CN107249631A - 改进的il‑6抗体 - Google Patents

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Abstract

提供了改进的IL‑6抗体。公开了抗体在治疗IL‑6相关疾病例如眼部疾病，诸如糖尿病黄斑水肿中的用途。

Description

改进的IL-6抗体
相关申请
本申请要求2014年11月7日提交的美国临时申请号62/077,105；2014年12月4日提交的美国临时申请号62/087,448；和在2015年10月28日提交的美国临时申请号62/247,705的优先权。这些申请的每一个的全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明领域涉及IL-6。更具体地，所述领域涉及IL-6的调节剂及其在治疗疾病如眼病中的用途。
发明背景
IL-6是一种在炎症、造血(hematopoiesis)、血管生成、细胞分化和神经元存活中具有报导作用的多效性细胞因子。本发明涉及改进的IL-6抗体及其用途。
发明概述
本发明涉及IL-6抗体及其片段(例如抗原结合片段)或衍生物，以及编码IL-6抗体和片段的核酸。本发明还涉及此类抗体，片段或衍生物的用途。抗体及其片段或衍生物可用于例如IL-6相关疾病的治疗。在实施方案中，抗体，其片段或衍生物可结合(例如，特异性结合)至IL-6，例如，人IL-6。在实施方案中，抗体，其片段或衍生物可结合(例如，特异性结合)至IL-6的位点II(例如，人IL-6的位点II)。
本文提供的一个方面是包含重链可变区的分离的抗体或抗原结合片段，所述重链可变区包含
(i)VH CDR1，其包含GYX1LX2NYLIE的序列(SEQ ID NO：45)，
(ii)VH CDR2，其包含VX3TPGX4GTIN的序列(SEQ ID NO：46)和
(ii)VH CDR3，
其中以下的一个或多个(例如，1,2,3或全部)是真实的：X1不是A，X2不是S，X3不是I，和X4不是S。在实施方案中，X1不是A，X2不是S，X3不是I和X4不是S。
在实施方案中，X1是V或V的保守取代。在实施方案中，X2是P或P的保守取代。在实施方案中，X3是T或T的保守取代。在实施方案中，X4是G或G的保守取代。在实施方案中，以下一个，两个，三个或全部是真实的：X1是V或V的保守取代，X2是P或P的保守取代，X3的保守取代是T或T的保守取代，和X4是G或G的保守取代。在实施方案中，X1是V或V的保守取代，X2是P或P的保守取代，X3是T或T的保守取代，和X4是G或G的保守取代。
在实施方案中，X1选自V，I，L和M。在实施方案中，X1选自V，I和L。在实施方案中，X2选自P，G和A。在实施方案中，X2选自P和G。在实施方案中，X3选自T和S。在实施方案中，X4选自G和P。
在实施方案中，以下的一个或多个(例如，1、2、3个或全部)是真实的：X1是V，X2是P，X3是T，和X4是G。在实施方案中，X1是V，X2是P，X3是T，和X4是G.
在实施方案中，VH CDR3包含SEQ ID NO:33的序列。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段具有对人IL-6增加的亲和力和/或增加的效力。在实施方案中，与包含序列，其中以下的一个或多个(例如1、2、3个或全部)是真实的：X1是A，X2是S，X3是I和X4是S的抗体或抗原结合片段(例如，其他方面相同的抗体或抗原结合片段)相比，抗体或抗原结合片段具有对人IL-6增加的亲和力和/或增加的效力。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：31的序列的VH CDR1，含有SEQ ID NO：32的序列的VH CDR2和任选地含有SEQ ID NO：NO：33的序列的VH CDR3。
在实施方案中，重链可变区包含与SEQ ID NO：17至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列。在实施方案中，重链可变区由以下序列组成，所述序列与SEQ ID NO：17至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列或者与SEQ ID NO：17差别不超过5个，4个，3个，2个或1个氨基酸。在实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO：17差别不超过5个，4个，3个，2个或1个氨基酸。在实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO：17差别1-5个氨基酸。
在实施方案中，重链可变区包含与SEQ ID NO：37至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列。在实施方案中，重链可变区由与SEQ ID NO：37至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列组成。在实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO：37差别不超过5、4、3、2或1个氨基酸。在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：37的重链可变区序列。在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含由SEQ ID NO：37组成的重链可变区序列。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：39至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列。在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：39差别不超过5、4、3、2或1个氨基酸的序列。在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含SEQ IDNO：39。在实施方案中，抗体或抗原结合片段是Fab。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：54至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的序列。在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：54差别不超过5、4、3、2或1个氨基酸的序列。在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含SEQID NO：54。在实施方案中，抗体或抗原结合片段是Fab。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段是scFv。在实施方案中，抗体或抗原结合包含下列scFv序列或由下列scFv序列组成：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYVLPNYLIEWVRQAPGQGLEWMGVTTPGGGTINYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRWDPLYYYALEYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGIPFMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSEEVPLTFGQGTKLEIKRTV(SEQ ID NO:52)或
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGIPFMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSEEVPLTFGQGTKLEIKRTVGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYVLPNYLIEWVRQAPGQGLEWMGVTTPGGGTINYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRWDPLYYYALEYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:53)。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列。在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53。在实施方案中，抗体或抗原结合片段是scFv。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：41至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的重链序列。在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含与SEQ IDNO：41差别不超过5、4、3、2或1个氨基酸的重链序列。在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：41的重链序列。在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含由SEQ ID NO：41组成的重链序列。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段与EBI-029或其片段相比具有增加的对人IL-6的亲和力和/或增加的效力。在实施方案中，与包含含有SEQ ID NO：4的序列的VH CDR1，含有SEQ ID NO：5的序列的VH CDR2，以及任选地含有SEQ ID NO：6的序列的VH CDR3的抗体或抗原结合片段相比，抗体或抗原结合片段具有增加的对人IL-6的亲和力和/或增加的效力。在实施方案中，与包含含有SEQ ID NO：17的重链可变区序列或由SEQ ID NO：17组成的重链可变区序列的抗体或抗原结合片段相比，抗体或抗原结合片段具有增加的对人IL-6的亲和力和/或增加的效力。在实施方案中，与包含SEQ ID NO：24的抗体或抗原结合片段相比，抗体或抗原结合片段具有增加的对人IL-6的亲和力和/或增加的效力。在实施方案中，与包含含有SEQ ID NO：11的重链序列或由SEQ ID NO：11组成的重链序列的抗体或抗原结合片段相比，抗体或抗原结合片段具有增加的对人IL-6的亲和力和/或增加的效力。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含表4中所提供的EBI-030或EBI-031的一个或多个序列。在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含如图15所示的EBI-030或EBI-031的一个或多个结构域(例如，重链序列的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4、CH1、铰链、CH2和CH3和/或轻链序列的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4和CK中的一个或多个)。在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链和轻链。在实施方案中，重链和轻链通过一个或多个二硫键连接。在实施方案中，抗体或抗原结合片段是Fab。在实施方案中，抗体或抗原结合片段是scFv。在实施方案中，抗体或抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv或Fv片段。
在实施方案中，与包含EBI-029的一个或多个相应序列或在WO2014/074905(将其全部内容通过引用并入本文)中描述的抗体的序列的抗体或抗原结合片段相比，抗体或抗原结合片段具有增加的对人IL-6的亲和力和/或增加的效力。在实施方案中，与托珠单抗(tocilizumab)相比，抗体或抗原结合片段具有增加的对人IL-6的亲和力和/或增加的效力。
表4：EBI-029、EBI-030和EBI-031序列的概述
aa＝氨基酸；na＝核酸；HC＝重链；LC＝轻链；VH＝重链可变区；VL＝轻链可变区
可以使用本文所述的方法和/或本领域已知的方法评估增加的亲和力和/或增加的效力。
在实施方案中，使用表面等离子体共振(SPR)评估亲和力。
在实施方案中，亲和力增加至少1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3或4倍。
在实施方案中，效力增加。在实施方案中，如IC50的降低和/或IC90的降低所指明的，效力增加。在实施方案中，IC50降低至少5、10、20、30、40或50倍。在实施方案中，IC50降低至少约50倍。在实施方案中，IC90降低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500倍。在实施方案中，IC90降低至少约100倍。
在实施方案中，例如通过使用HEK-BlueTM测定法或T1165增殖测定法来评价效力。
在实施方案中，例如，如基于使用本文所述的HEK-BlueTM测定法，例如用20pM游离IL-6获得的IC50值或IC90值评估的，抗体或抗原结合片段抑制顺式-IL-6信号传递。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段具有小于47pM的IC50和/或小于4350pM的IC90。在实施方案中，IC50小于47pM，例如小于40、30、20、10、5、4、3、2或1pM。在实施方案中，IC90小于4350pM，例如小于4000、2000、1000、100、50、40、30、20、15、10或5pM。在实施方案中，在用20pM IL-6进行的HEK-BlueTM测定中评估IC50和/或IC90。
在实施方案中，例如，如基于使用HEK-BlueTM测定用20pM IL-6获得的IC50值评估的，抗体或抗原结合片段相比于托珠单抗以更高效力阻断游离IL-6。在实施方案中，抗体或抗原结合片段与托珠单抗相比以超过900倍的效力抑制IL-6。在实施方案中，抗体或抗原结合片段是EBI-031或其抗原结合片段。在实施方案中，对于抑制IL-6，抗体或抗原结合片段具有小于15pM的IC50，例如14.2pM的IC50。
在实施方案中，例如，如基于使用本文所述的HEK-BlueTM测定法，例如用200pM超(hyper)IL-6评估的，抗体或抗原结合片段抑制反式-IL-6信号传递。在实施方案中，抗体或抗原结合片段抑制超IL-6的信号传递。在实施方案中，抗体或抗原结合片段以比托珠单抗更高的效力，例如以与托珠单抗相比超过900倍的效力抑制超IL-6的信号传递。在实施方案中，抗体或抗原结合片段以小于1μM的IC50抑制超IL-6的信号传递。在实施方案中，抗体或抗原结合片段以小于1nM的IC50抑制超IL-6的信号传递。在实施方案中，抗体或抗原结合片段以小于100pM或小于50pM的IC50，例如以约14-15pM的IC50抑制超IL-6的信号传递。在实施方案中，抗体或抗原结合片段是EBI-031或其抗原结合片段。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段抑制顺式-IL-6信号传递和反式IL-6信号传递。
在实施方案中，例如在玻璃体内施用后，抗体或抗原结合片段持续至少1个月，2个月，3个月，4个月，5个月或6个月有效阻断眼睛中IL-6信号传递。在实施方案中，例如在玻璃体内施用后，抗体或抗原结合片段持续至少1个月，2个月，3个月，4个月，5个月或6个月有效阻断眼睛中95％的IL-6信号传递。在实施方案中，抗体或抗原结合片段持续约150天阻断眼中95％的IL-6信号传递。
在另一个方面，本文提供的是分离的抗体或抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：37至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的重链可变区序列，其中所述重链序列包含选自V28，P30，T51和G55的一个或多个(例如，1、2、3或4个)氨基酸(氨基酸编号根据SEQID NO：41进行)。
在另一个方面，本文提供的是分离的抗体或抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：39至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列，其中所述序列包含选自V28，P30，T51和G55的一个或多个(例如，1、2、3或4个)氨基酸(氨基酸编号根据SEQ ID NO：41进行)。
在另一个方面，本文提供的是分离的抗体或抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：54至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列，其中所述序列包含选自V28，P30，T51和G55的一个或多个(例如，1、2、3或4个)氨基酸(氨基酸编号根据SEQ ID NO：41进行)。
本文还提供的是分离的抗体或抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：41至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的重链序列，其中所述重链序列包含选自V28，P30，T51和G55的一个或多个(例如，1、2、3或4个)氨基酸(氨基酸编号根据SEQ ID NO：41进行)。
在实施方案中，相对于对照抗体,例如相对于EBI-029或其片段，抗体或抗原结合片段具有对人IL-6的增加的亲和力。在实施方案中，相对于除了其不包含选自V28，P30，T51和/G55的一种或多种氨基酸，并且替代地包含选自A28,S30，I51和S55的一种或多种(例如，1、2、3或4种)氨基酸其他方面相同的抗体或抗原结合片段，抗体或抗原结合片段具有增加的对人IL-6的亲和力。在实施方案中，亲和力增加至少1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3或4倍。在实施方案中，使用表面等离子体共振(SPR)评估亲和力。
在实施方案中，相对于对照抗体，例如相对于EBI-029或其片段，抗体或抗原结合片段具有增加的效力。在实施方案中，相对于除了其不包含选自V28，P30，T51和/G55的所述一种或多种氨基酸，并且替代地包含选自A28,S30，I51和S55的一种或多种(例如，1、2、3或4种)氨基酸其他方面相同的抗体或抗原结合片段，抗体或抗原结合片段具有增加的效力。
在实施方案中，如IC50降低和/或IC90降低所指示的，效力增加。在实施方案中，IC50降低至少5、10、20、30、40或50倍。在实施方案中，IC50降低至少约50倍。在实施方案中，IC90降低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500倍。在实施方案中，IC90降低至少约100倍。
在实施方案中，使用HEK-BlueTM测定或T1165增殖测定来评估效力。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段具有小于47pM的IC50和/或小于4350pM的IC90。在实施方案中，IC50小于47pM，例如小于40、30、20、10、5、4、3、2或1pM。在实施方案中，IC90小于4350pM，例如小于4000、2000、1000、100、50、40、30、20、15、10或5pM。在实施方案中，在使用20pM IL-6的HEK-BlueTM测定中评估IC50和/或IC90。
在一些实施方案中，与除了其包含A28，S30，I51和S55在其他方面相同的抗体或抗原结合片段相比，包含V28，P30，T51和G55的抗体或抗原结合片段显示出对人IL-6的改善的亲和力和/或改善的效力。
在实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段进一步包含轻链可变区或其抗原结合片段，其包含VL CDR1，VL CDR2和VL CDR3。
在实施方案中，VL CDR1包含SEQ ID NO：34的序列，VL CDR2包含SEQ ID NO：35的序列，并且VL CDR3包含SEQ ID NO：36的序列。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段进一步包含与SEQ ID NO：38至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的轻链可变区序列。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段进一步包含轻链可变区序列，其包含SEQ IDNO：38或与SEQ ID NO：38差别不超过5、4、3、2或1个氨基酸。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段进一步包含含有SEQ ID NO：38的轻链可变区序列。在实施方案中，轻链可变区序列由SEQ ID NO：38组成。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段进一步包含与SEQ ID NO：42至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的轻链序列。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段进一步包含与SEQ ID NO：42差别不超过5、4、3、2或1个氨基酸的轻链序列。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段进一步包含含有SEQ ID NO:42的轻链序列。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段进一步包含含有SEQ ID NO:42或与SEQ IDNO：42差别不超过5、4、3、2或1个氨基酸的序列的轻链序列。在实施方案中，轻链序列由SEQID NO:42组成。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含(i)包含SEQ ID NO：31的序列的VHCDR1，包含SEQ ID NO：32的序列的VH CDR2和包含SEQ ID NO：33以及(ii)包含SEQ ID NO：34的序列的VL CDR1，包含SEQ ID NO：35的序列的VL CDR1和包含SEQ ID NO：36的序列的VLCDR3。在实施方案中，抗体或抗原结合片段除了其具有突变，例如，在所有六个CDR中总共至多1、2或3个突变外包含前述CDR。在实施方案中，突变不降低抗体或抗原结合片段的亲和力和/或效力。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段是IgG1，IgG2，IgG3或IgG4抗体或其片段。在实施方案中，抗体或抗原结合片段是IgG1或IgG2抗体或其片段。在实施方案中，抗体或抗原结合片段是IgG1 Fab或IgG2 Fab。在实施方案中，抗体或抗原结合片段是IgG2抗体或抗原结合片段。
在实施方案中，将抗体或抗原结合片段工程化以减少或消除ADCC活性。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。在实施方案中，抗体或抗原结合片段是人源化或人单克隆抗体或其抗原结合片段。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：37或由SEQ ID NO：37组成的重链可变区，和包含含有SEQ ID NO：38或由SEQ ID NO：38组成的轻链可变区。在实施方案中，抗体或抗原结合片段除了它具有突变，例如总共至多1、2或3个突变包含前述重链和轻链可变区。在实施方案中，突变不降低抗体或抗原结合片段的亲和力和/或效力。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：41的重链序列和任选地包含SEQ ID NO：42的轻链序列。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含由SEQ ID NO：41组成的重链序列和任选地由SEQ ID NO：42组成的轻链序列。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：47的重链序列和任选地含有SEQ ID NO：42的轻链序列。
在实施方案中，除了抗体或抗原结合片段包含突变(例如相对于SEQ ID NO：41和/或SEQ ID NO：42的1、2、3、4或5个总突变)之外，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ IDNO：41相同的重链序列和与SEQ ID NO：42相同的轻链序列。在实施方案中，突变在框架区中。在实施方案中，相对于不包含所述突变的抗体或抗原结合片段，突变不降低所述抗体或抗原结合片段的亲和力和/或效力。
在实施方案中，除了抗体或抗原结合片段包含突变(例如相对于SEQ ID NO：47和/或SEQ ID NO：42的1、2、3、4或5个总突变)之外，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ IDNO：47相同的重链序列和与SEQ ID NO：42相同的轻链序列。在实施方案中，突变在框架区中。在实施方案中，相对于不包含所述突变的抗体或抗原结合片段，突变不降低抗体或抗原结合片段的亲和力和/或效力。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段是Fab。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段是IgG1 Fab。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段是包含含有SEQ ID NO：39的重链序列和含有SEQ ID NO：42的轻链序列的分离的Fab。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段是分离的Fab，其包含由SEQ ID NO：39组成的重链序列和由SEQ ID NO：42组成的轻链序列。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段是IgG2 Fab。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段是包含含有SEQ ID NO：54的重链序列和含有SEQ ID NO：42的轻链序列的分离的Fab。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段是分离的Fab，其包含由SEQ ID NO：54组成的重链序列和由SEQ ID NO：42组成的轻链序列。
