JP2017535269A5

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Publication number: JP2017535269A5
Application number: JP2017527209A
Authority: JP
Filing date: 2015-11-19
Publication date: 2019-09-26
Anticipated expiration: 2035-11-19

Claims

標的結合ドメインとバーコードドメインとを含む配列決定プローブであって、
前記標的結合ドメインは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、かつ標的核酸に結合することができ、前記標的結合ドメイン中の少なくとも２つのヌクレオチドは、前記標的核酸内の任意の塩基に結合することができるユニバーサル塩基であり；
前記バーコードドメインは合成主鎖を含み、前記バーコードドメインは少なくとも６つの付着位置を含み、それぞれの付着位置は少なくとも１つの付着領域を含み、前記付着領域は相補的核酸分子にハイブリダイズする少なくとも１つの核酸配列を含み；
前記少なくとも６つの付着位置のそれぞれの付着位置は、標的結合ドメイン中の１つのヌクレオチドに相当し、前記少なくとも６つの付着位置のそれぞれは異なった核酸配列を有し、前記少なくとも６つの付着位置のそれぞれの位置の核酸配列は、前記標的結合ドメインによって結合される前記標的核酸中の対応する１つのヌクレオチドの位置及び本体を決定し、
前記ユニバーサル塩基は、前記バーコードドメインの位置に対応するヌクレオチドの前後に有する、配列決定プローブ。
前記合成主鎖が１本鎖ＤＮＡを含む、請求項１に記載の配列決定プローブ。
前記標的結合ドメインと前記バーコードドメインとの間に２本鎖ＤＮＡスペーサーを含む、請求項１に記載の配列決定プローブ。
標的結合ドメイン中のヌクレオチドの数は、バーコードドメイン中の付着位置の数よりも少なくとも２つ多い、請求項１に記載の配列決定プローブ。
前記バーコードドメイン中のそれぞれの位置が、（ａ）同じ数の付着領域、（ｂ）１つの付着領域、又は（ｃ）１超の付着領域、を有する、請求項１に記載の配列決定プローブ。
それぞれの相補的核酸分子が、
（ａ）それぞれの付着位置について、検出可能標識物を含み；あるいは
（ｂ）核酸分子スペーサーを介して第１の核酸分子に間接的に連結され；あるいは、
（ｃ）それぞれの付着位置について、約８つのヌクレオチド〜約２０のヌクレオチドを含み、好ましくはそれぞれの相補的核酸分子が約１２つのヌクレオチドを含む0041、請求項１に記載の配列決定プローブ。
それぞれの第１の核酸分子が少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの第２の核酸分子とハイブリダイズする、請求項６に記載の配列決定プローブ。
前記第２の核酸分子が少なくとも１つの検出可能標識物を含む、請求項７に記載の配列決定プローブ。
それぞれの第２の核酸分子が、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つの、少なくとも１つの検出可能標識物を含む第３の核酸分子とハイブリダイズする、請求項７に記載の配列決定プローブ。
前記バーコードドメイン中の１つ以上の付着位置が、少なくとも１つのフランキング１本鎖ポリヌクレオチドに隣接する、請求項１記載の配列決定プローブ。
複数の請求項１記載の配列決定プローブを含む配列決定プローブ集団。
以下の工程を含む核酸の配列決定方法：
（１）請求項１〜１０のいずれか1項記載の複数の配列決定プローブを含む第１配列決定プローブの少なくとも１つの第１集団を、基板に固定化された標的核酸にハイブリダイズさせる工程、ここで、前記標的核酸は１以上の位置に固定化される；
（２）少なくとも６つの付着位置の第１付着位置に、検出可能標識物を含む第１の相補的核酸分子、又は検出可能標識物を含む第１レポーター複合体の第１の相補的核酸分子を結合させる工程；
（３）結合された第１相補的核酸分子の検出可能標識物、又は第１レポーター複合体の結合された第１の相補的核酸分子の検出可能標識物を検出する工程；
（４）固定化標的核酸中の第１ヌクレオチドの位置及び本体を特定する工程；
（５）第１付着位置に、検出可能標識物を欠く第１のハイブリダイズ性核酸分子を結合させ、こうして、検出可能標識物を含む第１の相補的核酸分子、又は検出可能標識物を含む第１のレポーター複合体の第１の相補的核酸分子の結合をはずす工程；
（６）少なくとも６つの付着位置の第２付着位置に、検出可能標識物を含む第２の相補的核酸分子、又は検出可能標識物を含む第２レポーター複合体の第２の相補的核酸分子を結合させる工程；
