合性断片。
  37. ＤＭＥを有する被験体（例えば、ヒト）の処置における使用のための、請求項３６に記載の抗体または抗原結合性断片。
  38. 請求項１から３７のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片、および任意選択で、薬学的に許容される担体を含む組成物。
  39. 少なくとも６０、７０、８０、９０、９５もしくは９９％の前記抗体のＩｇＧ２−ＡアイソフォームもしくはＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォーム、またはそれらの組合せを含む、請求項３８に記載の組成物。
  40. １０％、５％、２％、１％または０．５％未満の前記抗体のＩｇＧ２−Ｂアイソフォームを含む、請求項３８または３９に記載の組成物。
  41. ＩＬ−６関連疾患の処置における使用のための、請求項３８から４０のいずれかに記載の組成物。
  42. 上昇したレベルのＩＬ−６を特徴とする眼性疾患の処置における使用のための、請求項４１に記載の組成物。
  43. 糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症、ドライアイ（例えば、ドライアイ疾患またはドライアイ症候群）、アレルギー性結膜炎、ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、裂孔原性網膜剥離（ＲＲＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、角膜移植、角膜上皮剥離、または眼に対する物理的傷害の処置における使用のための、請求項４１に記載の組成物。
  44. 治療有効量の請求項１から３７のいずれか一項に記載のＩＬ−６抗体または抗原結合性断片を被験体に投与することを含む、ＩＬ−６関連疾患を処置する方法。
  45. 前記ＩＬ−６関連疾患が、硝子体における上昇したレベルのＩＬ−６を特徴とする眼性疾患である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記ＩＬ−６関連疾患が、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、ドライアイ（例えば、ドライアイ疾患またはドライアイ症候群）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、角膜移植、角膜上皮剥離、または眼に対する物理的傷害である、請求項４４または４５に記載の方法。
  47. 前記抗体または前記抗原結合性断片が、前記被験体の眼の硝子体に送達される、請求項４５に記載の方法。
  48. 前記ＩＬ−６関連疾患が糖尿病性黄斑浮腫であり、前記抗体またはその断片が、前記被験体の眼の硝子体に送達される、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 請求項１から３７のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片をコードする配列を含む核酸。
  50. 配列番号４０、配列番号４３または配列番号４８を含む核酸。
  51. 請求項４９または５０に記載の核酸を含むベクター。
  52. 請求項５１に記載のベクターを含む細胞。
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