在实施方案中，除了抗体或抗原结合片段包含突变(例如相对于SEQ ID NO：39和/或SEQ ID NO：42的1、2、3、4或5个总突变)之外，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ IDNO：39相同的重链序列和与SEQ ID NO：42相同的轻链序列。在实施方案中，突变在框架区中。在实施方案中，相对于不包含所述突变的抗体或抗原结合片段，突变不降低抗体或抗原结合片段的亲和力和/或效力。
在实施方案中，除了抗体或抗原结合片段包含突变(例如相对于SEQ ID NO：54和/或SEQ ID NO：42的1、2、3、4或5个总突变)之外，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ IDNO：54相同的重链序列和与SEQ ID NO：42相同的轻链序列。在实施方案中，突变在框架区中。在实施方案中，相对于不包含所述突变的抗体或抗原结合片段，突变不降低抗体或抗原结合片段的亲和力和/或效力。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以结合人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118或V121中的至少一个。在实施方案中，抗体或抗原结合片段可以结合人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121。在实施方案中，抗体或抗原结合片段可以结合人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121的至少1个，至少2个，至少3个，至少4个，或至少5个。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段可以结合(例如，可以特异性结合)至人IL-6的位点II。
在实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以以70℃或更高的Tm结合IL-6。
在实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以以80℃或更高的Tm结合IL-6。
在实施方案中，抗体或其片段(例如其抗原结合片段)结合至人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121中的至少一个。
在实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合至人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121中的至少两个。在实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合至人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121中的至少三个。在实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合至人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121中的至少四个。在实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合至人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121中的至少五个。在实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合至人IL-6的R24、K27、Y31、D34、S118和V121。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。在实施方案中，抗体或抗原结合片段是人源化单克隆抗体。在实施方案中，抗体或抗原结合片段是人单克隆抗体。
在实施方案中，在pH 7.4的PBS中，抗体或抗原结合片段在100-150mg/mL的浓度，例如在约142mg/mL的浓度显示<10％的聚集。在实施方案中，与另一种治疗剂相比，例如与托珠单抗，贝伐单抗(bevacizumab)，兰尼单抗(ranibizumab)和/或相比，抗体或抗原结合片段具有改善的药代动力学性质。在实施方案中，当施用于眼时，例如，玻璃体内，例如通过玻璃体内注射施用时，所述抗体或抗原结合片段具有在眼睛中的改善的保留。在实施方案中，在眼中改善的保留通过眼中，例如在玻璃体，视网膜，眼房水，脉络膜和/或巩膜中增加的半衰期来指示。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段在玻璃体中具有至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天的半衰期。在实施方案中，玻璃体中的半衰期至少为10天。在实施方案中，玻璃体中的半衰期在动物中，例如在兔或猴中评估。在实施方案中，玻璃体中的半衰期在人中评估。
在实施方案中，与另一种治疗剂相比，例如与托珠单抗，贝伐单抗，兰尼单抗和/或阿柏西普相比，本文所述的抗体或抗原结合片段具有降低的系统半衰期(例如，较低的T1/2β)和/或更快的系统清除。在实施方案中，系统半衰期(例如，T1/2β)低于托珠单抗和/或阿柏西普的系统半衰期。在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含在对应于H311，D313，I254或H436(编号如SEQ ID NO：41)的一个或多个位置包含突变(例如，以1，2，3或4个突变)的Fc域。在实施方案中，突变选自H311A，H311E，H311N，D313T，I254A，I254R和H436A中的一个或多个。在实施方案中，抗体或抗原结合片段包含含有对应于H311A的突变的Fc域(编号如SEQ ID NO：41)。在实施方案中，Fc域是IgG1 Fc域。在实施方案中，Fc域是IgG2 Fc域。
在实施方案中，Fc域是具有SEQ ID NO：50的序列并且任选地在一个或多个加下划线位置(H90，D92，I33和H215)包含突变的人IgG1 Fc域：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:50)。
在实施方案中，IgG1 Fc域包含对应于H90A，H90E，H90N，D92T，I33A，I33R和H215A中的一个或多个的突变(根据SEQ ID NO：50编号)。
在实施方案中，Fc域是具有SEQ ID NO：51的序列并且任选地在一个或多个加下划线位置(H86，D88，I29和H211)包含突变的人IgG2 Fc域：
VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO:51)。
在实施方案中，IgG2 Fc域包含对应于H86A，H86E，H86N，D88T，I29A，I29R和H211A(编号为SEQ ID NO：51)的一个或多个的突变。
在实施方案中，Fc突变减少了抗体或抗原结合片段的系统积累(例如增加抗体或抗原结合片段的清除或降低半衰期，例如T1/2β)。在实施方案中，与另一种治疗剂(例如，托珠单抗，贝伐单抗，兰尼单抗和/或阿柏西普)相比，系统累积减少。在实施方案中，与托珠单抗和/或阿柏西普相比，系统累积减少。在实施方案中，与不包含所述突变的相应抗体或抗原结合片段的系统累积相比，系统积累减少。在实施方案中，在玻璃体内施用抗体或抗原结合片段后评价系统累积。
在另一方面本文提供了减少抑制受试者中IL-6的系统效应的方法，所述方法包括向受试者施用包含如本文所述的突变Fc域的抗体或其片段。在实施方案中，与具有野生型Fc域的相应抗体或其片段相比，抗体或抗原结合片段可以抑制IL-6的活性并具有减少的Fc活性(例如减少的与FcRn的结合)。在一些情况下，减少抑制受试者中IL-6的系统效应的方法包括向受试者施用包含如本文所述的突变Fc域的IL-6拮抗剂。
在另一方面，本文提供的是包含编码本文所述的抗体或抗原结合片段的序列的核酸。在实施方案中，核酸编码本文公开的氨基酸序列。在实施方案中，核酸包含SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：48。在实施方案中，核酸编码表4中公开的序列。
本文还提供了包含核酸的载体。本文还提供了包含核酸或载体的细胞。
在实施方案中，本文所述的IL-6抗体或抗原结合片段用于治疗患有IL-6相关疾病的受试者(例如，人)。在实施方案中，疾病是眼部疾病，例如以IL-6水平升高(例如在玻璃体中)为特征的眼部疾病。
在实施方案中，抗体或抗原结合片段用于治疗患有以下病症的受试者(例如，人)：糖尿病黄斑水肿(DME)、糖尿病视网膜病、葡萄膜炎(、青光眼、干眼(例如，干眼病或干眼综合征)、过敏性结膜炎、眼部疼痛、孔源性视网膜脱离(RRD)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、增生型糖尿病视网膜病变(PDR)、视网膜静脉阻塞(RVO)、视神经脊髓炎(NMO)、角膜移植物、角膜擦伤或对眼的物理损伤。在实施方案中，抗体或抗原结合片段用于治疗患有DME的受试者(例如，人)。
对眼的物理损伤在实施方案中，本文所述的IL-6抗体或抗原结合片段用于制备用于治疗IL-6相关疾病的药物。在实施方案中，该疾病是眼部疾病，例如以玻璃体中升高的IL-6水平为特征的眼部疾病。在实施方案中，IL-6相关疾病是糖尿病黄斑水肿(DME),糖尿病视网膜病,葡萄膜炎,干眼(例如，干眼病或干眼综合征),年龄相关性黄斑变性(AMD),增生型糖尿病视网膜病变(PDR),孔源性视网膜脱离(RRD),视网膜静脉阻塞(RVO),视神经脊髓炎(NMO),角膜移植物,角膜擦伤，或对眼的物理损伤。在实施方案中，IL-6相关疾病是糖尿病黄斑水肿。在实施方案中，将药物配制用于递送至受试者眼的玻璃体(例如，用于玻璃体内注射)。
本文还提供了包含本文所述的抗体或抗原结合片段的组合物。在实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的载体和一种或多种药学可接受的赋形剂。
在实施方案中，组合物用于治疗IL-6相关疾病。在实施方案中，该疾病是眼部疾病，例如以玻璃体中升高的IL-6水平为特征的眼部疾病。在实施方案中，该组合物用于治疗以下病症：糖尿病黄斑水肿(DME),糖尿病视网膜病,葡萄膜炎,干眼(例如，干眼病或干眼综合征),年龄相关性黄斑变性(AMD),增生型糖尿病视网膜病变(PDR),孔源性视网膜脱离(RRD),视网膜静脉阻塞(RVO),视神经脊髓炎(NMO),角膜移植物,角膜擦伤,或对眼的物理损伤。
本文还提供了治疗IL-6相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的IL-6抗体或片段。在实施方案中，IL-6相关疾病是眼部疾病，例如以玻璃体中升高的IL-6水平为特征的眼部疾病。在实施方案中，IL-6相关疾病是以下病症：糖尿病黄斑水肿(DME),糖尿病视网膜病,葡萄膜炎,干眼(例如，干眼病或干眼综合征),年龄相关性黄斑变性(AMD),增生型糖尿病视网膜病变(PDR),孔源性视网膜脱离(RRD),视网膜静脉阻塞(RVO),视神经脊髓炎(NMO),角膜移植物,角膜擦伤,或对眼的物理损伤。在实施方案中，IL-6相关疾病是糖尿病黄斑水肿。
在实施方案中，将抗体或抗原结合片段或包含抗体或抗原结合片段的组合物递送至受试者眼睛的玻璃体(例如，通过玻璃体内注射)。在实施方案中，抗体或抗原结合片段或包含抗体或抗原结合片段的组合物用于玻璃体内注射。
在实施方案中，IL-6相关疾病是糖尿病黄斑水肿，并且将抗体或片段或包含所述抗体或抗原结合片段的组合物递送至受试者眼睛的玻璃体。
本文还提供了抗体或其片段(例如，其抗原结合片段)(例如本文所述的IL-6抗体或其片段)，或包含此类抗体或其片段的组合物，其用于治疗IL-6相关疾病(例如，用于治疗受试者，例如具有IL-6相关疾病的人受试者)。
在实施方案中，所述疾病是以例如玻璃体中升高的IL-6水平为特征的眼睛疾病。在实施方案中，所述疾病是糖尿病黄斑水肿(DME),糖尿病视网膜病,葡萄膜炎,干眼(例如，干眼症或干眼病),过敏性结膜炎,年龄相关性黄斑变性(AMD),增生型糖尿病视网膜病变(PDR),孔源性视网膜脱离(RRD),视网膜静脉阻塞(RVO),视神经脊髓炎(NMO),角膜移植物,角膜擦伤,或对眼的物理损伤。在实施方案中，所述疾病是DME。在实施方案中，所述疾病是干眼病。在实施方案中，所述疾病是干眼综合征。在实施方案中，所述疾病是葡萄膜炎。在实施方案中，所述疾病是AMD。在实施方案中，所述疾病是PDR。在实施方案中，所述疾病是角膜移植物,角膜擦伤,或对眼的物理损伤。在实施方案中，抗体或其片段(如抗原结合片段)适合于递送至眼睛的玻璃体。在实施方案中，将抗体或其片段(如抗原结合片段)递送至眼睛的玻璃体。
本发明还提供了治疗IL-6相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用IL-6抗体或其片段(如其抗原结合片段)，例如本发明所描述的IL-6抗体或其片段。在实施方案中，以治疗有效量施用IL-6抗体或其片段(如其抗原结合片段)。在实施方案中，IL-6相关疾病是以玻璃体内升高的IL-6水平为特征的眼部疾病。在实施方案中，所述疾病是糖尿病黄斑水肿(DME)、糖尿病视网膜病、葡萄膜炎、干眼综合症、干眼病、年龄相关性黄斑变性(AMD)、增生型糖尿病视网膜病变(PDR)、视网膜静脉阻塞(RVO)、视神经脊髓炎(NMO)、角膜移植物、角膜擦伤或对眼的物理损伤。
在实施方案中，抗体或其片段(例如其抗原结合片段)适合于递送至眼睛的玻璃体。在实施方案中，将抗体或其片段(例如其抗原结合片段)递送至受试者眼睛的玻璃体。在实施方案中，IL-6相关疾病是糖尿病黄斑水肿，并且将抗体或其片段递送至受试者眼睛的玻璃体。
本文还提供了包含本文公开的IL-6抗体或组合物以及任选地用于使用的说明书的试剂盒。
本文还提供了容器或装置，例如药物递送装置，其包含本文公开的IL-6抗体或组合物。在实施方案中，将所述装置配置为用于将抗体或组合物递送至眼睛，例如玻璃体。本文还提供了包含所述容器或装置的试剂盒。
如本发明所用，术语“抗体”与免疫球蛋白含义相同，且在本领域中是公知的。术语抗体不受制备抗体的任何特定方法的限制。例如，术语抗体包括，特别是重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。如本发明所用，抗体是一种四聚体，且除非另外公开，每个抗体均由两对相同的多肽链组成，其中每对具有一个轻链和一个重链。每一条链的氨基端包含在抗原识别中起主要作用的约100到120或更多氨基酸的可变区。每一条链的羧基端包含在抗体效应子功能(antibody effector function)中起主要作用的恒定区。人轻链的种类被称为kappa和lambda轻链。重链种类为mu、delta、gamma、alpha或epsilon，并定义了抗体的同种型。抗体的同种型分别为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包括一个约3个或更多个氨基酸的“D”区。
每一重链/轻链对(VH和VL)的可变区分别形成抗原结合位点。因此，例如完整的IgG抗体具有两个结合位点。除双功能或双特异性抗体外，所述的两个结合位点是相同的。
抗体重链和轻链的可变区表现出通过3个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接的相对保守框架区(FR)的相同通用结构。术语“可变”指抗体间可变域的某些位点在序列上存在广泛的差异，并且这些位点涉及每一特定抗体与其特定抗原的结合和特异性。可变性(variability)主要位于CDRs中，其被更加高度保守的框架区(FRs)分开。根据KabatSequences of Proteins of Immnunological Interest(National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1987和1991)或Chothia和Lesk，J Mol Biol 196:901-917(1987)；Chothia等，Nature 342:878-883(1989)(其记载了本领域公知的方法)的定义进行每个结构域的氨基酸的分配。
“野生型”可指一个群体中最为普遍的等位基因或种类，或指来自于未经操作的动物的抗体，后者是与来自某种形式的操作的等位基因或多态性或变体或衍生物相较而言的，所述操作是例如诱变、使用重组方法等来改变该抗原结合分子的氨基酸。
术语“抗体片段”是指完整或全长链或抗体的一部分，通常为靶结合区或可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。“功能片段”或“抗-IL-6的位点II抗体的类似物”是可防止或实质降低IL-6结合到受体的能力、降低IL-6/IL-6R复合物结合到gp130的能力或降低配体结合到gp130或起始信号(initial signaling)的能力。如本文所用，“抗原结合片段”或“功能片段”通常与“抗体片段”含义相同，并且可指能防止或实质降低IL-6结合到受体的能力、降低IL-6/IL-6R复合物结合到gp130的能力或降低配体结合到gp130或起始信号能力的片段，例如Fv、Fab、F(ab')2等。
抗体的“衍生物”是包括本文公开的抗体的至少一个CDR的多肽。通常，该衍生物可以结合至IL-6的位点II。
“竞争”是指第一抗体或其片段能够与第二抗体或其片段竞争结合，使得与第二抗体不存在时第一抗体的结合相比，在第二抗体存在下，可检测到第一抗体与其表位结合的降低。在某些情况下，该术语也指在第一抗体存在下，第二抗体与其表位的结合是可检测的降低。在非限制性的例子中，该竞争的机制可通过位阻、构象改变或与共同表位结合。
核酸序列内容中的术语“序列同一性百分比”是指当比对以获得最大对应时，两序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以超过至少约9个核苷酸，例如，至少约18个、至少约24个、至少约28个、至少约32个、至少约36个或至少约48个或更多个核苷酸。可以使用本领域中已知的算法测量核苷酸序列的同一性。例如，可以使用FASTA、Gap或Bestfit(Wisconsin Package 10.0版本，Genetics Computer Group(GCG),Madison,WI)比较多核苷酸序列。FASTA，包括例如程序FASTA2和FASTA3，提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson,Methods Enzymol 183:63-98(1990)；Pearson,Methods Mol Biol 132:185-219(2000)；Pearson,Methods Enzymol 266:227-258(1996)；Pearson,J Mol Bio1276:71-84(1998)；通过引用并入本文)。通常使用特定程序或算法的缺省参数。例如，可以使用FASTA及其缺省参数(字长为6和用于计分矩阵的NOPAM系数)确定核酸序列间序列同一性百分比，或使用GCG第6.1版提供的具有默认参数的Gap来确定，通过引用并入本文。
氨基酸序列中的术语“序列同一性百分比”是指当比对以获得最大对应性时，两序列中相同的残基。序列同一性比对的长度可以超过至少5个氨基酸残基，例如，至少20个氨基酸残基、至少30个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基、至少150个氨基酸残基或至少200个或更多个氨基酸残基。通常使用序列分析软件测量多肽的序列同一性。用于确定序列同一性百分比的算法是已知的。例如可以使用FASTA、Gap或Bestfit(Wisconsin Package第10.0版，Genetics Computer Group(GCG),Madison,WI)比较氨基酸序列。蛋白分析软件使用比对多种取代、缺失以及包括保守性氨基酸置换的其他修饰的相似性的测量来匹配序列。例如，GCG含有诸如“Gap”和“Bestfit”程序，它们可以与默认参数一起用来决定密切相关的多肽(诸如来自不同物种之生物的同源性多肽)或野生型蛋白与其类似物之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如GCG第6.1版(University ofWisconsin，Madison，WI)。多肽序列也可以使用默认或建议参数的FASTA(参见GCG第6.1版)来比对。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson,Methods EnzymoI183:63-98(1990)；Pearson,Methods MolBioi 132:185-219(2000))。当要将序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库比对时，可以使用的另一种算法是BLAST，例如blastp或tblastn，使用程序提供的默认参数。参见例如Altschul等,J Mol Bioi 215:403-410(1990)；Altschul等人，,Nucleic Acids Res 25:3389-402(1997)。
当样品的至少约60或75％显示出单一种类的多肽时，蛋白或多肽是“基本纯净的，”“基本均质的，”或“基本纯化的”。多肽或蛋白可以是单体或多聚体。基本纯的多肽或蛋白可包含约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％纯品；例如，一个基本纯的多肽或蛋白是50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％纯的。蛋白的纯度或均质性可通过任何适当的方法评价，如蛋白样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着通过观察一条或多条与蛋白或多肽相关的条带(如在染色的凝胶上)、大小排阻HPLC、阳离子交换HPLC、SDS中的减压毛细管电泳、肽图谱或聚糖图谱。例如可使用现有技术中的已知方法或其他纯化方式实现高分辨率。
当指核酸或其片段时，术语“基本相似性”是指当以适当核苷酸插入或缺失，与另一核酸(或其互补链)进行最佳比对时，通过任何已知的序列同一性算法，如FASTA、BLAST或Gap测量的核苷酸碱基的核苷酸序列的同一性为至少约85％、至少约90％，和至少约95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
当用在多肽上时，术语“基本同一性”或“基本相似性”是指当两个多肽序列用如GAP或BESTFIT程序使用默认空位权重进行最佳比对时，共享至少约70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；例如，70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在某些实施方案中，不相同的残基位置的差异在于保守氨基酸变化。
“治疗有效量”是指施用该剂量的治疗剂将缓解所治疗疾病的至少一种征兆或症状或增加或提高可用于治疗IL-6相关疾病的另一疗法(如另一种治疗剂)的预防和或治疗效果。应当理解治疗有效量可以在有限的时间内多剂量施用或作为长期治疗。
“治疗”是指缓解疾病的一种或多种体征或症状的方法。
如本发明所用，术语“疾病”包括疾病和病症。
本发明所提到的每一个专利文件和科学文章的全部公开，以及在此所引用的这些专利文件和科学文章，出于所有的目的通过引用明确地并入本文中。
本发明其他的特点和优势在下面详细描述。
附图简述
图1是说明实验结果的图表，该实验在大鼠CNV模型中IVT施用抗IL-6抗体。抗VEGF抗体作为阳性对照被施用且阴性对照是载体本身。抗-IL-6对载体对照，第15天时p＝0.0054，第22天时p＝0.0005。
图2是说明测试鼠64抗体抑制IL-6/IL-6R结合gp130的能力的结合实验结果的图表。
图3A是说明实验的图表，该实验中测试了020在缺乏过多的可溶性IL-6Rα的情况下阻断IL-6信号传导的能力。实验是在具有0.2ng/mL IL-6和2μg/mL IL6Rα情况中在HEK-Blue-IL-6细胞上进行。
图3B是说明实验的图表，该实验中测试了020在过多的可溶性IL-6Rα存在的情况下阻断IL-6信号传导的能力。实验是在具有0.2ng/mL IL-6和2μg/mL IL6Rα的情况中在HEK-Blue-IL-6细胞上进行。
图4是说明在小鼠CNV模型中IVT施用单克隆抗IL-6抗体(“IL-6阻断”)的实验结果的图。对照为无处理(对侧眼)，玻璃体内注射抗VEGF抗体(“VEGF阻断”)或玻璃体内注射抗HRP同种型对照抗体(“对照抗体”)。
图5显示了相对于野生型抗体(EBI-029)，具有以下突变的抗体与IL-6的结合：(1)I51T/S55G,(2)A28V/I51T/S55G,(3)S30P/I51T/S55G,和(4)A28V/S30P/I51T/S55G(也称为EBI-030)。
图6显示了用IL-6和下列Fab之一处理的HEK-BlueTM IL6报告细胞中的信号传递分数(fractional signaling)：(1)WT(EBI-029),(2)A28V/I51T/S55G,(3)S30P/I51T/S55G,(4)A28V/S30P/I51T/S55G(EBI-030)。
图7显示了用IL-6和下列Fab之一以显示的浓度处理的T1165.85.2.1细胞中的发光(IL-6诱导的增殖的量度)：(1)WT(EBI-029),(2)A28V/I51T/S55G,(3)S30P/I51T/S55G,(4)A28V/S30P/I51T/S55G(EBI-030)。
图8显示了用20pM IL-6和各种浓度的以下项处理的HEK-BlueTM IL6报告细胞中产生的信号传递：(1)HEK-6E细胞中产生的EBI-029 IgG2(EBI029),(2)HEK-6E细胞中产生的EBI-030 IgG2(EBI030),和(3)HEK-6E细胞中产生的EBI-030 IgG2-H311A(EBI030H311A)；(4)托珠单抗(TOCI)和(5)稳定的CHO池中产生的EBI-030 IgG2(EBI-030CHO)。
图9描述了实施例20中描述的药代动力学模型。
图10描述了使用实施例20中描述的药代动力学模型模拟的增加抗体效力对眼睛中IL-6抑制的持续时间的影响。
图11显示玻璃体内施用后玻璃体中EBI-029，EBI-029-H311A，EBI-030，EBI-030-H311A，和托珠单抗(TCZ)随着时间的药物浓度。
图12显示玻璃体内施用后视网膜中EBI-029，EBI-029-H311A，EBI-030，EBI-030-H311A，和托珠单抗(TCZ)随着时间的药物浓度。
图13显示玻璃体内施用后眼房水中EBI-029，EBI-029-H311A，EBI-030，EBI-030-H311A，和托珠单抗(TCZ)随着时间的药物浓度。
图14显示玻璃体内施用后脉络膜中EBI-029，EBI-029-H311A，EBI-030，EBI-030-H311A，和托珠单抗(TCZ)随着时间的药物浓度。
图15A描绘了EBI-029(SEQ ID NO:11),EBI-030(SEQ ID NO:41),和EBI-031(EBI-031在本文中也称为EBI-030-H311A)(SEQ ID NO：47)的重链序列中的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4，CH1，铰链，CH2和CH3中的位置。