（７）結合された第２の相補的核酸分子の検出可能標識物、又は第２のレポーター複合体の結合された第２の相補的核酸分子の検出可能標識物を検出する工程；
（８）固定化標的核酸中の第２ヌクレオチドの位置及び本体を特定する工程；（９）少なくとも６つの付着位置の各々の付着位置が、検出可能標識物を含む相補的核酸分子、又は検出可能標識物を含むレポーター複合体の相補的核酸分子、及び結合された相補的核酸分子の検出可能標識物、又はレポーター複合体の結合された相補的核酸分子の検出可能標識物によって結合されるまで、工程（５）〜（８）を繰り返し、こうして、配列決定プローブの標的結合ドメインによってハイブリダイズされた固定化された標的核酸の少なくとも第１領域のための少なくとも６つのヌクレオチドの線状順序を特定する工程；そして
（１０）固定された標的核酸から第１配列決定プローブの少なくとも１つの第１集団を脱ハイブリダイズする工程。
工程（５）及び（６）は連続して又は同時に行われる、請求項１２に記載の方法。
第１の相補的核酸分子及び検出可能標識物を欠く第１のハイブリダイズ性核酸分子が、同一の核酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
検出可能標識物を欠く第１のハイブリダイズ核酸分子が、第１付着位置に隣接したフランキング１本鎖ポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
以下の工程を更に含む請求項１２に記載の方法：
（１１）請求項１〜１０のいずれか1項記載の複数の配列決定プローブを含む第２配列決定プローブの少なくとも１つの第２集団を、基板に固定化された標的核酸にハイブリダイズさせる工程、ここで、前記標的核酸は１以上の位置の基板に固定化され、第１配列決定プローブ及び第２配列決定プローブの標的結合ドメインは異なり、第２集団の各配列決定プローブは、固定された標的核酸からほぼ同じ条件下で脱ハイブリダイズし、及び固定された標的核酸から、第１集団中の配列決定プローブとは異なる条件下で脱ハイブリダイズする；
（１２）少なくとも６つの付着位置の第１付着位置に、検出可能標識物を含む第１の相補的核酸分子、又は検出可能標識物を含む第１レポーター複合体の第１の相補的核酸分子を結合させる工程；
（１３）結合された第１相補的核酸分子の検出可能標識物、又は第１レポーター複合体の結合された第１の相補的核酸分子の検出可能標識物を検出する工程；
（１４）固定化標的核酸中の第１ヌクレオチドの位置及び本体を特定する工程；
（１５）第１付着位置に、検出可能標識物を欠く第１のハイブリダイズ性核酸分子を結合させ、こうして、検出可能標識物を含む第１の相補的核酸分子、又は検出可能標識物を含む第１のレポーター複合体の第１の相補的核酸分子の結合をはずす工程；
（１６）少なくとも６つの付着位置の第２付着位置に、検出可能標識物を含む第２の相補的核酸分子、又は検出可能標識物を含む第２レポーター複合体の第２の相補的核酸分子を結合させる工程；
（１７）結合された第２の相補的核酸分子の検出可能標識物、又は第２のレポーター複合体の結合された第２の相補的核酸分子の検出可能標識物を検出する工程；
（１８）固定化標的核酸中の第２ヌクレオチドの位置及び本体を特定する工程；
（１９）少なくとも６つの付着位置の各々の付着位置が、検出可能標識物を含む相補的核酸分子、又は検出可能標識物を含むレポーター複合体の相補的核酸分子、及び結合された相補的核酸分子の検出可能標識物、又はレポーター複合体の結合された相補的核酸分子の検出可能標識物によって結合されるまで、工程（１５）〜（１８）を繰り返し、こうして、配列決定プローブの標的結合ドメインによってハイブリダイズされた固定化された標的核酸の少なくとも第２領域のための少なくとも６つのヌクレオチドの線状順序を特定する工程；そして
（２０）固定された標的核酸から第２配列決定プローブの少なくとも１つの第２集団を脱ハイブリダイズする工程。
固定化された標的核酸の少なくとも第１領域及び少なくとも第２領域におけるヌクレオチドの各特定された線状順序を組み立て、こうして固定化された標的核酸のための配列を特定する、工程を更に含む、請求項１６に記載の方法。
基板、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の複数の配列決定プローブ、
配列決定プローブ及びアフィニティタグにハイブリダイズする標的核酸の領域とは異なった標的核酸分子の領域にハイブリダイズする核酸配列を含む、少なくとも１つの捕捉プローブ、
配列決定プローブの少なくとも６つの付着位置の１つにハイブリダイズする核酸配列、及び検出可能標識物を含む、検出可能標識物を含む少なくとも６つの相補的核酸分子、
配列決定プローブの少なくとも６つの付着位置の１つにハイブリダイズする核酸配列、及び使用説明書を含む、検出可能標識物を欠く少なくとも６つの相補的核酸分子、
を含む、キット。