图15B描绘了轻链序列中的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4和CK的位置(EBI-029，EBI-030和EBI-031具有相同的轻链序列)(SEQ ID NO：12)。
图16A显示用20pM IL-6和各种浓度的EBI-031或托珠单抗处理的HEK-BlueTM IL-6报告细胞中的信号传递分数。
图16B显示用200pM超IL-6和各种浓度的EBI-031或托珠单抗处理的HEK-BlueTMIL-6报告细胞中的信号传递分数。
图17显出了实施例24中描述的计算模拟的结果。
图18显示了由于二硫键改组(shuffling)引起的IgG2抗体的三种不同结构亚型的示意图。
图19显示EBI-031样品的RP-HPLC层析图：未处理(顶图)，5mM DTT(中间图)，10mM半胱氨酸(底图)。
图20显示了从不同EBI-031细胞系收集的EBI-031样品的RP-HPLC层析图：克隆细胞系的200L规模培养物(顶部图)，来自亲本细胞系的10L规模培养物(中间图)，和稳定转染的细胞池(底图)。
图21显示了从克隆细胞系的200L规模培养物收集的EBI-031的RP-HPLC层析图，并指定和定量层析图中每个峰表示的亚型。
图22A是显示来自非洲绿猴(K797)的药代动力学数据的图，如实施例26所述。
图22B是显示来自非洲绿猴(K679)的药代动力学数据的图，如实施例26所述。
图23是显示来自两种非洲绿猴(K797或K679)药代动力学数据和拟合曲线的图。
图24A显示玻璃体内施用后玻璃体液中随着时间的EBI-031的药物浓度。
图24B显示玻璃体内施用后眼房水中随着时间的EBI-031的药物浓度。
图24C显示玻璃体内施用后脉络膜中随着时间的EBI-031的药物浓度。
图24D显示玻璃体内施用后结膜中随着时间的EBI-031的药物浓度。
图24E显示玻璃体内施用后角膜中随着时间的EBI-031的药物浓度。
图24F显示玻璃体内施用后虹膜睫状体中随着时间的EBI-031的药物浓度。
图24G显示玻璃体内施用后晶状体中随着时间的EBI-031的药物浓度。
图24H显示玻璃体内施用后视网膜中随着时间的EBI-031的药物浓度。
图24I显示玻璃体内施用后巩膜中随着时间的EBI-031的药物浓度。
发明详述
已经暗示IL-6在诸如类风湿性关节炎的多种疾病中起作用，且已经报道在包括眼部疾病在内的多种疾病中显著上调。IL-6可通过顺式和反式机制起作用。在顺式机制中，认为游离的IL-6结合至膜结合型IL-6受体(IL-6R，也称为IL-6Rα和CD126)，且然后，IL-6/IL-6R复合物与gp130(也称作CD130、制瘤素M受体、IL-6Rbeta和IL-6信号转导物)相互作用，以激活含有所述复合物的细胞中的信号传导。在反式机制中，游离的IL-6结合可溶性IL-6受体(sIL-6R)。IL-6/sIL-6R复合物然后能够结合存在于细胞膜上的gp130。这些机制间关键的不同之处在于表达gp130的细胞类型多于表达IL-6R(其表达是更有限的)的细胞类型。因此在希望抑制IL-6信号传导的疾病中，例如在那些希望广泛地抑制IL-6信号传导的疾病中，抑制顺式和反式IL-6信号两者是有用的。申请人已经工程化了IL-6拮抗剂，如抗IL-6抗体、片段和衍生物，该拮抗剂能够抑制IL-6的顺式和反式的信号传导。此外，申请人已经工程化了这样的IL-6拮抗剂以实现更快速的系统清除。IL-6拮抗剂，例如IL-6抗体及其片段或衍生物，描述在WO2014/074905中，将其全部内容通过引用并入本文。本发明涉及改进的IL-6抗体及其用途。
除非上下文另有明确说明，如本文所使用的包括但不限于“一”，“一个”或“那个”的单数术语包括复数。
IL-6拮抗剂(IL-6a)的特点
一般而言，本发明描述的IL-6拮抗剂(IL-6a)特异地结合IL-6的位点II(位点2)，且对于IL-6相关的眼病和某些其他疾病的治疗是有用的。IL-6相关的眼病是一种疾病，其中不希望的症状或疾病的生物学活性与IL-6的表达或存在有关。在一些实施方案中IL-6a对游离的和结合的IL-6具有高亲和力，在机体中是相对稳定的，能够抑制结合到IL-6R的IL-6(本发明中被称为IL-6/IL-6R复合物或IL-6/IL-6R)与gp130的结合，并且能具有治疗效果。一般来说，IL-6a是抗体或衍生自抗体。例如，IL-6a是高亲和性的人源化Fab，其能够特异地结合IL-6的位点II并有效阻止顺式和反式IL-6信号传导。在另一个例子中，IL-6a是全长抗体，如IgG1或IgG2抗体。
在一些实施方案中，Fab也被设置为Fc-工程化的序列或位于全长的抗体中。在一些实施方案中，Fc-工程化的IL-6a(如Fc-工程化的Fab)与适当的对照相比，如与相应的不具有工程化的Fc的抗体、其片段或衍生物相比，具有更快的全身清除。IL-6a的这些和其他特点在本发明中被进一步描述。
申请人已经设计出选择地结合IL-6的位点II的IL-6拮抗剂以提供IL-6信号传导的广泛抑制，因为这类分子可以抑制gp130与IL-6的结合，无论IL-6是游离的，结合膜IL-6R或结合sIL-6R。此外，靶向配体(IL-6)相对于IL-6受体可以避免受体介导的清除和由ADCC带来的毒性(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性)。由于IL-6在疾病中起到病理和保护性作用，因此使用IL-6拮抗剂(IL-6a)治疗与增加的IL-6相关的疾病可以改善某些方面的状况，但也可能造成显著的副作用，如系统性效应。这种IL-6通路的双重性(如具有希望的和/或不希望的效应的能力)使其不适合作为全身性抑制剂治疗IL-6相关病症。因此，本发明提供的组合物和方法对于治疗是有用的，所述组合物抑制至少一种IL-6的活性但对IL-6的积极活性不具有不当的影响，部分因为所述组合物能被配制为局部递送，如配制为局部递送至眼睛。例如，在某些方面，IL-6a被设计为适合于递送至特定位点的尺寸。在一些实施方案中，IL-6a是全长抗体。在一些实施方案中，IL-6a衍生自抗体且处于一种可在眼睛的玻璃体中具有更长的停留期和有限的系统性漏出(systemic leakage)的方式。在一些实施方案中，IL-6a是修饰的抗体(如具有修饰的Fc结构域的抗体)，与相应的未修饰的抗体相比，其在眼睛的玻璃体中具有更长的停留期和/或更为有限的全身性漏出。在一些实施方案中IL-6a是IgG2抗体。
在一些方面，IL-6a是相对小的IL-6a，如抗体的片段或其他抗体衍生物即小于全长抗体，例如衍生自IL-6抗体的Fab。在一些情况下，IL-6a处于一种能够从一个组织的一部分传递到另一个组织并与相应的全长IL-6抗体相比具有增加的动力学的形式。在一些实施方案中，IL-6a是被工程化为更大分子的Fab，其与Fab单独相比更可能在被递送的区域中具有延长的停留，例如IL-6a通过Fc结构域二聚化。在某些实施方案中，Fc结构域被工程化从而使Fc部分具有消弱的(ablated)或减弱的FcRn结合，从而可以与包含野生型Fc的相同的IL-6结合体(IL-6binding entity)相比减少全身积累。工程化的Fc域可以是，例如，IgG1结构域或IgG2结构域。
通常，本发明所描述的IL-6拮抗剂对其靶标IL-6具有足够高的亲和性从而有效改善IL-6的至少一个不希望的效应，并且还是足够稳定的以有助于其作为治疗剂。
一般而言，IL-6a的PK，如适合用在眼睛中的IL-6a在递送的位点(如玻璃体)中具有提供治疗效果的足够长的半衰期。在非限定的例子中，所述PK可以是至少8天、10天、14天、21天、28天或30天的半衰期。
结合到位点II的IL-6拮抗剂的鉴定
一般来说，本领域中已知的任何方法都可用于生产能够结合IL-6的分子，例如，实验中，多肽文库或分子文库可用于筛选具有结合到IL-6的能力的多肽或化合物的候选化合物。一旦鉴定了该候选化合物，可以使用本领域中已知的方法确定化合物的结合位点。例如，可以测试分子结合到野生型IL-6的能力并将该结合力与该分子与在位点I、位点II或位点III突变了的IL-6的结合能力作比较。在实施方案中，本发明所述的IL-6a保留结合到IL-6/IL-6Rα复合物和结合到IL-6的能力，并阻止IL-6/IL-6Rα结合到gp130。在实施方案中，例如本发明所述的IL-6a通过与IL-6的位点II的结合能够与gp130竞争结合IL-6/IL-6Rα复合物。可以使用本领域已知的方法测定该结合能力。
例如，可使用HEK-BlueTM IL-6测定系统(InvivoGen,San Diego)测试IL-6a候选物。HEK-BlueTM IL-6细胞是稳定转染了人IL-6R和STAT3-可诱导SEAP报告基因的HEK293细胞。在IL-6存在下，STAT3被激活且SEAP被分泌。例如可以使用QUANTI-BlueTM(InvivoGen,San Diego)测定SEAP。向细胞加入IL-6拮抗剂抑制了游离和可溶性受体与IL-6的结合，从而阻止了SEAP的分泌或降低了SEAP的水平。
KD指特定抗体-抗原相互作用或抗体片段-抗原相互作用的结合亲和平衡常数。在实施方案中，本文描述的抗体或抗原结合片段以低于或等于250pM，如低于或等于225pM、220pM、210pM、205pM、150pM、100pM、50pM、20pM、10pM或1pM的KD与抗原(例如IL-6)特异性结合。可使用现有技术中已知的方法确定KD，例如表面等离振子共振，如使用BiaCoreTM系统确定KD。
Koff指特定抗体-抗原相互作用或抗体片段-抗原复合物的解离速率常数。可使用表面等离振子共振，例如使用BiaCoreTM系统确定解离速率常数。一个相对慢的Koff可产生治疗所希望的特征，如允许以低频率向需要该治疗的个体施用抑制剂。
特异性
在一些实施方案中，本文所述的IL-6a特异性结合靶物，例如IL-6。通常，本文所用的“特异性结合”指示分子优先结合选择的分子并且展示对一种或多种其它分子的低得多的结合亲和力。在实施方案中，对另一分子的结合亲和力比对靶物的结合亲和力低1、2、3或更多个数量级。
如上文所讨论，IL-6可作为游离IL-6和作为结合到可溶性IL-6Rα的IL-6存在。申请人已经鉴定出，与结合IL-6位点I的抑制剂相比，IL-6的位点II是IL-6拮抗剂的最佳靶点。位点I的抑制剂可抑制游离IL-6与IL-6Rα的结合。然而，该抑制剂不能阻止由事先存在的复合物所引起的活性，除非通过替换，其受限于IL-6/IL-6R复合物的koff。在另一个可选方案中，结合IL-6Rα的抑制剂是不太合适的，因为除非其以饱和浓度存在，该抑制剂具有有限的阻止IL-6活性的能力。由于IL-6受体的量较IL-6的量通常是相当高的，因此这种方法可能需要施用不期望的大量的通过与受体结合来抑制IL-6活性的化合物。在实施方案中，本发明所描述的IL-6拮抗剂(如本发明所描述的抗体和片段及其衍生物)能够甚至当IL-6结合到IL-6R时阻断IL-6的活性。因此，本发明所描述的IL-6a的优势在于与靶向IL-6受体的抑制剂相比，实现治疗效果所需施用的化合物的量相对较小。抗受体抗体已被报道通过受体介导的清除被快速清除，这显著限制了抗体的PK，因此需要加大剂量、更高频给药或使用前述两者。另外，抗受体抗体和抗位点I IL-6抗体的问题在于它们通过阻断配体的正常受体介导的清除途径显著地增加了IL-6的组织浓度，从而使受试者处于组织中IL-6的潜在不需要的水平。此外，使用靶向IL-6Rα的抑制剂可能使抑制剂必需存在于寻求抑制剂的位点和不希望的位点(如全身治疗)附近。使用与位点II(gp130结合该位点)结合的IL-6a允许抑制游离的IL-6以及结合了IL-6R的IL-6，但并不激活经过gp130的IL-6途径。因此，不受理论的限制，本发明所描述的IL-6拮抗剂被设计为结合两种形式的IL-6(可溶的和结合到受体的)，特别是结合到IL-6的位点II的拮抗剂，该拮抗剂能够结合两种形式的IL-6。本发明所描述的包含IL-6a的组合物可通过IL-6抑制顺式和反式信号。
在某些情况下，本发明所提供的化合物和方法被设计为提供一种有效的IL-6阻断剂，其足以治疗至少一种IL-6相关病症的征兆或症状，如抑制血管发生和/或炎症。
本发明所描述的化合物还可用于治疗以不期望的高水平IL-6为特征的眼病，如在玻璃体中的疾病(参见Yuuki等人，,J Diabetes Compl 15:257(2001)；Funatsu等人，,Ophthalmology 110:1690,(2003)；Oh等人，,Curr Eye Res 35:1116(2010)；Noma等人，,Eye 22:42(2008)；Kawashima等人，,Jpn J Ophthalmol 51:100(2007)；Kauffman等人，,Invest Ophthalmol Vis Sci 35:900(1994)；Miao等人，,Molec Vis 18:574(2012))。
通常，本发明所描述的IL-6a是IL-6信号传导强效拮抗剂。在一些实施方案中，本文所述的IL-6a对IL-6具有高亲和力，例如，在使用10pM IL-6的HEK-Blue IL-6试验中IC50小于或等于100pM。可根据IL-6a的KD确定IL-6a的高亲和性，例如，小于或等于1nM的KD、小于或等于500pM的KD、小于或等于400pM的KD、小于或等于300pM的KD、小于或等于240pM的KD或小于或等于200pM的KD。
为了制备可用于治疗与增加的IL-6表达或活性有关病症的生物制剂IL-6a(例如蛋白或多肽如抗体、片段或其衍生物)，通常最好是所述生物制剂IL-6a具有高的产率。例如，合适的产率为高于或等于1g/L(如高于或等于2g/L、高于或等于5g/L或高于或等于10g/L)。
为了有效地施用IL-6拮抗剂，需要抑制剂具有与将要施用的浓度相匹配的溶解度。例如，在全长抗体的IL-6a的情况下，其溶解度大于或等于20mg/ml、大于或等于10mg/ml、大于或等于5mg/ml或大于或等于1mg/ml。
另外，抑制剂必须具有递送的体温下的高度稳定性和活性位点及储存稳定性从而成为一种可行的治疗。在实施方案中，抑制剂具有高于或等于60℃的Tm(如高于或等于60℃、高于或等于62.5℃、高于或等于65℃、高于或等于70℃、高于或等于73℃、或高于或等于75℃)。在实施方案中，抑制剂具有高于或等于45℃的Tonset，如高于或等于50℃、高于或等于51℃、高于或等于55℃或高于或等于60℃。可以用本领域已知的方法确定Tm和Tonset的方法。
可从本领域中已知的分子的类型中选择具有所需要的特性的拮抗剂，例如抗体，包括靶向IL-6的位点II的抗体的片段和衍生物，其一般保留或维持足够的亲本IL-6抗体的特征(如需要的结合特性)。该拮抗剂包括Fab片段、scFvs、工程化的含有Fc部分的Fab片段，以及工程化的具有不同于亲本IL-6的位点II靶向抗体框架的全长抗体。
在一些方面中，本发明所描述的IL-6a包括人抗体抗原结合位点，该位点能够竞争或交叉竞争能够结合IL-6的位点II的抗体或其片段。例如，抗体或其片段可以由本发明中公开的VH结构域和VL结构域组成，且VH和VL结构域包含本发明中公开的IL-6/位点II结合抗体的一组CDRs。
可使用任何合适的方法，例如通过突变IL-6上的多种位点来确定与IL-6a结合的结构域和/或表位。那些含有突变的表位阻止或降低IL-6a的结合，且IL-6配体直接参与与IL-6a的结合或如通过影响IL-6的构型间接影响结合位点。可以使用其他方法确定IL-6a所结合的氨基酸。例如，可以使用肽-结合扫描，如基于PEPSCAN的酶联免疫试验(ELISA)。在这种类型的肽-结合扫描中，源自抗原的短重叠肽被系统地针对其与结合成员的结合进行筛选。所述肽可以共价地连接于支持物表面，以形成肽阵列。肽可以是线性的或受限的构象。可以使用在每一肽序列的末端具有半胱氨酸(cys)残基的多肽产生受限的构象。可将cys残基直接或间接共价偶联到支持物表面从而使肽保持环形构象。因此，所述方法中所使用的肽可能具有一个添加在与抗原片段相关的肽的每一末端的cys残基。还可使用双环形肽，其中cys残基额外地定位于或靠近肽序列的中间部位。可将cys残基直接或间接共价偶联到支持物表面从而使肽形成双环的在中央cys残基的每一侧具有一个环的构象。可以合成产生肽，因而可以在需要的位置修饰cys残基，尽管其不是在IL-6的位点II序列天然发生的。任选地，可在肽-结合试验中筛选线性或构象受限的肽。肽-结合扫描可包括鉴定(如使用ELISA)一组结合到结合成员的肽，其中所述肽具有与IL-6a的片段相对应的氨基酸序列(如包括IL-6a的约5、10或15个连续残基的肽)，以及比对所述肽以确定结合成员所结合的残基的足迹，其中该足迹包含重叠肽共同的残基。可选地或额外地，可以使用肽-结合扫描方法以至少选定的信号：噪音比鉴定IL-6a要结合的肽。
可使用本领域中已知的其他方法确定抗体所结合的残基，和/或确认肽-结合扫描结果，包括例如，定点突变(如本发明所描述的)、氢氘交换、质谱、NMR和X-射线晶体法。
一般地，本发明所描述的有用的IL-6a是人抗体分子、人源化抗体分子或其结合片段。通常，抗体是单克隆抗体。该抗体的来源可以是人、小鼠、大鼠、骆驼、兔子、羊、猪或牛，且可按照那些本领域中已知的方法生产所述抗体。
通常，IL-6a至少包含抗体的CDR，所述CDR特异地结合至IL-6(例如人IL-6)，例如结合至IL-6的位点II。带有本发明的CDR或一组CDRs的结构可以是抗体重链或轻链序列或其实质性部分，在重链和轻链中CDR或一组CDRs位于天然发生的由重排免疫球蛋白基因编码的VH和VL抗体可变结构域的CDR或一组CDRs的对应位置。可通过参考Kabat等人，1983(国立健康研究院)以及使用任何因特网搜索引擎在“Kabat”下查找到的更新(updates)来确定免疫球蛋白可变结构域的结构和位置。
如本文公开的IL-6a通常是一般包含抗体VH结构域和/或VL结构域的抗体。VH结构域包含一组重链CDRs(VHCDRs)，以及VL结构域包含一组轻链CDRs(VLCDRs)。本文在实施例中提供了此类CDRs的例子。抗体分子可包含含有VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3和框架的抗体VH结构域。其可选地或还包含含有VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3和框架的抗体VL结构域。
本发明所公开的IL-6拮抗剂包含如那些在本发明中所公开的VHCDR1和/或VHCDR2和/或VHCDR3和/如那些在本发明中所公开的VLCDR1和/或VLCDR2和/或VLCDR3。IL-6a可包含一个或多个本发明所描述的任何抗体、片段或衍生物的CDRs。IL-6a可包含一组VHCDRs(如VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)，且可选地其还可以包含一组VLCDRs(如VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)。CDRs可源于一种或多种本发明所描述的抗体、片段或衍生物。例如，VLCDRs可源于与VHCDRs相同或不同的抗体。
通常，VH结构域与VL结构域配对以提供一个抗体抗原结合位点。例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的HC结构域与SEQ ID NO：2的LC结构域配对。在某些情况下，VH或VL结构域独自可以用作IL-6a。
在某些方面，IL-6a是抗体分子、片段或其衍生物，其包含(i)与本发明所描述的VH结构域(例如SEQ ID NO：37)具有至少60、70、80、85、90、95、98或99％氨基酸序列同一性的VH结构域序列，或(ii)来自VH域序列的一组VHCDRs(如，VHCDR1、VHCDR2和/或VHCDR3)。在实施方案中，抗体分子、片段或其衍生物包含SEQ ID NO：37的VHCDR1、VHCDR和VHCDR3。在实施方案中，抗体分子、片段或其衍生物包含整体上与SEQ ID NO：37的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的差异不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个氨基酸的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。
抗体分子、片段或其衍生物还可以任选地包含(i)与本发明所描述的VL结构域(例如SEQ ID NO：38的VL结构域)具有至少60、70、80、85、90、95、98或99％氨基酸序列同一性的VL结构域序列，或(ii)来自VL域的一组VLCDRs(如，VLCDR1、VLCDR2和/或VLCDR3)。在实施方案中，抗体分子、片段或其衍生物包含SEQ ID NO：38的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。在实施方案中，抗体分子、片段或衍生物包含整体上与SEQ ID NO：38的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的差异不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个氨基酸的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。能够用于计算两氨基酸序列百分比同一性的算法包括例如BLAST、FASTA，或Smith-Waterman算法，如采用缺省参数。
本发明所描述的IL-6a可包含抗体恒定区或其部分，如人抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可以在其C-末端附着包括人CK或CL链的抗体轻链恒定结构域。相似的，基于VH结构域的IL-6a能够在其C-末端附着免疫球蛋白重链的全部或部分(如CH1结构域)，该重链源于任何同种型抗体，如IgG、IgA、IgE和IgM以及任何的同种型亚类，特别是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在实施方案中，将抗体或抗原结合片段工程化以减少或消除ADCC活性。
在一个实施方案中，本发明的抗体是IgG2抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体包含如本文所述的IgG2框架，IgG2恒定区或IgG2 Fc区。
IgG2抗体可以作为三种主要结构亚型存在：IgG2-A，IgG2-B和IgG2-A/B(WypychJ.等人，Journal of Biological Chemistry.2008,383：16194-16205)。这种结构异质性是由于将Fab臂连接到重链铰链区的二硫键的不同构型。在IgG2-A亚型中，没有将Fab臂连接到铰链区的二硫键。在IgG2-B亚型中，两个Fab臂具有将重链和轻链与铰链区连接的二硫键。IgG2-A/B亚型是IgG2-A和IgG2-B亚型之间的混杂，其中仅一个Fab臂具有将Fab臂的重链和轻链连接到铰链区的二硫键。两种或所有不同结构亚型之间的IgG2抗体的转化，也称为二硫键改组，天然地发生于在体内和体外的天然存在和重组抗体中。因此，本领域中IgG2抗体的制剂包含IgG2-A，IgG2-B和IgG2-A/B亚型的异质混合物。不同的IgG2亚型可以具有独特和不同的功能性质，例如在稳定性，聚集，粘度，Fc受体结合或效力中的差异。IgG2抗体制剂中多种亚型的存在或特定亚型增加的水平可以不利地影响稳定性，聚集或效力。
本发明提供了具有主要以IgG2-A或IgG2-A/B亚型存在的优点的抗体。本发明的抗体不以IgG2-B亚型存在，或者在大量的时间中不以IgG2-B亚型存在。因此，包含本发明抗体的组合物和制剂与本领域已知的其它IgG2抗体相比是较少的异质性的，并且因此更优选地用于治疗应用。
包含本发明抗体的组合物主要包含抗体的IgG2-A和/或IgG2-A/B亚型。在一个实施方案中，包含本文所述抗体的组合物包含至少50、60、70、80、90、95、96、97、98或99％的IgG2-A或IgG2-A/B亚型的抗体。在一个实施方案中，包含本文所述的抗体的组合物总的来说包含至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％的IgG2-A和IgG2-A/B亚型。在此类实施方案中，包含本文所述抗体的组合物不包含大量的IgG2-B亚型的抗体。例如，组合物包含少于10％，5％，2％，1％，0.5％或0.1％的IgG2-B亚型的抗体。
在某些情况下，本发明的抗体被进一步使用本领域已知的方法修饰以制备具有特定同种异型(allotype)的序列，例如一种在具有特定地域起源的人群中占主导地位的同种异型。在某些情况下，修饰人类重链恒定区以达到该目的。
IL-6a可以是抗体分子、其结合片段或变体，其具有在抗体框架内的一个或多个CDRs，例如一组CDRs。例如，抗体(例如本发明所描述的抗体或其片段或衍生物)的一个或多个CDRs或一组CDRs可以被移植到框架中(如人框架)以提供抗体分子。框架区可以是源自人种系基因序列，或可以是非种系来源的。
VH和/或VL框架残基可以如所讨论的那样被修饰并在本发明中作为例子，如使用位点特异性突变。
可以在源自靶向IL-6的位点II的抗体IL-6a(本发明中定义为“参考IL-6抗体”)的一个或多个框架区和/或一个或多个CDRs中使用本领域已知的方法和参数进行氨基酸改变。本发明中还包括所产生的IL-6拮抗剂，其保留了与IL-6的位点II(如人IL-6的位点II)的结合且与参考IL-6抗体相比通常具有至少相同的结合或提高的亲和力。在一些情况下，为了改善诸如稳定性的参数，可以引入导致与参考IL-6a(如参考抗体)相比降低的结合亲和力的变化以制备有用的IL-6a。在某些实施方案中，例如在某些情况下，其中所述参考涉及FcRn结合或药代动力学(PK)参数，如在玻璃体中的半衰期或全身的半衰期(如，在血液、血浆、血清、淋巴、肝、肾、其他组织或体液)，参考抗体可以是非特异地结合IL-6的抗体。
IL-6a多肽的氨基酸序列中的变化可包括用非天然发生或非标准氨基酸取代一个或多个氨基酸残基，将一个或多个氨基酸残基修饰为非天然发生或非标准形式，或在序列中插入一个或多个非天然发生或非标准氨基酸。本发明序列中改变的数量和位置的例子在本发明别处描述。天然发生的氨基酸包括20种“标准的”L-氨基酸，其由它们的标准单字母被确定为G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R,、H、D、E。非天然发生氨基酸包括任何其他能够渗入多肽骨架或源自已有氨基酸残基修饰的残基。非标准氨基酸可以是天然发生或非天然发生的氨基酸。本领域已知数种天然发生的非标准氨基酸，如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、3-甲基组氨酸和N-乙酰丝氨酸。那些在N-alpha位置衍生化的氨基酸残基将仅能位于氨基酸序列的N-末端。氨基酸一般地为L-氨基酸。在一些情况下，氨基酸是D-氨基酸。因此改造可以包含将L-氨基酸修饰为，或将其替换为D-氨基酸。氨基酸的甲基化、乙酰化和/或磷酸化形式是已知的，且本发明中的氨基酸可进行该种修饰。
本发明的抗体结构域和结合成员中的氨基酸序列可包含本发明所讨论的非天然或非标准氨基酸。可以使用本领域中已知的方法，例如分子的合成或合成后修饰或氨基酸的替换，将非标准氨基酸(如D-氨基酸)渗入氨基酸序列。在一些情况下，D-氨基酸被用于增加IL-6a的PK。
可通过随机突变一个或多个选择的VH和/或VL核酸序列在整个可变结构域中产生突变的方式产生本发明携带CDR来源序列的新的VH或VL区。例如可使用易错PCR(Chao等,Nature Protocols,1:755-768(2006))。在一些实施方案中，在整个可变区或一组CDRs中进行一个或两个氨基酸替换。可使用其他本领域中已知的方法产生突变，例如一般在一个或多个CDRs中的定点突变。
用于产生抗体IL-6a的一种方法是通过添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸来改变VH结构域，如本文公开的那些。改变的结构域可与VL结构域(例如本文公开的VL结构域)组合，所述VL结构域也可以使用本领域中已知的方法如本发明所描述方式被改变。测试这些改变了的分子结合IL-6的位点II的能力以及任选地测试其他需要的特性如与参考分子相比增加的亲和力。在某些情况下，变体VH或VL结构域可具有1、2、3、4或5个这样的改变(如1、2、3、4或5个氨基酸替换)。
在实施方案中，本发明的IL-6a是结合IL-6的位点II的抗体的片段并且包含抗原结合位点，如能够结合IL-6的位点II的抗原结合位点。本发明的抗体片段一般从参考(亲本)抗体分子获得，如包含SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42的抗体分子。可使用本领域中已知的方法如重组DNA、酶切割(如使用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)、抗体的化学切割(如二硫桥的化学还原)的方式产生抗体片段。包含抗体抗原结合位点的抗体片段包括，但不限于分子如Fab、Fab'、Fab'-SH、scFv、Fv、dAb、Fd和二硫键稳定的可变区(dsFv)。可以改造包括一个或多个抗体抗原结合位点的多种其他抗体，包括例如F(ab’)2、F(ab)3、双抗体、三链抗体、四链抗体和迷你抗体。抗体分子以及它们的构建和使用方法的例子描述于Holliger和Hudson,2005,Nat Biotechnol 23:1126-1136。结合片段的非限定性的例子是由VL、VH、恒定轻链结构域(CL)和恒定重链结构域1(CH1)结构域构成的Fab片段；由VH和CH1结构域构成的Fd片段；由单链抗体(single antibody)的VL和VH结构域构成的Fv片段；由VH或VL结构域构成的dAb片段；分离的CDR区；F(ab')2片段、含有两个连接的Fab片段的二价片段；单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域由肽连接子(linker)连接从而联合两结构域以形成抗原结合位点；双特异性单链Fv二聚体(如公开于WO 1993/011161)以及使用基因融合(如公开于WO94/13804)构建的多价或双特异性片段的双抗体。可通过渗入连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定Fv、scFv或双抗体。还可以使用包含scFv连接到CH3结构域的迷你抗体作为IL-6a。其他可用作IL-6a的抗体的片段和衍生物包括Fab'，其通过在重链CH1结构域的羧基末端添加数个氨基酸残基(包括抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而不同于Fab片段，以及包括恒定区的半胱氨酸分子带有一个游离巯基的Fab'-SH。
在一些情况下，IL-6a是抗体片段，其已被化学修饰以增强或引入需要的特性，如PEG化或以增加半衰期或整合。
dAb(结构域抗体)是抗体的小单体抗原结合片段(抗体重链或轻链的可变区。VHdAbs天然发生于骆驼科动物中(例如骆驼和美洲驼)并能通过用靶抗原免疫骆驼类动物、分离抗原特异性B细胞和直接从单个B细胞中克隆dAb基因的方式产生。本发明的IL-6a可以是包含大体上本发明中VH或VL结构域的dAb，或包含大体上本发明中的一组CDRs的VH或VL结构域。
本发明的抗体包括双特异性抗体，该抗体的两个不同的结构域被组合到相同分子中。可将IL-6a作为双特异性抗体的一部分渗入，所述抗体可使用本领域已知方法制备，例如化学制备或从杂交瘤制备。该分子可以是前文已讨论过的类型的双特异性抗体片段。产生双特异性抗体的方法的一个非限制性的例子是BiTETM技术，该技术中可使用具有不同特异性的两个抗体的结合结构域并通过短的柔性肽直接连接。这将两抗体组合成一个短的单肽链。可不使用Fc区而仅使用可变结构域来构建双抗体和scFv，这潜在地减轻了抗独特型反应。双特异性抗体可构建为整个IgG、构建为双特异性Fab'2、构建为Fab'PEG、构建为双抗体或构建为其他双特异性scFv。此外，两种双特异性抗体可利用本领域中已知的常规方法进行连接以形成四价抗体。
双特异性双抗体，与双特异性完全抗体相对，是有用的，在某种程度上是因为它们能够被构建并在大肠杆菌中并表达。可从文库中使用噬菌体展示(WO 1994/13804)容易地选择出合适的结合特异性的双抗体(以及许多其他多肽，如抗体片段)。如果保持双抗体的一个臂恒定，例如，直接针对IL-6的位点II的特异性，则可以产生其他臂可变的文库，从而选择合适特异性的抗体。
双特异性全抗体可通过其他描述于WO 1996/27011、WO 1998/50431和WO 2006/028936的改造工程化方法制备。
在某些情况下，本发明的IL-6a在非抗体分子中包含抗原结合位点，例如，通过合并一个或多个CDRs，如在非抗体蛋白骨架中的一组CDRs，将在下文中进一步讨论。在某些情况下，CDRs被合并到非抗体的骨架中。可通过在非抗体蛋白骨架(如纤连蛋白或细胞色素B)上排列CDRs来提供IL-6的位点II的结合位点，或通过随机或突变蛋白骨架内环(loop)的氨基酸残基来赋予对IL-6的位点II的结合特异性。用于蛋白中工程化的新的结合位点的骨架是现有技术已知的。例如用于抗体模拟物的蛋白骨架在WO200034784被公开，其描述了包括具有至少一个随机化的环的纤连蛋白III型结构域的蛋白(抗体模拟物)。任何免疫球蛋白超家族的结构域成员可提供适合于移植入一个或多个CDRs，如一组HCDRs的骨架。骨架可以是人或非人蛋白。非抗体蛋白骨架的优势在于其可以在骨架分子中提供抗原结合位点，所述骨架分子至少比一些抗体分子更小和/或更易制备。小尺寸的结合成员可带来有用的生理特性，如进入细胞的能力、深度穿透组织或到达其他结构内的靶位，或结合靶抗原蛋白穴的能力。典型的是具有稳定主链和一个或多个可变环的蛋白质，在可变环中一个环或多个环的氨基酸序列被特别或随机突变以产生具有结合靶抗原特异性的抗原结合位点。该蛋白包括来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)蛋白质A的IgG结合结构域、转铁蛋白、四连接素(tetranectin)、纤连蛋白(如第10纤连蛋白的III型结构域)和脂笼蛋白(lipocalins)以及γ-晶体和其他AffilinTM骨架(Scil Proteins,Halle,Germany)。其他方法的例子包括合成的微体，其基于环肽(cyclotides)--具有分子内二硫键的小蛋白(如VersabodiesTM,AmunixInc.,Mountain View,CA)和锚蛋白重复蛋白(DARPins，如来自Molecular Partners AG,Zurich-Schlieren,Switzerland)。这些蛋白也包括小的，改造的蛋白结构域，如，免疫结构域(参见例如，美国专利公开第2003/082630和2003/157561号)。免疫结构域含有抗体的至少一个互补决定区(CDR)。
IL-6a可包含额外的氨基酸，如赋予所述分子除结合抗原的能力以外的其他功能特征的氨基酸。
在一些情况下，IL-6a携带一个可检测的标记，或与毒素或靶向部分或酶缀合(如，通过肽键或连接子)。例如，IL-6a可包含一催化位点(如在酶结构域中)和一抗原结合位点(如针对IL-6的位点II的结合位点)，这样，抗原结合位点与抗原结合并因此靶向催化位点到IL-6或IL-6/IL-6R复合物。所述催化位点能够，在一些情况下，进一步抑制IL-6的生物学功能，如通过切割IL-6、IL-6R，或其他与IL-6a/IL-6复合物有关的分子。
在一些方面中，本发明包括与参考抗体相比已经被修饰的抗体IL-6a以改变，例如增加、降低或消除IL-6a的生物学效应。在一个实施例中，Fc区被修饰或用修饰的Fc结构域替换亲本Fc结构域以改变(与未修饰的亲本相比)修饰的IL-6a的药代动力学。在一些实施方案中，IL-6a经改造以具有IgG2框架。在其他实施方案中，IL-6a是在IgG1或IgG2框架中并具有修饰的Fc，与亲本或其他参考IL-6a相比，其在pH 6.0时增加了结合亲和力而在pH 7.0时基本上不改变结合亲和力。在实施方案中，Fc结构域被修饰且与亲本或其他参考IL-6a相比，所述IL-6a具有减少的系统累积，降低的半衰期和/或增加的系统清除。
在一些实施方案中，抗体IL-6a被修饰以增加补体结合和补体依赖性细胞毒性。在其他方面中，抗体IL-6a被修饰以增加(与参考抗体相比)抗体激活效应细胞和参与抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的能力。在一些情况下，本发明中所公开的抗体可以被修饰以增强其激活效应细胞和参与抗体介导的细胞毒性(ADCC)的能力以及增加其补体结合和参与补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。
在一些实施方案中，本发明所公开的抗体被修饰以减小其固定补体和参与补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。在另一个的实施方案中，抗体被修饰以减小其抗体激活效应细胞和参与抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的能力。在又一实施方案中，本发明所公开的抗体可以被修饰以减小其激活效应细胞和参与抗体介导的细胞毒性(ADCC)的能力以及减小其补体结合和参与补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。
避免频繁地递送IL-6a剂量通常是有利的，例如，当注射递送入眼睛时。为了促进这一特征，在某些实施方案中，本发明所公开的IL-6a在递送位点如玻璃体的半衰期为至少4天、例如至少7天、至少9天、至少11天或至少14天。在某些实施方案中，IL-6a的平均半衰期为至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、25天、30天、40天、50天或60天。增加抗体半衰期的方法是本领域中已知的，例如描述于美国专利第6,277,375号和国际公开第WO 1998/23289号和第WO 1997/3461号。在一些实施方案中，IL-6a在靶向递送位点如玻璃体的半衰期大于全身半衰期，如血液、血浆、淋巴、肝、肾或其他组织或体液中的半衰期)。
在其他实施方案中，本发明提供了一种包括容器的制造品。所述容器包括含有本发明所公开的IL-6a的组合物，以及指示该组合物可用于治疗IL-6相关病症的包装说明书或标签。一般地，该组合物是包含IL-6a和药学上可接受的赋形剂的组合物。
在一些情况下，本发明是含有包含本发明所公开的IL-6a的组合物以及指示施用者向需要治疗的受试者施用所述组合物的说明的试剂盒。
在需要大的IL-6a的实施方案中，例如增强IL-6a位于或在递送位点附近的保留，增加大小但不显著地对IL-6a的功能(如对IL-6或IL-6/IL-6R复合物的结合亲和力)产生不利影响的部分可与IL-6a联合。例如可基因工程化Fab以表达含Fab和Fc部分的单个多肽。
在需要相对小尺寸的IL-6a的实施方案中，可使用IL-6的抗体或片段，例如scFv或Fab片段。IgG抗体的大小约为150kD，Fab约为50kD，而scFv约为25kD。在一些实施方案中，本发明所描述的IL-6a的大小小于约50kD。这种拮抗剂可以是，例如，小于或等于50kD并大于10kD、小于或等于50kD并大于20kD、小于或等于50kD并大于25kD。
在一些情况下，通过制造变体来提高IL-6拮抗剂(如具有二硫键的抗体或其他抑制剂)的稳定性，其中该变体的一个或多个二硫桥比亲本分子的更为稳定。
本发明所描述的某些IL-6a分子的其他优势可以是有效的分子的可用性，所述有效的分子具有合适的递送方式、递送位点或活性模式的大小。例如，Fab形式的IL-6a可用于局部应用。改造该分子的方法在本发明中所描述并且是本领域已知的。
适应症/IL-6相关疾病
可用本发明的IL-6a治疗的疾病包括这些疾病，在这些疾病中升高的IL-6与疾病状态相关或作为疾病状态的先决条件。这样的疾病包括由IL-6驱动的导致血管发生和炎症的疾病病理。这包括与正常水平相比升高的IL-6，例如玻璃体中IL-6升高的疾病(如糖尿病黄斑水肿、糖尿病性视网膜病和葡萄膜炎)或眼组织中IL-6升高的疾病。某些眼病的例子包括但不限于干眼(例如，干眼病或干眼综合征)、过敏性结膜炎,葡萄膜炎,年龄相关性黄斑变性(AMD),增生型糖尿病视网膜病变(PDR),糖尿病黄斑水肿(DME),孔源性视网膜脱离(RRD),视网膜静脉阻塞(RVO),视神经脊髓炎(NMO)。可以治疗的其它眼疾病包括那些由外伤引起眼病，如角膜移植、角膜擦伤，或其他对眼睛造成的该类物理伤害。因此，本发明包括使用本发明所描述的IL-6a治疗患有IL-6相关疾病的受试者的方法。
在一些实施方案中，IL-6相关疾病是炎性疾病。在一些实施方案中，该疾病是青光眼。
在一些实施方案中，该疾病是眼部疼痛。
在一些实施方案中，受试者的治疗还包括确定受试者是否患有IL-6相关疾病，和任选地，患者是否抵抗其他非IL-6抑制治疗，如类固醇或抗VEGF治疗。
某些基于抗体治疗的一个问题在于抗体在特定位置如眼睛，例如在玻璃体中，是有效的，但全身施用会导致副作用。一种解决方案是提供一种如本发明所述的分子为例的治疗剂，相对于全身递送，该治疗剂可以局部递送。由于一些局部递送的(如递送到玻璃体中)的治疗剂在一定程度上会出现全身递送，因此设计将具有相对快的全身清除(systemicturnover)的分子是有利的。申请人已经工程化了被设计为例如与亲本分子或参考抗体相比能快速全身清除的IL-6抗体的实例。这是通过突变Fc域以修饰分子的FcRn结合，例如以减少FcRn介导的IL-6a的再循环来实现的。
糖尿病黄斑水肿(DME)。糖尿病黄斑水肿(DME)参与视网膜血管的阻塞和渗漏，造成视力下降和潜在的失明。对DME的标准治疗方法包括局部施用类固醇或抗VEGF抗体。然而很多病人对这些疗法是难治的。糖尿病黄斑水肿的发病机理涉及血管发生、炎症和氧化应激。IL-6由缺氧和高血糖诱导并能增加血管炎症、血管通透性和病理性血管发生。IL-6可直接诱导VEGF的表达并能在动物模型中促进脉络膜血管新生。在DME患者中，眼睛的IL-6水平与黄斑厚度和疾病的严重程度正相关。IL-6水平被报道在抗VEGF疗法失败的患者中升高而在抗VEGF响应的患者中降低。因此，施用本发明所描述的IL-6a与抗VEGF治疗剂组合来治疗糖尿病患者或作为抗VEGF治疗的替代(包括那些对抗VEGF治疗不响应的患者)是有用的。用IL-6a治疗黄斑水肿还可通过去除完全抑制任何一种机制以抑制病症的需求来提高其安全性，从而保留了各细胞因子的一些需要的生理作用。因此，局部IL-6a治疗与VEGF抑制相组合能够降低给药频率并减轻治疗的副作用。
在DME中，玻璃体IL-6水平与疾病严重程度和VEGF难治的受试者两者正相关。因此本发明所记载的IL-6a可用于治疗对类固醇疗法、抗VEGF疗法或两者难治的DME受试者。在一些情况下，IL-6a与抗VEGF疗法或类固醇疗法组合使用，如治疗DME。
本发明所记载的IL-6a还可用于治疗病症例如癌症，如前列腺癌(prostatecancer)、白血病(leukemia)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)，炎性病(如慢性炎症增生疾病(chronic inflammatory proliferative diseases))和自身免疫性疾病(autoimmunedisease)，如类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、卡斯尔曼病(Castleman'sdisease)(巨大或血管滤泡淋巴结增生(giant or angiofollicular lymph nodehyperplasia)、淋巴错构瘤(lymphoid hamartoma)，血管滤泡性淋巴结增生(angiofollicular lymph node hyperplasia))、幼年特发性关节炎(juvenileidiopathic arthritis)(包括多关节幼年特发性关节炎(polyarticular juvenileidiopathic arthritis)和系统性幼年特发性关节炎(systemic juvenile idiopathicarthritis))、斯蒂尔病(Still's disease)(包括幼年特发性关节炎(juvenileidiopathic arthritis)和成年型斯蒂尔病(adult onset Still’s disease))、成年型斯蒂尔病(adult onset Still’s disease)、淀粉样蛋白A淀粉样变性病(amyloid Aamyloidosis)、风湿性多肌痛(polymyalgia rheumatica)、缓解性血清阴性对称性滑膜炎伴凹陷性水肿(remitting seronegative symmetrical synovitis with pittingedema)、脊椎关节炎(spondyloarthritides)、白塞氏病( disease)(包括治疗眼部表现(ocular manifestations)的治疗)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、银屑病(psoriasis)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosis)、多发性肌炎(polymyositis)(炎症性肌病inflammatory myopathy)、复发性多软骨炎(relapsingpolychondritis)、获得性血友病A(acquired hemophilia A)，多发性硬化症(multiplesclerosis)，炎症性贫血(anemia of inflammation)，和克罗恩病(Crohn’s disease)。
IL-6拮抗剂还可用于治疗某些神经疾病，例如抑郁症和阿尔茨海默氏病。
可用本发明中所记载的IL-6a治疗其他疾病，包括但不限于全身性硬化症(systemic sclerosis)、多发性大动脉炎(Takayasu arteritis)、巨细胞性动脉炎(giantcell arteritis)、移植物抗宿主病(graft versus host disease)、与肿瘤坏死因子受体相关周期性综合症(TNF-receptor-associated periodic syndrome TRAPS)。
剂量
可将IL-6抗体或其片段施用给受试者(如患者)，所述受试者表达，例如异常的高水平的IL-6。抗体或其片段可一次施用，或可多次施用。可施用抗体，例如，从每天三次到每六个月一次或更久。可以按计划施用如每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次和每六个月一次。抗体或片段可经由迷你泵或其他途径如可植入的缓释胶囊或通过生产抗体或其片段的细胞持续施用。抗体或其片段可经由粘膜、口腔、鼻内、吸入、静脉内、皮下、肌内、肠胃外、眼内或肿瘤内途径给药。抗体或其片段可施用一次、至少两次或在至少病症被治疗、减轻或治愈的时间段内施用。一般将施用抗体或其片段，只要病症存在。抗体或其片段，一般将其作为本发明所描述的药物组合物的一部分施用。抗体的剂量一般将在0.1到100mg/kg、0.5到50mg/kg,、1到20mg/kg和1到10mg/kg的范围内。可通过任何合适的方法测量抗体或其片段的血清浓度。本发明所描述的某些化合物的一个特征在于它们需要相对不频繁的给药，例如每周一次、每周两次、每周三次、每四周一次、每两周一次、每8周一次、每12周一次、每16周一次、每32周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次。在一些情况下，在需要的基础上，确定(例如通过受试者的状态)化合物的施用。本发明所描述的允许相对不频繁给药的IL-6拮抗剂的一个特征在于将高效力(至少部分是通过一旦结合到IL-6则具有慢解离速率实现的)和递送相对高浓度的化合物的能力相组合。
在一些情况下，IL-6a作为单一疗法施用。在其他实施方案中，IL-6a与甲氨蝶呤或其它疾病改善抗关节炎药物同时施用。
抗体的产生
可使用本领域已知方法如单克隆抗体方法学(如，参见Kohler and Milstein(1975)Nature 256:495)生产抗体IL-6a或其衍生物或片段。还可采用其他制造单克隆抗体的技术如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。
可基于使用本领域已知方法制备的小鼠单克隆抗体制备嵌合或人源化抗体。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可从感兴趣的小鼠杂交瘤中获得，以及所述DNA可使用标准分子生物学技术改造以包含非小鼠(如人)的免疫球蛋白序列。例如，为了制备嵌合抗体，可使用本领域已知技术(参见例如美国专利第4,816,567号)将小鼠可变区与人恒定区相连接。为了制造人源化抗体，可使用本领域已知技术(参见例如美国专利第5,225,539号和第5,530,101；5,585,089；5,693,762号；和第6,180,370号)将小鼠CDR区插入人框架。
在实施方案中，本发明所描述的IL-6a(如抗IL-6抗体或其衍生物或片段)能够特异地结合人IL-6。在实施方案中，IL-6a能够特异地结合IL-6的位点II(如人IL-6的位点II)。
在一些实施方案中，IL-6a抗体是人单克隆抗体。该抗体可使用包含部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生。这些转基因和转染色体小鼠包括“人Ig小鼠”，诸如HuMAb 和KM 参见，例如美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299和5,770,429号；美国专利号5,545,807；PCT公开号WO 92/03918,WO 93/12227,WO 94/25585,WO97/13852,WO 98/24884和WO 99/45962；和PCT公开号WO 01/14424号。
在其他方面中，可使用在转基因或转染色体中携带人免疫球蛋白序列的小鼠，如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠来生产人抗IL-6抗体。这类小鼠在PCT公开号WO 02/43478中详细描述。
其他表达人免疫球蛋白基因的转基因动物系统是本领域可获得的，且能被用于生产抗体IL-6a。例如可使用称作XenomouseTM(Abgenix,Inc.)的备选转基因系统；此类小鼠被描述于例如美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584；和6,162,963中。此外，表达人免疫球蛋白基因的转染色体动物系统是本领域可获得的，并可用于生产抗体IL-6a。例如携带人重链转染色体和人轻链转染色体两者的小鼠被描述于Tomizuka等中(2000,Proc Natl Acad Sci USA 97:722-727)。还可以使用SCID小鼠制备人单克隆抗体，其中在该小鼠中重建了人免疫细胞从而可以通过免疫接种来产生人抗体应答。此类小鼠被描述于例如美国专利号5,476,996和5,698,767中。
噬菌体展示文库
在一些情况下，抗体IL-6a抗体或其衍生物或片段是在使用噬菌体合成人抗体文库、用IL-6(例如人IL-6)或其片段筛选所述文库、分离结合IL-6的噬菌体以及从所述噬菌体获得抗体的方法中产生的。
还可以通过筛选重组组合抗体文库来分离重组人抗体IL-6a。一般来说，所述文库是scFv噬菌体文库，该文库是用人VL和VH cDNAs(从分离自B细胞的mRNA中制备)产生的。制备和筛选这类文库是本领域已知的。用于产生噬菌体展示文库的试剂盒是商业上可获得的(如Pharmacia公司的重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；和Stratagene SurfZApTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。其他可用于生产和筛选抗体噬菌体文库的方法和试剂是本领域已知的(参见，例如美国专利号5,223,409；PCT公开号WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；Fuchs等,Bio/Technology 9:1370-1372(1991)；Hay等,Hum Antibod Hybridomas 3:81-85(1992)；Huse等,Science 246:1275-1281(1989)；McCaffert等,Nature 348:552-554(1990)；Griffiths等,EMBO J 12:725-734(1993)；Hawkins等人，,J Mol Biol 226:889-896(1992)；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Gram等,Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580(1992)；Garrad等,Bio/Technology 9:1373-1377(1991)；Hoogenboom等,Nuc Acid Res 19:4133-4137(1991)；和Barbas等,Proc Natl Acad Sci USA 88:7978-7982(1991)，作为参考全部并入本文。
在一个分离和生产具有所需要特征的IL-6抗体的例子中，首先用人IL-6抗体，使用表位印迹法来选择相似IL-6结合能力的重链和轻链序列，所述方法描述于PCT公开号WO93/062l3中，作为参考并入本文。这一方法中所使用的抗体文库一般为scFv文库，该文库的制备和筛选描述于PCT公开号WO 92/01047；McCafferty等,Nature 348:552-554(1990)；and Griffiths等,EMBO J 12:725-734(1993)，作为参考全部并入本文。
一旦选择了初始人VL和VH结构域，就进行“混合并匹配”实验，在该实验中筛选不同对的初始选择的VL和VH片段的IL-6结合能力以选择优选的VL/VH对组合物。为了选择IL-6a所需要的特征，可随机突变所选对的VL和/或VH片段。这种体外亲和成熟例如可通过使用与所选择的VH和VL结构域的一个或两者的CDR互补的PCR引物扩增VH和VL结构域的方式实现，其中所述引物包含在某些位点的四个核苷酸碱基的随机组合，从而所产生的PCR产物编码引入了随机突变的VH和/或VL的片段。这类随机突变的VH和VL片段可被用来筛选IL-6的结合片段，例如IL-6的位点II的结合片段。
在从重组的免疫球蛋白展示文库中筛选和分离抗体IL-6a后，可从展示包装(display package)(例如从噬菌体基因组)回收编码选择的抗体的核酸，并通过本领域已知的重组DNA技术将其亚克隆入其他表达载体。可对这类抗体进一步操作以产生抗体片段，如那些在本发明中记载的抗体片段。
药代动力学(PK)
可使用本文描述的方法和/或本领域已知方法进行PK测试。需要使用动物进行测定例如测定PK的一个障碍在于人类的IL-6与那些通常用于此类测试的一些动物的IL-6具有小于50％的同源性。因此测试PK的一种方法是使用表达人IL-6的转基因小鼠。在一些实施方案中，使用非人灵长类动物来测定PK。
在一些实施方案中，抗IL-6抗体是突变的以改变其PK，例如通过改变FcRn结合的pH敏感性而改变其PK。获得这类突变的方法记载于实施例中。因此，在一些实施方案中，与亲本IL-6a或参考分子相比，所述IL-6a具有改变的全身PK(systemic PK)。在一些情况下，PK在玻璃体中是不改变的或是改善的。在一些实施方案中，与亲本IL-6a或参考分子相比，IL-6a具有降低的系统PK(例如，减少的半衰期和/或增加的清除，例如，如在循环流体如血液，血浆，淋巴或血清中测定的)。
用于测试IL-6拮抗剂的模型
可在疾病模型中测试IL-6拮抗剂的IL-6相关递送，特别是测试治疗效果和有限的针对IL-6有利特性的副作用。例如可以在大鼠或小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎模型中，使用在完全弗氏佐剂(CFA)中的感光细胞间受体视黄醇类结合蛋白(IRBP)免疫接种来测试葡萄膜炎(Caspi,Invest Ophthalmol Vis Sci 52:1873；Agarwal等,900:443-69,2012)。其他模型包括那些本领域中已知的树突状细胞诱导的葡萄膜炎、培养的效应T细胞的过继转移、在IRBP TcR Tg小鼠中的自发EAU、内毒素诱导的葡萄膜炎、自身免疫性葡萄膜视网膜炎(Haruta等,Invest Ophthalmol Vis Sci 53:3264(2011)；Yoshimura等,Rheumatology48:347-354(2009))。
其他能够用于检查IL-6a在治疗IL-6相关疾病的治疗中的效果的模型系统是例如，脉络膜新生血管(CNV)模型(Izumi-Nagai等,Am J Pathol 170:6(2007)；Krzystolik等,Arch Ophthalmol 120:338(2002))和糖尿病模型如那些描述于Kern等(Animal ModelsOf Diabetic Complications Consortium(P01 DK57733),Update Report(September2001–January 2004)的模型。用于测试IL-6a在类风湿关节炎中的动物模型是本领域已知的，例如参见Asquith等(Eur J Immunol 39:2040-4(2009))and Kollias等(Ann RheumDis 70:1357-62(2011)。
CNV模型代表例如AMD和DME的人类状况。视网膜新血管形成模型是有用的，例如用于研究缺血性视网膜病变，例如糖尿病视网膜病或早产儿视网膜病。各种脉络膜和视网膜新血管形成模型在本领域中是已知的(参见，例如，Grossniklaus,H.E.等人，Prog RetinEye Res.2010Nov；29(6):500-19.doi:10.1016/j.preteyeres.2010.05.003.Epub2010May 19；Saisin,Y等人，(2003)Journal of Cellular Physiology,195:241-248；Takahashi,K.等人，(2003)Investigative Ophthalmology&Visual Science,44(1):409-415；Lima e Silva,R.等人，(2007)FASEB Journal,21:3219-3230；Tobe等人，(1998)American Journal of Pathology,153(5):1641-1646；Dong,A等人，(2011)PNAS,108(35):14614-14619；Dong等人，(2009)J Cell Physiol 219:544-552；Smith,LE等人，1994Invest Ophthalmol Vis Sci 1994；35:101-111；Shen,J.等人，(2007)InvestigativeOphthalmology&Visual Science,48(9):4335-4341)，并且可用于研究IL-6a的功效。脉络膜新血管形成(CNV)可以通过例如激光，光，手术或遗传修饰来诱导。氧诱导的视网膜新生血管形成的模型是本领域已知的，并且描述于例如，在Smith,LE等人，1994 InvestOphthalmol Vis Sci 1994；35:101-111；Shen,J.等人，(2007)InvestigativeOphthalmology&Visual Science,48(9):4335-4341中。
还可以使用缺血/再灌注模型。参见例如Zheng,L等人，InvestigativeOphthalmology&Visual Science,vol.48no.1pp.361-367,2007。例如，在第1天，将附接到流体袋的30号针插入麻醉的小鼠的角膜中，并且将眼内压(IOP)升高至约120mmHg以产生缺血。30-90分钟后，除去针头，对IOP标准化，并且发生视网膜循环回流。包括TNF-α和ICAM-1在内的炎症标志物的表达可以通过蛋白质印迹和qPCR在第2-6天进行评估。另外，神经节细胞损失可以通过组织学在第3-14天评估，并且毛细血管变性通过胰蛋白酶消化技术在第10-14天测量。对于治疗研究，在诱导缺血之前或之后不久，将测试制品(例如1μL的适当浓度，例如20mg/mL的IL6a)经玻璃体内注射。
联合疗法
在一些实施方案中，将IL-6a与第二治疗性实体(therapeutic entity)组合施用。例如在包括VEGF抑制剂诸如例如兰尼单抗的治疗方案中施用IL-6a。在一些实施方案中，在包括PDGF抑制剂的治疗方案中施用IL-6a，其中所述PDGF抑制剂诸如例如抗PDGF抗体或抗PDGF受体抗体(例如伊马替尼)。在一些实施方案中，IL-6a与补体途径抑制剂,例如洛他珠单抗(lampalizumab)(因子D抑制剂)或C5抑制剂组合施用。
IL-6拮抗剂的递送
本文所述的IL-6拮抗剂或组合物可局部递送，直接接触或邻近进行IL-6抑制的靶细胞或组织。这种递送方法的非限制性的实例包括注射、输液或植入含有IL-6拮抗剂的物质。
在实施方案中，IL-6a或组合物经眼内施用，例如玻璃体内，例如通过玻璃体内注射，眼用插入物或基因递送。
在一些实施方案中，IL-6a组合物作为眼用制剂施用。该方法可包括施用IL-6a组合物和眼可接受的载体。在某些实施方案中，眼用制剂是液体、半固体、插入物(insert)、膜、微粒或纳米颗粒。IL-6a组合物可以例如通过局部施用或通过注射(例如，玻璃体内注射)施用。
在一些实施方案中，将IL-6a组合物配制用于玻璃体内施用。
在一些实施方案中，IL-6a组合物被配制用于局部施用，如眼睛施用。所述局部制剂可以是液体制剂或半固体，例如，局部制剂可以包括水溶液、水性悬浮液、软膏或凝胶。眼用的IL-6a的制剂可以局部施用于眼睛的前部、上眼睑下，下眼睑上和在cul-de-sac内。一般地，眼用制剂是无菌的。IL-6a眼用制剂可含有适合于眼用制剂的制备的一种或多种药物赋形剂。这些赋形剂的例子为防腐剂、缓冲剂、螯合剂、抗氧化剂和用于调节渗透压的盐。包括软膏剂和悬浮液的眼用制剂一般具有适合于所选的施用路径的粘度。在一些实施方案中，眼用制剂具有从约1,000至约30,000厘泊的粘度。
在一些实施方案中，所述制剂是一种包含聚合物的液体制剂。这类聚合物可用于改善的生物利用度、提高粘度或降低液体制剂从眼睛中排出。合适的聚合物包括但不限于，在Wagh等人(Asian J Pharm,2:12-17,2008)描述的那些聚合物。在非限制性的例子中，聚合物是透明质酸酶的钠盐、壳多糖、环糊精(如羟丙基β环糊精)、聚半乳糖醛酸、木葡聚糖、黄原胶、结冷胶、硫醇化聚合物、聚(原酸酯)(如Einmahl,Adv Drug Deliv Rev 53:45-73,2001)或罗望子种子多糖(如，Ghelardi等,Antimicrob Agents Chemother 48:3396-3401,2004)。
在一些实施方案中，包含用于眼部递送的IL-6a制剂可含有一种或多种的表面活性剂、辅助剂，佐剂、抗氧化剂、张力调节剂、防腐剂(如EDTA、BAK(苯扎氯铵)、亚氯酸钠、过硼酸钠、聚季铵盐-1(polyquaterium-1))、增稠剂或粘度调节剂(如羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、乙二醇400、丙二醇羟甲基纤维素、羟丙基瓜耳豆胶、透明质酸和羟丙基纤维素)等。制剂中的添加剂可以包括，但不限于，氯化钠、碳酸氢钠、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、蓖麻油和过硼酸钠。
在一些实施方案中，纯水或去离子水可用于组合物中。可通过添加任何生理和眼用可接受的pH调节的酸、碱或缓冲剂将pH调节至约5.0至8.5的范围内，如pH7.0、pH7.3、pH7.4或pH7.5。眼用可接受的酸的例子包括乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、盐酸等，碱的例子包括氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠、氨基丁三醇、三羟基甲基氨基甲烷等。可用于制剂的盐和缓冲液的例子包括柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠、氯化铵以及上述酸和碱的混合物。
在一些实施方案中，眼用组合物的渗透压可以为约10毫渗透摩尔(milliosmolar)(mOsM)至约400mOsM，例如200至400mOsM或220至370mOsM。通常，可以用生理上和眼科可接受的盐或赋形剂来调节渗透压。在一些实施方案中，制剂中包括氯化钠，例如，氯化钠存在于制剂中的浓度按重量计为0.01％至1％或按重量计为0.05％至0.45％，基于组合物的总重量。还可使用由一种或多种等量的由阳离子(如钾，铵等)和阴离子(如氯离子，柠檬酸根，抗坏血酸根，硼酸根，磷酸根，碳酸氢根，硫酸根，硫代硫酸根，硫酸氢盐，硫酸氢钠，硫酸铵等)组成的盐与氯化钠一同或替代氯化钠以实现在需要的范围内的渗透压。在一些实施方案中，还可使用糖，如甘露糖醇，右旋糖，山梨糖醇，葡萄糖等，来调节渗透压。
在一些实施方案中，所述方法包括形成或提供与眼外表面接触的药剂的储库(depot of the agent)。储库指的是试剂的供给源，所述储库不会被泪液或其他眼部清除机制除去。这允许通过单次应用，连续、持续高浓度的药剂存在于眼睛外表面的流体中。在一些实施方案中，储库可以保持多达八个小时以上。在一些实施方案中，眼储库制剂包括但不限于，聚合物水性悬浮液、软膏和固体插入物(solid inserts)。
在一些实施方案中，半固体组合物是一种施用到眼时增加粘度的液体制剂，所述粘度通常是由于液体制剂中存在聚合物，随着温度、pH或电解质浓度的变化粘度有所增加。聚合物可以是例如，乙酰基邻苯二甲酸纤维素(celluloseacetophthalate)、聚丙烯酸，结冷胶，透明质酸酶，壳多糖，藻酸盐(如藻酸钠)或环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物(如，BASF；泊洛沙姆)。在一些实施方案中，聚丙烯酸是交联的丙烯酸(如，)。在一些实施方案中，半固体组合物含有卡波姆以及环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物的混合物；甲基纤维素和羟乙基纤维素的混合物；或聚乙二醇以及环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物的混合物。
在一些实施方案中，包含IL-6a的眼用制剂是软膏或凝胶。在一些实施方案中，眼用制剂是油基递送载体。例如，制剂可包含加入IL-6a组合物(如在0.1％至2％)的石油或羊毛脂基载体和赋形剂。常见的基质(base)包括但不限于矿物油、矿脂及其组合。在一些实施方案中，软膏作为条带(ribbon)施用至下眼睑。
在一些情况下，眼用组合物是眼用插入物。在实施方案中，通过眼用插入物经玻璃体内施用组合物。
例如所述眼用插入物是生物学惰性的、柔软的、生物可腐蚀的、粘弹性的(viscoelastic)、暴露于治疗剂后稳定灭菌的、对空气传播细菌感染抗性的、生物可腐蚀的、生物相容的和/或粘弹性的(viscoelastic)。在一些实施方案中，插入物包含眼用可接受的基质，例如，聚合物基质。所述基质一般是一种聚合物，且IL-6a组合物分散在基质内或结合到聚合物基质。在一些实施方案中，药剂从基质通过溶解或水解共价键而缓慢释放。在一些实施方案中，聚合物是生物可腐蚀(溶解)的，且其溶解速度可控制分散在聚合物基质中药剂的释放速度。在另一种形式中，聚合物基质是可生物降解的聚合物，该聚合物例如通过水解而分解，从而释放出与其结合或分散在其中的药剂。在进一步的实施方案中，可用另外的聚合物包衣包围基质和药剂以进一步控制释放。在一些实施方案中，插入物包含可生物降解的聚合物，如聚己内酯(PCL)、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物(EVA)、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨酯、尼龙或聚DL-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)或任意这些的共聚物。在一些情况下，药剂被分散到基质材料或分散在单体组合物中，所述单体组合物用于在聚合前制造基质材料。在一些实施方案中，药剂的量为约0.1至约50％或从约2至约20％。可使用可生物可降解的或生物可腐蚀的聚合物基质，从而不必从眼睛中移除过的插入物。随着生物可降解或生物可腐蚀聚合物的降解或溶解，所述药剂得以释放。
在进一步的实施方案中，眼用插入物包含一种聚合物，包括但不限于，那些在Wagh,等,"Polymers used in ocular dosage form and drug delivery systems",AsianJ.Pharm.,pages 12-17(January 2008)中记载的聚合物，通过全文引用并入本文。在一些实施方案中，插入物包含聚合物，所述聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚合物或共聚物(如，来自Rohm或Degussa的聚合物家族)、羟甲基纤维素、聚丙烯酸、聚(酰氨基胺)树枝状聚合物、聚(二甲基硅氧烷)、聚环氧乙烷、聚(丙交酯共乙交酯)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚乙烯基醇)或聚(丙烯富马酸酯)。在一些实施方案中，插入物是450kDa的半胱氨酸-聚丙烯酸缀合物。
插入物可包括含有IL-6a组合物的芯(core)和外套管(如描述于美国专利公开第20040009222号中)。在一些情况下，外管对药物可以是渗透性的，半渗透性的或不渗透的。在一些实施方案中，芯包括对IL-6a组合物的释放速度不产生显著影响的聚合物基质。在一些情况下，外套管、芯的聚合物基质或两者是生物可腐蚀的。共挤出产品(co-extrudedproduct)可分割为(segmented into)药物递送装置。在一些实施方案中，所述装置是未包被的以使各自的端部是开放的，或所述装置用例如膜(layer)包被，所述膜对IL-6a组合物是可渗透的、对IL-6a组合物是半渗透的或生物可腐蚀的。在某些实施方案中，IL-6a组合物和至少一种聚合物以粉末形式混合。
在一些实施方案中，眼用组合物是眼用膜。适合于此类膜的聚合物包括但不限于那些描述于Wagh等(同前)的聚合物。在一些实施方案中，所述膜是软性隐形眼镜(soft-contract lens)，例如由N，N-二乙基丙烯酰胺和与乙二醇二甲基交联的甲基丙烯酸的共聚物组成的眼镜。
在某些实施方案中，IL-6a位于管状的插入物中，且可以是分割的(segmented)。
在一些实施方案中，IL-6a组合物被配制为治疗有效量，由聚合物基质包被的或分在聚合物基质中，使得IL-6a组合物为粒状或颗粒形式。在一些实施方案中，当颗粒中的药物溶解到或在基质中，沿基质扩散，并被释放到周围生理性液体中时，IL-6a组合物从配置物中释放出来。在一些实施方案中，释放速率主要受IL-6a组合物从颗粒/微粒溶解到基质中的速率的限制；沿基质扩散和分散到周围液体中的步骤不是主要的释放速率限制因素。在某些实施方案中，聚合物基质是非生物可腐蚀的，而在其他实施方案中其是可生物腐蚀的。示例性的可形成非生物可腐蚀聚合物基质可以是聚氨酯、聚硅氧烷、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)(EVA)、聚乙烯醇及其衍生物和共聚物。示例性的可形成非生物可腐蚀聚合物基质可以是聚酐、聚乳酸、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯(polyalkylcyanoacrylate)及其衍生物和共聚物。
在一些情况下，在胶原材料中配制IL-6a组合物。例如，插入物可以是可溶性眼用药物插入物(如能够被引入到上结膜囊用以药物递送的椭圆形聚合物薄膜；椭圆的插入物如由乙烯醋酸乙烯酯制成的(毛果芸香碱眼部治疗系统,由AlzaCorporation开发)；由纤维素制成的杆状插入物；新型眼科药物输送系统(NODS)，由聚(乙烯醇)制成；或那些描述于Fabrizio(Adv Drug Deliv Rev 16:95-106,1998)中的插入物。在一些情况下，插入物包含胶原、明胶或聚合物，其中所述聚合物选自聚己内酯(PCL)、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物(EVA)、氰基丙烯酸酯、聚氨酯、尼龙、聚(DL-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)或任何这些的共聚物。在一些情况下，在上眼睑下植入插入物。在一些情况下，插入物被植入到在眼睛的后段、脉络膜空间或巩膜内。在一些实施方案中，在玻璃体内或视网膜下植入插入物。
在一些实施方案中，视网膜下注射插入物。施用的方法和插入物的制备技术阐述于Remington's:The Practice of Science of Pharmacy,20th edition(LippincottWilliams&Wilkins,2006)中，通过引用将其全部并入本发明。
在其他实施方案中，包含的IL-6a组合物的插入物提供了药剂到眼睛玻璃体的持续释放。如本发明所用，“持续释放”是指组合物以受控的方式在延长的时间内释放药剂。在一些实施方案中，插入物以一种的速率释放药剂，使得在药剂的释放过程中，水中(aqueousagent)的药剂的浓度持续低于玻璃体中药剂的浓度。在一些实施方案中，水中(aqueousagent)的药剂的浓度为从约0.002μg/mL到约0.01μg/mL或从约0.01μg/mL，到约0.05μg/mL或到低于约0.05μg/mL。在一些实施方案中，以约1μg/天到约50μg/天，或从1μg/天到约10μg/天的速率释放药剂。在一些实施方案中，插入物还包含如上文详述的额外的治疗剂，例如氟轻松(如存在于眼部插入物中)。
在一些实施方案中，眼用组合物包含微球或纳米颗粒。在一些实施方案中，所述微球包含明胶。在一些实施方案中，微球被注射到眼睛的后段、脉络膜空间或巩膜内。在一些实施方案中，微球或纳米颗粒包含聚合物，包括但不限于那些在Wagh,等(Asian J Pharm2:12-17,2008)中描述的聚合物。在一些实施方案中，聚合物是壳多糖、聚羧酸，如聚丙烯酸、白蛋白颗粒、透明质酸酯、聚衣康酸、聚(丁基)氰基丙烯酸酯、聚己内酯、聚(异丁基)己内酯、聚(乳酸-共-乙醇酸)或聚(乳酸)。在一些实施方案中，微球或纳米颗粒包含固体脂质颗粒。
在一些实施方案中，IL-6a组合物包含离子交换树脂。在一些实施方案中，离子交换树脂是无机沸石树脂或合成的有机树脂。在一些实施方案中，离子交换树脂包括但不限于Wagh等中描述的树脂(同上)，通过引用将其全部并入本发明。在一些实施方案中，离子交换树脂为部分中和的聚丙烯酸。
可以在水性聚合物悬液中提供IL-6a组合物。在一些实施方案中，IL-6a组合物或聚合物悬液悬浮于水性介质(如具有前文所述特性的水性水性介质)中。聚合悬浮试剂的例子包括，但不限于，葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖凝胶、纤维素聚合物如羟丙基甲基纤维素和含羧基的聚合物，如丙烯酸的聚合物或共聚物，以及其它聚合物缓和剂(polymeric demulcents)。在一些实施方案中，该聚合物缓和剂是水可溶胀的、水不溶性聚合物，特别是交联的含羧基的聚合物。在一些实施方案中，以所存在的单体的总重量为基准计，该聚合物悬浮剂包含至少约90重量％到约99.9％，或约95％到约99.9％的一种或多种含羧基的单烯属不饱和单体。在一些实施方案中，该含羧基的单烯属不饱和单体包括丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基丙烯酸、甲基丙烯酸(巴豆酸)、顺式-α-甲基巴豆酸(当归酸)、反式-α-甲基巴豆酸(α-甲基巴豆酸)、α-丁基巴豆酸、α-苯基丙烯酸、α-苄基丙烯酸、α-环己基丙烯酸、苯基丙烯酸(肉桂酸)、香豆酸(邻羟基肉桂酸)以及伞形酸(对羟基香豆酸)。在一些实施方案中，该聚合物是通过多官能团交联剂(如，双官能的交联剂)来交联。在一些实施方案中，以所存在的单体的总重量为基准计，该交联剂的含量为约0.01％到约5％，或约0.1％到约5.0％，或约0.2％到约1％。在一些实施方案中，该交联剂是非聚烯基聚醚双官能交联用单体，例如二乙烯基乙二醇、2，3-二羟基己-1，5二烯、2，5-二甲基-1，5-己二烯、二乙烯基苯、N,N-二烯丙基丙烯酰胺、N，N-二烯丙基甲基丙烯酰胺；每一分子含有两个或更多个烯基醚基团的聚烯基聚醚交联剂，如含有末端H2C＝C基团的烯基醚基团，通过用卤代烯烃如烯丙基溴等将含有至少四个碳原子和至少三个羟基的多元醇醚化来制备，如聚烯丙基蔗糖，聚烯丙基季戊四醇等；分子量约400到约8000的二烯属非亲水性大分子交联剂，，例如二醇和多元醇的不溶性二丙烯酸酯和多丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯，由聚酯二醇、聚醚二醇或聚硅氧烷二醇与甲基丙烯酸羟烷基酯衍生的异氰酸酯终端的预聚物的二异氰酸酯丙烯酸或甲基丙烯酸羟烷基酯反应产物等
在一些实施方案中，交联聚合物可由作为唯一存在的单烯属不饱和单体的一种或多种含羧基的单烯属不饱和单体与一种或多种交联剂制备。在一些实施方案中，聚合物是其中至多约40％，优选约0％到约20％的一种或多种含羧基的单烯属不饱和单体被一种或多种不含羧基、仅含生理上和眼科学无害的取代基的单烯属不饱和单体替代的聚合物，所述单体包括丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯，例如甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸辛酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯，丙烯酸3-羟丙酯等，乙酸乙烯酯，N-乙烯基吡咯烷酮等(如Mueller等，美国专利第4,548,990号)。在一些实施方案中，聚合物包括聚卡波非(Noveon AA-1)、和在一些实施方案中，该交联聚合物通过使用常规自由基聚合催化剂将单体悬浮或乳液聚合至当量球径不超过约50μm的干燥粒度来制备。在一些实施方案中，该平均干燥粒度为当量球径约1到约30μm，或约3约20μm。在一些实施方案中，聚合物颗粒通过将较大的聚合物颗粒机械研磨来获得。在其他实施方案中，此类聚合物具有约250,000到约4,000,000，以及3,000,000,000到4,000,000,000的分子量。在其他实施方案中，交联聚合物的颗粒是单分散的，是指它们所具有的粒度分布应使得至少约80％、约90％或约95％的颗粒落入主粒度分布的μm带内。在其他实施方案中，单分散粒度是指不超过约20％，约10％，或约5％颗粒的粒度在1μm以下。在一些实施方案中，聚合物水性悬浮液包括约0.05到约1％、约0.1到约0.5％、或约0.1到约0.5％的治疗剂和约0.1到约10％、约0.5到约6.5％、约0.5到约2.0％、约0.5％到约1.2％、约0.6到约0.9％、或约0.6到约0.8％的聚合物悬浮剂。虽然提到的是单种，但应该理解，在总量处于规定范围的情况下，可以使用一种或多种聚合物悬浮剂。在一个实施方案中，不溶性的轻度交联的聚合物颗粒的量、pH和渗透压能够彼此相关，并且与交联度相关，以提供具有约500到约100,000厘泊，优选约1,000到约30,000厘泊或约1,000到约10,000厘泊的粘度的组合物，所述粘度使用装有25号芯轴和13R小样品接头的Brookfield数字LVT粘度计在12rpm和室温(约25℃)下测定。在一些实施方案中，该粘度为约10到约400厘泊，约10到约200厘泊或约10到约25厘泊。
在一些实施方案中，可以配制聚合物水性悬浮液，使得它们在眼中保持与施用于眼睛之前的粘度相同或基本上相同的粘度。在一些实施方案中，可以配制它们，使得其在与泪液接触时凝胶化增强。例如，当pH低于约6.7的含有或其他类似聚丙烯酸类聚合物的制剂施用于眼睛时，该聚合物在与泪液接触时可能溶胀，因为它具有较高的pH(大约7)。该凝胶化或凝胶化的增强可能导致悬浮颗粒的夹带，从而延长了组合物在眼睛中的停留时间。在一些实施方案中，随着悬浮颗粒经时溶解，该治疗剂慢慢地释放。在一些实施方案中，该输送途径增加了患者舒适感，增加了治疗剂与眼组织的接触时间，从而增加了药物吸收的程度和制剂在眼睛中的作用持续时间。在这些药物输送系统中含有的治疗剂可以取决于诸如药物本身及其外形、药物加载的程度和系统的pH以及还可能存在的任何药物输送助剂如与眼表相容的离子交换树脂之类的因素的速率从凝胶中释放。
在一些实施方案中，使用基因递送，如局部遗传递送，将IL-6拮抗剂提供给受试者。这种递送可通过瞬时表达系统递送，一种稳定的(如整合的)表达系统(如由BluebirdBio(Cambridge,MA)生产的慢病毒递送系统)，或在细胞工厂中递送，如那些由Neurotech(Cumberland,Rhode Island)所生产的细胞工厂。
所有技术特征可以这些特征的所有可能的组合方式单独地组合。
等同方案
本发明可用其他不违背其精神或主要特征的其他具体形式来体现。前述实施方案因此在所有方面被认为是说明性的而非对本发明所述发明的限制。
实施例
下列非限制性实施例进一步说明了本发明所述的本发明的实施方案。
实施例1：在脉络膜新生血管(CNV)模型中验证局部IL-6的阻断
为了确定局部IL-6阻断是否能够有效治疗眼睛疾病，例如糖尿病黄斑水肿(DME)或湿性AMD，抗IL-6抗体被局部施用到脉络膜新生血管模型系统中。激光诱导的CNV模型(eyecro.com/in-vivo/laser-induced-choroidal-neov ascularization-cnv/)再现许多DME下的病理过程，包括炎症和血管发生。Ey eCRO(Oklahoma City,OK)在大鼠中进行了研究。在第0天时，每组中的6只动物进行双侧激光处理以产生每只眼睛3处损伤。在第3天和第10天时，将3μg多克隆抗大鼠IL-6抗体(R&D Systems AF506；Minneapolis,MN)玻璃体(IVT)注射到实验组中，而将PBS或抗VEGF多克隆抗体(R&D Systems AF564)分别施用到载体和阳性对照组。在第15和22天体内造影以测量病变区域。在第15天和第22天抗IL-6处理组相对于载体对照显著地降低血管发生。抗IL-6处理组和抗VEGF阳性对照之间在应答上(response)没有显著差异。图1示出了该实验的结果。这些数据表明，IVT施用IL-6a，例如抗IL6抗体，可以在CNV大鼠模型中降低血管发生到与抗VEGF阳性对照相似的水平(抗I L-6对载体对照，在第15天p＝0.0054和在第22天p＝0.0005)。
这些数据表明，局部阻断IL-6对治疗眼病，例如涉及血管渗漏的眼病，如黄斑水肿是有用的。
实施例2：候选抗体IL-6拮抗剂
使用首先涉及免疫接种的流程开发候选抗体IL-6拮抗剂。免疫接种在发明人的指示下由合同研究组织(CRO)实施。向5只BALB/C小鼠皮下注射含80μg人IL-6(R&D Systems,cat#206-IL/CF,Minneapolis,MN)，1M NaCl和弗氏佐剂的PBS。用80μg和50μg的IL-6进行两次加强免疫。从最高滴度的小鼠中收集脾细胞并与P3x763Ag8.653骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤。
对杂交瘤上清液筛选IL-6结合和拮抗性。对于结合ELISA，用含1μg/mL人IL-6的PBS包被Costar 9018板，4℃过夜。用含有2％BSA的PBS封闭孔，洗涤，然后与50μL每种杂交瘤上清液孵育，所述杂交瘤上清液用含2％BSA的PBS以1:2稀释。60分钟后，将孔用含0.1％Tween-20的300μl PBS洗涤三次。然后每孔加入于PBS-BSA中以1:3000稀释的抗小鼠HRP，并孵育30分钟。板孔作如上的洗涤，然后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物，并在450和550nm处测量信号。对于拮抗研究，HEK-BlueTM-IL6报告细胞(InvivoGen,San Diego,CA)在1:10稀释的杂交瘤上清液的存在下与浓度递增的人IL-6孵育。20-24小时后，20μl上清液与180μl QuantiBlueTM(InvivoGen)混合，并在655nm处测量吸光度。
基于结合和拮抗研究，由申请人筛选出作为前导(lead)的杂交瘤64并在CRO亚克隆。进一步用酶联免疫吸附实验(ELISA)测试杂交瘤64(小鼠单克隆)抑制IL-6/IL-6Rα复合物结合到gp130的能力。通过ELISA，1.5μg/ml浓度的杂交瘤64显著地减弱了IL-6/IL-6Rα复合物结合到固定化的gp130(图2)。
再筛选所述亚克隆并用5’RACE PCR扩增亚克隆64.58的可变结构域并测序。小鼠可变结构域的序列(称为m64)如下：
m64 VH(可变重链)
QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVITPGSGTINYNEKFKGKAVLTADKSSSTVYMQLSSLTSDDSAVYFCAKSRWDPLYYYALEYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：13)
m64 VL(可变轻链)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO：14)
为了创建人源化序列，m64的互补决定区(CDR)被移植到通过计算算法选择的与小鼠序列相似的人种系框架(germline framework)中。人源化序列(称为h64)如下(与m64序列相比改变的残基用下划线标示)且与小鼠序列具有约79.5％的同一性(VH)和84.4％的同一性(VL)：
h64 VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGVITPGSGTINYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRWDPLYYYALEYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:15)
h64 VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGISFMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:16)
用DNA2.0(Menlo Park,CA)合成人源化序列，然后将其与人IgG1恒定结构域融合一并克隆入pcDNA3.1来源的表达载体。通过瞬时转染FreestyleTM-293细胞(Invitrogen,Grand Island,NY)表达，并通过蛋白A层析纯化IgG。在结合和拮抗研究中，与其m64祖先(predecessor)相比，h64 IgG表现出相当大的效力降低。因此利用酵母展示来恢复丧失的亲和力。
为了实施目的为恢复或提高人源化h64IgG亲和力的亲和力成熟(affinitymaturation)，h64抗体序列被重新克隆到pYC2/CT来源的酵母载体中以生产Fab分子，其中所述载体中FabH链通过(G4S)3连接子(SEQ ID NO：29)与抗FITC scFv 4m5.3融合。然后通过易错PCR(依照Chao等(2006,Nature Protocols,1:755-768)的方案)产生h64变体文库。表达H64变体并通过标记有FITC-PEG-NHS的酵母在表面捕获变体，然后与生物素化的人IL-6孵育。用亲和素-APC检测结合的IL-6，且在BD FACSAriaTM分选仪上选择结合有最高量IL-6的细胞，其中结合的IL-6的量与展示的Fabs的量相关。经过四轮筛选，高亲和力变体群体被选择和测序。由亲和力成熟所选择的克隆序列(称为h64-1.4)如下，其中所选择的突变(如与h64的VH和VL序列相比的突变)以粗体显示，且CDRs用下划线标示。这些是018的可变结构域(以及下述的020和029的IL-6a分子)。需要注意的是完整的Fabs包括CK和IgG1的CH1结构域。在本申请的上下文中，提及的“Fab”重链或轻链氨基酸序列是指序列可以是由轻链衍生序列和重链衍生的序列组成的起作用的Fab的一部分。
h64-1.4 VH(018VH)(可变结构域)
h64-1.4 VL(018VL)(可变结构域)
h64-1.4可变结构域被重新克隆到pcDNA3.1人IgG1载体中，并在FreestyleTM-HEK293细胞(Life Technologies)中表达全长的IgG1。所获得的纯化的IgG比原来的h64抗体在结合及细胞拮抗研究中是明显更为有效的。使用酵母系统测试了亲和力，所述亲和力从最初的人源化分子的343pM提高到43pM。使用HEK-Blue细胞系统测定的拮抗剂的效力提高了约10倍。
将h64-1.4 IgG重排为Fab以在眼部和其他适应症中使用。此外，进行另一轮的文库生成和基于酵母的筛选，以进一步提高亲和力。经过四轮筛选，存在具有A76V突变的VH变体的显著富集。包含A79V的抗体、变体及其片段称为019 IL-6a抗体、变体及其片段。
实施例3：形式的选择
为了研究基于抗体的IL-6拮抗剂的适合的形式，测试了如前文所述的选择出的IL-6抗体的瞬时表达、稳定性、聚集性、结合亲和力和IC50，其中所述抗体使用018序列的Fab、scFv(VH-VL)和scFv(VH-VL)形式。
候选IL-6a分子(包含018可变区的序列)其中之一的前述实验结果示于表1。
表1
这些数据展示了鉴定基于IL-6拮抗剂抗体的各种形式的关键特征的方法，并阐明了对于包含018可变区的IL-6拮抗剂而言，018Fab形式与scFv结构相比，在最多的关键类别(如表达、稳定性、聚集和结合亲和性)中具有最受欢迎的特征。018Fab的IC50落在用于治疗的合理的范围内。
实施例4：IL-6a抗体、片段和衍生物的例子
使用本发明所描述的方法，申请人已鉴定出下述序列。下划线的序列代表重链和轻链的CDRs。其它序列可在整个说明书中找到。
IgG1框架中的018重链(全长；fl018HC)多肽序列
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYALSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGVITPGSGTINYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRWDPLYYYALEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO:19)
IgG1框架中的018重链(全长；fl018HC)核酸序列
CAAGTGCAGCTGGTGCAGTCAGGGGCCGAGGTTAAGAAGCCAGGGAGCAGCGTCAAGGTATCTTGTAAAGCGTCTGGTTACGCCCTTTCAAACTACCTGATCGAATGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAAGGCCTGGAATGGATGGGAGTTATCACCCCTGGGAGCGGCACCATTAATTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGAGTGACGATTACCGCCGACGAGTCCACCAGTACTGCCTACATGGAGCTGTCCTCACTCCGCAGCGAGGACACGGCAGTTTACTACTGCGCCCGGAGTCGATGGGACCCTCTTTACTATTATGCTCTGGAATACTGGGGCCAGGGAACGACCGTTACAGTGTCATCTGCTAGCACAAAAGGACCATCAGTCTTCCCACTTGCTCCTTCATCTAAGAGCACAAGTGGTGGCACTGCAGCCCTTGGCTGCCTGGTGAAAGATTATTTCCCCGAACCTGTTACAGTTTCTTGGAACTCCGGTGCACTGACATCCGGAGTACACACTTTCCCAGCTGTGCTGCAGAGCTCAGGACTGTATAGCCTGTCTTCGGTGGTCACTGTTCCATCGTCGAGTCTTGGCACACAGACATATATTTGCAACGTCAATCACAAGCCCTCCAACACAAAAGTGGATAAGAAGGTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAGACCCATACGTGTCCTCCCTGTCCCGCCCCTGAACTGCTGGGAGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCACCTAAGCCAAAGGACACTCTGATGATCAGCCGGACTCCCGAGGTTACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCTCATGAAGACCCTGAGGTTAAGTTCAATTGGTACGTGGATGGCGTCGAGGTGCATAACGCAAAAACCAAGCCGAGAGAGGAGCAGTACaatAGCACCTATAGAGTAGTGAGCGTCCTGACTGTCTTACATCAGGATTGGCTCAATGGTAAAGAATATAAGTGCAAGGTAAGCAACAAGGCCCTACCCGCACCAATAGAGAAGACCATCTCCAAGGCGAAAGGTCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTTTATACACTGCCTCCCTCACGCGACGAATTAACAAAGAATCAGGTGTCTCTCACCTGTCTCGTCAAGGGCTTTTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAATCCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTATAAGACAACTCCCCCAGTCCTGGATTCAGATGGGTCGTTCTTTCTATATAGTAAGTTGACCGTGGATAAGTCTCGCTGGCAACAGGGGAACGTGTTCTCTTGCTCTGTTATGCATGAAGCGCTGCACAATCATTATACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGGAAG(SEQ ID NO：20)
IgG1框架中的018 Fab重链(018FabHC)多肽序列。CDRs以下划线标示
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYALSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGVITPGSGTINYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRWDPLYYYALEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(SEQID NO:1)
018全长轻链(fl018LC)多肽序列。CDRs以下划线标示
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGIPFMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSEEVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:2)
这也是020和029 IL-6拮抗剂的轻链
IgG1框架中的018全长轻链(018LC)核酸序列
GACATAGTGATGACTCAAAGTCCGGACAGCCTGGCGGTGTCACTCGGCGAACGGGCAACTATCAACTGCCGAGCCAGCGAGAGCGTCGATAATTACGGCATCCCCTTCATGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGACAGCCGCCCAAGCTGCTTATCTACGCCGCTTCCAACCGGGGATCAGGGGTGCCCGATCGATTTAGTGGAAGCGGTAGTGGGACCGATTTCACACTGACCATCAGCTCCCTTCAGGCCGAGGATGTGGCTGTCTATTATTGTCAGCAATCCGAGGAAGTGCCGCTCACGTTTGGTCAGGGAACCAAACTGGAGATCAAGCGGACCGTAGCGGCGCCTAGTGTCTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAACAGCTGAAGTCTGGCACTGCTTCCGTCGTGTGCCTGCTCAACAACTTTTACCCTAGAGAGGCAAAAGTTCAATGGAAAGTAGACAATGCCTTGCAGTCCGGGAACTCCCAGGAGTCTGTCACAGAGCAGGATAGTAAGGACTCAACCTACAGCCTGTCCAGCACACTGACCCTCTCCAAAGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCTTGCGAAGTTACGCATCAGGGGCTGTCCTCACCCGTTACAAAAAGTTTTAACAGAGGGGAGTGC(SEQ ID NO:26)
019 Fab重链(019FabHC，除A79V(粗体/斜体)外与018FabHC序列相同
019VH(可变区/019HC)
019抗体轻链(019LC)序列(多肽和核酸)与018LC相同
018HC的CDR1(VH CDR1 018)：GYALSNYLIE(SEQ ID NO：4)
018HC的CDR2(VH CDR2 018)：VITPGSGTIN(SEQ ID NO：5)
018HC的CDR3(VH CDR3 018)：SRWDPLYYYALEY(SEQ ID NO：6)
018LC的CDR1(VL CDR1)：RASESVDNYGIPFMN(SEQ ID NO：7)
018LC的CDR2(VL CDR2)：AASNRGS(SEQ ID NO：8)
018LC的CDR3(VL CDR3)：QQSEEVPLT(SEQ ID NO：9)
019HC的CDR1(VH CDR1 019)：GYALSNYLIE(SEQ ID NO：4)
019HC的CDR2(VH CDR2 019)：VITPGSGTIN(SEQ ID NO：5)
019HC的CDR3(VH CDR3 019)：SRWDPLYYYALEY(SEQ ID NO：6)
实施例5：表位和结构作图
表位作图
对所选择的候选IL-6拮抗剂进行功能表位作图。发现在ELISA中候选抗体(小鼠64抗体)没有减弱IL-6Rα对IL-6的结合，表明该候选抗体不结合位点I。额外进行的实验证明表明在ELISA中嵌合小鼠64抗体减弱IL-6/IL-6Rα复合物对gp130的结合，说明IL-6的位点II或位点III携带该抗体的结合位点。还发现小鼠64抗体不显著阻断已知的位点III结合抗体AH-65(Immunotech,Marseille,France)与IL-6的结合，说明该候选抗体结合IL-6的位点II。这些数据表明可产生针对位点II的抗体，以及证明了鉴定该抗体的方法。
为了进一步定义表位，在酵母中产生了IL-6的突变，其与4m5.3(Boder et al.,2000,Proc Natl Acad Sci USA 97,10701–10705；Chao et al.,2006,Nat Protoc 1,755–768)相融合。所表达的突变体是在人IL-6中具有下述单或双突变的突变体：R24E/D27E、R30E、Y31E、D34R、S118R/V121E、W157E、Q159E/T162P、K171E和R179E。所述表达的突变的IL-6分子被用于与018(Fab)的结合研究。观察到018(FAB)的R24E/K27E、Y31E、D34R和S118R/V121R亲和力的降低，其均位于IL-6的位点II中。因此，本发明所描述的发明包括抗体，其能够结合到人IL-6位置24、27、31、34、118和121中的至少一个，两个，三个，四个，五个或六个氨基酸，或能够结合IL-6中的等效位点。
位点II表位的结构定义
计算下列距离以在结构上定义位点II。该计算基于IL-6/IL-6α/gp130六聚体的晶体结构，PDB 1P9M(Boulanger et al.,2003,Science 300:2101-2104)。IL-6的螺旋1位于(runs)位点I和位点II之间，导致某些残基接近于位点II但具有指向位点I的侧链，如R30。D2和D3是指IL-6Rα的细胞外结构域。
下列IL-6的氨基酸被确定为落入gp130-D2-D3的以内：L19、R24、K27、Q28、R30、Y31、D34、E110、Q111、R113、A114、M117、S118、V121、Q124、F125和K128。
下列IL-6的氨基酸被确定为落入gp130-D2-D3的以内：L19、E23、R24I25、K27、Q28、I29、R30、Y31、D34、K41、Q102、E109、E110、Q111、A112、R113、A114、V115、Q116、M117、S118、K120、V121、L122、Q124、F125和K128。
因此，能够结合一个或多个IL-6中落入位点II或的氨基酸的分子，如抗体或其片段，可以是IL-6a。
提供下面的人IL-6序列作为参考(下划线所标示的序列是前导序列)。gp130-D2-D3的以内的氨基酸用斜体标记。氨基酸编号，如用于定义表位的突变，不含前导序列。
人IL-6
进行实验测试了h64-1.4人源化抗体的Fab片段，并证明该片段由于靶向位点II，从而能够阻断IL-6顺式和反式信号。可溶性IL-6受体(sIL-6R)的存在不改变Fab片段的效力。这与抗IL-6R IgG相反，其在sIL6R的存在下效力有所降低，且其仅阻断顺式信号。
这些实验证明靶向位点II的抗体或该抗体的片段，如Fab片段可用于抑制IL-6的顺式和反式信号。
实施例6：灵长类动物研究
由于非灵长类动物可以与灵长类动物的活力(activities)具有很大差异，因此一般使用非人灵长类动物进一步评价候选IL-6拮抗剂的PK和其他参数。
人IL-6与食蟹猴和猕猴IL-6有7个位点的不同，其中的一个位于位点(氨基酸28)II内且与非洲绿猴IL-6的位点II相同。这似乎只降低了含018序列的抗体约3-4倍的结合能力。结合到非人灵长类动物IL-6的能力是IL-6拮抗剂的一个有用的特征，其促进作为药物的候选物的开发，如通过使在非灵长类动物中的测试，如毒性测试成为可能。
如同大多数IL-6抗体一样，因为IL-6的低序列同源性，本发明所描述的抗IL-6抗体不与啮齿动物、兔或犬的IL-6发生交叉反应。然而，在亲和力研究中，发现018 Fab近似以人亲和力结合食蟹猴和非洲绿猴的IL-6(表2)。
表2：对各种物种的各种IL-6的单价亲和力(018 Fab)
物种 KD
人 200pM
非洲绿猴 280pM
食蟹猴 840pM
狗 >1μM
小鼠 >1μM
兔 >1μM
大鼠 >1μM
这些数据进一步证明了本发明所描述的IL-6a特异性结合的能力以及在适合的动物中形成具有允许检测(如毒理学和生殖研究)的特征的分子的能力。
实施例7：提高IL-6a的表达
为了提高018 Fab和019的Fab多肽的表达，利用本领域已知方法制备了向重链CH1/铰链区引入5个额外氨基酸(DKTHT(SEQ ID NO：30))的构建体。改变了的018Fab重链的序列示于下面的SEQ ID NO：24。改变的018序列在本发明中称为020且改变的019序列在本发明中称为021。020分子(020Fab重链和018Fab轻链)与具有018Fab重链和018Fab轻链的亲本Fab相比具有改善的表达。019分子与020分子相比未展现出显著的亲和力差异。020和019的表达分别增加了约2倍，亲和力未受改变的影响。
020重链(在羧基末端具有DKTHT(SEQ ID NO：30)的Fab))
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYALSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGVITPGSGTINYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRWDPLYYYALEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT(SEQ ID NO:24)
使用020Fab在HEK-BlueTMIL-6受体细胞(InvivoGen,San Diego,CA)中测量IL-6的拮抗作用。在含10pM IL-6和各种浓度的020或IL-6Rα抗体(Cell Sciences,Canton,MA)的混合液(含或不含50nM IL-6Rα)中孵育细胞，孵育20-24小时后，20μL细胞培养上清液与180μL QuantiBlueTM(InvivoGen)底物混合并孵育1小时；在655nm处测量吸光度。图3A和图3B显示了这些实验的数据，证明了在存在或缺乏IL-6R下，020抑制IL-6活性的能力。
实施例8：IgG2 IL-6抗体
使用本领域已知方法将018重构(reformat)入人IgG2同种型框架中以与IgG1形式的抗体相比减少FcγR的结合以及减少ADCC。另外，预期018重构为全长形式(如IgG2)由于分子的更大大小而降低从玻璃体中的清除率。
构建/纯化抗IL-6 IgG2抗体
为了使用如前文所述的抗-IL-6序列构建人IgG2抗体，从cDNA中PCR扩增出分别在N-和C-末端带有NheI和M1uI限制性位点的人IgG2恒定结构域。纯化PCR产物，用NheI和M1uI酶切消化，然后连接入pTT5载体中，所述载体包含抗IL6可变结构域，如SEQ ID NO：1(见上文)。这样得到全长的IgG2重链序列。含有包含018序列的全长轻链的质粒被用于提供轻链。
为了进一步减少FcRn的结合并因此减少IL-6a的再循环，在重链中进行了点突变。使用诱变(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)制造突变。使用聚(乙烯亚胺)(PEI)将重链和轻链质粒共转染到100mL HEK293-6E细胞的瞬时培养物中，并培养以允许进行约5天的表达。这种产生的抗体含有抗IL-6的位点II结合部分和IgG2结构。含有018CDRs的这种结构在本发明中称为018IgG2或029。在残基I253处制造点突变。
所述IgG2分子被很好地表达且在细胞学实验中以与020Fab相比略微改善的效力阻断IL-6。
029成熟序列(CDRs用下划线标示)
029重链
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYALSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGVITPGSGTINYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRWDPLYYYALEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:11)
029轻链
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGIPFMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSEEVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:12)
改变的FcRn结合
IL-6可以具有某些积极的系统性效应。因此改造IL-6使其在玻璃体中具有良好的滞留但具有有限的全身半衰期是有利的。减少或消除FcRn结合应当减少任何逃入循环的药物的系统性积累，从而提高IL-6a的安全性。
因此，由于FcRn介导的运输可能增加抗体从眼中流出，因此通过在Fc的残基I254、H311或H436引入突变(参见SEQ ID NO：23)编号根据Martin等,Molecular Cell,7:4,867-877(2001))，进一步修饰020 IgG2以消除FcRn的结合。突变的位点在SEQ ID NO：23中以粗体标明；I254突变为A或R；H311突变为A或E、H311突变为N且D313突变为T，以及H436突变为A(在前导序列后开始编号，所述前导序列在SEQ ID NO：23中以下划线标明。含有该序列的IL-6拮抗剂称为018IgG2m。
抗IL-6重链(IgG2)(常规字体：VH；斜体：CH)(无前导序列)显示突变位点(粗体)
抗IL-6重链(IgG2)(常规字体：VH；斜体：CH)有前导序列(下划线)显示突变位点(粗体)
因此，一些实施方案中包括具有重链序列的抗体，所述重链序列描述于SEQ IDNO：23中，并具有I254(如A或R)、H311(突变为A或E)、H436(突变为A)，或D313(突变为T)且H311突变为N的突变。
SEQ ID NO：25因此提供了一种序列，当在I133(如I133A或I133R)、H190(如H190A或H190E)、H315(H315A)，或D192和H190(如D192T和H190N)处发生突变时，该序列可用于抗体、片段或其衍生物以产生在低pH下(如pH5.5)或溶酶体pH下具有减弱Fc结合的多肽，和/或产生与亲本或其他不含该序列的参考分子相比具有减弱的全身半衰期的多肽。
抗IL-6轻链(IgG2)(常规字体：VH；斜体：CH)
实施例9：制剂稳定性
测试了抗IL-6/IgG1 Fab片段(包含IgG1CH1结构域)的稳定性，所述测试通过使用差示扫描荧光确定最初在PBS中的Tm，然后在一系列缓冲液和赋形剂中的Tm。发现柠檬酸盐缓冲液(pH5.5)将Tm提高到超过80℃。因此，在一些实施方案中，IL-6a提供于柠檬酸盐缓冲液中且在一些情况下具有至少80℃的Tm。
使用SEC-MALS测试了聚集程度且20mg/ml在磷酸盐缓冲液(PBS)中未观察到聚集。
实施例10：适合于增强PK的对pH敏感的抗体
IL-6可以具有某些积极的系统性效应。因此改造IL-6使其在玻璃体中具有良好的滞留但具有有限的全身半衰期是有利的。减少或消除与FcRn的结合能够减少任何逃入循环的药物在全身的积累，从而提高IL-6a的安全性。因此，由于FcRn介导的运输可能增加抗体从眼中流出，因此通过在Fc的残基I254、H311或H435引入突变(编号根据Martin等,Molecular Cell,7:4,867-877(2001))，以进一步修饰020 IgG2以减弱FcRn的结合。这种抗体在本发明中称为IL-6pH抗体或抗IL-6pH并在下面进一步描述。
具有pH敏感结合的抗体的产生
组氨酸的pKa为约6.0，且在结合界面上插入的组氨酸能够在低pH时在侧链质子化作用后破坏结合。使用如本发明中所述的抗IL-6位点II靶向抗体，从018中产生一个包含富含组氨酸的CDR变体的文库，且使用酵母展示从该文库中筛选pH敏感的结合。产生的文库是具有CDRs的组合文库，所述CDR是由简并密码子编码，使得每个残基是一个野生型残基(即，与亲本抗体相同)，或组氨酸残基。通过交替排序在生理pH(7.4)下高结合和在内涵体pH(5.5)下低结合进行筛选。
鉴定出了一个酵母-选择的突变体，其具有在pH7.4下相对高的结合(该突变体具有407pM的单价Kd相比亲本的192pM的Kd)和在pH5.5下相对低的结合(该突变体具有2.362nM的单价Kd相比亲本的195pM的Kd)。这构成在pH5.5下亲和力约5.8倍的变化。这种突变体包含在轻链CDR1处的多个组氨酸突变。因此，该突变体显示出在pH7.4下与亲本分子相似的结合能力，以及在pH5.5下亲和力的显著丧失。通过本领域已知的方法，使用ELISA、FACS和SPR分析验证了这一观察。
这些数据表明，可以创建基于抗体的IL-6a，其具有靶向IL-6的位点II的抗IL-6的特征，可用于抑制IL-6的顺式和反式活性，且具有与亲本抗体或其他具有野生型Fc结构域的抗体相比增加的PK，至少部分通过在pH5.5下改变的结合实现。
实施例11：局部IL-6阻断在小鼠激光脉络膜新血管形成(CNV)模型中的功效
为了确定局部IL-6阻断是否能有效治疗眼病，例如糖尿病黄斑水肿(DME)或湿性AMD，在用于脉络膜新血管形成的模型系统中局部施用单克隆抗IL-6抗体。在此实施例中利用如Saishin等人，Journal of Cellular Physiology,195:241-248(2003)描述的激光诱导的CNV模型。激光诱导的CNV模型再现了糖尿病黄斑水肿(DME)下的许多病理过程，包括炎症和血管新生。
通过玻璃体内(IVT)注射将单克隆抗小鼠IL-6抗体(MP5-20F3，其是购自Bio XCell，目录号BE0046的大鼠IgG1同种型抗体)施用于试验组。对照组接受VEGF抑制物(trap)的玻璃体内注射或抗-HRP同种型对照抗体(针对辣根过氧化物酶大鼠IgG1，克隆HRPN，购自BioXCell；目录号BE0088)的玻璃体内注射。对于所有抗体组，将1μL体积中的20μg蛋白质注射到试验眼中，而将对侧眼作为另外的对照不进行处理。
在激光后第7天麻醉小鼠，并用Griffonia Simplicifolia(GSA)凝集素染色脉络膜平底以测量病变面积。图4显示结果。与对照抗体处理组相比，抗IL-6抗体处理组显示出新生血管形成的统计学显著降低(p<0.05)。与抗VEGF阳性对照相比，平均来说抗IL-6抗体处理组也显示减少的新血管形成。
这些数据表明，通过IVT施用的IL-6a，例如单克隆抗IL-6抗体可以显著地降低小鼠CNV模型中的新血管形成。该结果进一步表明，与抗-VEGF抗体相比，抗IL-6抗体可以产生至少一样多且有可能更多的新血管形成减少。这些数据指示IL-6的局部抑制有用于治疗眼病，例如涉及血管渗漏的疾病，例如湿性AMD或黄斑水肿，例如糖尿病黄斑水肿。
实施例12：改进的IL-6抗体的开发
产生EBI-029抗体的变体。为了更好地表征突变A28V，S30P，I51T和S55G的贡献，将特定组合引入到野生型EBI-029Fab展示载体中并测量结合。结果显示在图5中。在与2μMIL-6过夜竞争后，与野生型EBI-029Fab相比，所有突变体具有显著更高的相对于展示保留在其细胞表面上的生物素化IL-6水平。结合从最高至最低亲和力的排列次序是A28V/S30P/I51T/S55G>A28V/I51T/S55G>S30P/I51T/S55G>I51T/S55G>wt。四重突变A28V/S30P/I51T/S55G在本文中也称为EBI-030。
EBI-030的序列显示如下。
030CDR序列
030HC的CDR1(VH CDR1 030):GYVLPNYLIE(SEQ ID NO:31)
030HC的CDR2(VH CDR2 030):VTTPGGGTIN(SEQ ID NO:32)
030HC的CDR3(VH CDR3 030):SRWDPLYYYALEY(SEQ ID NO:33)
030LC的CDR1(VL CDR1 030):RASESVDNYGIPFMN(SEQ ID NO:34)
030LC的CDR2(VL CDR2 030):AASNRGS(SEQ ID NO:35)
030LC的CDR3(VL CDR3 030):QQSEEVPLT(SEQ ID NO:36)
030重链可变区序列(相对于029的突变以粗体显示)：
030轻链可变区序列：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGIPFMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSEEVPLTFGQGTKLEIKRTV(SEQ ID NO:38)
030 Fab(IgG1)重链多肽序列(CDR加下划线，相对于029的突变显示为粗体)：
在实施方案中，SEQ ID NO：39的羧基端的DKTHT序列(SEQ ID NO：30)不包括在Fab序列中。
030 Fab重链核酸序列：
CAAGTGCAGCTGGTGCAGTCAGGGGCCGAGGTTAAGAAGCCAGGGAGCAGCGTCAAGGTATCTTGTAAAGCGTCTGGTTACGTCCTTCCAAACTACCTGATCGAATGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAAGGCCTGGAATGGATGGGAGTTACCACCCCTGGGGGCGGCACCATTAATTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGAGTGACGATTACCGCCGACGAGTCCACCAGTACTGCCTACATGGAGCTGTCCTCACTCCGCAGCGAGGACACGGCAGTTTACTACTGCGCCCGGAGTCGATGGGACCCTCTTTACTATTATGCTCTGGAATACTGGGGCCAGGGAACGACCGTTACAGTGTCATCTGCTAGCACAAAAGGACCATCAGTCTTCCCACTTGCTCCTTCATCTAAGAGCACAAGTGGTGGCACTGCAGCCCTTGGCTGCCTGGTGAAAGATTATTTCCCCGAACCTGTTACAGTTTCTTGGAACTCCGGTGCACTGACATCCGGAGTACACACTTTCCCAGCTGTGCTGCAGAGCTCAGGACTGTATAGCCTGTCTTCGGTGGTCACTGTTCCATCGTCGAGTCTTGGCACACAGACATATATTTGCAACGTCAATCACAAGCCCTCCAACACAAAAGTGGATAAGAAGGTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACACACACA(SEQ ID NO:40)
030也可以作为IgG2 Fab重链多肽序列产生：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYVLPNYLIEWVRQAPGQGLEWMGVTTPGGGTINYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRWDPLYYYALEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERK(SEQ IDNO:54)
实施例13：变体Fab片段的表达和纯化
通过用BamHI-HF/NheI-HF进行双重消化，从酵母展示载体产生含有以下突变体组合的VH域插入物：A28V/I51T/S55G，S30P/I51T/S55G和A28V/S30P/I51T/S55G(EBI-030)。插入物通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化，并连接到含有前导序列，人IgG1CH1结构域和C端His标签的pTT5衍生的哺乳动物表达载体中。在LB-Amp上选择转化体，小量制备，并通过测序证实插入物。对于与野生型EBI-029轻链(本文公开为SEQ ID NO：12)配对的每个突变型Fab重链，使用PEI作为转染试剂，在HEK-6E细胞(Canadian Research Council)中进行瞬时转染。也表达野生型EBI-029 Fab为对照(野生型Fab重链本文公开为SEQ ID NO：24)。5天后收获上清液，使用Ni-NTA琼脂糖(Life Technologies)通过亲和层析纯化表达的Fab。通过几轮浓度/稀释将纯化的蛋白质的缓冲液交换到PBS，pH 7.4中，并且通过吸光度280和SDS-PAGE测定蛋白质浓度和纯度。
实施例14：如使用表面等离子共振评价的变体抗体显示改善的结合
通过Reichert SR7000Dc光谱仪上的表面等离子共振(SPR)测量变体029Fab分子对IL-6的亲和力。通过标准胺偶联将10mM乙酸钠(pH 4.5)中的20μg/mL的人IL-6固定在500-kDa羧甲基葡聚糖芯片上。在25℃以25μL/min流速注入10mM HEPES，150mM NaCl，pH7.3中的每种Fab分子的连续稀释。4分钟后，停止加载，并通过流动的运行缓冲液(10mMHEPES，150mM NaCl，pH 7)测量解离5分钟。传感图迹线拟合于1:1结合模型很差，可能是由于芯片上IL-6的混合取向或非特异性抗体结合。相反，使用TraceDrawer软件将曲线拟合至2种类(低亲和力和高亲和力种类，在表3中标记为“低亲和力”和“高亲和力”)，其中ka1，kd1和KD1是低亲和力种类的缔合速率，解离速率，和平衡结合常数，并且ka2，kd2和KD2是高亲和力种类的缔合速率，解离速率和平衡结合常数。与wt EBI-029 Fab相比，所有突变体Fab具有显著较慢的解离，其中从最高至最低亲和力的排列顺序如下-A28V/S30P/I51T/S55G(EBI-030)>S30P/I51T/S55G>A28V/I51T/S55G>WT(EBI-029)。
表3：突变体抗体的SPR结果
实施例15：变体抗体在HEK-BlueTM IL6报告细胞中显示出改善的拮抗效力
HEK-BlueTM IL6报告细胞系(Invivogen)用于比较不同突变体EBI-029Fab片段之间IL6信号传递抑制的效力。HEK-BlueTM IL6细胞是稳定表达IL-6R基因的修饰的HEK-293系，并含有处于与四个STAT3结合位点融合的IFNβ最小启动子的控制下的分泌碱性磷酸酶报告基因。为了测定IL6拮抗作用，将10μL 400pM的人IL-6(R&D Systems 206-IL-010/CF)与10μL浓度范围内的每种Fab变体在96孔板中混合，并在室温下温育30分钟。将对数期的HEK-BlueTM IL6细胞进行胰蛋白酶消化，并以280,000个细胞/mL重悬于测定培养基(DMEM，4.5g/l葡萄糖，10％热灭活FBS，2mM L-谷氨酰胺，Pen-Step)中。将180μL细胞悬浮液加入到IL-6/Fab混合物的每个孔中，使最终的IL-6浓度达到20pM。将细胞在37℃/5％CO2下孵育20小时。然后将来自每孔的20μL上清液与180μL的Quanti-BlueTM试剂(Invivogen)混合，并在37℃下温育40分钟，之后在SpectraMax M5读板仪上测量650nM的吸光度。减去来自没有IL-6的孔的背景信号，然后除以用无抑制剂的IL-6处理的细胞以取得信号传递分数值。与wtEBI-029Pab相比，所有突变体显示出显著更高的效力，其中拮抗效力排列顺序如下：A28V/S30P/I51T/S55G(EBI-030)>A28V/I51T/S55G>S30P/I51T/S55G>WT(EBI-029)。这些结果显示于图6中。
实施例16：变体抗体在T1165增殖测定中显示出改善的拮抗效力
T1165.85.2.1细胞(R&D Systems)是响应于小鼠，大鼠或人IL-6而增殖的鼠浆细胞瘤细胞系。为了测定来自EBI-029Fab突变体的拮抗作用，在96孔板中将25μL的2ng/mL人IL-6(R&D Systems 206-IL-010/CF)与25μL在浓度范围内的每种Fab变体混合并在室温下培养30分钟。将对数期的T1165细胞沉淀并以2x105个细胞/mL重悬于测定培养基(90％RPMI1640,10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，Pen-Strep)中。将50μL细胞悬浮液加入到IL-6/Fab混合物的每个孔中，使最终的IL-6浓度达到0.5ng/mL。将细胞在37℃/5％CO 2下孵育72小时。将100μLCell-试剂(Promega)加入每个孔中并在室温下孵育10分钟。在SpectraMax M5读板仪上测量发光。所有突变体与wt EBI-029 Fab相比显示出显著更高的效力，其中在测试的Fab浓度范围内没有可测量的IL-6信号传递(参见图7)。
实施例17：变体抗体的药物样性质(Drug like property)比较
通过差示扫描荧光测定法(DSF)测定每个Fab变体的热稳定性。在BioRad 96孔PCR板中将2μL的2.5或5mg/mL的蛋白质与18μL PBS和2μL50x Sypro Orange混合。该板在BioRad CFX96RT-PCR系统中运行，其中线性温度从25℃增加至95℃，并随时间测量荧光。将Tm计算为熔化曲线的一阶导数的最低点。所有变体具有76和78℃之间的测量Tm值，与wtEBI-029Fab的76℃的测量Tm一致。
为了测量聚集，通过SEC-MALS使用Agilent 1260HPLC与Wyatt miniDawn TREOS光散射仪器和Wyatt Optilab rEX折射仪的组合评估样品。注射20-100μg蛋白质并以1mL/min的流速运行。如通过光散射测量的，所有变体的分子量在45000和52000Da之间，与野生型EBI-029 Fab一致。
这些结果指示，与EBI-029相比，EBI-030在其药物样性质方面表现相似地良好。
实施例18：产生全长EBI-029和EBI-030 IgG2抗体，以及具有突变Fc域的IgG2抗体
将EBI-029和EBI-030重构(reformat)为IgG2和突变体Fc IgG2
使用引入N端EcoRI位点和C-端NheI位点的引物，从Fab载体PCR扩增包含前导序列(MDWTWRILFLVAAATGAHS；SEQ ID NO：49)的EBI-029和EBI-030的重链可变域。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上纯化，并用EcoRI-HF和NheI-HF双重消化。含有野生型IgG2重链序列的或具有H311A突变(H311对应于SEQ ID NO：41中的编号；这对应于Martin等人，Molecular Cell,7:4,867-877(2001)中提供的编号中的H310)的变体IgG2结构域的基于pTT5的骨架的载体相似地用EcoRI-FH/NheI-HF消化，并在1％琼脂糖凝胶上纯化。使用Quikligase酶(NewEngland Biolabs)将插入物连接到消化的骨架中，在TOP10细胞(Life Technologies)中转化，并在LB-Amp上选择。将克隆进行小量制备并测序以确认插入物。选择H311A突变以降低Fc对FcRn的结合亲和力，以便减少从眼组织逃逸的分子的系统积累。
通过瞬时转染表达和纯化IgG2变体
通过瞬时转染在HEK-6E细胞中表达EBI-029 IgG2，EBI-029 IgG2-H311A，EBI-030IgG2和EBI-030 IgG2-H311A。使用PEI作为转染试剂，将含有各重链的pTT5载体与EBI-029LC质粒共转染。5天后收获上清液，通过亲和层析用蛋白A琼脂糖纯化表达的IgG2分子。通过几轮浓度/稀释将纯化的蛋白质的缓冲液交换到PBS，pH 7.4中，通过吸光度280和SDS-PAGE测定蛋白质浓度和纯度。
CHO稳定池生产
根据制造商的说明书使用Freedom CHO-S试剂盒(Life Technologies)生成产生EBI-029 IgG2，EBI-030 IgG2或EBI-030 IgG2-H311A的稳定CHO池。简而言之，通过标准消化/连接将与EBI-029LC组合的每个重链克隆到pCHO 1.0载体中。使用Freestyle MAX试剂将构建体转染到CHO-S细胞中，并使用增加浓度的嘌呤霉素和MTX选择稳定池。经过两轮选择后，通过分析蛋白A层析针对抗体产生筛选池，并选择最高生产者用于按比例放大和亚克隆。
序列显示如下。
030重链多肽序列(在IgG2框架中，CDR加下划线)：
030轻链多肽序列(在IgG2框架中,CDR加下划线):
030重链核酸序列：
CAAGTGCAGCTGGTGCAGTCAGGGGCCGAGGTTAAGAAGCCAGGGAGCAGCGTCAAGGTATCTTGTAAAGCGTCTGGTTACGTCCTTCCAAACTACCTGATCGAATGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAAGGCCTGGAATGGATGGGAGTTACCACCCCTGGGGGCGGCACCATTAATTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGAGTGACGATTACCGCCGACGAGTCCACCAGTACTGCCTACATGGAGCTGTCCTCACTCCGCAGCGAGGACACGGCAGTTTACTACTGCGCCCGGAGTCGATGGGACCCTCTTTACTATTATGCTCTGGAATACTGGGGCCAGGGAACGACCGTTACAGTGTCATCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA SEQ ID NO:43
030轻链核酸序列：
GACATAGTGATGACTCAAAGTCCGGACAGCCTGGCGGTGTCACTCGGCGAACGGGCAACTATCAACTGCCGAGCCAGCGAGAGCGTCGATAATTACGGCATCCCCTTCATGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGACAGCCGCCCAAGCTGCTTATCTACGCCGCTTCCAACCGGGGATCAGGGGTGCCCGATCGATTTAGTGGAAGCGGTAGTGGGACCGATTTCACACTGACCATCAGCTCCCTTCAGGCCGAGGATGTGGCTGTCTATTATTGTCAGCAATCCGAGGAAGTGCCGCTCACGTTTGGTCAGGGAACCAAACTGGAGATCAAGCGGACCGTAGCGGCGCCTAGTGTCTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAACAGCTGAAGTCTGGCACTGCTTCCGTCGTGTGCCTGCTCAACAACTTTTACCCTAGAGAGGCAAAAGTTCAATGGAAAGTAGACAATGCCTTGCAGTCCGGGAACTCCCAGGAGTCTGTCACAGAGCAGGATAGTAAGGACTCAACCTACAGCCTGTCCAGCACACTGACCCTCTCCAAAGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCTTGCGAAGTTACGCATCAGGGGCTGTCCTCACCCGTTACAAAAAGTTTTAACAGAGGGGAGTGCSEQ ID NO:44
具有H311A突变的030重链多肽序列(311A为粗体，CDR加下划线)，本文也称为031重链多肽序列：
031重链核酸序列：
CAAGTGCAGCTGGTGCAGTCAGGGGCCGAGGTTAAGAAGCCAGGGAGCAGCGTCAAGGTATCTTGTAAAGCGTCTGGTTACGTCCTTCCAAACTACCTGATCGAATGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAAGGCCTGGAATGGATGGGAGTTACCACCCCTGGGGGCGGCACCATTAATTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGAGTGACGATTACCGCCGACGAGTCCACCAGTACTGCCTACATGGAGCTGTCCTCACTCCGCAGCGAGGACACGGCAGTTTACTACTGCGCCCGGAGTCGATGGGACCCTCTTTACTATTATGCTCTGGAATACTGGGGCCAGGGAACGACCGTTACAGTGTCATCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCGTGGCCCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO:48)
实施例19：在HEK-Blue-IL6测定中EBI-030与EBI-029 IgG2效力的比较
使用HEK-BlueTM IL6报告细胞系(Invivogen)比较在EBI-029与EBI-030 IgG2抗体之间的IL6信号传递抑制的效力。比较了从HEK-6E细胞纯化的三种蛋白质制剂-EBI-029IgG2，EBI-030 IgG2和EBI-030 IgG2-H311A(也称为031或EBI-031)，连同在稳定的CHO池中产生的EBI-030 IgG2制剂。另外，也包括批准的抗IL6R抗体托珠单抗作为对照。为了测量IL6拮抗作用，将400pM的人IL-6(R&D系统206-IL-010/CF)与不同浓度的各抗体在96孔板中混合，并在室温下孵育30分钟。将对数期的HEK-Blue TM IL6细胞进行胰蛋白酶消化，并以280,000个细胞/mL重悬于测定培养基(DMEM，4.5g/l葡萄糖，10％热灭活FBS，2mM L-谷氨酰胺，Pen-Step)中。将180μL细胞悬液加入到IL-6/Fab混合物的每个孔中，使最终的IL-6浓度达到20pM。将细胞在37℃/5％CO2下孵育20小时。然后将来自每个孔的20μL的上清液与180μL的Quanti-BlueTM试剂(Invivogen)混合，并在37℃下温育40分钟，然后在SpectraMax M5读板仪上测量在650nM的吸光度。
结果显示于图8和表5中。与EBI-029相比，EBI-030(包括在HEK细胞中产生的具有或不具有H311A突变的EBI-030和在CHO细胞中产生的EBI-030)显示了显著改善的效力(IC50降低约50倍且IC90降低>100倍)。效力的增加大于通过SPR测量的亲和力的增加。
表5：IC50和IC90值
EBI-031(在本文中也称为EBI-030 IgG2-H311A)具有比EBI-029的IC50小75倍的IC50，和比EBI-029的IC90小约350倍的IC90。在HEK细胞中产生的EBI-030具有比EBI-029的IC50小50倍的IC50，和比EBI-029的IC90小约4000倍的IC90。
实施例20：增加的效力对玻璃体IL-6阻断持续时间的的建模分析
使用药物动力学模型模拟在玻璃体内施用后增加的效力对IL-6阻断的程度和持续时间的的影响(图9)。描述游离抗体(A)，游离IL-6(IL)和抗体/IL-6复合物(AIL)的变化的微分方程定义如下：
d/dt(A)＝-A*kae–A*IL*k1+AIL*k2
d/dt(IL)＝kpi–IL*kie–A*IL*k1+AIL*k2
d/dt(AIL)＝-AIL*kaie+A*IL*k1–AIL*k2
其中kae是游离抗体从玻璃体的清除速率，k1是抗体/IL-6结合的缔合速率，k2是抗体/IL6复合物的解离速率，kpi是IL-6产生的速率，kei是游离IL-6从玻璃体的清除速率，并且kaie是抗体/IL-6复合物从玻璃体的清除速率。启始参数值和速率如表6所示限定。
表6：起始参数值和速率
基于50μL剂量的50mg/mL抗体至具有5mL玻璃体体积的人眼的假设计算A0。基于～200pg/mL的DME患者中的玻璃体内IL-6的临床测量值估算IL0。k1基于1E5 M-1s-1的典型抗体缔合速率估算，而改变k2以模拟范围从100pM至1pM的效力值。Kae源自～11天的在兔中测量的玻璃体清除半衰期，如先前对人PK测量的缩放1.8。以24小时的清除半衰期间估算kie，且kpi计算为IL0*kie。
使用Berkeley Madonna软件在300天的时间过程中进行游离抗体和游离IL-6的模拟(图10)。选择95％IL-6阻断的截断来测量抑制的持续时间。该模型预测，增加的抗体效力显著地延长眼中IL-6抑制的持续时间，从k2/k1＝100pM的130天延长至k2/k1＝10pM的200天，至k2/k1＝1pM的225天。
实施例21：IL-6a的药代动力学
在PharmOptima(Portage，MI)的雄性新西兰白兔中进行药代动力学(PK)实验。所有动物是12-13个月龄，且体重为2.61-3.42公斤。比较以下蛋白质：EBI-029-IgG2(SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：12)，EBI-029-IgG2-H311A(SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12)，EBI-030(SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42)，EBI-030-IgG2-H311A(SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：42)，EBI-029Fab(SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：12)，(VEGF抑制剂)和托珠单抗(TCZ；抗IL6R抗体)。所有蛋白质在pH 7.4的PBS中以13.8mg/mL配制。EBI-029-IgG2，EBI-029-IgG2-H311A，EBI-030，EBI-030-IgG2-H311A，EBI-029Fab和托珠单抗在兔中不结合其靶抗原，而确实结合兔VEGF。
对于玻璃体内PK的研究，用50μL的检品注射9只动物的每只眼睛。在注射前，将盐酸利多卡因(可注射2％)，0.5％丙美卡因(Proparacaine)或0.5％丁卡因(Tetracaine)施用于眼表面。通过眼睛的背斜象限插入BD 300μL胰岛素注射器(31G×5/16英寸针头)以进行中部玻璃体的注射。对于系统性PK的研究，3只动物通过耳静脉注射100μL检品。
在0.083、1、4、8、24、72、168、240和336小时从IVT和iv组的3只动物收集连续血液样品，并用柠檬酸-磷酸-葡萄糖溶液1:1稀释并置于冰上。通过在4℃下以4000rpm离心冷冻血液样品10分钟收集血浆，并在-80℃下冷冻储存。
在给药后0.25、24、168和336小时，从IVT组的所有动物的两只眼睛中收获眼组织。动物通过静脉注射过量巴比妥盐安乐死。为了收获房水，在安乐死之后，立即将具有针头的注射器插入角膜下方，并且缓慢抽出房水。将房水转移到预先标记的管中并置于干冰上或在-80℃冷冻。为了收获玻璃体液，使用解剖刀将小切片引入到去核眼的巩膜中，并通过注射器经开口取出玻璃体。通过注射器上的刻度测量样品，将其转移到预先标记的管中，并置于干冰上或在-80℃下冷冻。
为了收获视网膜和脉络膜，在被摘出眼睛的巩膜中用解剖刀引入小切片，与角膜缘平行并在其尾部。将剪刀用于继续在眼球周围开口，将其分成两半。放置后眼球使内部朝上。使用鳃刀，从眼球小心收集视网膜。一旦从眼球收集视网膜，以类似的方式从剩下的眼球收集脉络膜。将两种样品分别转移到预称重和预先标记的管中，称重，并置于干冰上或在-80℃下冷冻。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中将视网膜和脉络膜组织稀释10倍，匀浆，并储存在-80℃。
通过ELISA评估每个组织中的蛋白质浓度。对于EBI-029-IgG2，EBI-029-IgG2-H311A，EBI-030，EBI-030-IgG2-H311A和EBI-029Bab，用在PBS中的1μg/mL人IL-6在室温下包被Costar半容量板1小时。孔用含有2％BSA的PBS封闭，洗涤，然后与使用PBS+5％兔血浆+0.05％吐温-20作为稀释剂稀释的每种样品的系列稀释物进行温育。每个平板上还包括使用纯化蛋白质获得的标准曲线。将样品在室温下孵育60分钟，然后用300μL含有0.05％土温-20的PBS洗涤三次。然后在每个孔中加入在PBS，1％BSA，0.05％土温-20中以1:10,000稀释的抗Kappa-HRP(Genway Inc.)并孵育30分钟。孔如上清洗，然后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物，并在Spectramax读板仪上在450和550nm测量信号。使用Softmax Pro 6软件，基于标准曲线计算蛋白质浓度。每个ELISA在至少3个独立平板上重复并报告平均半衰期。
对于托珠单抗，除了使用抗托珠单抗Fab(BioRad HCA252)作为捕获试剂，并使用抗人IgG-Fc-HRP(Sigma A0170)作为检测抗体之外，如上所述通过ELISA测定蛋白质浓度。使用两种不同的ELISA测定来测量游离和总的对于游离的用重组VEGF(R&D系统)包被孔，并用抗人IgG-Fc-HRP(Sigma A0170)检测结合的蛋白质。对于测量总将抗人Fc抗体(Sigma I2136)用于捕获，并将抗人IgG-CH2-HRP(BioRad MCA647P)用于检测。每种ELISA在至少3个独立平板上重复，并报告平均半衰期。
结果概述
在大多数动物中，在240和336小时的时间点观察到针对注射的蛋白质的稳健的抗体形成。因为这种抗体形成可以影响蛋白质清除或干扰ELISA，所以将数据分析限制到直到168小时的时间点并包括168小时。对于玻璃体内的PK，与(T1/2＝6.3天)，托珠单抗(T1/2＝4.8天)或EBI-029 Fab片段(T1/2＝3.9天)相比，所有EBI-029和EBI-030 IgG2蛋白的清除显著更慢(EB/029，EBI-029-H311A，EBI-030，和EBI-030-H311A分别为T1/2＝9.3,9.0,15.7,和9.8天)(图11，表7)。在视网膜，脉络膜和房水中观察到相似的趋势，其中与和托珠单抗相比，EBI-030和EBI-030-H311A以更高的水平积累(参见图12和图13)。在IVT施用后，所有蛋白质可在血浆中检测到，其中EBI-029，EBI-030和托珠单抗以比或EBI-030-H311A显著更高的水平积累(参见图14)。类似地，在IV施用后，和EBI-030-H311A从血浆中更快地清除，其中由于FcRn结合减少，EBI-030-H311A半衰期约为野生型IgG2的一半(表7)。
表7：药代动力学结果
实施例22：EBI-031在高浓度下的溶解度
使用Amicon Ultra-15自旋浓缩器将纯化的EBI-031在PBS中从3mg/mL浓缩至142mg/mL。通过在与Wyatt miniDawn TREOS光散射仪和Wyatt Optilab rEX折射率仪组合的Tosoh G3000SWXL 7.8x30SEC柱上运行，来评估浓缩前和浓缩后的浓度。注射20μg蛋白质，并以1mL/min的流速在PBS中运行。在预期的～150kDa的分子量下的峰的质量分数大约等于两个浓度(3mg/mL为90.9％，142mg/mL制剂为91.3％)，表明浓缩期间蛋白质聚集没有显著增加。这些结果证明EBI-031可以浓缩至高达142mg/mL，同时几乎没有可测量的聚集(<10％聚集)。
实施例23：EBI-031阻断顺式和反式IL6信号
使用HEK-BlueTM IL6报告细胞系(Invivogen)以比较EBI-031和托珠单抗用于阻断顺式和反式IL6信号传递的效力。对于顺式信号传递，在96孔板中将游离IL-6(终浓度＝20pM)与一系列浓度的EBI-031或托珠单抗混合，并在室温下孵育30分钟。胰蛋白酶消化对数期的HEK-BlueTM IL6细胞，并重悬于测定培养基(DMEM，4.5g/l葡萄糖，10％热灭活FBS，2mM L-谷氨酰胺，Pen-Step)中，并将50,000个细胞加入每个孔中，最终体积为200μL。将平板在37℃/5％CO2下孵育20小时。然后将来自每孔的50μL上清液与150μL Quanti-BlueTM试剂(Invivogen)混合，并在37℃下温育40分钟，然后在SpectraMax M5读板仪上测量650nM处的吸光度。减去来自没有IL-6的孔的背景信号，并且然后除以用IL-6而没有用抑制剂处理的细胞以得到信号传递分数值。相比于托珠单抗(IC50＝12.9nM)，EBI-031(IC50＝14.2pM)以>900倍更大的效力阻断游离IL-6(图16A)。
为了测量反式信号传递阻断，除了使用最终浓度为200pM的超IL-6代替游离IL-6之外，如上所述进行实验。超IL-6是IL-6和可溶性IL-6受体之间的基因融合物(Fischer等人，Nature Biotechnology15：142-145(1997)。EBI-031有效阻断了超IL-6(IC50＝32pM)，而托珠单抗不能显著地抑制至1μM浓度的信号传递(图16B)。
这些结果显示EBI-031在位点II或接触gp130的位点以pM亲和力结合人IL-6位点，并在细胞测定中以比托珠单抗>900倍更多的效力阻断IL-6和IL-6/sIL-6Rα复合物的信号传递。
实施例24：玻璃体内EBI-031抑制IL-6信号传递的计算模拟
如实施例20所述进行计算模拟，以预测在人中的玻璃体内施用EBI-031应当抑制95％IL-6信号传递的时间长度。k2设定为0.12d-1，使得在效力测定中测得的k2/k1＝14pM。基于在兔子中测量的玻璃体内清除半衰期对于人缩放1.8，将T1/2清除设定为18天。所有其他参数在表6中描述。该模型预测EBI-031应该在玻璃体内施用后持续～150天阻断95％的IL-6信号传递(图17)。这些建模结果表明，EBI-031可以在长时间内(例如高达约6个月)基本上阻断眼睛中的IL-6信号传递。
实施例25：EBI-031亚型的表征
EBI-031是IgG2抗体。如前所述，IgG2抗体存在三种不同的结构亚型，IgG2-A，IgG2-B和IgG2-A/B亚型(图18)。在该实施例中，进行实验以鉴定EBI-031样品中的结构亚型。
RP-HPLC分析
将反相高效液相层析(RP-HPLC)用于分辨EBI-031的各种结构亚型。优化以前已经使用的用于分辨IgG2二硫化物介导的结构亚型的增强的分析型RP-HPLC方法(参见Dillon等人，Journal of Chromatography A，2006,1120：112-120)用于分辨EBI-031。
将包含约30μg的EBI-031样品加载到Zorbax 300SB-C8柱(150mm×2.1mm,5.0μM,)上。柱温度设定在75℃。流动相A为含有0.1％TFA的水，并且流动相B为55％IPA，40％ACN，4.9％水和0.1％TFA。流速为0.5mL/min。该柱首先用90％流动相A和10％流动相B平衡2分钟，随后是10至25％B的2分钟不连续梯度。用超过21分钟的25-32％B的线性梯度实现洗脱。在214nm和/或280nm处监测UV吸光度。
为了确定分辨率是否与二硫化物有关，在室温下用5mM DTT和10mM半胱氨酸处理样品2分钟，并且然后用RP-HPLC方法分析(图19)。用有效的还原剂，DTT处理导致IgG2抗体的减少，导致洗脱成早期峰(峰0和峰1)(图19中间图)。使用与DTT相比较温和的还原剂，半胱氨酸处理也将亚型分布转移到早期峰(峰0和峰1)，尽管没有达到用DTT处理的样品所见的程度(图19，底图)。
数据证明，RP-HPLC方法可以分辨具有不同二硫键连接性的结构亚型。通过非还原肽定位和质谱分析证实了不同的二硫键结构：早期洗脱峰(峰1)含有IgG2-A/B亚型，并且晚期洗脱峰(峰2)含有IgG2-A亚型。重要的是，在EBI-031样品中没有检测到IgG2-B亚型B(峰0)(图19，上图)。
不同EBI-031样品的比较
使用上述RP-HPLC分析，分析从不同EBI-031表达细胞系收集的EBI-031样品，以比较产生的抗体的亚型分布。从克隆细胞系的200L规模培养物，来自亲本细胞系的10L规模培养物和稳定转染的细胞池中收集EBI-031样品。使用三步层析法从克隆和亲本EBI-031表达细胞系纯化EBI-031。使用蛋白A纯化从稳定转染的细胞池纯化EBI-031。通过上述方法分析样品。
图20中所示的结果显示，所有三种EBI-031样品都含有亚型IgG2-A和IgG2-A/B，但没有显著量的IgG2-B。该数据证明，无论是从克隆的EBI-031表达细胞系，亲本EBI-031表达细胞系，或是从稳定表达EBI-031的异质细胞群体产生，EBI-031 IgG2抗体以比其他IgG2抗体更少的异质混合物产生。图21显示来自克隆EBI-031表达细胞系的200L规模培养物的EBI-031样品的亚型分布，例如图20的上图。还测量了曲线下面积的区域，并且亚型之间的分布如图下的表所示。
实施例26：灵长类动物研究中的药代动力学
在灵长类动物研究中研究了EBI-031的药代动力学。测试了两只雄性非洲绿猴。将50μl 50mg/mL的EBI-031经玻璃体内注射到眼中。Madonna软件用于曲线拟合。
使用曲线拟合对来自灵长类动物研究的数据建模。描述玻璃体中的抗体(A)和玻璃体外的抗体(例如系统性(Ap))变化的微分方程定义如下：
d/dt(A)＝-A*kae
d/dt(Ap)＝A*kae(Dil)–Ap*kape
起始参数值和速率如下表所示定义：
表8：起始参数值和速率
参数 值
Dil-稀释 100
kae-玻璃体消除速率 0.2
kape-系统消除速率 1.4
初始A-玻璃体中的初始抗体 1000000
初始Ap-玻璃体外的初始抗体 0
包括的用于拟合的其他考虑因素包括：浮动稀释度和两种速率常数以用于拟合。将初始A保持恒定(在5mL眼中为2x 50ml的50mg/mL)。如图22A，22B和23中所示的建模结果显示玻璃体消除率常数对于两只猴子分别产生4.6和5.7天得半衰期。平均玻璃体消除速率常数计算为5.2天。系统消除建模为1.1天，和0.63天(平均0.85天)。这些结果证明在灵长类动物中，EBI-031在玻璃体中的半衰期明显长于系统半衰期。
实施例27：EBI-031的药代动力学
进行另一项药代动力学(PK)实验，其中将50μl的20mg/mL EBI-031溶液经玻璃体内注射到兔子眼中。检查的时间点为1,3,7和14天(例如，24,72,168和336小时)。对每个时间点分析两只动物(四只眼睛)。如实施例21所述进行施用EBI-031制剂，收获眼组织和测定蛋白质浓度的方法。
结果显示于图24A-24I中。当分析第1-14天玻璃体液中的蛋白质浓度时，EBI-031的半衰期测定为8.95天(图24A)。然而，在第14天检测到强的抗体应答，其可以影响这些结果。当分析第1-7天玻璃体液中的蛋白质浓度时，EBI-031的半衰期测定为18.88天。
玻璃体内注射后在眼睛其他部位也检测到EBI-031。EBI-031还渗透到房水(图24B)，脉络膜(图24C)，结膜(图24D)，角膜(图24E)，睫状体(图24F)，晶状体(图24G)，视网膜(图24H)和巩膜(图24I)中。这些组织中的药物浓度比玻璃体中检测到的浓度低一到两个数量级。
其他实施方案在以下权利要求的范围内。

Claims (52)

1.抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区包含
(i)VH CDR1，其包含GYX1LX2NYLIE的序列(SEQ ID NO：45)，
(ii)VH CDR2，其包含VX3TPGX4GTIN的序列(SEQ ID NO：46)和
(ii)VH CDR3，
其中以下的一个或多个是真实的：X1不是A，X2不是S，X3不是I，和X4不是S。
2.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中X1是V或V的保守取代，X2是P或P的保守取代，X3是T或T的保守取代，X4是G或G的保守取代。
3.权利要求1或2的抗体或抗原结合片段，其中与包含其中X1是A，X2是S，X3是I并且X4是S的重链可变区序列而其他方面相同的抗体或抗原结合片段相比，所述抗体或抗原结合片段具有对人IL-6增加的亲和力和/或增加的效力。
4.分离的抗体或其抗原结合片段，其包含(i)含有SEQ ID NO：31的序列的VH CDR1，含有SEQ ID NO：32的序列的VH CDR2和含有SEQ ID NO：33的序列的VH CDR3。
5.权利要求4的抗体或抗原结合片段，其中与包含含有SEQ ID NO：4的序列的VH CDR1，含有SEQ ID NO：5的序列的VH CDR2，和含有SEQ ID NO：6的序列的VH CDR3的抗体或抗原结合片段相比，所述抗体或抗原结合片段具有增加的对人IL-6的亲和力和/或增加的效力。
6.前述权利要求中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含(i)包含SEQ ID NO：37的重链可变区序列，或(ii)与SEQ ID NO：37至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的重链可变区序列。
7.前述权利要求中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含(i)SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：54，或(ii)与SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：54至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列。
8.前述权利要求中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含(i)包含SEQ ID NO：41的重链可变区序列，或(ii)与SEQ ID NO：41至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的重链可变区序列。
9.分离的抗体或抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：37至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的重链可变区序列，其中所述重链序列包含选自V28，P30，T51和G55(编号根据SEQ ID NO：41)的一个或多个(例如，1、2、3或4个)氨基酸。
10.分离的抗体或抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：54至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列，其中所述序列包含选自V28、P30、T51和G55(编号根据SEQ ID NO：41)的一个或多个(例如，1、2、3或4个)氨基酸。
11.分离的抗体或抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：41至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的重链序列，其中所述重链序列包含选自V28，P30，T51和G55(编号根据SEQ ID NO：41)的一个或多个(例如，1、2、3或4个)氨基酸。
12.权利要求9至11中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中相对于除了其不包含所述一个或多个氨基酸，而替代地包含选自A28、S30、I51和S55的一个或多个(例如，1、2、3或4个)氨基酸在其他方面相同的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段具有增加的对人IL-6的亲和力和/或增加的效力。
13.权利要求9至11中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中与除了其包含A28，S30，I51和S55在其他方面相同的抗体或抗原结合片段相比，所述包含V28、P30、T51和G55的抗体或抗原结合片段显示对人IL-6改善的亲和力和/或改善的效力。
14.前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段进一步包含含有SEQ ID NO：34的序列的VL CDR1，含有SEQ ID NO：35的序列的VL CDR2，和含有SEQ ID NO：36的序列的VL CDR3。
15.前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段进一步包含(i)包含SEQ ID NO：38的轻链可变区序列或(ii)与SEQ ID NO：38至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的轻链可变区序列。
16.前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段进一步包含(i)包含SEQ ID NO：42的轻链序列或(ii)与SEQ ID NO：42至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的轻链序列。
17.权利要求3、5、12或13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述亲和力增加至少1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3或4倍。
18.权利要求17的抗体或抗原结合片段，其中使用表面等离振子共振(SPR)或流式细胞术评估所述亲和力。
19.权利要求3、5、12或13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中如通过以下指明所述效力增加
(i)IC50的降低，任选地其中所述IC50降低至少5、10、20、30、40或50倍和/或
(ii)IC90的降低，任选地其中所述IC90降低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500倍。
20.权利要求3、5或13中任一项的抗体或抗原结合片段，其中使用HEK-BlueTM测定法或T1165增殖测定法评估所述效力。
21.分离的抗体或抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：37的重链可变区和含有SEQID NO：38的轻链可变区。
22.分离的抗体或抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：41的重链序列和含有SEQ IDNO：42的轻链序列。
23.分离的Fab，其包含含有SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：54的重链序列和含有SEQ IDNO：42的轻链序列。
24.前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段具有
(i)如在HEK-BlueTM测定法中用20pM IL-6评价的小于47pM的IC50(例如，小于40、30、20、10、5、4、3、2、或1pM的IC50)，
和/或
(ii)如在HEK-BlueTM测定法中用20pM IL-6评价的小于4350pM的IC90(例如，小于4000、2000、1000、100、50、40、30、20、15、10、或5pM的IC90)。
25.前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中当玻璃体内施用时，所述抗体或抗原结合片段具有在眼中改善的保留，例如与托珠单抗(tocilizumab)和/或相比。
26.前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在对应于H311、D313、I254或H436(编号如SEQ ID NO：41)的一个或多个位置包含突变(例如，以1、2、3或4个突变)。
27.权利要求26的抗体或抗原结合片段，其中所述突变选自H311A、H311E、H311N、D313T、I254A、I254R和H436A中的一个或多个。
28.前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含H311突变(编号如SEQ ID NO：41)。
29.权利要求26至28中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中与不包含所述突变的抗体或抗原结合片段的系统积累相比，所述突变减少了所述抗体或抗原结合片段的系统积累。
30.权利要求26至28中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中与不包含所述突变的抗体或抗原结合片段的系统积累相比，所述突变减少了所述抗体或抗原结合片段的系统积累，其中在玻璃体内施用所述抗体或抗原结合片段后评价所述系统积累。
31.前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段具有比托珠单抗和/或的系统半衰期短的系统半衰期。
32.前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是IgG2-A同种型或IgG2-A/B同种型，但不是IgG2-B同种型。
33.分离的抗体或抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：47的重链序列和任选地含有SEQ ID NO：42的轻链序列。
34.前述权利要求中任一项的抗体或抗原结合片段，其用于治疗具有IL-6相关疾病的受试者(例如人)。
35.权利要求34的抗体或抗原结合片段，其中所述疾病是特征在于玻璃体中升高的IL-6水平的眼部疾病。
36.权利要求34或35的抗体或抗原结合片段，其用于治疗具有以下疾病的受试者(例如，人)：糖尿病黄斑水肿(DME)、糖尿病视网膜病、葡萄膜炎、干眼(例如，干眼病或干眼综合征)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、增生型糖尿病视网膜病变(PDR)、视网膜静脉阻塞(RVO)、视神经脊髓炎(NMO)、角膜移植物、角膜擦伤、或对眼的物理损伤。
37.权利要求36的抗体或抗原结合片段，用于治疗具有DME的受试者(例如人)。
38.组合物，其包含权利要求1至37中任一项所述的抗体或抗原结合片段和任选的药学上可接受的载体。
39.权利要求38的组合物，其中所述组合物包含所述抗体的至少60、70、80、90、95或99％的IgG2-A或IgG2-A/B同种型，或其组合。
40.权利要求38或39的组合物，其中所述组合物包含小于所述抗体的10％、5％、2％、1％或0.5％的IgG2-B亚型。
41.权利要求38-40中任一项的组合物，其用于治疗IL-6相关疾病。
42.权利要求41的组合物，其用于治疗特征在于升高的IL-6水平的眼部疾病。
43.权利要求41的组合物，其用于治疗糖尿病黄斑水肿(DME)、糖尿病视网膜病、干眼(例如，干眼病或干眼综合征)、过敏性结膜炎、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、增生型糖尿病视网膜病变(PDR)、孔源性视网膜脱离(RRD)、视网膜静脉阻塞(RVO)、视神经脊髓炎(NMO)、角膜移植物、角膜擦伤、或对眼的物理损伤。
44.治疗IL-6相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1至37中任一项所述的IL-6抗体或抗原结合片段。
45.权利要求44的方法，其中所述IL-6相关疾病是特征在于玻璃体中升高的IL-6水平的眼部疾病。
46.权利要求44或45的方法，其中所述IL-6相关疾病是糖尿病黄斑水肿(DME)、糖尿病视网膜病、葡萄膜炎、干眼(例如，干眼病或干眼综合征)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、增生型糖尿病视网膜病变(PDR)、视网膜静脉阻塞(RVO)、视神经脊髓炎(NMO)、角膜移植物、角膜擦伤、或对眼的物理损伤。
47.权利要求45所述的方法，其中将所述抗体或抗原结合片段递送至所述受试者眼的玻璃体。
48.权利要求44至47中任一项所述的方法，其中所述IL-6相关疾病是糖尿病黄斑水肿，并且将所述抗体或其片段递送至所述受试者眼的玻璃体。
49.核酸，其包含编码根据权利要求1至37中任一项所述的抗体或抗原结合片段的序列。
50.核酸，其包含SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：48。
51.载体，其包含权利要求49或50的核酸。
52.细胞，其包含权利要求51的载体。
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